Исследование дискриминации ионообразования в электроспрее и Maldi методах ионизации для количественного анализа белков тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

На правах рукописи

НОВИКОВ Александр Валерьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИСКРИМИНАЦИИ НОВООБРАЗОВАНИЯ В ЭЛЕКТРОСПРЕЕ И МАЬШ МЕТОДАХ ИОНИЗАЦИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ

01.04.01 - ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ФИЗИКИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектрометрии института Аналитического приборостроения Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Краснов Н.В. доктор химических наук Миргородская O.A.

Официальные оппоненты:

академик РАЕН, доктор физико-математических наук,

профессор ГАЛЛЬ Л.Н.

доктор химических наук БАРАМ Г.И.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (СПбГПУ).

Защита состоится " ноября 2004 г. в V/ часов на заседании Диссертационного Совета Д002.034.01 при институте Аналитического приборостроения РАН по адресу: 190103, Санкт-Петербург, ул. Рижский пр., 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИАнП РАН по адресу: 190103, Санкт-Петербург, ул. Рижский пр., 26.

Автореферат разослан " Ab" октября 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат физико-математических наук

А.П.Щербаков

2 ¿>¿>6 - »

msiso

з

Актуальность работы. В настоящее время масс-спектрометрия является ключевым инструментом в исследованиях в области химии белка. Особенно это относится к идентификации различных пептидов и белков, аминокислотная последовательность которых может быть взята из различных баз данных, либо предсказана на основании генома. Однако для понимания физиологических процессов на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, по и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым и относятся белки, наиболее часто используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Elcctrospray Ionization Mass-Spectrometry, ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS). Оба этих масс-спектрометрических метода, по причине дискриминации новообразования и конкуренции за протон между отдельными компонентами смеси веществ, не позволяют определять количественные параметры. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются, однако все предлагаемые к настоящему времени подходы связанны с необходимостью дополнительных химических модификаций и созданием в каждом отдельном случае соответствующих стандартов. В связи с этим изучение дискриминации в ионообразовании и ее преодоления в мягких ионизационных методах, таких как ESI и MALDI с целью их адаптации к количественному анализу белков, имеет как теоретическую, так и практическую ценность.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение дискриминации ионообразования в электроспрее (bSI) и MALDI, и использование полученных данных для создания универсальной масс-спектрометрической методики количественного анализа белков и пептидов

РОС. Н41'1"ОН*ЛЬНАЯ

БИГ. ' • ЕКА С.Ьс.ербург

W06 РК

1. Изучить дискриминацию ионообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработать метод определения количества белков с помощью ESI-MS и MALDI-MS.

3. Апробировать разработанный подход на примере модельных белков в растворе и в геле.

Научная новизна работы. Изучена дискриминация ионообразования в мягких методах ионизации, таких как ESI и MALDI.

Предложена методика позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования и определить количество белков.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов была разработана методика, позволяющая количественно проанализировать белки на уровне 5 фмоль, без существенной доработки масс-спектрометрических приборов. Кроме того, продемонстрирована возможность определения количественных характеристик пептидов белков, не только предварительно выделенных, но и в смеси содержащей 2-3 компонента.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах в ИАнП РАН, на 6-й Путинской школе-конференции "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" (г. Пущино, 2002г.), на III съезде биофизиков России (г. Воронеж, 2004), на Desorption (S.- Petersburg, 2004i.), а так же на 2-ом Международном Семинаре-школе "Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии" (г. Звенигород, 2004г.)

Публикации. По теме диссертации опубликоьаны две статьи в журнале "Научное приборостроение", статья в журнале Analytical chemistry и материалы трех докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, иэ описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 87 страницах.

Основное содержание диссертации.

Во введении_дана оценка актуальности, научной новизны и

практической ценности работы, сформулирована задача настоящего исследования, отражающая основные вопросы, решаемые в диссертации.

Во второй главе приведены результаты изучения литературы по теме исследования.

Продемонстрирован спектр задач, решаемых с помощью ESI-MS и MALDI-MS. Показаны основные трудности, возникающие при анализе белков и пептидов.

На основании анализа описанных в литературе масс-спектрометрических методик количественного анализа белков и пептидов, выявлены их основные недостатки и, тем самым, обоснована актуальность разработки более универсального и удобного подхода.

Третья глава содержит описание полученных результатов и основных закономерностей, выявленных экспериментально. Обоснованы выводы, приведенные в заключении.

В четвертой главе описаны методики измерений, способы приготовления образцов и перечислены реактивы необходимые в процессе работы.

Экспериментальные работы по отработке методик количественного анализа белков и пептидов проводились на масс-спектрометре Finnigan МАТ 95 XL, с источником ионов типа "электроспрей" (ESI), времяпролетном масс-спектрометре с ортогональным вводом и ESI источником ионов МХ5303 (ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург). Кроме того, в работе использовались масс-спектрометры с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии магрицы (MALD1) Voyager-DE STR (ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург) и Voyager System 4270 (Университе! Южной Дании, г. Оденсе).

Количественное определение белков с использованием масс-спектрометрических методов

В настоящее время, для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым относятся белки и пептиды, используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Electrospray Ionization Mass-Spectrometry, ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS).

Наиболее серьезным недостатком этих ионизационных методов является дискриминация ионообразования, и как следствие возникает проблема не информативности интенсивности пиков с точки зрения количественного анализа.

К причинам изменения соотношения интенсивностей между пиками можно отнести как внешние факторы (температура, давление в источнике), так и внутренние (различное сродство к протону и, как следствие, конкуренция за протон).

Проблема влияния внешних факторов решается с использованием внутреннего стандарта, так как они одинаково влияют на компоненты смеси, и соотношение между пиками в этом случае остается неизменным. Преодоление же внутренних является трудной физической задачей.

