Исследование механизма и динамики оксигенации гемоглобина методами кинетической абсорбционной спектроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И АТОМНОЙ ФИЗИКИ " " 1 АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

- 3 МАР 1997

УДК 535.33.43/541.141.7+547.963.4------------

КРУК Николай Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА И ДИНАМИКИ ОКСИГЕНАЦИИ

ГЕМОГЛОБИНА МЕТОДАМИ КИНЕТИЧЕСКОЙ АБСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

01.04.05 — оптика + 03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Минск - 1996

Работа выполнена в Институте молекулярной п атомной физики АН Беларуси.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Джагаров Б.М.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор Холмогоров D.E.

доктор физико-математических наук Лосев Л.П.

Оппонирующая организация: ' Белорусский государственный

I

университет

Защита состоится '//" и/ар/па, 199^ г. в — часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.01.01 в Институте молекулярной и атомной физики АН Беларуси (220072, Минск, пр-т Ф.Скорины, 70).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной и атомной физики АН Беларуси.

Автореферат разослан '6"феврси-1- 199:2 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат физ.-мат. наук

ВАКузьминкий

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Дыхательный белок гемоглобин осуществляет связывание молекулярного кислорода и легких и его транспорт в ткани организма. Гемоглобин представляет собой тетрамернын белок, состоящий из двух типов субъсдиннц - 2-х а- и 2-х р-испей. Каждая субьедишша содержит в качестве активного центра Ре-протопорфирин-1Х (гем), в кагором связывается молекулярный кослород. Гем находится в гидрофобной полости, которая образована близлежащими боковыми цепями аминокислотных остатков белка и • называется гемовым карманом.. Молекула гемоглобина может находиться в двух стабильных состояниях — окенгеннрованном, когда по всех активных центрах связан молекулярный кислород, и дезоксигениропанном, в котором ни один, из активных центров не связал молекулу кислорода. Оксигеннроваиная форма белка является фотолабилыюй, при поглощении кванта света происходит фотоднссоциация молекулярного кислорода. С диссоциацией конкурируют процессы безызлучателыюй дезактивации, приводящие к заселению низколежащих короткоживущнх состояний перенос-зарядовой природы, в силу чего квантовый выход фотодиссоциацин принципиально меньше I. Фотоднссоциация молекулы кислорода приводит к тому, что спектр поглощения гемоглобина в видимой области, обусловленный поглощением простетнческон группы — гема, становится существенно "отличным от спектра- поглощения белка в оксигенированном состоянии. Это позволяет применить для исследования гемоглобина методы кинетической абсорбционной спектроскопии. Кинетика изменения оптической плотности фотонндуцпровашюго поглощения отражает связывание гемоглобина с кислородом. Установлено, что взаимодействие молекулярного кислорода с простетнческон группой контролируется белковой частью молекулы гемоглобина (аллостерическля регуляция), однако природа этих процессов до сих пор во многом остается невыясненной. Причина заключается в большой сложности регуляторных процессов в белке, которые контролируют реакцию взаимодействия активного центра белка с молекулярным кислородом и протекают во временном диапазоне от сотен фемтосекунд до сотен микросекунд. Возможность их прямого исследования появилась сравнительно недавно, с развитием методов и техники спектроскопии с высоким временным разрешением.

Ко времени начала наших исследований'в 1992 г. в литературе приводились противоречивые сведения о величинах первичного у0 и кажущегося квантового выхода фотодиссоциации т. который пропорционален числу молекул кислорода, вышедших из белковой глобулы после акта фотодиссоциацин, и практически не было исследовано их поведение при воздействии на белок различными аллостерическими эффекторами (Н+, СГ, органические фосфаты). Не была определена эффективность выхода а~у/у0 молекулы кислорода из белковой

глобулы после фотодиссоциации. Наконец, не были исследованы динамика геминальной рекомбинации кислорода с гемоглобином и динамика аллостерической регуляции. Такая информация крайне необходима для понимания механизмов функционирования гемоглобина in vivo.

Это обусловило необходимость привлечения методов кинетической абсорбционной спектроскопии для систематического исследования динамики геминальной и бимолекулярной стадий рекомбинации гемоглобина с кислородом и влияния на них различных аллосгерических эффекторов, а также влияния модификации белка и введения сорастворителей.

Связь с крупными научными программами, темами

Результаты, положенные в основу настоящей диссертационной работы были получены в рамках работ по проеюам Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Механизм и динамика оксигенации гемоглобина" — 19921995 гг., № госрегистрации 5006, "Магнитные и спиновые эффекты в реакции оксигенации гемоглобина? — 1996-1997 гг., № госрегистрации 5572 и в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований "Пикосекундная спектроскопия гембелков: гемоглобина и миоглобина" — 1991-1995 гг.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является систематическое изучение методами абсорбционной спектроскопии с временным разрешением явления фотодиссоциации оксигемоглобина человека и динамики последующего взаимодействия белка с молекулярным кислородом; исследование динамики и установление механизма, процессов аллостерической рефляции сродства гемоглобина к кислороду; выяснение механизма влияния на сродство модификации белка и условий среды.

