Иммунохимические тест-методы определения токсикантов в продуктах питания и объектах окружающей среды тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

БАСОВА ЕВГЕНИЯ ЮРЬЕВНА

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

02.00.02. - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Саратов-2010 2 8 ОКТ

004612000

Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Горячева Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кулапина Елена Григорьевна Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

кандидат химических наук, Веселова Ирина Анатольевна Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Липецкий государственный технический университет, г. Липецк

Защита состоится 11 ноября 2010 года в 16 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, Саратов, СГУ, Институт химии, I корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СГУ имени Н.Г. Чернышевского

Автореферат разослан 4 октября 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, !

доктор химических наук А у Т.Ю. Русанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Увеличение количества нормируемых контаминантов пищевых продуктов и ужесточение требований по их максимально допустимому содержанию приводят к необходимости разработки высокочувствительных методик определения. Наряду с широким использованием хроматографии, актуальной является разработка недорогих и простых тест-устройств для экспрессного определения токсичных соединений в пищевых продуктах и природных объектах. Широкое распространение получили тест-методы, основанные на принципах биологического узнавания. Использование специфических взаимодействий антиген-антитело позволяет проводить идентификацию и количественное определение большого круга целевых аналитов. Данные тесты не требуют сложной процедуры пробоподготовки, быстры в получении аналитической информации, а также доступны для использования вне лаборатории, что делает разработку иммунохимических тест-методов одним из наиболее перспективных направлений современной аналитической химии. В настоящее время проводятся исследования преимущественно в области иммунохроматографических и иммунофильтрационных мембранных тест-средств.

К моменту начала исследований, представленных в данной работе, были описаны лишь единичные примеры иммунохимических колоночных тестов. В данной работе основное внимание было уделено: повышению чувствительности; одновременному определению нескольких аналитов; устранению матричного эффекта образца; упрощению интерпретации результатов; развитию подходов к полуколичественному определению. Отличительной особенностью разрабатываемых систем является совмещение функций очистки, концентрирования и определения в едином устройстве.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка неинструментальных иммунохимических тест-методов и их применение для анализа продуктов питания и объектов окружающей среды. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

разработать иммуноферментные тест-методы для определения микотоксинов, бензо(а)пирена и 2,4,6-тринитротолуола в продуктах питания и объектах окружающей среды; осуществить выбор оптимальных параметров аналитических систем для определения как индивидуальных, так и нескольких соединений с помощью тест-методов и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА); провести сравнительную оценку чувствительности определения;

осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с ферментом;

получить поликлональные антитела к 2,4,6-тринтротолуолу и охарактеризовать их специфичность; изучить характеристики методик при использовании реагентов различной природы;

разработать новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев, помещенных в прозрачное тест-устройство цилиндрической формы;

получить новый иммуносорбент на основе наночастиц силикагеля, модифицированных антителами; изучить оптимальные условия связывания наночастиц с иммуноглобулинами; разработать и испытать иммуноферментный тест-метод для обнаружения бензо(а)пирена в воде. Разработать иммунохроматографический тест-метод на основе модифицированных наночастиц оксида железа (III), покрытых наночастицами золота и применить его для определения афлатоксина В2 в образцах красного перца.

Методы и объекты. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс иммунохимических методов анализа и физико-химических методов исследования. Объектами определения явились микотоксины: охратоксин А, зеараленон, Т-2 токсин, афлатоксин В2, цитринин и микофеноловая кислота; а также 2,4,6-тринитротолуол и бензо(а)пирен. В работе применяли такие носители для иммунореагентов, как сефароза4В и наночастицы силикагеля.

Научная новизна состоит в следующем:

Разработаны и оптимизированы тест-методы для определения индивидуальных соединений, таких как охратоксин А, бензо(а)пирен, 2,4,6-тринитротолуол и афлатоксин В2, а также групп соединений (одновременное детектирование зеараленона и Т-2 токсина в кормах; цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в сыре).

Проведена сравнительная оценка эффективности одновременного детектирования трех микотоксинов с помощью тест-метода и прямого конкурентного ИФА; определены аналитические характеристики разработанных методик.

Выделены, очищены и протестированы антитела к 2,4,6-тринитротолуолу; изучены характеристики методик его определения при использовании иммунореагентов различной природы.

Разработан новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев, помещенных в тест-устройство цилиндрической формы.

Получен новый иммуносорбент на основе наночастиц силикагеля, разработан и оптимизирован тест-метод определения бензо(а)пирена.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены иммунореагенты, поликлональные антитела к 2,4,6-тринитротолуолу, и разработаны тест-методы для индивидуального и одновременного определения нескольких микотоксинов, 2,4,6-тринитротолуола и бензо(а)пирена в реальных объектах. Разработаны

подходы к созданию тест-средств для определения нескольких аналитов в сложных матрицах. Показано, что данные тест-методы могут быть использованы для качественного и полуколичественного определения данных соединений в пиве, воде, кормах, сыре и других продуктах питания.

На защиту автор выносит:

• Новые подходы к сочетанию шагов очистка-концентрирование-определение для развития внелабораторных качественных тест-методов.

• Принципы оптимизации иммунохимических тест-методов для одновременного определения следовых количеств токсикантов в различных матрицах.

• Новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев помещенных в тест-устройство цилиндрической формы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International Mendeleev Congress (Moscow, Russia, 2007); International Society for Mycotoxicology «ISM Conference 2009» (Tulln, Austria, 2009); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов 2007-2010" (Москва, Россия 2007-2010); VI Всероссийская «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия 2007, 2010); Всероссийская конференция «Химический анализ» (Москва, Россия 2008); III Всероссийская конференция «Аналитика России» (Туапсе, Россия, 2009); Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, Россия, 2009); IV Всероссийская научно-исследовательская конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2009).

Публикации. По теме данного исследования опубликована 21 публикация, в том числе 5 статей в международных журналах из списка ВАК, 5 в сборниках статей, 1 патент РФ, 10 тезисов докладов международных и всероссийских конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 216 ссылок. Работа изложена на 167 страницах, содержит 48 рисунка и 17 таблиц.

Финансовая поддержка работы осуществлялась проектами: гранты РФФИ (10-03-91168-ГФЕН и 05-03-34828-МФ), фант НАТО-Россия (CBP.NR.CLG .982651), гранты ДААД (А0872873,2008; А0972750,2009).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В данной главе представлен обзор литературы, касающийся основных характеристик токсичных веществ (микотоксинов, бензо(а)пирена, 2,4,6-тринитротолуола), методики определения которых разрабатывались в данной работе. Рассмотрены факторы, способствующие их появлению, и влияние на организм человека и животных. Описаны иммунохимические методы определения этих токсикантов, включающие твердофазный ИФА и цеинструментальные тест-методы. Проанализированы принципы реализации каждого метода, приведены примеры их использования для определения токсикантов различных групп в продуктах питания, кормах для животных и объектах окружающей среды.

Глава 2. Экспериментальная часть

В работе в качестве определяемых веществ выбраны: Т-2 токсин, зеараленон, охратоксин А, цитринин, микофеноловая кислота, афлатоксин В2, 2,4,6-тринитротолуол, бензо(а)пирен (рис.1).

ЧУ Ч/П

нУЛ

Охратоксин А

о,*

ког

2,4,6-тринитротолуол

.го У ¿н

Бензо(а)пирен

Цитринин

ОН О

Микофеноловая кислота

Н3СО Афлатоксин В2 Рис. 1. Химические структуры анализируемых соединений

Конструкция тестов состояла из прозрачного картриджа, в который помещали детектирующий иммунослой, представляющий собой смесь геля на основе сефарозы 4В с привитыми антителами и геля с блокированными активными группами. Полученный гель помещали между пористыми

фильтрами (фритами). Варианты тестов, используемых в работе, приведены на рис. 2.

i

Л)

тг

Б) ^ В)

Рис. 2. Схема тест-колонок для определения: А) индивидуального аналита; Б) двух аналигов с контролем ложноположительных результатов (контрольный отрицательный слой); В) трех аналигов с контролем ложноположительных результатов (контрольный отрицательный слой) и ложноотрицателыак результатов (контрольный положительный слой). 1 -детектирующий слой; 2 - контрольный отрицательный слой; 3 - кошрольный положительный слой

В работе синтезированы конъюгаты: 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС)' с пероксидазой хрена (ПХ) (ТНБ-ПХ), микофеноловой кислоты с ПХ (МФК-ПХ) и 1- бензо(а)пиренбутановой кислоты с ПХ (БАП-БК-ПХ). В качестве носителя для антител (геля) использовалась сефароза 4В с цианогруппами, а так же наночастицы силикагеля (НС). Связывание антител осуществляли ковалентно, в ряде случаев посредством использования вторичных антител.

Для полуколичественной оценки результатов проводили сканирование детектирующих и контрольных слоев с использованием сканера и последующим определением значения параметров различных цветовых моделей в графическом редакторе Adobe Photoshop CS3. Было показано, что параметр насыщенности цвета S (цветовая модель HSB) является наиболее чувствительным для разрабатываемых систем с ферментативным окрашиванием (при использовании ПХ и субстрата на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензвдина). Значения S<8 соответствуют белому цвету, S>8 голубому.

1 АфВ2 - афлатоксин 132: 4-АДНТ-ГА - 4-амино-2,6-дини1ротолуол-глутаровый альдегид; 4-ДДНТ-ГА-СТИ -конъюгат 4-амино-2,6-диннтротолуол-глутаровый альдегид с соевым трипсиыовым ингибитором; 4-АДНТ-ГА-ПХ - конъюгат 4-амино-2,б-динигротолуол-глутаровый альдегида с пероксидазой хрена; Ант - антрацен, БСА - бычий сывороточный альбумин; БАП - бензо(а)пирен; БАА - беш(а)антрацен; ВЭЖХ-Фл -высокоэффективная жидкостная хроматография с флуориметрическнм детектированием; ЗЕА - зеараленон; ЗЕА-ПХ - конъюгат зеараленона с перокскдазой хрена; МФК - ыикофеноловая кислота; МФК-ПХ -конъюгат микофеноловой кислоты с пероксидазой хрена; НС - наночастицы силикагеля; HC-IgG -наночастицы силикагеля ковалентно связанные с иммуноглобулинами IgG; ОБА - овальбумин; OTA -охратоксин А; ОТА-ПХ - конъюгат охратоксина А с пероксидазой хрена; ПАУ - полициклнчсские ароматические углеводороды; ПХ - пероксидаза хрена; Пир - пирен; СТИ - соевый трипсиновый ингибитор; T2 - T-2 токсин; Т2-ПХ - конъюгат T-2 токсина с пероксидазой хрена; THT - 2,4,6-трнншротолуол; ТНБС -2,4,6-тринитробснзолсульфоновая кислота; ТНБ-ПХ - конъюгат 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты с пероксидазой хрена; ЦИТ - шпринин; ЦИТ-ПХ - конъюгат цнтришша с пероксидазой хрена.

