Иммуноглобулинсвязывающие белки Yersinia pseudotuberculosis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

G034G6538

На правах рукописи

Сидорин Евгений Викторович

Иммуноглобулинсвязывающие белки Yersinia pseudotuberculosis

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2009

003466538

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Соловьева Т.Ф.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Монастырная М.М. доктор биологических наук, Лукьянова О.Н.

Ведущая организация:

Дальневосточный государственный университет

Защита состоится «2Я» апреля 2009 г. в /Z часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте совета http://piboc.dvo.ru

Автореферат разослан » Л'-w 20091

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор химических наук, старший научный сотрудник

Авилов С.А.

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия патоген-хозяин - одна из важнейших задач биологии, иммунологии и медицины, лежащая в основе разработки эффективных средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. На разных стадиях развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на защитные системы организма хозяина использует макромолекулы, наделенные определенным видом активности. Сопоставление биологической активности отдельных видов макромолекул, продуцируемых патогенными бактериями, с тем эффектом, который они вызывают в организме хозяина, позволяет характеризовать функцию этих биополимеров как факторов патогенности. Одним из важных факторов патогенности бактерий, способных вызывать различные заболевания животных и человека, являются иммуноглобулинсвязывающие белки (ИСБ). Считается, что неиммунное связывание иммуноглобулинов (Ig) с клетками через ИСБ защищает бактерии от действия комплемента, уменьшает их опсонизацию и фагоцитоз, что, в итоге, позволяет микроорганизмам избежать воздействия иммунной системы хозяина. Кроме того, многие из известных ИСБ являются иолифункциональными, они могут связываться с различными компонентами сыворотки крови животных и человека, а также непосредственно взаимодействуют с иммунокомпетеитными клетками макроорганизма.

На сегодняшний день некоторые из известных бактериальных ИСБ находят применение в медицине. Их способность с высокой аффинностью связывать широкий спектр классов и подклассов Ig разных видов животных и человека позволяет успешно использовать их в качестве вторых антител в нммунодиагностических тест-снстемах для обнаружения специфических иммунных комплексов. Благодаря вышеупомянутым свойствам ИСБ, иммобилизованные па твердых носителях, применяются в качестве сорбентов при лечении пациентов, которым показано выведение из организма аутоантител, иммунных комплексов или иммуноглобулинов. ИСБ также находят широкое применение в иммунохимии и иммунологии как один из специфических инструментов исследования.

С 50-х годов прошлого столетия накоплен большой экспериментальный материал, касающийся строения и свойств ИСБ грамположительных бактерий, а также механизмов их взаимодействия с Ig разных видов животных н человека. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены структура и функциональные свойства ИСБ стафилококков, стрептококков группы А, С, G н пептококков. Однако остается неизученным вопрос взаимосвязи между структурой ИСБ и их Ig-связывающей активностью.

В грамотрицательных бактериях также идентифицированы белки, способные связывать иммуноглобулины неиммунным образом, но известно о них значительно меньше. Во многих случаях они очень плохо охарактеризованы. Для этих белков, в отличие от ИСБ грамположительных бактерий, отсутствуют данные о молекулярной структуре и строении их комплексов с Ig.

Объектом нашего исследования являются ИСБ грамотрицательных бактерии Yersinia pseudotuberculosis (семейство Enterobacteriaceae). У. pseudotuberculosis относятся к факультативным психрофилам и характеризуются большим разнообразием условий обитания. Эти бактерии могут вести как сапрофитический, так и паразитический образ жизни. После орального заражения Y. pseudotuberculosis вызывают кишечные формы нсевдотуберкулеза, в тяжелых случаях протекающего с генерализацией процесса, а также системные заболевания с повреждением внутренних органов, с постинфекционными артритами. Иерсшшозы имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека и регистрируются повсеместно. Следует особо подчеркнуть, что большая часть болеющих псевдотуберкулезом — дети в возрасте до 14 лет. Они составляют более 65% от общего числа заболевших. В то же время патогенез, эпидемиология и диагностика заболевания изучены и разработаны недостаточно.

Из всего вышесказанного следует, что изучение ИСБ грамотрицательных бактерий, в частности ИСБ Y. pseudotuberculosis, остается актуальной задачей, которая имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы было изучение белков У. pseudotuberculosis, способных связывать IgG животных и человека неиммунным способом. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи: 1) изучить зависимость экспрессии ИСБ в клетках Y. pseudotuberculosis от условий роста бактерий и присутствия плазмид вирулентности; 2) выделить ИСБ в индивидуальном виде; 3) изучить структуру и физико-химические свойства ИСБ; 4) изучить Ig-связывающую активность этих белков.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что грамотрицательные бактерии Г. pseudotuberculosis, способны связывать IgG животных и человека неиммунным способом. Показано влияние условий роста бактерии на ее Ig-связывающую активность.

Впервые выделены из Y. pseudotuberculosis три ИСБ с молекулярными массами 7, 14 п 16 кДа (ИСБ-7, ИСБ-14 и ИСБ-16, соответственно). Белки ИСБ-7 и ИСБ-16 были идентифицированы с белками, ранее предсказанными на основе анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК Y. pseudotuberculosis: гипотетическим протеином (код A7FNV7, UniProt) и шапероном Skp (код A7FFH8, UniProt) соответственно. Для ИСБ-14 и ИСБ-16 показано, что сайты их связывания на молекуле IgG в основном локализованы в области Fc-фрагмента.

Впервые построены модели пространственных структур ИСБ-7 и ИСБ-16, а также комплексов этих белков с IgGl человека. Определены вероятностные сайты связывания этих белков на Fc- и Fab-фрагмептах тяжелых цепей IgGl человека.

Полученные результаты вносят вклад в понимание патогенеза псевдотуберкулезнон инфекции и имеют большое значение в разработке вопросов, связанных с терапией псевдотуберкулеза.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на Международной конференции по проблемам иерсиниозов и других актуальных инфекций, Санкт-Петербург, 2000; III Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы», Москва, 2004; Международной конференции «Химия, структура и функция бномолекул», Минск, 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 212 цитируемых работ.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.х.н. Соловьевой Т.Ф. за неоценимую помощь в обсуждении результатов экспериментов и написании данной работы. За помощь в выполнении отдельных разделов работы и ценные советы автор благодарит к.х.н. Г.А. Набережных и к.ф-м.н. Г.Н. Лихацкую. Автор признателен всем сотрудникам Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета, а также сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавших участие в работе: профессору д.б.н. А.В. Реунову, к.б.н. Л.А. Лапшиной, к.х.н. П.С. Дмитренку, инженеру-электронщику С.Д. Анастюку, н.с. НЛО. Ким, к.х.н. Е.В. Лейченко (Клышко), к.б.н. О.В. Черникову, и сотрудникам Института биоорганической химии имени акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва) к.х.н. И.В. Назимову и к.х.н. Р.Х. Зигашпнну.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Общая характеристика иммуноглобулинсвязывающей активности К pseudotuberculosis

С помощью флуоресцентной микроскопии было найдено, что обработка клеток псевдотуберкулезного микроба неиммунными IgG кролика, меченными флуоресцеином, приводит к связыванию иммуноглобулинов на поверхности клеток (рис. 1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что на поверхности бактериальных клеток присутствуют белки, способные связывать иммуноглобулины кролика, которые не являются антителами к поверхностным антигенам Y. pseudotuberculosis. Взаимодействие IgG с клетками Y. pseudotuberculosis было подтверждено электронной микроскопией бактерий, обработанных IgG кролика, меченными золем золота (рис. 2).

Рис. 1. Связывание IgG кролика, меченных Рис. 2. Взаимодействие IgG кролика,

ФИТЦ, с клетками К pseudotuberculosis. меченных коллоидным золотом, с

клетками У. pseudotuberculosis.

В лизате клеток Y. pseudotuberculosis методом вестерн блота ИСБ были обнаружены в виде нескольких диффузных полос, расположенных в области от 7 до 20 кДа (рис. 3, а, б, дорожка 1). Как видно из рисунка 3, клеточные оболочки (КО) бактерий псевдотуберкулеза, полученные методом Нюрминен, содержат в основном те же активные белки, которые обнаруживаются в лизате клеток (рис. 3, а, б, дорожка 2).

Рис. 3. Электрофореграмма белков Y. pseudotuberculosis в градиентном 10-25%-ном ДСН-ПААГ (а) и вестерн блот тех же образцов, выявленных конъгатом IgG кролика с пероксидазой хрена (б). 1 - лизат целых клеток в 2% ДСН; 2 - клеточные оболочки бактерии, полученные методом Нюрминен (схема, КО-1) и растворенные в 2% ДСН. Показано положение белков-маркеров с молекулярными массами в кДа.

Полученные данные позволяют считать, что ИСБ Y. pseudotuberculosis связаны с клеточной оболочкой и могут быть локализованы на поверхности бактерии, что характерно для большинства ИСБ грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Кроме того, при выращивании бактерий на жидкой питательной среде Ig-связывающая активность была зафиксирована методом иммуноферментного анализа (ИФА) также в культуральной среде (рис. 6 б, колонки 1, 2).Это говорит о том, что помимо ИСБ,

кДа а

9467433020148-

1 2

б

1 2

закрепленных на поверхности бактериальных клеток, присутствует секретируемая форма ИСБ.

2. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Y. pseudotuberculosis

Известно, что содержание в бактериях белков, способных связываться с иммуноглобулинами, может зависеть от состава питательной среды и фазы роста клеток. Анализ кривых связывания бактерий псевдотуберкулеза, взятых из культур разного возраста, с IgG кролика, меченными пероксидазой хрена (IgG-ПХ), показал, что на стационарной фазе роста активность бактерий примерно в 1,5 раза выше, чем на логарифмической фазе (рис. 4). В дальнейшей работе при сравнительном изучении активности бактерий, выращенных в разных условиях, использовали клетки псевдотуберкулезного микроба, находящиеся в фазе стационарного роста.

0,4 -I

0,3'

£

о m 0,2-

чг

0,1 ■

0,

Рис. 4. Зависимость Ig-связываюгцей ^^^^ активности клеток К pseudotuberculosis от

3 --,-,-, фазы роста. Стационарная фаза (1),

2000 4000 6000 8000 логарифмическая фаза (2), контроль - клетки разбавление конъюгата Е- coli>не взаимодействующие с IgG (3).

Эффективность связывания клеток с кролика значительно варьировала в зависимости от способа выращивания бактерий (твердая или жидкая среда) и состава среды культивирования (рис. 5). Бактерии, растущие на поверхности агара, по сравнению со свободноживущими бактериальными клетками, менее активно связывали Добавление в культуральную среду углеводов (галактозы и глюкозы), в качестве источников углерода, приводит к увеличению активности клеток псевдотуберкулеза. В наибольшей степени, этот эффект наблюдался для клеток, выращенных на глюкозосодержащей среде (рис. 5, колонка

3).

Рис. 5. Влияние способа культивирования бактерий и состава питательной среды на Ig-связываюшую активность Y. pseudotuberculosis. Клетки выращены на питательном агаре (1), питательном бульоне (2), питательном бульоне с добавлением глюкозы (3), питательном бульоне с добавлением галактозы (4).

9,7 0,6 Щ 9,5 8 0,4 < 9.3 0.2 9,1 О

Рис.6. Влияние значений рН среды на экспрессию в клетках и секрецию в культуральную среду ИСБ Y. pseudotuberculosis. Бактерии выращены при 4°С (а), культуральная среда (б), 1 - рН 6,0, 2 - рН 7,2.

На иммуноглобулинсвязывающую активность клеток Y. pseudotuberculosis влияет также рН среды. Бактерии, культивированные при рН 6,0. связывали больше коиыогата IgG-ПХ по сравнению с клетками, выращенными при рП 7,2 (рис. 6 а, колонки 1, 2). Интересно, что при обеих величинах рН происходила секреция ИСБ в культуральную среду (рис. б б, колонки 1,2).

Существенное влияние на lg-связывающую активность бактерии псевдотуберкулеза оказывает температура. Как видно из рисунка 7, самой высокой активностью обладали бактерии, растущие при низкой температуре (4°С). При увеличении температуры культивирования бактерий от 4°С до 20°С происходит снижение способности клеток связывать IgG. Особенно резко активность клеток падала при их культивировании при температуре 37°С.

Температура роста бактерий также влияет на содержание ИСБ в лизатах клеток. Действительно, по данным вестерн блога ИСБ присутствуют в клетках, культивированных при 4°С, и не обнаруживаются в бактериях, растущих при 37°С (рис. 8, дорожки 2 и 3, 5 и 6).

Рис. 7. Иммуноглобулинсвязывающая активность двух штаммов Y. pseudotuberculosis: с плазмидами pYV48 и pVM82 (темный столбец) и бесплазмидного (светлый столбец), выращенных при 4°, 20°, 37°С.