Для выполнения поставленной цели исследования требовалось решить

следующие зааоын:

— исследовать кинетики мономолекулярной геминальной и бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом и определить величину кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН от 4,0 до 11,0;

. — измерить первичный квантовый выход фотодиссоциации оксигемоглобина т0 при различных значениях величины рН раствора;

— определить эффективность выхода а молекул кислорода из белка после акта фотодиссоциации;

— изучить влияние органических фосфатов и ионов Cl" на кинетику связывания гемоглобина с кислородом;

— изучить влияние этилового спирта как сорастворителя на кинетики, геминальной и бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом;

— измерить кинетики связывания кислорода с гемоглобином, модифицированным ковалентным присоединением пиркцоксаль-5'-фосфата, а также при добавлении в раствор 1-аннлинонафтален-8-сульфоната;

— изучить динамику связывания молекулярного кислорода изолированными а- и (5-цепями гемоглобина, а также а- и р-цепями гемоглобина, модифицированными пара-хлормеркурибензоатом, и сравнить результаты с данными, полученными для тетрамерного белка.

Научная новизна работы

— Впервые систематически исследована рН-зависимость кинетик геминальной и бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом в широком диапазоне рН для гемоглобина, находящегося в Я-состоянии четвертичной структуры. Обнаружено, что рН—зависимости константы скорости бимолекулярной стадии ассоциации трилигандиро ванного гемоглобина с кислородом и кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН>6,0 не являются монотонными и обнаруживают экстремум при рН=8,5.

— Получено аналитическое выражение, описывающее кинетику геминальной рекомбинации кислорода с гемоглобином и изолированными а- и р-цепями во временном диапазоне до 1,65 не.

— Экспериментально определена величина первичного квантового выхода фотодисс'оциации оксигемоглобина ус и показано, что она не подвержена влиянию аллостерических эффекторов.

— Показано, что эффективность выхода кислорода из белка в окружающую среду после акта фотодиссоциации а определяется фазой геминальной рекомбинации и аллостеричсская регуляция сродства гемоглобина к кислороду носит динамический характер.

— Показано, что шшяние этанола на функциональные свойства молекулы гемоглобина обусловлено изменением объемной диэлектрической проницаемости раствора е и выражается в увеличении эффективности выхода молекул кислорода из белка, а наблюдаемое уменьшение константы скорости связывания трнлнгандированного гемоглобина с кислородом вызвано увеличением вязкости раствора, причем имеет место зависимость вида ~1 /т0-5.

Научная и практическая значимость работы

Полученные результаты углубляют существующие представления о динамике взаимодействий низкомолекулярных лигондов с белковыми макромолекулами, процессах аллостернческой регуляции функциональных свойств белковых систем и влиянии условий окружения белка на реакцию его пмимодействия с лигандами.

Результаты представляют интерес для специалистов, работающих в области спектроскопии межмолекуляриых взамодействий, фотохимии и фотофизики супрамолекулярных систем молекулярной электроники, ферментативной

кинетики, биофизики и биохимии. Полученные результаты дают важную информацию о механизме и динамике взаимодействия между простетическон • группой белка и лигандом н могут быть использованы в исследованиях других фермент—субстратных реакций, а также при изучении процессов молекулярного узнавания. Результаты работы могут быть полезными при разработке новых лекарственных препаратов и методов диагностики, так как представляют собой систематическое описание динамики связывания гемоглобина с кислородом и влияния на реакцию связывания различных эффекторов и внешних условий.

Разработанные методики определения эффективности выхода молекул кислорода из белка и константы скорости связывания применены в работах, выполненных совместно с Институтом охраны материнства и детства МЗ РБ и Международным институтом по радиоэкологии им. А.Д.Сахарова, которые были посвящены изучению свойств гемоглобина у людей, проживающих на территориях, загрязненных в результате аварии на ЧАЭС.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

— рН—зависимости константы скорости бимолекулярной стации связывания трнлипшдированного гемоглобина с кислородом к'4 и кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН>6,0 не являются монотонными и обнаруживают экстремум при рН=8,5, что свидетельствует о различном влиянии концентрации протонов на взаимодействие гемоглобина с кислородом на отдельных стадиях оксигенации белка.

— Кинетика изменения оптической плотности фотоиндуцированного поглощения, соответствующая геминальнон рекомбинации молекулы кислорода с гемоглобином и изолированными а- и р-цепямн во временном диапазоне до 1,65 не описывается суммой двух экспоненциальных функций А^схр(-1/т,) с хараетерисгическими временами 190 пс и 1,6 не и постоянной составляющей, причем предэкспонеициальные множители А,, А2 и постоянная составляющая А] различны для изолированнных цепей и тетрамерного белка и для последнего подвержены влиянию аллосерических эффекторов.

— Величина первичного квантового выхода фотодиссоцнации у0 равна 0,23± 0,03 и не зависит от концентрации в растворе прогонов Н+, ионов С1-, АТФ н АМФ, в то время как эффективность выхода молекулы кислорода из белковой глобулы определяется концентрацией указанных аллостернческих эффекторов. Влияние эффекторов выражается в изменении доли молекул кислорода, связывающихся непосредственно из гемового кармана белка в ходе сверхбыстрой стадии геминальной рекомбинации (т=190 пс).

