Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов

Пастухов, Александр Вениаминович

Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Пастухов, Александр Вениаминович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Черноголовка МЕСТО ЗАЩИТЫ

2000 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов»

Автореферат диссертации на тему "Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов"

РГ5 ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 2'з !ЗСЗ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ

На правах рукописи

ПАСТУХОВ АЛЕКСАНДР ВЕНИАМИНОВИЧ

УДК 535.373

Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов.

02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Черноголовка 2000

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор А.И.Котельников кандидат физико-математических наук, с.н.с. В.Р.Фогель

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.З.Пащенко доктор физико-математических наук, в.н.с. В.А.Смирнов

Ведущая организация:

Филиал Института энергетических проблем химической физики РАН

Защита состоится «(РЬ 2000 г.

//Г

в /и час.

на заседании специализированного совета Д 200.08.02 при Институте проблем химической физики РАН по адресу: 142432, Московская обл., П.Черноголовка, Институтский проспект, 14, Институт проблем химической физики РАН, корпус общего назначенш

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПХФ РАН Автореферат разослан « 01 » ИОсЛС)\^{ 2000 г. Ученый секретарь ,

специализированного совета у //

доктор химических наук ^ ~^^^>Г.С.Джабиев

Р ^ Г)

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Влияние, которое растворитель оказывает на химические реакции, протекающие в растворах, в течение многих десятилетий является одной из фундаментальных проблем физической химии. Первоначально внимание исследователей было преимущественно сконцентрировано на равновесных эффектах растворителя, таких как изменение потенциальной энергии реагентов и продуктов реакции по сравнению с их энергиями в газовой фазе. Однако, в последние годы стало ясно, что во многих быстрых реакциях динамика растворителя может иметь критическое значение для их протекания. Наиболее ярко динамический эффект растворителя проявляется в реакциях с переносом заряда. Быстрота, с которой растворитель откликается на перераспределение заряда в реакционной системе, может оказывать влияние как на скорость, так и на выход реакции. Существующие на сегодняшний день теории неравновесной сольватации развиты для процессов в чистых, однородных растворителях. На практике большая часть химических реакций протекает в многокомпонентных растворах. Поэтому экспериментальное исследование многокомпонентных растворов является пока основным источником получения информации о молекулярной динамике таких сложных и гетерогенных систем, как переохлажденные жидкости, стекла и белки. Метод регистрации разрешенного во времени стоксова сдвига спектра люминесценции зонда, входящего в состав сложных, гетерогенных систем, позволяет изучать релаксационные процессы в этих системах в широком интервале времен от 10'14 до 10: с.

Стекла и переохлажденные жидкости образуют класс веществ широко распространенных в природе. В стеклообразном или

переохлажденном состоянии могут находиться различные материалы: полимеры, сплавы металлов, коллоиды, эмульсии, биологические макромолекулы - белки, многие органические жидкости и т.д. Таким образом, исследование структурных и динамических свойств стекол и переохлажденных жидкостей представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных знаний, а также для решения разнообразных прикладных задач.

Природные биополимеры - белки представлены во всех формах жизни и выполняют широкий набор функций, в частности, катализируют различные химические реакции. Изучение ферментативных систем направлено, с одной стороны, на выяснение детального механизма каталитического процесса, а, с другой стороны, на создание искусственных модельных систем, обладающих столь же высокой каталитической активностью и субстратной специфичностью, что и природные ферменты. Последние годы интенсивно исследуется проблема связи динамических свойств белков с их функциональной активностью. Различными методами получены данные, подтверждающие тесную корреляцию конформационной подвижности белков с эффективностью осуществляемых ими функций. Развитие новых подходов в исследованиях природы высокой функциональной эффективности биополимеров позволит приблизиться к решению задачи по созданию столь же эффективных модельных систем. Цель работы

Основной целью данной работы было исследование динамических свойств вязких полярных растворителей и белков, определение возможной корреляции между внутри молекулярной динамикой белков и осуществляемыми ими функциями. Используемые методы: кинетическая фосфоресиентная спектроскопия и регистрация кинетики термической

изомеризации фотохрома, ассоциированного с белком, позволяют проводить одновременное изучение медленной молекулярной динамики и кинетики химических превращений, осуществляемых в одной и той же системе.

