Исследование функциональных комплексов рибосомы методом криоэлектронной микроскопии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Направахрукописи

Мясников Александр Геннадьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ РИБОСОМЫ МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в Институте Генетики, Молекулярной и Клеточной Биологии, Страсбург, Франция, в Империал Колледже, Лондон, Великобритания.

Научные руководители:

Д.х.н, проф. Донцова Ольга Анатольевна К.Х.Н., ст.н.с. Шпанченко Ольга Валерьевна

Научный консультант:

проф. Бруно Клахольц

Официальные оппоненты:

Д.х.н., проф. Польшаков Владимир Иванович д.б.н. Фролова Людмила Юрьевна

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 24 февраля 2004 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119699, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат раЗОСЛан<<января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г.

2004-4 25062

Актуальность проблемы: В течение длительного времени усилия многих исследователей сосредоточены на изучении механизма биосинтеза белка. В первую очередь они направлены на изучение строения компонентов белок-синтезирующей системы. Центральным компонентом системы биосинтеза белка является рибосома - -сложный рибонуклеопротеидный комплекс. В последнее время появились данные об атомарной структуре 308 и 508 субчастиц рибосомы, целой 708 рибосомы и о структуре комплексов рибосомы с различными лигандами

Между тем до сих пор остаются до конца не ясными механизмы многих процессов, протекающих на рибосоме, например, программируемой остановки рибосомы, вызванной взаимодействием с сигнал узнающей частицей (8ИР), механизмы терминации, процессов передачи сигналов между функциональными центрами 708 рибосомы в ходе трансляции.

Ответы на эти и многие другие вопросы приведут к пониманию не только механизма процесса трансляции, но и общих принципов структурно-функционального взаимодействия как внутри самой рибосомы, так и рибосомы с факторами трансляции в ходе белкового синтеза.

-з- Шб&т

Общая характеристика работы

Цель работы - С помощью метода криоэлектронной микроскопии провести изучение структурных перестроек внутри мутантных 508 субчастиц рибосом Е.евИ, связанных с обменом сигналами между функциональными центрами рибосомы, локализовать белковый компонент 8ИР на рибосоме, исследовать две стадии процесса терминации белкового синтеза, протекающие при участии факторов терминации ЕБ2 и №3.

Научная новизна и практическая значимость. Для исследования механизма обмена сигналами между функциональными центрами рибосомы в настоящей работе мы использовали рибосомные субчастицы, в которых методом сайт-направленного мутагенза были нарушены природные контакты внутренних элементов 23 8 рРНК. Анализ структурных перестроек проводили методом криоэлектронной микроскопии с последующей реконструкцией структуры 508 субчастиц. Получены структуры

мутантных рибосом с разрешением 10 А. Г^

со

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПстсИт лу /

оэ ткдм 'П

структурой 50S субчастицы дикого типа мы не обнаружили существенных различий в положении ГТФазного центра.

При исследовании комплекса белкового компонента SRP, белка Ffh, с рибосомой было показано, что он связывается в области белка L23, находящегося в непосредственной близости от выхода из пептидного туннеля.

Исследование комплекса фактора терминации RF2 с рибосомой показало, что при взаимодействии с рибосомой фактор термннации RF2 изменяет свою конформацию. Она получила название «открытая» в отличие от «закрытой» конформации, определенной методом рентгеноструктурного анализа. Методом криоэлектронной микроскопии показано взаимодействие функционально важных центров рибосомы и фактора терминации RF2.

При исследовании рибосомного терминационного комплекса с участием фактора терминации RF3 было выявлено место связывания фактора. При дальнейшем рассмотрении полученной структуры мы обнаружили, что фактор терминации RF3 может находиться в двух состояниях, причем только одно из них допускает наличие фактора терминации RF2 в Р участке рибосомы.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на Международной Конференции в честь А.С. Спирина "Protein Synthesis" (Пущино, Россия, 2001); Международном Конгрессе по кристаллографии «XIX ШСг Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography» (Женева, Швейцария, 2002) и на Международной Конференции «ESRF user meeting 2002» (Гренобль, Франция, 2002), а так же доложены и обсуждены на семинарах лаборатории химии нуклеопротевдов, кафедры химии природных соединений, группы криоэлектронной микроскопии Imperial College (Лондон, Англия) и группы криоэлектронной микроскопии IGBMC (Страсбург, Франция).

Структура и объем диссертационной работы Диссертационная работа изложена на /Д5 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован рисунками и О таблицами. Библиографический указатель включает цитированных работ.

Содержание работы

1. Изучение передачи сигналов путем исследования структурных перестроек внутри мутантных 50S субчастиц рибосом E. соЛ'методом криоэлектронной микроскопии

Ранее в нашей лаборатории был получен ряд мутаций в 23 S рРНК, влияющих на передачу сигнала из ГТФазного центра рибосомы в пептидилтрансферазный центр (ПТЦ). Мутация в спирали 89 нарушала передачу сигнала от сарцин-рициновой петли (часть ГТФазного центра рибосомы) в ПТЦ рибосомы, что было подтверждено ранее биохимическими методами. Мутация в спирали 42 влияла на правильность прочтения стоп кодонов и на сохранение рамки считывания. Возможной причиной такого поведения мутантных рибосом может быть изменение положения ГТФазного центра. Данное предположение было проверено методом электронной микроскопии. Нам удалось получить структуры мутантных 50S субчастиц с разрешением 10 А. Однако ввиду большой подвижности ГТФазного центра мы не смогли достоверно проследить за конформационными изменениями, вызванными этими мутациями; возможно, они проявляются только в том случае, когда положение ГТФазного центра зафиксировано, например, при связывании факторов элонгации.

2. Изучение структуры комплекса белка FfhM с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии

Удаление NG доменов белка Ffh, одного из компонентов SRP, препятствует его связыванию с рецептором, расположенным на мембране, что приводит к накоплению комплекса рибосомы с белком FfhM в клетке. В нашей лаборатории был выделен такой комплекс и исследована его структура методом электронной микроскопии. Оказалось, что белок FfhM связывается с рибосомой в районе рибосомного белка L23. Данный белок расположен у выхода из пептидного туннеля, по которому движется растущая полипептидная цепь.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что именно белок Ffh ответственен за узнавание сигнального пептида.

3. Изучение структуры комплекса фактора терминации RF2 с рибосомой

Комплекс фактора терминации RF2 с рибосомой для исследования методом криоэлектронной микроскопии был предоставлен лабораторией

проф. Эренберга М. (Ehrenberg M, Department of Cell and Molecular Biology, BMC, Uppsala University, Box 596, 75124 Uppsala, Sweden). Нам удалось получить структуры этого комплекса с разрешением 14 Л. Для детальной интерпретации полученных структур было проведено встраивание рентгеноструктурных данных для 70S рибосомы Thermus thermophilus и фактора терминации RF2 E.coli в электронную карту плотности. Наиболее полного совмещения структуры фактора терминации RF2 и электронной плотности удалось добиться путем перемещения доменов 1 и 3 фактора, в то время как домепы 2 и 4 выступали как функциональная единица (один супердомен).

Домены 2 и 4 формируют структуру вытянутой формы, которая великолепно вписывается в электронную плопюсть, соединенную с декодирующим сайтом рибосомы (рис. 1А, 1Б). Небольшое смещение домена 1 (используя Gly 121 как точку поворота) позволяет точно вписать домен 1 в электронную плопюсть, которая простирается от места связывания фактора терминации RF2 до области «головы» 30S (рис. 1Б). Оставшийся домен 3 может быть вписан в электронную плотность, которая находится между декодирующей областью и ПТЦ. Вписывание этого домена было произведено с помощью изменения положения петель, расположенных до и после домена 3. Данные о месте посадки фактора терминации RF2 на рибосоме, полученные с помощью криоэлектронной микроскопии, кореллирует с результатами, полученными методом иммунолокализации и сайт-направленного «пробинга».