Количество ИСБ, экспрессируемых клетками, также зависит от значения рН культуральной среды. При этом содержание ИСБ в клетках, культивированных при рН 6.0, увеличивается по сравнению с бактериями, выращенными при рН 7,2 (рис. 8, дорожки I и 2, 4 и 5). Согласно полученным данным наблюдается корреляция между ^-связывающей активностью бактериальных клеток (рис. 6) и содержанием в них ИСБ (рис. 8).

кДа а б

Рис. 8. Вестерн блот лизатов клеток изогенных штаммов Y. pseudotuberculosis. Штамм с плазмидами pYV48 и pVM82 (а), выращенный при 4°С, рН 6,0 (1); 4°С, рН 7,2 (2); и- «мы _, „ 37°С, рН 7,2 (3). Бесплазмидный штамм (б),

в----¿L _ * выращенный при 4°С, рН 6,0 (4); 4°С, рН 7,2 (5);

37°С, рН 7,2 (6). Показано положение белков-12з is б маркеров с молекулярными массами в кДа.

Как известно, многие факторы патогенности иерсиний кодируются плазмидой вирулентности pYV48, а также плазмидой pVM82. Сравнительный анализ бактерий двух изогенных штаммов Y. pseudotuberculosis, бесплазмидного и с двумя плазмидами (pYV48 и pVM82), выращенных при одинаковых условиях, показал, что их Ig-связывающая активность отличается незначительно. Даже при 37°С, температуре необходимой для экспрессии генов плазмид вирулентности, оба штамма демонстрируют одинаковую lg-связывающую активность (рис. 7). Влияние температуры и значения рН среды на активность бактерий и содержание ИСБ в клетках одинаково для обоих изогенных штаммов (рис. 8 а, б). Следовательно, экспрессия ИСБ в бактериях псевдотуберкулеза не зависит от присутствия в клетках плазмид вирулентности. По-видимому, биосинтез этих белков Y. pseudotuberculosis, как и большинства известных ИСБ бактерий, детерминируется хромосомными генами.

3. Выделение ИСБ У. pseudotuberculosis

Для выделения ИСБ была разработана схема, включающая несколько стадий (схема). На первой стадии микробную массу Y. pseudotuberculosis энергично перемешивали в фосфатпо-солевом буферном растворе, рН-7,2 со стеклянными бусами. Экстракт, полученный после центрифугирования суспензии клеток (схема, Экстракт-1), по данным дог анализа содержал активные белки и в дальнейшем был использован для выделения ИСБ-7. Остаток клеток (схема, Ос-1), согласно дот анализу, также содержал активные белки и был использован для получения клеточных оболочек (КО).

Схема выделения ИСБ

* КОХ - катионообменная хроматография.

Клеточные оболочки получали двумя разными способами. Первый способ основан на разрушении пептидогликанового слоя бактерий лтоцимом по методу Нюрминен (схема, КО-1), второй - на дезинтеграции клеток методом «замораживания и оттаивания» с последующей обработкой ультразвуком (схема, КО-2). По данным ДСН-ПААГ-электрофореза и блоттинга клеточные оболочки КО-1 и КО-2 содержали набор ИСБ с молекулярными массами в области от 7 до 20 кДа (рис. 3 а, б, дорожка 1; рис. 14 а, б, дорожка 1, соответственно). Полученные КО-1 и КО-2 обрабатывали 50 мМ Тп.ч-ПП буферным раствором, рН 8,0 (схема, Экстракт-2 и -3). Щелочной буферный раствор в обоих

случаях извлекает большой набор белков, не обладающих Ig-связывающей активностью (рис. 10 а, б, дорожка 1).

Остатки КО, Осадок-2 и Осадок-3 (схема), экстрагировали натрий-ацетатными буферными растворами, рП 4,0 и рН 5,0, соответственно. Кислый буферный раствор извлекает из осадков 2 и 3 в основном активные белки (схема, Экстракт-р11 4.0 и Экстракт-рН5). Экстракт-рП 4,0 содержит преимущественно ИСБ с электрофоретической подвижностью в области 14 кДа (ИСБ-14) (рис. 10 а, б, дорожки 2 и 3), а Экстракт-рП 5,0 -ИСБ с электрофоретической подвижностью в области 16-17 кДа (ИСБ-16) (рис. 14 а. б, дорожка 2).

Рис. 10. Электрофореграмма образцов, полученных при выделении ИСБ-14. в градиентном 10-25%-ном ДСН-ПАЛГ (а) и вестерн блот тех же препаратов, выявленных коныогатом IgG кролика с пероксидазой хрена (б): 1 - Экстракт-2; 2 - Экстракт-рН 4,0: 3 -Экстракт-рН 4,0 после прогревания при 100°С в буферном растворе для образцов: 4 - ИСБ-14, элюированный с катионнообменной колонки Source 15S; 5 - ИСБ-14 после хранения в течение 7 дней в 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0. Показано положение белков-маркеров с молекулярными массами в кДа.

Выделение ИСБ-14 из Экстракта-рН 4,0 проводили с помощью катионообменнои хроматографии при умеренном давлении на колонке Source 15S, уравновешенной натрий-ацетатным буферным раствором, рН 4.0. В условиях фракционирования активный белок элюируется с кагионообменника раствором высокой ионной силы (0,6 M NaCl) в виде одного несимметричного пика (рис. 11 ) и обнаруживается на блоте в виде единственной полосы с подвижностью в области 14 кДа (рис. 10 б, дорожка 4).

— 100 Рис. 11. Катионообменная

хроматография белков Экстракта-рН -ю 4,0 на колонке Source 15S (0.46x10 см), уравновешенной 50 мМ натрий. so g ацетатным буферным раствором, рН z 4,0. Элюция градиентом

_ 40 Р концентраций NaCl в рабочем 35 буферном растворе. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Объем ~20 фракций - 0,5 мл. Отмечены границы объединения активных

■ - 0 фракций.

50

Для дальнейшей очистки ИСБ-14 от низкомолекулярных соединений (ниже 5 кДа) была использована гель-фильтрация на колонке IliTrap Desalting, уравновешенной натрий-ацетатным буферным раствором, рН 4.0 (рис. 12). Полученный ИСБ был гомогенен по данным ДСН-ПААГ электрофореза, масс-спектрометрии и N-концевого аминокислотного анализа. В качестве N-концевой аминокислоты ИСБ содержал глицин. Полученный в результате проведенного выделения образец ИСБ содержал до 6 % моносахаридов.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

т*

30

-Г"

35

Рис. 12. Гель-фильтрация белков активной фракции ИСБ-14 (рис. 11) на колонке IliTrap Desalting (1,6x2,5 см), уравновешенной 50 мМ натрий-ацетатным буферным раствором, pll 4,0. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Объем фракций - 0,5 мл. Отмечены границы объединения активных фракций.

Первый этап выделения ИСБ-16 из Экстракта-рН 5,0 также проводили с помощью катионообменной хроматографии при умеренном давлении на колонке Source I5S, уравновешенной натрий-ацетатным буферным раствором, рН 5,0. В условиях хроматографии происходит концентрирование активных белков и разделение их на две фракции (рис. 13, пики 1 и 2). Во фракции 1, которая элюируется с колонки при концентрации NaCl от 0,2 М до 0,4 М, в основном присутствует ИСБ-16 (рис. 14, а, б, дорожка 3). Фракция 2, собранная при повышении концентрации до 0,6 М NaCl, содержит ИСБ с молекулярными массами 10 и 14 кДа и небольшое количество ИСБ-16 (рис. 14, а, б, дорожка 4).

Рис. 13. Катионообменная

хроматография белков Экстракта-рН 5,0 на колонке Source 15S (0,46x10 см), уравновешенной 50 мМ натрий-ацетатным буферным раствором, рН 4,0. Элюция градиентом концентраций NaCl в рабочем буферном растворе. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Объем фракций - 0,5 мл. I - первая суммарная фракция, содержащая активные белки; 2 - вторая суммарная фракция, содержащая активные белки. Отмечены границы объединения активных фракций.

60 о

40 Щ

),0 10,5

15,0

Ж шщ тМ 1

- ЩИр |||| ***»

кЛа

-130-■100-72-55-40-33-24-•17-11-

«es

Рис. 14. Электрофореграмма образцов, полученных при выделении ИСБ-16, в градиентном 10-25%-ном ДСН-ПААГ (а) и вестерн блот тех же образцов, выявленных с помощью кролика,

конъюгированных с пероксидазой хрена (о). 1 - КО-2; 2 - Экстракт-рП 5,0; 3 - Фракция 1; 4 - Фракция 2; 5 - белки-маркеры; 6 -Фракция 1 после рехроматографии на катионообменной колонке.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

Фракцию 1 рехроматографировали на катионообменной колонке (рис. 14, а, дорожка 6). В качестве дополнительного шага очистки ИСБ-16 был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C8. В условиях обратнофазовой гидрофобной хроматографии ИСБ элюируется одним основным

пиком при концентрации ацетонитрила 40% (рис. 15). Полученный ИСБ-16 был гомогенен по данным ДСН-ПААГ - электрофореза, Ы-концевого аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.

38

33 с 1

28

1 23 ' I

S 18 • сч r

" 13. 8 ■ (I J Г

3 • .9 . __^S —' I 1-.-,-.—

110 100

70

ео 50 40

■ зо

8.3

Рис. 15. Обратнофазовая ВЭЖХ на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4,6x150 мм) образца (рис. 14, а, дорожка 6), полученного после рехрома-тографии фракции 1 на катионообменной колонке (не приведена). Элюция градиентом концентраций ацетонитрила от 15 до 100% в 0,1% трифторуксусной """ кислоте. Отмечены границы

активной фракции.

Для выделения ИСБ-7 был использован Экстракт-1 (схема). Он был фракционирован на катионообменной колонке Source 15 S, уравновешенной натрий-ацетатным буферным раствором, pH 5,0. При этом большая часть белков, содержащихся в образце, не связывалась с катионообменником и не обладала Ig-связывающей активностью (рис. 17 а). Фракции, содержащие активные белки, были элюированы с колонки при увеличении концентрации NaCl от 0,6 M до 1,6 М. При этом максимальная активность наблюдалась во фракциях, элюированых 1 M NaCl (рис. 17 б, Фр-А).

кДа

94- - 67—-- 43- . ЗО- ...........

20-

-SE.

14 ' - Щ

1 2

кДа

зо

oo

72

55

-40

-33

-24

-1 7

-11

Рис. 16. Электрофореграммы белков Y. pseudotuberculosis в градиентньк 10-25%-ном (а) и 12,5-25%-ном (б) ДСН-ПААГ. 1,5- белки маркеры; 2 - Экстракт-1; 3 - Экстракт-1 после прогревания в течение 7 мин при 100°С в растворе для образцов; 4 - Фр-А после рехроматографии на катионообменной колонке и гель-фильтрации.

Рис. 17. Катионообменная хроматография белков Экстракта-1 на колонке Source 15S, уравновешенной 50 мМ натрий-ацетатным буферным раствором, рН 5,0: (а) Элюция градиентом концентраций NaCl в рабочем буферном растворе; (б) Участок кривой, соответствующий выходу белков, элюируемых NaCl; Фр-А - суммарная фракция активных белков (заштрихованная область).

О 5 10 15 20 2530 3540 45 50 55

41 О 45 47 49

Суммарная фракция активных белков (Фр-А, рис. 17 б) была рехроматографирована на катионообменной колонке с последующей гель-фильтрацией на колонке HiTrap Desalting, уравновешенной натрий-ацетатным буферным раствором, рН 5,0. В результате был получен образец, содержащий ИСБ-7 и сопутствующие белки (рис. 16, дорожка 4), не обладающие Ig-

связывающей активностью. Дальнейшее фракционирование этого образца проводили на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C8. В условиях обратнофазовой гидрофобной хроматографии

Рис. 18. Обратнофазовая ВЭЖХ на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4,6x150 мм) образца (рис. 16, дорожка 4), полученного после рехрома-тографии на катионообменной колонке и гель-фильтрации Фр-А. Элюция в градиенте концентраций ацетонитрила от 15 до 100% в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Стрелкой указано положение фракции, содержащей активный белок.

ИСБ-7 элюировался при концентрации ацетонитрила 41% (рис. 18). Полученный ИСБ-7 был гомогенен по данным масс-спекгрометрии и N-концевого аминокислотного анализа.

4. Химические и физико-химические характеристики ИСБ-14

По данным времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (ВП МАЛДИ МС) молекулярная масса ИСБ-14 в 50 мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН-4,0 составила 14305±20 Да. В этом буфере ИСБ-14 может храниться длительное время, не теряя активности и не образуя агрегатов. В буферных растворах с нейтральным или щелочным значением рН, а также в растворах с низкой ионной силой изолированный ИСБ-14 имеет склонность к агрегации. В масс-спектре ИСБ-14, растворенного в деионизованной воде, хорошо видны олигомерные структуры: димер, тример и тетрамер (рис. 19).

Рис. 19. Масс-спектр ВП МАЛДИ МС ИСБ-14 в деионизованной воде.

