Идентификация электрофоретических пиков в мицеллярной электрокинетической хроматографии на примере аминокислот и фенолов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

СТЕПАНОВ КОНСТАНТИН ВИКТОРОВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ПИКОВ В МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ПРИМЕРЕ АМИНОКИСЛОТ И ФЕНОЛОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в лаборатории хроматографических методов анализа кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Научный руководитель Кандидат химических наук, ведущий

научный сотрудник Пирогов Андрей Владимирович

Официальные оппоненты

Доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович, ОАО НПО «ХимАвтоматика», г Москва Кандидат химических наук, старший научный сотрудник Назимов Игорь Владимирович, Институт

Биоорганической Химии им ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, г Москва

Ведущая организация

Центр «Биоинженерия» РАН, г Москва

Защита состоится «14» ноября г в 16 ч 15 мин в ауд 446 на заседании диссертационного совета Д501 001 88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М В Ломоносова, по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 11 октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Торочешникова И И

7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы. Высокоэффективный капиллярный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография являются динамично развивающимися методами химического анализа, позволяющими в короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей По принципу разделения метод мицеллярной электрокинетической хроматографии близок к обращенно-фазовой жидкостной хроматографии, в связи с этим представляется интересным применить современную методологию расчетов, применяемую в жидкостной хроматографии, для расчета и оптимизации условий разделения сложных органических соединений

Вместе с тем сильная зависимость от температуры, электропроводности буферного раствора и раствора пробы и наличия ионогенных примесей в пробе приводят к недостаточной воспроизводимости времен миграции как в мицеллярной электрокинетической хроматографии, так и в капиллярном зонном электрофорезе В работе рассмотрено использование различных подходов к снижению и компенсации влияния различных эффектов, связанных с электропроводностью на стадии подготовки проб

Цель работы состояла в изучении разделения сложных смесей органических соединений методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с последующим анализом реальных объектов на примере протеиновых гидролизатов (сывороточного альбумина и рыбной муки), а определением фенолов в фармацевтической продукции Цели работы предусматривали решение следующих задач

1 Разделение фенолов и фенилтиогидантоин-аминокислот в модельных смесях

2 Разработку схемы проведения реакций дериватизации аминокислот с получением смеси производных, пригодных для анализа методом мицеллярной электрокинетической хроматографии, в том числе и для анализа реальных объектов (гидролизатов)

3 Разработка и сравнение методов надежной идентификации пиков в многокомпонентных смесях на примере аминокислот и фенолов

Научная новизна Для фенилтиогидантоин-аминокислот предложены и сравнены численные методы расчета времен миграции компонентов с применением стандартов времен миграции, позволяющие однозначно идентифицировать пики при разделении смеси аминокислот методом мицеллярной электрокинетической хроматографии Для идентификации пиков использованы параметры гидрофобности, примененные к временам миграции с вычетом скорости электроосмотического потока В случае с фенолами продемонстрирована высокая корреляция параметра гидрофобности с временем

миграции фенолов, разделяемых методом МЭКХ при обращенном электроосмотическом потоке, на основании полученных данных рассчитан параметр logP и-гексилрезорцина из экспериментальных электрофоретических данных В ходе экспериментов с аминокислотами показано, что расчетные значения параметра logD также коррелируют с временем миграции для наборов ФТГ-аминокислот сходной структуры, но не обеспечивают достаточной точности идентификации электрофоретических пиков Для аминокислот рассмотрены и сравнены варианты с одним и двумя стандартами времен миграции Для определения аминокислот в реальных объектах предложена схема дериватизации, позволяющая разделять аминокислоты методом МЭКХ при работе с реальными объектами, включающая очистку от ионогенных соединений и аммония, а также методы количественного определения с использованием стандартной добавки триптофана или группы из 16 аминокислот

Практическая значимость работы В ходе работы нами предложены подходы к надежной идентификации фенолов и ФТГ-аминокислот, разделяемых методом МЭКХ Предложены методы использования стандартов времен миграции На примере фенолов продемонстрирована возможность использования параметров гидрофобности для определения последовательности выхода пиков на электрофореграмме В случае аминокислот предложены эффективные численные методы с использованием одного и двух стандартов времен миграции Предложена схема проведения реакций дериватизации позволяющая работать с широким кругом реальных объектов В работе сравнены различные условия проведения реакций дериватизации и очистки смеси производных для получения минимальных количеств побочных продуктов, так же приводится оценка потерь аминокислот при проведении дериватизации Предложенные методы идентификации электрофоретических пиков и способ проведения дериватизации опробованы при анализе гидролизатов рыбной муки и пищевого альбумина

На защиту выносятся:

1 Способы идентификации пиков фенилтиогидантоин(ФТГ)-аминокислот разделяемых в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии Для идентификации использован метод линейной регрессии, в котором время миграции аминокислот является функцией от времен миграции двух стандартов времен миграции, и метод на основе использования log£>' (рассчитанный с помощью пакета программ ACD/LC Simulator 8 0 компании ACDLabs 1пс(Канада)) Продемонстрировано наличие высокой корреляции расчетных значений параметра гидрофобности с временем миграции для группы ФТГ-аминокислот - аланина, лейцина (изолейцина), триптофана и фенилаланина, коэффициент корреляции с параметром logP, R2=0,99

2 Условия разделения фенолов, на которых показана высокая корреляция параметра гидрофобности logP с временем миграции На основании электорофоретических данных рассчитан параметр logP для n-гексилрезорцина (logP =3,31) и и-хлорфенола (logР =1,32)

3 Способы получения и очистки ФТГ-производных аминокислот и условия разделения 16 аминокислот Способ получения производных включает реакцию гидролизата белка с фенилизотиоцианатом с последующей циклизацией фенилтиокарбаматных производных в трифторуксусной кислоте (схема представлена)

4 Предложены дополнительные процедуры очистки фенилтиокарбаматов и фенилтиогидантоинов аминокислот от побочных продуктов и ионогенных примесей

5 Способ количественного определения аминокислот с использованием внутреннего стандарта - ФТГ-триптофана и стандартных добавок других аминокислот на стадии дериватизации

Апробация работы

Результаты работы докладывались на международных конференциях "Euroanalysis XII" (Дортмунд, Германия, 2002), SBS 2003 "100 years of chromatography" (Москва, Россия, 2003), ASIANALYSIS VI (Токио, Япония, 2001), научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии, МГУ

Публикация результатов

По материалам диссертации было опубликовано 4 статьи и 5 тезисов докладов Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, общих выводов, списков цитируемой литературы и сокращений Материал диссертации изложен на 148 страницах, содержит 35 рисунков и 18 таблиц, список литературы включает 136 ссылок

Основное содержание работы Обзор литературы

Обсуждены методы разделения и определения фенолов и аминокислот методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии Рассмотрены различные электрофоретические условия разделения производных аминокислот и фенолов На основании данных литературного обзора выбран метод дериватизации аминокислот и условия их разделения

Экспериментальная часть

В работе использовали системы капиллярного электрофореза «Капель-103» и «Капель-105» производства ООО «Люмекс» (Санкт-Петербург, Россия), а также систему «HP3D СЕ», Agilent Technologies Inc (Вальдборн, Германия) В обоих приборах использовали кварцевые капилляры (Phoenix, США) различных длин и диаметров, разные напряженности электрического поля Фотометрическое детектирование осуществляли при разных длинах волн в диапазоне 195-270 нм Температуру разделения регулировали при помощи встроенного термостата прибора «Капель 105»

В работе также использовали спектрофотометр «Shimadzu 2201» (Япония), вакуумную центрифугу Labconco, США, пластинчато-роторный вакуумный насос НВР-4.5Д, Вакууммаш, Россия

Для получения ФТГ-аминокислот использовали свободные аминокислоты, фенилизотиоцианат (Sigma, США), ФТК-производные получали в смеси (7 1 1 1) этанол вода триэтиламин фенилизотиоцианат Фосфатные и боратные буферные растворы готовили растворением точных навесок в бидистиллированной воде при контроле pH

Использование параметра 1одР для идентификации фенолов

Для оценки удерживания фенолов в МЭКХ предложено использовать параметр гидрофобности Ханша Найдено, что времена миграции фенолов зависят от их гидрофобности, причем такая зависимость носит линейный характер После построения зависимости времени миграции от параметра гидрофобности Ханша получено уравнение, связывающее параметр гидрофобности и время миграции

tr = 0,054 log/>- 7,0599, где logР - параметр Ханша R2 = 0,9983

Действительно, в соответствии с теорией в МЭКХ фенолы удерживаются в порядке роста их гидрофобности Таблица 1 Параметры log Р для фенолов

Фенол log/»

«-Нитрофенол 1,91

и-Хлорфенол 1,32, эксп 1,33

Резорцин 0,88

Пирокатехин 1,01

Фенол 1,48

и-Гексилрезорцин эксп 3,31

Гидрохинон 0,54

Рис.]. Элекгрофореграмма смеси фенолов в режиме МЭКХ.