— Увеличение величины кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в водно-спиртовых смесях вызывается уменьшением объемной диэлектрической проницаемости раствора е. В то же время первичный квантовый выход фотодиссоциации у0 от концентрации этанола не зависит.

Личный вклад соискателя

Содержание диссертации отражает личный вклад соискателя в настоящую работу. Все основные результаты, 1 пложенные в диссертационной работе получены автором самостоятельно. Постановка задачи исследования принадлежит ниучцому руководителю —-"заведующему лабораторией фотоникн молекул ИМАФ ЛИ Беларуси д.ф.-м.н. Джагарову Б.М.. Измерения бимолекулярной стадии оксигенашш гемоглобина гга установке лазерной абсорбционной спектроскопии с наиосекундным временным разрешением выполнены лично автором. Измерения геминальной стадии рекомбинации гемоглобина с кислородом на установках лазерной абсорбционной спектроскопии с . нпкосекундным временным' разрешением иынашены соавторами работ к.ф.-м.н. Тихомировым С.А. и Гялиепекнм В.А. В этих исследованиях автор участвовал в постановке эксперимента, выполнил математическую обработку полученных кинетических кривых. Результаты, опубликованные в работе в соавторстве с к.ф.-м.н. Гульбинпсом В. (Институт физики АН Литвы) в днссертациионной работе используются в части, лично полученных автором. Соавторы работ к.х.а. Андрекж Г.М., к.б.н. Заволннк И.Б., к.б.н. Степуро И.И. выполнили выделение гемоглобина из цельной крови, его очистку, модифицировали белок и участвовали в обсуждении полученных результатов. Якугович М.Д. выполнила выделение гемоглобина нч донорской крови, очистку от органических фосфатов к принимала участие и нршотоатснип буферных растворов.

Апробации результатов работы

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на VIII-м н 1Х-м Международных Симпозиумах "Сверхбыстрые процессы в спектроскопии" (Вильнюс, Литва, 1993, Триест, Италия, 1995), Республиканской конференции молодых ученых но квантовой электронике (Минск, 1994), 5-й и 6-й Международных конференциях "Применения лазеров в штуках о Жизни" (Минск, 1994, Йена, Германия, 1996), 1-м и И-м съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994, 1996), 15-й Международной конференции но когерентной и нелинейной оптике (Санкт-Петербург, Россия, 1995), Симпозиуме но физической органической фотохимии (Познань, Польша, 1995), ХУП-й Международной конференции по фотохимии (Лондон, Великобритания, 1995), У1-й Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Лилль, Франция, Г995), Международном Симпозиуме "Фотохимия и фотофизика молекул и ионов", посвященном 100-летию со дня рождения академика А.Н.Терснина (Санкт-Петербург, Россия, 1996).

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных рабог, в том числе 6 научных статей и 12 тсзнсов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, которые включают обзор литературы, методы и материалы исследования, результаты, исследований и их обсуждение, а также выводов. Список цитируемой литературы включает 284 литературных источника. Днссертационнная работа изложена на 172 машинописных страницах и содержит 6 таблиц и 41 рисунок.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко рассмотрено состояние исследуемой проблемы.

О общей характеристике обоснована актуальность проблемы, сформулирована цель работы, поставлены задачи, определена научная новизна н практическая значимость работы, приведены защищаемые положения и сведения о публикациях по теме диссертации."

В Главе 1 представлен обзор литературы по исследование строения молекулы гемоглобина н его взаимодействия с лигандамн. Кратко рассмотрены физико-химические свойства молекулы гемоглобина и основные достижения в изучении явлений кооперативного связывания лигандов и гетеротропной регуляции, которые имелись к началу исследований. Рассмотрены релаксационные процессы й белках н их роль в реакции связывания лигандов, отмечено, что для описания реакции может быть привлечена модель последовательных потенциальных барьеров для связывания. Приведен критический анализ работ по исследованию фотодиссоциацнН н связывания лигандов с гемоглобином. Указана решающая роль прямых измерений кипелгик связывания гемоглобина с кислородом для установления механизма аллостернческой регуляции.

Р Главе 2 содержатся данные о методах исследования и технике эксперимента. Изложена методика проведения экспериментов по исследованию динамики связывания ки. .орода с гемоглобином. Описаны установки лазерной кинетической абсорбционной спектроскопии с нано- и пикосскундным временным разрешением. Проанализированы возможные источники погрешностей измерений и оценена их величина. При определении значения к4* она составляет не более 8+10%, для у — не более 12+15%. Здесь также приведены сведения о методиках выделения оксигемоглобина из донорской крови, его очистке, а также о приготовлении буферных растворов и модификации белка.

В Главе 3 описаны результаты исследования динамики аллостернческой гетеротропной регуляции взаимодействия гемоглобина с кислородом.

В разделе 3.1 представлены результаты исследования по влиянию концентрации протонов (рН раствора) на динамику связывания с молекулярным

кислородом трилигондированного гемоглобина НЬ(С>2)3, находящегося в состоянии с высоким сродством к лига иду (11-состояние четвертичной структуры белка).