Глава 3. Определение охратоксина А в образцах пива2

В данной главе описана разработка тест-метода для внелабораторного скрининга охратоксина A (OTA) в образцах пива на основе визуального детектирования. Метод объединил в себе концентрирование определяемого вещества и его определение. Поскольку аналитическим сигналом для определения OTA в пробе служило изменение окраски детектирующего слоя, которую фиксировали визуально, то задачей оптимизации условий явилось получение четкой разницы в окраске между положительным (отсутствие окраски) и отрицательным (развитие окраски за время детектирования) результатами при необходимом значении предела обнаружения (ПрО). На значение ПрО влияет, прежде всего, концентрация специфических антител, при увеличении которой ПрО увеличивается, а при снижении, наоборот, уменьшается. На интенсивность окраски и время ее развития влияет в значительной степени концентрация конъюгата гаптена с ферментом, в качестве которого угспользовали ПХ. Увеличение концентрации конъюгата приводит к возрастанию интенсивности окраски и сокращению времени ее развития. При фиксированной концентрации антител и конъюгата интенсивность окраски находится в обратной зависимости от содержания определяемого вещества, так как молекулы конъюгата связываются с оставшимися свободными антителами.

Также варьируемыми параметрами являлись объем пробы, ее разбавление и способ очистки. Выбраны оптимальные условия определения OTA в пиве: концентрация специфических антител -1,6 мкг/мл; конъюгата ОТА-ПХ - 5 мкг/мл; объем пропускаемой пробы 12 мл и разбавление 1:1 (об.) фосфатно-солевым буферным раствором (0,05 М) в присутствии 1% полиэтиленгликоля. Для анализа использована последовательность действий, приведенная в табл. 1.

С целью установления предела обнаружения разрабатываемого тест-метода в оптимизированных условиях изучено развитие окраски для образца пива, загрязненного OTA (0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 мкг/л). Показано, что интенсивность развития синей окраски детектирующего слоя максимальна в случае отсутствия OTA в пробе; по мере увеличения концентрации OTA интенсивность окраски снижается. При анализе образцов, содержащих OTA на уровне 0,2 мкг/л, окраска не развивается. Таким образом, ПрО тест-метода составляет 0,2 мкг/л, что соответствует максимально допустимому уровню, рекомендуемому ЕС.

Проведен анализ 33 сортов пива отечественных и зарубежных производителей. Анализ каждого образца проводили трем независимым

2 Автор выражает благодарность Prof- Sarah De Saeger (университет г. Гент, Бельгия) за предоставленные реагенты.

тестам. Для контроля возможного матричного эффекта и ложноотрицательных результатов в порцию образца вводили добавку OTA на уровне 0,2 мкг/л. Показано полное отсутствие ложноотрицательных результатов. Для подтверждения полученных результатов часть образцов проанализированы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ВЭЖХ-Фл) с предварительным концентрированием с помощью иммуноаффинной колонки. Полученные результаты представлены в табл. 2. Из приведенных данных видно, что результаты определения OTA в образцах пива, полученные с помощью тест-метода, хорошо коррелируют с данными ВЭЖХ-Фл.

Таблица 1

Последовательность проведения анализа при использовании тест-колонки с одним детектирующим слоем

№ V, мл Направление движения по колонке Примечание

12мл аликвоты

1 Внесение образца в колонку 24 Сверху вниз + 12мл ФСБ + 1% ПЭГ

2 Промывка 3 Снизу вниз ФСБ + 0,05 % Твин-20

3 Внесение коньюгата 0,05 Снизу вверх и задержать в объеме Раствор коньюгата

4 Промывка 18 Сверху вниз ФСБ + 0,05 % Твин-20

5 Внесение субстрата 0,1 Сверху вниз задержать в объеме на 30 сек. Субстрат

Таблица 2

Содержание охратоксина А в образцах пива

Пиво Иммунохимический тест-метод ВЭЖХ-Фл

OTA 0 мкг/мл OTA 0,2 мкг/мл мкг/л

Delhaize + + + 0,01

Corona — + + + 0

Sara — + + + 0,12

Saxo + + + + + + 0,49

(-) - отрицательный результат - развитие синей окраски детектирующего иммунослоя, концентрация OTA < 0,2 м кг/л;

(±) - отрицательный результат - развитие малоинтенсивной синей окраски детекшрующего иммунослоя, концентрация OTA < 0,2 мкг/л;

(+) - положительный результат - отсутствие окраски детектирующего иммунослоя, концентрация OTA >0,2 мкг/л.

Рассчитанные в соответствии с рекомендациями ЕС аналитические характеристики качественного тест-метода приведены в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Количество полученных положительных и отрицательных результатов определения OTA в

образцах пива

OTA <0,2 мкг/л OTA >0,2 мкг/л Всего

Положительный результат 1 (№гожноположит) 15 (Ыположит) 16

Отрицательный результат 8 (Noipmi) 0 (Шожноотриц) 8

Всего 9(NJ 15 (N+) 24 (N)

Таблица 4

Рассчитанные аналитические характеристики качественного тест-метода определения OTA в образцах пива (контрольный уровень OTA 0,2 мкг/л)

Характеристика Формула для расчета Значение %

Процент ложноположит. результатов (Нюмюположщ- / N J • 100 % 0

Процент ложноотриц. результатов (N.,„MlWTp„u/N+) ■ 100% 6,3

Правильность [(NnaM»«r + N«^„„1 / N] ■ 100 % 95,8

Специфичность (N^/NJ-100% 100

Чувствительность (Nn0OT/N+) • 100% 94,0

Данные табл. 4 показывают, что полученные аналитические характеристики удовлетворяют требованиям, которые предъявляются к качественному тест-методу. Рассчитанные значения правильности составляют 95,8 %, чувствительность 94 % и процент ложноотрицательных результатов < 5 %, что дает возможность сделать вывод о применимости данного метода.

Глава 4. Получение иммунореагентов и оптимизация тест-метода определения 2,4,6-тринитротолуола3

Антитела являются одними из ключевых реагентов для разработки любого иммуноанализа. В рамках настоящей работы получены иммунореагенты дня определения 2,4,6-тринитротоуола (ТНТ). Для получения поликлональных куриных антител, специфичных к ТНТ, использовали иммуногены разной структуры: 4-амино-2,6-динитротолуол-глутаровый альдегид с белком (4-АДНТ-ГА-белок), 2,4,6-тринитробензол с белком (ТНБ-белок). В качестве белка-носителя использовали соевый трипсиновый ингибитор (СТИ), бычий сывороточный альбумин (БСА) и

J Автор выражает благодарность Prof. Bruno De Meulenaer (университет г. Гент, Бельгия) за возможность проведения работы и предоставленные реагенты.

овальбумин (ОВА). Первичную иммунизацию кур проводили с помощью полного адъюванта Фрейнда, повторную реапизовывапи через 40 дней неполным адъювантом Фрейнда. Три курицы иммунизировали каждым конъюгатом и три использовали для контроля. Сбор яиц, выделение и очистку антител из желтков проводили каждую неделю. Для контроля связывания антител с антигенами использовали непрямой твердофазный ИФА.

Для исследования влияния структуры иммунореагентов на характеристики анализа изучены различные комбинации гетерологичных пар (анти-ТНБ-БСА антитела и 4-АДНТ-ГА-ПХ; анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела и ТНБ-ПХ) и гомологичных пар (анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела и 4-АДНТ-ГА-ПХ; анти-ТНБ-БСА антитела и ТНБ-ПХ) и найдены оптимальные концентрации иммунореагентов.

Для объективной оценки получаемого аналитического сигнала было необходимо развить подход к количественной интерпретации результатов. В связи с этим разработана новая методика полуколичественного определения аналитов, основанная на использовании планшетного сканера для считывания интенсивности окраски иммунослоя, находящегося внутри картриджа, с последующим применением программного обеспечения. Использование такого представления результатов позволяет сравнивать селективность и чувствительность определений.

Рис. 3. Зависимость параметра насыщенности цвета (Б) от времени развития окраски для

серии различных концентраций ТНТ со следующими парами иммунореагентов:

А - анти-ТНБ-БСА антитела и 4-АДНТ-ГА-ПХ;

Б - анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела и 4-АДНТ-ГА-ПХ;

В - анти-ТНБ-БСА антитела и ТНБ-ПХ;

Г - анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела и ТНБ-ПХ.

Из данных рис. 3 видно, что оптимальной является гомологичная пара анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела и конъюгат 4-АДНТ-ГА-ПХ; гетерологичной - анти-ТНБ-БСА антитела и конъюгат 4-АДНТ-ГА-ПХ. В оптимизированных условиях для обеих выбранных пар иммунореагентов предел обнаружения составляет 5 мкг/л, время детектирования - три минуты (рис. 4).

э,0/»

5,%

4 е 8 ю

С (ТНТ), мкг/л

С (ТНТ), мкг/л

Рис. 4. Значения параметра насыщеннности цвета (5) при определении ТНТ с помощью 4-АДНТ-ГА-ПХ. Время детектирования - 3 минуты, п=3. А - анти-ТНБ-БСА антитела, Б - анти-4-АДНТ-ГА-СТИ антитела

Для оценки специфичности теста изучена зависимость кинетики развития окраски от концентрации структурно близких веществ (ТНТ, толуол, а также для гаптенов, использованных при синтезе конъюгатов, 4-АДНТ, 2-АДНТ, ТНБС) (рис. 5). Как видно из рис. 5, в течение времени детектирования (3 мин) развитие окраски в случае ТНТ не наблюдается (кривая 6). Толуол мешающего влияния не оказывает. Следует упомянуть, что 2-АДНТ и 4-АДНТ также являются метаболитами ТНТ и могут присутствовать в природных объектах. Таким образом, тест позволяет оценивать только суммарное содержание ТНТ и этих соединений.

Для оценки влияния матрицы образца осуществляли сравнение градуировочных кривых определения ТНТ, полученных для модельных растворов, с кривыми испытуемых образцов воды. Полученные данные представлены на рис. 6. Из рисунка видно, что при загрязнении образцов воды на уровне 5 мкг/л окраска не развивалась, что свидетельствует о незначительном матричном эффекте образца.

Время, Время,

минут минут

Рис. 5. Зависимость параметра насыщенности цвета (8) от времени развития окраски детектирующего иммунослоя при определении различных структурно - родственных ТНТ соединений (С = 5 мкг/л): 1- холостой раствор; 2 - толуол; 3 - 4-АДНТ; 4 - 2-АДНТ; 5 -ТНБС; 6 - ТНТ

А - гель, связанный с анти - ТНБ-БСА антителами, Б - гель, связанный с анти - 4-АДНТ-ГА-СТИ антителами

S, %

I Холостая проба

Озерная вода

г ""*...... Речная вода

4 ~Jf— Водопроводная вода

5 — Талый снег

Рис. 6. Результат определения ТНТ в различных образцах воды с использованием анти-ТНБ-БСА антител и 4-АДНТ-ГА-ПХ, п = 3

о Л-1-1-,-,-,—

О 2 4 б 8 10

С (ТНТ). мкг л

Глава 5. Иммунохимический тест для одновременного определения зеараленоиа и Т-2 токсина4

Микотоксины продуцируются многими видами микроскопических грибов, одними из которых являются грибки рода Fusarium, способные продуцировать группу микотоксинов в продуктах растительного происхождения. В связи с этим особый интерес представляет разработка

4 Автор выражает благодарность Prof. Erwin Märtlbauer (университет Людвига-Максимилиана г. Мюнхен, Германия) за предоставленные реагенты.