По данным ДСН-ПААГ-электрофореза и вестерн блота агрегаты, которые образовались при хранении образца ИСБ-14 в Tris-HCl, рН 8,0 в течение 7 дней, не обладали Ig-связывающей активностью (рис. 10 а, б, дорожки 4 и 5). Агрегация с потерей активности происходит также при переводе ИСБ-14 в буферный раствор, содержащий неионный детергент Triton Х-100 (данные не приведены). ИСБ-14 не изменяет подвижности в условиях электрофореза и сохраняет способность связывать иммуноглобулины после прогревания в течение 7 мин при 100°С в буферном растворе для образцов, содержащем 2 % ДСН (рис. 10 а, б, дорожка 2 и 3).

По данным аминокислотного анализа методом Капальди был рассчитан индекс полярности ИСБ-14, он равен 55,3 %. Такая высокая полярность характерна для большинства водорастворимых белков (47 ± 6 %).

Для изучения пространственной структуры ИСБ-14 был использован метод КД-спектроскопии. Спектр КД исследуемого белка в пептидной области (рис. 20, а) имеет широкую полосу при длине волны 220 нм, характерную для p-структуры. Присутствие а-спиральных участков в молекуле ИСБ-14 подтверждается наличием максимума при длине волны 204 нм. Смещение спектра в дальнюю УФ-область (от 190 до 200 нм) говорит о присутствии большого количества неупорядоченной структуры. Содержание элементов вторичной структуры в молекуле ИСБ-14 рассчитывали из спектров КД по методу Провенчера. Согласно расчетным данным, молекула ИСБ-14 содержит 6% а-спиралей, 29% Р-структуры, 19% )3-изгибов и 46% неупорядоченной структуры. Таким образом, ИСБ-14 относится к смешанным а/р или а + р белкам.

Рис. 20. Спектры КД ИСБ-14 в 50мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,0, снятые в дальней (а) и ближней (б) УФ-областях.

В ближней УФ-области (от 300 до 250 нм) спектра КД ИСБ-14 (рис. 20 б) наблюдается интенсивная положительная полоса с большой амплитудой (до 18 ед.) и максимумами при 280 и 286 нм, что говорит о наличии в белке остатков тирозина и триптофана соответственно. Форма КД-спектра позволяет сделать вывод, что белок обладает довольно жесткой третичной структурой. В то же время имеет место симметризация окружения ароматических аминокислотных остатков, о чем говорит наличие малого количества полос и симметричный вид спектральной кривой. Очевидно, структура белковой глобулы немного разрыхлена. Спектры КД снимали в 50 мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,0, в условиях, в которых белок наиболее устойчив.

5. Взаимодействие ИСБ-14 с IgG разных видов животных

С помощью метода капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) исследовали взаимодействие ИСБ-14 с IgG козы, быка и осла. С этой целью провели титрование IgG увеличивающимися концентрациями ИСБ-14. Смеси, полученные в каждой точке титрования, анализировали методом КЗЭ. На электрофореграммах они обнаруживались в виде одного пика, который отличался по времени миграции от пика свободного иммуноглобулина (рис. 21). Время миграции пика зависело от количества ИСБ-14, введенного в реакцию. Изменение времени миграции пика при повышении концентрации ИСБ-14 в реакционной смеси связано с изменением отношения заряд/масса в результате комплексообразования. Форма пика также зависела от концентрации ИСБ-14, добавленного к иммуноглобулину. При избытке в смеси иммуноглобулина (IgG:HCB-14, (5:1) моль/моль) анализируемый пик имел две вершины, что может свидетельствовать о высокой скорости ассоциации-диссоциации образующегося комплекса в условиях электрофореза.

130110-во. 7050. 3010-10 <

zJL

Рис. 21 Определение взаимодействия ИСБ-14 Y. pseudotuberculosis с IgG козы методом капиллярного зонного электрофореза. Электрофореграммы смеси IgG:HCB-14 при разных молярных соотношениях белков: 1:0 - красная линия, 5:1 - черная линия, 1:1 -синяя линия, 1:5 - зеленая линия.

В процессе титрования козы белком время миграции пика изменялось до некоторой величины, которая оставалась постоянной при дальнейшем увеличении концентрации ИСБ-14. Это говорит о достижении насыщения мест связывания на молекуле Стехиометрия комплекса в точке насыщения была равна 1:1 (моль/моль). По данным КЗЭ при титровании быка и осла белком ИСБ-14 также происходило образование комплекса, но точку насыщения определить не удалось, так как при увеличении концентрации ИСБ-14 в смеси ^0:ИСБ выше эквимолярной происходило образование преципитата.

Связывание ИСБ с зависит от значений рН реакционной среды. Как видно из рисунка 22, ИСБ-14 взаимодействует с кролика в узкой области значений рН (5-8), максимальное связывание наблюдается при рН 6,0.

1 м

< м

м

м

•

+

Рис. 22. Влияние pH на реакцию связывания ИСБ-14 с IgG кролика.

рн

Для того чтобы определить локализацию мест связывания ИСБ-14 на молекуле кролика, была изучена способность Бс-фрагмента кролика ингибировать взаимодействие между этими компонентами. С помощью конкурентного ИФА было показано, что

ингибнрование реакции связывания проходит на 92 ± 4 %. Полученные данные говорят о том, что ИСБ-14 Y. pseudotuberculosis, подобно большинству ИСБ других бактерии, связывается с Fc-фрагментом IgG.

По данным ВП МЛЛДИ масс-спектрометрин молекулярная масса ИСБ-16 составила 16102 ± 6 Да. В результате автоматического твердофазного секвеннровання по методу Эдмапа была установлена N-концевая аминокислотная последовательность ИСБ-16 (15 аминокислотных остатков): ADKIAIVNVSSIFQ.

С целыо дальнейшей идентификации ИСБ-16 методом изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) на непокрытом капилляре была определена его шоэлектрнческая точка (pl). IIa рисунке 23, а показано разделение смеси белков-маркеров с известными pi (многлобнн из сердца лошади (pi 6,8, 7,2), яичный лнзоцпм (pi 9,37) и исследуемого белка, а также график зависимости значений pi белков-маркеров от их времени выхода (рнс.23, б). С помощью калибровочного графика была рассчитана изоэлектрическая точка исследуемого белка, которая составила 9,23±0,09.

На основании экспериментально полученных характеристик белка (молекулярная масса, pi и N-концевая аминокислотная последовательность) с помощью программ Tagldent и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot ИСБ-16 был идентифицирован как белок-шаперон Skp (OmpII) )'. pseudottiberculosis (код UniProt A7FFII8). Приведенная в базе данных аминокислотная последовательность белка Skp )'. pseudotuberculosis была выведена из установленной нукпеотидной последовательности кодирующего его гена. При анализе нуклеотидной последовательности геномной ДНК Y. pseudotuberculosis не было обнаружено гена, который бы кодировал другой белок с идентичной N-концевой аминокислотной последовательностью.

6. Характеристика и идентификации 11С Ii-16 кДа

а

6,8

6

ле

2 X

СО

N <

21

МИН.

мин

м

Рис. 23. Разделение ИСБ-16 и

7,2

белков-маркеров

методом

изоэлектрического фокусирования в капилляре. Прядок выхода белков определяли с помощью детекции при длинах волн 280 им и 415 им (а). Калибровочный график для определения р1 (б).

мин

Для подтверждения полученных результатов, провели идентификацию ИСБ-16 методом пептидного фингерприпта с использованием ВП МАЛДИ масс-спектрометрии. С этой целью был получен триптический гидролизат белка. Па основании молекулярно-

массового распределения полученных фрагментов при помощи программы Mascot и базы данных белковых последовательностей Swiss-Prot белок ИСБ-16 также идентифицировали с предсказанным белком Skp У. pseudotuberculosis. Значение параметра достоверности результата идентификации (Score) равно 70, поэтому проведенную идентификацию можно считать достоверной.

Белок Skp У. pseudotuberculosis идентичен предсказанному Skp Yersinia pestis, степень его гомологии с Skp других видов иерсиний составляет 68-94%.

7. Взаимодействие ИСБ-16 кДа с кролика и человека

Способность ИСБ-16 взаимодействовать с кролика была исследована с помощью ИФА. С этой целью ИСБ-16, иммобилизовыванный на полистирольном планшете, титровали меченным пероксидазой хрена. Насыщаемость кривой связывания свидетельствует о специфичности реакции между ИСБ-16 и кролика (рис. 24 а).

Рис. 24. Кривые связывания lgG кролика, меченного пероксидазой хрена, с ИСБ-16 У. pseudotuberculosis (а). Ингибирование связывания ИСБ-16 с IgG человека Fc-фрагментом IgG человека (б).

Для определения локализации мест связывания ИСБ-16 на молекуле IgG использовали конкурентный ИФА. Было показано, что взаимодействие между ИСБ-16 и IgG человека ингибируется при добавлении в реакционную смесь Fc-фрагментов IgG человека (рис. 24, б). Полученные данные позволяют считать, что Fc-учаеток иммуноглобулина связывается с ИСБ-16 У. pseudotuberculosis. Нужно отметить, что максимальное ингибирование реакции связывания достигает 72 %. Возможно, другие участки молекулы IgG также могут участвовать во взаимодействии с ИСБ-16, как это раннее было показано для ИСБ из других микроорганизмов. Исходя из данных ингибирования, была рассчитана равновесная константа ассоциации ИСБ-16 с IgG человека (Д"„), величина которой составила 3,05 мкМ'1.

8. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-16 н его комплексов с Fc- и РаЬ-фрагмептамп IgGl человека

Для изучения строения комплекса ИСБ-16 и IgGl человека с помощью методов компьютерного моделирования была сконструирована его теоретическая модель. Поскольку к настоящему времени пространственная структура Skp У. pseudotuberculosis, с которым был идентифицирован ИСБ-16, не установлена, моделирование комплекса было начато с построения трехмерной структуры этого белка.

В качестве прототипа для построения модели пространственной структуры Skp У. pseudotuberculosis был выбран белок Skp Е. coli (код PDB 1U2M_C), структура которого

установлена рентгеноструктурным анализом. Степень идентичности аминокислотных последовательностей Skp )'. pseudotuberculosis и белка-прототипа составляет 65% (рис. 25, а). Теоретическая модель пространственной структуры Skp )'. pseudotuberculosis, полученная методом сравнительного моделирования с помощью сервера Swiss-Model, представлена па рисунке 25 б. Суперпозиция Са-атомов модели белка Skp )'. pseudotuberculosis и белка-прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения составляет 0.24 А. Величина потенциальной энергии молекулы Skp К pseudotuberculosis в вакууме составила -10443,9 кДж/моль. Таким образом, нами построена высокоточная модель пространственной структуры Skp Y. pseudotuberculosis.

Трехмерная структура Skp )'. pseudotuberculosis имеет характерную для мономера Skp Е. coli упаковку и консервативно расположенные [¡-структурированные участки. Как видно из рисунка 25 б, молекула включает два домена: компактный преимущественно f!-структурированный центральный домен (I), образованный N- и С-концевыми участками молекулы, и домен (2), который состоит из двух вытянутых а-спиралнзованных сегментов, образующих шпильку с концами в центральном домене. Расчет молекулярной поверхности и электростатического потенциала Skp показал, что на поверхности молекулы расположено достаточно много положительно и отрицательно заряженных участков.

Высокая точность полученной модели пространственной белка Skp (ИСБ-16) )'. pseudotuberculosis, с которым был идентифицирован ИСБ-16, позволила использовать ее для построения модели комплекса этого белка с Fc-фрагментом IgGl человека.

а

skp_Y. ps. 1U2M.C

skp_Y. ps 1U2M.C

skp_Y. ps 1U2M.C

QAADKIAIVNVSSIFQQLPAREAVAKQLENEFKGRATELQGMERDLQTKMQKLQRDGSTM

GMADKIAIVWMGSLFQQVAQKTOVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQ---SMK

********..*;***. ^ . .*;; ************* ** ***.**.*** *

KASDRTKLENEVMKQRETFSTKAQAFEQDNRRRQAEERNKILSRIQDAVKSVATKGGYDV AGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDL ^*******.;** **;**; ********^ **. ***.*;;;*** ******f

VIDANAVAYADS-SKDITADVLKQVK WDANAVAYNSSDVKDITÄDVLKQVK

Рис. 25. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка Skp У. pseudotuberculosis (serotype О:lb/ strain IP31758) код UniProt A7FFII8 и Skp E. coli код PDB 1U2M_C (а). На рисунке отмечены идентичные остатки (*), консервативные (:) и полуконсервативпые (.) замены. Ленточная диаграмма модели пространственной структуры Skp }'. pseudotuberculosis (б).