Работа проводилась по следующим направлениям:

1. Определение динамических характеристик бинарных вязких полярных стеклующихся растворителей в широком диапазоне температур (103 -262 К).

2. Исследование динамической подвижности гемсодержащих белков и ее влияния на реакцию внутримолекулярного переноса электрона методом кинетической фосфоресцентной спектроскопии.

3. Создание модельных ферментативных систем на основе небольших глобулярных гембелков и детальное исследование зависимости их функций от различных факторов и, прежде всего, от конформационной динамики.

Научная новизна работы

С использованием метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии изучена динамика ориентационной релаксации в низкотемпературных стеклующихся полярных глицерино-водных и этиленгликоль-водных растворах в широком диапазоне температур. Показано существование широкого распределения времен релаксации в исследованных переохлажденных жидкостях. Отработаны методики определения параметров распределений времен релаксации для систем с гетерогенной динамикой.

Получены данные, свидетельствующие о гетерогенной структуре глицериновых растворов. Сделана оценка масштабов и динамики реструктуризации гетерогенных областей в 94% глицерино-водном растворе при 237 К.

Изучена молекулярная динамика и кинетика реакции внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-метмиоглобин и показана возможность адиабатического механизма реакции переноса электрона в данной системе при низких температурах.

Разработан новый подход, основанный на ускорении термической цис транс изомеризации бетаина стильбазола в присутствии некоторых гембелков, для оценки масштабов и времен медленной, глобальной конформационной динамики этих белков. Практическая значимость работы

В результате проделанной работы получены количественные данные, характеризующие гетерогенную динамику низкотемпературных, стеклующихся водных растворов глицерина и этиленгликоля. Обнаруженные в этих системах структурная неоднородность и возможность существования нескольких фаз при одинаковых условиях имеют важное значение для понимания процессов, протекающих в стеклах и переохлажденных жидкостях.

На основе метода регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина отработана методика определения релаксационных параметров локального окружения в таких микрогетерогенных системах, как глобулярные гемсодержащие белки.

сила среды, температура, вязкость, структура активного центра, природа иона металла, конформационная динамика на каталитическую активность белка.

На основании эффекта ускорения некоторыми гемсодержащими белками термической изомеризации бетаина стильбазола развита методика изучения медленной, крупномасштабной конформационной динамики этих белков.

Личный вклад автора

В диссертации представлены результаты работы, выполненной лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением молекулярной динамики в гетерогенных системах низкотемпературных, вязких стеклующихся растворах и белках - методами кинетической фосфоресцентной спектроскопии и изомеризующихся зондов. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, их проведении и в обобщении результатов исследований.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на 7-й Международной конференции по бионеорганичексой химии, Любек, Германия, 1995 (Seventh International Conference on Bioinorganic Chemistry, September 3-8, 1995, Lübeck, Germany); 3-й Европейской конференции по бионеорганичексой химии, Нордвиджкерхоут, Голландия, 1996 (3rd European Conference on Bio-inorganic Chemistry, August 4-10, 1996, Noordwijkerhoiit, the Netherlands); 5-й Международной конференции по методам и приложениям флуоресцентной спектроскопии, Берлин, Германия, 1997 (Vlh International Conference on Methods and Applications of fluorescence Spectroscopy, September 21-24, 1997, Berlin, Germany); на

Всероссийском совещания «Высокоорганизованные каталитические

системы», 9-10 июня 1998, Черноголовка, Россия; на 2 Съезде биофизиков России, 23-27 августа, 1999 г, Москва, Россия; на 2 Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы», 2000 г, Москва, Россия.

Кроме того, содержание работы докладывалось на заседаниях Ученого совета ИПХФ РАН, научных семинарах ИПХФ РАН и отдела Кинетики и Катализа. Основные результаты диссертации опубликованы в 7 статьях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах, состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и содержит 36 рисунков, 5 таблиц. Список литературы включает 143 наименования.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность выбранной темы работы, сформулирована цель работы и изложены основные результаты, выносимые на защиту.