Домен I является своеобразным мостом, связывающим большую и малую субчастицы рибосомы (рис. 1А, 1Б). При полученном разрешении можно наблюдать трехспиральный участок домена 1, который вытянут по направлению к спирали 33 16 рРНК субчастицы (рис. 1Б). Другая часть домена 1 обвивает N-концевую часть белка Lll 50S субчастицы, а так же контактирует со спиралями 43 и 44 23S рРНК (рис. 2А). Контакт в районе «юловы» 30S субчастицы, по-видимому, приводит к конформационным изменениям в структуре «головы», что видно из сравнения наших данных с рентгеноструктурными данными для 70S рибосомы и криоэлектронными данными, полученными для рибосом без RF2. Эта перестройка включает в себя небольшое смещение спирали 33 (30S «клюв»), белков S10, S3 и S5, локализованных у места входа мРНК в рибосому (рис. 1Б). Контакт RF2 со спиралями 43 и 44 23 S рРНК

соответствует данным, показывающим, что основания А1067 и А1095, расположенные в этих спиралях, необходимы для связывания №2 с рибосомой (рис. 2А). Данная область перекрывается с областью связывания антибиотика тиострептона. Можно предположить, что этот антибиотик конкурирует за место посадки с ЕР2.

Структура, полученная методом криоэлектронной микроскопии, показывает, что домен 2/4 фактора терминации ИБ2 точно вписывается в декодирующий карман рибосомы, образованный с одной стороны спиралью 18 168 рРНК и белком 812, а с другой стороны спиралями 44 168 рРНК и 69 238 рРНК (рис. 2А, 3). Домен 4 фактора терминации ИБ2 близок к спирали 18, домен 2 ответственен за все другие контакты с декодирующим центром рибосомы. Петля домена 2, несущая консервативный 8РР аминокислотный мотив, проникает в мРНК-туннель. мРНК на данной карте электронной плотности не видна из-за недостаточного разрешения, но • о ее расположении на рибосоме можно высказать предположение, исходя из данных рентгеноструктурного анализа. Суммируя данные о расположении мРНК и домена 2 фактора терминации ИБ2, можно предположить существование прямого контакта между стоп кодоном мРНК и 8РБ мотивом фактора терминации ИБ2 (рис. 2А, 3). Наша модель так же предполагает, что заряженные аминокислотные остатки, находящиеся в прямо не участвуют в процессе декодирования, так как они расположены ближе к спиралям 69 и 44, чем к мРНК.

Другой консервативный мотив, ООр петля, контактирует со спиралью 93 238 рРНК и 3' концом тРНК, расположенной в Р участке. Согласно нашим результатам тРНК, находящаяся в Р участке, смещается по направлению к белку Ь5 по сравнению с рентгеноструктурными данными.

Структура фактора терминации ЕР2, полученная нами, отличается от структуры, полученной на основании данных рентгеноструктурного анализа. Наши данные показывают, что ИБ2 приобретает «открытую» конформацию на рибосоме, в то время как рентгеноструктурные данные указывают на компактную структуру фактора терминации ИБ2 (рис. 4А). Связывание фактора терминации ИБ2 с рибосомой и узнавание стоп кодона, возможно, индуцируют изменения в положении домена 3 фактора так, что ООр петля, находящаяся на кончике домена, располагается в непосредственной близости от ПНД (рис. 2Б, 4А). Конформационные изменения в факторе терминации ИБ2 позволяют объяснить наблюдаемые различия в расстоянии между функциональными центрами тРНК и ИБ2. Как известно из рентгеноструктурных

данных, расстояние в молекуле фактора терминации 2 между SPF мотивом и GGQ составляет 23 А, в то время как в тРНК расстояние между антикодоном и 3' ССЛ концом составляет 75 А. В предложенной нами модели фактора терминации RF2 расстояние между активными центрами приближается к таковому у тРНК, что позволяет фактору терминации RF2 передавать сигнал из декодирующего центра в пептидил трансферазный центр рибосомы (рис. 3). Данное свойство фактора мимикрирует подобное свойство у тРНК, но при наложении структур тРНК и фактора терминации RF2 (рис. 4В) мы видим только частичное их перекрывание, что указывает на то, что концепция молекулярной мимикрии в случае RF2 применима больше для функции, нежели для формы молекулы.

Факторы терминации первого класса у прокариот и эукариот, как предполагается, взаимодействуют с А участком рибосомы по сходному механизму, но структуры данных факторов сильно отличаются: так структура eRFl похожа по форме на букву Y, в то время как RF2 имеет «закрытую» конформацию молекулы, напоминающую по форме U (рис. 4Б). Домены 1 и 2 фактора терминации eRFl, как предполагают, ответственны за узнавание кодона и гидролиз пептида, соответственно. Из биохимических данных известно, что домен 1 фактора терминации eRFl содержит аминокислотный мотив NIKS и соответствует домену 2 фактора терминации RF2, содержащему SPF мотив. Декодирующий домен факторов eRFl и RF2 имеет сходную форму, но, несмотря на это, совершенно разное строение (рис. 4Б). С-концевой домен фактора терминации eRFl, как известно, взаимодействует с фактором терминации второго класса - eRF3 и похож по строению на домен 1 фактора терминации RF2. Строение домена 2 фактора терминации eRFl и домена 3 фактора терминации RF2 очень похоже: они оба содержат длинную а-спираль и Ji-лисг в своей структуре. При совмещении структур фактора терминации 2, полученной методом криоэлектронной микроскопии, и eRFl (рентгеноструктурные данные) видно, что домен 2, несущий универсальный GGQ мотив, фактора терминации eRFl должен быть переориентирован для того, чтобы достичь ПТЦ, подобно тому, как это случилось с доменом 3 фактора терминации RF2. Стоит отметить, что такая перестройка будет затрагивать в большей степени домен 2, а положение доменов 1 и 3 останется почти без изменений. Следовательно, можно предположить, что после взаимодействии с рибосомой факторы терминации eRFl и RF2 принимают сходную конформацию, а принцип механизма терминации одинаков у разных организмов.

Рис 1 А Структура терминационного комплекса 708 рибосомы КеоИ и фактора терминацми КР2 Полупрозрачным красным цветом показана электронная карта, фиолетовым - рибосомная РНК, зеленым — рибосомные белки, ярко-красным - фактор терминацин №2 Б Детальное изображение положения фактора терминации №2 и его доменов на рибосоме Отмечены белки 83, 85, 84, 812, 819, 810, Ь6, Ь11 и спирали 33, 95 Стрелки указывают несоответствие между электронной картой, полученной криоэлектронной микроскопией, и рентгеноструктурными данными Обозначены следующие структурные элементы 708 рибосомы 1Д1 — центральный протуберанец, Голова, Палец.

Рис. 2 А Домены 2 и 4 (оранжевые) лежат между спиралью 18 16$ рРНК и белком 812, с одной стороны, и спиралями 44 16Б рРНК и 69 235 рРНК, с другой Петля Домена 2 содержит 5РР мотив, который способен достигать декодирующего центра. Б Домен 3 (желтый) простирается от спирали 69 23Б рРНК по направлению к ПТЦ, при этом контактируя со спиралями 71, 89, 92 23в рРНК и тРНК, находящейся в Р участке

Жгаш

( ?Ь71,Ь» V. ^ Ь93, Р-1ИЖ

соя

Рис 3. Схема взаимодействия фактора терминации ИР2 с различными участками рибосомы. Красным цветом обозначен домен 1, оранжевым - супер домен 2/4, желтым - домен 3.

Рис 4. А. Наложение структур фактора терминации полученных методами криоэлеггронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа (синий цвет). Видны различия в положении домега 3 и незначительные изменения в положении домена 1. Б. Сравнение структуры факторов терминации №2 и eR.Fl (фиолетовый цвет). В. Наложение структур тРНК (зеленый цвет) и фактора терминации RF2.

Рис 5. Усредненное изображение, полученное на основе приблизителыю 10 индивидуальных изображений, в определенной ориентации и идентичная ему репроекция для структурного «состояния 1» (А и В) и «состояния 2» (Б, Г) рибосом. Кругом выделена область отличия между двумя состояниями. Обозначены положения некоторых структурных элементов 308 субчастицы рибосомы.

Рис б. Комплекс RF3 с рибосомой K.coli в «состоянии 1» (А) и в «состоянии 2» (Б) Полупрозрачным синим и красным цветом показана соответствующая рибосоме криоэлектронная плотность для «состояния 1» и «состояния 2», соответственно. Положение фактора терминации RF3 показано темно-синим («состояние 1») и ярко-красным («состояние 2») цветом. Фиолетовым цветом обозначена рибосомная РНК, зеленым - рибосомные бедки.