методик одновременного детектирования Т-2 токсина (Т2) и зеараленона (ЗЕА).

Важным шагом разработки одновременного детектирования микотоксинов являлась оптимизация условий определения индивидуальных аналитов. Для достижения этой цели определение оптимальных концентраций иммунореагентов проводили аналогично «шахматному титрованию». Для контроля чувствительности детектирующего слоя использование две одинаковые тест-колоноки. Через колонки пропускали модельный раствор в отсутствие и присутствии ЗЕА и Т2 на уровне 10 мкг/л. Затем детектирующие слои группировали в одну тест-колонку и проводили дополнительный тест на совместное определение.

Для установления предела обнаружения разрабатываемого тест-метода было изучено развитие окраски для серии образцов пшеницы, содержащей разные уровни ЗЕА и Т2, результаты представлены на рис. 7. Из рисунка видно, что для данной системы достигнут контрольный уровень 75 мкг/кг (Э < 8), что соответствует максимально допустимому уровню, рекомендуемому ЕС (100 мкг/кг) и отечественному законодательству (максимально допустимое

Рис. 7. Значения параметра насыщенности цвета (5) контрольного слоя, ЗЕА и Т2 детектирующих слоев для загрязненных

образцов пшеницы. Время детектирования -4 минуты, п=3.

Применение тест-методов связано с возможным появлением ложноположительных результатов и неверной интерпретацией результатов наблюдателями. Для устранения этих недостатков нами предложено использование контрольного отрицательного слоя, который также показывает работоспособность теста и представляет собой гель с привитыми антителами специфическими к ферменту ПХ. В связи с этим определена оптимальная техническая конструкция тест-устройства, которая позволяет осуществлять детектирование аналитов и включала контрольный слой (рис. 26). Пример определения ЗЕА и Т2 в образце пшеницы представлены на рис. 8.

Проанализировано семь образцов комбикормов и один образец пшеницы, которые содержали ЗЕА и Т2 с концентрацией ниже 75 мкг/кг (по результатам жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором (ЖХ-МС/МС)). Для предотвращения ложноотрицательных результатов, связанных с матрицей образца, каждый

содержание 1 и 0,1 мг/кг для ЗЕА и Т2, соответственно).

Б. Уо 15

д Контр.слой отриц. р Детектирующий слой ЗЕА Детектирующий слой Т2

О 25 50 75 100

С,ЗЕА и Т2, мкг/кг

образец анализировали также с введенными добавками ЗЕА и Т2 на уровне 100 мкг/кг. Результаты исследований представлены на рис. 9.

Рис. 8. Результаты анализа образца пшеницы. Время детектирования - 4 минуты. А - незагрязненный образец,

Б - загрязненный образец (100 мкг/кг Т2 и 100 мкг/кг ЗЕА)

Я Коктр отриу СЛОК

i Детект. слой ЗЕА О Детект. слой Т2

Пшен.

Рис. 9. Зависимость параметра насыщенности цвета (Э) контрольного отрицательного слоя, детектирующего слоя ЗЕА и детектирующего слоя Т2 для незагрязненных образцов пшеницы и кормов (А) и для образцов содержащих ЗЕА и Т2 на уровне 100 мкг/кг (Б). Время детектирования - 4 минуты, п=3.

Из рисунка видно, что в пределах времени детектирования голубая окраска развивалась для контрольного отрицательного слоя и не развивалась для детектирующих слоев (рис. 9 б) Однако для образца № 7 результаты загрязненной пробы бьши такими же, как и незагрязненной, а именно развитие окраски не наблюдалось. Отсутствие окраски для контрольного слоя позволяет сделать вывод о наличии матричного эффекта и неприменимости теста для анализа данного образца. Таким образом, окраска контрольного отрицательного слоя не зависит от присутствия / отсутствия аналита, позволяет облегчить интерпретацию результатов и судить о влиянии матрицы образца или о не рабочем состоянии теста.

Глава 6. Сравнительная характеристика иммунохимических методик определения цитринина, охратоксина А и микофеиоловой кислоты

в сыре5

Представляло интерес сопоставить чувствительность разрабатываемого тест-метода и традиционного конкурентного ИФА. Это сделано на примере определения цитринина (ЦИТ), OTA и микофеноловой кислоты (МФК) в образцах сыра.

Разработка методики иммунохимического определения ЦИТ, OTA и МФК включала в себя несколько этапов: получение конъюгатов аналит-фермент, оптимизацию условий проведения определения методом твердофазного ИФА и неинструментальным тест-методом, приготовление тесг-устройства.

В связи с тем, что сыр представляет собой многокомпонентный образец, насыщенный белками, жирами и т.д., для определения микотоксинов в нем предварительно оптимизирован способ их извлечения. В качестве оптимального выбран метод, который заключался в экстракции аналигов смесью метанол/вода 70:30 (об. %) в соотношении образец/экстрагент (1:5). Образцы сыра экстрагировали, центрифугировали (10 мин., 10000 об/мин), экстракт шестикратно разбавляли. Чтобы оценить возможность применения данной методики для контроля микотоксинов в реальных образцах сыра был проведен тест на открытие ЦИТ, OTA и МФК в пробах. Для этого использовали образцы сыра, для которых достоверно известно, что не содержат искомых соединений. Процент открытия исследуемых соединений в сыре достаточно высок и составляет 85, 97 и 92 (%) для ЦИТ, OTA и МФК, соответственно.

Для контроля влияния матрицы пробы проводили анализ серии образцов сыра, искусственно загрязненных различной концентрацией ЦИТ, OTA и МФК. С целью предотвращения ложноотрицательных результатов в тест-устройство введен слой блокированного геля без антител - положительный контрольный слой, а для предотвращения ложноположительных результатов -отрицательный контрольный слой (гель с ковалентно-связанными антителами,

5 Автор выражает благодарность Prof. Erwin Märtlbauer (университет Людвига-Максимилиана г. Мюнхен, Германия) за возможность проведения работы и предоставленные реагенты.

специфичными к ПХ). Результаты тест-метода представлены на рис. 10. Полученные характеристики разработанных методик сопоставлены в табл. 5.

0 1 2 5 10 С. нг/г

Рис. 10. Определение ЦИТ, OTA и МФК, выполненное с помощью неиструментального тест-метода. Время детектирования - 7 минут, п=3.

Таблица 5

Пределы обнаружения ИФА и неиструментального тест-метода определения ЦИТ, OTA и МФК в сырах*

Микотоксин ИФА, нг/г Неиструментальный тест, нг/г

Цитринин 50 2

Охратоксин А 15 2

Микофеноловая кислота 50 2

* Р = 0,95; п = 3

При сравнении аналитических характеристик неиструментального тест-метода и ИФА (табл. 5) следует, что более чувствительным является неиструментальный тест-метод.

Глава 7. Новые носители для ковалентного связывания с биомолекулами6

Наряду с использованием известных традиционных иммуносорбентов существует необходимость поиска новых альтернативных носителей для ковалентной пришивки антител. В последние годы широкое применение находят наночастицы различной структуры и состава. Особый интерес представляют наночастицы силикагеля ЗЮ^ (НС), которые успешно применяют в классических вариантах иммуноанапиза, однако не было описано их применение в тест-методах. НС синтезированы по описанной в литературе методике. Активацию и связывание НС с биомолекулами, а именно с иммуноглобулинами (НС-^С) осуществляли посредством у-

4 Автор выражает благодарность Prof Dietmar Knopp (Технический университет Мюнхена, г. Мюнхен) Г ермания, за возможность проведения работы и предоставленные реагенты.

глицидоксипропилтриметоксисилана. В качетсве модельного анагшта ивпользовали бензо(а)пирен (БАП). Показано, что оптимальное связывание с НС наблюдается при концентрации 40 мкг/мл в течение 12 ч при 4 С. Для разработки нового тест-метода необходимо подобрать подложку для наночастиц. После сравнения четырех видов подложек (полиэтиленовый фрит, фильтровальная бумага, полиэтиленовая мембрана, нейлоновая мембрана) в качестве оптимальной выбраны полиэтиленовый фриты, обладающие низким уровнем неспецифического связывания, воспроизводимыми свойствами и позволяющие получить четко локализованное окрашенное пятно. Полиэтиленовый фрит с диаметром пор 0,2 мкм предварительно блокировали раствором БСА (3 %), затем сорбировали НС с ковалентно связанными 1§С. Далее добавляли раствор специфических антител и высушивали при 37 С. Полученный фрит с нанесенными иммунореагентами вносили в пластиковую колонку. Для установления предела обнаружения изучено развитие окраски пятна на фрите для серии модельных растворов, результаты представлены на рис. 31.

S, % 15

0 0.001 0.01 0.04 0.1 0.4 С, мкг/л

Антр

Пир

БАП

Рис. П. Зависимость параметра насыщен- Рис. 12. Зависимость параметра насыщенности цвета (Б) от концентрации БАП в ности цвета (5) от типа определяемого Г1АУ модельном растворе, п-'З анализируемых в модельных растворах. С

(ПАУ) = 0,1 мкг/л, п=3

Показано, что для данной системы в модельных растворах достигнут ПрО 0,1 мкг/л. Для оценки селективности определения БАП изучено влияние других полиароматических углеводородов (ПАУ): антрацен (Антр), бенз(а)антрацен (БАА), пирен (Пир) на развитие окраски детектирующего пятна рис. 12. Показано, что выше перечисленные ПАУ не мешают определению БАП той же концентрации.

Одной из последних тенденций нанотехнологий является разработка наноматериалов, в частности новых нанометок для биомолекул, с последующим применением в иммуноанализе. Так, получены наночастицы оксида железа (III), покрытые наночастицами золота, которые использовали в качестве меток в иммунохроматографическом тесте для определения афлатоксина В2 (АфВ2) в образцах красного перца. В оптимизированных условиях проведено сравнение чувствительности определения АфВ2 с использованием в качестве меток традиционных наночастиц золота и наночастиц оксида железа (III), покрытых наночастицами золота. Показано,

что ПрО во втором случае несколько ниже (0,9 нг/л), чем в случае золотых наночастиц (3 нг/мл).

Таким образом, использование наночастиц позволяет улучшить аналитические характеристики иммунохимических тест-методов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны подходы к созданию и оптимизации иммунохимических тест-методов для одновременного определения следовых количеств токсикантов в различных матрицах. Осуществлен выбор оптимальных параметров аналитических систем для качественного определения как индивидуальных, так и нескольких соединений с помощью тест-систем и иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Разработана тест-система для индивидуального определения микотоксинов; показана её применимость для определения охратоксина А в различных образцах пива с контрольным уровнем 0,2 мкг/л в соответствии с максимально допустимым уровнем, рекомендованным ЕС. Оптимизирована методика экстракции и пробоподготовка образца. Результаты разработанного тест-метода хорошо коррелируют с результатами, полученными методом ВЭЖХ-Фл.