В подразделе 3:1.Г приведены результаты измерения рН-зависимости константы скорости бимолекулярной стадии связывания гемоглобина с кислородом и кажущегося квантового выхода фотодиссоциацин оксигемоглобина. Установлено, что указанные зависимости имеют экстремум при рН=8.5 и при дальнейшем увеличении рН константа скорости уменьшается при одновременном увеличении кажущегося квантового выхода фотодиссоциашги (Рис.1).

Рнс.1 Зависимость константы скорости к'4 бимолекулярной стадии связывания ПЬ(0,)3 с 02 и кажущегося квантового выхода фотодпссоциации г от величины рН. Концентрация гемоглобина — 1,5-10—3М. Линией показана апрокснмация с помощью уравнения Гендерсона— Хассельбалха.

Установлено, что рН-зависимостн описываются при помощи трех величин Р^Ж =5,510,1, 7,3+0,1 и 9,1+0,1, веса которых относятся как 0,44:1,0:0,4. Показано, что белок реагирует на изменение концентрации двояко: с одной стороны изменяется количество молекул кислорода, покидающих белковую глобулу, с другой — изменяется скорость связывания. Наряду с согласованным изменением состояния четвертичной структуры белка имеют место конформационные перестройки третичной структуры, причем обнаружено, что в области рН>8,5 эффект Бора для трклигандировлнного гемоглобина маскируется эффектом для дн- и монолиганднроианного белка, а кислотный эффект Бора для трилигандированного гемоглобина выражен также ярко, как и п случае предельного эффекта Бора.

В подразделе 3.1.2 приведены результаты определения первичного квантового выхода фотодиссоциацин для растворов с различной величиной рН.

Установлено, что величина первичного квантового выхода фотодиссоииации }0 не зависит от величины рН раствора и равна 0,23+0,03. Эффективность выхода молекул кислорода из белковой глобулы а является функцией рН. На основании анализа экспериментальных величин у0 и- y Для различных значений рН установлено, что аллостсрнческая регуляция протонами сродства гемоглобина к кислороду имеет дшшигчсскнП характер.

.В подразделе 3.1.3 приведены результаты исследования геминальной стадии связывания-трнлигандированного гемоглобина с кислородом п изучению влияния рН на ее характеристики. Установлено, что кинетика геминальной рекомбинации не является моноэкспопенцнаЛьной и обнаруживает рН-завнснмость. Изменение оптической плотности наведенного поглощения, соответствующее геминальной стадии связывания, описывается выражением:

A(t)=A1-cxp(-t/tI)+A2-cxp(-t/T2)+A3, где A(t) — нормированное число молекул дезокенгемоглобина. Соответственно, А(0)=А|+А2+А3=1. Измерения проверены в диапазоне рН от 6,0 до 9,4 (Табл.1).

Таблица I. Величины характеристических времен короткожнвущего и долгоживущего компонентов ц, т2, их веса Ль А2, постоянная составляющая А3 , а также величина эффективности выхода молекул кислорода из белка а и величина кажущегося квантового выхода фотодиссоциацни у для различных величин рН.

рН А, а2 АЭ т,. пс т2, пс а у,%

6.0 0.280 (Г 505 0.215 190 1600 0.150 3.45

6.8 0.300 0.500 0.200 190 1600 0.139 3.20

7.0 0.310 0.500 0.190 190 1600 0.133 3.05

7.2 0.320 0.500 0.180 190 1600 0.126 2.90

7.4 0.330 0.500 0.170 190 1600 0.120 2.75

7.7 0.355 0.490 0.155 190 1600 0.109 2.50

8.0 0.385 0 70 0.145 190 1600 0.102 2.35

8.5 0.395 0.470 0.135 190 1600 0.096 2.20

9.4 0.360 0.490 0.150 190 1600 0.104 2.40

Характер рН-зависимости определяется эффективностью связывания молекул кислорода непосредственно из гемового кармана в ходе сверхбыстрой стадии геминальной рекомбинации с характеристическим временем 190 пс (Рнс.2). Показано, что компонент с характеристическим временем 1,6 не от pli практически не зависит.

На основании полученных характеристик геминальной и бимолекулярной' стадий связывания рассчитаны модельные кинетики связывания гемоглобина с кислородом для ряда рН.

В разделе 3.2 приведены результаты исследования влияния анионов на динамику взаимодействия гемоглобина с кислородом.

---------Б подразделе 3.2.1 изложены результаты влияния ионов С1~ на динамику

взаимодействия юмоглобнпа с кислородом. Установлено, что в растворе с концентрацией КаС! 1М величина кажущегося квантового выхода фотоднссоциацнгг существенно увелнчнпоется, причем для рН=б,0 наблюдается увеличение п -1,3 раза, а для рН=8,5 — в 2 раза. Этот факт приводит к тому, что величина у от рН не зависит и составляет 0,045, копеташа скорости связывания при -ЛОМ не изменяется. Показано, что первичный квантовый выход фотоднссоциации в растворе с высокой ионной силой не нзменяспся, а наблюдаемое увеличение эффективности выхода молекул кислорода из белка . объясняется уменьшением эффективности сверхбыстрой столиц рекомбинации (* = 190 пс).