Так рассмотрим упрощенную систему, в которой сведены к минимуму влияние внешних факторов. Проанализируем масс-спектрометрически смесь аргинина (Arg) и лизина (Lys). Выбор этих двух аминокислот объясняется тем, что обе они проявляют основные свойства и, как следствие, могут использоваться как внутренние стандарты по отношению друг к другу (рис.3.1 а).

К смеси эгих двух аминокислот, в течение эксперимента в равные промежутки времени добавляли лизин, причем концентрация аргинина оставалась не изменой (рис. 1 б, в.).

Рис. 1 Единичные масс-спектры аминокислот Lys и Arg

а) соотношение количества Lys/Arg=l/1

б) соотношение количества Lys/Arg=2/1

в) соотношение количества Lys/Arg=3/1

Таким образом, интенсивность ионного тока является функцией от концентрации.

1=Г(С„С2,С3.............С*) (3.1)

Введем следующие обозначения:

Количество компонентов смеси Концентрация Эффективность

1 с, ai

2 с2 а-2

3 С3 сх3

i с, а,

N См aN

Где а эффективность ионообразования.

а = I / С (3.2)

Такая зависимость справедлива лишь в однокомпонентной смеси. В случае конкуренции за протон:

Ix = Сж-ох/(2С1--о,) (3.3)

IST = CsT-asT/a:Cia1) (3.4)

где Т, - интенсивность вещества X;

схх - эффективность ионообразования вещества X;

Ist - интенсивность стандарта;

сцт - эффективность ионообразования стандарта.

Таким образом если необходимо выразить концентрацию вещества х в растворе:

С, = CS1 ■ I, / Ist 1 aST / а, (3.5)

Причем необходимо отметить, что интенсивность ионов, a следовательно и эффективность экстракции остается функцией от концентрации.

С* = CST • Ix / Ist ■ «st / а, • f(C...CN) (3.6)

В случае же использования изотопных аналогов эффективность ионообразования равна.

otsT=ax

Соответственно формула приобретает вид:

С,= Cst ' I» I IST

(3.7)

(3.8)

С целью подтверждения этих предположений, была проделана работа по разработке метода количественного анализа белков. За основу был взят метод изотопного разбавления.

Была проведена серия экспериментов целью, которой, было доказательство стабильности новообразования лизина, аргинина и их изотопных аналогов (рис. 3.2).

Рис.2 Масс-спектры лизина - дейтерированного лизина (т/г=151.1 Да) и аргинина - модифицированного аргинина (т/т= 177.1 Да)

Съемка велась непрерывно в течение ЗОмин., с проверкой результатов каждые 60 сек Было показано, что изменения соотношения между пиками не превышают 1%.

Основной недостаток существующих на сегодняшний день масс-спектрометрических методов измерения концентрации белков обусловлен необходимостью приготовления индивидуального стандарта для каждого белка.

В настоящей работе предложен подход, который устраняет этот недостаток, поскольку в качестве стандартов используются канонические аминокислоты, содержащие стабильные изотопы. В этом случае процедура

ферментативного гидролиза дополняется стадией кислотного гидролиза в парах соляной кислоты. На рис. 3 представлена функциональная схема масс-спектрометрического количественного определения белков в растворах.

Рис.3. Функциональная схема методики пробоподготовки для масс-спектрометрического количественного определения белков в растворах.

В экспериментах были использованы как коммерческие изотопные аналоги аминокислот, так и полученные в лабораторных условиях стандарты, промодифицированные с помощью изотопного обмена в

Первоначально предполагалось, что масс-спектрометрически возможно определение концентрации белков лишь в случае использования Е81-М8. Это вызвано, прежде всего, тем, что в случае использования МАЬБ! в

областях низких масс наблюдается наличие пиков относящихся к матрице. Поэтому первоначально работа была проделана на ESI-MS.

В качестве стандартов использовали 018-меченые аминокислоты (аргинин (R), лизин (К), фенилаланин (F), тирозин (Y), гистидин (Н)), а также дейтерированный лизин (JVLys), модифицированный по N15 аргинин (l5N2-Arg) и дейтерированный лейцин (D3-Leu) приобретенные в Cambridge Isotope Laboratories inc., США. 018-изотопные стандарты получали по разработанной методике путем изотопного обмена при инкубации нативных аминокислот в среде Н2|80, в присутствии 20% трифторуксусной кислоты (ТФУ), при 20°С или 100°С, в течение 5 дней или 8 часов соответственно. Изотопный обмен осуществлялся как при получении стандартов для отдельных аминокислот, так и смеси, состоящие из двух или трех аминокислот.

Отработку методики масс-спектрометрического количественного анализа начали с определения концентрации нативных аминокислот. В качестве стандартов использовали ,80-меченные Lys и Arg, а также D4- Lys и 'Ч Arg.

При использовании в качестве стандартов модифицированных в Н2,80 аминокислот в спектре рабочей пробы (рис. 4) наблюдается наложение пиков исследуемой аминокислоты и стандарта, в котором не произошел обмен на

|8о.

Это несколько усложняет интерпретацию данного спектра и процедуру расчета. Этих недостатков можно избежать при использовании в качестве стандарта различных коммерческих изотопно-меченых аминокислот.

В данном случае расчет концентраций исследуемых аминокислот проводился из простого соотношения интенсивностей пиков стандарта, концентрация которого известна, и самой аминокислоты:

С„ CctVICT? где Сак - концентрация исследуемой аминокислоты;

1ак - интенсивность пика исследуемой аминокислоты;

Сет - концентрация стандарта;

- интенсивность пика стандарта.