Использование параметров гидрофобности для идентификации аминокислот

Времена миграции аминокислот в МЭКХ существенно зависят от электропроводности пробы и рН пробы. Данные факторы влияют на подвижность ФТГ-аминокислот в зоне пробы и скорость ЭОП. В связи с этим проведены эксперименты с использованием параметров гидрофобности для идентификации электрофоретических пиков методом расчета времени миграции.

В ходе эксперимента получена электрофореграмма модельной смеси ФТГ-аминокислот с добавкой маркера ЭОП, проведена идентификация аминокислот, после чего с учетом нулевого времени миграции (по маркеру ЭОП) построены корреляционные уравнения времени миграции с параметрами logD, log/3 и logD' (при различных значениях параметра "conditional charge"). Минимальная погрешность достигается при использовании параметра logD' при conditional charge = 8,2. Проведен расчет прогнозируемых времен миграции. Наибольшие неточности предсказания отмечены для производных гидрофильных полярных аминокислот - аргинина(К), аспарагиновой кислоты(О), глутаминовой кислоты(Е), гистидина(Н) и лизина(К) при расчетах с использованием как logD, так и logР и logD'. По-видимому, расчет параметров гидрофобности этих соединений неточен ввиду сложности прогнозирования свойств веществ с гидрофильной природой.

Рис. 2. Применение параметра IogD по группам аминокислот.

Использование параметра IogD для предсказания времени миграции (рис. 2) в случае незаряженных ФТГ-аминокислот позволяет получить наилучшее предсказание для ФТГ-производных гидрофобных неполярных аминокислот, таких как аланин, пролин, валин, метионин, лейцин (изолейцин), триптофан и фенилаланин (для аланина, вапина, лейцина, триптофана и фенилаланина коэффициент корреляции со временем миграции R2=0,99. Таким образом, при использовании в качестве маркера ФТГ-триптофана можно достоверно идентифицировать эти аминокислоты. В случае использования параметра log/5 не удалось точно идентифицировать ФТГ-производные аминокислот, при этом времена миграции ФТГ-аминокислот аланина, лейцина (изолейцина), триптофана и фенилаланина имеют высокий коэффициент корреляции с параметром logP, /?"=0,99. В случае использования параметра IogD' удалось получить наиболее высокий коэффициент корреляции для предсказания времен миграции всех разделяемых ФТГ-аминокислот, однако при использовании этого параметра получено несоответствие экспериментального и расчетного порядка выхода электрофоретических пиков в случае ФТГ-триптофана и ФТГ-фенилаланина. Прогнозирование времен миграции с использованием критериев IogD, так и log/3 и IogD' с использованием пакета программ ACD/LC Simulator возможно при условии исключения из набора прогнозируемых времен миграции гидрофильных и заряженных аминокислот, а также с учетом того, что ФТГ-лейцин и ФТГ-изолейцин

имеют разные времена миграции.

Использование стандартов времен миграции ФТГ-аминокислот

Методы расчета времен миграции ФТГ-аминокислот с использованием параметров гидрофобное™ не обладают достаточной точностью для идентификации пиков. В связи с этим для идентификации электрофоретических пиков применены стандарты (маркеры) времен миграции (эксперименты проводили на капилляре 40 см х 50 мкм). В качестве маркера времени выхода ЭОП использовали ацетон. Для идентификации пиков использовали время, полученное вычитанием времени выхода пика ацетона из времени выхода каждого из пиков ФТГ-аминокислот. Для полученных значений рассчитывали стандартные отклонения (и=4) (рис.3). Из полученного графика видно, что даже использование маркера ЭОП позволяет более надежно идентифицировать пики (особенно находящиеся в непосредственной близости от него). При этом стандартное отклонение времен миграции ФТГ-аминокислот уменьшается с 0,4 мин (без учета времени ЭОП) до примерно 0,25 мин (с учетом).

1

I 0,9

0 0,8

1 0,7 | 0,6

S 0,5

§ 0,4

I 0,3 <тз

Э 0.2 5 0,1 о

III

□ Без использования параметра скорости ЭОП

использованием параметра скорости ЭОП

Y Т Р V М Аминокислоты

Н К

Рис. 3. Стандартные отклонения времен миграции ФТГ-аминокислот (п=4, Р=0,95), с учетом скорости ЭОП и без неё.

В качестве других маркеров времен миграции использовали гидрофобные соединения, которые мигрируют вместе с мицеллами буферного электролита и имеют большие времена миграции. Нами проведено сравнение ФТГ-триптофана, п-гексилрезорцина и судана III. ФТГ-триптофан может быть использован как стандарт времени миграции и внутренний стандарт при количественном определении аминокислот, поскольку триптофан разрушается при кислотном гидролизе протеина и может быть введен в качестве стандартной добавки в гидролизат на стадии получения ФТК-производных аминокислот. Использование ФТГ-триптофана в качестве стандарта времени миграции позволяет провести полное разделение смеси аминокислот. Снижение стандартного отклонения при использовании ФТГ-триптофана показано на рис. 4. Пик

ФТГ-триптофана может быть идентифицирован (как самый большой пик на электрофореграмме) в случае использования стандартной добавки более I мг к сухому остатку гидролизата.

Использование я-гексилрезорцина не позволило добиться хорошего разрешения с пиками ФТГ-аминокислот в конце хроматограммы, краситель судан III малорастворим и его применение сильно увеличивает время анализа. Пики Судана III и я-гексилрезорцина выходят в конце электрофореграммы и имеют значительную ширину.

1

I

| 0,9 о" 0,8

о 0.7 -| "

о 0,5

S 0.4

о. 0,3 л

5 0,2 га

5 о,1 о

ш

□ Без использования времени миграции ФТГ-триптофана

■ С

использованием времени миграции ФТГ-триптофана

Аминокислоты

Рис. 4. Стандартные отклонения времен миграции ФТГ-аминокислот него (п=4, Р=0,95), с учетом времени миграции ФТГ-триптофана и без него.

Применение двух стандартов времени миграции (рис.5) для идентификации смесей

аминокислот удобно представить в виде корреляционного уравнения, в котором времена выхода аминокислот являются линейной комбинацией времен миграции двух маркеров. Данные, полученные из электрофореграмм, были обработаны с помощью методов математической статистики для 3 групп электрофореграмм реального объекта, стандартной смеси 23 аминокислот и стандартной смеси 16 аминокислот (п=3). Методом МНК получена таблица оптимальных коэффициентов для линейной комбинации времен выхода 2 маркеров для функции вида:

7исп= Tmi Кц + Ттг Кц

для каждой ФТГ-аминокислоты со временем миграции меньшим, чем у ФТГ-триптофана, где Тисп — исправленное время миграции для каждой аминокислоты, Tmi , Tnt2i - времена миграции маркеров времени миграции, К\\, Кг\ - коэффициенты, подобранные методом наименьших квадратов.

Из рис. 5,6 видно, что отклонение времен миграции аминокислот значительно уменьшается в непосредственной близости от маркеров. На пики идущие после триптофана, параметр скорости ЭОП оказывает искажающее действие, внося дополнительную неточность определения за счет наличия в уравнении члена с большим временем миграции (относительно ЭОП), и, соответственно, с большой погрешностью. Очевидно, что использование этого параметра нелогично для пиков со временем

миграции большим, чем у второго маркера. Поэтому коэффициент Кц для пиков следующих за триптофаном предполагается равным 0. На рис. 5 приведен вариант расчета, в котором для пиков, расположенных до ФТГ-триптофана, используется корреляционное уравнение, а для пиков, расположенных после - коррекция с применением одного стандарта времени миграции (ФТГ-триптофана). Таким образом, применение варианта с использованием двух стандартов времен миграции позволяет дополнительно снизить стандартные отклонения времен миграции ФТГ-аминокислот, которые в этом случае находятся в интервале от 0,083 до 0,26 мин.

Аминокислоты

Рис. 5. Стандартные отклонения времен миграции ФТГ-аминокислот (п=4, Р=0,95), с учетом времени миграции ФТГ-триптофана и скорости ЭОП и без него.

□ Расчетные времена удерживания аминокислот

■ Времена удерживания аминокислот при анализе протеинового гидролизата

Аминокислоты

Рис. 6. Сравнение экспериментальных и расчетных времен миграции для электорофореграммы реального объекта, условия приведены на рис. 3.