Рис. 7 Контакты фактора терминации ЯРЗ в «состоянии 1» (А) и в «состоянии 2» (Б) с рибосомой Стрелками указаны направления контактов, в рамках указаны спирали и белки, с которыми осуществляется контакт Спирали большой субъединицы обозначены как «Н»,

Рис. 8 Комплекс №3 с рибосомой КсоЬ в «состоянии 1» (Л) и в «состоянии 2» (Б) Полупро.!рачным синим и красным цветом показана соответствующая рибосоме электронная плотность для «состояния 1» и «состояния 2», соответственно Положение фактора терминации ЯРЗ показано темно-синим («состояние 1») и ярко-красным («состояние 2») цветом С Сопоставление изолированных электронных плотностей для двуч состояний Показано положение фактора терминации ДОЗ, тРНК и области белка 1Л

4. Структурные исследования положения фактора терминацнм RF3 на • рибосоме в составе терминационного комплекса.

Комплекс фактора терминации RF3 с рибосомой, использованный нами для определения структуры методом криоэлектронной микроскопии, был получен в лаборатории проф. Эренберга М. (Ehrenbeig M, Department of Cell and Molecular Biology, BMC, Uppsala University, Box 596, 75124 Uppsala, Sweden). Уже первая электронная карта содержала легко выявляемую электронную плотность, соответствующую фактору терминации RF3. Однако мы заметили, что некоторые регионы рибосомы размыты (особенно в районе «клюва» 30S субчастицы), что явно указывало на существование нескольких структурных состояний внутри одного образца. После трехмерной реконструкции модели комплекса нам удалось выявить два его различных структурных состояния. Они отличаются конформацией фактора терминации RF3, позицией тРНК на рибосоме и структурными изменениями внутри рибосомы (изменением позиции 30S субъединицы относительно 50S и изменением положения области белка L1). Мы обнаружили прямую зависимость между конформациоными изменениями отдельных частей рибосомы, таких как область белка L1, «клюв» 30S субчастицы, «палец» 30S субчастицы, тРНК и фактором терминации RF3. Для интерпретации электронной карты мы использовали рентгеноструктурные данные о структуре рибосомы Т. Thermophilus 70S и гомологичной RF3 части мутантной формы фактора элонгации G с упорядоченным доменом 3. При сравнении двух состояний мы обнаружили, что «состояние 1» представляет собой пре-транслокационный комплекс с тРНК в Р участке и неактивным фактором терминации RF3, расположенным вблизи ГТФазного центра рибосомы. В «состоянии 2» мы видим пост-транслокационное состояние, в котором фактор терминации RF3 тесно связан с рибосомным ГТФазным центром, а тРНК находится в Е участке рибосомы (рис. 6,7,8).

Общая черта двух состояний комплекса 70S/RF3/GDPNP - это наличие общего места связывания RF3, расположенного там же, где и место посадки факторов элонгации Ти и G на рибосоме. Сравнение электронных карт двух комплексов с контрольной картой, полученной для свободных 70S рибосом, показало, что в обоих случаях присутствует значительная электронная плотность, соответствующая RF3, в непосредственной близости от ГТФазного центра рибосомы и белка L6 (рис. 6). Она простирается до 30S субъединицы, где резко поворачивает в сторону

межсубъсдиничного пространства и далее идет в Л участок и по направлению к белку S12 (рис. 6,7).

В обоих случаях электронная плотность RF3 видна без разрывов и представляет собой единое целое от N-концевого G-домена до С-концевого. Для интерпретации полученной электронной плотности для фактора терминации RF3 мы использовали, основываясь на гомологии, рентгеноструктурные данные для фактора элонгации G (рис. 7А, 7Б).

Структурная единица, сформированная доменами 1 и 2 фактора элонгации G, несет ГТФазную активность и может быть вписана в электронную плотность очень точно. Домен 3 было необходимо повернуть относительно доменов 1 и 2 по направлению к А участку рибосомы. Оставшаяся электронная плотность точно соответствует С-концевому домену фактора терминации RF3, который имеет сходную со второй частью домена 4 EF-G (основания Pro535-Val608) аминокислотную последовательность. Домен 4 фактора терминации RF3 соответствует мотиву спираль-поворот-спираль в домене 4 фактора элонгации G и заполняет оставшуюся электронную плотность. Этот домен был повернут так, чтобы соединиться с доменом 3 фактора терминации RF3. Аминокислотная последовательность, соответствующая первой части домена 4 и домену 5 EF-G пропущена в факторе терминации RF3.

Конформации фактора терминации RF3 в двух состояниях во многом отличается (рис. 6,7). В «состоянии 1» фактор терминации RF3 имеет лишь несколько контактов с рибосомой, а именно, с «пальцем» и «плечом» 30S субчастицы, декодирующим сайтом и с кончиком спирали 44 23S рРНК (рис. 6А и 7А). Как видно из наших данных, в «состоянии 1» фактор терминации RF3 не контактирует с сарцин-рициновой петлей (SRL), главным компонентом ГТФазного центра на 50S субчастице. Более того, домены 1 и 2 фактора терминации RF3 повернуты от 50S субчастицы и располагаются у входа в межсубъединичное пространство. Единственным контактом для доменов 1 и 2 с рибосомой является контакт с «пальцем» 30S субчастицы. Возможно, что он является промежуточным при посадке фактора терминации RF3 на рибосому. Домен 3 фактора терминации RF3 контактирует с малой субъединицей рибосомы на уровне спиралей 16 и 17. В межсубъедииичном пространстве фактор терминации показывает хороший контакт с белком S12, далее электронная плотность простирается около спирали 44 16S рРНК и достигает кончика спирали 69 23S рРНК.

В отличие от «состояния 1» в «состоянии 2» фактор терминации RF3 (рис. 6Б, 7Б) тесно связан с рибосомой, и его G-домен направлен в сторону ГТФазного центра рибосомы: ГТФ-карман G-домена фактора терминации RF3 смотрит в сторону SRL. Контакт С-концевой части белка L6 с фактором терминации осуществляется через G'-домен, являющийся консервативным для факторов элонгации G и терминации RF3. Возможно, через него происходит «заякоривание» доменов 1 и 2 вблизи ГТФазного центра рибосомы. Домен 2 имеет контакт со средней частью спирали 17 16S рРНК, домен 3-е областью вокруг спиралей 16 и 17 16S рРНК. Несколько контактов было обнаружено с областью А участка: так, домен 3 контактирует с SRL на 50S субчастице и с белком S12 на 30S. Кончик спирали 5 16S рРНК касается RF3 между доменами 2 и 3. Следует отметить высокую электронную плотность, соответствующую С-концевому домену, достигающую кончика спирали 69 23 S рРНК и соединяющую спирали 69, 89 и 38 (А-сайтовый палец).

В процессе перехода из одного состояния фактора терминации RF3 в другое осуществляется два основных типа перестроек в структуре 30S субъединицы. Во-первых - это поворот 30S субчастицы относительно 50S субчастицы примерно на 6 градусов. Центр вращения лежит в пределах спиралей 67 и 71 23S рРНК (межсубъединичные контакты В2 и ВЗ, соответственно). Большинство контактов между субъединицами сохраняются, хотя и слегка смещаются. Во-вгорьгх - перестройка нескольких областей, таких как, «клюв» и «палец» 30S субчастицы и район белка L1 (рис. 6 и 8). В «состоянии 2» «клюв» сдвигается против движения 30S субчастицы и, таким образом, приближается к белку S3, в результате чего увеличивается расстояние между «головой» и «плечом» 30S субчастицы. В «состоянии 1» область белка L1 направлена от рибосомы (рис. 8), в то время как в «состоянии 2» данная область смещена в сторону межсубъединичного пространства, что позволяет стабилизировать положение TPJ IK в Е участке.

Конформационные изменения рибосомы между состояниями 1 и 2, которые индуцируются фактором терминации RF3, сходны с пре- и пост-транслокационными состояниями для фактора элонгации G. Однако, в отличие от EF-G, который индуцирует транслокацию тРНК изАиРвРиЕ участки, соответственно, фактор терминации RF3 вызывает диссоциацию факторов терминации первого класса из А участка и индуцирует транслокацию тРНК из Р в Е участок (рис. 8). Конформационные изменения, начинающиеся с изменения в G-домене фактора терминации RF3, по-

Рнс. 9. Сопоставление положения фактора терминации RF2 с положением фактора терминации RF3 в«состоянии 1».