Теоретическая модель пространственной структуры комплекса Skp }'. pseudotuberculosis с тяжелыми цепями IgGI человека получена методом молекулярного докипга с помощью программы GRAMM 1.03. Структура тяжелых цепей А и Б (остатки 1452 для каждой цепи) была построена из фрагментов молекулы IgGI человека (коды PDB 1FC2, 2IG2, IOQO). Обнаружено, что наиболее выгодный сайт связывания исследуемого белка расположен в Fe фрагменте IgGI (рис. 26). Для анализа контактов из 100 рассчитанных комплексов выбран комплекс с наиболее низкой энергией, в котором Skp взаимодействует с

Fc фрагментом. Минимизация энергии комплекса проведена с потенциалом сил OPLS-AA в программе МОЕ. Величина потенциальной энергии комплекса составила -42330,17кДж/моль.

Анализ контактов показал, что структура комплекса стабилизирована 17 водородными и 3 ионными связями. Белок Skp образует связи с СН2 и СНЗ доменами тяжелых цепей А и Б (15 водородных и 3 ионных) и с углеводным участком (две водородные) Fc-фрагмента.

Молекулярный докинг Skp Y. pseudotuberculosis с тяжелыми цепями (А и Б) IgGl показал, что кроме доменов Fc-фрагмента во взаимодействии могут участвовать и домены (Сн1) тяжелых цепей Fab-фрагмента. Этим, по-видимому, объясняется то, что в эксперименте Fc-фрагмент не ингибирует связывание ИСБ-16 с lgG человека на 100%.

По данным ВГ1 МАЛДИ масс-спектрометрии молекулярная масса ИСБ-7 составила 7358 ± 10 Да. В результате автоматического твердофазного секвенировапия по методу Эдмана была установлена N-концевая аминокислотная последовательность ИСБ-7 (20 аминокислотных остатков): AKEITKQEAEANNYEK1GTV.

Для получения дополнительной характеристики ИСБ-7 была определена изоэлектрическая точка белка методом ИЭФ на непокрытом капилляре. С этой целью проведено разделение смеси белков-маркеров с известными pi и исследуемого белка и построен график зависимости значений pi белков-маркеров от их времени выхода. Используя калибровочный график (рис. 27), рассчитали изоэлектрическую точку исследуемого белка, которая составила 6,21±0,15.

На основе экспериментально полученных характеристик белка (молекулярная масса, pi и N-концевая аминокислотная последовательность), с помощью программ Tagldent и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot, ИСБ-7 был идентифицирован как гипотетический протеин Y. pseudotuberculosis с неизвестной функцией (код UniProt A7FNV7).

Поиск в компьютерных базах данных белковых структур обнаружил в различных энгеробактериях, включая бактерии рода Yersinia, гипотетические секреторные белки с неизвестной функцией гомологичные белку A7FNV7 Y. pseudotuberculosis. Эти белки были предсказаны на основе анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК соответствующих бактерий и объединены согласно структурной гомологии в семейство, обозначенное DUFI471 (база данных Pfam). Степень гомологии белка A7FNV7 Y. pseudotuberculosis с белками данного семейства других энтеробактерий варьирует от 93-100

Asp 2 - Lys 340

Рис. 26. Теоретическая модель комплекса Skp

)'. pseudotuberculosis, идентифицированного с ИСБ-16, с Fc фрагментом IgGl, полученная с помощью программы GRAMM. В виде ленточных диаграмм показаны структуры Fc-фрагмента (светло-серый цвет) и Skp (темно-серый цвет), отмечено положение Сн2 и СнЗ доменов Fc-фрагмента. Отмечены аминокислотные остатки, образующие ионные связи в комплексе. Эти остатки показаны в виде атомных моделей светлосерого цвета для Skp и темно-серого цвета для Fc-фрагмента.

9. Характеристика и идентификации ИСБ-7 кДа

% (с белками У. enterocolitica и У. pestis) до 60-75 % (с белками бактерий родов Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Serratia и Shigella).

PI

Рис. 27. Калибровочный график для определения р1 ИСБ-7 методом ИЭФ в капилляре.

Таким образом, ИСБ-7 У. pseudotuberculosis - первый белок, принадлежащий к семейству (код Pfam DUF1471) гипотетических энтеробактериальных белков с неизвестной функцией, который был выделен из бактериальной клетки и охарактеризован.

10. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-7 и его комплексов с Fc- и Fab-фрагментами IgGl человека

Вероятная первичная структура белка ИСБ-7 У. pseudotuberculosis (серотип О:lb) получена из базы данных UniProt код A7FNV7 на основании проведенной идентификации. Для построения модели пространственной структуры ИСБ-7 провели поиск белка-прототипа с помощью программы SPDBV 4.01. Степень идентичности аминокислотной последовательности ИСБ-7 У. pseudotuberculosis и прототипа - секретируемого белка STM0082 Salmonella typhimurium LT2 (код PDB 2JNA), пространственная структура которого в растворе была установлена методом ЯМР, составляет 47% (рис. 28 а). Методом сравнительного моделирования с помощью программы SPDBV 4.01 и сервера Swiss-Model была построена модель пространственной структуры ИСБ-7 (рис. 28 б).

ИСБ-7 2JNA

ИСБ-7 2JNA

48

50

MKLLKNMAVA LVISGLSFAA IAAKEITKQE AEANNYEKIG TVSTT---GE

MKKRIIAAA LLATVASFST LAAEQVSKQE ISHFKLVKVG TINVSQSGGQ

* * *

**

* *

ATSPMDVKKA LSKLADEKGG KYYVIIAERE KG-KFDADAE VYK

ISSPSDLREK LSELADAKGG KYYHIIAARE HGPNFEAVAE VYNDATKLEH ** * ** *** *** *** *** ** * ******

Рис. 28. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка У. pseudotuberculosis (serotype О: lb/ strain IP31758) (код UniProt A7FNV7) и секретируемого белка STM0082 S. typhimurium LT2 (код PDB 2JNA). Отмечены идентичные остатки (*) и полуконсервативные (.) замены (а). Теоретическая модель пространственной структуры белка ИСБ-7, построенная с помощью сервера SWISS-MODEL и показанная в виде ленточной диаграммы. Красным цветом на рисунке показаны а-спирали, желтым цветом (5-структура и голубым цветом - неупорядоченная структура (б).

Согласно этой модели, зрелый белок ИСБ-7 имеет компактную упаковку (39x22x22 А), содержит две а-спирали и три )5-стренда. Вторичная структура белка ИСБ-7 содержит 31,3% а-спирали, 34,3% Р-структуры и 34,4% неупорядоченной структуры. Суперпозиция Са-атомов модели белка ИСБ-7 и его прототипа, белка STM0082, показала,

что величина среднеквадратичного отклонения составляет 0,64 А. После минимизации энергии в вакууме с помощью программы GROMACS 3.3 и потенциалом сил GROMOS96 43В1 величина потенциальной энергии белка ИСБ-7 составила - 2082,45 кДж/моль.

ИСБ-7 по размеру и структуре имеет большое сходство с Ig-связывающим доменом С2 протеина G (SpG), иммуноглобулинсвязывающего белка стрептококков, который взаимодействует с Fc-фрагментом IgG человека (рис. 29). Суперпозиция пространственных структур ИСБ-7 и С2 домена SpG с использованием программы SPDBV 4.01 показала, что для 23 Са-атомов величина среднеквадратичного отклонения составляет 1,55 А. Как видно из рисунка 29, положение а-спирали и трех p-стрендов белка ИСБ-7 Y. pseudotuberculosis хорошо совпадают с расположением соответствующих элементов С2 домена SpG. С помощью суперпозиции ИСБ-7 и С2 домена SpG в составе его комплекса с Fc-фрагментом IgGl человека, структура которого известна, была получена модель комплекса белка ИСБ-7 с Fc-фрагментом (рис. 30). Структуру полученного комплекса оптимизировали с помощью программы МОЕ методом минимизации энергии с потенциалом сил AMBER99.

Рис. 29. Суперпозиция ИСБ-7 Y. pseudotuberculosis с С2 доменом SpG (код PDB 1FCC). Структура белков показана в виде ленточных диаграмм красного (SpG) и зеленого (ИСБ-7) цветов, (а) -вид на а-спираль SpG сверху, (б) - вид на а-спираль сбоку.

Рис. 30. Суперпозиция ИСБ-7 Y. pseudotuberculosis с С2 доменом SpG в его комплексе с Fc-фрагментом IgGl человека (код PDB 1FCC). Структуры тяжелых цепей А и Б Fc-фрагмента, С2 доменов SpG, белка ИСБ-7 показаны в виде ленточных диаграмм красного и синего, зеленого и розового, желтого цветов соответственно.

Дополнительно для моделирования комплекса ИСБ-7 Y. pseudotuberculosis с Fc-фрагментом IgGl человека был использован метод молекулярного докинга. С помощью программы GRAMM 1.03 с параметрами высокого разрешения (шаг сетки 1,7 А) были рассчитаны структуры 100 комплексов. Сравнительный анализ показал, что комплекс с наиболее низкой энергией соответствует комплексу, который был построен методом суперпозиции.

С помощью программы МОЕ был проведен анализ контактов в построенном комплексе и в кристаллических комплексах С2 домена SpG и Б домена протеина Л Staphylococcus aureus (SpA) с Fc-фрагментом IgGl человека. Сравнение контактов, стабилизирующих комплексы бактериальных белков с Fc-фрагментом IgGl человека, показало, что белок ИСБ-7 )'. pseudotuberculosis имеет только гидрофильные контакты с Fc-фрагмептом, комплекс SpG:Fc включает также в основном полярные контакты, в то время как SpA и Fc-фрагмент преимущественно удерживаются вместе за счет гидрофобных связен н нескольких полярных контактов (табл.).

Некоторые аминокислотные остатки Fc-фрагмепга, которые участвуют в образовании комплекса с ИСБ-7, также взаимодействуют с SpA (SF.R254, GLN311, ASN434) и SpG (SER254, GLU380, GLU382, TYR436, ASN434) (табл.).

Таблица

Взаимодействие Fc-фрагмента IgGl человека с ИСБ-7 К pseudotuberculosis, Б доменом SpA и _С2 доменом SpG._

Аминокислотные остатки, образующие контакты в комплексе

FC - SpA Fc - SpG Fc - ИСБ -7

Водородные связи

SER254 ОО PHE124 N LEU251 О LYS31. NZ GLN311 0Е1 THR27 0G1

SER254 OQ GLN129 NE2 ILE253 N GLU27.0Е2 GLN311 NE2 GLU3 0 0E1

ASN434 0D1 ASN130 ND2 SER254 • N GLU27.0E1 SER254 00 LYS55 NZ

LEU432 О TYR133 он GLU380 • 0Е1 LYS28.NZ GLU380 0Е1 LYS56 NZ

QLN311 NE2 ASN147 0D1 HIS433 .0 ASN35.ND2 GLU382 0Е2 LYS56.NZ

A5N434 ND2 ASN35.0D1 SER426 OQ LYS56 NZ

ASN434 • ND2 VAL39.0 ASN434 0 SER59 OG

ASN434 . 0D1 TRP43.NE1 ASN434 ND2 GLY67 0

TYR436 .0 ASN35.ND2 TYR436 OH LYS56 NZ

GLN138 . 0Е1 GLN32.NE2

Гидрофоб) ые контакты

МЕТ252 СЕ PHE124 CD1 ILE253 . CG1 TRP43.СВ _

ILE253 CD1 РНЕ132 СБ

LEU314 CD1 LEU136 CD2

ILE253 CD1 LEU153 CG

Ионные связи

_ GLU3S0 . ОЕ1 LYS2 8.NZ GLU380 0Е1 LYS56 NZ

GLU382 • 0Е2 LYS2 8.NZ GLU382 0E2 LYS56 NZ

Известно, что взаимодействие SpG с иммуноглобулином не ограничивается связыванием с Fc-фрагментом IgG. D процессе взаимодействия до 10% этого белка образует комплекс с Fab-фрагментом IgG человека (Сц1 доменом тяжелой цепи IgG). Структура этого комплекса известна, она была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа. Это позволило методом суперпозиции построить модель комплекса ИСБ-7 с Fab-фрагментом. Контакты, стабилизирующие комплексы белков с РаЬ-фрагментом, рассчитаны с помощью программы МОЕ. Несколько аминокислотных остатков Fab-фрагмента IgGl человека, которые участвуют в образовании комплекса с ИСБ-7, также взаимодействуют с SpG (данные не приведены).

Полученные с помощью компьютерного моделирования структуры ИСБ У. pseudotuberculosis и их комплексов с IgG имеют в определенной степени вероятностный характер и нуждаются в экспериментальном подтверждении.

ВЫВОДЫ

I. Впервые показано, что бактерии псевдотуберкулеза содержат белки, способные связывать иммуноглобулин G неиммунным способом. Биосинтез этих белков в клетке зависит от условий (температура, значения рН, состав среды) и фазы роста бактерий. Плазмнды вирулентности не оказывают влияния на экспрессию

иммуноглобулннсвязывающих белков, их биосинтез детерминируется хромосомными генами.

2. Из бактерий пссвдотуберкулеза выделены в индивидуальном виде три иммуноглобулннсвязывающих белка, ИСБ-7, ИСБ-14 и ИСБ-16, с молекулярными массами 7,36, 14,3 и 16,1 кДа соответственно.