интенсивность. %

100-J

интенсивность, %

ISO 160 i/o пМг «во 170 tea m/i

Рис 4. Фрагменты ESI-MS-спектров аминокислот Lys и Arg (а, в) и His, Phe и Туг (б, г): (а, 6) природных форм; (в, г) ,80-изотопных форм.

На серии опытов с использованием в качестве объектов анализа нативных аминокислот была доказана работоспособность подхода, так как средняя погрешность не превышала 5%.

Далее была поведена серия опытов, целью которых было определение концентрации различных белков. В качестве объектов исследования были взяты бычий сывороточный альбумин (BSA), химотрипсиноген (ChTg) и предшественник инсулина (Proins).

Разработанный метод количес гвенного анализа белков основывается на определении концентрации отдельных аминокислот, входящих в состав исследуемого белка, после его кислотного гидролиза путем измерения относительных интенсивностей ионов аминокислоты и ее стандарта. Гидролиз белков осуществляли в твердом состоянии в парах концентрированных соляной и ТФУ кислот в соотношении 1:1 в вакууме (I-10°мм. рт. ст ) при температуре 107°С в течение 18 часов. К смеси добавляли

фенол для защиты ароматических аминокислот. После окончания гидролиза образцы высушивали на вакуумной центрифуге с целью удаления следов кислот и передавали на анализ.

При добавлении к гидролизату BSA в качестве стандарта смеси пяти 180-меченных аминокислот: Lys, His, Phe, Arg и Туг расчет концентрации белка осуществляли по каждой из пяти аминокислот на основании соотношения интенсивностей первого, третьего и пятого изотопных пиков смеси аминокислота - стандарт с помощью подхода, основанного на решении переопределенной системы линейных уравнений. С помощью этого метода определяется концентрация выбранной аминокислоты в анализируемом белке. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Определение концентрации BSA с использованием 180-меченых внутренних

стандартов

Относительная

Опыт (смесь) Концентрация интенсивность основных 3 Концентрация BSA.

стандарта в смеси, пмоль/мкл пиков для смеси, % пмоль/мкл

M М + 2 M ь4 эксперимент. заданная

1 Arg 52.0 33.6 44.2 192 0.35 0.34

Lys 59.0 40 8 42.9 16.3 0.34

2 Arg 52.0 34.2 46.9 18.8 0.35 0.34

Lys 59.0 41.4 41.8 16.8 0.33

3 Arg 46.0 51.9 33.6 14.5 0.94 0.90

Lys 53.0 45 0 41.3 137 0.89

Arg 45.0 33.5 47 0 195 0.30

Lys 51 0 42 0 43 0 15.0 0.31

4 His 46.5 21.6 44.6 33.8 0.35 0 33

Phe 39.0 28.3 37 9 33 8 0.34

Туг 30 0 18.0 440 38.0 0.06

Arg 30.0 47.8 37.7 14.5 0.55

Lys 34 0 45 9 36 1 18 0 0.51

5 His 42 5 29.1 39 4 31.5 0.59 0.54

Phe 36 0 38 6 31 6 29 8 0 57

Туг 27.5 25.0 42.2 32.8 0.19

Концентрацию самого белка определяли следующим образом:

С бе 1ка~'Сдк/п,

где СбеЛка - концентрация исследуемого белка, пмоль/мкл;

Сак - концентрация аминокислоты входящей в состав анализируемого белка, пмоль/мкл;

п - количество определяемой аминокислоты в анализируемом белке.

В табл. 1 также приведены результаты анализа масс-спектров гидролизата BSA с добавлением в качестве стандарта смеси двух помеченных аминокислот Lys и Arg. Расчет концентрации белка осуществлялся также как и в случае использования смеси пяти аминокислот.

На основании результатов представленных в табл. 1 можно утверждать, что при определении концентрации белка в качестве стандарта достаточно использовать смесь двух аминокислот (средняя погрешность меньше 10%). Однако с увеличением количества аминокислот в стандарте точность метода возрастает (относительная погрешность 5%). Использование в качестве стандарта Туг достаточно проблематично, так как в процессе химического гидролиза при выбранных условиях наблюдается частичная фрагментация этой аминокислоты.

Таблица 2.

Определение концентрации белков с испопьзованиеы D_/-Lys и l5N2- Arg в качестве внутреннего стандарта

Опыт Белок Концентрация стандарта в смеси, пмоль/мкл Концентрация белка, пмоль/мкл Погрешность, %

Эксперимент Заданная

1. BSA Arg 5.0 0.23 0.2 13.0

2 Arg 10.0 0.4 04 0.0

3 Lys 5.0 0.09 0.08 11.1

4 Lys 100 0.15 0 16 6.3

5. Arg __ _ Lys 5 10 0,23 0.26 0.25 0.25 80 3.8

6 CHTg Arg 1 0 0.22 0 25 120

7. Lys 4.0 0.28 0.3 6.7

8 Arg Lys 20 60 0 49 0.5 0.5 0.5 2.0 0

9. Proins Arg 40 1 0 1 0 0

10 Lys 40 1.9 2.0 5 0

15 Arg Lys 11.9 58 3.0 2.9 3.0 3.0 0 3.3

Так как при использовании в качестве стандартов |80-меченых аналогов аминокислот, для расчета концентрации анализируемых аминокислот, возникает необходимость использования специальной программы, то использование коммерческих аминокислот представляется намного более удобным.

Результаты опытов, в которых в качестве стандартов использовались D4-Lys и 2-Arg, представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 средняя ошибка эксперимента не превышает 10%.

Таким образом, было продемонстрировано, что, несмотря на нестабильность новообразования, которая свойственна

электрораспылительному методу ионизации (ESI), используя предложенный подход, становится возможным определение концентрации различных белков.

MALDI был выбран для анализа белковых гидролизатов из-за его высокой скорости получения данных и легкости автоматизации процессов подготовки проб и обработки данных. Кроме того, многие исследования в области химии белка, в особенности протеомике, сделаны именно этим типом масс-спектрометрических приборов.