На электронной карте обозначены области клюва (Beak), спирали 17 16S рРНК (Ь17), белка L11, красным цветом показан фактор терминации RF2, фиолетовым цветом - область RF3

видимому, приводят к перестройке в домене 3 с последующим изменением в домене 4, что, в свою очередь, приводит к сдвигу спирали 69 23 8 рРНК в Р участок, в котором отсутствует тРНК (рис. 8) Поскольку спираль 69 близка к центру вращения 308 субъединицы, она может играть ключевую роль в структурной перестройке всей рибосомы.

Расположение факторов тсрминации первого класса на рибосоме в пост-терминационном комплексе, являющимся субстратом для фактора терминации ЕР3, известно из предыдущих опытов, что позволяет наложить друг на друга две карты электронной плотности. В «состоянии 1» фактор терминации №3 оставляет место для связывания фактора терминации ИБ2 (рис. 9).

Небольшое перекрывание электронных плотностей наблюдается лишь в области доменов 2/4 ИБ2 и месте контакта домена 4 ЕР3 со спиралью 44 168 рРНК. Напротив, в «состоянии 2» фактор терминации КР3 не оставляет места для связывания фактора терминации ЕР2, так как №3 занимает область доменов 2/4, а так же частично перекрывается с доменами 1 и 3 фактора терминации ИБ2. В «состоянии 1» форма и позиция факторов терминации первого и второго классов комплементарны друг другу, что позволяет предположить существование прямого взаимодействия между ними

Как видно из реконструкции, С-концевая часть домена 3 фактора терминации ИБ3 находится близко к домену 1 фактора терминации ИБ2, а домен 4 фактора терминации ЕР3, возможно, взаимодействует с доменом 2/4 фактора терминации №2 (рис 9)

Эта модель соответствует биохимическим данным, показывающим, что домен 1 RF2 необходим для взаимодействия с RF3. Интересно заметить, что взаимодействие С-концевых доменов факторов терминации первою и второго класса эукариот осуществляется подобным же образом, что позволяет утверждать, что С-концевой домен эукариогического фактора терминации eRFl эквивалентен N-концевой части прокариотического фактора терминации RF2. Диссоциация факторов терминации первого класса, по-видимому, индуцируется переходом факторов терминации второго класса из «состояния 1» в «состояние 2». Данный переход сопровождается перемещением доменов 3 и 4 в ответ на изменение положения доменов 1 и 2 (рис. 7).

Таким образом, в нашей работе методом криоэлектронной микроскопии удалось исследовать важные функциональные комплексы, которые не могут быть изучены методом рентгеноструктурного анализа. Полученные результаты приближают нас к пониманию сложных процессов, происходящих внутри клетки с участием рибосом.

Выводы

1. Анализ структур 50S субъединиц рибосом E.coli, несущих мутации в спиралях 89 и 42, методом криоэлектронной микроскопии с разрешением 10 А не позволяет выявить в них отличий от рибосом дикого типа.

2. Методом криоэлектронной микроскопии локализован белок FfhM на рибосоме в области белка L23.

3. При взаимодействии с рибосомой в процессе терминации отдельные домены фактора терминации RF2 располагаются вблизи декодирующего и пептидил-трансферазного центров.

4. Комплекс RF3 с рибосомой может существовать в двух состояниях; переход из первого во второе, по-видимому, индуцирует диссоциацию RF2.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Список работ опубликованных по теме диссертации

Avdeeva О. N., Myasnikov A. G., Seigiev Р. V., Bogdanov A. A., Brimacombe R., and Dontsova О. А (2002) Construction ofthe 'minimal' SRP that interacts with the translating ribosome but not with specific membrane receptors in Escherichia coli. FEBSLett 514,70-3.

Klaholz В. Р., Раре Т., Myasnikov A. G., Zavialov A. V., Orlova E., Ehrenberg M. and van Heel M. Release factor-ribosome interactions revealed by combination of cryo-electron microscopy and crystallography. Ada. Cryst. (2002). A58 (Supplement), C7.

A. G. Myasnikov, B. P. Klaholz and M. van Heel Localisation of release factor 3 on the ribosome by cryo-electron microscopy. Ada Cryst. (2002). A58 (Supplement), С172.

Klaholz, В. Р., Раре, Т., Zavialov, A. V., Myasnikov, A. G., Orlova, E. V., Vestergaard, В., Ehrenberg, M., and Van Heel, M. (2003) Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90-4.

Avdeeva O. N., Myasnikov A. G., Sergiev P. V., Bogdanov A. A., Brimacombe R., and Dontsova O. A. (2001) Study of interaction between SRP and the Ribosome of E.Coli. Protein Synthesis, International Conference in honour of Alexander Spirin, August 27 - September 1,2001, p. 55

Myasnikov A. G., Klaholz B. P. and van Heel M. (2002) Localization ofrelease factor3 on the ribosome by cryo-electron microscopy. XIX ШСг Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography, Geneva, Switzerland, August 6-15,2002, C172.

Klaholz В. Р., Раре Т., Zavialov A. V., Myasnikov A. G., Gross L, Matadeen R., Ehrenberg M., van Heel M.. Localization of release factor RF2 in an E. coli ribosomal termination complex by cryo electron microscopy. International Conference on Protein Synthesis in Honor of Alexander Spirin 2001, Institute of Protein Research, Pushchino, Moscow Region, Russia, p.69.

ООП МГУ. Заказ 10. Тираж 100

Р ' 17 55

РЫБ Русский фонд

2004-4 25062

1 Содержание

2 Список сокращений

3 Введение

4 Криоэлектронная микроскопия «одной частицы» в исследовании структуры макромолекул

4.1 Метод криоэлектронной микроскопии «одной частицы» и его перспективы

4.1.1 . Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы»

4.1.2. Суть метода крио-ЭМ «одной частицы»

4.1.3. Микроскопы, различия и особенности

4.1.4. Оценка качества полученных микрофотографий

4.1.5. Выбор частиц

4.1.6. Коррекция частотно-контрастной характеристики

4.1.7. Выравнивание частиц (Alignment)

4.1.7.1. Выравнивание частиц без использования образца

4.1.7.2. Выравнивание с использованием репроекций, полученных на базе известной трехмерной реконструкции

4.1.8. Множественный статистический анализ 26 4.1.8.1. Сжатие данных и их классификация после выравнивания частиц.

4.1.9. Определение углов и построение трехмерной модели

4.1.10. Интерпретация данных крио-ЭМ путем сравнения с данными рентгеноструктурного анализа

4.1.11. К вопросу о разрешении в методе крио-ЭМ

4.1.12. Ограничения метода и способы их преодоления 37 4.2. Применение крио-ЭМ в исследовании структуры рибосом и рибосомных комплексов

4.2.1. Инициация трансляции

4.2.2. Элонгация трансляции

4.2.3. Терминация трансляции

4.2.3.1. Декодирование стоп сигнала и высвобождение (путем активации гидролиза) растущего полипептида с пептидил-тРНК в Р участке

4.2.3.2. Фактор терминации второго класса вызывает высвобождение факторов терминации первого класса

5. Исследование различных функциональных комплексов рибосом методом криоэлектронной микроскопии 59 (Результаты и обсуждения)