3. Определены химические и физико-химические характеристики выделенных белков. Показано, что ИСБ-14 является гидрофильным белком с высоким индексом полярности (55,3%), который относится по данным КД-сиектроскопии к смешанным а/р протеинам, и имеет склонность к агрегации с потерей Ig- связывающей активности. Определены изоэлектрические точки н N-концевые аминокислотные последовательности для ИСБ-7 и ИСБ-16. С использованием масс-спектрометрии получено молекулярно-массовое распределение пептидов триптического гидролизата ИСБ-16.

4. На основе экспериментально полученных характеристик белков с использованием соответствующих баз данных ИСБ-7 и ИСБ-16 были идентифицированы с ранее предсказанными белками Y. pseudotuberculosis - гипотетическим секреторным протеином с неизвестной функцией (код A7FNV7, UniProt) и белком шапероном OmpH/Skp (код A7FFH8, UniProt) соответственно.

5. Установлено, что ИСБ Y. pseudotuberculosis, подобно большинству бактериальных ИСБ, специфически взаимодействуют с IgG разных видов животных и человека. Областью их связывания на молекуле IgG является Fc-фрагмент. Образование комплекса ИСБ-14 с IgG зависит от значения рН реакционной среды и максимальное связывание наблюдается при рН 6,0. Взаимодействие ИСБ-16 с IgG человека происходит с Ка равной 3,05 мкМ"'.

6. Методом компьютерного моделирования построены модели пространственных структур ИСБ-7 и ИСБ-16, а также их комплексов с IgG. Определены возможные межмолекулярные контакты, стабилизирующие эти комплексы. Показано, что ИСБ-7 н ИСБ-16 имеют общие сайты связывания на Fc- и Fab-фрагментах IgG человека с иммуноглобулинсвязывающими белками SpA и SpG грамположительных бактерий.

Работа поддержана грантом ДВО РАН № 09-Ш-05-150 и грантом р_восток_а № 09-0498576.

Основные публикации по теме диссертации

1. Набережных Г.А., Сидорин Е.В., Ким Н.Ю., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика иммуноглобулинсвязывающего белка из Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2002. Т.67, N 9. С. 1282-1288.

2. Сидорин Е.В., Ким НЛО., Лейченко Е.В., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Набережных Г.А., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика низкомолекулярного иммуноглобулинсвязывающего белка из Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2006. Т. 71, N 11. С. 1570-1576.

3. Набережных Г.А., Сидорин Е.В., Лапшина Л.А., Реунов А.В., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулннсвязывающих белков Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2006. Т. 71, N 11. С. 1577- 1582.

4. Сидорин Е.В., Знганшин Р.Х., Набережных Г.А., Лихацкая Г.Н., Трифонов Е.В., Анастюк С.Д., Черников О.В., Соловьева Т.Ф. Белок шаперон Skp из Yersinia pseudotuberculosis обладает способностью связывать иммуноглобулины G // Биохимия. 2009. Т. 74, N4. С. 501-514.

5. Сидорин Е.В., Набережных Г.А. Изучение иммуноглобулинсвязывакяцих белков из Yersinia pseudotuberculosis // II Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых: сб. тез. докл. - Владивосток, 1999. С. 138.

6. Набережных Г.А., Сидорин Е.В., Соловьева Т.Ф. Свойства иммуноглобулин-связывающих белков из Yersinia pseudotuberculosis И Международной конференции по проблемам иерсиниозов и других актуальных инфекций: сб. тез. докл. - С.-Петербург, 2000. С. 41-42.

7. Набережных Г.А. Сидорин Е.В., Дмитренок П.С. Характеристика мембранных белков из Yersinia pseudotuberculosis масс-спектрометрией MALDI-TOF // «Биоактивные вещества из морских макро - и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока»: сб. тез. докл. - Владивосток: Дальнаука. 2001. С. 130-131.

8. Набережных Г.А. Сидорин Е.В. Иммуноглобулинсвязывающие белки из Yersinia pseudotuberculosis И «Биоактивные вещества из морских макро - и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока»: сб. тез. докл. - Владивосток, 2001. С. 127-129.

9. Набережных ГА., Сидорин Е.В., Соловьева Т.Ф. Иммуноглобулин-связывающий белок из Yersinia pseudotuberculosis // III Съезд биохимического общества: сб. тез. докл. -Санкт-Петербург. 2002. С. 245.

10. Набережных Г.А., Сидорин Е.В, Портнягина О.Ю., Агафонова И.Г., Аминин Д.Л., Соловьева Т.Ф. Влияние иммуноглобулинсвязывающих белков из Yersinia pseudotuberculosis на активность макрофагов // Russian J. Immunol. 2004. Vol. 9. Suppl. 1,

11. Сидорин E.B., Набережных Г.А, Соловьева Т.Ф. Использование капиллярного электрофореза для изучения взаимодействия иммуноглобулина G с бактериальным иммуноглобулин-связывающим белком // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы.»: сб. тез. докл. — Москва. 2004. С. 236.

12. Набережных Г.А, Сидорин Е.В., Лапшина Л.А., Реунов А.В. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Yersinia pseudotuberculosis II Региональная научная конференция: сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С. 87.

13. Сидорин Е.В., Клышко Е.В., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Набережных Г.А., Иммуноглобулинсвязывающий белок из Yersinia pseudotuberculosis II Международная конференция «Химия, структура и функция биомолекул»: сб. тез. докл. - Минск. 2004.

Р. 173-174.

С. 89.

Соискатель

Сидорин Е.В.

Сидорин Евгений Викторович

Иммуноглобулинсвязывающие белки Yersinia pseudotuberculosis

Автореферат

Подписано в печать 24.03.09 Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 090101

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г. Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел.: 36-26-16, 55-95-31, www.kpacku.com

1. Введение.

2. Литературный обзор. Белки способные связывать иммуноглобулины неиммунным способом.

2.1. Иммуноглобулины. Структура и классификация.

2.2. Иммуноглобулинсвязывающие белки грамположительных бактерий.

2.2.1. Экспрессия иммуноглобулинсвязывающих белков, их структурная и функциональная гетерогенность.

2.2.1.1. Иммуноглобулинсвязывающие белки стафилококков.

2.2.1.2. Иммуноглобулинсвязывающие белки группы А стрептококков.

2.2.1.3. Иммуноглобулинсвязывающие белки стрептококков группы С и G.

2.2.1.4. Иммуноглобулинсвязывающие белки Peptostreptococcus niagnus.

2.2.2. Структура иммуноглобулинсвязывающих белков грамположительных бактерий.

2.2.2.1. Протеин A Staphylococcus aureus.

2.2.2.2. Протеин G групп С и G стрептококков.

2.2.2.3. Протеин L Peptostreptococcus magnus.

2.2.2.4. М-протеины стрептококков группы А.

2.2.3. Пространственные структуры комплексов протеина А стафилококков и протеина G стрептококков с IgG человека.

2.3. Иммуноглобулинсвязывающие белки грамотрицательных бактерий.

3. Результаты и обсуждения.

3.1. Общая характеристика иммуноглобулинсвязывающей активности Yersina pseudotuberculosis.

3.2. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Y. pseudotuberculosis.

3.3. Выделение ИСБ Y. pseudotuberculosis.

3.4. Изучение структуры и свойств ИСБ-14.

3.4.1. Химические и физико-химические характеристики ИСБ-14.

3.4.2. Взаимодействие ИСБ-14 с IgG разных видов животных.

3.5. Изучение структуры и свойств ИСБ-16.

3.5.1. Характеристика и идентификация ИСБ-16.

3.5.2. Взаимодействие ИСБ-16 кДа с IgG кролика и человека.

3.6. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-16 и его комплексов с молекулой IgG человека.

3.6.1. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-16.

3.6.2. Теоретическое предсказание структуры комплекса ИСБ-16 с Fc-фрагментом IgGl человека.

3.7. Характеристика и идентификация ИСБ-7.

3.8. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-7 и его комплексов с IgG человека.

3.8.1. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-7.

3.8.2. Теоретическое моделирование структуры комплекса ИСБ-7 с тяжелыми цепями Fc- и БаЬ-фрагментов IgG человека.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

5. Выводы.

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия патоген-хозяин - одна из важнейших задач биологии, иммунологии и медицины, лежащая в основе разработки эффективных средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. На разных стадиях развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на защитные системы организма хозяина использует макромолекулы, наделенные определенным видом активности. Сопоставление биологической активности отдельных видов макромолекул, продуцируемых патогенными бактериями, с тем эффектом, который они вызывают в организме хозяина, позволяет характеризовать функцию этих биополимеров как факторов патогенности. Одним из важных факторов патогенности бактерий, способных вызывать различные заболевания животных и человека, являются иммупоглобулннсвязывающие белки (ИСБ). Считается, что неиммунное связывание иммуноглобулинов (Ig) с клетками через ИСБ защищает бактерии от действия комплемента, уменьшает их опсонизацию и фагоцитоз, что, в итоге, позволяет микроорганизмам избежать воздействия иммунной системы хозяина. Кроме того, многие из известных ИСБ являются полифункциональными, они могут связываться с различными компонентами сыворотки крови животных и человека, а также непосредственно взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками макроорганизма.

На сегодняшний день некоторые из известных бактериальных ИСБ находят применение в медицине. Их способность с высокой аффинностью связывать широкий спектр классов и подклассов Ig разных видов животных и человека позволяет успешно использовать их в качестве вторых антител в иммунодиагностических тест-системах для обнаружения специфических иммунных комплексов. Благодаря вышеупомянутым свойствам ИСБ, иммобилизованные па твердых носителях, применяются в качестве сорбентов при лечении пациентов, которым показано выведение из организма аутоантител, иммунных комплексов или иммуноглобулинов. ИСБ также находят широкое применение в иммунохимии и иммунологии как один из специфических инструментов исследования.

С 50-х годов прошлого столетия накоплен большой экспериментальный материал, касающийся строения и свойств ИСБ грамположительных бактерий, а также механизмов их взаимодействия с Ig разных видов животных и человека. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены структура и функциональные свойства ИСБ стафилококков, стрептококков группы А, С, G и пептококков. Однако остается неизученным вопрос взаимосвязи между структурой ИСБ и их Ig-связывающей активностью.

В грамотрицательных бактериях также идентифицированы белки, способные связывать иммуноглобулины неиммунным образом, но известно о них значительно меньше. Во многих случаях они очень плохо охарактеризованы. Для этих белков, в отличие от ИСБ грамположительных бактерий, отсутствуют данные о молекулярной структуре и строении их комплексов с Ig.

Объектом нашего исследования являются ИСБ грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis (семейство Enterobacteriaceae). Y. pseudotuberculosis относятся к факультативным психрофилам и характеризуются большим разнообразием условий обитания. Эти бактерии могут вести как сапрофитический, так и паразитический образ жизни. После орального заражения Y. pseudotuberculosis вызывают кишечные формы псевдотуберкулеза, в тяжелых случаях протекающего с генерализацией процесса, а также системные заболевания с повреждением внутренних органов, с постинфекционными артритами. Иерсиниозы имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека и регистрируются повсеместно. Следует особо подчеркнуть, что большая часть болеющих псевдотуберкулезом - дети в возрасте до 14 лет. Они составляют более 65% от общего числа заболевших. В то же время патогенез, эпидемиология и диагностика заболевания изучены и разработаны недостаточно.

Из всего вышесказанного следует, что изучение ИСБ грамотрицательных бактерий, в частности ИСБ Y. pseudotuberculosis, остается актуальной задачей, которая имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.

5. Выводы

1. Впервые показано, что бактерии псевдотуберкулеза содержат белки, способные связывать иммуноглобулин G неиммунным способом. Биосинтез этих белков в клетке зависит от условий (температура, значения рН, состав среды) и фазы роста бактерий. Плазмиды вирулентности не оказывают влияния на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков, их биосинтез детерминируется хромосомными генами.

2. Из бактерий псевдотуберкулеза выделены в индивидуальном виде три иммуноглобулинсвязывающих белка, ИСБ-7, ИСБ-14 и ИСБ-16, с молекулярными массами 7,36, 14,3 и 16,1 кДа соответственно.

3. Определены химические и физико-химические характеристики выделенных белков. Показано, что ИСБ-14 является гидрофильным белком с высоким индексом полярности (55,3%), который относится по данным КД-спектроскопии к смешанным а//3 протеинам, и имеет склонность к агрегации с потерей Ig-связывающей активности. Определены изоэлектрические точки и N-концевые аминокислотные последовательности для ИСБ-7 и ИСБ-16. С использованием масс-спектрометрии получено молекулярно-массовое распределение пептидов триптического гидролизата ИСБ-16.

4. На основе экспериментально полученных характеристик белков с использованием соответствующих баз данных ИСБ-7 и ИСБ-16 были идентифицированы с ранее предсказанными белками Y. pseudotuberculosis - гипотетическим секреторным протеином с неизвестной функцией (код A7FNV7, UniProt) и белком шапероном OmpH/Skp (код A7FFH8, UniProt) соответственно.