Данное уравнение было применено для теоретического расчета ожидаемых времен миграции ФТГ-аминокислот с временем миграции меньшим, чем у ФТГ-триптофана, а для производных фенилапанина, гистидина, лизина и аргинина использовали вариант с одним маркером - ФТГ-триптофаном (Кц = 0).

На основании расчетных данных была построена столбчатая диаграмма (рис 6 ), которая иллюстрирует зависимость среднего отклонения для окна миграции каждой из аминокислот относительно расчетной неточности определения положения аминокислоты

Таким образом, видно, что предложенная схема применения стандартов времен миграции позволяет проводить качественную идентификацию аминокислот со временами миграции, близкими к времени миграции стандарта и находящимися непосредственно в окне миграции стандартов Применение схемы идентификации с двумя стандартами позволяет идентифицировать большую часть аминокислот Применение корреляционного уравнения к электрофореграммам, полученным на других капиллярах, возможно, однако по мере увеличения длины капилляра возрастает неточность предсказания времени миграции большинства аминокислот

Разделение и определение аминокислот

В ходе эксперимента использованы различные капилляры с целью подбора оптимальных условий разделения Наибольшая селективность разделения достигнута на капиллярах диаметром 50 мкм Для разделения модельных смесей использованы капилляры различной длины, использование капилляра с длиной 75 см позволяет получить хорошее разделение пиков в начале электрофореграммы, но приводит к уширению пиков, выходящих в конце электрофореграммы, время анализа составляем 45 мин Применение капилляра длиной 40 см не позволяет идентифицировать пики, выходящие в начале хроматограммы, без стандарта времени миграции, время анализа составляет 20 мин

В экспериментах по предсказанию времен миграции и анализам реальных объектов использовали длину волны 210 нм, гидродинамический ввод пробы 20 мБар, 10 с, рабочее напряжение 25 кВ и интервал температур 13-16 °С

Таблица 2 Условия разделения ФТГ-аминокислот

Параметр Значение

Капилляры 40 см х 50 мкм,

65 см х 50 мкм,

50 см х 50 мкм,

50 см х 75 мкм

10,7 мМ КаН2РС>4,

Буферный раствор 25 мМ ДЦСН,

1,8 мМ N828407

рН6,8

Способ ввода пробы Гидродинамический

Время ввода пробы 20 мБар, 10 с,

20 мБар, 5 с,

Длина волны детектора, нм 210, 270, 254

Температура капилляра, °С 14-45

Рабочее напряжение, кВ 13- 25

Получение ФТГ-производных аминокислот

Для разделения и определения аминокислот методом мицеллярной электрокинетической хроматографии использована дериватизация аминокислот фенилизотиоцианатом Выбор фенилизотиоцианата в качестве дериватизирующего обусловлен хорошой стабильностью производных при хранении и легкостью очистки производных аминокислот от мешающих соединений Схема дериватизации, применяемая для электрофоретического разделения аминокислот, должна обеспечивать удаление ионогенных примесей, (растворимых солей), удаление аммония, жировых и мелкодисперсных примесей, избытка дериватизирующего агента и органических растворителей Данные требования обусловлены чувствительностью МЭКХ к электропроводности пробы, а также необходимостью отсутствия механических примесей

Предложенная схема дериватизации (рис 3) включает следующие этапы

1) Предварительная обработка гидролизата аминокислот аликвоту смеси аминокислот или белка вносили в сухук? пробирку и упаривали досуха в вакууме при нагревании до 40 °С Далее к сухому остатку добавляли 50 мкл смеси (2 1) этанол триэтиламин либо 100 мкл раствора триптофана 1 мг/мл в смеси (2 1) этанол триэтиламин и упаривали досуха

2) Получение ФТК производных аминокислот к полученным основным формам аминокислот добавляли 50 мкл дериватизирующей смеси (7 1 1 1) этанол триэтиламин вода фенилизотиоцианат, и оставляли стоять при комнатной температуре 30 мин Растворители и избыток фенилизотиоцианата отгоняли в вакууме при комнатной температуре до образования вязкого остатка К остатку, содержащему фенилизотиоцианат и ФТК- аминокислоты добавляли 100 мкл воды и перемешивали Далее проводили очистку ФТК производных от фенилизотиоцианата экстракцией Для этого к пробе добавляли 100 мкл смеси (7 1) гексан этилацетат и встряхивали в течение 30 с, после этого верхний слой отбрасывали, операцию повторяли 3 раза до получения гомогенного раствора

3) Циклизация ФТК-производных аминокислот к 100 мкл раствора ФТК производных аминокислот добавляли 100 мкл 50%-ной трифторуксусной кислоты в 2 М НС1 Полученную смесь переносили в водяную баню и нагревали в течение 4 мин Затем смесь охлаждали и проводили экстракцию ФТГ-производных этилацетатом Для этого в пробирку, содержащую 200 мкл смеси, вносили 400 мкл этилацетата и встряхивали 1 мин, после расслаивания смеси собирали раствор производных аминокислот в этилацетате (верхний слой) Последующие 2 цикла экстракции проводили, используя порции 200 мкл этилацетата, экстракты объединяли и упаривали в вакууме досуха при нагревании (30-40

°С) на водяной бане Полученный сухой остаток растворяли в электрофоретическом буферном электролите или в ацетонитриле

Рис 7 Схема реакций получения ФТГ-производных аминокислот

В качестве основного побочного продукта при проведении реакции дериватизации фенилизотиоцианатом аминокислот при работе с реальным объектом образуется дифенилтиомочевина - продукт реакции фенилизотиоцианата с аммиаком, содержащимся в реальном объекте или получающимся при гидролизе некоторых аминокислот в виде иона аммония

Количества дифенилтиомочевины в реакционной смеси на различных стадиях дериватизации определяли методом ВЭЖХ Для этого продукты реакции, полученные в разных условиях растворяли в ацетонитриле и разделяли на жидкостном хроматографе с фотометрическим детектором с рабочей длиной волны 240 нм Процесс дериватизации аминокислот характеризуется соотношением полученных производных и образованием побочных продуктов в результате реакции Основными побочными продуктами являются различные производные тиомочевины, которые затрудняют разделение и идентификацию производных аминокислот Сравнение выходов дифенилтиомочевины в ходе реакции образования ФТК-аминокислот в различных условиях показано на рис 8 Типовые электрофореграммы гидролизатов аминокислот представлены на рис 9,10

N4

80 С, 4 мин

N14

5

£

% 4

О)

о. ^

§ з

га О

2

1

О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000

Площадь пика дифенилмочевины, мВ*с.

Рис. 8. Содержание дифенилмочевины на различных стадиях пробоподготовки. (1) -Получение ФТК аминокислот при 55 °С; (2) - Получение ФТК аминокислот при 20 °С; (3) - после обработки реакционной смеси, полученной при 20 °С смесью (7:1) гексан : этилацетат; (4) - смесь, полученная при 20 °С после циклизации при 80 "С; (5) - смесь, полученная при 20 °С после циклизации при 55 °С; (6) - смесь ФТГ-аминокислот, приготовленная по предлагаемой методике, включающей образование ФТК-производных, очистку продукта, циклизацию при 80 °С, с последующей экстракцией ФТГ-аминокислот этилацетатом. Все исследуемые смеси были доведены до 2 г дистиллированной водой.

При проведении реакции дериватизации для удаления избытка фенилизотиоцианата и очистки от ионогенных примесей нами использована экстракция. Показано, что при экстракции ФИТЦ смесью (7:1) гексан : этилацетат органическая фаза не содержит Ф'ГК-аминокислот, для определения остатков ФТК - аминокислот экстракт упаривали в вакууме и добавляли 25%-ный раствор аммиака до полного растворения осадка, после чего раствор упаривали и проводили разделение и определение ФТК-аминокислот и продукта реакции ФИТЦ с аммиаком - дифенилтиомочевины. ФТК-аминоксислоты в экстракте не обнаружены. Для оценки потерь аминокислот при экстракции ФТГ-аминокислот этилацетатом водный слой (25%-ный раствор трифторуксусной кислоты) упаривали в вакууме, остаток растворяли в электрофоретическом буфере и проводили разделение. Были отмечены потери лизина на уровне 1,5% и гистидина на уровне 2,4%.

