Исследование кинетики и механизмов фотохимических реакций с участием триптофана и нуклеотидов методами химической поляризации ядер и лазерного импульсного фотолиза тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Снытникова Ольга Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ И МЕХАНИЗМОВ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ ТРИПТОФАНА И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДАМИ ХИМИЧЕСКОЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ ЯДЕР И ЛАЗЕРНОГО ИМПУЛЬСНОГО ФОТОЛИЗА

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Международном томографическом центре Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель: д.х.н. Центалович Ю.П.

Официальные оппоненты: к.х.н. Гарабан М.Б.

д.х.н. Некипелова Т.Д.

Ведушая организация: Институт химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН, г. Новосибирск-

Защита состоится

"20" р&глди 2004 г. в ■/£_

00

на заседании

Диссертационного совета К 003.014.01 при Институте Химической Кинетики и Горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКиГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН и в библиотеке Международного томографического центра СО РАН

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.х.н., профессор

Грицаи И.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Детальное исследование механизмов фотохимических реакций с участием структурных единиц белков и нуклеиновых кислот - аминокислот и нуклеотидов - является важным шагом для понимания механизмов фотохимических реакций, протекающих в живой природе. Поскольку триптофан является самым сильным хромофором из всех аминокислот, фотоионизация триптофана является одной из основных причин фотоиндуцированного окисления белков, поэтому изучение фотохимических реакций с его участием является весьма актуальным. В течение последних десятилетий фотохимия триптофана активно изучалась рядом научных коллективов, однако, несмотря на это, литературные данные по некоторым аспектам фотохимии триптофана являются противоречивыми, и ряд вопросов остается открытым. В первую очередь это относится к механизму фотоионизации - не ясно, какой вклад в ионизацию вносят предфлуоресцентное и релаксированное флуоресцентное состояния, а также каким образом эти два возможных канала ионизации зависят от температуры. Неизвестны также кислотно-основные свойства возбужденных состояний триптофана и механизм кислотного тушения синглетного возбужденного состояния. Практически неизученным является вопрос о возможных реакциях между триплетным триптофаном и структурными элементами нуклеиновых кислот - нуклеотидами, которые (или, точнее, их аналоги) могут иметь существенное значение в живых организмах. Настоящая работа направлена на решение этих вопросов. Кроме того, значительное внимание в работе уделено исследованию механизмов формирования ХПЯ в реакциях с участием триптофана и нуклеотидов. Эти исследования важны, в первую очередь, с методологической точки зрения, поскольку являются необходимым шагом для применения метода ХПЯ для исследования пространственной структуры и динамических процессов в биополимерах. ..

Цель диссертационной работы состояла: в определении физико-химических свойств интермедиатов. образующихся при фотолизе водных растворов триптофана; в установлении механизма реакций этих интермедиатов с нуклеотидами и определении свойств образующихся радикалов; в выяснении влияния параметров среды (рН, температура) на эти реакции; а также в установлении механизмов фотохимических реакций между одним из нуклеотидов и фоговозбужденными аза-ароматическими красителями и механизмов формирования ХПЯ в этих реакциях.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Научная новизна работы. Изучены свойства короткоживущих интермедиатов, образующихся при фотолизе водных растворов триптофана. Исследованы зависимости от рН среды времени жизни и квантового выхода формирования триплетного состояния триптофана. Установлены основные физико-химические свойства триплетного триптофана (время жизни, спектр поглощения, константа кислотно-основного равновесия), а также основные каналы гибели и нижняя граница константы кислотно-основного равновесия синглетного фотовозбужденного состояния. Изучен механизм фотоионизации триптофана, протекающей из двух состояний: предфлуоресцентного нерелаксированного S* и синглетного возбужденного состояния S1. Показано, что при комнатной температуре основным предшественником фотоионизации является предфлуоресцентное нерелаксированное состояние S* , при увеличении температуры возрастает вклад в ионизацию от релаксированного состояния S1. Проведено исследование зависимости выхода короткоживущего протонированного триплетного состояния от температуры. Определены аррениусовские параметры константы скорости фотоионизации из синглетного возбужденного состояния и константы скорости внутримолекулярного переноса протона. Предложена количественная схема фотолиза триптофана.

Установлены механизмы фотохимических реакций между 2,2'-дипиридином и нуклеотидом (гуанозин-5'-монофосфат), определены значения констант скорости, а также установлен механизм формирования ХПЯ в этих реакциях. Показано, что на кинетику сигналов ХПЯ нуклеотида сильное влияние оказывает реакция вырожденного электронного обмена (ВЭО), определены константы скорости этого процесса в кислых и щелочных условиях.

Установлен механизм и определены значения констант скорости реакций триплетного возбужденного триптофана с нуклеотидами (5'-ГМФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ, 5'-УМФ). Определен квантовый выход образования радикалов триптофана в реакции между триплетом триптофана и уридин-5'-монофосфатом.

Практическая ценность работы. Результаты исследований могут быть использованы для изучения пространственной структуры биополимеров, ряда динамических процессов в биополимерах: формирование и разрушение нативной структуры, внутримолекулярная миграция электрона, связывание с лигандами. Полученные результаты могут быть применены в области фотодинамической терапии, фогоафинной модификации биополимеров, протеомики, а также в области молекулярного дизайна биологических молекул.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XIII-XV симпозиумах "Современная химическая физика" (г. Туапсе, Россия, 2001-2003г.), VI конференции им. Воеводского "Физика и химия элементарных химических процессов" (г. Новосибирск, Россия, 2002), 16-ой европейской конференции по экспериментальному ЯМР (г. Прага, Чехия, 2002), на XXXX-XLII Международных научных студенческих конференциях (г. Новосибирск, Россия, 2002-2004), а также на общих физико-химических семинарах МТЦ СО РАН и ИХКиГ СО РАН.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 4 статьях, а также в тезисах международных, российских симпозиумов и конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 180 наименований. Работа изложена на 115 страницах, содержит 1 таблицу, 6 схем и 27 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.

Глава I представляет собой обзор литературы. В первом разделе главы рассматриваются вопросы фотофизики и фотохимии индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены основные фотохимические реакции, а также свойства радикалов и возбужденных состояний, образующихся при фотолизе этих молекул. Особое внимание уделено рассмотрению реакций образования и гибели триплетного состояния триптофана, а также фотоионизации (механизм, квантовый выход) триптофана, являющейся основным каналом фотодеградации многих протеинов. Во втором разделе первой главы дан обзор работ по изучению фотохимических реакций с участием нуклеиновых кислот и их компонентов. Приведены примеры использования физико-химических методов для изучения этих реакций, в частности, рассмотрено применение стационарного метода химической поляризации ядер к изучению фотохимических реакций фото возбужденных красителей с нуклеозидами, нуклеотидами и олигонуклеотидами.

В главе II подробно описаны методы исследования (ЛИФ, ХПЯ) и методики проведения экспериментов (рН-, актино- и спектрофотометрия).

Эксперименты по лазерному импульсному фотолизу проводились на установке, созданной в МТЦ СО РАН. Излучение импульсного эксимерного ХеС1 лазера (Lambda Physik EMG 101, длина волны 308 нм, энергия до 100 мДж/импульс, длительность импульса 15-20 не), проходило через блок измерения мощности, концентрировалось двумя сферическими линзами на поверхность кварцевой кюветы. Регистрирующая система состояла из дуговой ксеноновой лампы ДКсШ-150 (длительность импульса 2 мс, размер регистрирующего луча 1x3 мм), двух синхронно управляемых монохроматоров (240-670 нм, 1200 штрихов на мм, обратная дисперсия 3 нм/мм, набор щелей 2-0.1 мм), фотоумножителя (9794В, Electron Tubes Ltd., питание до 1000 В, 9 динодов) и цифрового двухканального осциллографа с 11-битным АЦП (LeCroy 9310A, 400 МГц, временное разрешение 10 нс). Установка полностью управлялась компьютером IBM PC 486 посредством МР488СТ IEEE 488 интерфейса. Установка оснащена температурной приставкой, позволяющей проводить эксперименты в диапазоне температур от 190 К до 350 К. Температура образца контролировалась термопарой, помещенной внутрь образца.

Все измерения по изучению эффектов ХПЯ, представленные в данной работе, проводились на установке ХПЯ с временным разрешением (50 нс), созданной в МТЦ СО РАН на базе ЯМР-спектрометра Avance -200 (Bruker). Облучение образца, помещенного в пирексовую ампулу, осуществлялось в датчике ЯМР-спектрометра с помощью эксимерного лазера (СОМРЕХ Lambda Physik, длина волны 308 нм, мощность импульса до 150 мДж). Свет к образцу подводился с помощью оптической системы, состоящей из сферической линзы, призмы и световода диаметром 5 мм. Варьирование временной задержки между импульсом лазера и радиочастотным импульсом позволило провести изучение кинетики формирования диамагнитных продуктов радикальных реакций в микросекундном временном диапазоне и получить количественную информацию о временах ядерной релаксации радикалов в растворе.