Первая глава содержит анализ литературных данных, касающихся проблемы сольватационной динамики в полярных растворителях и метода регистрации динамического стоксова сдвига спектра люминесценции зонда в молярном растворителе. Изложены основные принципы теорий сольватационной динамики, начиная с моделей континуального диэлектрика и заканчивая моделями, учитывающими молекулярную структуру растворителя. Проведен об юр имеющихся жсиериментальных данных по регистрации динамическою стоксова сдвига спектра люминесценции зонда в молярных растворителях. Кроме того, рассмотрены современные представления о структурной организации и

конформационной подвижности белков, их связи с функциональной активностью, в частности, с реакцией переноса электрона.

Использование простых континуальных моделей, рассматривающих растворитель как непрерывный однородный диэлектрик, характеризуемый дебаевским временем релаксации приводит к экспоненциальному затуханию сольватационной динамики с характеристическим временем ?1.=(£я/£о)Тс1 - временем продольной релаксации поляризации растворителя. Как показывает эксперимент, в большинстве растворителей характер затухания сольватационной динамики неэкспоненциален, а среднее время релаксации <ъ> лежит в диапазоне г£ -ь г^. Такой характер поляризационного отклика растворителя в ответ на изменение дипольного момента молекулы растворенного зонда обусловлен существованием в реальном диэлектрике распределения по временам релаксации, что, в свою очередь, обусловлено молекулярной природой растворителя.

Белки являются природными высокоорганизованными макромолекулярными системами. Они обладают высоким уровнем пространственной организации, но в то же время должны допускать широкое распределение информационных движений как по временам, так и по амплитуде, что связано с их функциональной активностью. Белки проявляют свойства кристаллических и жидких тел, но в большей степени сходны со стеклами. Как и для стекол, для белков характерна неэкспоненциальность релаксационных процессов, неаррениусова температурная зависимость, метастабильность ниже температуры стеклования, «шероховатая» поверхность конформационной свободной • энергии, наличие распределения по скоростям релаксации. В то же время белки обладают рядом своих особенностей. Во-первых, они являются мезоскопическими системами. Во-вторых, распределение скоростей релаксации не является непрерывным. Это вызвано тем, что белки имеют

иерархическую организацию конформационных подсостояний. Поэтому существует конечный набор высот энергетических барьеров, разделяющих конформационные подсостояния различного уровня. Это, в свою очередь, означает дискретность распределения скоростей релаксации между конформационными подсостояниями. Дан обзор литературных данных о временном диапазоне конформационных движений белков.

Связь конформационной динамики белков с их функциональной активностью рассматриваются на примере реакции переноса электрона в белках. Дается краткое изложение теории Маркуса по переносу электрона в полярных средах и результаты ее последующего развития. В приложении к переносу электрона в белках в настоящее время преимущественно используется неадиабатический предел теории Маркуса, согласно которому скорость реакции переноса критическим образом зависит от квадрата матричного элемента перекрывания волновых функций донора и акцептора электрона. Однако, как показывают результаты теоретических и некоторых экспериментальных работ, в случае, когда матричный элемент достаточно велик или же динамика полярной среды является достаточно медленной по сравнению со скоростью переноса электрона, может реализоваться адиабатический режим реакции. В этом пределе скорость переноса будет определяться характеристической частотой реполяризации среды.

Во второй главе дается описание экспериментальной установки, методов приготовления образцов и обработки экспериментальных данных. Для исследования сольватационной динамики в низкотемпературных вязких водных растворах этиленгликоля и глицерина, а также молекулярной динамики и внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-миоглобин применялся метод кинетической фосфоресцентной спектроскопии. Использование эозина в качестве

триплетного зонда позволило проводить исследования процессов релаксации с характеристическими временами Ю^-ИО"2 с.