0.575 тЛТт

Е

Рис. 9. Электрофореграмма гидролизата рыбной муки со стандартной добавкой 0,1 мг триптофана на капилляре 40 см х 50 мкм, длина волны детектора 195 нм, 25 кВ. Буферный раствор - 25 мМ додедилсульфат натрия, 1,8 мМ тетраборат натрия и 10,7 мМ ди гидрофосфат натрия

Рис. 10. Электрофореграмма гидролизата молочного протеина со стандартной добавкой 0,1 мг триптофана (30% углеводов, 70% протеина, жиров менее 1%) на капилляре 40 см х 50 мкм, длина волны детектора 195 нм, 25 кВ. Буферный раствор - 25 мМ додедилсульфат натрия, 1,8 мМ тетраборат натрия и 10,7 мМ дигидрофосфат натрия.

1103 тли

Рис. 11. Оценка потерь ФТГ-аминокислот при экстракции этилацетатом, смесь аминокислот (масштаб 1,103 шАи, снизу), остаток от упаривания водной фазы (масштаб 0,089 шАУ, сверху)

Использование внутренних стандартов для количественного определения

Для количественного определения аминокислот в гидролизате применен метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта для количественного определения использовали точные навески одной или нескольких аминокислот, которые добавляли к протеиновому гидрализату после упаривания соляной кислоты. Вводимые таким образом стандартные добавки не позволяют учитывать особенности протекания гидролиза. Введение внутренних стандартов таким способом позволяет, по нашему мнению, проводить более точное определение, т.к. процедура дериватизации включает две реакции и проведение экстракции. Для количественного определения аминокислот в реальных объектах мы использовали стандартную добавку триптофана - аминокислоты, полностью разрушающейся в процессе гидролиза. Такая стандартная добавка использована также в качестве стандарта времени миграции. Для точного определения аминокислот может быть использована стандартная добавка всех 16 аминокислот, такая добавка позволяет учесть особенности протекания процедуры гидролиза. Условия проведения реакции дериватизации исследованы количественно введением добавок аминокислот (табл. 3).

Таблица 3. Правильность определения отдельных аминокислот

введено, мкМ найдено, мкМ =

(/>=0,95; п=3) (/>=0,95; п=3) 5 г, 11=3

Серии 18,05 17,4±1,8 0,0141

Треонин 17,5 15,2+1,3 0,0120

Метионин 20,47 19,66±1,6 0,0124

Триптофан 9,88 9,62±0,9 0,0092

Лизин 14,24 15,2±1,1 0,0088

Разделение и определение фенолов

Выбор состава и рН буферного раствора

Соединения, разделяемые методом МЭКХ, должны присутствовать в растворе преимущественно в виде нейтральных соединений, поскольку солюбилизация в мицеллярной фазе возможна только в этом случае Фенолы являются очень слабыми органическими кислотами, поэтому при разделении возможно использование нейтральных или слабокислых буферов В литературе описано большое число вариантов состава буферных растворов фосфатных, ацетатных и боратных, как правило, разделение происходит в интервале рН 3-9 Для разделения фенолов мы использовали ацетатный буфер, содержащий 20 мМ ацетат натрия (рН 5,2)

Ионены имеют высокие значения ККМ, из литературных данных известно, что концентрации ионенов в буфере для МЭКХ составляют 2-5% Строго говоря, в этом случае образуются не мицеллы в классическом смысле, а скорее мицеллоподобные агрегаты Однако в литературе их часто называют мицеллами Для простоты мы придерживались этого правила

В работе исследован концентрационный диапазон 2-5% на примере РОАЭМА и 3-б-ионена Показано что при использовании выбранного ацетатного буфера с концентрацией ионена выше 4% возможно разделение фенолов в качестве нейтральных соединений по гидрофобному механизму При этом фенолы солюбилизируются в полимерных клубках и мигрируют вместе с ними против ЭОП Таким образом, пики фенолов на электрофореграмме имеют большие времена, чем пик, соответствующий электроосмотическому потоку Это снижает экспрессность определения, но часто повышает селективность, за счет изменения механизма миграции (солюбилизация вместо образования ионных пар) При концентрации ионенов ниже 4% фенолы либо мигрируют как анионы, либо выходят с ЭОП Более высокие концентрации не использовали, поскольку это приводит к повышению вязкости раствора и увеличению силы тока через капилляр

Присутствие ионена в высоких концентрациях в буферном растворе приводит к повышению электропроводности буфера, увеличению силы тока через капилляр и разогреву капилляра В связи с этим увеличивается время анализа, поскольку использование высокого напряжения невозможно Для снижения силы тока через капилляр иногда можно использовать органические растворители, однако их применение может вызвать коагуляцию полимера

Нами исследованы смеси вода - ацетонитрил в соотношении 9 1,41 и 2 1 Смесь (9 1) вода - ацетонитрил позволяет разделять фенол, резорцин, и-хлорфенол и гидрохинон без значительных изменений в эффективности и селективности по сравнению с водным

буфером Сила тока через капилляр снизилась с 250 до 220 мкА при -10 кВ, время анализа при этом не изменилось При использовании этого буфера для разделения при -12 кВ время анализа сократилось с 26 мин до 22 мин, однако при этом значительно снизилась селективность разделения, вероятно, вследствие изменения коэффициентов распределения вещество - мицелла Добавки органических растворителей приводят к энергетически более выгодному пребыванию веществ в водной фазе и селективность разделения уменьшается

Буферные растворы, содержащие 20% и более ацетонитрила, не позволяют добиться воспроизводимых результатов из-за нестабильности силы тока через капилляр, по-видимому, из-за начала выпадения полимера Использование таких буферов ведет к значительному снижению эффективности и воспроизводимости разделения

Сравнение селективностей разделения

Сравнивая результаты определения фенолов методом МЭКХ с использованием ионенов и PDADMA, мы наблюдаем в целом те же закономерности, что и при разделении фенолов в виде анионов Однако в случае МЭКХ сильное значение приобретает плотность заряда на полимерной цепи В случае МЭКХ ион-парные взаимодействия практически не играют роли в разделении, разделение происходит за счет гидрофобных взаимодействий Так, 6-9-ионен имеет гибкую структуру молекулы, способную легко образовывать в водных растворах клубки-глобулы Высокая селективность разделения объясняется гидрофобными взаимодействиями фенол - полимер Для более гидрофильных гидрохинона и резорцина наблюдается такой же эффект Таким образом, 6-9-ионен, обладая малой плотностью заряда и высокой гидрофобностью является одним из наиболее перспективных ионенов для МЭКХ Графики зависимостей селективности определения некоторых фенолов приведены на рис 12

Селективность

резорцин - фенол

Селективность

3-6 ионе н 2-10 ионе н РОДОМ А 6-9

ионен резорцин - гидрохинон

Рис. 12. Селективность разделения пар фенолов с использованием различных полимеров.

Выводы

1 Предложены и сравнены два способа идентификации пиков фенилтиогидантоин (ФТГ) -аминокислот разделяемых в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии Показано, что вариант с идентификацией ФТГ-аминокислот по стандартам времен миграции позволяет идентифицировать электрофоретические пики всех 16 разделяемых аминокислот Способ идентификации аминокислот с учетом гидрофобности имеет ряд преимуществ, поскольку в случае применения к ФТГ-производным неполярных аминокислот позволяет предсказывать порядок выхода электрофоретических пиков, однако применение корреляционного уравнения позволяет провести еще более точный расчет

2 Для фенолов показана высокая корреляция параметра гидрофобности logP с временем миграции Показано наличие высокой корреляции расчетных значений параметра гидрофобности с временем миграции для группы ФТГ-аминокислот - аланина, лейцина (изолейцина), триптофана и фенилаланина, коэффициент корреляции с параметром logP, R2=0,99

3 Предложен метод получения фенилтиогидантоинов 16 аминокислот для анализа методом капиллярного электрофореза в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии Способ получения производных включает в себя реакцию гидролизата белка с фенилизотиоцианатом с последующей циклизацией фенилтиокарбаматных производных в трифторуксусной кислоте(схема представлена) Предложены дополнительные процедуры очистки фенилтиокарбаматов и фенилтиогидантоинов аминокислот от побочных продуктов и ионогенных примесей Способ опробован при анализе гидролизатов протеина и рыбной муки

4 Предложены способы количественного определения аминокислот с использованием внутреннего стандарта - ФТГ-триптофана и стандартных добавок других аминокислот на стадии дериватизации

Результаты диссертации изложены в следующих работах.