5.1. Изучение структурных перестроек в мутантных 50S субчастицах рибосом

E.coli

5.2. Изучение структуры комплекса белка FfhM с рибосомой

5.3. Изучение структуры комплекса фактора терминации RF2 с рибосомой

5.4. Изучение структуры комплекса фактора терминации RF3 с рибосомой

6. Материалы и методы

Выделение комплекса FfhM-рибосома методом аффинной хроматографии

7. Выводы

Прорывы в той или другой области знаний часто связаны с созданием принципиально новых методов исследования. Одним из ярких примеров является электронная микроскопия, оказывающая большое влияние на развитие химии и биологии. Человек всегда хотел быть богом, он хотел творить и создавать, а как можно что-либо создавать, не познав, как оно устроено?! Поэтому современная наука старается понять строение всего живого, понять, как все организовано и из чего состоит. Мы все дальше и дальше проникаем в суть процессов, которые идут в клетке элементарной единице всего живого. Мы уже знаем многое о строении клетки и клеточных органелл, и кажется, что осталось дело за малым понять, как же устроены отдельные молекулы внутри клетки, а узнав их строение, попробовать понять, как эти сложные молекулярные ансамбли работают вместе. В данной работе показаны возможности одного из современных методов исследования структуры макромолекул криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения структуры и функции макромолекул на примере рибонуклеопротеидного комплекса рибосомы. Большая часть обзора литературы посвящена описанию этого метода. Прокариотическая рибосома, седиментирующая как 70S частица, состоит из двух субъединиц большой, с коэффициентом седиментации 50S, и малой, с коэффициентом седиментации 30S. Каждая из субъединиц на 60% (по массе) состоит из РНК. Малая содержит декодирующий центр, координирующий правильные взаимодействия между матричной РНК (мРНК) и транспортной РНК (тРНК), что определяет аминокислотную последовательность синтезируемого на рибосоме белка. Большая субъединица катализирует образование пептидной связи. Рибосома была открьгга в 50-х годах, и тогда никого не удивило, что помимо РНК она содержит еще и белки. Поскольку она катализирует биосинтез белка, а ферменты являются белками, то все было ясно роль рибосомных белков заключается в катализе образования пептидной связи. Представления о роли и функции рибосомной РНК (рРНК) и белков были, по мере накопления биохимических данных, пересмотрены. После установления структуры рибосомы и ее субчастиц с атомным разрешением стало понятно, что рибосома является рибозимом, в то время как белки помогают поддерживать компактную структуру рРНК. Тем не менее, знания структуры рибосомы явно не достаточно для понимания механизма трансляции. Дело в том, что процесс синтеза белка многостадиен, причем в каждую стадию вовлечены определенные белковые факторы. Как же работают эти факторы, как они взаимодействуют между собой!? Получить ответ на этот вопрос с помощью рентгеноструктурного анализа (PCА) в большинстве случаев не удается. В то же время криоэлектронная микроскопия формирует отдельное направление в изучении молекулярных ансамблей биологических молекул, которые часто бывают либо слишком велики, либо слишком лабильны для иззения их методом РСА. Важно, что крио-ЭМ позволяет характеризовать перестройки в макромолекулярных комплексах и таким образом изучать динамику биологических процессов. Примеры таких исследований для рибосомных комплексов рассматриваются в обзоре литературы и этому посвящена диссертационная работа.Криоэлектронная микроскопия «одной частицы» в исследовании структуры макромолекул 4.1 Метод криоэлектронной микроскопии «одной частицы» и его перспективы Все больше и больше структур белков решается методом рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Использование баз данных позволяет определять структурно-функциональные домены в белке, что в свою очередь ведет к возможности связать структуру белка с его функцией. В то же время внимание ученых сейчас смещается в область изучения взаимодействия макромолекул внутри клетки. Представляется важным и интересным отследить образование комплекса макромолекул, взаимодействие компонентов комплекса, определить места посадки лигандов, для чего приходится привлекать новые подходы. Рентгеноструктурный анализ мощный метод определения трехмерной структуры отдельных белков имеет ряд ограничений, когда мы переходим к изучению крупных макромолекулярных комплексов: 1. Зачастую крупный комплекс не удается Зсжристаллизовать вовсе, или это удается сделать только после того, как из него удалены наиболее конформационно лабильные компоненты; 2. Условия кристаллизации чаще всего далеки от таковых в клетке, что может вызвать перестройку всего комплекса или отдельных его компонентов; 3. Чем больше комплекс, тем больше нужно данных, для того чтобы точно описать трехмерную структуру. Кроме того, в кристаллографии приходится преодолевать также фазовую проблему. Информация о строении кристалла при рентгеноструктурном анализе представлена в виде дифракционной картины. Молекула белка упакована в кристаллической решетке определенным образом и чтобы определить от какой части молекулы происходит тот или иной рефлекс (сигнал) приходится применять сложные вычисления или вводить в строго определенные места молекулы тяжелоатомные производные. Криоэлектронная микроскопия «одной частицы» не имеет этих ограничений. Данный метод позволяет изучать молекулы без получения кристаллов. Исследование комплексов проводят в условиях, приближенных к существующим в клетке. Крио-ЭМ дает возможность изучить различные функциональные состояния комплекса. Проблема криоэлектронной пространственном микроскопии разрешении. «одной Однако частицы» здесь на это ограничение в помощь приходит рентгеноструктурный анализ. Часто трехмерная структура отдельных компонентов комплекса или молекул, им гомологичных, оказывается известной. В этом случае в карту электронной плотности «низкого разрешения» вписьшают данные рентгеноструктурного анализа, что позволяет предсказать точки взаимодействий между компонентами комплекса. Часто для того чтобы быгь уверенными в своих предположениях, комплексы получают в системах in vitro, что, конечно же, уводит нас от внутриклеточных условий. Однако во многих случаях удается показать, что такие комплексы очень близки по своим свойствам к комплексам, существующим в клетке [см. например [1]]. 4.1.1. Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы» Как особый метод крио-ЭМ используется уже в течение 20 лет [[2]; [3]]. Сам же метод был изобретен около 40 лет назад Тэйлором и Глайсером (Taylor Glaeser). Изначально крио-ЭМ использовали только для изучения высоко упорядоченных образцов, таких, как скрученные белковые волокна (актин), двумерные кристаллы (например, кристаллы с одним или двумя липидными слоями), и высоко симметричньгх структур, таких, как вирусы. Только образцы такого рода позволяли получать результаты с хорошим разрешением. Хотя при исследовании вышеперечисленных объектов были достигнуты большие успехи, для белков с нормальными размерами рентгеноструктурный анализ был предпочтительней. При исследовании двумерных кристаллов метод крио-ЭМ столкнулся с непреодолимыми трудностями, такими как -нарушения в структуре двумерных кристаллов и проблемы при использованием больших углов ячейки, используемой в криоэлектронной микроскопии в так называемой «серии углов» (tilt series). Наиболее перспективным для изучения методом крио-ЭМ оказались мембранные белки, но, к сожалению, лишь в нескольких работах удалось достичь атомарного разрешения. Для высокомолекулярных комплексов ф одинаково трудным оказалось получение как двумерных (пригодных для крио-ЭМ так и трехмерных (пригодных для РСА) кристаллов. Все попытки разрешить структуру рибосом, используя микроскопию двумерных кристаллов [[4], [5]], провалились из-за плохой упорядоченности кристаллов. Потенциально более широкая область применения крио-ЭМ бьша создана после разработки так назьшаемого метода реконструкции «одной частицы», для использования которого нужно иметь много копий одной молекулы. Этот метод [[6], Р [7], [8], [9]] и его предшественник [[10] [И], [12], [13], [14], [15], [16]] были разработаны изначально для образцов, приготовленных методом негативного контрастирования, но успех метода был ограничен артефактными включениями в процессе приготовления образца. При негативном контрастировании, которое использовалось до изобретения крио-ЭМ, водный образец смешивали с 1-2% раствором соли тяжелого металла и высушивали на воздухе. На микроскопической ячейке молекулы, приготовленные таким образом, были хорошо видны, а ионы тяжелого металла повышали контраст на электронной микрофотографии.Кнопка остановки u; Металлический стержень Направляющее кольцо щш, Т| Пинцет Крио-ячейка Пенопласт Рис. 1. А. Общая схема плунжерного устройства для быстрой заморозки образца. Б. Общий вид плунжерного устройства. В, Г. Мгновенная заморозка образца. Однако, кроме того, что при этом нельзя было увидеть разницу в электронной плотности внутри молекулы, негативное контрастирование вело и к изменению формы молекулы. В современном варианте метод предполагает быстрое охлаждение образца в жидком этане (рис. 1): Образец, нанесенный на ячейку для крио-ЭМ, висящую на самом кончике пинцета, быстро помещают в жидкий этан, находящийся при температуре жидкого азота (рис. 1). Этан обладает высокой теплопроводностью, поэтому образец замерзает мгновенно, благодаря чему образуется аморфный лед, 10 который обладает некоторыми общими оптическими свойствами с жидкой водой. Важно, что при этом не образуются кристаллы льда, которые могли бы повредить молекулу. Прогресс, достигнутый слиянием двух методов, крионегативного контрастирования и криоэлектронной микроскопии «одной частицы», может быть оценен при сравнении карт электронной плотности 70S рибосом E.coli, полученных методами негативного контрастирования и крио-ЭМ «одной частицы» [[17]]. В первом случее структура получилась рыхлой, без четкого межсубъединичного пространства; тогда как во втором глобулярная и с четким

1. Dubochet, J., et al., Cryo-electron microscopy of vitrified biological Trends Biochem. Sci., 1985.10: p. 143-

2. Lepault, J., F.P. Booy, and J. Dubochet, Electron microscopy of frozen suspensions. J Microsc, 1983.129 Pt 1: p. 89-102. specimens. biological Milligan, R.A. and P.N.T. Unwin, Location of exit channel for nascent protein in SOS ribosome. Nature (London), 1986. 319(6055): p. 693-

3. Yonath, A., K.R. Leonard, and H.G. Wittmann, A tunnel in the large ribosomal subunit revealed by three-dimensional image reconstruction. Science, 1987. 236(4803): p. 813-6. 6.