Рис.2 рН-зависнмость кажущегося кв.иггойого выхода фотоднссоциацни у (о) и величины 3-А, (*). Линией показана апроксимация с помош.ло уравнения Гендерсона— Хассельбалха.

В подразделе 3.2.2 представлены результаты исследования концентрации органических фосфатов на динамику взаимодействия гемоглобина с кислородом. Показано, что прксугствие 2,3—ДФГ приводит к уменьшению величины к'4 и увеличению величины а. При этом рН--зависимость у обеих величии сохраняется, однако происходит уменьшение величины рК,^, от 7,3 до 6,9. Исследована зависимость величины у от концентрации в растворе АТФ и ЛМФ и показано, что при увеличении» концентрации фосфатов в растворе до 2-10"4М АТФ и 8+9-10 •'М ЛМФ величина у вырастает в~1,2 раза и далее не изменяется, что обясмено тем, что при данных концентрациях фосфатов и белка (2.5-10-5М) все места связывания на белке заняты. Различие в концентрациях фосфатов обусловлено различием констант связывания с белком. Зависимости величин к'4 и у от рН в

растворе с концентрацией АТФ 4,1- !0~4М могут быть охарактеризованы рКэфф=7,1. Установлено, что величина у0 при добавке АТФ не изменяется к полученные изменения величины эффективности выхода из белка а полностью объясняются изменением эффективности сверхбыстрой стадии геминальной рекомбинации.

Исследования, результаты которых изложены в Главе 3, позволили установить, что присутствие в растворе гемоглобина 2,3—ДФГ, АТФ, АМФ и ионов С1— приводит к уменьшению величины к'4 и увеличению величины у. Увеличение величины а обусловлено уменьшением эффективности сверхбыстрой стадии геминалыюй рекомбинации из гемового кармана. Более протяженные стадии геминальной рекомбинации не испытывают влияния аллостерических эффекторов. Отсутствие влияния рН па величину эффективности выхода молекул кислорода из белка а в случае высокой концентрации в растворе ионов С1- и существование рН—зависимости для 2,3—ДФГ и АТФ, обусловлено, по-виднмому, различием в конформацнонных изменениях белка при связывании данных анионов.

В Главе 4 изложены результаты исследования влияния этанола как сорастворителя на функциональные свойства молекулы гемоглобина и исследования динамики оксигеиации модифицированного гемоглобина и изолнрованнных а- и р-цепей.

В разделе 4.1 приведены результаты исследования по выяснению механизма влияния этанола на функциональные свойства молекулы гемоглобина. Установлено, что при добавке этанола уменьшается эффектнвность геминальной рекомбинации и увеличивется доля молекул кислорода, выходящих из белкопой глобулы в раствор после акта фотодиссоцнашш. В исследованном интервале концентраций этанола (до 4,5М) его влияние на структуру и функциональные свойства молекулы гемоглобина определяется изменением диэлектрической проницаемости раствора. Наблюдаемые изменения величины к'4 обусловлены увеличением вязкости раствора, причем имеет место зависимость вида к.'4~ 1///)-5. Онаружсно, что при инициированном этанолом окислении оксигемоглобина в гемихром в области гемового кармана протекают значительные конформационные изменения, приводящие к более чем двукратному увеличению эффективности выхода молекул кислорода из белковой глобулы в раствор после фогодиссоциации.

В разделе 4.2 приведены результаты исследования динамики оксигеиации модифицированного гемоглобина и изолнрованнных а- и р-цепей.

В подразделе 4.2.1 изложены результаты изучения влияния модификации гемоглобина пнридоксаль-5'-фосфатом и 1-аннлннонафтален-8-сульфонатом на его взаимодействие с кислородом. Установлено, что при ковалентиой модификации белка существенно изменяются величины к'4 и у (Табл.2).

Модификация гемоглобина ПЛФ приводит к конформационным перестройкам в белке, приводящим к уменьшению эффективности геминальной рекомбинации и, следовательно, к увеличению эффективности выхода молекул кислорода из белка а. Исличнна константы скорости связывании при этом уменьшается.

Таблица 2. Пслнчпны кажущегося квантового выхода фоюдиссонмации у и константы скорости бимолекулярной стадии ассоциации !;'., для инрчдоксплпрованиого гемоглобина.

рН к'.,, Ю7 (М-с)-' У. "4 Прн.адчзнне

—ПЛФ 1ПЛЦ> —ПЛФ + ПЛФ

6.3 7.4 4,1 3,6 3,4 3,8 Моднф. п дезоксиформс

5 "> 4.5 ! — — Модиф. и дезокелформе

7,4 5,0 4,2 — Модяф. в оксифор\-е

8,8 6,6 5,3 2,3 3,1 Модчф. в дезоксиформе

Обнаружено, что связывание молекул АНС с гемоглобином приподнт к увеличению величины у. При эквимолярном соотношении АНС/гем наблюдаемые изменения достигают максимальной величины Ду/у~15%. Установлено, что увеличение велшшны а сопровождается одновременным изменением вероятности

входа п белковую глобулу, так как величина к',( не изменяется.

