Иммунохимический анализ белков оболочки некоторых вирусов потигруппы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

РГ 6 од

І 7 ОКТ 1994 На правах рукопису

ЗАЙЦЕВА Лариса Сергіївна

ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ БІЛКІВ ОБОЛОНКИ ДЕЯКИХ ВІРУСІВ ПОТІГРУПИ

02.00.10 - біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Дисертацією е рукопис

Робота виконана в лабораторії структури та функції білка Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук, Радавський Ю. Л.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Дяченко Н.С. кандидат хімічних наук, Шилін В. В.

Провідна установа:

Інститут біохімії їм. 0.В. Палладіна НАН України

Захист відбудеться " /0 1994 г.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.016.65.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України ( 253094, м. Київ вул. Мурманська,1 ).

З дисертаціє» можна ознайомитись в бібліотеці інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Автореферат розісланий іе^>" @<9 1994 г.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ФВДОРЯК

Актуальність.

Вивчення біологічних функцій білків - одна з важливих проблем біоорганічної хімії. Для їх розуміня суттєвим

моментом є визначення структурних параметрів ділянок білка, що відповідають за його біологічні властивості. Встановлення структури 61лок-ов'язуючого сайта дасть змогу дублювати та маніпулювати функціонуванням білка, зокрема аналіз та синтез антигенних детермінант дозволить зрозуміти молекулярні основи антигенності.

Потіьіруси - найбільша група вірусів росши, які пошкоджують широке коло рослин Із 53 родин, у тому числі сільськогосподарські культури. Зараз провадяться багаточисгльні дослідження потівірусів та їх компонентів. Інтере-с до них

викликаний з одного боку значним впливом на економіку сіль-

ського господарства, а з іншого - різноманітністю структурно-функціональної організації їхніх білків 1 гено^лих нуклеїнових кислот. Знання антигенної будови білків оболонки

потівірусів дає інформацію про їхню топографі« в капсиді, що є важливим для встановлення молекулярної організації віріону, вивчення білок-білкової та білок-нуклеіиової взаємодії та •розуміння таких процесів, як самозбірка вірусів та вивільнення РНК від білка, а.також надасть можливість удосконалити Існуючі методи їх діагностики.

Антитіла, до отримані до пептидів, які відповідають антигенним детермінантам білків оболонки потівірусів можуть служити інструментом для їх ідентифікації. З метою отримання посиленої імунної відповіді на пептиди, останні кон'югують з

високомолекулярними носіями за допомогою різноманітних 61-функціональних реагентів. Синтез та застосування нових 61функціональних реагентів е вельми актуальною задаче» при створенні синтетичних антигенів.

Ступінь дослідкеності тематики. Встановлено, що вірус-специйічні епітопи потівірусів локалізовані на гі-кін-цевій (29-95 амінокислотних залишків в залежності від вірусу ) ділянці білка оболонки, цо експонована на поверхні ьіріону (БПикіа, 1989). Також відомо, що групо-специфічні епітопи розташовані на консервативній коровій ділянці білка оболонки, проте дані про місце локалізації вірус-специфіч-ного епітопу для білка оболонки У- вірусу картопі (рїу) відсутні.

Для отримання Імунокон’югатів зараз застосовується велика кількість біфуккціональних реагентів, але відомості про використання 2-нітро-4-сульфофен1лового (N8?) ефіру адипінової кислота з подібно» мето» у літературі не зустрічаються.

Мета дослідження. Метою роботи було проведення Імунохі-мічного аналізу білків оболонки трьох штамів руу та деяких вірусів потігрупи, локалізація та синтез епітопу білка оболонки РУУ-н, порівняння первинних структур білків оболонки потівірусів та їх характеристика з застосуванням комп'ютерних методів розрахунку, а такої вивчення можливості застосування нового 61функціонального реагента в імунохімічних дослідженнях.

Задачі дослідження. Для досягнення мети роботи необхідно було вирішити такі завдання: •.