3. Получены, выделены и протестированы поликлональные куриные антитела, специфичные к 2,4,6-тринитротолуолу. Установлено, что наибольшей аффинностью обладают антитела, полученные при использовании в качестве иммуногенов конъюгатов 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты с бычьим сывороточным альбуминов и 4-амино-2,6-динитротолуол-глутаровый альдегид с соевым трипсиновым ингибитором. Найдены оптимальные гомологичная и гетерологичная пары. Разработан и оптимизирован иммуноферментный колоночный тест-метод определения 2,4,6-тринитротолуола в водных объектах с пределом обнаружения 5 мкг/л.

4. Развит подход к контролю ложноположительных результатов путем введения в тест-устройство дополнительного слоя (отрицательный контроль); данный подход апробирован на тест-системе для одновременного определения зеараленона и Т-2 токсина в кормах для животных с пределом обнаружения 100 мкг/кг.

5. Проведена сравнительная оценка эффективности детектирования микотоксинов с помощью тест-системы и прямого конкурентного ИФА. Показано, что неиструментальный тест-метод (ПрО 2 нг/г) является более чувствительным, чем ИФА (ПрО 15, 50 и 50 нг/г для охратоксина А, цитринина и микофеноловой кислоты, соответственно). Разработаны и оптимизированы условия одновременного тест-определения трех аналитов на примере микотоксинов цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в сырах с двумя контрольными слоями (положительный и отрицательный контроль). Оптимизирована методика экстракции сыров для одновременного определения трех микотоксинов.

6. Получен новый иммуносорбенг на основе наночастиц силикагеля, изучены и установлены оптимальные условия связывания антител, разработаны и сконструированы новые тест-методы определения токсикантов (на примере бензо(а)пирена) в образцах воды (ПрО 0,1 мкг/л). Получены наночастицы оксида железа (III) покрытые золотыми наночастицами. На их основе разработан иммунохроматографический тест-метод определения афлатоксина В2 в образцах красного перца с пределом обнаружения 0,9 нг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Goryacheva I.Yu., Basova E.Yu., Van Peteghem C., Eremin S.A., Pussemier L., Motte J.-C., De Saeger S. Novel gel-based rapid test for non-instrumental detection of ochratoxin A in beer // Anal Bioanal. Chetn. 2008. Vol. 390. P. 723-727.

2. Burmistrova N.A., Goryacheva I.Yu., Basova E.Yu., Franki A.S., Elewaut D., Van Beneden K., Deforce D., Van Peteghem C., De Saeger S. Application of a new anti-zearalenone monoclonal antibody in different immunoassay formats // Anal. Bioanal Chem. 2009. Vol. 395. P. 13011307.

3. Tang D, Sauceda J.C., Ott S., Basova E., Goryacheva I., Biselli S., Niessner R., Knopp D. Magnetic nanogold microspheres-based lateral flow immunodipstick for rapid detection of aflatoxin B2 in food // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 25. P. 514-518.

4. Basova E.Yu., Goryacheva I.Yu., Mikhirev D.A., Rusanova T.Yu., Burmistrova N.A., Kerkaert В., Cucu Т., De Saeger S., De Meulenaer B. Rapid method for qualitative detection of 2,4, 6-tririitrotoIuene in environmental water samples II Anal. Methods. 2009. Vol. 1. P. 170-176.

5. Basova E.Yu., Goryacheva I.Yu., Burmistrova N.A., Rusanova T.Yu., Dietrich R., Maertlbauer E., Detavernier C., Van Peteghem C., De Saeger S. An immunochemical test for rapid screening of zearalenone and T-2 toxin // Anal Bioanal. Client 2010. Vol. 397. P. 55-62.

6. Горячева И.Ю., Белоглазова H.B., Басова Е.Ю., Карагушева М.А., Русанова Т.Ю. Тест-система для иммуноферментного определения токсикантов. Патент на изобретение № 2374649. Дата приоритета 04.05.2008.

7. Басова Е.Ю., Бурмистрова Н.А., Горячева И.Ю. Разработка иммунохимического тест-метода для определения охратоксина А в пиве // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. Межвуз. сборник научных трудов. Изд-во «Научная книга», Саратов, 2007. С. 170-173.

8. Карагушева М.А., Басова Е.Ю., Горячева И.Ю. Разработка иммунохимических тест-методов для определения микотоксинов в продуктах питания .// Изв. Сар-та. Ун-та.2008. Т.8. Сер. Химия. Биология. Экология. № 1. С. 39-42.

9. Басова Е.Ю. Разработка тест-метода для определения микотоксинов в продуктах питания // Materialicn zum wissenschaftlichen Seminar der Stipendiaten der Programme "Michail Lomonosov II" und Immanuil Kant II" 2008/2009.15-16 April 2009. Moscow. P. 16-19.

Ю.Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Басова Е.Ю. Юрасов H.А. Новые тест-системы для контроля содержания микотоксинов в продуктах растительного происхождения // Материалы IV Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул, 2009. Книга 2. С. 138-139.

П.Басова Е.Ю. Мультианализ микотоксинов в образцах сыра неиструментальным тестом // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. Межвуз. сборник научных трудов. Изд-во «Научная книга», Саратов, 2010. С. 195-197.

12.Goryacheva I.Yu.. Karagusheva М.А., Basova E.Yu., De Saeger S., Lobeau M., Van Petegem C. Gel-based non-instrumental immunoassay for mycotoxin détection // International Mendeleev Congress. 21-26 September 2007. Moscow. Book of abstract P. 23.

13.Басова Е.Ю. Разработка неинструментального тест-метода для определения охратоксина А в образцах пива // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». 12-15 апреля. 2007. Москва. С.10.

14.Басова Е.Ю., Бурмистрова Н.А., Горячева И.Ю. Иммунохмический метод для определения охратоксина А в продуктах питания // Материалы Всероссийской конференции «Химический анализ». Апрель 21-25.2008. Москва. Россия. С. 79-80.

15. Васина Л.А., Басова Е.Ю., Горячева И.Ю.Иммунохимический тест-метод для определения Т-2 токсина в зерне // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». 8-11 апреля. 2008. Москва. С.19.

16.Голованова Т.В., Басова Е.Ю. Иммунохимическое определение охратоксина А в кормах // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». 8-11 апреля. 2008. Москва. С. 25.

17.Basova Е. Yu., Goryacheva I. Yu., De Saeger S. Simultaneous noninstrumental détection of T-2 toxin and zearalenone using a clean-up tandem immunoassay column // International Society for Mycotoxicology «ISM Conférence 2009» September 9-11, 2009. Tulln. Austria. Book of abstract P. 158.

18.Басова Е.Ю., Горячева И.Ю.. Иммунохимический метод определения микотоксинов в кормах // III Всероссийская конференция «Аналитика России». Сентябрь 27-3 Октябрь. 2009. Туапсе. Россия. С. 71.

19.Басова Е.Ю. Видяшев С.С., Потапкина Д.А., Болатова А.Г. Быстрые методы определения токсинов // Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. 27-28 Октябрь. 2009. Саратов. Россия. С. 102.

20.Басова ЕЛО. Иммунохимический тест для быстрого скрининга зеараленона и Т-2 токсина в образцах корма // XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». 13-18 апреля. 2010. Москва. С. 11.

21.Басова Е.Ю. Неиструментальный колоночный тест для одновременного детектирвоания цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в образцах сыра // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». 12-16 апреля. 2010. Москва. С. II.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 30.09.2010

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 120 экз. Заказ 0397_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачевская, 161, офис 320 3 27-26-93

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I 1 Общая характеристика микотоксинов

1 2 Иммунохимические методы определения

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ и зз

2 1 Вещества и материалы зз 2 2 Получение и выделение антител 38 2 3 Приготовление носителей и связывание с антителами

2 4 Аппаратура и техника измерений

ГЛАВА 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А В ОБРАЗЦАХ ПИВА

3 1 Принцип действия тест-метода

3 2 Иммунохимическое тест-определение охратоксина А в модельных растворах

3 3 Иммунохимическое тест-определение OTA в образцах пива

3 4 Анализ образцов пива

ГЛАВА 4 ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОРЕАГЕПТОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ

ТЕСТ-МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА

4 1 Получение и тестирование полпклональных антисывороюк

4 2 Изучение влияния структуры иммунореагентов на аналитические характерна ики тест — метода

4 3 Минимизация неспецифической сорбции

4 4 Оптимизация тест - метода

4 5 Определение 2,4,6-тринитротолуола в образцах воды с помощью тест-метода

ГЛАВА 5 ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА И Т-2 ТОКСИНА

5 1 Выбор оптимальных условий реализации колоночного тестметода для одновременного детектирования зеараленона и Т-2 токсина

5 2 Разработка тест - устройства, оптимизация техники эксперимента для совместного детектирования аналитов

5 3 Анализ образцов пшеницы

5 4 Иммунохимическое определение Т-2 токсина и ЗЕА в кормах для

ЖИВОТНЫХ

ГЛАВА 6 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТРИПИНА. ОХРАТОКСИНА А И МИКОФЕНОЛОВОЙ КИСЛОТЫ В СЫРЕ Ю

6 1 Изучение активности пероксидазных конъюгатов по

6 2 Разработка иммуноферментного анализа определения цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты

6 3 Разработка неиструментального тест—метода для мультиопределения микотоксинов на примере цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты

6 4 Оптимизация пробоподготовки сыра

6 5 Одновременное определение цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в образцах сыра с использованием тест-метода и иммуноферментного анализа

ГЛАВА 7 НОВЫЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ КОВАЛЕНТНОГО СВЯЗЫВАНИЯ С БИОМОЛЕКУЛАМИ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ

7 1. Синтез наночастиц силикагеля и связывание антител 129 7 2 Разработка тест-метода для определения токсикантов iз i

ВЫВОДЫ

Актуальность темы. Увеличение количества нормируемых контаминантов пищевых продуктов и ужесточение требований по их максимально допустимому содержанию приводят к необходимости разработки высокочувствительных методик определения. Наряду с широким использованием хроматографии, актуальной является разработка недорогих и простых тест-устройств для экспрессного определения токсичных соединений в пищевых продуктах и природных объектах. Широкое распространение получили тест-методы, основанные на принципах биологического узнавания. Использование специфических взаимодействий антиген-антитело позволяет проводить идентификацию и количественное определение большого круга целевых аналитов. Данные тесты не требуют сложной процедуры пробоподготовки, быстры в получении аналитической информации, а также доступны для использования вне лаборатории, что делает разработку иммунохимических тест-методов одним из наиболее перспективных направлений современной аналитической химии. В настоящее время проводятся исследования преимущественно в области иммунохроматографических и иммунофильтрационных мембранных тест-средств.