Глава ///диссертации посвящена исследованию фотохимических реакций. протекающих при фотолизе водных растворов триптофана. Представлены результаты изучения эволюции и свойств образующихся интермедиатов, изучен механизм реакции фогоионизации триптофана, предложена целостная количественная схема фотолиза данной аминокислоты.

В ходе проведенных исследований были получены индивидуальные спектры поглощения коротко живущих интермедиатов, образующихся при фотолизе водных растворов триптофана при комнатной температуре - триплетного состояния (нейтрального и протонированного). катион-радикала и нейтрального радикала триптофана.

сольватированного электрона, а также радикального аддукта сольватированного электрона с триптофаном (рис. I).

Исследованы зависимости от рН среды времени жизни триплетного состояния, а также квантового выхода формирования триплетов. С увеличением кислотности растворов скорость гибели нейтрального триплетного состояния триптофана возрастает, а квантовый выход падает. В нейтральной среде квантовый выход составляет Фт=0.065 (рис. 2).

Установлено, что основным каналом гибели синглетного возбужденного состояния является его протонирование с последующей быстрой интеркомбинационной конверсией в триплетное состояние. В нейтральной среде протонирование происходит за счет внутримолекулярного переноса протона от NH3+ группы, а в кислых растворах - через растворитель. Протонированный триплет имеет максимум поглощения на 400 нм и время жизни около 30 нс. Определены значение константы кислотно-основного равновесия триплетного триптофана рКа = 3.2 и нижняя граница константы кислотно-основного равновесия синглетного фотовозбужденного триптофана

При облучении растворов

триптофана в присутствии ацетона было обнаружено, что происходит процесс переноса энергии с триплета ацетона на молекулу триптофана с последующим тушением триплетного состояния триптофана основным состоянием ацетона. Значения констант этих процессов были определены (к = (2.0±0.4)х Ю9 М 'с'1 и кт.лс соответственно).

В данной главе представлены также результаты изучения механизма фотоионизации триптофана под действием ультрафиолетового излучения. Для выявления вкладов

нерелаксированного предфлуоресцентного S и релаксированного S1 синглетных состояний в фотоионизадию были проведены измерения квантовых выходов фотоионизации от температуры для Ь-триптофана (рис. 3) и ^ацетилтриптофана в кислых и нейтральных растворах. Предварительно были подобраны такие экспериментальные условия, в которых имеет место только монофотонная ионизация. Для этого было проведено изучение зависимости квантового выхода фотоионизации от энергии лазерного облучения. Условия монофотонной ионизации были достигнуты при энергии лазерного импульса < 30 мДж.

Исследование зависимости фотоионизации триптофана от температуры показало, что при комнатной температуре основным предшественником ионизации триптофана является нерелаксированное предфлуоресцентное состояние S*. С ростом температуры наблюдается небольшое уменьшение квантового выхода ионизации из данного состояния. Этот эффект, вероятно, следует отнести к увеличению скорости релаксации из состояния S* в флуоресцентное состояние S1.

Ионизация из S1 состояния является зависимым от температуры процессом со следующими параметрами Аррениуса для константы скорости

Е,„„ = 50+5 кДж/моль. Для Ь-триптофана при комнатной температуре ионизация из S1 состояния почти полностью подавляется другими каналами дезактивации данного возбужденного состояния, в первую очередь, - внутримолекулярным переносом протона (ВПП) от протонированной аминогруппы к индольному кольцу. Вклад первого синглетного состояния становится существенным при температуре свыше 320 К и возрастает с увеличением температуры. Так как для ^ацетилтриптофана реакция ВПП невозможна, то уже при комнатной температуре наблюдается существенный вклад состояния S1 в ионизацию. В белках для остатков триптофана реакция ВПП может иметь место только в

особых случаях. Таким образом, в реальных биологических системах при температуре 300 -320 К ионизация может происходить как из S* , так и из S1 состояния.

Реакция внутримолекулярного переноса протона является основным каналом гибели S1 состояния. Вследствие конкуренции между реакциями ВПП и ионизации, квантовый выход реакции ВПП остается приблизительно постоянным во всем диапазоне

температур от 300 до 360 К. Определены аррениусовские параметры для константы скорости внутримолекулярного переноса протона:

На основе данных, полученных в данной работе, а также авторами других работ, общую схему эволюции фотовозбужденных состояний триптофана можно представить следующим образом:

В четвертой главе представлены результаты исследования фотохимических реакций 2,2'-дипиридина с одним из мономеров РНК гуанозин-5'-монофосфатом (ГМФ) в водных растворах в широком диапазоне рН. В результате проделанной работы были установлены механизмы реакций между триплетным возбужденным красителем и нуклеотидом, а также особенности формирования эффектов ХПЯ, определены константы скорости различных стадий реакций и охарактеризованы промежуточные продукты реакций. Исследование реакции тушения триплетов красителя - 2,2'-дипиридина (DP) нуклеотидом - гуанозин-5'-монофосфатом методом лазерного импульсного фотолиза и методом ХПЯ с временным разрешением показало, что механизм изучаемой реакции зависит от того, в каких протонированных формах находятся реагирующие частицы (рис.

Как видно из рисунка, вся зависимость от рН может быть условно поделена на четыре интервала р^ границами которых являются значения констант кислотно-основного равновесия рКа реагирующих частиц - триплета дипиридина и нуклеотида. Значениями рКа определяется природа реагирующих частиц. Для каждой пары реагирующих частиц были получены константы скорости реакции тушения нуклеотидом возбужденного триплетного состояния красителя, и предложены механизмы реакций (перенос атома водорода, либо перенос электрона). Перенос атома водорода от нейтральной формы нуклеотида G к нейтральному триплету красителя TDP протекает с константой скорости равной 1.6x10' М 'с'1. Реакции между ТОРН* и ОН* (*,=1.3х109 м 'с"1), тОРН* и в (*2=2.7х109 М"'с"'), т0Р и С(-Н)" (¿4=1.1x10' М"'с"') идут через перенос электрона с константами скорости, близкими к диффузионной константе скорости. Используя метод ХПЯ с временным разрешением для изучения кинетики и механизма исследуемой реакции, было обнаружено, что вырожденный электронный обмен между при а также в щелочной среде

приводит к быстрой потере поляризации и к так называемому "эффекту компенсации ХПЯ".

На рис. 5 приведены кинетики ХПЯ, наблюдаемые на протонах ^ нуклеотида, имеющие типичный вид кинетической кривой в присутствии реакции вырожденного электронного обмена: быстрый спад к стационарному значению, зависимость от концентрации нуклеотида как скорости спада, так и остаточной поляризации. Для констант скорости вырожденного электронного обмена были получены следующие значения: для пары реагирующих частиц и для пары

4.0х 107 М"'с"'.

Данный эффект не проявляется в нейтральных растворах, в этом случае кинетика ядерной поляризации для ГМФ имеет другой вид и не зависит от концентрации нуклеотида. Времена ядерной парамагнитной релаксации, полученные для дикатиона и нейтрального радикалов нуклеотида, совпадают в пределах экспериментальной ошибки и составляют

Время, мкс

Рис. б. Кинетика ХПЯ 'Н, полученная для фотореакции гуанозин-5' -монофосфата с 22' -дипиридином при рН" 1.3: О - на протонах Н54 дипиридина при концентрации [ГМФ] = 3.1 мМ; • • на протонах Н| нуклеотида при концентрации [ГМФ] = 3.1 мМ;

О - на протонах Н| нуклеотида при концентрации [ГМФ] = 6.|мМ.

20±5 микросекунд. На основе анализа знаков ядерной поляризации, наблюдаемой для дипиридина и флавинмононуклеотида, можно сделать заключение, что g-фактор нейтрального радикала нуклеотида G(-H)* лежит в интервале 2.0030^<2.0032. Важно отметить, что эффекты ХПЯ, проявляющиеся в реакции гуанозин-5'-монофосфата с 2,2'-дипиридином, намного выше по амплитуде, чем в реакции с флавинмононуклеотидом. В связи с этим 2,2'-дипиридин может служить в качестве

фотосенсибилизатора для изучения радикальных реакций с участием нуклеотидов и олигонуклеотидов.

Пятая глава диссертации посвящена исследованию фотоиндуцированных реакций между триптофаном и нуклеотидами. При фотолизе растворов триптофана (ТгрН) в присутствии нуклеотидов обнаружено, что две промежуточные частицы, триплет и сольватированный электрон, вступают в химические реакции с нуклеотидами. Методом импульсного фотолиза были получены константы скорости тушения триплетного

состояния ТгрН различными нуклеотидами (5'-ГМФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ, 5'-УМФ), значения которых лежат в интервале (0.5б+5.7)х108 М''с"'.