Таблица 3. Параметры бимолекулярной стадии связывания «- и р-

ЦСПСН С КИСЛОРОДОМ.

ООразен к',107(У. С)-1 У,%

ЧТь(0,)4 4,7 2,75

•},1 I 5,3

аРмп-0, 4,3 | 5,0

Р-о, 7,1 4,5

5,3 10,8

Таблица 4. Параметры кинетик геминальной рекомбинации, величина эффективности выхода молекул кислорода из белка а для изолированных а- и р-непей, арми- и ррмв-цспей и контрольного образна 1смоглобипа.

Ои£а чен 11Ь(0,), Л, Лч Т|, ПС Г}, НС «,%

0,33 0.50 0,17 1У0 1,6 0,12

а-О, 0.05 0,66 0,29 ¡90 1,6 0,23

цРМВ.О, 0,05 0,675 0,275 190 1,6 0.22

Р-О, 0.30 0,38 0.32 190 1,6 0,20

прмв_0, 0,00 0,25 0,75 — 1,6 0,47

В подразделе 4.2.2 приведены результаты исследования взаимодействия с молекулярным кислородом изолированных цепей гемоглобина и илияния на их оксигенацию модификации РМВ. Определены величины константы скорости связывания к' и величины кажущегося квантового выхода фотодиссоцнацин у (Табл.3).

Впервые исследованы кинетики геминлльной рекомбинации с кислородом изолированных а-, р-, аРМВ- и рРМВ-цепей (Табл.4). Установлено, что наиболее сильные отличия по сравнению с гемоглобином наблюдаются для ррмв-цепи. Компонент с характеристическим временем 190 пс в кинетике отсутствует. Показано, что причина таких сильных изменении функциональных свойств белка заключается в том, что модификация происходит вблизи гема, так как р93Цнс, к которому присоединяется молекула РМВ, является соседним с проксимальным гистндином аминокислотным остатком. Сборка цепей в тара мерную молекулу приводит к нивелированию индивидуальных свойств цепей. Первичный квантовый выход фотодиссоциации у0 одинаков для а- и р-цепей и совпадает с величиной, полученной для тетрамерного гемоглобина. Модификация РМВ не оказывает влияния на величину у0.

ВЫВОДЫ

— рН-зависимости константы скорости бимолекулярной стадии связывания гемоглобина с кислородом и кажущегося квантового выхода фотодиссоцнацин оксигемоглобнна в диапазоне рН от 4,0 до 11,0 могут быть описаны при помощи трех величин рКэфф = 5,5+0,1, 7,3±0,1 и 9,1+0,1, веса которых относятся как 0,44:1,0:0,4. Указанные рН-зависимостн имеют экстремум при рН=8,5. При рН>8,5 константа скорости уменьшается при одновременном увеличении кажущегося квантового выхода фотодиссоцнацин.

— Эффективность выхода молекулы кислорода из белковой глобулы поел* акта фотодиссоциации определяется тремя стадиями геминальнон рекомбинации сверхбыстрой (т=190 пс), которая соответствует связыванию молекулярной; кислорода непосредственно из гемового кармана, быстрой (т=1,6 не), в теченж которой происходит рекомбинация из объема белка, и медленной (т~50 не) которая соответствует связыванию нз пограничной области белок-буферньн раствор. ■

— Механизм аллостерической регуляции сродства гемоглобина к кислород; протонами, С1— и органическимим фосфатами заключается в изменении дол1 молекул кислорода, связывающихся непосредственно нз гемового кармана белка ходе сверхбыстрой стадии геминальнон рекомбинации (т=190 пс), и имеет, гаки» образом, динамическую природу.

— Величина первичного квантового выход а фотоднссоцнацнн уа составляет 0,23±0,03 и не зависит ни'от величины рН, нн от присутствия других аллостерических эффекторов.

— Влияние этанола на структуру и функциональные свойства молекулы гемоглобина определяется изменением диэлектрической проницаемости раствора. При инициированном этанолом окислении гемоглобина в ге.чихром у неокнсленных субъелиниц в области гемового кармана протекают значительные конформационные изменения, приводящие к более чем двукратному увеличению гффективности выхода молекул кислорода из белковой глобулы п раствор после фотодиссониацни. Наблюдаемое уменьшение константы скорости связывания грилигандированного гемоглобина с кислородом вызвано увеличением вязкости раствора, причем имеет место зависимость вида /if'>s.

— Эффективность выхода из белковой глобулы у изолированных а- н р-лепей в ~2 раза больше, чем у тстрамера гемоглобина. При модификации полированных цепей РМВ эффективность выхода у а-цепей не изменяется, аур ■цепей становится в -5 раз больше, чем у тетрамера гемоглобина. Различия >бусловлены существенными изменениями в эффективности связывания лолекулярного кислорода непосредственно из гемового кармана. Первичный жштовый выход фотодиссоциации кислорода у0 одинаков для о- и р-цепей и :овпадает с величиной, полученной для тетрамериого гемоглобина. Модификация 7МВ не оказывает влияния па величину у0.