-виділити білки оболонки трьох штамів РУУ та отримати

- з -

поліклональні антитіла (ПКА) до штамів РУУ;

-локалізувати антигенні детермінанти білка оболонкн руу за допомого» моноклональних антитіл (МКА);

-провести імунохімічний аналіз деяких представників по-тіьірусів;

-провести порівняння первинної структури білків оболонки потівірусів та комп’ютерний аналіз структурно-функціональних особливостей, до випливають з їхньої амінокислотної послідовності ;

-вивчити можливості застосування 2-н1тро~4-сульфофен1ло-вих ефірів для отримання імунокон'югатів.

Наукова.новизна долота полягає в тому, що вперше за допомогою МКА локалізований групс-специфічний епітоп поті вірусів, який відповідає ділянці 198-208 полі пептидного ланцюга білка оболонки руї. Також, вперше проведений порівняльний аналіз первинної, вторинної та антигенної структур білків оболонки вірусів поті групи з використанням комп'ютерних програм. Показана можливість отримання Імукокон'шмтів з застосуванням 2-нітро-4-сульфо$<?нілових ефірів кислот.

Одержані ПКЛ до р\т, які можуть бути використані для імунодіагностики вірусів у посадковому матеріалі.

Розроблений засіб виділення пептиду, ко являє собоз гру-по-специфічний епітоп потівірусів. Цей пеіітид та синтезований аналог дадуть змогу удогконалити діагностичні тест-снстеми для Ідентифікації потівірусів у рослинах.

2-и1тро-4-сульфобеггіяовпй ефір адипінової кислоти може знайти застосування у вакшінології для отримання депонованих білкових препаратів та синтетичних вакцин.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботі! були викладені та обговорені на Всесоюзному симпозіумі "Хімія. 01лк1в"(ТбІл1с1, 1990), VIII Міжнародному конгресі по вірусології (Берлін, ФРН, 1090), Міжнародній конференції "Фундаментальні та прикладні проблеми в фітовірусологи" (Ялта, 1994), їх конвенції з біооорганічної хімії та нафтохімії 1Б0НХ НАІЇ України (Київ, 1994)

Публікації. По темі дисертації опубліковано 7 робіт.

' Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 44f"стор. машинописного тексту та складається з вступу, двох розділів огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження та результатів 1 їх обговорення. Список використаних літературних джерел містить найменувань. У

дисертації & таблиць, /З малюнків та JL додатки.

К£Ш?тк1.АСРіЗиС.Ш-ДДЄС0К-ДЦС£Діааха. Робота вцілому виконана особисто дисертантом.

Метоли дослідження. Дослідження проводились на трьох штамах PYY: PYY-0 (звичайний - відзначається суворими симптомами на картоплі), PYY-H (некротичний - викликає некроз гилок тютюну) та PVY-C ( відрізняється від решти штамів відсутністю передачі характерним вектором PVY - Uyzua perdeos Sulz). Віруси були люб'язно надані Біологогрунтовим Інститутом ДСВ РАН. .

Білки оболонки PVY-H, PVY-0 та PYY-C виділяли інкубацією очищених вірусів у 2 М líci при -20°С протягом З годин. РНК відокремлювали шляхом низькошвидкісного центрифугування, роз-ч;ш білку діалізували проти води та ліофі лізу вали.

Гомогенність білка оболонки перевіряли електрофорезом в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (ДСН) (Іаемпіі,

1970).

Антитіла (ПКА) до PVY отримували Імунізацією кроликів за загальноприйнятою схемою, імуноглобуліни з сироватки виділяли за методикою, то описана llorejsi, 1956. Титр антитіл визначали імуноферментним аналізом (ІФА) (Clai'k, 1977).

Моноклональні антитіла (МКА) Y3C8, та Y4D1 були люб’язно надані М.Саарма (Інститут хімічної та біологічної фізики АН Естонії, м.Таллінн).

Пептид, що відповідає ділянці 198-208 білка оболонки PVY був синтезований В.Абакумовим в Інституті біоорганічної хімії їм. М. М. Шемякіна-Ю. А. Овчіннікова РАН.