Для выяснения механизма тушения триплетного состояния триптофана нуклеотидами были проведены эксперименты, в которых выход триплета триптофана был увеличен путем добавления к раствору бромида калия. Данный способ позволяет существенным образом увеличить выход триплетного состояния, и тем самым выделить канал образования радикалов триптофана в реакции с нуклеотидами, что может являться доказательством протекания реакции тушения по радикальному механизму.

Для трех нуклеотидов АМФ, ЦМФ и ГМФ не было выявлено заметных изменений в поглощении радикала триптофана при увеличении концентрации бромида. Только в случае использования УМФ наблюдался линейный рост выхода радикалов триптофана с повышением содержания ионов брома в растворе (рис. 6).

Полученные результаты позволяют оценить эффективность образования радикалов в реакции тушения уридилатом. При увеличении концентрации бромида от 0 до 2.0 М выход триплетов увеличивается почти в 7 раз от 0.07 до примерно 0.45, а выход радикалов возрастает от 0.04 до 0.09. Квантовый выход радикалов может быть оценен как приблизительно равный 0.13.

При исследовании этой реакции был также использован метод ХПЯ с временным разрешением (рис. 7).

ТгрН

Н4 Н2.в

т = 0 мкс

УМФ|

ТгрН

р-сн2

= 100 мкс б

УМФ

н*

ЦМФ

н.

т = 100 мкс

Рис.7. Спектры ХПЯ 'Н, полученные при фотолизе триптофана с нуклеотидами: а) и 6) - |.0хЮ"2 М ТгрН и 7.7x10""' М УМФ, наблюдаемые сразу и через )00 мкс после импульса лазера; в) - 1.1*Ю'г М ТгрН и !.2*10'! М ЦМФ, 100 мкс после лазерного импульса: г) - 1.0x10° М ТгрМ и 7.5x10 ' М АМФ, 100 мкс после импульса лазера, д) 1.2x10'' М ТгрН и 2.1x10° М ГМФ. 100 мкс после импульса лазера.

I АМФ

н.1 |Нг

Н, (АМН -Тгр)

АМФ

г =100 мкс ч^гМ^Н/**1***!*****«»*!

ГМФ

нч

х = 100 мкс V***

,-,-,-,-,-,-,-г

8 6 4 2

Химический сдвиг, м.д.

При фотолизе триптофана с нуклеотидами ГМФ, АМФ, ЦМФ ядерная поляризация формируется только в F-napax. В реакции с УМФ формирование поляризации на протонах нуклеотида наблюдается как в геминальных, так и в F-napax, что подтверждается также кинетической зависимостью формирования эффектов ХПЯ, полученной для данного нуклеотида. По результатам данных, полученных методами ЛИФ и ХПЯ, было установлено, что тушение триплетного ТгрН уридин-5'-монофосфатом является химической реакцией, то есть реакцией, в результате которой образуются радикалы. Для остальных нуклеотидов реакция тушения триплета триптофана протекает по пути физического тушения, в результате которой образуются исходные молекулы реагирующих веществ. Восстановление 5'-АМФ сольватированным электроном приводит к образованию N - протонированного радикала ANH*, который затем быстро превращается в С - протонированный АСН". В спектрах ХПЯ, полученных во время облучения растворов триптофана в присутствии 5'-АМФ, поляризация наблюдается на N - протонированном радикале.

ВЫВОДЫ

1. Изучены свойства короткоживущих интермедиатов, образующихся при фотолизе водных растворов триптофана. Исследованы зависимости от рН среды времени жизни и квантового выхода триплетного состояния триптофана. Установлено, что основным каналом гибели синглетного фотовозбужденного состояния является его протонированне с последующей быстрой интеркомбинационной конверсией в триплетное состояние. В нейтральной среде протонирование происходит за счет внутримолекулярного переноса протона от группы, а в кислых растворах - через растворитель. Определены время жизни и спектр поглощения протонированного триплета триптофана, а также константа кислотно-основного равновесия триплетного триптофана и нижняя граница константы кислотно-основного равновесия синглетного фотовозбужденного триптофана.

2. Установлен механизм фотоионизации триптофана под действием ультрафиолетового излучения. Изучены температурные зависимости квантовых выходов фотоионизации и фотоиндуцированного внутримолекулярного переноса протона. Показано, что при комнатной температуре основным предшественником фотоионизации является предфлуорецентное нерелаксированное состояние S* , при увеличении температуры возрастает вклад в ионизацию от рслаксированного состояния S1. Определены аррениусовские параметры константы скорости фотоионизации из синглетного

возбужденного состояния St и константы скорости внутримолекулярного переноса протона.

3. Установлены механизмы фотохимических реакций между 2,2'-дипиридином и 5'-ГМФ, а также механизм формирования ХПЯ в этих реакциях. Показано, что тушение триплетного дипиридина нуклеотидом происходит через перенос электрона в кислых и щелочных растворах, в диапазоне 5.8<рН<9.4 тушение предположительно происходит по механизму переноса атома водорода. Определены значения констант скорости тушения триплета 2,2'дипиридина различными формами нуклеотида. Показано, что на кинетику сигналов ХПЯ нуклеотида сильное влияние оказывает реакция вырожденного электронного обмена (ВЭО), определены константы скорости этого процесса в кислых и щелочных условиях.

4. Установлен механизм и определены значения констант скорости реакции тушения триплета ТгрН различными нуклеотидами (5'-ГМФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ, 5'-УМФ). Установлено, что тушение триплетного ТгрН уридин-5'-монофосфатом является химической реакцией, в которых происходит образование радикалов. Определен квантовый выход их образования. Для остальных нуклеотидов осуществляется физическое тушение триплета триптофана, в результате чего образуются исходные молекулы реагирующих веществ.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

(в связи со вступлением в брак О. Л. Курнышева изменила фамилию на Снытникова)

1. A.V. Yurkovskaya, O.A. Snytnikova, O.B. Morozova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, "Time-resolved CIDNP and Laser Flash Photolysis study of photoreaction between triplet 2,2'-dipyridyl and guanosine-5'-monophosphate in water". Physical Chemistry Chemical Physics, 2003, 5 (17). 3653-3659.

2. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova. R.Z. Sagdeev. "Properties of excited states of aqueous tryptophan", J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 2004, 162 (2-3), 371-379.

3. O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, "LFP and lime-resolved CIDNP study of photochemical reactions between aqueous tryptophan and nucleotides". Applied Magnetic Resonance, 2004,26.183-195.

4. P.S. Sherin. O.A. Snytnikova. Yu.P. Tsentalovich, 'Tryptophan photoionization from prefluorescenl and fluorescent slates". Chemical Physical Letters, 2004, 391 (1-3). 44-49.

5. О.А. Курнышева, А.В. Юрковская, Ю.П. Центалович, "Последовательные радикальные стадии в фотохимических реакциях с участием гуанина", XIII школа-симпозиум "Современная химическая физика", 25 сентября- 6 октября 2001, г.Туапсе, стр.145;

6. О.А. Курнышева "Исследование кинетики и механизмов фотохимических реакций с участием 5'-GMP ", ХХХХ Международная научная студенческая конференция, апрель 2002, г.Новосибирск; стр.67;

7.0. Kurnysheva, A. Yurkovskaya, Yu. Tsentalovich, "The consequent radical steps in photochemical reactions with the participation of 5'-GMP nucleotide", 16th European Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference, June 9-14, 2002, Prague, Czech Republic, Book of abstracts, abstract No.PA53;

8. O. Kumysheva, A. Yurkovskaya, Yu. Tsentalovich, "Study of photochemical reactions cf 5'-GMP nucleotide with dyes by CIDNP and LFP methods", VI Voevodsky Conference, July 2125, 2002, Akademgorodok, Novosibirsk, Russia, Book of abstracts, p. 194;

9. О.А. Курнышева, А.В. Юрковская, Ю.П. Центалович, О.Б. Морозова, "Исследование кинетики и механизма фотохимических реакций с участием 5'-ГМФ с красителями в водных растворах", XIV Симпозиум "Современная химическая физика", 18-29 сентября 2002, г.Туапсе, стр.108;

10. О.А. Снытникова, "Последовательные радикальные стадии в фотохимических реакциях с участием 5'-ГМФ", XLI Международная научная студенческая конференция, 16 апреля 2003, г.Новосибирск; стр.8;

П. О.А. Снытникова, Ю.П. Центалович, "Светоиндуцированные реакции триптофана с нуклеотидами", XV Симпозиум "Современная химическая физика", 18-29 сентября 2003, г.Туапсе, с. 123;

12. Ю.П. Центалович, О.А. Снытникова, "Свойства фотовозбужденных состояний триптофана", XV Симпозиум "Современная химическая физика", 18-29 сентября 2003, г.Туапсе, с. 37;

13. О.А. Снытникова, "Изучение свойств триплетного состояния триптофана и его реакций с нуклеотидами", XLII Международная научная студенческая конференция, 14 апреля 2004, г. Новосибирск; Россия, стр.38.