Проблема наличия пиков в области масс от 74-204 Да, относящихся к мафице и продуктам ее фрагментации была решена использованием типовых матриц, таких как а-циано-п-гидроксикоричная кислота (а-суапо-hydroxycinnaxnic acid) и 2,5- дигидроксибензойная кислота и внимательным изучением продуктов ее фрагментации (рис.5).

На рис.5 а видно, что при использовании а-циано-п-гидроксикоричная кислоты в качестве матрицы становится невозможным выбор Lys в качестве объекта анализа, так как в спектре при значении m/z 147.1, соответствующем этой аминокислоте, присутствует пик одного из фрагментов матрицы. Следовательно, если требуется использовать Lys в качестве объекта анализа,

то необходимо выбрать какую-либо другую матрицу, например 2,5-дигидроксибензойную кислоту (рис. 5 б).

100

(а)

нссн

172.2

164.1

146.1

140

150

160

170

180

100

(W

DHB

177J0

155 JO

138JB

Л. di

140

150 160 170 180 т<7

Рис.5. Масс-спемр продуктов фрагментации матрицы

а) а-аиано-п-i идроксикоричная кислота (o-cvano-h)droxycinnamic acid)

б)2,5- дигидроксибенюйная кислота.

В качестве объектов анализа, как и в экспериментах с Е5!-М$, были выбраны I}э и Л]Ц, по причине того, что эти аминокислоты являются основными и таким образом имеют наибольший выход положительных ионов В качестве стандартов использовались устойчивые изотопные аналоги Ьуь и А^ - ОгЬуБ и 15Ы2-Аг§ соответственно.

С целью демонстрации возможностей равработанного подхода, так же как и в случае с ЕБЬМЗ, была проведена серия опытов, целью которых было определение концентрации аминокислот Выбор матрицы осуществлялся в зависимости от тою, какая аминокистога была выбрана в качестве объекта исследования Проведенная серия опытов показала, что максимальная

ошибка, так же как и в случае использования ионизации электрораспылением, не превышает 10%.

После окончания апробации метода количественного анализа на аминокислотах, как и в случае использования ESI-MS, перешли к работе с модельными белками. В качестве объектов исследования были выбраны BSA и Ovalbumin.

Белки также были подвергнуты кислотному гидролизу в газовой фазе в присутствии соляной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовался D4-Lys и l5N2-Arg.

Таблица 3.

Определение концентрации белков с использованием П4-1ух в качестве внутреннего стандарта.____

Количество D<i-Lys [фмоль] Количество белка | фмоль] погрешность [%]

Образец Измеренная Ожидаемая

BSA 882 16.5 17.7 6.8

882 16.8 17.7 5.1

BSA 546 8.3 8.7 4.6

546 8.6 87 1.1

546 8.4 87 3.4

Ovalbumin 486 20.3 21.3 4.7

486 23.3 21.3 9.4

Ovalbumin 120 6.4 6.0 6.7

Таблица 4.

Определение концентрации белков с использованием в качестве

внутреннего стандарта.

Количество nN2- Количество белка [фмоль] погрешность

Образец Arg [фмоль] {%}

Измеренное Ожидаемое

BSA 384 17.2 17.7 2.8

384 16.6 17.7 6.2

384 16.2 17.7 8.5

BSA 177 8.7 8.7 0.0

Ovalbumin 480 22 2 21.3 05

480 18.2 21.3 14.6

Ovalbumin 120 5.9 6 1 7

120 5.3 6 11.7

Как видно из представленных в таблицах 3 и 4 данных, средняя ошибка, в случае использования D4-I.ys в качестве внутреннего стандарта, составила 5.8%, а в случае использования "Nj-Arg - 7.2%.

Причем, с помощью данного подхода удалось проанализировать белок в количестве от 5-10 fmol, чго по ч>вствительности выше, чем при использовании ВЭЖХ в качестве аналитического метода.

Получив подтверждение относительно возможности количественно!о анализа с использованием масс-спектромегрии с MAI.DI-источником ионов, возник вопрос, можно ли определить количество белка снятого с геля. С этой целью BSA и Ovalbumin были разделены с помощью двумерного электрофореза. Далее белки восстанавлявали и алкилировали и подготавливали к триптическому гидролизу. К пробе, отобранной для количественного анализа, добавляли аминокислотные изотопно-меченые иандарш (DrL>s, '"XVArg в зависимости от матрицы), посте чего полвергати кислотном) гидротиз\ при условиях сходных с условиями, используемыми при работе с белками в растворе. Гидролизат лиофильно высушивали и лерерас1воряли в 0.1% ТФУ для масс-спектрометрического анализа. Расчеты концентраций белков в зависимости от внутреннего аандарта иредаавлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из результатов представленных в таблицах 5 и 6 количество белка нанесенного на геть и замеренного масс-спектрометрически различаю1ся. Эю объясняется тем, чю белки не мог}т быть полностью сняты с 1 е 1я, и степень >ффек1ивноаи извлечения белков, равная приблизительно 75%, вполне соотносится с известными данными, относящимися к двумерному электрофорезу Кроме того, как видно из результатов представленных в таблицах 5 и 6 эффективность извлечения так же зависит и от белка. 1аким образом, во избежание потерь при снятии белка с геля, есть смысл проводи ib разделение с помощью жидкостной хроматографии

Таблица 5.