Обмежений протеоліз трипсином PYY-H здійснювали за методом Shukla, 19Б8. Отриману суміш пептидів аналізували методом ВЕРХ у зворотній фазі. .

N-кінцевий аналіз здійснювали за методом Gray, 1972.

Флуороімуноаналіз (ФІА-РЧ) проводили, як описано у роботі Sinijarv et al. , 1988.

Імуноелектроблотінг здійснювали эа методикою Towbln et al., 1979. '

Комп’ютерний аналіз структурно-функціональних особливостей білків оболонки вірусів потигрупи, цо випливають із їхньої амінокислотної послідовності, виконували з викорис-' танням програми PC Gena.

2-нітро-4-сульфо$еніяовий ефір адипінової кислоти був синтезований 0.А.Гершковичем (Інститут біоорганічної, хімії та нафтохімії НАН України).

Реакцію кон’югації проводили в 0,1 М бікарбонаті натрію, pH 8,5. БСА розчлнялн у згаданому буфері, додавали 30-кратний молярний надлишок пептиду та Nap ефір адипінової кислоти.

Реакцію зупиняли підлужуванням реакційного середовища за допомого» 25 * аміаку. Реакційну суміш розділяли за методом гельфільтраці1 на колонці з сефадексом 0-25. Реакцію кон'югації за допомогою глутароього альдегіду проводили за методикою Sohaapor et al, 1989.

Для визначення амінокислотного складу кон'югати гідролізували у запаяних під вакуумом ампулах у розчині 5,7 н неї при 110—112°С протягом 24 год. Амінокислотний склад визначали на автоматичному аналізаторі амінокислот ААА-339. Епітопн;'' густину для кожного кон’югату розраховували на підставі співвідношення вмісту будь-якої амінокислоти, .яка е в складі пептиду, у кон’югаті, та 11 вмісту у складі білка-носія.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

1. Порівняння білків оболонки трьох штамів pvy

Електрофорез у ПААГ з ДСН. Білки оболонки PVY-H, PVY-0, та pvy-C, що були виділені сольовим методом аналізували електрофорезом у 12,5* ПААГ у присутності ДСН. Результати аналізу, ао наведені на мал.1, свідчать про часткове розщеплення білків оболонки під дією протеаз рослинного походження на стадії виділення вірусів. Окрім основної мажорної смуги з молекулярно» масою . (М.м.) 32 кДа, яка відповідає М.м. Інтактного білка оболонки pvy присутні білкові смуги з меншою М.и. На електрофореграмі білка оболонки pvy-C (мал 1-3) були присутні дві смуги у еквімолярному співвідношенні, М.U однієї з низ відповідала М.и. інтактного бїдка. Друга смуга з М.м. приблизно 28 кДа, певно, с коровим залишком білка

оболонки (без N- і С- кінцевих ділянок), так як відомо, tao під дією протеаз рослинного походження початково відщеплюються N- (біля ЗО амінокислотних залишків) та С-(біля 20 амінокислотних залишків) кінцеві ділянки, що експоновані на поверхні віріону.

Отримані результати свідчать про штамові відмінності у первинних структурах білків оболонки РГГ.

Мал. 1. Електрофорез у ПМГ з ДСН білків оболонки трьох штамів Р\Т.

1 - ртлг-о, з - руу-н, з - руу-о, 4 - маркерні білки фосфорілаза (04 кДа), БСА (07 кДа), овальбумін (43 кДа), карбангідраза (ЗО кДа), Інгібітор трипсину (20 кЛа)

Імуноелектооблотінг а використанням ПКА. З метою порівняння антигенних властивостей білків оболонки штамів РУУ-Н, рутг-о та руу-с був проведений ікуноелектроблотіиг з ПКА. Для аналізу використовувала три ПКА, котрі були отримані до цілого віріону кожного з штамів, по досліждувались.