1 Степанов К В , Пирогов А В , Шпигун О А Идентификация электрофоретических пиков фенилтиогвдантоиновых производных аминокислот // Журн аналит химии, 2006 Т61 №1 С 10-17

2 Пирогов А В , Степанов К В , Шпигун О А Изменение электрофоретической подвижности фенолов при использовании добавок ионенов в буферный электролит / Журн, аналит химии, 2003 Т 58 №5 С 478-484

3 Pirogov А V , Stepanov К V , Shpigun О A Electrophoretic Determination of phenols m capillaries modified by catiomc polyelectrolytes //J Analyt Science, 2001 V 17

P al29-al31

4 Степанов К В, Пирогов А В, Дикунец М А, Шпигун О А Получение фенилтиогидантоинов аминокислот для количественного анализа аминокислотного состава белков методом капиллярного электрофореза // Вестн Моек ун-та Серия Химия 2005 Т 46 № 6 С 395-399

Типография МГУ 117574, Москва, ул Академика Хохлова, д 11 Заказ № 603 Тираж 100 экз

4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Метод капиллярного электрофореза

2.1.1. Способы проведения электросепарационных методов

2.1.2. Перемещение ионов в электрическом поле

2.2. Электроосмотический поток 11 2.2.1. Управление электроосмотическим потоком

2.3. Капиллярный зонный электрофорез

2.3.1. Регулирование селективности за счёт добавок

2.3.2. Выбор буферного раствора

2.3.3. Поверхностно-активные вещества

2.4. Мнцеллярная электрокинетическая хроматография

2.5. Способы детектирования фенолов и аминокислот

2.5.1. Спекгрофотометрическое (СФ) детектирование фенолов

2.5.2. Флуоресцентное детектирование фенолов

2.5.3. Прочие методы детектирования фенолов

2.5.4. Прямое фотометрическое детектирование аминокислот

2.5.5. Косвенное фотометрическое детектирование аминокислот

2.5.6. Масс-спектрометрическое детектирование аминокислот

2.5.7. Флуоресцентное детектирование производных аминокислот

2.6. Способы ввода пробы

2.7. Динамическое модифицирование капилляров

2.7.1. Низкомолекулярные ПАВ

2.7.2. Полимерные ПАВ

2.8. Определение фенолов в виде анионов методом КЭ с обращением ЭОЛ

2.9. Определение фенолов в виде нейтральных соединений методами МЭКХ

2.10. Хроматографические методы определения фенолов

2.11. Методы количественного определения и разделения аминокислот

2.11.1. Планарная хроматография

2.11.2. Сорбционная колоночная хроматография

2.11.2. Распределительная колоночная хроматография

2.11.3. Ионообменная хроматография

2.11.4. Вытеснительная ионообменная хроматография на ионообменных смолах

2.11.5. Элюентная (проявительная) хроматография на ионообменных смолах

2.11.6. Лигандообменная хроматография

2.11.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.11.8. Обращённо-фазовая жидкостная хроматография

2.11.9. Ион-парная хроматография

2.12. Детектирование аминокислот и их производных 58 2.12.1. Детектирование производных аминокислот

2.13. Электрофоретические методы разделения аминокислот и их производных 63 2.13.1. Методы разделения призводных аминокислот с использованием МЭКХ

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Приборы

3.2. Расходные материалы

3.3. Реактивы

3.4. Вспомогательные растворы для анализа аминокислот

3.5. Методы подготовки капилляров к работе

3.5.1. Подготовка нового капилляра к работе

3.5.2. Ежедневная подготовка капилляра к работе

3.5.3. Подготовка к работе модифицированных капилляров

3.6. Стандартные растворы аминокислот

3.6.1. Стандартный раствор 18 аминокислот

3.6.2. Прочие стандартные растворы аминокислот и вспомогательных веществ

3.7. Электрофоретические буферные растворы для разделения производных аминокислот

3.8. Условия разделения ФТК-производных аминокислот и определения фенилтиомочевины

3.9. Проведение дериватизации

3.9.1. Методика гидролиза белка

3.9.2. Предварительная очистка гидролизата

3.9.3. Удаление аммония

3.9.4. Получение ФТК-аминокислот

3.9.5. Экстракция фенилизотиоцианата

3.9.6. Получение ФТГ-аминокислот

3.9.7. Очистка от ионогенных примесей

3.10. Условия разделения ФТГ-производных аминокислот

3.11. Вспомогательные методики

3.11.1. Определение фенилизотиоцианата

3.11.2. Определение дифенилтиомочевины

3.11.3. Определение потерь аминокислот при экстракции

3.12. Обработка данных 83 3.12.2. Сбор и обработка хроматографических данных 83 3.12.2. Расчёт параметров logD и logD'

3.13. Проведение количественного определения 84 3.13.1. Использование стандартной добавки триптофана к гидролизату 84 3.13.1. Использование смеси 16 аминокислот в качестве стандартной добавки

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Электрофоретическое определение фенолов в виде анионов

4.1.1. Выбор состава и рН буферного раствора

4.1.2. Выбор концентрации полимеров

4.1.3. Влияние добавок органического растворителя 91 в буферном растворе

4.1.4. Исследование спектральных характеристик фенолов

4.1.5. Селективность определения

4.1.6. Эффективность разделения и влияние рН

4.1.7. Свойства использованных полимеров и их влияние на удерживание фенолов

4.1.8. Интервал линейности и пределы обнаружения

4.2. Определение фенолов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии

4.2.1. Выбор состава и рН буферного раствора

4.2.2. Выбор концентрации ионенов

4.2.3. Влияние добавок органического растворителя в буферном растворе

4.2.4. Сравнение селективностей разделения ЮЗ

4.2.5. Определение времён миграции фенолов по параметру гидрофобности Ханша

4.3. Определение аминокислот 107 4.3.1. Получение ФТГ-производных аминокислот

4.4. Электрофоретическое разделение аминокислот

4.4.1. Выбор оптимальных условий разделения

4.4.2. Идентификация аминокислот

4.4.3. Использование «стандартов времён миграции»

4.4.4. Использование параметра гидрофобности logD' для предсказания времён миграции

5. ВЫВОДЫ

Актуальность работы. Высокоэффективный капиллярный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) являются динамично развивающимися методами химического анализа, позволяющими в короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение компонентов сложных смесей. По принципу разделения метод МЭКХ близок к обращённо-фазовой жидкостной хроматографии, в связи с этим представляется интересным применить современную методологию расчётов, применяемую в жидкостной хроматографии, для расчёта и оптимизации условий разделения сложных органических соединений.

Вместе с тем сильная зависимость от температуры, электропроводности буферного раствора и раствора пробы и наличия ионогенных примесей в пробе приводят к недостаточной воспроизводимости времён миграции как в МЭКХ, так и в капиллярном зонном электрофорезе. В работе рассмотрено использование различных подходов к снижению и компенсации влияния различных эффектов, связанных с электропроводностью на стадии подготовки проб.

Цель работы состояла в изучении процессов разделения сложных смесей органических соединений методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с последующим анализом реальных объектов на примере протеиновых гидролизатов (сывороточного альбумина и рыбной муки), а также определением примесей фенолов в фармацевтической продукции. Цели работы предусматривали решение следующих задач:

1. Разделение фенолов и ФТГ-аминокислот на модельных смесях.

2. Оптимизацию условий разделения смесей и идентификацию электрофоретических пиков.

3. Разработку схемы проведения реакций дериватизации аминокислот с получением смеси производных, пригодных для анализа методом МЭКХ, в том числе и для анализа реальных объектов (гидролизатов).

4. Предложение и сравнение методов надёжной идентификации пиков в многокомпонентных смесях на примере аминокислот и фенолов.

Научная новизна. На примере аминокислот предложены и сравнены методы расчёта времён миграции, в том числе с применением стандартов времён миграции, позволяющие однозначно идентифицировать пики в многокомпонентных смесях. Для идентификации пиков использованы параметры гидрофобности, применённые к временам миграции с вычетом скорости электроосмотического потока. В случае с фенолами продемонстрирована высокая корреляция параметра log/5 с временем миграции фенолов, разделяемых методом МЭКХ при обращенном электроосмотическом потоке, на основании полученных данных был рассчитан параметр logP я-гексилрезорцина из полученных электрофоретических данных. В ходе экспериментов с аминокислотами показано, что расчётные значения параметра logD также имеют корреляцию с временем миграции для наборов ФТГ-аминокислот сходной структуры, но не обеспечивают достаточной точности идентификации электрофоретических пиков. Для аминокислот рассмотрены и сравнены варианты с одним и двумя стандартами времён миграции. Для определения аминокислот в реальных объектах предложена схема дериватизации, позволяющая разделять аминокислоты методом МЭКХ при работе с реальными объектами, включающая очистку от ионогенных соединений и аммония, а также методы количественного определения с использованием стандартной добавки триптофана или группы из 16 аминокислот.