V t

Подписано к печати "13" сентября 2004г. Формат бумаги 60x84 1/16. Объём 2 псч. л.

Тираж 120 экз. Заказ № 1304. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

» 18788

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фотофизика и фотохимия индола, триптофана и их производных.

1.1.1. Спектры поглощения основного состояния.

1.1.2. Возбужденные триплетные состояния.

1.1.2.1. Спектры поглощения.

1.1.2.2. Коэффициенты экстинкции.

1.1.2.3. Выходы интеркомбинационной конверсии.

1.1.2.4. Время жизни.

1.1.3. Свойства радикалов.

1.1.3.1. Радикалы, образующиеся в реакциях окисления.

1.1.3.2. Радикалы, образующиеся в реакциях восстановления.

1.1.4. Реакции синглетного возбужденного состояния.

1.1.4.1. Реакции переноса протона.

1.1.4.2. Фотоионизация индола, триптофана и их производных.

1.2. Фотофизика и фотохимия нуклеиновых кислот и их компонентов.

1.2.1. Строение нуклеиновых кислот.

1.2.2. Спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот.

1.2.3. Фотохимические реакции нуклеиновых кислот и их компонентов.

1.2.4. Применение метода ХПЯ к изучению фотохимических реакций с участием молекул нуклеиновых кислот и их компонентов.

1.3. Постановка задачи.

Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Методы исследования.

2.1.1 Установка лазерного импульсного фотолиза.

2.1.2. Установка химической поляризации ядер с временным разрешением.

2.1.3. рН- и спектрофотометрия.

2.1.4. Актинометрия.

2.2. Материалы и реактивы.

Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ТРИПТОФАНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ.

3.1. Свойства возбужденных состояний триптофана.

3.1.1. Спектроскопические характеристики интермедиатов триптофана.

3.1.2. Кинетические характеристики.

3.1.3. Измерение квантового выхода триплета триптофана.

3.1.4. Константы скорости и квантовые выходы.

3.1.5. Природа короткоживущего интермедиата.

3.2. Фотоионизация триптофана.

3.2.1. Предшественник фотоионизации триптофана.

3.2.2. Зависимость выхода фотоионизации от энергии лазерного облучения.

3.2.3. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для N-ацетилтриптофана (NATrpH).

3.2.4. Зависимость квантового выхода фото ионизации от температуры для L-триптофана (L-TrpH).

3.2.5. Зависимость от температуры реакции внутримолекулярного переноса электрона для L-TrpH.

3.2.6. Реакции синглетного состояния триптофана.

3.2.7. Численное моделирование реакций ионизации и ВПП.

3.3. Количественная модель фотолиза триптофана.

Жизнь на Земле возникла и развивалась благодаря поглощению излучения. Несколько миллиардов лет назад под действием солнечного ультрафиолетового излучения, свободно проникавшего сквозь первозданную разбавленную атмосферу нашей планеты, ионизирующих излучений радиоактивных элементов и тепла вулканов синтезировались сложные органические молекулы, и началась пребиотическая эволюция, приведшая к созданию анаэробных организмов. Фотосинтез возник и стал развиваться позже, когда в земной атмосфере появились кислород и озон, защищающие поверхность планеты от воздействия солнечной УФ-радиации. В это время гетеротрофы - организмы, использовавшие для своего питания органические соединения, синтезируемые под действием ультрафиолетового излучения, исчезли, уступив свое место автотрофам -организмам, содержащим порфирины и обладающим способностью синтезировать собственную пищу, поглощая энергию видимого света. Фотосинтез снабжал и до сих пор снабжает все живые организмы энергией, необходимой для развития. Солнечный свет к тому же позволяет многим живущим организмам видеть свое окружение. Однако ионизирующее, ультрафиолетовое или видимое излучения оказывают и вредное воздействие на жизнедеятельность клеток. Они способны повреждать биологические молекулы, что приводит к изменению их активности или гибели клетки.

Белки, составляющими которых являются аминокислоты, участвуют во многих биологических процессах, а ультрафиолетовое излучение и ионизирующая радиация изменяют многие их свойства. С точки зрения фотобиологии триптофан наиболее важен, так как его спектр поглощения основного состояния перекрывается со спектром солнечной радиации, достигающей земной поверхности. Поэтому его фотовозбуждение может приводить к таким процессам, как фотоинактивация ферментов и фотоиндуцированное повреждение белков, приводящие к развитию различных заболеваний, в первую очередь кожи и органов зрения. Очевидно, что фотохимические реакции водных растворов триптофана могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофанильные остатки находятся в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (которыми являются биологические растворы) могут отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и их реакций является важным шагом для понимания механизмов фотохимических реакций, протекающих в живой природе. В связи с этим в течение последних десятилетий фотохимия триптофана активно изучалась рядом научных коллективов. Однако, несмотря на это, до сих пор не существует детального количественного описания фотохимических реакций с участием этой аминокислоты.

Наиболее тяжелые последствия воздействия избыточного УФ облучения для людей связаны с повреждениями молекул нуклеиновых кислот. Реакции, вызванные прямым облучением структурных элементов нуклеиновых кислот - нуклеотидов ионизирующим или жестким ультрафиолетовым облучением, изучены достаточно хорошо. Однако основную опасность повреждения ДНК и РНК представляет не прямой, а сенсибилизированный фотолиз, так как сами нуклеиновые кислоты в видимом и ближнем УФ диапазонах прозрачны. Известно, что некоторые аминокислоты (триптофан, тирозин) способны поглощать свет в области длин волн 280-300 нм (то есть в диапазоне солнечного света) с образованием высокореакционных интермедиатов. Поскольку в живых организмах белки связываются с молекулами нуклеиновых кислот (например, в процессе транскрипции), то образующиеся интермедиаты могут вступать в реакции с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и вызывать химические повреждения последних. В связи с этим возникает необходимость в исследовании фотохимических реакций, вызванных облучением аминокислот, наиболее интенсивно поглощающих в области ближнего УФ диапазона (в первую очередь триптофана), в присутствии различных нуклеотидов. Таким образом, исследование свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе растворов как самого триптофана, так и в присутствии нуклеотидов, имеет фундаментальное значение для фотохимии и фотобиологии.

В настоящее время взаимодействие излучений с биомолекулами является главным объектом исследования многих научных дисциплин, использующих различные методы. Основным вопросом всех исследований, прежде всего, является выяснением механизма реакций. Важнейшую роль в изучении механизмов фотохимических реакций с участием биомолекул играют современные кинетические методы. Как правило, эти методы основаны на импульсном возбуждении химической реакции с последующей регистрацией временной эволюции как исходных реагентов и конечных продуктов реакции, так и промежуточных частиц, возникающих в ходе реакции. Для импульсного инициирования реакции используют реакторы быстрого смешивания (для реакций смешения), а также импульсное облучение образца светом лазера или потоком ионизирующих частиц (для фото- и радиохимических реакций). Для регистрации проходящих в исследуемой системе изменений используется большое количество различных методов, среди которых важное место занимают методы спиновой химии. Эти методы основаны на использовании явлений спиновой поляризации (ХПЯ - химическая поляризация ядер и ХПЭ - химическая поляризация электронов), возникающей в ходе радикальных химических реакций. Ядерная поляризация формируется за наносекунды в продуктах геминальной рекомбинации, но сохраняется в диамагнитных продуктах реакции в течение времени ядерной релаксации (порядка секунды) и может быть использована как спиновая селективная неразрушающая метка на молекуле биополимера. К преимуществу этого метода относится также его более высокая чувствительность по сравнению с обычными методами ЭПР и ЯМР, связанная с высокой степенью поляризации исследуемых образцов. Кроме того, современные методы позволяют проводить исследование кинетики формирования спиновой поляризации в микросекундном и субмикросекундном временных диапазонах, что в сочетании со спектральной информативностью, свойственной ЭПР и ЯМР, делает эти методы незаменимыми при исследовании механизмов быстрых радикальных реакций. Информация о механизме реакции может быть получена из анализа знаков, амплитуды и кинетики формирования сигналов поляризации. Поскольку спектры ХПЯ возникают в результате взаимодействий радикальных частиц, детальное изучение этих спектров и кинетики их эволюции позволяет сделать важные выводы о магнитных и кинетических свойствах этих интермедиатов. Следует заметить, что каждый метод сам по себе способен дать только ограниченную информацию о механизме исследуемой реакции, и для детального исследования необходимо комплексное использование ряда методов.

Настоящая работа посвящена исследованию кинетики и механизмов фотохимических реакций с участием структурных элементов биологических молекул -аминокислот и нуклеотидов, а также изучению свойств и взаимодействий короткоживущих промежуточных частиц, возникающих в ходе этих реакций. Исследования проводились с использованием комплексного подхода, основанного на совместном применении магнитнорезонансного и оптического методов: метода ХПЯ с временным разрешением и метода лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ).