Определение концентрации белков снятых с геля с использованием в

качестве внутреннего стандарта

концентрация белка в геле. Количество D4-Lys [фмоль] Количество белка на мишени [фмоль] Расчет эффективности экстракции, %

измеренное ожидаемое

BSA, 2 prnol 720 720 720 20 4 22.6 21.3 24 24 24 85 0 94.2 87 3

BSA, lpmol 720 720 720 8.0 8.1 76 12 12 12 66.7 67.5 63.3

BSA, 0.5pmol 900 900 900 4.4 4.5 4.3 6 6 6 73.3 75.0 71.7

BSA O.Spmol 420 420 420 4.5 4.2 4.3 6 6 6 75 0 70.0 71.7

Ovalbumin, 2 pmol 900 900 19.5 17.0 24 24 81.3 70.8

Ovalbumin, 1 'pmol 300 300 10.1 9.6 12 12 84.2 80.0

Ovalbumin, 0.5pmol 60 60 60 4.8 52 4.6 6 6 6 80.0 86.7 76.7

Таблица 6.

Определение концентрации белков снятых с геля, с использованием 15 в качестве внутреннего стандарта._____

Количество белка Количество l5N4-Lys Количество белка на мишени [фмоль ] эффективность экстракции

[фмоль] Измеренное Теоретическое [%]

BSA 240 23.1 24 96.3

2 pmol 240 22.6 24 94.2

BSA, lpmol 180 9.1 12 75.8

180 180 8.6 8.8 12 12 71.7 73.3

BSA. 180 4.7 6 78 3

0.5pmol 180 4.4 6 73.3

Ovalbumin 2pmoI 360 360 19.8 20.4 24 24 82 5 85.0

Ovalbumin 120 6.7 12 55.8

1 pmol 120 5.5 12 45.8

Ovalbumin 36 4.4 6 73 3

0.5pmol 36 4.3 6 71 7

Анализируя результаты представленные в таблицах 3-6, можно сказать, что одного внутреннего стандарта вполне достаточно для количественного анализа белков, как в растворе, так и с геля. Но, тем не менее, при использовании нескольких стандартов одновременно, как и в случае с ионизацией электрораспылением, можно снизить ошибку анализа. Это предположение было полностью подтверждено опытным путем, причем средняя ошибка не превышала 5%, а в некоторых случаях составляла менее 1%.

Для проверки в качестве стандарта использовали смесь D3-Leu и 15N2-Arg. Анализ проводили на а-циано-п-гидроксикоричной кислоте.

Таблица 7.

Количественное определение BSA и fi-лактоглобулина с использованием смеси внутренних стандартов (D3-Leu и hN2-Arg).

№ Количество стандарта на мишени, [пмоль] Количество белка на MALDI мишени [пмоль] Ошибка [%]

В SA (5-лактоглобулин

D3-Leu ,5N,-Arg Измеренная Ожидаемая Измеренная Ожидаемая BSA Р- Lact

1 5 7 0 15 0 10 (Di-Leu) 0 09 (,SN-Arg) 0 10 • - 00 -

2 5 8 0 15 - - 0 69 (D-,-Leu) 0 70 ("NrArg) 0 69 - 0.0

3 56 2 5 0 066 0 066 0 18 0 23 00 23 7

4 112 1 95 0 04? 0 046 0 34 0 32 87 63

5 6 1 24 0.024 0 030 0 39 0 43 20 0 103

6 84 1 9 0 02 0 023 0 47 0 50 П 0 60

Как видно из табл.7 использование нескольких стандартов дает возможность анализа смеси белков, в том случае, если аминокислотная последовательность этих белков известна., с помощью простой системы уравнений.

С(а/к1)„р= С(белка)! • П|+С(белка)2• п'|

С(а/к2)пр= С(белка)] • п2+С(белка)2 ■ п'2

где С(а/к1)Пр- замеренное количество аминокислоты 1, пмоль.

C(a/k2)„p - замеренное количество аминокислоты 2, пмоль.

С(белка)| - количество белка 1, пмоль.

С(белка)2 - количество белка 2, пмоль.

пь n'i - содержание аминокислоты 1 в аминокислотной последовательности белков 1 и 2, соответственно.

гъ, п*2 - содержание аминокислоты 2 в аминокислотной последовательности белков 1 и 2, соответственно.

Зная количество аминокислот в том или ином белке и концентрацию стандарта, можно составить систему линейных уравнений, решение которых позволит рассчитать содержание того или иного белка в смеси. Это предположение было опробовано на примере смеси BS А и ß-лактоглобулин (табл. 9 п.3-6). В этих белках содержание R 23 и 3 соответственно, Не и Leu - 75 и 32 соответственно. Таким образом, можно составить следующее уравнение:

C(Arg)nP =C(BSA) • 23+C(ß-lactoglobulin) -3 C(Ue/Leu)np=C(BSA) -75+C C(ß-lactoglobulin) -32 где C(Arg)np- количество Arg, пмоль;

C(BSA)- количество BSA, пмоль;

C(ß-lactoglobulin) - количество ß-лактоглобулина, пмоль;

C(Ile/Leu)np- замеренная количество смеси lie/Leu, пмоль.

Кроме того, было продемонстрировано, что при использовании в качестве внутреннего стандарта D3-Leu возможно определение суммарной концентрации лейцина и изолейцина.

Таким образом, разработанный метод позволяет определять количество белков с помощью ESI-MS и MALDI-MS, как в растворе, так и в геле, при использовании фиксированного набора изотопно-меченных аминокислот, в качестве внутреннего стандарта. То есть данный метод можно назвать универсальным.

Основные результаты и выводы.

1. Изучена дискриминация ионообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработана и апробирована масс-спектрометрическая методика количественного анализа белков, позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования для мягких методов ионизации (ESI и MALDI).

3. Разработанные методики позволяют использовать стандартные масс-спектрометрические системы (ESI и MALDI) для проведения количественного анализа белков.