В качестве источника возбуждающего света использовался импульсный лазер ЛИГ - N(1. Спектр фосфоресценции эозина сканировался с шагом 5-6 нм. На каждой длине волны записывалось по 10 кинетических кривых затухания фосфоресценции. В целом по полосе записывалась кинетика затухания фосфоресценции на 12-15 длинах волн.

-1

V, см

Рис.1. «Мгновенные» спектры фосфоресценции эозина в 94% глицерино-водной смеси при 203 К. Экспериментальные данные представлены точками, сплошные линии - результат описания экспериментальных данных с помощью log- нормального распределения. Числа обозначают время в микросекундах с момента возбуждения сигнала фосфоресценции.

После усреднения кинетических кривых, на основе метода спектральной реконструкции строились «мгновенные» спектры фосфоресценции эозина, рис.1. Форма линии мгновенных спектров описывалась с помощью полинома и 1оц-нормалыюго распределения. С использованием мгновенных спектров получали кривые спектральной релаксации и нормированную релаксационную функцию стоксова сдвига С(0 фосфоресценции эозина:

ПО

\V) И <>) ill))" И"°)'

(I)

где I¡(О), у(0 и у(оо) - положения некоторой характеристической точки спектра в моменты времени 0,1 и х> соответственно.

В качестве модельной ферментативной системы использовался комплекс мероцианинового красителя, бетаина стильбазола М, и метмиоглобина. В эксперименте регистрировалась кинетика термической цис транс изомеризации. Цис-изомер получали из исходного трансизомера путем фотохимической изомеризации при облучении УФ-светом на 366 нм. В качестве источника света использовалась ртутная лампа <ысокого давления ДРК-120. Кинетика термической изомеризации регистрировалась спектрофотометрически по поглощению на 372 нм с использованием спектрофотометра «Спекорд-М40».

В третьей главе изложены результаты исследования спектральной релаксации фосфоресценции эозина в вязких стеклующихся водных растворах этиленгликоля и глицерина, находящихся в переохлажденном и застеклованном состояниях.

В пункте 3.1 дается краткий обзор литературных данных, касающихся динамических особенностей переохлажденных жидкостей и стекол.

В пункте 3.2 представлены данные по спектральной релаксации

фосфоресценции эозина в чти лен гл и ко л ь- водн ы х (50, 75 и 90% по объему)

и глицерино-водных (60 и 94% по массе) растворах в температурном

диапазоне 103 - 262 К. Для исследованных систем можно выделить три

характерных области температуры: ниже температуры стеклования

раствора (Ти), несколько выше Тс, и намного выше Т^. Кинетика затухания

фосфоресценции на разных длинах волн во всех трех температурных

диапазонах существенно различна. В застеклованной матрице (рис.2а)

кинетика затухания фосфоресценции экспоненциальна. При этом время

жизни коротковолновых центров ( Г/</,) превышает г,./, длинноволновых

(и

центров вследствие более эффективной безызлучательной дезактивации последних. Кроме того, спектры фосфоресценции являются статически неоднородно уширенными. Как результат, в застеклованных матрицах

наблюдается «синий» сдвиг спектра фосфоресценции эозина (рис.За).

При температурах несколько выше Тст, когда времена релаксации молекул растворителя сопоставимы со временем жизни триплетного эозина, наблюдается разрешенный во времени длинноволновый стоксов сдвиг спектра фосфоресценции (рис.За). При этом вид кинетических кривых на разных длинах волн значительно изменяется (рис.26). На коротковолновом крае спектра фосфоресценции наблюдается быстрое затухание интенсивности фосфоресценции на начальных временах, тогда как по мере продвижения к длинноволновому краю происходит постепенное «разгорание» интенсивности фосфоресценции. Длинноволновый стоксов сдвиг и соответствующее изменение вида кинетических кривых на разных участках спектра обусловлены ориентационной релаксацией молекул растворителя вблизи возбужденного люминофора.

Рис.2. Нормированные кинетические кривые фосфоресценции эозина в 94% глицерино-водной смеси при разных температурах, (а) 149 К; (6) 191 К; (3) 237 К.