Цель диссертационной работы состояла в определении физико-химических свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе триптофана, в установлении механизма реакций этих интермедиатов с нуклеотидами и определении свойств образующихся радикалов, в выяснении влияния параметров среды (рН, температура) на эти реакции, а также в установлении механизма фотохимических реакций между одним из нуклеотидов и фотовозбужденными аза-ароматическими красителями и механизмов формирования ХПЯ в этих реакциях.

5.3. Заключение.

При проведении фотолиза растворов триптофана (ТгрН) в присутствии нуклеотидов обнаружено, что две промежуточные частицы (триплет и сольватированный электрон) вступают в химические реакции с нуклеотидами. Установлен механизм и определены константы скорости реакции тушения триплета ТгрН различными нуклеотидами (5'-ГМФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ, 5'-УМФ), значения которых лежат в о 11 интервале (0.56-s-5.7)xl0 М" с" . Тушение триплетного ТгрН уридин-5'-монофосфатом является химической реакцией, то есть реакцией образования радикалов. Определен квантовый выход их образования. Для остальных нуклеотидов осуществляется физическое тушение триплета триптофана, в результате чего образуются исходные молекулы реагирующих веществ. Восстановление 5'-АМФ сольватированным электроном приводит к образованию N - протонированного радикала ANH*, который затем превращается в С - протонированный АСН*. В спектрах ХПЯ, полученных во время облучения растворов триптофана в присутствии 5'-АМФ, поляризация наблюдается на N-протонированном радикале.

Изучены свойства короткожнвущнх интермедиатов, образующихся при фотолизе водных растворов триптофана. Исследованы зависимости от рН среды времени жизни триплетного состояния триптофана, а также квантового выхода формирования триплетов. Установлено, что основным каналом гибели синглетного фотовозбужденного состояния является его протонирование с последующей быстрой интеркомбинационной конверсией в триплетное состояние. В нейтральной среде протонирование происходит за счет внутримолекулярного переноса протона от NH3+ группы, а в кислых растворах - через растворитель. Установлено время жизни и спектр поглощения протонированного триплета триптофана. Определена константа диссоциации триплетного триптофана и нижняя граница константы диссоциации синглетного фотовозбужденного триптофана.

Изучен механизм фотоионизации триптофана под действием ультрафиолетового излучения. Установлены температурные зависимости для квантовых выходов фотоионизации и фотоиндуцированного внутримолекулярного переноса протона. Показано, что при комнатной температуре основным предшественником фотоионизации является предфлуоресцентное нерелаксированное состояние S*, при увеличении температуры возрастает вклад в ионизацию от релаксированного состояния Si. Определены аррениусовские параметры для константы скорости фотоионизации из синглетного возбужденного состояния Si и для константы скорости внутримолекулярного переноса протона.

Установлены механизмы фотохимических реакций между 2,2'-дипиридином и 5'-ГМФ, а также механизм формирования ХПЯ в этих реакциях. Показано, что тушение триплетного дипиридина нуклеотидом происходит через перенос электрона в кислых и щелочных растворах, в диапазоне 5.8<рН<9.4 тушение предположительно происходит по механизму переноса атома водорода. Определены значения констант скорости тушения триплета 2,2'дипиридина различными формами нуклеотида. Показано, что на кинетику сигналов ХПЯ нуклеотида сильное влияние оказывает реакция вырожденного электронного обмена (ВЭО), определены константы скорости этого процесса в кислых и щелочных условиях.

Установлен механизм и определены значения констант скорости реакции тушения триплета ТгрН различными нуклеотидами (5'-ГМФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ, 5'-УМФ). Установлено, что тушение триплетного ТгрН уридин-5'-монофосфатом является химической реакцией, то есть реакцией образования радикалов. Определен квантовый выход их образования. Для остальных нуклеотидов осуществляется физическое тушение триплета триптофана, в результате чего образуются исходные молекулы реагирующих веществ.

1. D.B. Wetlaufer, Adv. Protein Chem., 17 (1962) 303.

2. A.D. McLaren, O. Hidalgo-Salvatierra, "Quantum yields for enzyme inactivation and the amino acid composition of proteins", Photochem. Photobiol., 3 (1964) 349.

3. S. Zigman, Photochem. Photobiol., 26 (1977) 437.

4. Ч.Р. Кантор, П.Р. Шиммел, Биофизическая химия. В 3-х т., М.: Мир, 1984.

5. Е. Gudgin, R. Lopez-Delgado, W.R. Ware, "The tryptophan fluorescence lifetime puzzle. A study of decay times in aqueous solution as a function of pH and buffer composition", Can. J. Chem., 59 (1981) 1037-1044.

6. D.M. Rayner, A.G. Szabo, "Time resolved fluorescence of aqueous tryptophan", Can. J. Chem., 56 (1978) 743-745.

7. R.J. Robbins, G.R. Fleming, G.S. Beddard, G.W. Robinson, PJ. Thistlethwaite, G.J. Woolfe, "Photophysics of aqueous tryptophan: pH and temperature effects", J. Am. Chem. Soc. 102 (1980) 6271-6279.

8. D.V. Bent, E. Hayon, "Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. Ш. Tryptophan", J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 2612-2619.

9. F.D. Bryant, R. Santus, L.I. Grossweiner, "Laser flash photolysis of aqueous tryptophan", J. Phys. Chem. 79 (1975) 2711-2716.

10. R. Santus, L.I. Grossweiner, "Primary products in the flash photolysis of tryptophan", Photochem. Photobiol., 15 (1972) 101-105.

11. W.A. Volkert, R.R. Kuntz, C.A. Ghiron, R.F. Evans, "Flash photolysis of tryptophan and N-acetyl-L-tryptophanamide; the effect of bromide on transient yields", Photochem. Photobiol. 26 (1977) 3-9.

12. M.L. Posener, G.E. Adams, P. Wardman, R.B. Cundall, J. Chem. Soc. Faraday Trans. П 72 (1976)2231.

13. C. Pernot, L. Lindqvist, "Laser photolysis of indole in cyclohexane", J. Photochem. 6 (1976/1977) 215-220.

14. R. Klein, I. Tatischeff, M. Bazin, R. Santus, "Photophysics of indole. Comparative study of quenching, solvent, and temperature effects by laser flash photolysis and fluorescence", J. Phys. Chem. 85 (1981) 670-677.

15. T. Medinger, F. Wilkinson, Trans. Faraday Soc. 61 (1965) 620.

16. J. Moan, Israel J. Chem. 9 (1971) 637.

17. M.L. Saviotti, W.C. Galley, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (1974) 4154.

18. A.L. Kwiram, In 'Triplet State ODMR Spectroscopy"; R.H. Clarke, Ed.; Wiley: New York, 1982, p. 427.

19. S. Papp, J.M. Vanderkooi, "Tryptophan phosphorescence at room temperature as a tool to study protein structure and dynamics", Photochem. Photobiol. 49 (1989) 775-784.

20. N.E. Geacintov, H.C. Brenner, "The triplet state as a probe of dynamics and structure in biological macromolecules", Photochem. Photobiol. 50 (1989) 841-858.

21. A.H. Maki, Methods Enzymol. 246 (1995) 610.

22. A. Gershenson, A. Gafiii, D. Steel, "Comparison of the time-resolved absorption and phosphorescence from the tryptophan triplet state in proteins solution", Photochem. Photobiol. 67 (1998) 391-398.

23. P. Cioni, Biophys. Chem. 87 (2000) 15.

24. G.B. Strambini, M. Gonelli, "Tryptophan phosphorescence in fluid solution", J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 7646-7651.

25. L.J. Lapidus, W.A. Eaton, J. Hofrichter, "Measuring the rate of intramolecular contact formation in polypeptides", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (2000) 7220-7225.

26. R.V. Bensasson, E.J. Land, T.G. Truscott, Flash Photolysis and Pulse Radiolysis. Contributions to the Chemistry of Biology and Medicine. Pergamon Press, Oxford, 1983.

27. P.N. Moorthy, E. Hayon, "Intermediates Produced from the One-Electron Reduction of Nitrogen Heterocyclic compounds in Solution" J. Phys. Chem. 78 (1974) 2615-2620.

28. E. Hayon, M. Simic, "Acid-Base Properties of Organic Peroxy Radicals, OORH, in Aqueous Solution", J. Am. Chem. Soc. 95 (1973) 6681-6684.

29. J. Feitelson, E. Hayon, A. Treinin, "Photoionization of phenols in water. Effects of light intensity, oxygen, pH, and temperaturre", J. Am. Chem. Soc. 95 (1973) 1025-1029.