4 Предложенная методика количественного определения белков для масс-спектрометрических методов ESI и MALDI позволяет проводить измерение с точностью 5-10%. На уровне от 5 фмоль.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Новиков А В., Савельева И.В., Краснов Н.В., Роепсторфф П., Кернер Р., Миргородская O.A. Использование ESI-MS и изотопномеченых аминокислотных стандартов для определения концентрации белков // Научное приборостроение - 2002. - Т. 12, №4 - С. 70-80.

2. Новиков A.B., Савельева Н.В., Симанкова А.Н., Краснов Н.В., Миргородская O.A. Масс-спектрометрическое определение энзиматических СВОЙС1В протеолитических ферментов на примере аспартатной протеиназы из Trichoderma viride //Научное приборостроение - 2004 -Т.14, №1-С. 18-32.

3. Mirgorodskaya О., Körner R., Novikov A., Roepstorff P. Absolute quantitation of proteins by a combination of acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // Anal. Chem. - 2004. - V.76, №13 - P. 3569-3575

4. Новиков AB., Краснов H.B. Савельева H.B., Миргородская O.A. Использование ESI-MS для определения количества белков. // Сборник

тезисов 6-ой Путинской школы конференции " Биология -наука XXI века". -2002, с. 293

5. Новиков A.B., Савельева Н.В., Симанкова А.Н., Краснов Н.В., Миргородская O.A. Масс-спектрометрическое изучение специфичности аспартатной протеиназы из Trichoderma viride. II Сборник тезисов Ш-го съезда биофизиков России. - 2004. Воронеж. Том 1, стр. 79.

6. Nazimov I.V., Rusanov V.N., Novikov A.V., Verenchikov V. N. Monitoring of recombinant human insulin production. // In Proc. 10th International Conference. - 2004. S. Petersburg. Desorption. P.46.

7. О.А.Миргородская, Р. Кёрнер, А.В.Новиков, П. Роепсторфф

Определение абсолютной концентрации белков комбинацией кислотного гидролиза и MALDI-MS. // Сборник тезисов 2-го Международного Семинара-школы "Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии" - 2004. г. Звенигород. С. 238,

РНБ Русский фонд

2006-4 424

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать №. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл. печ. л Тираж /ОО . Заказ .

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

1

27 ОКТ 200Г"

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исследование белка с помощью масс-спектрометрии.

2.2. Основные методы ионообразования термолабильных веществ.

2.2.1. Образование ионов при электрораспылении

Electrospray Ionization, ESI).

2.2.2. Ионизация лазерной десорбции в присутствии матрицы

Matrix assisted laser Desorbtion / Ionization, MALDI).

2.3.Масс-анализатор ы.

2.3.1.Магнитные секторные масс-анализаторы.

2.3.2. Времяпролетные масс-анализаторы.

2.4. Методики определения количества белка с использованием f масс-спектрометрии.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение аминокислотных стандартов.

3.2. Количественный анализ аминокислот.

3.2.1. Количественный анализ аминокислот с использованием

ESI-MS.'.

3.2.2. Количественное определение аминокислот с использованием MALDI-MS.

3.3. Определение количества белков.

3.3.1. Определение количества белка с помощью ESI-MS.

3.3.2. Определение количества белков с помощью MALDI-MS.

3.3.3.Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ.

4. Материалы и методы.

ВЫВОДЫ.

В настоящее время масс-спектрометрия является ключевым инструментом в исследованиях в области химии белка. Особенно это относится к идентификации различных пептидов и белков, аминокислотная последовательность которых может быть взята из различных баз данных, либо предсказана на; основании генома. Однако для понимания физиологических процессов на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, но и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым и относятся белки, наиболее часто используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Electrospray Ionization Mass-Spectrometry, ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorptioiyionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS). Оба этих масс-спектрометрических метода, по причине дискриминации ионообразования и конкуренции за протон между отдельными компонентами смеси веществ, не позволяют определять количественные параметры. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются, однако все предлагаемые к настоящему времени подходы связанны с необходимостью дополнительных химических модификаций и созданием в каждом отдельном случае соответствующих стандартов. В связи с этим изучение дискриминации в ионообразовании и ее преодоления в мягких ионизационных методах, таких как ESI и MALDI с целью их адаптации к количественному анализу белков, имеет как теоретическую, так и практическую ценность.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение дискриминации новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI, и использование полученных данных для создания универсальной масс-спектрометрической методики количественного анализа белков и пептидов.

1. Изучить дискриминацию новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработать метод определения количества белков с помощью ESI-MS и MALDI-MS.

3. Апробировать разработанный подход на примере модельных белков в растворе и в геле. '

Научная новизна работы. Изучена дискриминация новообразования в мягких методах ионизации, таких как ESI и MALDI.

Предложена методика позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования и определить количество белков.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов была разработана методика, позволяющая количественно проанализировать белки на уровне 5 фмоль, без существенной доработки масс-спектрометрических приборов. Кроме того, продемонстрирована возможность определения количественных характеристик пептидов белков, не только предварительно выделенных, но и в смеси содержащей 2-3 компонента.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах в ИАнП РАН, на 6-й Пущинской школе-конференции "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" (г. Пущино, 2002г.), на III съезде биофизиков России (г. Воронеж, 2004), а так же на Desorption 2004. (S.- Petersburg).

Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи в журнале "Научное приборостроение", статья в журнале Analytical chemistry и материалы трех докладов на конференциях.

ВЫВОДЫ

1. Изучена дискриминация новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработана и апробирована масс-спектрометрическая методика количественного анализа белков, позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования для мягких методов ионизации (ESI и MALDI).

3. Разработанные методики позволяют использовать стандартные масс-спектрометрические системы (ESI и MALDI) для проведения количественного диализа белков.

4. Предложенная методика количественного определения белков для масс-спектрометрических методов ESI и MALDI позволяет проводить измерение с точностью 5-10%. На уровне от 5 фмоль.