К моменту начала исследований, представленных в данной работе, -были описаны лишь единичные примеры иммунохимических колоночных тестов. В данной работе основное внимание было уделено: повышению чувствительности; одновременному определению нескольких аналитов; устранению матричного эффекта образца; упрощению интерпретации результатов; развитию подходов к полуколичественному определению. Отличительной особенностью разрабатываемых систем является совмещение функций очистки, концентрирования и определения в едином устройстве.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка неинструментальных иммунохимических тест-методов и их применение для анализа продуктов питания и объектов окружающей среды. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

-разработать иммуноферментные тест-методы для определения микотоксинов, бензо(а)пирена и 2,4,6-тринитротолуола в продуктах питания и объектах окружающей среды; осуществить выбор оптимальных параметров аналитических систем для определения как индивидуальных, так и нескольких соединений с помощью тест-методов и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА); провести сравнительную оценку чувствительности определения;

-осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с ферментом;

-получить поликлональные антитела к 2,4,6-тринтротолуолу и охарактеризовать их специфичность; изучить характеристики методик при использовании реагентов различной природы;

-разработать новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев, помещенных в прозрачное тест-устройство цилиндрической формы;

-получить новый иммуносорбент на основе наночастиц силикагеля, модифицированных антителами; изучить оптимальные условия связывания наночастиц с иммуноглобулинами; разработать и испытать иммуноферментный тест-метод для обнаружения бензо(а)пирена в воде. Разработать иммунохроматографический тест-метод на основе модифицированных наночастиц оксида железа (III), покрытых наночастицами золота и применить его для определения афлатоксина В2 в образцах красного перца.

Методы и объекты. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс иммунохимических методов анализа и физико-химических методов исследования. Объектами определения явились микотоксины: охратоксин А, зеараленон, Т-2 токсин, афлатоксин В2, цитринин и микофеноловая кислота; а также 2,4,6-тринитротолуол и бензо(а)пирен. В работе применяли такие носители для иммунореагентов, как сефароза 4В и наночастицы силикагеля.

Научная новизна состоит в следующем:

Разработаны и оптимизированы тест-методы для определения индивидуальных соединений, таких как охратоксин А, бензо(а)пирен, 2,4,6-тринитротолуол и афлатоксин В2, а также групп соединений (одновременное детектирование зеараленона и Т-2 токсина в кормах; цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в сыре).

Проведена сравнительная оценка эффективности одновременного детектирования трех микотоксинов с помощью тест-метода и прямого конкурентного ИФА; определены аналитические характеристики разработанных методик.

Выделены, очищены и протестированы антитела к 2,4,6-тринитротолуолу; изучены характеристики методик его определения при использовании иммунореагентов различной природы.

Разработан новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев, помещенных в тест-устройство цилиндрической формы.

Получен новый иммуносорбент на основе наночастиц силикагеля, разработан и оптимизирован тест-метод определения бензо(а)пирена.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены иммунореагенты, поликлональные антитела к 2,4,6-тринитротолуолу, и разработаны тест-методы для индивидуального и одновременного определения нескольких микотоксинов, 2,4,6-тринитротолуола и бензо(а)пирена в реальных объектах. Разработаны подходы к созданию тест-средств для определения нескольких аналитов в сложных матрицах. Показано, что данные тест-методы могут быть использованы для качественного и полуколичественного определения данных соединений в пиве, воде, кормах, сыре и других продуктах питания.

На защиту автор выносит:

• Новые подходы к сочетанию шагов очистка-концентрирование-определение для развития внелабораторных качественных тест-методов.

• Принципы оптимизации иммунохимических тест-методов для одновременного определения следовых количеств токсикантов в различных матрицах.

• Новый подход к измерению цветометрических характеристик и численной оценке интенсивности окраски иммунослоев помещенных в тест-устройство цилиндрической формы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International Mendeleev Congress (Moscow, Russia, 2007); International Society for Mycotoxicology «ISM Conference 2009» (Tulln, Austria, 2009); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов 20072010" (Москва, Россия 2007-2010); VI Всероссийская «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия 2007, 2010); Всероссийская конференция «Химический анализ» (Москва, Россия 2008); III Всероссийская конференция «Аналитика России» (Туапсе, Россия, 2009); Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, Россия, 2009); IV Всероссийская научно-исследовательская конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2009).

Публикации. По теме данного исследования опубликована 21 публикация, в том числе 5 статей в международных журналах из списка ВАК, 5 в сборниках статей, 1 патент РФ, 10 тезисов докладов международных и всероссийских конференций. и

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 216 ссылок. Работа изложена на 167 страницах, содержит 48 рисунка и 17 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны подходы к созданию и оптимизации иммунохимических тест-методов для одновременного определения следовых количеств токсикантов в различных матрицах. Осуществлен выбор оптимальных параметров аналитических систем для качественного определения как индивидуальных, так и нескольких соединений с помощью тест-систем и иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Разработана тест-система для индивидуального определения микотоксипов; показана её применимость для определения охратоксина Л в различных образцах пива с контрольным уровнем 0,2 мкг/л в соответствии с максимально допустимым уровнем, рекомендованным ЕС. Оптимизирована методика экстракции и пробоподготовка образца. Результаты разработанного тсст-мстода хорошо коррелируют с результатами, полученными методом ВЭЖХ-Фл.

3. Получены, выделены и протестированы поликлональпые куриные антитела, специфичные к 2,4,6-тринитротолуолу. Установлено, что наибольшей аффинностью обладают антитела, полученные при использовании в качестве иммуногенов конъюгатов 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты с бычьим сывороточным альбуминов и 4-амино-2,6-динитротолуол-глутаровый альдегид с соевым трипсиновым ингибитором. Найдены оптимальные гомологичная и гетерологичная пары. Разработан и оптимизирован иммуноферментный колоночный тест-метод определения 2.4,6-тринитротолуола в водных объектах с пределом обнаружения 5 мкг/л.

4. Развит подход к контролю ложноположительных результатов путем введения в тест-устройство дополнительного слоя (отрицательный контроль); данный подход апробирован на тест-системе для одновременного определения зеараленона и Т-2 токсина в кормах для животных с пределом обнаружения 100 мкг/кг.

5. Проведена сравнительная оценка эффективности детектирования микотоксинов с помощью тест-системы и прямого конкурентного ИФА Показано, что неиструментальный тест-метод (ПрО 2 нг/г) является более чувствительным, чем ИФА (ПрО 15, 50 и 50 нг/г для охратоксина А. цитрттштпа и микофеноловой кислоты, соответственно). Разработаны и оптимизированы условия одновременного тест-опредсления трех аналитов на примере микотоксинов цитринина, охратоксина А и микофеноловой кислоты в сырах с двумя контрольными слоями (положительный и отрицательный контроль). Оптимизирована методика экстракции сыров для одновременного определения трех микотоксинов.

6. Получен новый иммуносорбент на основе наночастиц силикагеля, изучены и установлены оптимальные условия связывания антител, разработаны и сконструированы новые тест-методы определения токсикантов (на примере бензо(а)пирена) в образцах воды (ПрО 0,1 мкг/л). Получены наночастицы оксида железа (III) покрытые золотыми наночастицами. На их основе разработан иммунохроматографический тест-метод определения афлатоксина В2 в образцах красного перца с пределом обнаружения 0,9 нг/мл.

1. Монастырский О.А. Современное состояние и проблемы исследования токсиногенпых грибов, поражающих злаковые культуры. Пущино: Актуальные вопросы биологизации защиты растений, 2000. С.79-89.

2. European Commission. Commission Regulation 683/2004 of 13 April 2004 amending Regulation (EC) No 466/2001 as regards ailatoxms and ochratoxin A in foods for infants and young children // Off. J. Eur. Commun 2004. Vol. LI06. P. 3-5.

3. European Commission, Commission Regulation 123/2005 of 26 January 2005 amending Regulation (EC) N. 466/2001 as regards ochratoxin A // Off. J. Eur. Commun. 2005. Vol. L25. P. 3-5.

4. European Commission, Commission Recomendation 576/2006 of 17 January 2005 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding // Off. J. Eur. Commun. 2006. Vol. L229. P. 7-9.

5. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. JI.: Химия, 1982. С. 215.

6. Song, Y.F., Jing, X., Fleischmann, S. and Wilke, B.-M. Comparative study of extraction methods for the. determination of PAHs from contaminated soils and sediments // Chemosphere. 2002. Vol. 48. P. 993-1001.

7. Lüthje, К., Hyotylainen, Т. and Riekkola, M.-L. On-line coupling of microporous membrane liquid-liquid extraction and gas chromatography in the analysis of organic pollutants in water // Anal. Bioanal. Chem. 2004. Vol. 378. P. 1991-1998.

8. Shariati-Feizabadi S., Yamini Y., Bahramifar. N. Headspace solvent microextraction and gas chromatographic determination of some polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples // Anal. Chim. Acta. 2003. Vol. 489. P. 21-31.

9. Lage Yusty M.A., Cortizo Davina J.L. Supercritical fluid extraction and highperformance liquid chromatography-fluorescence detection method for polycyclic aromatic hydrocarbons investigation in vegetable oil // Food Control. 2005. Vol. 16. P. 59-64.

10. Librando V., Hutzinger O., Tringali G. and Aresta M. Supercritical fluid extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons from marine sediments and soil samples // Chemosphere. 2003. Vol. 54. P.l 189-1197.

11. Visconti A, Pascale M, Centonze G. Determination of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography//!. Chromatogr. A 1999. Vol. 864. P. 89-101.

12. Visconti A., Pascale M., Centonze G. Determination of ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity column clean-up and LC analysis with fluorometric detection: Collaborative study // J. AO AC Int. 2001a. Vol. 84. № 6. P. 1818 1827.

13. Batlle R. Carlsson H., Holmgren E., Colmsjo A., Crescenzi C. On-line coupling of supercritical fluid extraction with highperformance liquid chromatography for the detection of explosives in vapour phases // J. Chromatogr. 2002. Vol. 963. P. 73-82.

14. Krska R., Molinelli A. Mycotoxin analysis: State of the art and future trends // Anal. Bioanal. Chem. 2007. Vol. 387. P. 145-148.

15. Яшин Я.И. Яшин А.Я. Анализ пищевых продуктов и напитков методами высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографии с электрохимическими детекторами // Журн. аналит. химии. 2004. Т. 59. № 12. С. 1237-1243.

16. Панин С.Н., Никитин Ю.С., Петренко В.В. // Журн. аналит. химии 1989. Т. 44. № 12. С. 2235-2242.

17. Beier R.C., Stanker L.H. Application of Immunoassay for Detection of Antibiotics in Foods and Feed: A Review. Recent Res. Develop. // Agric. Food Chem. 2000. Vol. 4. P. 59-93.

18. Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Бурмистрова Н А., Де Сайгер с Иммунохимическис методы опредеелния миктоксинов // Журн. аналит. хим.2009. Т.64. №8. С.788-806.

19. Maragos С М. Emerging technologies for mycotoxin detection // J Toxic. Toxin Rev. 2004. Vol. 23. P. 317-344.

20. Goryacheva IY, De Saeger S, Eremin SA, Van Peteghem C. Immunochemical methods for rapid mycotoxin detection: Evolution from single to multiple analyte screening//Food Addit. 2007. Contain. Vol. 61. P. 169-1183.

21. Тутельян В.А. Природные токсины и проблемы биобезопасности // Тез. док. 2-го съезда токсикологов России. Российский регистр потенциальноопасных химических и биологических веществ Минздрава России. М., 2003. С. 32-35.

22. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Кислякова О.С. Актуальность изучения проблемы охратоксикоза в России // Успехи медицинской микологии. Т. 1. М: Нац. Акад. микологии. 2003. С. 122-124.