30. J.L. Redpath, R. Santus, J. Ovadia, L.I. Grossweiner, Int. J. Radiant. Biol. 28 (1975) 243.

31. R.C. Armstrong, A.J. Swallow, "Pulse- and gamma-radiolysis of aqueous solution of tryptophan", Radiat. Res. 40 (1969) 563-579.

32. M. Faraggi, A. Bettelheim, "The reaction of the hydrated electron with amino acids, peptides, and proteins in aqueous solutions", Radiat. Res. 72 (1977) 81-88.

33. R. Santus, M. Bazin, M. Aubailly, "Nature, identification and properties of intermediates produced by UV excitation of indole derivatives at low and room temperature", Rev. Chem. Intermed. 3 (1980) 231-283.

34. В.И. Слесарев, Химия. Основы химии живого. Учебник для вузов, ХИМИЗДАТ, 2000.

35. J. Feitelson, Isr. J. Chem. 8 (1970) 241.

36. I. Saito, H. Sugiyama, A. Yamamoto, S. Muramatsu, T. Matsuura, "Photochemical hydrogen-deuterium exchange reaction of tryptophan. The role in nonradiative decay of singlet tryptophan", J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 4286-4287.

37. H. Shizuka, M. Serizawa, H. Kobayashi, K. Kameta, H. Sugiyama, T. Matsuura, I. Saito, "Excited-state behavior of tryptamine and related indoles. Remarkably efficient intramolecular proton-induced quenching", J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 1726-1732.

38. H. Shizuka, M. Serizawa, T. Shimo, I. Saito, T. Matsuura, "Fluorescence-quenching mechanism of tryptophan. Remarkably efficient internal proton-induced quenching and charge-transfer quenching", J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 1930-1934.

39. H.-T. Yu, W.J. Colucci, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley, "Fluorescence quenching in indoles by excited-state proton transfer", J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8449-8454.

40. Y. Chen, B. Liu, M.D. Barkley, "Trifluoroethanol quenches indole fluorescence by excited-state proton transfer" J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 5608-5609.

41. A.D. McLaren, D. Shugar, Photochemistry of Proteins and Nucleic Acids. MacMillan, New York, 1964.

42. M. Bazin, J.Pierre, P.Debey, R. Santus, Eur. J.Biochem. 124 (1982) 539-544.

43. J. Dillon, D.Roy, A. Spector, Exp. Eye Res. 41 (1985) 53-60.

44. J.A. Shauerte, A. Gafiii, Biochem. Biophys. Res. Commun. 212 (1995) 9p0-905.

45. M.J. Devies, R.J.W. Truscott, "Photo-oxidation of proteins and its role in cataractogenesis", J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 63 (2001) 114-125

46. E. Amouyal, A.Bernas, D. Grand, "On the photoionization energy threshold of tryptophan in aqueous solutions", Photochem. Photobiol. 29 (1979) 1071-1077.

47. U. Lachish, A. Shafferman, G. Stein, "Intensity dependence in laser flash photolysis experiments: hydrated electron formation from ferrocyanide, tyrosine and tryptophan", J. Chem. Phys. 64 (1976) 4205-4211.

48. B. Finnstroem, F. Tfibel, L. Lindqvist, "One- and two-proton ionization of aqueous tryptophan by the harmonics of the Nd laser", Chem. Phys. Letters 71 (1980) 312-316.

49. D.N. Nikogosyan, H. Gorner, "Photolysis of aromatic amino acids in aqueous solution by nanosecond 248 and 193 nm laser light", J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 13 (1992) 219-234.

50. M. Bazin, L.K. Patterson, R. Santus, "Direct observation of monophotonic photoionization in tryptophan by excited by 300-nm radiation. A laser photolysis study", J. Phys. Chem. 87 (1983) 189-190.

51. H.B. Steen, "Wavelength dependence of the quantum yield of fluorescence and photoionization of indoles", J. Chem. Phys. 61 (1974) 3997-4002.

52. J. Feitelson, "The formation of hydrated electrons from the excited state of indole derivatives", Photochem. Photobiol. 13 (1971) 87-96.

53. A. Bernas, D. Grand, E. Amouyal, "Photoionization of solutes and conduction band edge of solvents. Indole in water and alcohols", J. Phys. Chem. 84 (1980) 1259-1262.

54. F. Saito, S. Tobita, H. Shizuka, "Photoionization mechanism of aniline derivatives in aqueous solution studied by laser flash photolysis", J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 106 (1997), 119-126.

55. C. Pigault, D. Gerard, G. Laustriat, in: Proceedings of 10th International Conference on Photochemistry, Iraklion, Greece, 6-12 September 1981.

56. J.C. Mialocq, E. Amouyal, A. Bernas, D. Grand, "Picosecond laser photolysis of aqueous indole and tryptophan", J. Phys. Chem. 86 (1982) 3173-3177.

57. J. Peon, G.C. Hess, J.-M.L. Pecourt, T. Yuzawa, B. Kohler, "Ultrafast photoionization dynamics of indole in water", J. Phys. Chem. 103 (1999) 2460-2466.

58. L.I. Grossweiner, A.M. Brendzel, A. Blum, "Multiple pathways of tryptophan photoionization", Chem. Phys. 57 (1981) 147-155.

59. F. Gai, R.L. Rich, J.W. Petrich, "Monophotonic ionization of 7-azaindole, indole and their derivatives and the role of overlapping excited states", J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 735-746.

60. L.I. Grossweiner, Y. Usui, "Flash photolysis and inactivation of aqueous lysozyme", Photochem. Photobiol. 13 (1971) 195-214.

61. H. Templer, PJ. Thistlethwaite, "Flash photolysis of aqueous tryptophan, alanyl tryptophan and tryptophyl alanine", Photochem. Photobiol., 23 (1976) 79-85.

62. J.F. Baugher, L.I. Grossweiner, "Photolysis mechanism of aqueous tryptophan", J. Phys. Chem. 81 (1977) 1349-1354.

63. R.F. Evans, R.R. Kuntz, W.A. Volkert, C.A. Ghiron, Photochem. Photobiol. 27 (1978) 511.

64. E.V. Khoroshilova, Y.A. Repeyev, D.N. Nikogosyan, "UV photolysis of aromatic amino acids and related dipeptides and tripeptides", J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 7 (1990) 159-172.

65. G.A. Papadantonakis, K.L. Stevenson, P.R. LeBreten, "Evidence of temperature dependent activation barriers for near-threshold aqueous photoionization of 2'-deoxyguanosine and tryptophan", Chem. Phys. Letters 346 (2001) 97-102.

66. Tatischeff, R. Klein, "Influence of the environment on the excitation wavelength dependence of the fluorescence quantum yield of indole", Photochem. Photobiol. 22 (1975) 221-229.

67. J. Eisinger, G. Navon, "Fluorescence quenching and isotope effect of tryptophan", J. Chem. Phys. 50 (1969) 2069-2077.

68. E.P. Kirby, R.F. Steiner, "The influence of solvent and temperature upon the fluorescence of indole derivatives", J. Phys. Chem. 74 (1970) 4480-4490.

69. L.P. McMahon, W.J. Colucci, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley, "Deiterium isotope effects in constrained tryptophan derivatives: implication for tryptophan photophysics", J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8442-8448.

70. L. Jian, W.F. Wang, Z.D. Zheng, S.D. Yao, J.S. Zhang, N.Y. Lin, "Reactive intermediates in laser photolysis of guanosine", Res. Chem. Intermed. 15 (1991) 293301.

71. Z.H. Zuo, S.D. Yao, J. Luo, W.F. Wang, J.S. Zhang, N.Y. Lin, "Laser photolysis of cytosine, cytidine and dCMP in aqueous solution", J. Photochem. Photobiol. В.: Biol. 15 (1992)215-222.

72. N.Y. Lin, "Excitation transfer, charge transfer and hydrogen abstraction reaction, kinetic studies of modification of DNA components", Radiant. Phys. Chem. 47 (1996) 209-212.

73. J.H. Ma, W.Z. Lin, W.F. Wang, Z.H. Han, S.D. Yao, N.Y. Lin, "Triplet transfer mechanism for electron transfer oxidation of DNA", J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 57 (2000) 76-81.

74. D. Creed, "The photophysics and photochemistry of the near-UV absorbing amino acids-I. Tyrosine and its simple derivatives": Photochem. Photobiol. 39 (1984) 563-575.

75. D. Creed, "The photophysics and photochemistry of the near-UV absorbing amino acids-I. Tryptophan and its simple derivatives" Photochem. Photobiol. 39 (1984) 537562.

76. D. Creed, "The photophysics and photochemistry of the near-UV absorbing amino acids-I. Cystine and its simple derivatives", Photochem. Photobiol. 39 (1984) 577-583.

77. S. Steenken, "Purine Bases, Nucleosides, and Nucleotides: Aqueous Solution Redox Chemistry and Transformation Reaction of Their Radical Cations and e and OH Adducts" Chem. Rev. 89 (1989) 503-520.