4. Radermacher, M., et al., A new 3-D reconstruction scheme applied to the SOS ribosomal subunit ofE. coli. J Microsc, 1986. 141 Pt 1): p. RPl-

5. Radermacher, M., et al.. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the SOS ribosomal subunit of Escherichia coli. J Microsc, 1987.146 Pt 2): p. 113-36. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

6. Radermacher, M., et al.. Three-dimensional structure of the large ribosomal subunit from Escherichia coli. Embo J, 1987. 6(4): p. 1107-14. Van Heel, M., Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy, 1987. 21(2): p. 111-

7. Frank, J., Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects. Ultramicroscopy, 1975.1(2): p. 159-

8. Frank, J., et al., Reconstruction of glutamine synthetase using computer averaging. Ultramicroscopy, 1978. 3(3): p. 283-

9. Frank, J., A. Verschoor, and M. Boublik, Computer averaging of electron micrographs of 40S ribosomal subunits. Science, 1981. 214(4527): p. 1353-5. van Heel, M. and J. Frank, Use of multivariate statistics in analysing the images of biological macromolecules. Ultramicroscopy, 1981. 6(2): p. 187-

10. Verschoor, A., et al., Three-dimensional reconstruction of the 30 S ribosomal subunit from randomly oriented particle %W IBMs. J. Mol. Biol., 1984. 178(3): p. 677-

11. Boublik, M., et al.. Structure of ribosomes and their components by advanced techniques of electron microscopy and computer image analysis. Struct., Funct., Genet. Ribosomes, ["Ribosome Conf."], Meeting Date, 1985.

12. Frank, J., et al.. New strategies for determining ribosomal subunit structure from electron micrographs by single particle. Biophys. J., 1986. 49(1): p. 9-11. 95

13. Wagenknecht, Т., et al., Three-dimensional reconstruction Escherichia coli. Biophys J, 1989. 55(3): p. 455-

14. Boisset, N., et al.. Three-dimensional 16-29. reconstruction of the ribosome from of Androctonus australis hemocyanin labeled with a monoclonal Fab fragment. J Struct Biol, 1995. 115(1): p. 19. 20. 21. 22. 23.

15. Frank, J., et al.. Three-dimensional cryoelectron microscopy of ribosomes. RNA Ligand Interactions Pt A Structural Biology Methods, 2000. 317: p. 276-

16. Orlova, E.V., Structural analysis of non-crystalline macromolecules: the ribosome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56.( Pt 10): p. 1253-

17. Saibil, H.R., Macromolecular structure determination by cryo-electron Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56 P t 10): p. 1215-

18. Unwin, P.N. and R. Henderson, Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J Mol Biol, 1975. 94(3): p. 425-

19. Chiu, W., et al., Cryo-protection in electron microscopy. J. Mi-crosc, 1986. 141: p. 385-

20. Agrawal, R.K., et al., EF-G-dependent Biol, 1999. 6(7): p. 643-647. 25.

21. Frank, J. and R.K. Agrawal, A ratchet-like inter-subunit reorganization ribosome during translocation. Nature, 2000. 406: p. 318-

22. Kandror, O., et a l Trigger factor is involved in GroEL-dependent protein degradation in Escherichia coli and promotes binding of GroEL to unfolded proteins. Embo J, 1995.14(23): p. 6021-7. 27. 28. 29.

23. Rouiller, L, et al., A major conformational change in p97 AAA ATPase upon ATP binding. Mol Cell, 2000. 6(6): p. 1485-

24. Zhang, X., et al., Structure of the AAA ATPase p97. Mol Cell, 2000. 6(6): p. 1473-

25. Borland, L. and M. van Heel, Classification of image data in conjugate representation spaces. J. Opt. Soc. Am, 1990. A7: p. 601-

26. Frank, J., Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies, in Three-dimensional electron microscopy of macromolecular a5.semW/e.s. 1996: New York. 31. 32. 33. 34. 35. van Heel, M., Classification of very large electron microscopial image data sets. Optik, 1989.82:p. 114-

27. Frank, J.a.W., Т., Automatic selection of molecular images from electron micrographs. Ultramicroscopic, 1984. 12: p. 169-

28. Lata, K. and P.a.F. Penczek, J. Automatic particle picking from electron micrographs, m Proceedings of the 52nd Annual Meeting MSA (New Orleans). 1994. San Francisco: San Francisco Press. 40. 41. 42.

29. Borland, L.a.v.H., M, Classification of image data in conjugate representation spaces. J.Opt.Soc.Am., 1990. A7: p. 601-

30. Ward, J.J., Hierarchical grouping to optimize an objective function. Am. Statist. Assoc, 1982. 58: p. 236-

31. Radermacher, M., et al., A new 3-D reconstruction scheme applied to the 50S ribosomalsubunit ofE.coli. J Microsc, 1986. 141: p. RPl-

32. Crowther, R.A., Procedures for three-dimensional reconstruction of spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci, 1971. 261(837): p. 221-30.

33. Penczek, P.A., J. Zhu, and J. Frank, A common-lines based method for orientations for N>3 particle projections simultaneously. 63(3-4): p. 205-218. 45. 46. 47. DeRosier, D.J.a.K., A., Reconstruction of three-dimensional structures from electron micrographs. Nature, 1968. 217: p. 130-

34. Goncharov, A.a.G., MS, Determitation ofmutaual orientation of indentical particles from their projections by the moments method. Ultramicroscopy, 1988. 25: p. 317-

35. Harauz, G. and F. Ottensmeyer, Direct 309-320.

36. Penczek, P.A., R.A. Grassucci, and J. Frank, The Ribosome at Improved Resolution New Techniques for Merging and Orientation Refinement in 3D 49.

37. Cryo-Electron biological Microscopy of Biological Particles. Ultramicroscopy, 1994. 53(3): p. 251-

38. Hoppe, W., et al.. Three-dimensional electron microscopy of individual objects. I. Methods. Z. Natur-forsch, 1976. A31: p. 645-

39. Radermacher, reconstruction 51. M., et al., Cryo-electron microscopy and three-dimensional skeletal of the calcium release channel/ryanodine receptor from three-dimensional reconstruction for macromolecular complexes from electron micrographs. Ultramicroscopy, 1984. 12: p. determining Ultramicroscopy, 1996. muscle. J Cell Biol, 1994.127(2): p. 411-

40. Stewart, P.L., S.D. Fuller, and R.M. Burnett, Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. Embo J, 1993.12(7): p. 2589-99. 97

41. Rossmann, M.G., Fitting atomic models into electron-microscopy Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56 Pt 10): p. 1341-9. maps. Acta Rayment, I., et al.. Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science, 1993. 261(5117): p. 58-

42. Agrawal, R., et al.. Visualization of elongation factor G on The Escherichia coli 70S ribosome: The mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 95: p. 6134-6138. 55. 56. 57. 58.

43. Gabashvili, I.S., et al.. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 angstrom resolution. Cell, 2000. 100(5): p. 537-

44. Stark, H., et al.. Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal Ul small nuclear ribonucleoproteinparticle. Nature, 2001. 409(6819): p. 539-

45. Saibil, H., Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Curr Opin Struct Biol, 2000. 10(2): p. 251-8. van Heel, M. and H. G, Resolution criteria for three-dimensional Optik, 1986. 73: p. 119-

46. Bottcher, В., S.A. Wynne, and R.A. Crowther, Determination of the fold of the core protein of hepatitis В virus by electron cryomicroscopy. Nature, 1997. 386(6620): p. 88-91. reconstruction.

47. Malhotra, A., et al., E. coli JOS ribosome at 15 E resolution by 280: p. 103-116. cryo-electron microscopy: Localization offMet-tRNAJ and fitting of LI protein. J Mol Biol, 1998.

48. Orlova, E.V., et al.. Structure of keyhole limpet hemocyanin type I (KLHl) at 15 A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution. J Mol Biol, 1997. 271(3): p. 417-37.