23. Жуленко В.Н., Рабинович М.И., Таланов Г.А. Ветеринарная токсикология /Под ред. В.Н. Жуленко. М.: КолосС. 2004. С. 384.

24. Кузнецов А.Ф. Ветеринарная микология. СПб. :Изд-во«Лань»,2001. С.416.

25. Monaci L., Palmisano F., Matrella R., Tantillo G. Rapid and efficient chiral separation of nateglinide and its 1-enantioraer on monolithic molecularly imprinted polymers //J. Chromatogr. A. 2005. Vol. 10.90. P. 184-187.

26. Аксенов И.В., Эллер К.И., Тутельян В.А. Оптимизация аналитических методов количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах // Гигиеиа и сан. 2006. № 4. С. 50-53.

27. Blesa J., Berrada Н., Soriano J.M., Molto J.C., Manes J. A comparison between enzyme immunoassay and HPLC for ochratoxin A detection in green, roasted and instant coffee //J. Chromatogr. A. 2004. Vol. 1046. P. 127-131.

28. Reinsch M., Topfer A., Lehmann A., Nehls IPanne U. Determination of ochratoxin A in beer by LC-MS/MS ion trap detection // Food Chemistry. 2007. Vol. 100. P. 312-317.

29. Santos E.A., Vargas E.A Immunoaffinity column clean-up and thin layer chromatography for determination of ochratoxin A in green coffee. // Food Add. Contain. 2002. Vol. 19. № 5. P. 447-458.

30. Moss MO, Thrane U Development of a Generic PCR Detection of 3-Acetyldeoxynivalenol-,15-Acetyldeoxynivalenol- and Nivalenol-Chemotypes of Fusarium graminearum Clade // Toxicol. Lett. 2004. Vol. 153. P. 23-28.

31. Кривцов В. Фузариозы и фузариотоксикозы // Птицеводство. 1999. №5. С. 39-42.

32. Хмелевский Б.Н., Пилипец З.И., Малиновская JT.C. и др. Профилактика микотоксикозов животных. М.: Агроиромиздат. 1985. С. 271.

33. Труфанов О В. Метаболизм Т-2 токсина неспецифическими эстеразами крови in vitro //Успехи медицинской микологии. М: Национальная академия микологии. 2003. Т.1. С. 181-183.

34. Johanning Е., Biagini R.3 Hull D.-L. et al. Health and immunology study following exposure to toxigenic fungi (Stachybotrys chartarum) in a water-damaged office environment // Int. Arch. Occup. Environ. Health. 1996. Vol. 68. P. 207-218.

35. Johanning E., Garies E.L., Hintikka E.-L. // Appl. Industr. Hygiene J. 1998. Vol. 54. № 11. P. 305-312.

36. Langseth, W., Rundberget, T. Instrumental methods for determination of nonmacrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuffs and cultures // J. Chromatogr. A. 1998.Vol. 815. P. 103-121.

37. Котик A.H., Труфанова В.А. Биоавтографический метод определения трихотеценовых микотоксинов в зерне и продуктах его переработки // Гигиена и санитария. 1989. №9. С. 53-54.

38. Тапака Т. Yoneda A., Inoue S., Sugiura Y., Ueno Y. Simultaneous etermination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr A. 2000. Vol.882. №1-2. P. 23-28.

39. ЗО.Микотокснны: Совместное издание Программы ООН по окружающей среде и ВОЗ (Гигиенические критерии состояния окружающей среды). М: Медицина. 1982. С. 146.

40. Tanaka Т., Yoneda A., Inoue S., Dugiura Y., Ueno Y. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 882. P. 23-28.

41. Lemieux P.M., Lutes C.C., Santoianni D.A. Emissions of organic air toxics from open burning: a comprehensive review // Progr. Energy Comb. Sci. 2004. Vol. 30. № 1. P. 1- 32.

42. Покровский A.A., Лашнева H.B., Станева М.П. и др. К теории биохимического действия афлатоксинов // Проблемы медицинской химии. М.: «Медицина», 1973. С. 106-127.

43. Tilton F., Benson W.H., Schlenk D. Elevation of serum 17-beta-estradioI in channel catfish following injection of 17-beta-estradiol, ethynyl estradiol, estrone, estriol and estradiol-17-beta-glucuronide // Env. Toxic. Pharm. 2001. Vol. 9. P. 169-172.

44. Пурмаль А.П., Антропогенная токсикация планеты // Соровский образовательный журнал. 1998. №9. С. 46-51.

45. Rodenhiser A. Perturbation of Polyelectrolyte-Surfactant Binding by Cationic Quenchers and its Effects on Fluorescence Quenching Determination of Aggregation Numbers //J. Phys. Chem. B. 1999. Vol. 103. P. 2970 2972.

46. Pandey S., Acree W.E., Fetzer J.C. Cetylpyridinium chloride micelles as a selective fluorescence quenching solvent media for discriminating between alternant versus nonalternant polycyclic aromatic hydrocarbons // Talanta. 1997. Vol. 45. P. 39-45.

47. Groner M., Muroski A.R., Myrick M.L. Identification of major water-soluble fluorescent components of some petrochcmicals // Mar. Poll. Bull. 2001. Vol. 42. P. 935-941.

48. Liguori L., Heggstad K., Helge T. Hove, Julshamn K. An automated extraction approach for isolation of 24 polyaromatic hydrocarbons (PAHs) from various marine matrixes //Anal. Chim. Acta. 2006. Vol. 573-574. P. 181-188.

49. Knopp D., Seifert M., Vaananen V., Niessner R. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated water and soil samples with immunological and chromatographic methods // Environ. Sci. and Technol. 2000. Vol. 34. № 10. P. 2035 -2041.

50. Bhattacharya, D., Bhattacharya, R., Dhar, Т. K. A novel signal amplification technology for ELISA based on catalyzed reporter deposition. Demonstration of its applicability for measuring aflatoxin B1 //J. Immunol. 1999. Meth. Vol. 230. P. 71-86.

51. Буркин M. А., Яковлева И. В., Свиридов В. В. Определение афлатоксина в ИФА с использованием моноклональных антител // Успехи медицинской микологии. 2001. Т.1 Г.4. С. 127-130.

52. Возняк М.В., Лушников К.В., Шамборант О.Г., Винокуров Л.М., Возняк В.М. // 3 Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 14-18 марта, 2005: Материалы конгресса. Ч. 2. М. 2005. С. 95.

53. Bryselbout С., Henner P. Carsignol J. Lichtfouse E. Polycyclic aromatic hydrocarbons in highway plants and soils. Evidence for a local distillation effect // Analysis. 2000. Vol. 28. P. 290 293.

54. Scharnweber Т., Fisher M. Suchanek M., Knopp D., R. Niessner Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzoa.pyrene Immunogcn. Fres //J. Anal. Chem. 2001. Vol. 371. P. 578-585.

55. Quan, Y., Zhang. Y., Wang, S., Lee, N., and Kennedy, I.R. A rapid and sensitive chemiluminescence enzyme-liked immunosorbent assay for the determination of fumonisin B1 in food samples // Anal. Chim. Acta. 2006. Vol. 580. № 1. P. 1-8.

56. Gathumbi, J.K., Usleber, E., and Martlbauer Production of ultrasensitive antibodies against a.atoxin B1 // Lett. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 32. № 5. P. 349351.

57. Garden S.R., Strachan N.J.C Novel colorimetric immunoassay for detection of aflatoxin В1//Anal. Chim. Acta. 2001. Vol. 444. P. 187-191.

58. Huang В. Tao W.Y., Shi J., Tang L., Jin J. Determination of ochratoxin A by polyclonal antibodies based sensitive time-resolved lluoroimmunoassay // Arch. Tox. 2006. Vol. 80. № 8. P. 481-485.

59. Sapsford K.E., Ngundi M.M., Moore M.H., Lassman M.E., Shriver-Lake L.C., Taitt C.R., Ligler F.S. Rapid detection of foodborne contaminants using an Array Biosensor // Sens. Actuators B. 2006. Vol. 113. P. 599-607.

60. Yu F.Y., Chi T.F., Liu B.H., Su C.C. Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of ochratoxin A // J.Agric. Food Chem. 2005. Vol. 53. P. 6947-6953.

61. Золотов Ю. А. О тест-методах // Жури, аналит. химии. 1996. Т. 51. № 10. С. 1029-1030.

62. Евгеньев М. И. Тест-методы и экология // Сор. Обр.журн. 1999. № 11. С. 29-34.

63. Меркушев В. А., Моросанова Е. И. Возможности и перспективы применения тест-систем. //Партнеры и конкуренты. 2005. № 9. С. 23-29.

64. Huang B., Tao W., Shi J. Tang L. Jin J., Immunochemical methods of mycotoxin analysis // Arch.Toxicol. 2006. Vol. 80. № 8. P. 481-485.

65. Cozzini P., Ingletto G., Singh R., DalFAsta Ch. Mycotoxin Detection Plays "Cops and Robbers": Cyclodextrin Chemosensors as Specialized Police? // Int J Mol Sci. 2008. Vol. 9. № 12. P. 2474-2494.

66. Ho J.A.A., Wauchope R.D. A strip liposome immunoassay for aflatoxin B-l // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 1493-1496.

67. SO.Delmulle B.S., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. Development of an immunoassay-based lateral flow dipstick fort herapid detection of AflatoxinB 1 inpig feed//J. Agric. Food Chem. 2005. Vol. 53. P. 3364-3368.

68. Collin R., Schneider E., Briggs L., Towers N. Development of immunodiagnostic field tests for the detection of the mycotoxin. sporidesmin A // Food and Agricultural Immunology. 1998. Vol. 10. P. 91-104.

69. Usleber E., Schneider E., Martlbauer E. Terplan G. Two formats of enzyme immunoassay for 15-acetyldeoxynivalenol applied to wheat //J. Agric. Food Chem. 1993. Vol. 41. P. 2019.

70. Schneider E., Curtui V., Seidler C., Dietrich R.r Usleber E.; Martlbauer E. Rapid methods for deoxynivalenol and other trichothecenes. // Tox. Lett. 2004. Vol. 153. P. 113-121.

71. Schneider E., Usleber E., Martlbauer E., Deitrich R. Terplan G. Multimycotoxin dipstick enzyme immunoassay applied to wheat // Food Add.Contam. 1995. Vol. 12. P. 387-393.

72. Abouzied. M. M., Pestka, J. J. Simultaneous screening of fumonisin Bu allatoxin Bi, and zearalenone by line immunoblot: a computer-assisted multianalyte assay system //J. AO AC Int. 1994. Vol. 77. P. 495.

73. Wang. S., Quan, Y., Lee, NJ. & Kennedy. IR., 'Rapid determination of fumonisin B-l in food samples by enzyme-linked Immunosorbent assay and colloidal gold immunoassay' // J. Agric. Food Chem. 2006. Vol. 54. № 7. P. 24912495.

74. De Saeger S., Van Peteghem C. Dipstick enzyme immunoassay to detect Fusarium T-2 toxin in wheat // Applied and Environmental Microbiology. 1996. Vol. 62. P. 1880-1884.