78. J. Cadet, P. Vigny, Bioorganic photochemistry, Vol. 1, Photochemistry and the Nucleic Acids; H. Morrison, Ed., New York: Willey 1990.

79. D.V. Bent, E. Hayon, "Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. I. Tyrosine", J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 2599-2606.

80. D.V. Bent, E. Hayon, "Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. I. Phenylalanine", J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 2606-2612.

81. Yu.P Tsentalovich, O.A. Snytnikova, R.Z. Sagdeev, "Properties of exited states of aqueous tryptophan", J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 162 (2004) 371-379.87. von Sonntag, G.: The Chemical Basis of Radiation Biology, London: Taylor and Francis 1987.

82. G.V. Buxton, C.L. Greenstock, W.P. Helman, A.B. Ross, "Critical review of rate constants for reaction of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxy. radicals (OH/O ) in aqueous solution", J. Phys. Ref. Data 17 (1988) 513-886.

83. A.J. Bertichamps, J. Huttermann, W. Kohnlein, R. Teoule, Eds.: Effects of Ionizing Radiation on DNA, Berlin: Springer 1978.

84. J. Huttermann in: Radical Ionic Systems; Lund A., Shiotani M, Eds, Boston: Kluwer Academic 1991.

85. W.A. Bernhard, "Sites of electron trapping in DNA as determined by ESR of one-electron-reduced oligonucleotides": J. Phys. Chem. 93 (1989) 2187-2189.

86. J. Barnes, W.A. Bernhard, K.R. Mercer, Radiat. Res. 126 (1991) 104-107.

87. S.V. Jovanovic, M.G. Simic, "One-electron redox potentials of purines and pyrimidines", J. Phys. Chem. 90 (1986) 974-978.

88. S. Steenken, J.P. Telo, H.M. Novais, L.P. Candeias, "One-electron-reduction potentials of pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides in aqueous solution. Consequences for DNA redox chemistry", J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 4701-4709 (1992).

89. M. Faraggi, F. Broitman, J.B. Trent, M.H. Klapper, "One-electron oxidation reactions of some purine and pyrimidine bases in aqueous solutions. Electrochemical and pulse radiolysis studies", J. Phys. Chem. 100 (1996) 14751-14761.

90. S. Steenken, S. V. Jovanovic "How easily oxidizable is DNA? One-electron reduction potentials of adenosine and guanosine radicals in aqueous solution", J. Am. Chem. Soc. 119(1997) 617-618.

91. L. P. Candeias, S. Steenken "Structure and acid-base properties of one-electron-oxidized deoxyguanosine, guanosine and 1-methylguanosine", J. Am. Chem. Soc. Ill (1989) 1094-1099.

92. R. Arce, J. Rivera "Internal heavy-atom effect on the photophysics and photocnemistry of 2-styrylantracene", J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry 49 (1989) 219-237.

93. J. Schmidt, D. Borg "Free Radicals from purine nucleosides after hydroxyl radical attack", Radiat. Res. 65 (1976) 220-237.

94. M. D. Shetlar "Photochemical and free radical initiated reactions of 1,3-dimethylthymine with isopropanol", Photochem. Photobiol. 29 (1979) 253-259.

95. E.F. McCord, R.R. Bucks, S.G. Boxer "Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization Studies of the Reaction between Photoexcited Flavins and Tryptophan Derivatives at 360 MHz", Biochemistry 20 (1981) 2880-2888.

96. E.F. McCord, K.M. Morden, A. Pardi, I. Tinoco, Jr. and S.G. Boxer "Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization Studies of Guanosine in Nucleotides, Dinucleotides, and Oligonucleotides", Biochemistry 23 (1984) 1926-1934.

97. R. M. Scheek, S. Stob, T. Schleich, N. С. M. Alma, C. W. Hilbers, R. Kaptein, "Photo-CIDNP Study of Adenosine 5'-Monophosphate. Pair-Substitution Effects due to Cation Radical Deprotonation", J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 5930-5932.

98. R. Kaptein, K. Nicolay, K. Dijkstra, "Photo CIDNP in nucleic acid bases and nucleotides", J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1979) 1092-1094.

99. M. D. Sevilla, J. B. D'Arcy, К. M. Morehouse, M. L. Engelhardt "An EPR study of ideation radicals in dinucleoside phosphates and DNA produced by photoionization", Photochem. Photobiol. 29 (1979) 37-42.

100. R. Kaptein, "Photo CIDNP studies of proteins" In Biological Magnetic Resonance, ed. L. J. Berliner and J. Reuben, Plenum Press, New York, 1982,4, p. 145-191.

101. R. Kaptein, K. Dijkstra, K. Nicolay, "Laser photo CIDNP as a surface probe for proteins in solution", Nature 274 (1978) 293-294.

102. R. Kaptein, "Structural information from photo CIDNP in proteins" In NMR Spectroscopy in Molecular Biology, ed. B. Pullman, Reidel, Dordrecht, 1978, p. 211229.

103. P. J. Hore, R. W. Broadhurst, "Photo CIDNP in biopolymers", Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 25 (1993) 345-402.

104. L. T. Muus, P. W. Atkins, K. A. McLauchlan, J. B. Pedersen, Chemically Induced Magnetic Polarization, Reidel, Dortrecht, 1977.

105. К. M. Salikhov, Yu. N. Molin, R. Z. Sagdeev, A. L. Buchachenko, Spin Polarization and magnetic Field Effects in Radical Reactions, Elsevier, Amsterdam, 1984.

106. E. F. McCord, К. M. Morden, I. Tinoco, Jr. and S. G. Boxer "Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization Studies of Yeast tRNAPhe", Biochemistry 23 (1984) 1935-1939.

107. S. Stob, R. M. Scheek, R. Kaptein, "Photo-CIDNP in guanine nucleic acid derivatives, A mechanistic study", Photochem. Photobiol. 49 (1989) 717-723.

108. S. Stob, R. Kaptein, "Photo CIDNP of the amino acids", Photochem. Photobiol. 49 (1989) 565-577.

109. M. Katahira, R. Sakaguchi-Katahira, F. Hayasni, S. Uesugi, Y. Kyogoku, "Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization studies of oligonucleotide duplexes", J. Am. Chem. Soc. 113 (1991) 8647-8651.

110. G. L. Closs, R. J. Miller, "Laser Flash Photolysis with NMR detection microsecond time resolve CIDNP separation of geminate and random phase processes", J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 1639-1641.

111. I.F. Molokov, Yu.P. Tsentalovich, A.V. Yurkovskaya, R.Z. Sagdeev, "Investigation of the photo-Fries rearrangement reactions of 1- and 2- naphthyl acetates" J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry 110 (1997) 159-165.

112. Yu.P. Tsentalovich, L.V. Kulik, N.P. Gritsan, A.V. Yurkovskaya, "Solvent effect on the rate of p-scission of the tert-butoxyl radical", J. Phys. Chem. A 102 (1998) 7975-7980.

113. S. Schaublin, A. Honener, R.R. Ernst "Fourier spectroscopy of nonequilibrium states, application to CIDNP, Overhauser experiments and relaxation time measurements", J.Magn.Reson. 13 (1974) 196-216.

114. R. J. Miller, G. L. Closs "Application of Fourier transform NMR spectroscopy to submicrosecond time-resolved detection in laser flash photolysis ", Rev. Sci. Instrum. 52 (1981) 1876 1885.

115. W. G. Clark "Pulsed nuclear resonance apparatus", Rev. Sci. Instrum. 35 (1964) 316333.

116. J.D. Ellett, M. D. Gibby, U. Haeberien, L. M. Huber, U. Mehring, A. Pines, J.S. Waugh "Spectrometers for multiple-pulse NMR" Adv. Magn. Reson.5 (1971) 117-176.

117. G. E. Janes, H. Stemlight "Fourier transform nuclear magnetic resonance, I. Repetitive pulses" J. Magn. Reson. 6 (1972) 167-182.

118. А. Абрагам "Ядерный магнетизм", ИЛ, Москва, 1963.

119. H.D. Hill, R.E. Richards "Limits of measurements in magnetic resonance", J. Phys. E Ser.2, 1 (1986) 977-983.

120. D. Shaw "Fourier transform NMR spectroscopy", Elsevier, Amsterdam, 1976.

121. Т. Фаррар, Э. Беюсер "Импульсная и фурье спектроскопия ЯМР", Мир, Москва, 1973

122. R. Bensasson, E.J. Land, "Triplet-triplet extinction coefficients via energy transfer", Trans. Faraday Soc. 67 (1971) 1904-1915.

123. B. Amand, R. Bensasson, "Determination of triplet quantum yields by laser flash absorption spectroscopy", Chem. Phys. Letters 34 (1975) 44-48.

124. R.F. Evans, C.A. Ghiron, W.A. Volkert, R.R. Kuntz, "Flash photolysis of N-acetyl-L-tryptophanamine; acg-basic equilibrium of the radical transients", Chem. Phys. Letters 42 (1976) 43-45.