5. Установлено, что ИСБ Y. pseudotuberculosis, подобно большинству бактериальных ИСБ, специфически взаимодействуют с IgG разных видов животных и человека. Областью их связывания на молекуле IgG является Fc-фрагмент. Образование комплекса ИСБ-14 с IgG зависит от значения рН реакционной среды и максимальное связывание наблюдается при рН 6,0. Взаимодействие ИСБ-16 с IgG человека происходит с Ка равной 3,05 мкМ"1.

6. Методом компьютерного моделирования построены модели пространственных структур ИСБ-7 и ИСБ-16, а также их комплексов с IgG. Определены возможные межмолекулярные контакты, стабилизирующие эти комплексы. Показано, что ИСБ-7 и ИСБ-16 имеют общие сайты связывания на Fc- и Fab-фрагментах IgG человека с иммуноглобулипсвязывающими белками SpA и SpG грамположительных бактерий.

Работа поддержана грантом ДВО РАН № 09-111-05-150 и грантом рвостока № 0904-98576.

1. Kihlberg В.-М., Collin М., Olsen A. and Bjorck L. Protein H and Antiphagocytic Surface Protein in Streptococcus pyogenes // Infect. Immun. 1999. Vol. 67, N 4, P. 1708-1714.

2. Tolo K. and Helgeland K. Fc-binding components: a virulence factor in Actinobacillus actinomycetemcomitansl // Oral Microbiol Immunol. 1991. Vol. 6, N 6, P. 373-377.

3. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий // Москва: Наука, 1977. с. 216

4. Widders P.R., Dorrance L.A., Yarnall М. and Corbeil, L.B. Immunoglobulin-binding activity among pathogenic and carrier isolates of Haemophilus somnus // Infect. Immun. 1989. Vol. 57, N 2. P. 639-642.

5. Bjorck L. Protein L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains // J. Immunol. 1988. Vol. 140, P. 1194-1197.

6. Raeder R., Faulmann E.L. and Boyle M.D. Evidence for functional heterogeneity in IgG Fc-binding proteins associated with group A streptococci // J. Immunol. 1991. Vol. 146, P. 1247-1253.

7. Labbe S. and Grenier D. Characterization of the human immunoglobulin G Fc-binding activity in Prevotella intermedia // Infect. Immun. 1995. Vol. 63, N 7. P. 2785-2789.

8. Bjorck L. and Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent // J. Immunol. 1984. Vol. 133, P. 969-974.

9. Akesson P., Schmidt K.H., Cooney J. and Bjorck L. Ml protein and protein PI: IgGFc- and albumin-binding streptococcal surface proteins encoded by adjacent genes //Biochem. J. 1994. N 300. P. 877-886.

10. Yarnall M., Widders P.R. and Corbeil L.B. Isolation and characterization of Fc receptors from Haemophilus somnus // Scand. J. Immunol. 1988. Vol. 28, N 2. P. 129-137.

11. Yarnall M. and Widders P.R. Comparison of IgG Fc receptors from clinical isolates of Streptococcus zooepidemicus И J. Med. Microbiol. 1989. Vol. 28, N 2. P. 137-41.

12. Mintz K.P. and Fivestaylor P M. Identification of an immunoglobulin Fc receptor of Actinobacillus actinomycetemcomitans II Infec. Immun. 1994. Vol. 62, N 10. P. 4500-4505.

13. Sandt C.H., Wang Y.-D., Wilson R.A. and Hill C.W. Escherichia coli strains with Nonimmune Immunoglobulin-Binding Activity 11 Infect. Immun. 1997. Vol. 65, N 11. P. 4572-4579.

14. Бурова JI.A., Тотолян A.A., Кристенсен П., Шален К. Иммуноглобулиповая Fc-рецепция стрептококков и ее участие в постстрептококковых осложнениях // Микробиол. 1984. N 10. С. 12-20.

15. Марри Р., Греннер Д., Мейес П. и Родуэлл В. Плазма крови и процесс свертывания. // Биохимия человека; Москва: Мир, 1993. Т. 2, С. 321-325.

16. Ройт А. Молекулы, распознающие антиген. // Основы иммунологии, под ред. ВасиловаР.Г. и Киркина А.Ф.; Москва: Мир, 1991. С. 42-55.

17. Straley S.C. and Perry R.D. Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia//Trends Microbiol. 1995. Vol. 3, P. 310-317.

18. Eitel J. and Dersch P. The YadA Protein of Yersinia pseudotuberculosis Mediates High-Efficiency Uptake into Human Cells under Environmental Conditions in Which Invasin Is Repressed // Infect. Immun. 2002. Vol. 70, N 9. P. 4880-4891.

19. Yarnall M., Reis K.J., Ayoub E.M. and Boyle M.D.P. An immunoblotting technique for the detection of bound and secreted bacterial Fc receptors // J. Microbiol. Methods. 1984. Vol. 3, P. 83-93.

20. Reis K.J., Siden E.J. and Boyle M.D.P. Selective Colony Blotting to Expand Bacterial Surface Receptors: Applications to Receptors for Rat Immunoglobulins // BioTechniques. 1988. Vol. 6, N 2. P. 130-136.

21. Myhre E.B. and Kronvall G. Heterogeneity of nonimmune immunoglobulin Fc reactivity among gram-positive cocci: description of three major types of receptors for human immunoglobulin G // Infect. Immun. 1977. Vol. 17, N 3. P. 475-482.

22. Jensen K. A normally occurring staphylococcus antibody in the human serum // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1958. Vol. 44, P. 421-428.

23. Forsgren A. and Sjoquist J. "Protein A" from S. aureus. I. Pseudoimmune reaction with human gamma-globulin // J. Immunol. 1966. Vol. 97. P. 822-827.

24. Bjork I., Petersson B.A. and Sjoquist J. Some physiochemical properties of protein A from Staphylococcus aureus II Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 29, N 3. P. 579-584.

25. Sjoquist J., Meloun B. and Hjelm H. Protein A isolated from Staphylococcus aureus after digestion with lysostaphin // Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 29, N 3. P. 572-578.

26. Sjodahl J. Repetitive sequences in protein A from Staphylococcus aureus. Arrangement of five regions within the protein, four being highly homologous and Fc-binding//Eur. J. Biochem. 1977. Vol. 73, N2. P. 343-351.

27. Lind I., Reyn A., Birch-Anderson., Electron Microscopy of Staphylococcal Protein A Reactivity and Specific Antigen-Antibody Reaction // Acta Path. Microbiol. Scand. 1972, Sec. B, Vol. 80, N 2. P.281-291.

28. Forsgren A. Significance of Protein A Production by Staphylococci // Infect. Immun. 1970. Vol. 2, P. 672-673.

29. Dossett J.H., Kronvall G., Williams R.C., Quie Jr. and P.G. Antiphagocytic Effects of Staphylococcal Protein A // J. Immunol. 1969. Vol. 103, P. 1405-1410.

30. Lind I. Protein A production in different strains of Staphylococcus aureus under various growth conditions // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1974. Sect. B, Vol. 82, P. 821-828.

31. Winblad S. and Ericson C. Sensitized sheep red cells as a reactant for Staphylococcus aureus protein A // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1973. Sect. B, Vol. 81, P. 150156.

32. Lind I. Correlation between the occurrence of protein A and some other properties in Staphylococcus aureus II Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1972. Sect. B, Vol. 80, P. 702-708.

33. Cohen S. and Sweeney H.M. Modulation of Protein A Formation in Staphylococcus aureus by Genetic Determinants for Methicillin Resistance // J. Bacteriol. 1979. Vol. 140, N3. P. 1028-1035.

34. Lindmark R., Movitz J. and Sjoquist J. Extracellular Protein A from a Methicillin-Resistant Strain of Staphylococcus aureus II Eur. J. Biochem. 1977. Vol. 74, P. 623628.

35. Cheung A.L., Bayer A.S., Peters J. and Ward J.I. Analysis by Gel Electrophoresis, Western Blot, and Peptide Mapping of Protein A Heterogeneity in Staphylococcus aureus Strains // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, N 4. P. 843-847.

36. Hjelm H., Sjodahl J. and Sjoquist J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus II Eur. J. Biochem 1975. Vol. 57. N 2. P. 395-403.

37. Forsgren A. Protein A from Staphylococcus aureus. VI. Reaction with subunits from guinea pig yr and y2- globulin // J. Immunol. 1968. Vol. 100, P. 927-930.

38. Kronvall G., Grey H.M. and Williams R.C. Protein A reactivity with mouse immunoglobulins. Structural relationship between some mouse and human immunoglobulins И J. Immunol. 1970. Vol. 105, N 5, P.l 116-1123.

39. Jacobsson K. and Frykberg L. Cloning of ligand-binding domains of bacterial receptors by phage display // BioTechniques. 1995. Vol. 18, P. 878-885.

40. Zhang L., Jacobsson K., Vasi J., Lindberg M. and Frykberg L. A second IgG-binding protein in Staphylococcus aureus II Microbiol. 1998. Vol. 144, P. 985-991.

41. Lancefield R.C. The antigenic complex of Streptococcus hemolyticus. I. Demonstration of a type-specific substance in extracts of Streptococcus hemolyticus II J. Exp. Med. 1928. Vol. 47, P. 91-103.

42. Todd E.W. and Lancefield R.C. Variants of hemolytic streptococci; their relation to type-specific substance, virulence, and toxin // J. Exp. Med., 1928, Vol. 48, P. 751761.

43. Maxted W.R. The indirect bactericidal test as a means of identifying antibody to the M antigen of Streptococcus pyogenes // Br. J. Exp. Pathol. 1956. Vol. 37, N 4. P. 415-422.

44. Foley M.J. and Wood W.B.Jr. Studies on the pathogenicity of group A streptococci. II. The antiphagocytic effects of the M protein and the capsular gel // J Exp. Med. 1959. Vol. 110, P. 617-628.

45. Freimer E.H., Krause R.M., McCarty M. Studies of L forms and protoplasts of group A streptococci. I. Isolation, growth, and bacteriologic characteristics // J. Exp. Med. 1959. Vol. 110, P. 853-874.

46. Lancefield, R.C. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci //J. Immunol. 1962. Vol. 89, P. 307-313.

47. Hahn J.J., Cole R.M. Streptococcal M antigen location and synthesis , studied by immunofluorescence // J. Exp. Med. 1963. Vol. 118, P. 659-666.

48. Cohen J.O. Effect of Culture Medium Composition and on the Production of M Protein and Proteinase by Group A Streptococci //J. Bacteriol. 1969. 99, P. 737-744.

49. Lancefield R.C. and Perlmann G.E. Preparation and properties of type-specific M antigen isolated from group A, type 1 hemolytic Streptococcus // J. Exp. Med. 1952. Vol. 96, P. 71-82.

50. Elliott S.D., Stuart D. A proteolytic enzyme produced by group A streptococci with special reference to its effect on the type specific M antigen // J. Exp. Med. 1945. Vol, 81, P. 537-591.

51. Boyle M.D.P. Bacterial immunoglobulin-binding proteins // Encyclopedia of immunology. 2nd ed. New York: Acad. Press. 1998. P. 323-327.

52. Pack T.D. and Boyle M.D.P. Characterization of a type II'о group A streptococcal immunoglobulin-binding protein // Mol. Immunol. 1995. Vol. 32, P. 1235-1243.

53. Raeder R., Woischnik M., Podbielski A. and Boyle M.D. A secreted streptococcal cysteine protease can cleave a surface-expressed Ml protein and alter the immunoglobulin binding properties // Res. Microbiol, 1998. Vol. 149, N 8. P. 539-48.

54. Kawabata S., Tamura Y., Murakami J., Terao Y., Nakagawa I. and Hamada S. A novel, anchorless streptococcal surface protein that binds to human immunoglobulins // Bioch. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 296, N 5. P. 1329-1333.

55. Bisno A., Craven D.E. and McCabe W.R. M proteins of group G streptococci isolated from bacteremic human infection // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, P. 753-757.

56. Bisno A.L., Collins C.M. and Turner J.C. M proteins of group С streptococci isolated from patients with acute pharyngitis // J. Clin. Microbiol. 1996. Vol. 34, P. 25112515.

57. Collins C.M., Kimura A. and Bisno A.L. Group G streptococcal M protein exhibits structural features analogous to those of class-I M protein of group A streptococci // Infect. Immun. 1992. Vol. 60, P. 3689-3696.

58. Jones K.F. and Fischetti V.A. Biological and immunochemical identity of M protein on group G streptococci with M protein on group A streptococci // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, P. 502-506.

59. Smirnov O., Denesyuk A.I., Zakharov M.V., Abramov V.M. and Zav'yalov V.P. Protein V, a novel type-II IgG receptor from Streptococcus sp.: sequence, homologies and putative Fc-binding site // Gene. 1992. Vol. 120, P. 27-32.