Імуноелектроблотінг показав, ао Інтактний білок глг-о, а

також продукти його деградації досить Інтенсивно реагували з усіма антитілами (мал. 2.-а,г,ж). Аналіз РУї-с виявив подібні результати (мал. 2.-в,е,1). Що стосується Інтактного білка оболонки РТУ-к, то він реагував з ПКЛ, ідо були отримані до кожного з штамів, тимчасом як білкова смуга з М.м. близько ЗО кДа не давала реакції ні з одним Із ПКА (мал. 2. - б,д,з).Цей факт свідчить про відсутність у даному білковому компоненті Імунодомінантних областей. Слід відмітити наявність високоактивної ІмунодомінаитноІ області в зоні поліпептидів з М.м. 12 - 14 кДа. ІЬвно, ці поліпептиди є к- 1 С- кінцевими фрагментами білків оболонки, які містять штамоспецифічні епі-топи. Ці данні узгоджуються з результатами ,цо отримані для

Інших поті вірусі в (аішісіа ег аі. 1ЄВ8). ___ ,

і

■ ! \

А Б В

Мал. 2 Імуноелектроблотінг білків оболонки штамів РТО з попіклональшши антитілами. .

А - ПКА ДО РУЇ-О; Б - ПКА ДО РУЇ-Н; В - ПКА ДО РУУ-С; а,г,ж - білок РУї-О; б,д,з - білок РУї-ІІ; в,о,1 - білок РУУ-С

Імунселектроблотінг з використання?.; МКА. Для аналізу були використані МКА УЗСб та У4В1. Результати аназізу найдені на мал 3. У разі використання МКА УЗСб відмічена реакція другої білкової смуги з М.м. близько ЗО кДа, котра не взаємодіяла ні з одним із ПКА, ні з МКА У4В1. Крім того, не відмічено реакції МКА УЗСб та У4В1 з поліпептидаш невеликої М. м.Цей факт свідчить про спрямованість МКА до епітопів корової частини білків оболонки штамів РУУ.

Мал 3. іммуноелектроблотінг білків оболонки штамів руу з МКА '

А - МКА УЗСб, 0 - МКА У4В1; 1 - білок оболонки РУУ-О,

2 - білок оболонки РУУ-Н, з - білок оболонки РТЇ-С

2. Локалізація епітопів РУУ-н

3 метоп локалізації антигенних детермінант білка оболонки руу-н останній розщеплювали бромціаном. Місця атаки бромціаном пептидних зв’язків білка ойолонки РУУ показані на мал. 4.

12 З А

І • 2 З

6

10 ,?n 30

4 H I) t ] D А С. В 3 S К К D Л R Р Е Q 0 I 0.V К Р N К G К

40 ’ Г>0 60

DKDYNAGTGGTHTVPRIKAITA К M*R М^Р R 3 К

70 00 90

G А ? Y L II L Е Н I, L Е Y А Р Q Q Т Л I Г> N Т R А Т Q S Q Р

100 110 120

Г) Т W Y Е А V R М'а Y D Е G Е Т її М*Р Т V M*D G L B Y W О I

110 . 140 150

Е N G S Р К V N G Y W V mVd GHKQVEYPLKPIVE

160 170 180

К А К Р Т L R Q I М*А II Р 5 I) V A Е А У I Б M*R N К К Е Р Y

190 __200____________ 210

Ы'Р R Y Q L I R N L R D V G 1 A r[y A FDFYEYTS^T Р

220 ?30 240

VRAREAIIIQ КГК A A A L К S A Q Р R I, V G L D G G I S

250 260

TQEENTERHTTEDVSPS м'н TLLGVKNM

Мал. 4. Амінокислотна послідовність білка оболонки P.VY

(Shukla et al. , 1980) •

місце атаки пептидного зв'язку бромціаном

Суміш бромціанових пептидів'аналізували електрофорезом у ПААГ з ДСН. Аналіз показав відсутність нативного білка оболонки, що свідчить про повне його розщеплення (Мал. 5). Далі суміш бромціанових пептидів досліджували методом імуно-електроблотінгу з використанням МКА УЗСб. У результаті виявлено, що тільки один бромціановий пептид реагував з МКА (Мал. 5).