Практическая значимость работы. В ходе работы предложены подходы к надёжной идентификации разделяемых соединений. Предложены методы использования стандартов времён миграции. На примере фенолов продемонстрировано использование параметров гидрофобности для определения последовательности выхода пиков на электрофореграмме. В случае аминокислот предложены эффективные численные методы с использованием одного и двух стандартов времён миграции. Проведено сравнение численных методов идентификации аминокислот и методов с использованием параметров гидрофобности. Предложена схема проведения реакций дериватизации, позволяющая работать с широким кругом реальных объектов. В работе сравнены различные условия проведения реакций дериватизации и очистки смеси производных для получения минимальных количеств побочных продуктов, также приводится оценка потерь аминокислот при проведении дериватизации. Методика опробована при анализе гидролизатов протеина и рыбной муки.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международных конференциях «Euroanalysis XII» (Дортмунд, Германия, 2002); SBS 2003 «100 years of chromatography» (Москва, Россия, 2003), научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии.

Публикации результатов. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов докладов.

5. ВЫВОДЫ

1. Предложены и сравнены два способа идентификации пиков фенилтиогидантоин (ФТГ)-аминокислот, разделяемых в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии. Показано, что вариант с идентификацией ФТГ-аминокислот по стандартам времён миграции позволяет идентифицировать электрофоретические пики всех 16 разделяемых аминокислот. Способ идентификации аминокислот с учётом гидрофобности имеет ряд преимуществ, поскольку в случае применения к ФТГ-производным неполярных аминокислот позволяет предсказывать порядок выхода электрофоретических пиков, однако применение корреляционного уравнения позволяет провести ещё более точный расчёт.

2. На примере фенолов показана высокая корреляция параметра гидрофобности log/5 с временем миграции для группы ФТГ-аминокислот - аланина, лейцина (изолейцина), триптофана и фенилаланина, коэффициент корреляции с параметром logP R2 = 0,99.

3. Предложен метод получения фенилтиогидантоинов 16 аминокислот для анализа методом капиллярного электрофореза в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии. Способ получения производных включает реакцию гидролизата белка с фенилизотиоцианатом с последующей циклизацией фенилтиокарбаминатных производных в трифторуксусной кислоте (схема представлена). Предложены дополнительные процедуры очистки фенилтиокарбаминатов и фенилтиогидантоинов аминокислот от побочных продуктов и ионогенных примесей. Способ опробован при анализе гидролизатов протеина и рыбной муки.

4. Предложены способы количественного определения аминокислот с использованием внутреннего стандарта - ФТГ-триптофана и стандартных добавок других аминокислот на стадии дериватизации.

1. Руководство по капиллярному электрофорезу. Под. ред. A.M. Волощука. Научный совет РАН по хроматографии. М.: Наука, 1996,231 с.

2. K.D. Lukacs, J.W. Jorgenson. Capillary zone electrophoresis: effect of physical parameters on separation efficiency and quantitation. // J. High Res. Chromatogr., 1985, V. 8, No. 8, P. 407-411.

3. S. Terabe, T. Isemura. Ion-exchange electrokinetic chromatography with polymer ions for the separation of isomeric ions having identical electrophoretic mobilities. // Anal. Chem., 1990, V. 62, No. 6, P. 650-659.

4. W.J. Lambert, D.L. Middleton. pH hysteresis effect with silica capillaries in capillary zone electrophoresis. // Anal. Chem., 1990, V. 62, No. 15, P. 1585-1587.

5. Th.P.E.M. Verheggen, A.C. Schoots, F.M. Everaerts. Feasibility of capillary zone electrophoresis with suppression of electroendosmotic flow in completely closed systems. //J. Chromatogr. A, 1990, V. 503, No. 1, P. 245-255.

6. S. Terabe. Electrokinetic chromatography: an interface between electrophoresis and chromatography. // Trends Anal. Chem., 1989, V. 8, No. 4, P. 129-134.

7. L.E. Vera-Avila, M. Caude, R. Rosset. Ion pair chromatography. II. Resolution of amino acids and ethylene and aromatic carboxylic acids mixtures. // Analusis, 1982, V. 10, No. 1,P. 43-49.

8. Каталог Agilent Inc., Rapid Screening of Amino Acids in Food by CE-ESI-MS.

9. Y.F.Cheng, N.J.Dovichi. Subattomole amino acid analysis by capillary zone electrophoresis and laser-induced fluorescence. // Science, 1988, V. 242, No. 2, P. 562-564.

10. A. Zemann, D. Volgger. Separation of priority pollutant phenols with coelectroosmotic capillary electrophoresis. // Anal. Chem., 1997, V. 69, No. 16, P. 3243-3250.

11. A. Rembaum, W. Baumgartner, A. Eisenberg. Aliphatic ionenes. // J. Polym. Sci. Polym. Lett. Ed., 1968, V. 6, No. 3, P. 159-171.

12. Y. Zhao, C.E. Lunte. pH-mediated field amplification on-column preconcentration of anions in physiological samples for capillary electrophoresis. // Anal. Chem., 1999, V. 71, No. 18, P. 3985-3991.

13. T. Okada. Non-aqueous capillary electrophoretic separation of Bronsted acids as heteroconjugated anions. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 771, No. 1-2, P. 275-284.

14. T.Zhao, X.-B. Hu, J.-K. Cheng, X.-R.Lu. P-sulfonic calyx4.arene as running buffer additive in electrokinetic chromatography. // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 1998, V. 21, No. 20, P. 3111-3124.

15. M.R.Lehman, C.D.Thompson, C.S.Marvel. Quantenary ammonium salts from halogenated alkyl dimethylamines. III. Omega-bromo-heptyl-, -octyl-, -nonyl- and -decyl-dimethylamines. // J. Am. Chem. Soc., 1933, V. 55, No. 5, P. 1977-1981.

16. D. Puig, D. Barcel6. Determination of phenolic compounds in water and waste water. // Trends Anal. Chem., 1996, V. 15, No. 8, P. 362-375.

17. D. Kaniansky, E. Kr6mova, V. Madajova, M. Masar, J. Marak, F.I. Onuska. Determination of nitrophenols by capillary zone electrophoresis in a hydrodynamically closed separation compartment. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 772, No. 1-2, P. 327-337.

18. A.J. Zemann. Sub-minute separations of organic and inorganic anions co-electroosmotic capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 787, No. 1-2, P. 243-251.

19. X. Liu, H. Frank. Separation of chlorophenols by capillary zone electrophoresis. The influence of pH of the electrophoretic buffer on selectivity. // J. High Res. Chromatogr., 1998, V. 21, No. 5, P. 309-314.

20. I. Rodriguez, M.I. Turnes, M.H. Bollain, M.C. Mejuto, R. Cela. Determination of phenolic pollutants in drinking water by capillary electrophoresis in the sample stacking mode. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 778, No. 1-2, P. 279-288.

21. F.B. Erim. Effect of cationic polymer on the separation of phenols by capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A, 1997, V. 768,No. 1, P. 161-167.

22. F.B. Erim. Separation of phenols by capillary electrophoresis in a polyethyleneimine-coated capillary. // J. Microchem., 1997, V. 57, No. 3, P. 283-287.

23. P.G. Muijselaar, H.A. Cleassens, C.A. Cramers. Migration behavior of monovalent weak acids in micellar electrokinetic chromatography. Mobility model versus retention model. // J. Cromatogr. A, 1997, V. 765, No. 2, P. 295-306.

24. D.J. Bailey, J.G. Dorsey. pH effects on micelle-water partitioning determined by micellar electrokinetic chromatography. // J. Cromatogr. A, 1999, V. 852, No. 2, P. 559-571.

25. A. Versari, G.P. Parpinello, S. Galassi. Analysis of selected phenolic compounds by MECC and HPLC. A comparative study. // Ann. Chim., 1999, V. 89, No. 11-12, P. 901-910.

26. Y. He, H. Lee. Separation of structural homologues of alkylphenols and isomers of 4-nonylphenol by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A, 1996, V. 749, No. 1-2, P. 227-236.

27. S. Kar, P. Dasgupta. Measurement of phenols on a loop-supported liquid film by micellar electrokinetic chromatography and direct UV detection. // J. Chromatogr. A, 1996, V. 739, No. 1-2, P. 379-387.

28. M.C. Boyce, I.J. Bennett. Complimentary role of micellar electrokinetic capillary chromatography and high performance liquid chromatography in the separation of plant phenolics. // Anal. Lett., 1996, V. 29, No. 10, P. 1805-1815.