49. Rosenthal, P.a.H.R., Optimal Determination of Particle Orientation, Absolute Hand, and Contras Loss in Single-particle Electron Cryomicroscopy. J.Mol.Biol., 2003. 333: p. 721-745. 63. 64. De Rosier, D.J., Electron cryomicroscopy. Who needs crystals anyway? Nature, 1997. 386(6620): p. 26-

50. Bremer, H. and P.P. Dermis, Modulation of chemical composition parameters of the cell by growth rate, in Escherichia 65. 66. and other coli and Salmonella, F.C. Neidhardt, et al., Editors. 1996, ASM Press: Washington D.C. p. 1553-1

51. Bouadloun, P., D. Dormer, and C.G. Kurland, Codon-specific missense errors in vivo. EMBO J., 1983. 2: p. 1351-1

52. Frank, J., et al.. Three dimensional reconstruction of the 70S Escherichia 597-605.

53. Frank, J., et al., A Model of Protein Synthesis Based On Cryo-Electron Microscopy of the E-Coli Ribosome. Nature., 1995.376(6539): p. 441-444. coli ribosome in ice The distribution of ribosomal RNA. J. Cell Biol., 1991. 115(3): p. 98

54. Stark, Н., et al., The 70S Echerichia coli ribosome at 23 E resolution: Fitting the ribosomal RNA. Structure, 1995. 3: p. 815-

55. Mueller, F. and R. Brimacombe, A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. II. The RNA-protein data. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 566-587.

56. Mueller, F. and R. Brimacombe, A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli I6S ribosomal RNA. L Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20. 1997.

57. Mueller, F. and R, Brimacombe, A New Model for the Three-dimensional Folding of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA. П. The RNA-Protein Interaction Data. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 545-565.

58. Mueller, F., et al., A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. III. The topography of the functional centre. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 566-587.

60. Ban, N., et al.. Placement of protein and RNA structures into a 5 E -resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature, 1999. 400: p. 841-

61. Matadeen, R., et al.. The Escherichia coli large ribosomal subunit at 7.5 A resolution. Structure with Folding Design, 1999. 7: p. 1575-1

62. Valle, M., et al.. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryoelectron microscopy. Nat Struct Biol, 2003.10(11): p. 899-906. McCutcheon, J.P., et al.. Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. 96(8): p. 4301-4

63. Pioletti, M., et al.. Crystal structures of complexes of the small ribosomal subunit with tetracycline, edeine andIF3. EMBO J., 2001. 20(8): p. 1829-1

64. Potapov, A.P., A sterospecific mechanism for the aminoacyl-tRNA selection at the ribosome. FEBS Lett., 1982.146: p. 28-

65. Bourne, H.R., D.A. Sanders, and F. McCormick, The GTPase superfamily: conserverd structure and molecular mechanism. Nature, 1991. 349: p. 117-

66. Zavialov, A.V. and M. Ehrenberg, Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translational factors. Cell, 2003.114: p. 113-

67. Nissen, P., et al., The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science, 2000. 289(5481): p. 920-

68. Aevarsson, A., et al.. Three-dimensional structure of the ribosomal 3677. 99 translocase: Elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBO J., 1994. 13(16): p. 3669-

69. Czworkowski, J., et al.. The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7Eresolution. 123-

70. Fraser, СМ., et al., The minimal gene complement of Mycoplasma Science, 1995. 270: p. 397-

71. Hutchison, C.A., et al., Global transposon mutagenesis and a minimal genome. Science, 1999. 286(5447): p. 2165-2

72. Inamine, J.M., et al.. Evidence that UGA is read as tryptophan rather than stop by Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma gallisepticum. J. Bacteriol., 1990. 172: p. 504-

73. Mycoplasma genitalium. EMBO J., 1994. 13: p. 3661-3

74. Valle, M., et al., Locking and Unlocking of Ribosomal Motions. Cell, 2003. 114: p. 90.

75. Osawa, S. and Т.Н. Jukes, On codon reassignment. J Mol Evol, 1995. 41(2): p. 247249. OSullivan, J.M., J.B. Davenport, and M.F. Tuite, Codon reassignment 2001. 17(1): p. 20-2. and the evolving genetic code: problems and pitfalls in post-genome analysis. Trends Genet,

76. Pel, H.J., et al.. The yeast nuclear gene MRFl encodes a mitochondrial peptide chain release factor and cures several mitochondrial RNA splicing defects. Nucleic Acids Res, 1992. 20: p. 6339-6346. 93. 94. 95. 96.

77. Caskey, Т., et al.. Peptide chain termination, codon, protein factor, and ribosomal requirements, in Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. p. 479-

78. Scolnick, E., et al.. Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Nat. Acad. Sci., USA., 1968. 61: p. 768-

79. Caskey, СТ., et al.. Cloning of the Escherichia coli release factor Bacterid., 1984.158(1): p. 365-

80. Weiss, R.B., J.P. Murphy, and J.A. Gallant, Genetic screen for cloned release factor genes. J. Bacteriol., 1984.158(1): p. 362-

81. Pel, H.J., M. Rep, and L.A. Grivell, Sequence Comparison of New Prokaryotic and Mitochondrial Members of the Polypeptide Chain Release Factor Family Predicts a 5-Domain Model for Release Factor Structure. Nucleic Acids Res, 1992. 20: p. 44234428.

82. Ito, K., et al., Conserved motifs in prokaryotic and eukaryotic polypeptide p. 5443-5448. 99.

83. Vestergaard, В., et al.. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol. Cell, 2001. 8(6): p. 1375-1

84. Moffat, J.G., et al.. Functional Domains in the Escherichia coli Release Factors Activities of Hybrids Between RF-1 and RF-2. Eur. J. Biochem., 1993. 213: p. 749756. release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93(11): 2 gene. J. 100

85. Klaholz, B.P., et al., Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor

87. Rawat, U.B., et al., A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound factor RF

89. Beaudet, A.L. and C.T. Caskey, Mammalian peptide chain termination, II. Codon specificity and GTPase activity of RF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971. 68: p. 619624. termination 105. 106. 107. 108.

90. Caskey, СТ., A.L. Beaudet, nd W.PvTate, Mammalian release factor: in vitro assay and purification. Methods Enzymol., 1974. 30: p. 293-

91. Konecki, D.S., et al.. Characterization of reticulocyte release factor. J. Biol. Chem., 1977. 252: p. 4514-4

92. Frolova, L., et al., A highly conserved eukaryotic protein family possessing of polypeptide chain release factor. Nature, 1994. 372: p. 701-

93. Bult, С J., et al.. Complete genome sequence of the methanogenic Methanococcusjannaschii. Smith, D.R., et al.. thermoautotrophicum Science, 1996. 273(5278): p. 1058-1

94. Complete genome sequence of Methanobacterium J. analysis and comparative genomics. archaeon, properties deltaH: functional Bacterid., 1997.179(22): p. 7135-55. 110.

95. Klenk, H.P., et al.. The complete genome sequence of the hyper thermophilic, sulphatereducing archaeon Archaeoglobus fulgidus. Nature, 1997. 390(6658): p. 364-

96. Dontsova, M., et al., Translation termination factor 472(2-3): p. 213-216.

97. Frolova, L., et al.. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish the ability of human eRFl to trigger peptidyl-tRNA RNA, 1999. 5: p. 1014-1020.

98. Song, H., et al., The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl Mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell, 2000. 100: p. 311-321. 114.

99. Bertram, G., et al.. Terminating eukaryote translation: domain I of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA, 2000. 6(9): p. 1236-

100. Tate, W., B. Greuer, and R. Brimacombe, Codon Recognition in Polypeptide Release Factor-

101. Nucleic Acids Res., 1990.18: p. 6537-6544.

102. Brown, C M and W.P. Tate, Direct recognition ofmRNA stop signals by Escherichia coli polypeptide chain release factor two. J Biol Chem, 1994. 269: p. 33164-33

103. Chain Termination Site Directed Crosslinking of Termination Codon to Escherichia coli hydrolysis. aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBS Lett., 2000. 101

104. Poole, E., et al., Translational termination in Escherichia coli: three bases following the stop codon crossling to release factor 2 and affect the decoding efficiency containing signals. Nucleic Acids Res., 1998. 26: p. 954-960.