Man. 5. Електрофорез у ПААГ з ДСН та імунозлектрсбло-тінг з МКА V3CB бромціанових фрагментів pvy-h 1 - пептиди-маркери; 2 - біг >к ооолонки,Р7У-Н5 3 -суміш бромціанових фрагменті»; 4 - фракція 13 (Мал.5);

5 - імуноелектроблотінг суміші бромціанових фрагментів з МКА Y3C6

Паралельно суміш бромціанових фрагментів розділяли ВЕРХ в зворотній фазі. На мал.0 показаний профіль елюції бром-ціанового гідролізату PVY-H. Наявність великої кількості пеіггшших фракцій зумовлена можливістю недорозаеплення окре' мих зв'язків Uet-X. Крім того, відомо, по пептиди, отримані в результаті розчеплення бромціаном містять як С-кінцеву амінокислоту гомосерин або лактон_ гомосерину, цо Істотно впливає на їх час утримання. Особливо це стосується невеликих пептидів.

Т2 -

а ***

Мая.й Розділення бромціакових пептидів білка оболонки РУУ-н за допомогою ВЕРХ у зворотній фазі

Колонка "ЬіСіїгозогЬ КР-18 " '3 мкм, 25 х 0,4В см); градієнт ацетонітрилу 2 -- 50% з 0,1 ї ТФО. Час розділення -60 хвилин; швидкість елюції - 1 ші/хе. Виявлення при довжині хвилі 220 нм '

Отримані у результаті розділення пептиди аналізували методом Ф1А з розрішенням в часі з використанням МКА їЗСЙ. Пептиди фракцій 13 та 16 взаємодіяли з МКА. М-кінцєеий аналіз фракцій 13 та 1В, проведений дансилхлоридним методом, показав пролін як Іі-кінцеву кислоту.

З метою уточнення місця локалізації епітопа, що взаємодіє з МКА УЗСВ руу-н піддавали обмеженому протеолізу трипсином. Суміш пептидів, що були отримані в результаті протеолі-

- ІЗ -

зу аналізували методом ВЕРХ у зворотній фазі. Профіль елюції триптичних пептидів наведений на мал. 7.

Мал. 7. Розділення пептидіз, отриманих у результаті обмеженого протеолізу трипсином PYY-H за допомогою ВЕРХ у зворотній фазі Колонка С18 (218 ТР, 5 мкм, 4,6 х 200 мм); градієнт ацето-нітрилу 0 - 75% у 0,1% ТФО, час розділення - 80 хв, швидкість елюції 1 мл/хв. Визначення при довжині хвилі 220 нм.

Отримані фракції ліофілізували та досліджували методом ФІА-РЧ з використанням МКА Y3C0. Матеріал фракцій 14 та 17 реагував з МКА. Встановлено, iso фракція 14 являє ссбо» гомогенний пептид. За допомогою автоматичного секвенатора амінокислот була визначена амінокислотна послідовність цього

пептида:

YAFDíYEYISR Ця послідовність цілком співпадає з послідовністю 188 - 208 білка оболонки pyy-k та входить до складу брої,¡ціанового фрагменту 182 - 220, котрий за результатами наших досліджень реагував з МКА Y3G3.

Таким чином, за данними імукохімічногб аналізу брсмці-анових та триптичних пептидів встановлено, що послідовність 1S8 - 208 білка оболонки PVY-H містить епітоп, що взаємодіє з МКА Y3CÖ.