— Для пиридоксилированного гемоглобина и гемоглобина^ юдифицщюванного ЛНС, наблюдается увеличение эффективности выхода юлскул кислорода из белка после акта фотодиссоциацин.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ . Laser picosecond and nanosecond flash-photolysis of hemoglobin: excited states pectra and lifetimes, oxygen phui -dissociation and recombination, the pH-elTect / B.M. Jzhagarov, N.N. Kruk, S.A. Tikhomirov, V.Gulbinas, G.M.Andreyuk // Lith. J. of

'hysies. - 1994. - Vol. 34, № 1-2. - P. 108-113.

. Джагаров Б.М., Крук H.H. Щелочной эффект Бора: регуляция связывания Oj с рилнгандированным гемоглобином НЬ(02)з // Биофизика. - 1996. - Т. 41, № 3. -:. 606-612.

. Laser kinetic spectroscopy studies of the reaction of human hemoglobin with toleciilar oxygen / B.M. Dzhagarov, N.N. Knik, S.A. Tikhomirov, 1.1. Stepnro // .A.Apanasevich et a!., Eds., Proceedings SP1E. - 1995. - Vol. 2370. - P. 232-241. . Picosecond time-resolved sj>ectroscopy of hemoproteins / B.M. Dzhagarov, N.N. .n»k, S.A. Tikhomirov, G.M. Andreyuk // J.-C. Merlin el al„ Eds., Spectroscopy of iological Molecules. -1995. - Kluwer Academic Publishers, P. 239-240. , The study of the excited states of high- and low-spin mcthemoglobin derivatives by icosecond spectroscopy / N.N. Kruk, S.A. Tikhomirov, G.M. Andreyuk, B.M.

Dzhagarov // O.Svelto et al., Eds., Ultrofast processes in Spectroscopy-IX. - 1996. -Plenum Publishing Corporation, P.523-526.

6. Hemoglobin Oxygenation Dynamics on Picosecond Time Scale / B.M. Dzhagarov, N.N. Kruk, S.A. Tikhomirov, V.A. Galievsky // O.Svelto et al., Eds., Ultrafast processes in Spectroscopy-IX. - 1996. - Plenum Publishing Coiporation, P.497-502.

7. Крук H.H. Исследование механизма эффекта Бора методом лазерной абсорбционной спектроскопии // Республиканская конференция молодых ученых по квантовой электронике: Тез. докл. конф. - Минск, 1994. - С. 42.

8. Laser kinetic spectroscopy studies of the reaction of human hemoglobin with molecular oxygen / Dzhagarov B.M., Kmk N.N., Tikhomirov S.A., Stepuro I.I. // 5th International Conference on Laser Applications in Life Sciences: Book of abstr. -Minsk, 1994. - P.49. -

9. Джагаров Б.М., Крук H.H., Тихомиров СЛ. Механизм и динамика оксигенации гемоглобина // I съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл. - Минск, 1994. - С. 45.

10. Dzhagarov В.М., Kruk N.N., Tikhomirov S.A., Picosecond dynamics of oxygen motion in the interior of hemoglobin // 15th International Conference on Coherent and Nonlinear Optics: Technical digest, Vol.2. - St.-Peterburg, 1995, P. 373-374.

11. Dzhagarov B.M., Kruk N.N., Tikhomirov S.A., Laser kinetic spectroscopy studies of the Bohr effect on hemoglobin oxygenation // Symposium on Physical Organic Photochemistry: Abstracts. - Poznan, 1995. - P. ИР-27.

12. Dzhagarov B.M., Kruk N.N., Tikhomirov S.A., Picosecond and nanosecond flash-photolysis study of the photodissociation and rebinding of dioxygen in gemoglobin // XVIIth International Conference on Photochemistry: Book of abstr. - London, 1995. -P. 4P17.

13. Dzhagarov B.M., Kmk N.N., Tikhomirov S.A., Hemoglobin Oxygenation Dynamics on Picosecond Time Scale // IX International Symposium on Ultrafast processes in Spectroscopy: Technical digest. - Trieste, 1995. - P. ThE4.

14. The study of the excited states of high- and low-spin methemoglobin derivatives by picosecond spectroscopy / N.N. Kruk, S.A. Tikhomirov, G.M. Andreyuk, B.M. Dzhagarov // IX International Symposium on Ultrafast processes in Spectroscopy: Technical digest. - Trieste, 1995. - P. ThPll.

15. Крук H.H., Джагаров Б.М., Заводник И.Б. Оксигенация гемоглобина i присутствии алифатических спиртов // II съезд Белорусского общестш фотобиологов и биофизиков "Молекулярно—клеточные основь функционирования биосистем": Тез. докл. - Минск, 1996. - С. 97.

16. Анион—зависимый эффект Бора: динамика оксигенации гемоглобина / Н.Н Крук, Б.М. Джагаров, М.Д. Якутович, Г.М. Андреюк // II съезд Белорусской общества фотобиодогов и биофизиков "Молекулярно—клеточные основь функционирования биосистем": Тез. докл. - Минск, 1996. - С. 98.