105. Ito, K., M. Uno, and Y. Nakamura, Single amino acid substitution in prokaryote polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three stop codons. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(14): p. 8165-9. 120. 121.

106. Ito, K., M. Uno, and Y. Nakamura, A tripeptide anticodon deciphers stop codons in messenger RNA. Nature, 2000. 403(6770): p. 680-

107. Nakamura, Y., K. Ito, and M. Ehrenberg, Mimicry grasps reality in translation termination. Cell, 2000. 101(4): p. 349-

108. Wilson, D.N., et al.. Factor-mediated termination of protein synthesis: a welcome return to the mainstream of translation, Washington, DC. p. 495-508.

109. Pel, H.J., et al., Single Point Mutations in Domain-II of the Yeast 5308-5315. 124.

110. Askarian-Amiri, M.E., et al.. Functional characterization release factor 1. J Biol Chem, 2000. 275(23): p. 17241-

111. Wilson, D.N., et al., Protein synthesis Pept. Sci.,2002.3(l):p. 1-53. 126. 127.

112. Ogle, J.M., et al., Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science, 2001. 292(5518): p. 897-

113. Carter, A.P., et al., Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature, 2000. 407(6802): p. 340-

114. Fourmy, D., S. Yoshizawa, and J.D. Puglisi, Paromomycin binding induces a local conformational change in the A-Site ofl6SrRNA. 345. 129.

115. Fourmy, D., et al., Structure of the A-site of E. coli 16S ribosomal RNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science, 1996. 274: p. 1367-1

116. Lodmell, J.S. and A.E. Dahlberg, A Conformational Switch in Escherichia coli 16S Ribosomal RNA During Decoding of Messenger RNA. Science, 1997. 277: p. 12621267.

117. Inagaki, Y. and W.F. Doolittle, Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res, 2001. 29(4): p. 921-

118. Lozupone, C.A., R.D. Knight, and L.F. Landweber, The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol, 2001. 11(2): p. 65-

119. Velichutina, I.V., et al., Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces p. 1174-1184. cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome. RNA, 2000. 6(8):

120. Uno, M., K. Ito, and Y. Nakamura, Functional specificity of amino acid at position 246 in the tRNA mimicry domain of bacterial release factor

121. Biochimie, 1996. 78(11-12): p. 935-943.

122. Wilson, D.N., D. Guevremont, and W.P. Tate, The ribosomal binding and peptidyltRNA hydrolysis functions of Escherichia coli release factor 2 are linked through residue 246. RNA, 2000. 6(12): p. 1704-1713.

123. Dincbas-Renqvist, V., et al., A post-translational 19(24): p. 6900-7. modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J, 2000. 138. 139.

124. Wilson, K.S., et al.. Functional sites of interaction between release factor RFl and the ribosome. Nat. Struct. Biol., 2000. 7(10): p. 866-

125. Ban, N., et al., The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 E resolution. Science, 2000. 289: p. 905-

126. Wilson, K.S. and H.F. NoUer, Mapping the Position of Translational p. 131-139. 141. 142.

127. Wimberly, B.T., et al., Structure of the 308 ribosomal subunit. Nature, 2000. 407: p. 327-

128. Ramakrishnan, V. and S.W. White, The structure of ribosomal protein-SS reveals sites of interaction with 16SrRNA. Nature, 1992. 358: p. 768-

129. Seit-Nebi, A., et al.. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res., 2001.29(19): p. 3982-3987.

130. Seit Nebi, A., et al.. Mutation of a glutamine residue in the universal tripeptide GGQ in human eRFl termination factor does not cause complete loss of its activity. Mol Biol (Mosk), 2000.34: p. 899-900.

131. Polacek, N., et al.. The critical role of the universally conserved A2602 of 23S ribosomal RNA in the release of the nascent peptide during translation Mol. Ceil, 2003.11(1): p. 103-112.

132. Capecchi, M.R. and H.A. Klein, Characterisation of three proteins involved in polypeptide chain termination, in Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 1969, Cold Spring Harbour Laboratory of Quantitative Biology, p. 469-477. termination. Elongation Factor EF-G in the Ribosome by Directed Hydroxyl Radical Probing. Cell, 1998. 92: 103

133. Milman, G., et al., Peptide chain termination. III. Stimulation of in vitro termination. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1969. 63: p. 183-

134. Mikuni, O., et al.. Identification of the prfC gene, which encodes 5798-5802. peptide-chainrelease factor 3 of Escherichia coll Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 1994. 91(13): p.

135. Pavlov, M.Y., et al.. Release factor RF3 abolishes competition between release factor RFl and ribosome recycling factor (RRF) for a ribosome binding site. J. Mol. Biol., 1997. 273(2): p. 389-401.

136. Freistroffer, D.V., et al., Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RFI and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J., 1997.16(13): p. 4126-4133.

137. Crawford, D.J., et al., Indirect regulation of translational termination efficiency at highly expressed genes and recoding sites by the factor recycling function of Escherichia coli release factor RF3. EMBO J, 1999. 18(3): p. 727-32.

138. Zavialov, A.V., R.H. Buckingham, and M. Ehrenberg, A posttermination Cell, 2001.107(1): p. 115-124. ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. 153. 154. 155.

139. Nagai, K., et al., Structure, function and evolution of the signal recognition particle. Embo J, 2003. 22(14): p. 3479-85. Gu, S.Q., et al.. The signal recognition particle binds to protein L23 at the peptide exit of the Escherichia coli ribosome. Rna, 2003. 9(5): p. 566-

140. Yusupov, M.M., et al.. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science, 2001. 292(5518): p. 883-

141. Tin, O.F., et al.. Proteolytic fragmentation of polypeptide release factor I 765-72.

142. Kastner, В., C.N.A. Trotman, and W.P. Tate, Localization of the binding site of release factor-2 158. on the 70S ribosome by immuno-electron microscopy. Proc. Univ. Otago Med. Sch., 1986. 64: p. 41-42. Xu, W., F.T. Pagel, and E.J. Murgola, Mutations in the GTPase center of Escherichia coli 23S rRNA indicate release factor 2-interactive sites. J Bacteriol, 2002. 184(4): p. 1200-3. 159. 160. 161.

143. Wimberly, B.T., et al., A detailed view of a ribosomal active site: The structure of the LIl-RNA complex. Cell., 1999. 97(4): p. 491-

144. Conn, G.L., et al.. Crystal structure of a conserved ribosomal protein-RNA Science, 1999. 284: p. 1171-1

145. Yusupova, G.Z., et al.. The path of messenger RNA through the ribosome. Cell, 2001. 106(2): p. 233-

146. Nissen, P., et al., Crystal structure of the ternary complex ofPhe-tRNA, EF-Tu, and a GTP analog. Science, 1995. 270: p. 1464-1472. 104 complex. ofThermus thermophilus and crystallization of the stable fragments. Biochimie, 2000. 82(8): p.

147. Inagaki, Y., et al.. Convergence and constraint in eukaryotic release factor J (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res, 2002. 30(2): p. 532-44. 165. 166. 167. 168.

148. Merkulova, Т.1., et al., C-terminal domains of human translation termination factors eRFl andeRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett., 1999. 443(1): p. 41-

149. Laurberg, M., et al.. Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid binding site. J. Mol. Bioi., 2000. 303(4): p. 593-

150. Stark, H., et al., Visualization of Elongation Factor Tu On the Escherichia Ribosome. Nature., 1997. 389(6649): p. 403-

151. Stark, H., et al., Ribosome interactions ofaminoacyl-tRNA Stark, H., et al., Large-scale 301-309. and elongation factor Tu in G and extensive the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol., 2002. 15: p. 15-20. movement of elongation factor conformational change of the ribosome during translocation. Cell, 2000. 100(3): p. Coli 170.

152. Aevarsson, A., Structure-based sequence alignment of elongation factors Tu and G with related GTPases involved in translation. J Mol Evol, 1995. 41(6): p. 1096-1

153. Mora, L., et al., Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RFI and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol, 2003. 50(5): p. 1467-76.

154. Ito, K., K. Ebihara, and Y. Nakamura, The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. IWA, 1998. 4: p. 958-972. 173.

155. Kisselev, L., M. Ehrenberg, and L. Frolova, Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J., 2003. 22(2): p. 175-

156. Zavialov, A.V., et al., Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol. Cell, 2002. 10(4): p. 789798. 175. van Heel, M., et al.. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys, 2000. 33(4): p. 307-69. 105