Для підтвердження результатів, до отримані на підставі аналізу природних пептидів білка оболонки PVY-H, був синтезований пептид, що відповідає позиції 128 - 208 поліпептидного лакцвгу вивчаємого білка. Далі був отриманий кон’югат синтетичного пептиду з БСА з використанням 2-нітро-4-сульфо-§ен1лового ефіру адипінової кислоти. Епітопна густина отриманого кон’вгату становила 14 молів пептиду на моль білка-носія, Аналіз синтетичного пептиду та його кон’югату з БСА методом Ф1А-РЧ показав, що иі синтетичний пептид, ні його кок'югат не взаємодіяли з МКА Y3CB. Відсутність реакції зв’язування синтетичного пептиду з МКА можна пояснити можливим гліпозуванням природного пептиду по оксігрупам трео-ніну-200, серіну-207 або карбоксильній групі аспарагінової кислоти-201. Оскільки відомо, що вуглеводна частина глікопротеїна відіграє важливу роль у взаємодії антигена з антитілом. Таким чином, відсутність реакції синтетичного пептиду з МКА hí) заперечує тому, що послідовність 193 - 208 білка оболонки РГ/-Н містить епітоп, що взаємодіє з МКА Y3C0.

- 15 -

3. Порівняння антигенної структури білків ОбОЛОНКИ деяких потівірусів При порівнянні первинних структур білків оболонки 17 потівірусів шляхом множинного вирівнювання з застосування» комп'ютерних методів виявлена висока ступінь гомології амінокислотної послідовності в області епітопа, то локалізований нами у руу-н. '

Відомо, то м-кінцеві ділянки білків оболонки потівірусів, які експоновані на поверхні віріону містять вірус-специфічні епітопи, а корові ділянки білків оболонки з високос гомологіє» амінокислотної послідовності містять групо-специфічні епітопи, 1 антитіла до таких ділянок можуть взаємодіяти з Іншими поті вірусами. На підставі вищевикладе-ного ми припустили, що МКА їЗСЗ, яке взаємодіяло з епітопом, локалізованим у висококонсервативній області білка оболонки може взаємодіяти з Іншими потівірусами. З метою перевірка цоьго припущення були досліджені вісім потівірусів методом Імуноелектроблотінгу з МКА УЗС8. Білки оболонки восьми вірусів реагували з МКА (Мая.8)

Отримані результати свідчать про те, що МКА їЗСб спрямоване на групо-специфічний епітоп білка оболонки потівірусів. Наявність спільного епітопу для восьми потівірусів підтверджено імунохімічним аналізом з ПКА до РТУ-Н.

4. Порівняння первйнної, вторинної та антигенної структур білків оболонки 17 потівірусів Зараз встановлена первинна структура білків оболонки 17 потівірусів. Нами був проведений порівняльний аналіз первинних структур білків оболонки 17 потівірусів шляхом попарного

—/., - ЗО кДа

123 456 739

Мал. 8. Імуноелектроблотінг деяких вірусів потігрупи з мка «са

1- pvy, 2- А-Еірус картоплі, 3- пірус Tradeacantla аі-btflora, і- вірус мозаїки турнепсу, 5- вірус мозаїки гіпеас-трума, 7- вірус жовтої карликовості цибулі, 8- вірус жовтої мозаїки квасолі, 9 - маркерні білки 1

та множинного вірівнювакня з використанням комп'ютерних методів.

Множинне вирівнювання показало, то ll-кінцеві ділянки білків оболонки потівІрусІБ значно відрізняються ДОВЖИНОЮ 1 характеризуються відсутністю гомологічних залишків, тоді як центральні та C-кінцеві області мають високий ступінь гомології амінокислотної послідовності, до того s виявлено 54 ідентичних та 76 східних амінокислотних залишків у білках оболонки 17 потівірусів. Слід відмітити наступні консервативні послідовності, до характерні для білків оболонки по-Тіьірусів: ї'(Іі) М W О I E(D) NOTE Р(С),

HA REA------Q М К A A A, LARYAFDF E(R),

А И A Y І Е М R; Y К ї R Y О 1, Р 0 L D G, IE REI

Одна э виявлених консервативних ділянок (ь a r y f d f k/r) частково входить до пептиду, котрий по результатам наших досліджень містить групо-специфічний епітоп потівірусів.

При попарному вирівнюванні амінокислотних послідовностей білків оболонки 17 потівірусів знайдено високий ступінь гомології - від 49 до 87 ¡6.