13.2 13.1 13.0 14.9 14.8 14.7 14.6

14.3

145,173 К

212.233.237,248 К 220 К

145.1731<

Функция СО) (рис.Зб) непосредственно связана с сольватационной динамикой молекул растворителя и используется для нахождения характеристическ их времен

сольватации. Поскольку во всех исследованных системах затухание функции С(1) было неэкспоненциальным, для аналитического представления

экспериментальных функций С(0 использовались три типа распределений:

а) сумма двух экспонент

/(') = в1 ехр{-/ / г,) + а2 ехр(-* / г2); (2)

б) распределение Кольрауша-Уилльямса-Уотгса (КУУ)

<р{1) = ехр[- / г4 )А ], 0 < Д 51; (3)

в) распределение Коула-Дэвидсона (КД)

212,220 К

Рис.3, (а) Температурные зависимости положения максимума мгновенных спектров фосфоресценции эозина в 94% глицерино-водной смеси, (б) Корреляционные функции стоксова сдвига спектра фосфоресценции эозина в 94% глицерино-водной смеси.

$\Т17Грс1 71Х

Рсо

, й<рсв<\, тйтсо.

(4)

В таблице 1 приведены значения параметров этих распределений, полученные из обработки экспериментальных функций С О) для этилегликоль-водных растворов при 170 К. Степень совпадения экспериментальной (Сжг„) и расчетной (С^,,) корреляционных функций оценивалась по параметру х=ЦСжсп-Срас.У. Как следует из таблицы 1, наиболее точное представление экспериментальных данных достигается при использовании распределения Коула-Дэвидсона. При температурах регистрации динамического стоксова сдвига средние времена сольватационной динамики в исследованных системах находятся в диапазоне 10'Ч 10"2 с.

Таблица 1. Времена орнентационной релаксации в этиленгликоль-водных растворах при 170 К.____

Распределение 50% раствор 75% раствор 90% раствор

Сумма двух

экспонент

а1 0.6 0.68 0,58

а2 0.4 0.32 0.42

т1. МКС 11 31 81

т2. мкс 209 440 1690

<Тч>, мкс 90.2 162 757

х 1.53 0,96 1.1

Распределение КУУ

0.48 0.46 0.46

Тки«, мкс 44.4 73 396

<Тч>, мкс 93.7 176 859

X 1.64 0.7 0.87

Распределение КД

Р., 0.26 0.26 0.24

Т1Ч|. мкс 350 592 3300

<Тч>. МКС 91.4 155 795

г 1.27 0.7 0.7

И рассмотренном температурном диапазоне наблюдаемая динамика

стоксова сдвига может быть искажена вследствие неоднородного уширсния спектра фосфоресценции и различия скоростей бе и.плуча тельной дезактивации триплетов на разных участках спектра. Лналич плюральной ишснсшпшсш фосфоресценции показал, что

влияние неоднородного уширения спектра может сказываться на динамике спектральной релаксации мгновенных спектров на первых 100-200 мкс, в зависимости от температуры и вязкости раствора. Последующая спектральная релаксация полностью обусловлена релаксационными процессами в растворителе.

На основании поведения кривых релаксации максимума мгновенных спектров фосфоресценции эозина в глицерино-водных растворах было сделано предположение о том, что переохлажденные глицериновые растворы состоят из микрогетерогенных областей - кластеров. В пользу данного вывода также свидетельствует наблюдаемое в 94% глицерине при 237 К «разгорание» интенсивности на начальных участках кинетических кривых (рис.2в). «Разгорание» наблюдается на всех длинах волн и имеет характеристическое время 160 ± 20 мкс. Сольватационная динамика молекул растворителя при данной температуре происходит за времена порядка субмикросекунд - микросекунд и поэтому не может быть связана с процессом «разгорания». Наблюдаемый эффект, по-видимому, вызван более крупномасштабными процессами реструктуризации растворителя. В предположении, что «разгорание» вызвано уменьшением рэлеевского рассеяния вследствие декомпозиции кластеров, индуцируемой возбуждением эозина, можно оценить порядок линейных размеров областей неоднородности в 102 А при 237 К.