1. Киселев Л.Л. Геном человека и биология XXI века. Вестник академии наук. 2000, том 70, №5, с.412-424.

2. Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. Под ред. Проф. Ю. В. Митина., М.: Мир, 1983, с.621.

3. А. Дарбре. Практическая химия белка. М.: Мир, 1985, с.456.

4. Klose J. //Genotypes and phenotypes. Electrophoresis, 1999, v.20, p. 643652.

5. Corthals G.L., Wasinger V.C., Hochstrasser D.F. and Sanchez J.C. The dynamic range of protein expression: a challenge , for proteomic research // Electrophoresis. 2000. N 21. P. 1104-1115.

6. Dunham I., Shimizu N., Roe B.A. et al. The DNA sequence of human chromosome 22 // Nature. 1999. V. 402. P. 489-495.

7. Venter J.C., Adamd M.D., Myers E.W et al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304-1351.

8. William S.Hancock, Shiaw-Lin Wu, Paul Shieh. The challenges of developing a sound proteomics strategy. Proteomics 2002,v.2 , p. 352 -359.

9. Jasminka Godovac-Zimmermann and Larry R. Brown. Perspectives for mass spectrometry and functional proteomics. Mass Spectrometry Reviews, 2001,20,1-57

10. Aebersold R. and Mann M. Mass spectrometry-based proteomics // Nature. 2003. V. 422. P. 198-207.

11. M. Mann, R. C. Hendrickson, A. Pandey. Analysis of proteins and proteoms by mass spectrometry. Annu. Rev. Biochem. 2001. v. 70, p. 437-473.

12. С. Dass. Principles and practice of biological mass spectrometry. Wiley-interscience. New-York, USA, 2001,416 p.

13. Edmond de Hoffman and Vincent Stroobant. Mass spectrometry. Principles and Applications. Wiley- interscience. New-York, USA, 2003, 407 p.

14. J. Qin, B. Chait. Identification and characterization of posttranslational modification of proteins by MALDI ion trap mass spectrometry. — Anal.

15. Chem. 1997, v.69, p. 4002-4009.

16. Spengler В., Kirsch D., Kaufmann R. and Jaeger E. Peptide sequencing by matrix-assisted laser-desorption mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992. N 6. P. 105-108.

17. Mann M., Hojrup P. and Roepstorff P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases // Biol. Mass Spectrom. 1993. V. 22. P. 338-345.

18. Jensen O.N., Podtelejnikov A.V. and Mann M. Identification of the components of simple protein mixtures by high-accuracy peptide mass mapping and database searching // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4741-4750.

19. Zhang W., Chait B.T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 2482-2489.

20. Krutchinski A.N., Zhang W. and Chait B.T. Rapidly switchable matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray quadrupoletime- of-flight mass spectrometry for protein identification // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. N 11. P. 493-504.

21. P. R. Graves, T. A. J. Haystead. Molecular Biologist's Guide to Proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, v. 66, №1 p. 39-63.

22. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O. and Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 850-858.

23. Shevchenko A., Jensen O.N., Podtelejnikov A.V. et al. Linking genome andproteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. V. 93. P. 14440-14445.

24. Hanno Steen. Mass Spectrometric Analysis of Protein Modifications. PhD Thesis, University of Southern Denmark, Odense, Denmark, 2001.

25. Gottfried J. Feistner, Kym F. Faull, Douglas F. Barofsky, Peter Roepstorff. Mass Spectrometric Peptide and Protein Charting. J. Mass Spectrom., 1995, v.30, p. 519-530.

26. S. D. Patterson, R. Aebersold. Mass spectrometric approaches for the identification gel-separated proteins. Electrophoresis, 1995, v. 16, p. 17911814.

27. Mirgorodskaya E.P., Mirgorodskaya O.A., Dobretsov S.V., Shevchenko A.A., Dodonov A.F., Kozlovskiy V.I., Raznikov V.V. // Electrospray mass-spectrometric study of melittin trypsinolysis by a kinetic approach. Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 2864-2869.

28. Mirgorodskaya O., Kazanina G., Roepstorf P., Mirgorodskaya E.,

29. Zamolodchikova Т., Vorotyntseva Т., Miroshnikov A., Alexandrov S. // Acomparative study of the specificity of proinsulin hydrolysis by duodenase,trypsin and plasmin. Prot. and Peptide Letters. 1998. V. 5. P. 27-32. i

30. K. Gevaert, J. Vandekerckhove. Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis 2000, v. 21, p. 1145-1154.

31. William S.Hancock, Shiaw-Lin Wu, Paul Shieh. The challenges of developing a sound proteomics strategy. Proteomics 2002,v.2 , p. 352 -359.

32. Electrospray Ionization Mass Spectronmetry: Fundamentals, Instrumentation and Applications / Ed. Cole R.B. NY.: Willey, 1997.

33. N. B. Cech, C. G. Enke. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362-387.

34. Renato Zenobi, Richard Knochenmuss. Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Reviews, 17, 337-366, 1998.

35. Dole. M., Mack, L.L., Hines, R.L. Molecular Beams of Macroions. Journal of Chemical Physics, 49, 1968, pp2240-2249.

36. С.И.Шевченко, А.И. Григорьев, C.O. Ширяева. Электродинамическое распыление жидкости. Научное приборостроение. 1991, Том1, №4, стр 3-21.

37. L.D.Ferguson, iM.B.Alice, M.Dole, L.L.Mack, R.L.Hines, L.D.Mobley Molecular Beams of Macroions.- J.Chem.Phys. v.52, 1970, № 10, p.4977-4986.