З застосуванням комп’ютерних методів був проведений розрахунок вторинних структур білків оболонки 17 потівірусів. Розрахунки показали, до переважним елементом вторинної структури білків оболонки потівірусів е о-спіраль (53,8 -32,756) та неупорядковані витягнені ділянки ( 47,2 - 26,5$).

На підставі алгоритмів програми PC Gene намя були передбачені потенціальні антигенні детермінанти для білків оболонки 17 потівірусів. Отримані результати свідчать про високу епітопну густину на N-кІнцевих ділянках білків оболонки потівірусів, то характерно взагалі для усіх палич-ковидних вірусів.

5. Використання 2-н1тро-4-сульфо$ен1лового ефіру адипінової кислоти для отримання іммунокон'югатів

Для вирішення задачі по вивченню антигенної структури вивчаємих білків оболонки виникла необхідність синтезувати коп'югат на основі пептида та білка-носія. При цьому важливіш аспектом був вибір 61функціонального зшиваючого реагента. Наші був розроблений засіб отримання кон'агатів пептид-білок з застосуванням нового біфункціонального pea» гонта 2-н1тро-4-сульфо$еиілевого ефіру адипінової кислоти. Реакція кон’югації проходить по схемі:

1.Білок нн,

2.Пептид NH,

ССН,

/

CO-&-NH БІЛОК

C0-0-NH Пептид

З ното» випробування цього реагента, два синтетичних пэптида (П-1 - відповідає позиції 34 - 40 білка оболонки X-fcipyey картоплі; П-2 - відповідає позиції 198 - 208 .білка оболонки PVY) коп'огували з БСА за допомогов Nsp-ефіру адипінової кислоти. Для встановлення оптимальних умов реакціо проводили у різні Інтервали часу. Для порівняння проводили кон'югаціє э застосуванням глутароього альдегіду. Епітопну густину отриманих кон'агатів розраховували на підставі амінокислотного аналізу. У таблиці і наведена епітопна густина отриманих кой'»гатів.

З таблиці видно, що після 10-хвилинного Інтервалу співвідношення пептид:білок-нос1й ке змінсється з часом. Можна стверджувати,- ио по ефективності 2-нітро-4-сульфофеніловий ефір адипінової кислоти не поступається широко відомому зшиваючому реагенту - глутаровому альдегіду.

Таким чином, новий реагент 2-нітро-4-сульфофен1ловий ефір адипінової кислоти може бути використаним для отримання кон'пг&тів пэптид-<51лок в імунохімічішх дослідженнях.

Таблиця 1.

Залежність складу отриманих кон'югатів від часу кон'югації

реагент Час кон' игаці 1 Моль пептиду П-1 на 1 моль БСА Моль П9ПТИДУ П-2 на 1 моль БСА

Иар-ефир 5 хв. 9 8

адипіновой кислоти 10 хв. 15 14

1 ч 15 14

24 ч 15 14

ГлутаровиП альдегід 5 хв. 7 7

10 ХВ. 12 11

1 ч 12 12

24 Ч 12 12

П-1 - пептид послідовності І ? В о п ї ї,

П-2 - пептид послідовносте їаррвїЕїізи

ВИСНОВКИ

1. Виділені білки оболонки трьох впгамів РТУ: РУї-Н,

РГ{-0 та РУУ-С. .

2. Проведений порівняльний аналіз білків оболонки трьох штамів РУУ з використанням ПКА.що отримані нами до когного а штамів та МКА, до отримані до'РТї-Н. •

3. З використанням ЯКА локалізований групо-спвцифічяий впітоп потівірусів, який відповідає позиції 198-208 поліпептидного ланцюга.білка оболонки РТї-а.

4. Синтезований пептид - аналог г руйо-спеїшфічного епітопу потівірусів, отриманий кся'огат цього пептиду а

білком-носієм та проведений їх Імунохімічний аналіз.