11ри вычислении функции C(t) для глицерино-водных растворов была предложена модификация уравнения (I). Очевидно, что в случае микро!с'1ср01снных систем величина v(x-) в уравнении (1) должна быть I см пераlypno зависимой. Нсли изменение температуры системы индуцирует изменение струкiypi.i растворителя, окружающею молекулу люминофора, кнда величина потенциальной энергии еисюмы

возбужденный зонд-растворитель а, следовательно , и значение у(<х>) также будут изменяться с температурой.

Для 94% глицеринового раствора наблюдалось также явление полиаморфизма - существование при одних и тех же условиях нескольких аморфных фаз. В данном случае к изменению фазового состояния переохлажденного глицерино-водного раствора приводило изменение режима размораживания застеклованного образца. На основе анализа спектральной релаксации мгновенных спектров фосфоресценции полученная, так называемая «ледяная», фаза была охарактеризована как более жесткая и стабильная по сравнению с переохлажденной жидкостью.

На основании полученных данных был сделан вывод о высокой информативности метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии в исследовании динамических и структурных свойств низкотемпературных вязких многокомпонентных систем. Была отработана методика получения параметров распределений КД и КУУ, характеризующих спектры времен релаксации в системах с гетерогенной динамикой.

В четвертой главе рассматриваются вопросы белковой динамики и ее связи с процессом внутримолекулярного переноса электрона. В качестве исследуемых систем использовались комплексы эозин-апомиоглобин и эозин-метмиоглобин в стеклующихся растворителях.

В пункте 4.1. дается краткий анализ литературных данных, касающихся структуры и функций миоглобина, а также его апоформы.

В пункте 4.2. рассмотрены данные по спектральной релаксации фосфоресценции эозина, ковалентно связанного с концевой аминогруппой эпомиоглобина. Измерения проводились в диапазоне температур 130 - 251 К, в качестве растворителя применялись стеклующиеся вязкие водные эастворы этиленгликоля (50% по объему) и глицерина (60 и 94% по массе). 4а рис.4а представлены зависимости от времени положения максимума

спектра фосфоресценции эозина на апомиоглобине в 60% глицериновом растворе. Характерной особенностью всех изученных систем была значительная неэкспоненциальность релаксационных кривых, на которых можно выделить два существенно различных участка:

быстрый начальный сдвиг

*** 207,237.251К

максимума спектра последующую замедленную релаксацию на больших временах. Такой вид релаксационных кривых можно объяснить значительной микрогетерогенностью белковой макромолекулы, что ведет к двухэтапному характеру диэлектрической релаксации белковой глобулы в ответ на возбуждение люминофора. Начальная быстрая фаза происходит из диэлектрического отклика локальных

полярных групп белка, к которым относятся остатки некоторых аминокислот и пептидные связи, и окружающего растворителя. Медленная фаза обусловлена релаксационными движениями более крупных и удаленных участков белковой макромолекулы.

Рис.4, (а) Температурные зависимости положения максимума мгновенных спектров фосфоресценции эозина на апомиоглобине в 60% глицеринно-водной смеси, (б) Корреляционные функции стоксова сдвига фосфоресценции эозина на апомиоглобине в 60% глицерино-водной смеси.

Для аналитического описания экспериментальных функций С(0 фосфоресценции эозина на апомиоглобине, рис.4б, были привлечены распределения КД и КУУ, поскольку сумма двух экспонент не могла дать удовлетворительного совпадения экспериментальной и расчетной функций. В таблице 2 представлены результаты фиттинга функции С(!) для апомиоглобина в 60% глицерине. Как видно из табл.2, значения параметра Реи лежат в диапазоне 0,05-И),2, который совпадает с данными для белков, полученными другими методами. Такие значения параметра Ры свидетельствуют о существовании широкого распределения времен диэлектрической релаксации в белках с преимущественным, вкладом коротких времен релаксации.