60. Mogollon J.D., Pijoan C., Murtaugh M.P., Cleary P.P. and Collins J.E. Testing meningeal strains of Streptococcus suis to detect M protein genes // Res. Vet. Sci. 1992. Vol. 53, P. 244-246.

61. Schnitzler N., Podbielski A., Baumgarten G., Mignon M. and Kaufhold A. M or M-like protein gene polymorphisms in human group G streptococci // J. Clin. Microbiol. 1995. Vol. 33, P. 356-363.

62. Simpson W.J., Robbins J.C. and Cleary P.P. Evidence for group A-related M protein genes in human but not animal-associated group G streptococcal pathogens // Microb. Pathog. 1987. Vol. 3, P. 339-350.

63. Scott J.R., Pulliam W.M., Hollingshead S.K. and Fischetti V.A. Relationship of M protein genes in group A streptococci // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. Vol. 82, P. 1822-1826.

64. Myhre E.B. and Kronvall G. Demonstration of specific binding sites for human serum albumin in group С and G streptococci // Infect. Immun. 1980. Vol. 27, P. 6-14.

65. Akerstrom В., Brodin Т., Reis K. and Bjorck L. Protein G: a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies // J. Immunol. 1985. Vol. 135, P. 2589-2592.

66. Sjobring U., Trojnar J., Grubb A., Akerstrom B. and Bjorck L. Ig-binding bacterial proteins also bind proteinase inhibitors // J. Immunol. 1989. Vol. 143, P. 2948-2954.

67. Jonsson H., Burtsoff-Asp C. and Guss B. Streptococcal protein MAG— a protein with broad albumin binding specificity // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1249, P. 65-71.

68. Jonsson H., Frykberg L., Rantamaki L. and Guss B. MAG, a novel plasma protein receptor from Streptococcus dysgalactiae II Gene. 1994. Vol. 143, P. 85-89.

69. Jonsson H. and Muller H.P. The type-Ill Fc receptor from Streptococcus dysgalactiae is also an alpha 2-macroglobulin receptor // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 220, P. 819— 826.

70. Jonsson H., Lindmark H. and Guss B. A protein G-related cell surface protein in Streptococcus zooepidemicus II Infect. Immun. 1995. Vol. 63, P. 2968-2975.

71. Akerstrom B. and Bjorck L. Protein L: an immunoglobulin light chain-binding bacterial protein. Characterization of binding and physicochemical properties // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264, P. 19740-19746.

72. Enokizono J., Wikstrom M., Sjobring U., Bjorck L., Forsen S., Arata Y., Kato K. and Shimada I. NMR analysis of the interaction between protein L and Ig light chains // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 270, P. 8-13.

73. Nilson B.H., Solomon A., Bjorck L. and Akerslrom B. Protein L from Peptostreptococcus magnus binds to the kappa light chain variable domain // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, P. 2234-2239.

74. Wikstrom M., Sjobring U., Drakenberg Т., Forsen S. and Bjorck L. Mapping of the immunoglobulin light chain-binding site of protein L // J. Mol. Biol. 1995. Vol. 250, P. 128-133.

75. Patella V., Casolaro V., Bjorck L. and Marone G. Protein L. A bactcrial Ig-binding protein that activates human basophils and mast cells // J. Immunol. 1990. Vol. 145, P. 3054-3061.

76. Fischetti V.A., Pancholi V. and Schneewind O. Conservation of a hexapeptide sequence in the anchor region of surface proteins from Gram-positive cocci // Mol. Microbiol. 1990. Vol. 4, P.1603-1605.

77. Navarre W.W. and Schneewind O. Surface Proteins of Gram-Positive Bactcria and Mechanisms of Their Targeting to the Cell Wall Envelope // Microbiol. Mol Biol. 1999. Vol. 63, N 1. P. 174-229.

78. Schneewind O., Model P., Fischetti V.A. Sorting of protein A to the Staphylococcal cell wall // Cell. 1992. Vol.70, P. 267-281.

79. Gouda PL, Torigoe H., Saito A., Sato M., Arata Y. and Schimada I. Three-dimensional solution structure of the B-domain of staphylococcal protein A: Comparisons of the solution and crystal structures // Biochem. 1992. Vol. 31, N 40. P. 9665-9672.

80. Derrick J.P. and Wigley D.B. Crystal structure of a streptococcal protein G domain bound to Fab fragment // Nature. 1992. Vol. 359, 752-754.

81. Starovasnik M.A., O'Connell M.P., Fairbrother W.J. and Kelley R.F. Antibody variable region binding by Staphylococcal protein A: Thermodynamic analysis andlocation of the Fv binding site on E-domain // Protein Sci. 1999. Vol. 8, P. 14231431.

82. Lian L.-Y., Barsukov I.L., Derrick, J.P. & Roberts G.C.K. Mapping the interactions between streptococcal protein G and the Fab fragment of IgG in solution // Nat. Struct. Biol. 1994. Vol. 1, 355-357.

83. Boyle M.D.P. and Reis K.J. Bacterial Fc Receptors // Bio/Technology 1987. Vol. 5, P.697-703.

84. Sjoholm I. Protein A from Staphylococcus aureus. Spectropolarimetric and spectrophotometric studies // Eur. J. Biochem. 1975. Vol. 51, P. 55-61.

85. Guss В., Uhlen M., Nilsson В., Lindberg M., Sjoquist J. and Sjodahl J. Region X, the cell-wall-attachment part of staphylococcal protein A // Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 138, P. 413-420.

86. Abrahmsen L., Moks Т., Nilsson В., Hellman U. and Uhlen M. Analysis of signals for secretion in the staphylococcal protein A gene // Embo. J. 1985. Vol. 4, P. 39013906.

87. Sjodahl J. Repetitive sequences in protein A from Staphylococcus aureus. arrangement of five regions within the protein, four being highly homologous and Fc-binding // Eur. J. Biochem. 1977. Vol. 73, P. 343-351.

88. Moks Т., Abrahmsen L., Nilsson В., Hellman U., Sjoquist J. and Uhlen M. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains // Eur. J. Biochem. 1986. Vol. 156, P. 637-643.

89. Schneewind O., Fowler A. and Faull K.F. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus II Science 1995. Vol. 268, P. 103-106.

90. Nilsson В., Moks Т., Jansson В., Abrahmsen L., Elmblad A., Holmgren E., Henrichson C., Jones T.A. and Uhlen M. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A//Protein Eng. 1987. Vol. 1,P. 107-113.

91. Kronvall G. and Williams R.C. Differences in anti-protein A activity among IgG subgroups // J. Immunol. 1969. Vol. 103, P. 828-833.

92. Ankerst J., Christensen P., Kjellen L. and Kronvall G. A rountine diagnostic test for IgA and IgM antibodies to rubella virus: absorption of IgG with Staphylococcus aureus // J. Infect. Dis. 1974. Vol. 130, P. 268-273.

93. Jansson В., Uhlen, M., Nygren, P.A. All individual domains of staphylococcal protein A show Fab binding // FEMS Immunol. Medical. Microbiol. 1998. Vol. 20, N 1. P. 69-78.

94. Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment В of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution//Biochem. 1981. Vol. 20, P. 2361-2370.

95. Atkins K.L., Burman J.D., Chamberlain E.S., Cooper J.E., Poutrel В., Bagby S., Jenkins A.T.A., Feil E.J. and van den Elsen J.M.H. S. aureus IgG-binding proteins

96. SpA and Sbi: Host specificity and mechanisms of immune complex formation 11 Mol. Immunol. 2008. Vol. 45, P. 1600-1611.

97. Reis K.J., Ayoub E.M. and Boyle M.D. Streptococcal Fc receptors. I. Isolation and partial characterization of the receptor from a group С streptococcus // J. Immunol. 1984. Vol. 132, P. 3091-3097.

98. Reis K.J., Ayoub E.M. and Boyle M.D. Streptococcal Fc receptors. II. Comparison of the reactivity of a receptor from a group С streptococcus with staphylococcal protein A // J. Immunol. 1984. Vol. 132, P. 3098-3102.

99. Guss В., Eliasson M., Olsson A., Ulilen M., Frej A.K., Jornvall H., Flock J.I. and Lindberg M. Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G // EMBO J. 1986. Vol. 5, P. 1567-1575.

100. Olsson A., Eliasson M., Guss В., Nilsson В., Hellman U., Lindberg M. and Uhlen M. Structure and evolution of the repetitive gene encoding streptococcal protein G // Eur. J. Biochem. 1987. Vol. 168, P. 319-324.

101. Filpula D., Alexander P. and Fahnestock S.R. Nucleotide sequence of the protein G gene from Streptococcus GX7805, and comparison to previously reported sequences // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15, P. 7210.

102. Fahnestock S.R., Alexander P., Nagle J. and Filpula D. Gene for an immunoglobulin-binding protein from a group G streptococcus // J. Bacteriol. 1986. Vol. 167, P. 870880.

103. Sjobring U., Bjorck L. and Kastern W. Streptococcal protein G. Gene structure and protein binding properties // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, P. 399-405.

104. Bjorck L., Kastern W., Lindahl G. and Wideback K. Streptococcal protein G, expressed by streptococci or by Escherichia coli, has separate binding sites for human albumin and IgG // Mol. Immunol. 1987. Vol. 24, P. 1113-1122.

105. Akerstrom, В., E. Nielsen, and L. Bjorck. Definition of IgG- and albumin-binding regions of streptococcal protein G // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, P. 13388-13391.

106. Sjobring U., Falkenberg C., Nielsen E., Akerstrom B. and Bjorck L. Isolation and characterization of a 14-kDa albumin-binding fragment of streptococcal protein G // J. Immunol. 1988. Vol.140, P. 1595-1599.

107. Johansson M.U., de Chateau M., Wikstrom M., Forsen S., Drakenberg T. and Bjorck L. Solution structure of the albumin-binding GA module: a versatile bacterial protein domain // J. Mol. Biol. 1997. Vol 266, P. 859-865.

108. Sjobring U., Bjorck L. and Kastern W. Protein G genes: structure and distribution of IgG-binding and albumin-binding domains // Mol. Microbiol. 1989. Vol. 3, P. 319327.

109. Gallagher Т., Alexander P., Bryan P. and Gilliland G.L. Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR// Biochem. 1994. Vol. 33, P. 4721-4729.121. Achari

110. A. et al., & Whitlow M. 1.67Л X-ray structure of the B2 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison to the NMR structure of the B1 domain//Biochem. 1992. Vol. 31, P. 10449-10457.

111. Derrick J.P. and Wigley D.B. The third IgG-binding domain from streptococcal protein G. An analysis by X-ray crystallography of the structure alone and in a complex with Fab // J. Mol. Biol. 1994. Vol. 243, P. 906-918.

112. Sauer-Eriksson A.E., Kleywegt G.J., Uhlen M. and. Jones T.A. Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG // Structure 1995. Vol. 3, N 3. P. 265-278.

113. Kastern W., Sjobring U. and Bjorck L. Structure of peptostreptococcal protein L and identification of a repeated immunoglobulin light chain-binding domain // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, P. 12820-12825.

114. Murphy J.P., Trowern A.R. and Duggleby C.J. Nucleotide sequence of the gene for peptostreptococcal protein L // DNA Seq. 1994. Vol. 4, P. 259-265.

115. Murphy J.P., Duggleby C.J., Atkinson M.A., Trowen A.R., Atkinson T. and Go ward C.R. The functional units of a peptostreptococcal protein L // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12, N6. P. 911-920.

116. Gu H.D., Yi Q.A., Bray S.T., Riddle D.S., Shiau A.K. and Baker D, A phage display system for studying the sequence determinants of protein-folding // Protein Sci. 1995. Vol. 4, P. 1108-1117.

117. Phillips G.N., Flicker P.F., Cohen C., Manjula B.N. and Fischetti V.A. Streptococcal M protein: «-helical coiled-coil structure and arrangements on the cell surface // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78, P. 4698-4693.

118. Fischetti V.A. Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior // Clin. Microbiol. 1989. Vol. 2, P. 285-314.

119. Hollingshead S.K., Fischetti V.A. and Scott J.R. Complete nucleotide sequence of type 6 M protein of the group A streptococcus: repetitive structure and membrane anchor//J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, P. 1677-1686.

120. Mouw A.R., Beachey E.H. and Burdett V. Molecular evolution of streptococcal M protein: cloning and nucleotide sequence of the type 24 M protein gene and relation to other genes of Streptococcus pyogenes II J. Bacteriol. 1988. Vol. 170, P. 676-684.

121. Robinson J.H., Atherton M.C., Goodacre J.A., Pinkney M., Weightman H. and Kehoe M.A. Mapping T-cell epitopes in group A streptococcal type 5 M protein // Infect. Immun. 1991. Vol. 59, P. 4324-4331.

122. Scott J.R. and Fischetti V.A. Expression of streptococcal M protein in Escherichia coli/l Science 1983. Vol. 221, P. 758-760.

123. Hollingshead S.K., Fischetti V.A. and Scott J.R. A highly conserved region present in transcripts encoding heterologous M proteins of group A streptococci // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, P. 3237-3239.