29. C.-E. Lin, W.-C. Lin. Migration behavior of dichlorophenols for replicate separations without replenishment of buffer electrolyte in micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Chromatogr. A, 1996, V. 732, No. 2, P. 361-367.

30. A.L. Gray, J.T. Hsu. Novel sulfonic avid-modified starburst dendrimer used as a pseudostationary phase in electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A, 1998, V. 824, No. 1,P. 119-124.

31. C. Liu, Т. Ma, B. Zhang, P. Wang, X. Fang, H. Li. Separation of alkylphenols in oil field water by micellar electrokinetic chromatography. // Sepu, 1999, V. 17, No. 3, P. 236-239.

32. C.P. Ong, C.L. Ng, N.C. Chong, H.K. Lee, S.F.Y. Li. Retention of eleven priority phenols using micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A, 1990, V. 516, No. 1,P. 263-270.

33. C.A. Groom, J.H.T. Luong. Sulfobutylether-|}-cyclodextrin-mediated capillary electrophoresis for separation of chlorinated and substituted phenols. // Electrophoresis, 1997, V. 18, No. 7, P. 1166-1172.

34. J.-B. Kim, K. Otsuka, S. Terabe. On-line sample concentration in micellar electrokinetic chromatography with cationic micelles in a coated capillary. // J. Cromatogr. A, 2001, V. 912, No. 2, P. 343-352.

35. Z. Yuan, S. Zhang. // Anal. Lett., 1998, V. 26, P. 614-620.

36. S. Takeda, S.-I. Wakida, M. Yamane, K. Higashi, S. Terabe. Effect of the polar groups on anionic surfactant on migration behavior in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 781, No. 1-2, P. 11-16.

37. C.E. Lin, Y.T. Chen, T.Z. Wang. Separation of benzenediamines, benzenediols and aminophenols in oxidative hair dyes by micellar electrokinetic chromatography using cationic surfactants. //J. Chromatogr. A, 1999, V. 837, No. 1-2, P. 241-252.

38. W. Ding, J.S. Fritz. Separation of neutral compounds and basic drugs by capillary electrophoresis in acidic solution using laurylpoly(oxyethylene) sulfate as an additive. //Anal. Chem., 1998, V. 70,No. 9, P. 1859-1865.

39. Т. Zhao, X. Ни, J. Cheng, X. Lu. Use of ealix4.arene to separate positional isomers in capillary electrophoresis. //Anal. Chim. Acta, 1998, V. 358, No. 9, P. 263-268.

40. M.M. Bushey, J.W. Jorgenson. Separation of dansylated methylamine and dansylated methyl-D3-amine by micellar electrokinetic capillary chromatography with methanol-modified mobile phase. // Anal. Chem., 1989, V. 61, No. 5, P. 260-264.

41. P. Mubmann, K. Levsen, W. Radeck. Gas-chromatographic determination of phenols in aqueous sample after solid phase extraction. // Fresenius J. Anal. Chem., 1994, V. 348, No. 10, P. 654-659.

42. B. Bennett, B.F.J. Bowler, S.R. Larter. Determination of C0-C3 alkylphenols in crude oils and waters. //Anal. Chem., 1996, V. 68, No. 20, P. 3697-3702.

43. M.A. Crespin, E. Ballesteros, M. Gallego, M. Valcarcel. Trace enrichment of phenols by on-line solid-phase extraction and gas chromatographic determination. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 757, No. 1-2, P. 165-172.

44. E. Ballesteros, M. Gallego, M. Valcarcel. On-line preconcentration and gas chromatographic determination of N-methylcarbamates and their degradation products in aqueous samples. // Environ. Sci. Technol., 1996, V. 30, No. 6, P.2071-2077.

45. M.-L. Bao, K. Barbieri, D. Burrini, O. Griffini, F. Pantani. Traces determination of phenols in water by solid phase extraction followed by pentafluorobenzoylation. // Ann. Chim. (Rome), 1996, V. 86, No. 7-8, P. 343-356.

46. M.A. Crespin, E. Ballesteros, M. Gallego, M. Valcarcel. Automatic preconcentration of chlorophenols and gas chromatographic determination with electron capture detection. //Chromatographia, 1996, V. 43, No. 11-12, P. 633-639.

47. K. Kadokami, K. Sato, M. Koga, R. Shinohara. Simultaneous determination of 285 chemicals in water at ppt levels by GC-ion trap mass spectrometry. // Anal. Sci. Technol., 1995, V. 8, No. 4, P. 771-778.

48. R. Tyagi. Determination of substituted phenols in water by gas chromatography / mass spectroscopy after solid phase extraction. // Fres. Environ. Bull., 1995, V. 4, No. 12, P. 751-759.

49. M.L. Bao, F. Pantani, K. Barbieri, D. Burrini, 0. Griffini. Direct acetylation followed by solid-phase disk extraction and GC-ITDMS for the determination of trace phenols in water. // Chromatographic 1996, V. 42, No. 3-4, P. 227-233.

50. J.J. Mangas, M.P. Gonzalez, R. Rodriguez, D. Blanco. Solid-phase extraction and determination of trace aroma and flavour components in cider by GC-MS. // Chromatographia, 1996, V. 42, No. 1-2, P. 101-105.

51. A. Geissler, H.F. Scholer. Gaschromatographic determination of phenol, methyl-phenols, chlorophenols, nitrophenols and nitroquinones in water at 0.1 pg-Г1. // Water Research, 1994, V. 28, No. 10, P. 2047-2053.

52. J. Ruana, I. Urbe, F. Borrull. Determination of phenols at the ng/1 level in drinking and river wares by liquid chromatography with uv and electrochemical detection. // J. Chromatogr. A, 1993, V. 655, No. 2, P. 217-226.

53. T.J. Clark, J.E. Bunch. Quantitative determination of phenols in mainstream smoke with solid-phase microextraction gas chromatography - selected ion monitoring mass spectrometry. // J. Chromatogr. Sci., 1996, V. 34, No. 6, P. 272-275.

54. R. Lega, G. Ladwig, O. Meresz, R.E. Clement, G. Crawford, R. Salemi, Y. Jones. Quantitative determination of organic priority pollutants in sewage sludge by GC/MS. // Chemosphere, 1997, V. 34, No. 8, P. 1705-1712.

55. L.E. Vera-Avila, J. Reza, R. Covarrubias. On-line trace enrichment, cleanup and determination of the most hydrophilic priority pollutant phenols in water. // Int. J. Environ. Anal. Chem., 1996, V. 63, No. 4, P. 301-314.

56. E. Pocurull, R.M. Marce, F. Borrull. Determination of phenolic compounds in natural waters by liquid chromatography with ultraviolet and electrochemical detection after on-line trace enrichment. //J. Chromatogr. A, 1996, V. 738, No. 1, P. 1-9.

57. M.T. Galceran, 0. Jauregui. Determination of phenols in sea water by liquid chromatography with electrochemical detection after enrichment by using solid-phase extraction cartridges and disks. // Anal. Chim. Acta, 1995, V. 304, No. 1, P. 75-84.

58. K.A. Massey, D.L. Van Engelen, I.M. Warner. Determination of carbaryl and its primary metabolite, 1-naphthol, by reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorometric detection. // Talanta, 1995, V. 42, No. 10, P. 1457-1463.

59. S. Dupeyron, M. Astruc, M. Marbach. Automated solid-phase extraction for routine determination of phenol and chlorophenols at trace level in water by high-performance liquid chromatography. // Analusis, 1995, V. 23, No. 9, P. 470-473.

60. L.V. Perez-Arribas, M.E. Leon-Gonzalez, L.M. Polo-Diez. Phenol determination by HPLC using an ion chromatography column and inverse least squares analysis of partially resolved peaks. // Analusis, 1994, V. 22, No. 7, P. 369-372.

61. V. Coquart, M.-C. Hennion. Trace-level determination of polar phenolic compounds in aqueous samples by high-performance liquid chromatography and on-line preconcentration on porous graphitic carbon. // J. Chromatogr. A, 1992, V. 600, No. 2, P. 195-201.

62. B. Paterson, C.E. Cowie, P.E. Jackson. Determination of phenols in environmental waters using chromatography with electrochemical detection. // J. Chromatogr. A, 1996, V. 731, No. 1-2, P. 95-102.

63. X.B.Chen, J.H.Pagella, M.L.Bakker, O.Parra. Determination of aromatic metabolites in ruminant urine by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B: Biomed. Appl., 1996, V. 682, No. 2, P. 201-208.

64. E. Lederer, M. Lederer. Chromatography: A review of principles and applications. Elsevier Pub. Co., Amsterdam, 1953,460 pp.