Таблица 2. Времена релаксации для апомноглобнна в 60% глицерино-водной смеси

Распределение 178 К 187 К 207 К

Распределение КД

Ро) 0,05 0,15 0,13

Ты, МКС 31000 1800 210

<ТХ>, МКС 2550 270 27,3

х 7,09 0,72 1,7

Таким образом, использование метода регистрации динамического стоксова сдвига спектра люминесценции зонда, связанного с белком, позволяет получать уникальную информацию о релаксационных характеристиках локального микрогетерогенного белкового окружения

В пункте 4.3. представлены данные по кинетике внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-метмиоглобин. Использование вязких стеклующихся растворителей и проведение эксперимента при пониженных температурах ведут к замедлению конформационной динамики белковой глобулы. В области температур, где скорость собственно реакции переноса электрона и скорость релаксации полярного окружения становятся соизмеримыми, возможен адиабатический режим реакции переноса электрона, при

котором константа скорости переноса электрона (А/./) пропорциональна частоте релаксации окружающего растворителя. Использование метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии позволяет осуществлять одновременное исследование кинетики переноса электрона и

Константа скорости к а определялась по

дополнительному тушению фосфоресценции эозина на метмиоглобине по

сравнению со. временем жизни триплетного

эозина на апобелке:

к kl ~ ~ ш (5)

На рисунке 5 представлены температурные зависимости константы скорости внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин - метмиоглобин в 60% и 94% глицерино-водных растворах соответственно. Из рисунка 5 видно, что размораживание молекулярной подвижности в исследуемых системах сопровождается существенным увеличением k¡j. Сравнение с данными по релаксационной динамике аномиоглобина в 50% этилеш ликоле, (>0% и 94% i лицериноных растворах покатывает, что для температурных шмервалов oí к'мнературы стеклования раствори 1сля Ти до , t.10 К найденные значения к/, ( = 10' с'1 для раствора эшлеш ликоля и ^Н)2 с"' для i лнпер'иноных рас i норов) коррелирую! с оПрашыми значениями времен

релаксационной динамики среды.

т, к

Рис.5. Температурные зависимости константы скорости внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эознн - метмноглобинв 60% и 94% глицерино-водных растворах.

релаксационной подвижности белковой матрицы (~102-И04 с"1) в соответствующих растворах. Поскольку в системе триплетный эозин-метмиоглобин кроме тушения фосфоресценции путем обратимого переноса электрона на гем существует возможность тушения за счет переноса энергии, то рассмотрены аргументы, указывающие на незначительный вклад в процесс тушения фосфоресценции по второму механизму. В итоге сделан вывод о возможности адиабатического режима внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-метмиоглобин при рассмотренных выше условиях.

В пятой главе изложены результаты экспериментов по моделированию ферментативной активности в комплексе метмиоглобин -бетаин стильбазола и исследованию связи конформационной подвижности метмиоглобина с его «каталитической» функцией. Нами было установлено, что в присутствии метмиоглобина скорость реакции термической цис —> транс изомеризации мероцианинового красителя, бетаина стильбазола М, может возрастать на 2-3 порядка. Эксперименты, проведенные с анионными гемовыми лигандами, другими гембелками, апомиоглобином и альбумином, позволили установить, что ускорение термической изомеризации обусловлено координированием бетаина стильбазола по шестому лигандному положению гемового железа, рис.6. С целью определения механизма ускорения термической изомеризации были проведены эксперименты по исследованию кинетики реакции в зависимости от рН, ионной силы раствора, полярности микроокружения, присутствия ингибиторов, степени восстановленности атома железа, а также эксперименты по замене атома железа на атомы Со и

Проведенные исследования позволили предложить два возможных механизма реакции. Первый связан со сдвигом протеолитичес-кого равновесия в системе бетаин стильбазола - гем под действием ближайшего аминокислотного окружения, а также с низкой полярностью

гемового кармана. Второй механизм основан на возможности перераспределения электронной плотности от закомплексованного бетаина стильбазола к атому Ре3+. Наиболее вероятным представляется промежуточный механизм. Были определены константа связывания трансизомера бетаина стильбазола с метмиоглобином («104 М"1), константа Михаэлиса (5,6*10"5 М), константа «каталитической» стадии (»8*10"4 с"1 при рН 6,0).