124. Cunningham M.W. Pathogenesis of Group A Streptococcal Infections // Clinical Microbiol. Rev. 2000. Vol. 13, N 3. P. 470-511.

125. Frick IM, Crossin KL, Edelman GM, Bjorck L. Protein H- a bacterial surface protein with affinity for both immunoglobulin and fibronectin type III domains // EMBO J. 1995. Vol. 14, P. 1674-1679.

126. Fagan K.P., Reinscheid D., Gottschalk B. and Chhatwal G.S. Identification and Characterization of a Novel Secreted Immunoglobulin Binding Protein from Group A Streptococcus // Infect. Immun., 2001, Vol.69, N 8. P. 4851-4857.

127. Demuth D.R., Davis C.A., Corner A.M., Lamont R.J., Leboy P.S. and Malamud D. Cloning and expression of a Streptococcus sanguis surface antigen that interacts with a human salivary agglutinin // Infect. Immun. 1988. Vol. 56, P. 2484-2490.

128. Akerstrom B. and Bjorck, L. A physicochemical study of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G-binding properties 11 J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, P. 10240-10247.

129. Reza A.H., Ascencio F., Ljungh A. and Wadstrm T. Particle agglutination assay for detection of albumin and IgG binding cell surface components of Helicobacter pylori // Zentralbl. Bakteriol. 1995. Vol. 282, N 3. P. 255-64.

130. Corbeil L.B., Bastida-Corcuera F.D. and Beveridge T.J. Haemophilus somnus Immunoglobulin Binding Proteins and Surface Fibrils // Infect. Immun. 1997. Vol. 65,N 10. P.4250-4257.

131. Guo M., Han Y.W., Sharma A., de Nardin E. Identification and characterization of human immunoglobulin G Fc receptors of Fusobacterium nucleatum II Oral. Microbiol. Immunol. 2000. Vol.15, P. 119-123.

132. Grover S., McGee Z.A. and Odell W.D. Isolation of a 30 kDa immunoglobulin binding protein from Pseudomonas maltophilia II J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 141, N2. P. 187-197.

133. Amini H.-R., Ascensio F., Ljungh A. and Wadstrom T. Particle agglutination assay for detection of albumin and IgG binding cell surface components of Helicobacter pylori II Zentbl. Bacterid. Mikrobiol. Hyg. 1995. Vol. 282, P. 255-264.

134. Amini H.-R., Ascencio F., Cruz-Villacorta A., Ruiz-Bustos E. and Wadstrom T. Immunochemical properties of a 60 kDa cell surface-associated heat shock-protein (I-Isp60) from Helicobacter pylori IIFEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. Vol. 16, P. 163-172.

135. Linder L.L., Klempner M.S., Straley S.C. Yersinia pestis pH6 antigen: genetic, biochemical, and virulence characterization of a protein involved in the pathogenesis of bubonic plague // Infect. Immun. 1990. V. 58, N 8. P. 2569-2577.

136. Yang Y., Isberg R.R. Transcription regulation of Yersinia pseudotuberculosis pH6 antigen adhesion by two envelope-associated components // Mol. Microb. 1997. Vol. 24, N3. P. 499-510.

137. Makoveichuk E., Cherepanov P., Lundberg S., Forsberg A. and Olivecrona G. pH6 antigen of Yersinia pestis interacts with plasma lipoproteins and cell membranes // J. Lipid Res. 2003. Vol. 44, P. 320-330.

138. Linder L.L., Klempner Y.Y., Merriam J.J., Isberg R.R. The psa locus is responsible for thermoinducible binding of Yersinia pseudotuberculosis to cultured cells // Infect. Immun. 1996. Vol. 65, N 4. P. 2583-2589.

139. Набережных Г.А, Сидорин E.B, Ким H. IO., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика иммуноглобулинсвязывающего белка из Yersinia pseudotuberculosis И Биохимия. 2002. Т.67, N 9. С. 1282-1288.

140. Набережных Г.А., Сидорин Е.В., Лапшина Л.А., Реунов А.В., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулин связывающих белков Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия. 2006. Т. 71, N 11. С. 1577- 1582.

141. Nurminen М. Enterobacterial Surface antigens: Methods for Molecular Characterization // Ed. Korhonen N.K. New York: Elsevier Science Publ. 1985. P. 293-300.

142. Widders P.R. Bacterial Immunoglobulin-Binding Proteins: Microbiology, Chemistry, and Biology //Ed. Boyle M. D. P. San Diego: Acad. Press Inc. 1991. P. 375-396.

143. Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф., Шубин Ф.Н., Тимченко Н.Ф. Влияние глюкозы и галактозы на морфологию и биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis II Журн. микробиол. 2005. N 5. С. 6-10.

144. Сомов Г.П. Психрофильность патогенных микроорганизмов и ее эпидемиологическое и патогенетическое значение // Вестн. АМН СССР. 1985. N 1. С. 58-65.

145. Гоготов И.Н., Зории Н.А. Гидрогеназпая активность во фракциях из клеток фототрофных бактерий // Материалы всесоюз. конф. «Дезинтеграция микроорганизмов», 25-27 октября. 1972. Пущипо-на-Оке. С. 207-210.

146. Ратнер Е.Н., Фихте Б.А. О возможности «бескавитационной» ультразвуковой дезинтеграции микроорганизмов // Материалы всесоюз. конф. «Дезинтеграция микроорганизмов», 25-27 октября. 1972. Пущино-на-Оке. С. 223-226.

147. Laemmli, U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, P. 680-685.

148. Capaldi R. and Vanderkooi G. The Low Polarity of Many Membrane Proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69, N 4. P. 930-932.

149. Kilar F., Vegvari A., Mod A. New set-up for capillary isoelectric focusing in uncoated capillaries // J. Chromatography. 1998. Vol. 813, N 2. P. 349-360.

150. Thome В., Hoffschulte H., Schiltz E. and Muller M. A protein with sequence identity to Skp (FirA) supports protein translocation into plasma membrane vesicles of Escherichia coli//FEBS Lett. 1990. Vol. 269, P. 113-116.

151. Thome B. and Muller M. Skp is a periplasmic E. coli protein requiring SecA and SecY for export//Mol. Microbiol. 1991. Vol. 5, P. 2815-2821.

152. Chen R. and Henning U. A periplasmic protein (Skp) of Escherichia coli selectively binds a class of outer membrane proteins // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 19, P. 12871294.

153. Schafer U., Beck K. and Miiller M. Skp, a molecular chaperone of gram-negative bacteria, is required for the formation of soluble periplasmic intermediates of outer membrane proteins // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, P. 24567-24574.

154. Qu J., Mayer C., Behrens S., Hoist O. and Kleinschmidt J. The trimeric periplasmic chaperone Skp of E. coli forms 1:1 complexes with outer membrane proteins via hydrophobic and electrostatic interactions // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 374, P. 91-105.

155. Bulieris P., Behrens S., Hoist O. and Kleinschmidt J.H. Folding and insertion of the outer membrane protein OmpA is assisted by the chaperone Skp and by lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, P. 9092-9099.

156. Geyer R., Galanos C., Westphal O. and Golecki,J. A lipopolysaccharide-binding cell-surface protein from Salmonella Minnesota // Eur. J. Biochem. 1979. Vol. 98, P. 2738.

157. Hoick A, Kleppe K. Cloning and sequencing of the gene for the DNA-binding 17K protein of Escherichia coli // Gene. 1988, Vol. 67, P. 117-124.

158. Hoick A., Lossius I., Aasland R. and Kleppe K. Purification and characterization of the 17 К protein, a DNA-binding protein from Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1987. Vol. 914, P. 49-54.

159. Hoick A., Lossius I., Aasland R., Haarr L. and Kleppe K. DNA- and RNA-binding proteins of chromatin from Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1987. Vol. 908, P. 188-199.

160. Koski P., Rhen M., Kantele J. and Vaara M. Isolation, cloning, and primary structure of a cationic 16-kDa outer membrane protein of Salmonella typhimurium. // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264, P. 18973-18980.

161. Koski P., Hirvas L. and Vaara M. Complete sequence of the ompH gene encoding the 16-kDa cationic outer membrane protein of Salmonella typhimurium // Gene. 1990. Vol. 88, P. 117-120.

162. Vuorio R., Hirvas L., Raybourne R.B., Yu D.T.Y., Vaara M. The nucleotide and deduced amino acid sequence of the cationic 19 kDa outer membrane protein OmpH of Yersinia pseudotuberculosis // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1129, P. 124126.

163. Shrestha A., Shi L., Tanase S., Tsukamoto M., Nishino N., Tokita K. and Yamamoto T. Bacterial Chaperone Protein, Skp, Induces Leukocyte Chemotaxis via C5a Receptor//Am. J. Pathol. 2004. Vol. 164, P. 763-772.

164. Langone J.J. Use of labeled protein A in quantitative immunochamical analysis of antigens and antibodies // J. Immunol. Meth. 1982. Vol.51, P. 3-22.

165. Langone J.J. Protein A from Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumococci // Adv. Immunol. 1982. Vol. 32, P. 157-252.

166. Lewis M.J., Meehan M., Owen P. and Woof J.M. A Common Theme in Interaction of Bacterial Immunoglobulin-binding Proteins with Immunoglobulins Illustrated in the Equine System // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, P. 17615-17623.

167. Walton T.A., and Sousa M.C. Crystal Structure of Skp, a Prefoldin-like Chaperone that Protects Soluble and Membrane Proteins from Aggregation // Mol. Cell. 2004. Vol. 15, P. 367-374.

168. Meininger D.P., Ranee M., Starovasnik A., Fairbrother W.J. and Skelton N.J. Characterization of the binding interface between the E-domain of Staphylococcal protein A and an antibody Fv-fragment // Biochem. 2000. Vol. 39, N 1. P. 26-36.

169. Шовадаева Г.А., Шубин Ф.Н., Шагинян И.А., Марков А.П., Гинцбург A.JL, Смирнов Г.Б. Альтернативная локализация детерминант патогенности, кодируемых плазмидой pVM 82 Yersinia pseudotuberculosis II Мол. генетика. 1991. Т. 11, С. 23-27.

170. Ovodov Yu.S., Gorshkova R.P. and Tomshich S.V. Chemical and immunochemical studies on Pasteurella Pseudotuberculosis lipopolysaccharides-I. Isolation and general characterization // Imunoch. 1971. Vol. 8, P. 1071-1079.

171. Widders P.R., Smith J.W., Yarnall M., McGuire T.C., Corbeil L.B. Non-immune immunoglobulin binding by "Haemophilus somnus" // J. Med. Microbiol. 1988. Vol. 26, N4. P. 307-311.

172. Михайлов A.T., Симирский B.H. В кн. Методы иммунохтшческого анализа в биологии развития. II Наука, Москва. 1991, с. 253.

173. Гаспаров B.C., Дегтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250 // Биохим. 1994, Т. 59, N 6. С. 763-777.

174. Dubois М., Gilles К.A., Hamilton J.K., Rebers Р.Н., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. Vol. 28, N 2. P. 350-356.

175. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology, in: Hirs C.H.W., Timasheff S.N. (Eds.), Academic Press. New York. London. 1972. Vol. 25, Part B. P. 121-139.

176. Беленький Б.Г., Ганкина E.C., Нестеров В.В. Экспрессный ультрачувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // ДАН СССР. 1967. Т. 172, С. 91-93.

177. Provencher S.W. and Glokner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochem. 1981. Vol. 20, N 1. P. 34-37.

178. Кетти Д. и Райкундалиа Ч. Оптимальная концентрация антигена для сенсибилизации панелей. // Антитела. Методы, (под ред. Кэтти Д.), Москва: Мир. 1991, Т. 2, С. 180-181.

179. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Получение коньюгатов фермент-белок. // Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высшая школа. 1991. С. 182-183.

180. Бобровник С.А. Влияние концентрации лиганда на точность определения параметров лиганд-рецепторного взаимодействия методом серийных разведений // Укр. BioxiM. Ж. 2004. Т. 76, N 6. С. 5-28.

181. Rappsilber J., Ishihama Y. and Mann M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics // Anal. Chem. 2003. Vol. 75, P. 663-670.

182. Arnold K., and Bordoli L., Kopp J., and Schwede T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling // Bioinformatics. 2006. Vol. 22, P. 195-201.

183. Schwede Т., Kopp J., Guex N. and Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31, P. 3381-3385.

184. Kopp J. and Schwede T. The SWISS-MODEL Repository of annotated three-dimensional protein structure homology models // Nucleic Acids Research. 2004. Vol. 32, P. D230-D234.

185. Berman H.M., Westbrook J., and Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., and Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Research. 2000. Vol. 28, P. 235-242.

186. Lindahl E., Hess В., and Spoel D. GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis // J. Mol. Mod. 2001. Vol. 7, P. 306-317.

187. Padlan E.A. Anatomy of the antibody molecule // Mol. Immunol. 1994. Vol. 31, P. 169-217.