75. De Saeger S., Van Peteghem C. Flow-Through Membrane-Based Enzyme Immunoassay for Rapid Detection of Ochratoxin A in Wheat // J. Food Protect. 1999.Vol. 62. P. 65.

76. Sibanda L, De Saeger S. Van Peteghem C; Grabarkiewicz-Szczesna J, Tomczak M. Detection of T-2 toxin in different cereals by flow-through enzyme immunoassay with a simultaneous internal reference // J. Agric. Food Chem. 2000. Vol. 48. P.5864-5867.

77. De Saeger S, Sibanda L, Desmet A, Van Peteghem C. A collaborative study to validate novel field immunoassay kits for rapid mycotoxin detection // Int. J. Food Microbiol. 2002. Vol. 75. P. 135-142.

78. Sibanda L, De Saeger S, Van Peteghem C. Development of a portable field immunoassay for the detection of aflatoxin Ml in milk // Int. J. Food Microbiol. 1999. Vol.48. P.203-209.

79. Pal A., Acharya D. Saha D., Roy D., Dhar T.K. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxinB in food samples// J. Food Prot. 2005. Vol. 68. P. 2169-2177.

80. Paepens C, De Saeger S, Sibanda L, Barna-Vetro I, Leglise I, Van Hove F, Van Peteghem C. A (low-through enzyme immunoassay for the screening of fumonisins in maize // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol.523. P. 229-235.

81. Keuchel C., Niessner R. Rapid field screening test for determination of 2,4,6-trinitrotoluene in water and soil with immunofiltration Presenilis" // J. of Anal. Chem. 1994. Vol. 350. P. 538-543.

82. Schuetz A. J.: Winklmair M., Weller M. G., Niessner R. Fresenius Selection of Hapten structures for indirect immunosensor arrays // J. Anal. Chem. 1999. Vol. 363. P. 625-631.

83. Hawkes R. Identification of concanavalin A-binding proteins after sodium dodecyl sullate-gel electrophoresis and protein blotting // Anal. Biochem. 1982. Vol. 123. P. 143.

84. Saha D, Acharya D, Dhar TK. Method for homogeneous spotting of antibodies on membranes: Application to the sensitive detection of ochratoxin A // Anal. Bioanal. Chem. 2006. Vol. 385. P. 847-854.

85. Pal A., Acharya D., Saha D. Dhar T.K. Development of a membrane-based immunofiltration assay for the detection of T-2 toxin // Anal. Chem. 2004. Vol.76. P. 4237-4240.

86. Pal A, Acharya D, Saha D, Dhar TK. Development of a membrane-based immunofiltration assay for the detection of T-2 toxin // Anal. Chem. 2004. Vol. 76 № 14. P. 4237-4240.

87. Saha D., Acharya D., Roy D. Shrestha D., Dhar T.K. Simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin B1 and ochratoxin A in chili samples // Anal. Chim. Acta. 2007. Vol. 584. № 2. P. 343-349.

88. Sibanda L., De Saeger S., Van Peteghem C., Grabarkiewicz-Szczesna J. Tomczak M. Detection of T-2 Toxin in different cereals by flow-throgh enzyme immunoassay with a simultaneous internal rcferencc // J. Agric. Food Chem. 2000. Vol. 48. P. 5864-5867.

89. Sibanda L, De Saeger S, Barna-Vetro I, Van Peteghem C. Development of a solid-phase cleanup and portable rapid flowthrough enzyme immunoassay for the detection of ochratoxin A in roasted coffee // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50. P. 6964-6967

90. Pal A., Dhar T.K. An analytical device for on-site immunoassay. Demonstration of its applicability in semiquantitative detection of aflatoxin B1 in a batch of samples with ultrahigh sensitivity // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 98104

91. Goryacheva I. Yu., Rusanova T. Yu., Burmistrova N. A., De Saeger S. Immunochemical Methods for the Determination of Mycotoxins // J. Anal. Chem. 2009 Vol. 64. №. 8. P. 768-785.

92. Goryacheva I. Yu., De Saeger S., Nesterenko I.S, Eremin S.A., Van Peteghem C. Rapid all-in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of ochratoxin A in high-coloured herbs and spices // Talanta 2007. Vol. 72. P. 1230-1234.

93. Gory ache va I. Yu.,. Karagusheva M. A, Van Peteghem C., Sibanda L., De Saeger S. Immunoaffinity pre-concentration combined with on-column visual detection as a tool for rapid ailatoxin Ml screening in milk // Food Contr. 2009. Vol. 20. P. 802-806.

94. De Meulenaer B.„ Baert K., Lanckriet H., Van Hoed V., Huychebaert A. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for bisphenol a using chicken immunoglobulins // J. Agrie. Food Chem. 2002. Vol. 50. P. 5273-5282.

95. De Meulenaer В., Huyghebaert A. Isolation and purification of chicken immunoglobulins//Areview. FoodAgric.Immunol.2001. Vol.13. P.275-288.

96. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Кислякова O.C. Актуальность изученияпроблемы охратоксикоза в России // Успехи медицинской микологии. М: Нац. Акад. микологии. 2003. Т. 1. С. 122-124.

97. Жулепко ВН., Рабинович М.И. Таланов Г.А. Ветеринарная токсикология /Под ред. В.Н. Жуленко. М.: Колос. С. 2004; С. 384.

98. Кузнецов А.Ф. Ветеринарная микология. СПб.: Изд. «Лань». 2001. С. 416.

99. Ngundi MM., Shriver-Lake L.C., Moore М.Н., Lassman M.E., Ligler F.S., Taitt C.R. Array Biosensor for Detection of Ochratoxin A in Cereals and Beverages // Anal. Chem. 2005. T77. №1. C. 148-154.

100. P. А. Ахмадышин, А. В. Канарский, 3. А. Канарская Микотоксины контаминанты кормов П 2007. №2. С. 88-103.

101. Bedele A. M., Carlton W.s Krogh P., Lillehoj E. B. Binding of Ochratoxin A to a Urinary Globulin: A New Concept to Account for Gender Difference in Rat Ncphrocarcinogenic Responses //J. Nat. Cancer Inst. 1985. Vol. 75. P. 773-774.

102. Bruinink A. Sidler С The Neurotoxic Effects of Ochratoxin-A Are Reduced by Protein Binding but Are Not Affected byl-Phenylalanine // Tox. Appl.Pharm. 1997. Vol. 146. P. 173-179.

103. Entwisle А.С., Williams А.С., Mann P.J., Slack P.T., Gilbert J. Liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup for determination of ochratoxin A in barley: collaborative study // J. AO AC Int. 2000. T83. №6. 1377-1383.

104. Rizzo A. Eskola M. Atroshi M. Ochratoxin A in cereals, foodstuffs and human plasma//Eur. J. Plant Pathol. 2002. Vol. 108. P. 631-637.

105. Studer-Rohr J., Schlatter J., Schlatter C„ Dietrich D. R. Intraindividual variation in plasma levels and kinetic parameters of ochratoxin A in humans. Arch. Toxicol. 2000. Vol. 74. P. 499-520.

106. Patel S„ Hazel C.M., Winterton A.G.M., Gleadle A.E. Surveillance of fumonisins in UK maize-based foods and cereals // Food Addit. Contam. 1997. Vol. 14. №2. P. 187-191.

107. Ottender H., Majerus P. Occurrence of ochratoxin A (ochratoxin A) in wines: Influence of the type of wine and its geographical origin // Food Addit. Contam. 2000. Vol. 17. P. 793-798.

108. Visconti A., Pascale M., Centonze G. Determination of ochratoxin A in domestic and imported beers in Italy by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography // J. Chromatogr. A. T888. 2000. №1-2. P. 321-326.

109. Burdaspal P.A., Legarda T.M. Ochratoxin A in wines, must and grape juice produced in Spain and other European countries. Aliment. 1999 Vol. 299. P. 107113.

110. Ottender H. Majerus P. Occurrence of ochratoxin A (ochratoxin A) in wines: Influence of the type of wine and its geographical origin // Food Addit. Contam. 2000. Vol. 17. P. 793-798.

111. Zimmerli В., Dick R., Ochratoxin A in table wine and grape-juice: Occurrence and risk assessment// Food Addit. Contam. 1996. Vol. 13. P. 655-668.

112. Кравченко JT.В., Тутельян В.А. Вопросы организации системы контроля за загрязнением пищевых продуктов микотоксинами // Вопросы питания. 1982. №5. С. 16-23.

113. Imada К., Hirose М., Ogiso Т., Kurata Y., Ito N. Quantitative analysis of initiating and promoting activities of five mycotoxins in liver carcinogenesis in rats. Cancer Lett. 1982. Vol. 16. P. 137-143.

114. Shephard G.S., Fabiani A., Stockenstrom S., Mshicileli N., Sewram V. Quantitation of ochratoxin A in South African wines // J Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. №4. P. 1102-1106.

115. Lindenmeier M, Schieberle P, Rychlik M J Quantification of ochratoxin A in foods by a stable isotope dilution assay using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Chromatogr A. 2004. Vol. 1023. P.57-66.

116. Worldwide regulations for mycotoxins // FoodAgr.Org.Un. Nat. 19.95. Vol. 64. P. 6.

117. Tangni E.K., Ponchaut S., Maudoux M., Rozenberg R., Larondelle Y. Ochratoxin A in domestic and imported beers in Belgium: occurrence and exposure assessment // Food Addit. Contam. 2002. Vol. 19. № 12. P. 1169-79.

118. Barna-Vetr'o I. Solti L., Teren J., Gyong'yosi A., Szabo E. W'olfling A. Sensitive ELiSA Test for Determination of Ochratoxin A // J. Agric. Food Chem. 1996. Vol. 44. P. 4071.

119. De Saeger S., Van Peteghem C. Flow-through membrane-based enzyme immunoassay for rapid detection of ochratoxin A in wheat // J. Food Protect. 1999. Vol. 62. № 1. P. 65-69.

120. De Saeger S., Sibanda L., Desmet A., Van Peteghem C. A collaborative study to validate novel field immunoassay kits for rapid mycotoxin detection // Int. J. Food Microbiol. 2002. Vol. 75. № 1-2. P. 135-142.

121. Baxter ED, Slaiding I.R, Kelly B Behavior of ochratoxin A in brewing // J.Am.Soc.Brew.Chem. 2001. Vol. 59. P. 98-100.

122. Nakajima M., Tsubouchi PI., Miyabe M., A survey of ochratoxin A and atlatoxins in domestic and imported beers in Japan by immunoaffinity and liquid chromatography.// J.AOACInt. 1999. Vol. 82. P. 897-902.

123. Tangni E.K., Ponchaut S., Mau doux M., Rozenberg R. Larondelle Y. Ochratoxin A in domestic and imported beers in Belgium: occurrence and exposure assessment // Food Addit Contain. 2002. Vol. 19. №12. P. 1169-79.

124. Visconti A., Pascale M., Centonze G. Determination of ochratoxin A in domestic and imported beers in Italy by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography//J. Chromatogr. A. 2000a. Vol. 888. P. 321-326.

125. Soleas G. Yan J., Goldberg D. M. Assay of ochratoxin A in wine and beer by high-pressure liquid chromatography photodiode array and gas chromatography mass selective detection//J. Agric. Food Chem. 2001. Vol. 49. P. 2733-2740.