125. R.S. Shetiya, K.N. Rao, J. Shankar, "Determination of rate constants for the reactions of H, OH, and e"aq with indole-3-acetic acid and other plant hormones", Radiat. Effects 14 (1972) 185-189.

126. Y.Tal, M. Faraggi, "The reaction of the hydrated electron with amino acids, peptides, and proteins in aqueous solutions. I. Factors affecting the rate constants", Radiat. Res. 62 (1975) 337-346.

127. J. Cygler, G.R. Freeman, "Effects of solvent structure on electron reactivity and radiolysis yields: 2-propanol/water mixed solvents", Can. J. Chem. 62 (1984) 12651270.

128. A. Szutka, J.K. Tomas, S. Gordon, E.J. Hart, "Rate constants of hydrated electron reactions with some aromatic acids, alkyl halides, heterocyclic compounds, and Werner complexes", J. Phys. Chem. 69 (1965) 289-292.

129. M. Anbar, E.J. Hart, "The reactivity of metal ions and some oxy anions toward hydrated electrons", J. Phys. Chem. 69 (1965) 973-977.

130. F. Barat, L. Gilles, B. Hickel, B. Lesigne, "Effect of the dielectric constant on the reactivity of the solvated electron", J. Phys. Chem. 77 (1973) 1711-1715.

131. A.M. Afanassiev, K. Okazaki, G.R. Freeman, J. Phys. Chem. 83 (1979) 1244.

132. G.O. Philips, D.J. Wedlock, O.I. Micic, B.H. Milosavljevic, J.K. Tomas, Radiat. Phys. Chem. 15(1980) 187.

133. K.M. Idriss-Ali, G.R. Freeman, Can. J. Chem. 62 (1984) 2217.

134. K. Kasama, A. Takematsu, S. Arai, "Photochemical reactions of triplet acetone with indole, purine and pyrimidine derivatives", J. Phys. Chem. 86 (1982) 2420-2427.

135. J.L. Redpath, R. Santus, J. Ovadia, L.I. Grossweiner, Int. J. Radiat. Biol. 27 (1975) 201.

136. E.J. Land, W.A. Prutz, Int. J. Radiat. Biol. 32 (1977) 203.

137. S.P. McGlynn, Т. Azumi, M. Kinoshita, In: Molecular Spectroscopy of Triplet State. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1969, p. 159.

138. G. Porter, S.K. Dogra, R.O. Loutfy, S.E. Sugamori, R.W. Yip, J. Chem. Soc. Faraday m Trans. 169 (1973) 1462.

139. M.V. Encinas, E.A. Lissi, J.C. Scaiano, "Photochemistry of aliphatic ketones in polar solvents", J. Phys. Chem. 84 (1980) 948-951.

140. R. Leuschner, H. Fischer, 'Type I cleavage of triplet acetone in solution studied by time-resolved CIDNP", Chem. Phys. Letters 121 (1985) 554-558.

141. Q.H. Song, Y.P. Xu, S.Q. Yu, C.X. Chen, X.X. Ma, W.F. Wang, S.D. Yao, N.Y. Lin, "Characterization of transient species in laser photolysis of aromatic amino acids using acetone as photosensitizer", Sci. in China Series В Chem. 42 (1999) 561-566.

142. P.J. Hore, R. Kaptein, "Proton Nuclear Magnetic Resonance Assignments and surface accessibility of tryptophan residues in lysozyme ising photoChemically Induced Dynamic Nuclear Polarization spectroscopy", Biochemistry 22 (1983) 1906-1911.

143. T. J. Meyer, "Photochemistry of metal coordination complexes: metal to ligand charge transfer excited states", Pure Appl. Chem. 9 (1986) 1193-1206.

144. A. Juris, V. Balzani, F. Barigelletti, S. Champagna, P. Belser, von Zalewski, A. Coord. • Chem. Rev. 84 (1988) 85-277.

145. K. Kalyanasundaram, Photochemistry of Polypyridine and Porphyrin Complexes; Academic Press: London, 1992.

146. M. D. Newton, N. Sutin, "Electron transfer reactions in condensed phases", Annu. Rev. Phys. Chem. 35 (1984) 437-480.

147. G. Buntinx, O. Poizat, P. Valat, V. Wintgens, R. Righini, P. Foggi, "Transient absorption and resonance Raman studies of the photoreduction of 2,2'-bipyridine by amines", J. Chem. Phys. 90 (1993) 1733-1748.

148. G. Buntinx, R. Naskrecki, O. Poizat, "Subpicosecond transient absorption analysis of the photophysics of 2,2'-bipyridine and 4,4'-bipyridine in solution", J. Phys. Chem. 100 (1996) 19380-19388.

149. A. Harriman, "Photophysics of 2,2'-bipyridyl", J. Photochem. 8 (1978) 205-209.

150. M. Z. Hoffman, M. G. Simic, Q. G. Mulazzani, S. Emmi, P. G. Fuochi, M. Venturi, ^ "One-electron reduction of 2,2'-bipyridine in aqueous solution", Radiat. Phys. Chem. 121978) 111-113.

151. Q. G. Mulazzani, S. Emmi, P. G. Fuochi, M. Venturi, M. Z. Hoffinan, M. G. Simic, "One-electron reduction of aromatic nitrogen heterocycles in aqueos solution. 2,2'-bipyridine and 1,10-phenanthroline", J. Phys. Chem. 83 (1979) 1582-1590.

152. S. Dhanya, P. K. Bhattacharyya, "Laser flash photolysis of 2,2'-bipyridine in aqueous solution", J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 54 (1990) 63-72.

153. E. Castellucci, L. Angeloni, G. Marconi, E. Venuti, I. Baraldi, "Mechanism of deactivation of the low-lying electronic states of 2,2'-bipyridine", J. Phys. Chem. 94 (1990) 1740-1745.

154. В. C. Noble, R. D. Peacock "Spectroscopic studies on the bipyridinium anion", Spectrochim. Acta 46a (1990) 407-412.

155. R. Shapiro, "Chemistry of guanine and its biologically significant derivatives" In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, ed. J. N. Davidson and W. E. Cohn, Academic Press, London, 8 (1968) 73-112.

156. R. H. Linnell, A. Kaczmarczuk, "Ultraviolet spectra of -N=C-C=N- compounds", J. Phys. Chem. 65 (1961) 1196-1200.

157. Yu. P. Tsentalovich, О. B. Morozova, "Laser flash photolysis and time resolved CIDNP study of the photoreaction of 2,2'-dipyridyl with N-acetyl tyrosine in aqueous solutions", J. Photochem. Photobiol., A: Chem. 131 (2000) 33-40.

158. О. B. Morozova, A. V. Yurkovskaya, Yu. P. Tsentalovich, M. D. E. Forbes, R. J. Hore, R. Z. Sagdeev, "Time-resolved CIDNP study of electron transfer reactions in proteins and model compounds", Mol. Phys. 100 (2002) 1187-1195.

159. R. Kaptein, "Simple rules for chemically induced dynamic nuclear polarization", J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1971) 732-733.

160. L. E. G. Eriksson, A. Ehrenberg, "Electron spin resonance study on anionic flavin free radicals", Acta Chem. Scand. 18 (1964) 1437-1453.

161. E. Koenig, Н. Fischer, "Electrospinresonanzuntersuchenger am anionradical des 2,2'-dipyridyl", Z. Naturforsch. 17a (1962) 1063-1066.

162. J.-K. Vollenweider, H. Fischer, J Hennig and R. Leuschner, "Time-resolved CIDNP in laser flash photolysis of aliphatic ketones. A quantitative analysis", Chem. Phys. 97 (1985)217-234.

163. P.J. Hore, R. Kaptein, "Photochemically induced dynamic nuclear polarization (Photo-CroNP) of biological molecules using continuous wave and time-resolved methods", ACS Symp. Ser. 101 (1982) 285-318.

164. J. Bum, H. Fischer, "Degenerate electron exchange of radical ions in liquid solution studied by pulse NMR", Chem. Phys. 161 (1992) 429-435.

165. F. Q. Ngo, E. E. Budzinski, H. J. Box, "Free radicals formation in X irradiated histidine HC1", J. Chem. Phys. 60 (1974) 3373-3377.

166. E.J. Hart, J.W. Boag, "Absorption spectrum of the hydrated electron in water and in aqueous solutions", J. Am. Chem. Soc. 84 (1962) 4090-4095.

167. D.M. Close, W.H. Nelson, E. Sagstuen, in: Electronic Magnetic Resonance of the Solid State; Weil J.A., Ed., p.237, Ottawa: Can. Soc. Chem. 1987.

168. P.D. Wood, R.W. Redmond "Triplet state interactions between nucleic acid bases in solution at room temperature: Intermolecular energy and electron transfer" J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 4256-4263.