5. На підставі комп'ютерних методів проведений порівняльний аналіз первинної, вторинної та антигенної структур білків оболонки 17 потівірусів. Шляхом множинного вирівнювання амінокислотних послідовностей білків оболонки виявлений високий ступінь гомології на ділянці, що відповідає локалізованому нами групо-специфічному епітопу.

G. Розроблений засіб отримання кон’югатів пептид-білок

э використанням нового біфункціонального реагента 2-нітро-4-сульфо*ен1лового ефіру адипінової кислоти.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Антигенная характеристика капсидных белков штаммов Y-вируса картофеля / в соавт. Гнутова Р.Ft., Сибирякоьа И.И., Радавский Ю.Л. и др. // Биологические науки.-1991.-М1.-С.35 - 46.

2. Зайцева Л.С., Гершкович A.A., Радавский Ю.Л. и др. / Применение водорастворимого 2-нитро-4-сульфофенилового эфира ашшновой кислоти для получения конъюгатов пептид-белок // Укр. биохим. ж.-1992.-ЖЗ.-С.94 - 97.

3. Радавсісий Ю.Л.6 Зайцева Л.С., Кухарь В.П. / Бифункцио-налыше поперечносшиващие реагенты и методи получения конъюгатов пептид-носитель // Биополимеры и клетка.-1993. -JM.-C.3 - 21.

4. Антигенная структура Калединых белков трех вирусов картофеля / в соавт. Радавский Ю.Л., Витер 0.0., Оаарма M.D. и' др.// Тез. Всесоюз. симпоз. химия белков.-Тбилиси.-1990.“ С.147.

I 5. Радавский Ю.Л.. Зайцева Л.С., Партеако A.B. и др. Использование водорастворимого 2-нитро-4-сульфоф911Шювого эфира адипиновой кислоты в иммунологических исследованиях белков // Тез. Всесоюз, симпоз. химия белков.-Тбилиси.-1990.-

- С.148. '

6. Jarvekulg Ь. Saarma М. Zaitseva L. et oZ. Localization oi the group-specilio epitop of potyviruse3 with monoclonal antibodies // Abstr. VIII-th Intern. Congress Virology.-Berlln, Germany.-1990.-P.84.

7. Radavslcy Yu.L., Viter S.S., Zaitseva L.S. ot aZ.Using monoclonal antibodies ior the study of potato virus -X, -M, and -Y coat proteins // Abstr. Intern. Conference "Fundamental and Applied problems in Phytovirology".-Yalta, Ukrain.-1994.-P.12.

Зайцева JI.G. Иммунохимический анализ белков оболочки некоторых вирусов потигруппы.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины. Киев. 1994.

Защищается 7 научных работ, которые содержат иммунохи-мический анализ белков оболочки трех штаммов Y-вируса картофеля и некоторых других потивирусов, а также способ получения иммуноконъюгатов с использованием 2-нитро-4-сульфофе-нилового эфира адипиновой кислоты. Установлено, что участок 198-208 полипептидной цопи белка оболочки PYY содержит груп-по-специфичный эпитоп потивирусов. Показана возможность получения конъюгатов пептид-белок с использованием 2-нитро-4-оульфофенилового эфира адипиновой кислоты.

Zaitseva L.S. Immunochemical analysis of the coat proteins of somo potyviruses.

Dissertation ha3 been presented for the receiving the degree of the Candidate of Sciences ( Chemistry ).

Speciality is 02.00.10 - Bioorganic Chemistry. Chemistry of Natural Substances. Institute ' of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academi of Sciences of Ulcrain. Kiov. 1994. *

7 scientific worke, which contain immunochemioal analysis of the coat proteins of the three, strains potato virus-Y and soma other potyviruses; method lor obtaining the inwiunooon.iugates by using 2-nitro-4-sulfophenyl ester of adipinic aold era defended. It hae been established, that region 190-200 of coat protoin PVY contains group-spooifio epitop of potyviruaes. A new bifunctional reagent for conjugation peptides with proteina has been suggested.

Клсчов1 слова:

1мукох*1м1чниа анал1з, сЛлок оболокки, антигенна детерминанта, эшиваючий реагент. .