17. Dzhagarov B.M., Kruk N.N., Tikhomirov S.A. Pliotophysics and photochemistry of hemoglobin // Terenin Memorial International Symposium on photochemistry and photophysics of molecules and ions: Abstacts. Vol.2. - St.-Peterburg, 1996. - P. 161.

18. Picosecond time scale events in heme proteins: photophysics, ligand rebinding — dynamics and protein conformational relaxation / B.M. Dzhagarov, N.N, Kruk, S.A. Tikhomirov, V.A. Galievsky // 6th International Conference on Laser Applications in Life Sciences: Book of abstr. - Jena, 1996. - P. TL10-2.

РЭ310МЭ КРУК MiKxiail MiKaJiaeniH ДАСЛЕДАВАННЕ MEXAH13MAI ДЫНАМ1К1 АКС1ГЕНАЦЫ1 ГЕМАГЛАБ1НА .

МЕТАДАМ1 КШЕТЫЧНАЙ АБСАРБЦЫЙНАЙ СПЕКТРАСКАПИ Ключавьш словы: кшетычная спектраскатя, несгацыянарнае паглынанне, узбуджаныя электронныя станы, фотадысацыяцыя малекулярнага юсларода, акагенацыя, гемаглабш, аластэрычныя гетэратропныя эфектары.

МетадаМ! абсарбцыйнай спектраскапн з часавым распазнаваннем (10~|2-10~3 с) даследавана динамика акагенаикн гемаглаб'ша чалавека. Вывучаны рН-залежнасц! кшетык б(малекулярнай i гемшальнай стадий звязвання

трьипгандз!раванага гемаглабша з мслародам i вызначаны велгчыш г.ершаснага квантавага выхала фотадысацыяцьн i эфекты?насш выхада мадекул юсларода э бялковай глобулы. Атрыманы аналпгычны выраз, яю а п ¡свае дынамжу гемшальнай рэкамбшацьн гемаглабша i ¡залявапых a- i р-ланцугоу з юслародам. Вывучаны уплыу анюнау на дынакнку рэакцьн акедгенацьн. Установлены механ!зм уплыву этанола на функцыянальныя уласшвасщ малекулы гемаглаб'ша. На шэрагу прыкладау даследаваны уплыу мадыф1кацьн бялку на я го функцыянальныя ^ласшвасш.

РЕЗЮМЕ КРУК Николай Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА И ДИНАМИКИ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА МЕТОДАМИ КИНЕТИЧЕСКОЙ АБСОРБЦИОННОЙ

СПЕКТРОСКОПИИ Ключевые слова: кинетическая спектроскопия, нестационарное поглощение, возбужденные электронные состояния, фотоднссоциация молекулярного кислорода, оксигенация, гемоглобин, аллостсрическис гетеротропные эффекторы.

Методами абсорбционной спектроскопии с временным разрешением (1012103 с) исследована динамика окенгенации гемоглобина человека. Изучены рН-зависимости кинетик бимолекулярной и геминальной стадий связывания

трилигандированного гемоглобина с кислородом и определены величины первичного квантового выхода фотодиссоциацин и эффективности выхода молекул кислорода из белковой глобулы. Получено аналитическое выражение, описывающее динамику геминалыюй рекомбинации гемоглобина и изолированных а- и р-цепей с кислородом. Изучено влияние анионов на динамику реакции оксигенации. Установлен механизм влияния этанола на функциональные свойства молекулы гемоглобина. На ряде примеров исследовано влияние модификации белка на его функциональные свойства.

ABSTRACT KRUK Nicolay Nicolaevich STUDY OF MECHANISM AND DYNAMICS OF THE HEMOGLOBIN OXYGENATION BY KINETIC ABSORPTION SPECTROSCOPY Key words: kinetic spectroscopy, transient absorption, excited electronic states, photodissociation of molecular oxygen, oxygenation, hemoglobin, allosteric heterotropic effectors.

The dynamics of the human hemoglobin oxygenation has been studied by time-resolved (10",2-10"3 s) absorption spectroscopy. The pH-dependencies of the bimoleculai and geminate stages of the binding of triliganded hemoglobin with oxygen have been investigated and values of the photodissociation priniary quantum yield and efficiency ol oxygen molecules exit from protein matrix have been determined. The analytic expression describing the dynamics of the oxygen geminate rebinding with hemoglobir and isolated a- and p-chains have been obtained. The anions influence on the oxygenation reaction dynamics have been studied. The mechanism of the cthanol influence on the hemoglobin molecule functional properties have been established. For a number of examples the influence of protein modification он its functional properties ha' been studied.

КРУК Николай Николаевич

ИССДЕДООЛТШЕ МЕХАНИЗМА И ДИНАМИКИ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА МЕТОДАМИ КИНЕТИЧЕСКОЙ АБСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Подписано к печати 05. О/.199 7г. Формат 60x90 1/16. Бумага тшкирафская. Печать офсетная. Объем 1.25 пл. Тираж 100 экз. Заказ 4.

Институт молекулярной и атомной физики АНБ 220(172, Минск, нр-т Ф.Скорины, 70. Отпечатано на ро1анринтс БГУ 220080 Минск, ул. Бобруйская, 7