126. Varga J., Kiss R., Matrai T., Matrai T., Teren J. Detection of ochratoxin A in Hungarian wines and beers // Acta Alim. Hung. 2005. Vol. 34. P. 381-392.

127. European Commission, Commission Regulation 123/2005 of 26 January 2005 amending Regulation (EC) N. 466/2001 as regards ochratoxin A // Off. J. Eur. Commun. 2005. Vol. L25. P. 3-5.

128. Goryacheva T.Yu., Basova E.Yu., Van Peteghem C., Eremin S.A., Pussemier L., Motle J.-C., De Saeger S. Novel gel-based rapid test lor non-instrumental detection of ochratoxin A in beer // Anal.Bioanal.Chem. 2008. Vol. 390. P. 723727.

129. Lobeau M., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. Application and validation of a clean-up tandem assay column for screening ochratoxin A in cocoa powder // Food Addit Contain. 2007. Vol. 24. P. 398-405.

130. Rusanova T.Yu., Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Lobeau M., Van Peteghem СDe Saeger S. Non-instrumental immunochemical tests for rapid ochratoxin A detection in red wine // Anal. Chim. Acta. 2009. Vol. 653. P. 97-102.

131. Егоров A.M., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментпого анализа//М.:ВШ. 1991. ТЗЗ. С. 288.

132. Wang P. Degelmann, М. Becker, М. Herderich, Н. U. Humpf Determination of ochratoxin a in beer by high-performance liquid chromatography // Chromatogr. Vol.49. №9-10. P. 543-546.

133. Rouhi A.M. Landmines: horrors begging for solutions // Chem. Eng. News 1997. Vol. 75. P. 1-13.

134. Yinon J. Field detection and monitoring of explosives. Trends Anal. Chem. 2002. Vol. 21. P. 292-301.

135. Environmental Protection Agency. Health Advisory for TNT. Criteria and Standard Division // Office of Drinking Water. Washington. DC. 1989

136. Гратфельд-Хюсген А., Шустер Р. ВЭЖХ анализ остатков взрывчатых веществ в образцах почвы Э // Hewlett Packard.-Вальдбронне. 1999.

137. Ciumasu loan М., Kr amer Petra М., Weber Cristina M., Kolb Gunther, Tiemann David, Windisch Stefan, Frese Ines, Kettrup Antonius A // Biosens.Bioelectr. 2005. Vol. 21. P. 354-364.

138. Dhesingh Ravi Shankaran, K. Vengatajalabathy Gobi, Takatoshi Sakaic, Kiyoshi Matsumoto, Kiyoshi Toko, Norio Miura // Biosen.Bioelect.2005. Vol. 20. P 1750-1756.

139. Medary R.T. Inexpensive rapid field screening test for 2,4,6-trinitrotoluene in soil // Anal. Chim. Acta. 1992. Vol. 258. P. 341-346.

140. Miura N., Shankaran D. R., Kawaguchi Т., Matsumoto K., Toko K. Highperformance Surface Plasmon Resonance Immunosensors for TNT Detection // Electrochem. 2007. Vol. 75. P. 13-22.

141. Batlle R., Carlsson H., Holmgren E., Colmsjo A., Crescenzi C. On-line coupling of supercritical fluid extraction with highperformance liquid chromatography for the detection of explosives in vapour phases // J. Chromatogr. A. 2002. Vol. 963. P. 73-82.

142. Walsh M.E. Determination of nitroaromatic, nitramine, and nitrate ester explosives in soil by gas chromatography and an electron capture detector. Talanta 2001. Vol. 54. P. 427-438.

143. Khayamian Т., Tabrizchi M., Jafari M.T., Analysis of 2,4,6-trinitrotoluene, pentaerythritol tetranitrate and cyclo-1,3,5- trimethylene-2,4,6-trinitramine using negative corona discharge ion mobility spectrometry // Talanta 2003. Vol. 59. P. 327-333.

144. Bader M., Goen Т., Muller J., Angerer J. Analysis of nitroaromatic compounds in urine by gas chromatography-mass spectrometry for the biological monitoring of explosives //J. Chromatogr. B. 1998. Vol. 710. P. 91-99.

145. Wang J., Chen G., Chatrathi M.P., Fujishima A., Tryk D.A., Shin D., Microchip capillary electrophoresis coupled with a borondoped diamond electrode-based electrochemical detector// Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 935-939.

146. Smith R. G., D'Souza N., Nicklin S. A review of biosensors and biologically-inspired systems for explosives detection // Analyst. 2008. Vol. 133. P. 571—584.

147. Lonnberg M., Carlsson J. Quantitative detection in the attomole range for immunochromatographic tests by means of a flatbed scanner // Anal. Biochem. 2001. Vol. 293. P. 224-231.

148. Ахмадышин А., Канарский А. В., Канарская 3. А. Микотоксины -контаминанты кормов // Биомедицина и клиника. 2003. Т. 19. №3. С. 216-223.

149. Langseth W., Rundberget Т. Instrumental methods for determination of non-macrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuffs and cultures // J. Chromatogr. A. 1998. Vol. 815. P. 103-121.

150. Котик A. H., Труфанова В. A. / Тр. Всесоюз. ин-та зерна и продуктов его переработки. 1987.Т. 65. С. 127-130.

151. Котик А Н., Труфанова В.А. Действие микотоксина Т-2 в рационе на индюшат и цыплят Микотоксины (продуценты, химия, биосинтез, определение, действие на организм). Оренбург: Оренбургский мед. ин-т, 1977. С. 8990.

152. Tanaka Т., Yoneda A., Inoue S., Sugiura Y., Ueno Y. Simultaneous etermination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry Hi. Chromatogr A. 2000. Vol.882. №1-2. P. 23-28.

153. Cavaliere C., Foglia P., Pastorini E., et.al. Development of a multiresidue method for analysis of major Fusarium mycotoxins in corn meal using liquidchromatography/ tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19. P. 2085-2093.

154. Usleber E., Martlbauer E., Dietrich R. et.al. Multimycotoxin dipstick enzyme immunoassay applied to wheat // Food Chem. 1991. Vol. 39. P. 2091-2095.

155. Casa!e. W.L; Pestka .J.J.; Hert .L.P Enzyme-linked immunosorbent-assay employing monoclonal-antibody specific for deoxynivalenol (vomitoxin) and several analogs //J. Agric. Food Chem. 1988. Vol. 36. P.663-668.

156. Буркин А. А., Соболева H. А., Конопенко Г. П. Изучение контаминации кукурузного зерна микотоксинами // I Съезд микологов России. Тезисы докладов. Раздел 10. С. 262-263

157. Золотое Ю.А., Иванов В М.3 Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа //М.: Едиториал УРСС. 2002. С. 304.

158. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии // М.:ВШ. 1996. Т1. С. 22.

159. Kitagawa Т., Shimozono Т., Aikawa Т., Yoshida Т., Nishimura Н. Preparation and characterization of hetero-bifunctional crosslinking reagents for protein modifications // Chem. Pharm. Bull. 1981. Vol. 29. P. 1130-113.

160. Usleber E., Dade M., Schneider E., Dietrich R., Bauer J.n Maertlbauer E. Enzyme immunoassay for mycophenolic acid in milk and cheese // J. Agrie Food Chem. 2008. Vol. 56. P. 6857-6862.

161. Rahimil E.3 Karim G. Shakerianl A. Occurrence of aflatoxin Ml in traditional cheese consumed in Esfahan // World Mycotox. J. 2009. Vol. 2. N. 1 P.91-94.

162. Бендикене В.Г., Песлякас И.Г., Веса B.C. Хроматография сериновых протсаз на хитине и его производных // Прикладная биохимия и микробиол. 1981. Т. 17. №3. С. 441-447.

163. Подзолкова ГГ., Климова И.М, Ефременко В.И. и др. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов // Журн. микробиол. 1988. N» 5. С.56-58

164. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей ОО и других инфекций: Автореф. дис. доктор, мед. наук. Саратов. 1996. С. 57.

165. Киселев A.B. Кустова Т.Н. Способ приготовления аэросилогелей // A.c. N 264369 . 1976.

166. Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах // Прикладная биохимия и микробиология,- М., Наука. 1991. Т. 27. №5. С. 720-724.

167. Брыкалов A.B. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине // Материалы конф. Химиков Сев.Кавказа. Нальчик. 1991. С. 185-186.

168. Темишевская Л .Я. Использование техники иммобилизации клеток для непрерывного культивирования токсинообразуюших анаэробов // Журн. микробиол. 1995. №6. С.21-22.

169. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liguid chromatography. N.Y. Wiley. 1979. P. 863.

170. Рогожина C.B., Варламов В.П., Вальковский Д.Г. Получение модифицированных кремнеземов для присоединения биологически активных соединений //Изв. АН СССР. 1975. № 8. С.1718-1721.

171. Березин В.Б., Лахтин В.М., Ямсков И.А. Аффинный хроматографический сорбент, содержащий группировки конканавалина А, иммобили-зованного комплексообразованием с кобальтом // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т.31. №4. С.400-404.

172. Алесковский В.В., Юффа А.Я. Модифицирование поверхности неорганическими соединениями // Журнал Всес. Хим. общ. Им. Д.И.Менделеева. 1989. №3. С. 317-324.

173. Кольцов С.И., Алесковский В.Б. Силикагель, его строение и физико-химические свойства. Л: Госхимиздат. 1973. С.96.

174. Лисичкин Г.В. Достижения, проблемы и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ // Журн. Всесоюз. хим.общества им.Менделеева. 1989.Т.34. № 3. С. 291-297.

175. Ходж Ф. Органические реакции с использованием реагентов или субстратов, ковалентно закрепленных на функционализированныхнеорганических носителях // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1989. Т.34. №3. С.331-339.

176. Khlebtsov В. Dykman L., Bogatyrev V., Zharov V. Khlebtsov N. A solid-phase dot assay using silica/gold nanoshells //Nanoscale Res. Lett. 2007. Vol. 2. P 6-11

177. Yafeng W., Chengliang Ch., Songqin L. Enzyme-Functionalized Silica Nanoparticles as Sensitive Labels in Biosensing // Anal. Chem. 2009. Vol. 81. N 4. P.1600-1607.

178. Wang J. Guodong L., Engelhard M. H., Yuehe L. // Sensitive Immunoassay of a Biomarker Tumor Necrosis Factor-r Based on Poly(guanine)-Functionalized Silica Nanoparticle Label //Anal. Chem. 2006. Vol. 78. P. 6974-6979.

179. Хлебцов H Г., Богатырев B.A., Дыкман JT.A., Хлебцов Б.Н. Золотые наночастицы различных размеров и форм в биомедицинской диагностике // Российские нанотехнологии. 2007. Т.2. С.69.

180. Munge В., Liu G., Collins G., Wang J. Multiple Enzyme Layers on Carbon Nanotubes for Ultrasensitive Electrochemical Detection Down to 80 DNA Copies // J. Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 4662-4666.

181. Chang S., Lee M., Kim W.-S. Preparation of large monodispersed spherical silica particles using seed particle growth // J. Colloid Interface Sci. 2005. Vol. 286. P. 536-542