38. M.Dole, H.L.Cox, J.Gienic Electrospray Mass Spectrometry -Adv.Chem. Ser.1255, 1975, p.73-84.

39. L.L.Mack, K.Nakamae, C.Guptu Electrospray Mass Spectrometry of Macromolecules, Application of an Ion Drift Spectrometer. -Biomed. Mass Spectrom., vl 1,1984, p.259-269.

40. J.V.Iribarne, B.A.Thomson On the Evaporation of Small Ions Irom Charged Droplets.- J.Chem.Phys. v.64, 1976, № 8, p.2287.

41. B.A.Thomson, J.V.Iribarne Field Induced Ion Evaporation from Liquid Surfaces at Atmospheric Pressure - J.Chem.Phys, v.7 , 1979, & 1, p.4451-4463.

42. B.A.Thomson, J.V.Iriburne, P.Dziedzic Liquid Ion Evaporation /Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry for Detection of Polar Labile Molecules.- Anal.Chem. v.54, 1982, Jfc 13, p.2219-2224.

43. B.A.Thomson, J.V.Iribarne, P.J.Dziedzic Atmospheric Pressure1.n Evaporation Mass Spectrometry.- Int.J.Mass Spectrom.Ion., v.50, 983, №3,p.331-347.

44. Iribarne J.V., Dziedic P.J. and Thomson B.A. Atmospheric Pressure Ion Evaporation Mass Spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1983. V. 50. P. 331-347.

45. Александров M. JL, Галль Л.Н., Краснов H.B., Николаев В.И., Шкуровi

46. B.A. и Павленко B.A. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый способ масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ. // ДАН, 1984, т. 277, №2, с. 379-383.

47. Александров М. Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В., Николаев В.И. иI

48. Шкуров В.А. Метод масс-спектрометрического анализа труднолетучих термически нестабильных веществ основанный на экстракции ионов из раствора при атмосферном давлении// ЖАХ, 1985, т. 40, №6, с. 160172.

49. М.Л. Александров, Л.Н. Галль, А.Н. Веренчиков, Н.В. Краснов, В.А. Шкуров. Исследование механизма образования катионов в масс-спектрометрии ЭРИАД. Научное приборостроение. 1991, том 1., №2, стр. 3-36.

50. Н.В. Краснов, М.З. Мурадымов, С.И. Шевченко. Комплексные исследования характеристик ЭГД распыления жидкости. Научное приборостроение. 1991, том 1, №1, стр 42-52.

51. J. В. Fenn, М. Mann, С.К. Meng, С. М. Whitehouse. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 1989, v.246, p.64-71.

52. Дж. Чепмен. Практическая органическая масс-спектрометрия. М.: Мир, 1988, стр. 216.

53. J.R. Chapman. Practical organic Mass Spectrometry. John Wiley & Sons. Chichester. 1995. p.338.

54. F. Hillenkamp, M. Karas. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biopolymers. Anal. Chem. 63, 1193A-1202A, 1991

55. Michael Karas, Matthias Gliickmann and Jurgen Schefer. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky surviv/ors. J. Mass Spectrom. 35, 1-12, 2000.

56. R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker and R. Zenobi. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization, J. Mass Spectrom.,v. 35, 1237-1245 (2000).

57. Scott E., Van Bramer. An introduction to Mass Spectrometry. Review 1998.

58. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. Пер с англ. М.: Мир 1980, 581с.

59. Грушка Э., Йенсен Э. Хатиб С., Левин С., Миллер Г. Р., Оган К., Пул К.Ф., Риз Ч. Е., Скотт Р.П.У., Уден П.К. Количественный анализ хроматографическимим методами. Пер. с англ. М.: Мир, 1990, 320с.

60. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа. М. Мир, 1989, 608с.

61. С. L. Nilsson, P. Davidsson. New separation tools for comprehensive studies of protein expression by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2000, v.19, p.390-397.

62. Boyd, R. K., J. D. Henion, M. Alexander, W. L. Budde, J. D. Gilbert, S. M. Musser, C. Palmer, and E. K. Zurek. "Mass spectrometry and good laboratory practices". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1996; 7:211-218.

63. X. Zhu, and D.M. Desiderio,. Peptide quantification by tandem mass spectrometry. Mass, Spectrometry Reviews 15:213-240, 1996

64. D.M. Desiderio, X. Zhu. Quantitative analysis of methionine enkephalin and beta-endorphin in the pituitary by liquid secondary ion massspectrometry and tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 794, 85-96. Review. (1998).i

65. Mann M. Quantitative proteomics? Natural biotechnology, 1999, v. 17; 954-955.

66. Gygi S.P, B. Rist, Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat. Biotechnol. 1999, v. 17, p.994-999.

67. Smolka M.B., Zhou H., Purkayastha S. and Aebersold R. Optimization of the isotope-coded affinity tag-labeling procedure for quantitative proteome analysis // Anal. Biochem. 2001. V. 297. P. 25-31.

68. Mahmoud Hamdan and Pier Giorgio Righetti. Modern strategies for protein quantification in proteome analysis: advantages and limitations. Mass Spectrometry Reviews,2002,v.21, p. 287-302.

69. Oda Y., Huang K., Croos F.R., Cowburn D.,Chait B.T. Accurate quantitation of protein expression and site specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA,1999, v. 96, p.6591-6596.

70. Миргородская O.A., Козьмин Ю.П., Титов М.И., Савельева Н.В., Кернер Р., Сонксэн К., Мирошников А.И., Ройпсторфф П. // Использование MALDI-MS для количественного анализа пептидов и белков. Биоорганическая химия, Москва 2000. Т. 26. С. 662-671.

71. Yao X., Freas A., J. Ramirez P., Demirev P.A., Fenselau C. // Proteolitic1Я

72. О Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 2001. V73. P 2836-2842

73. Wilm M. and Mann M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source//Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 1-8.i