65. H.R. Bentley, J.K. Whitehead. Water-miscible solvents in the separation of amino-acids by paper chromatography. // Biochem. J., 1950, V. 46, P. 341-345.

66. C.H. de Verdier, G. Agren. Paper chromatographic analysis of amino acids and peptides in tissue extracts and enzyme hydrolyzed proteins. // Acta Chem. Scand., 1948, V. 2, P. 783-796.

67. E.F, McFarren. Buffered filter paper chromatography of the amino acids. // Anal. Chem., 1951, V. 23, No. 1, P. 168-174.

68. P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991,544 с.

69. D.W.Armstrong, М.McNeely. Use of micelles in the TLC separation of polynuclear aromatic compounds and amino acids. // Anal. Lett., 1979, V. 12, No. A12, P. 1285-1291.

70. D.A. Hall, A. Tiselius. The separation of small amounts of aromatic amino acids. // Acta Chem. Scand., 1951, V. 5, P. 854-858.

71. G.Schramm, J.Primosigh. Die Adsorptionsanalyse der Aminosauren. II. Gruppenseparation der kompletten Mischung. // Ber. dtsch. chem. Ges., 1944, B. 77, S. 417-426.

72. H. Beyer, U. Schenk. Determination of dinitrophenylamino acids in structural proteins by chromatography on nylon powder columns. II. The ether-soluble dinitrophenylamino acids. // J. Chromatogr. A, 1969, V. 39, P. 482-490.

73. Т. Yamabe, N. Takai, H. Nakamura. Analysis of Dns-amino acids by liquid chromatography. I. Selection of optimum mobile phase composition for separation of Dns-amino acids on polyvinyl acetate del. // J. Chromatogr. A, 1975, V. 104, No. 2, P. 359-365.

74. A.J.P. Martin, R.L.M. Synge. A new form of chromatogram employing two liquid phases. //Biochem. J., 1941, V. 35, P. 1358-1368.

75. S. Moore, W.H. Stein. Chromatography of amino acids on starch columns. Separation of phenylalanine, leucine, isoleucine, methionine, tyrosine, and valine. // J. Biol. Chem., 1948, V. 176, No. 1, P. 337-365.

76. S. Moore, W.H. Stein. Chromatography of amino acids on starch columns. Solvent mixtures for the fractionation of protein hydrolysates. // J. Biol. Chem., 1949, V. 178, No. 1,P. 53-77.

77. S.M. Partridge, R.G. Westall. Displacement chromatography on the synthetic ion-exchange resins. 1. Separation of organic bases and amino-acids using cation-exchange resins. // Biochem. J., 1949, V. 44, P. 418-428.

78. S.M. Partridge. Displacement chromatography on the synthetic ion-exchange resins. 4. The isolation of glucosamine and histidine from a protein hydrolysate. // Biochem. J., 1949, V. 45, P. 459-463.

79. S.M. Partridge, R.C. Brimley. Displacement chromatography on the synthetic ion-exchange resins. 7. Separations using a strongly basic resin. // Biochem. J., 1951, V.49, P. 153-157.

80. S. Moore, W.H. Stein. Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. // J. Biol. Chem., 1951, V. 192, No. 2, P. 663-681.

81. S.Moore, D.H. Spackman, W.H. Stein. Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. An improved system. // Anal. Chem., 1958, V. 30, No. 7, P. 1185-1190.

82. D.H. Spackman, W.H. Stein, S. Moore. Automatic recording apparatus for use in chromatography of amino acids. // Anal. Chem., 1958, V. 30, No. 7, P. 1190-1206.

83. D.H. Simmonds, R.J. Rowlands. Automatic equipment for simultaneous determination of amino acids separated on several ion exchange resin columns. // Anal. Chem, 1960, V. 32, No. 2, P. 259-268.

84. E.A. Peterson, Н.А. Sober. Variable gradient device for chromatography. // Anal. Chem, 1959, V. 31, No. 5, P. 857-862.

85. В.Г. Мальцев, Б.Г. Беленький, M.JI. Александров. Оптимизация автоматического хроматографического анализа аминокислот. // Журн. аналит. химии, 1978, Т. 33, № 4, С. 798-807.

86. S. Moore, W.H. Stein. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. // J. Biol. Chem, 1954, V. 211, No. 2, P. 907-913.

87. R.W. Hubbard. Studies in accelerated amino acid analysis. // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1965, V. 19, No. 6, P. 679-685.

88. J.V. Benson, Jr., M.J. Gordon, J.A. Patterson. Accelerated chromatographic analysis of amino acids in physiological fluids containing glutamine and asparagine. // Anal. Biochem, 1967, V. 18, No. 2, P. 228-240.

89. В. Hemmasi, E. Bayer. Ligand-exchange chromatography of amino acids on cooper-, cobalt-, and zinc-chelex 100. // J. Chromatogr. A, 1975, V. 109, No. 1, P. 43-48.

90. B.A. Даванков, Дж, Навратил, X. Уолтон. Лигандообменная хроматография. М.: Мир, 1990,294 с.

91. Химия привитых поверхностных соединений. Под. ред. Г.В.Лисичкина. М.: Физматлит, 2003,592 с.

92. W.R. Melander, C.Horvath. Mechanistic study on ion-pair reversed-phase chromatography. //J. Chromatogr. A, 1980, V. 201, P. 211-224.

93. M. Koller, H. Eckert. Derivatization of peptides for their determination by chromatographic methods. //Anal. Chim. Acta, 1997, V. 352, No. 1-3, P. 31-59.

94. S. Moore, W. Stein. Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. //J. Biol. Chem., 1948, V. 176, No. 1, P. 367-388.

95. G.R.Rhodes, V.K.Boppaa. High-performance liquid chromatographic analysis of arginine-containing peptides inbiological fluids by means of a selective post-column reaction with fluorescence detection. // J. Chromatogr., 1988, V. 444, P. 123-131.

96. T. Teerlink. Derivatization of posttranslationally modified amino acids. // J. Chromatogr. B: Biomed. Appl., 1994, V. 659, No. 1-2, P. 185-207.

97. H. Bruckner, M. Lupke. Use of chromogenic and fluorescent oxycarbonyl chlorides as reagents for amino acid analysis by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A, 1995, V. 697, No. 1-2, P. 295-307.

98. S. Terabe, Y. Ishihama, H. Nishi, T. Fukuyama, K. Otsuka. Effect of urea addition in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A, 1991, V. 545, No. 2, P. 359-368.

99. K.C. Waldron, N.J. Dovichi. Sub-femtomole determination of phenylthiohydantoin amino acids: Capillary electrophoresis and thermooptical detection. // Anal. Chem, 1992, V. 64, No. 13, P. 1396-1399.

100. M. Albin, R. Weinberger, E. Sapp, S. Moring. Fluorescence detection in capillary electrophoresis evaluation of derivatizing reagents and techniques. // Anal. Chem, 1991, V. 63, No. 5, P. 417-422.

101. S. Oguri, K. Yokoi, Y. Motohase. Determination of amino acids by high-performance capillary electrophoresis with on-line mode in-capillary derivatization. // J. Chromatogr. A, 1997, V. 787, No. 1-2, P. 253-260.

102. ACD/LC Simulator, version 8.0, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto ON, Canada, www.acdlabs.com, 2004.

103. A.V. Pirogov, M.M. Platonov, O.A. Shpigun. Polyelectrolyte sorbents based on aliphatic ionenes for ion chromatography. // J. Chromatogr. A, 1999, V. 850, No. 1-2, P. 53-63.

104. A.V. Pirogov, O.V. Krokhin, M.M. Platonov, Ya.I. Deryugina, O.A. Shpigun. Ion-chromatographic selectivity of polyelectrolyte sorbents based on some aliphatic and aromatic ionenes. // J. Chromatogr. A, 2000, V. 884, No. 1-2, P. 31-39.

105. A.V. Pirogov, W. Buchberger. Ionene-coated sulfonated silica as a packing material in the packed-capillary mode of electrochromatography. // J. Chromatogr. A, 2001, V. 916, No. 1-2, P. 51-59.

106. Справочник по аналитической химии. Под ред. Лурье Ю. М.: Госхимиздат 1979г. 480 с.

107. S.G. Dmitrienko, E.N. Myshak, L.N. Pyatkova. An empirical relationship between distribution coefficients of phenols by polyurethane foams and their octanol-water distribution constants and p Ka values. I I Talanta, 1999, V. 49, No. 2, P. 309-318.

108. Z. Li, X. Zhang, Y. Chen, Y. Zhong. Hydrophobic interaction of ionenes in aqueous solution. // Macromolecules, 1992, V. 25, No. 1, P. 450-470.