Поскольку молекула стильбазола является крупным лигандом (13x5x2 А), то ее проникновение и изомеризация в гемовом кармане должны сопровождаться крупномасштабными флуктуациями белковой глобулы. Если процесс конформационных флуктуаций является скоростьопределяющим, то из значения константы скорости «каталитической» стадии можно оценить времена крупномасштабных флуктуаций - порядка 103 с. Но поскольку эта константа зависит от рН и ионной силы среды, ее нельзя однозначно трактовать как скорость

глобальных движений белковой макромолекулы. Для более точного определения скорости конформационных флуктуаций были проведены эксперименты по нестационарной кинетике реакции термической цис —> транс изомеризации, которые позволили оценить константу скорости проникновения бетаина стильбазола в гемовый карман. Она составляет порядка 5*10"3 с'1, что хорошо коррелирует с значением, полученным из стационарной кинетики. Таким образом, можно сделать вывод, что молекула метмиоглобина испытывает в области гемового кармана равновесные крупномасштабные конформационные флуктуации с амплитудой 2-4 А и характеристическими временами порядка 102 -5- 103 с.

Выводы

1. Методом регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина исследована релаксационная динамика вязких водных растворов этиленгликоля (50%, 75% и 90% по объему) и глицерина (60% и 94% по массе) в температурном диапазоне 103 - 262 К. Показано существование широкого распределения времен релаксации в изученных системах. Отработаны методики определения параметров распределения времен релаксационной динамики. Средние времена ориентационной релаксации молекул растворителя исследованных образцов находятся в интервале Ю"5 10'2 с при температурах регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина.

характеристических масштабов неоднородностей - порядка 102 А при 237 К. Предложена модификация процедуры вычисления корреляционной функции стоксова сдвига для гетерогенных переохлажденных жидкостей.

3. Исследована динамика релаксационных процессов в

апомиоглобине и миоглобине, растворенных в вязких стеклующихся

растворителях, в температурном диапазоне 130 - 251 К. Релаксационная

динамика в изученных системах характеризуется значительной

неэкспоненциальностью, что свидетельствует о широком распределении

времен молекулярной подвижности в данных системах. Определены

параметры распределения времен релаксации в изученных системах.

Исследована кинетика внутримолекулярного переноса электрона в

комплексе эозин-метмиоглобин. В температурном интервале Тсг - Тст+30 К

для данного растворителя показана количественная корреляция между /

временами релаксации микроокружения среды и временами внутримолекулярного переноса электрона. Сделан вывод о возможности адиабатического режима реакции переноса электрона в данных условиях.

4. Установлен эффект ускорения термической ifuc —> транс изомеризации мероцианинового, красителя, бетаина стильбазола М, в присутствии метмиоглобина. Исследовано влияние различных факторов: ,рН, ионной силы, присутствия анионных гемовых лигандов, полярности микроокружения, природы иона металла на процесс ускорения термической цис -стране изомеризации бетаина стильбазола. Определено, что ускорение реакции термической изомеризации обусловлено координированием молекулы фотохрома по шестому лигандному положению I емового железа. 11редложены возможные механизмы vcKopeiiHH реакции. Определены константа связывания бетаина стильбазола, К„ 4*101 М"1, константа Михаэлиса, Км 5,6* 10й М, константа

скорости «каталитической» стадии, kt.,„ 8*10"' с"1 при pli 6,0.

> 1

5. На основе эффекта ускорения реакции термической цис транс изомеризации бетаина стильбазола, ассоциированного с гемом метмиоглобина, предложен метод оценки времен и амплитуд медленных крупномасштабных конформационных флуктуаций белковой глобулы миоглобина в области гемового кармана. Показано существование конформационных движений макромолекулы с амплитудой 2 - 4 Â и характеристическими временами порядка 102 - 103 с.

Основные результаты работы изложены в публикациях:

1. «Влияние молекулярной динамики на фотоиндуцированный перенос электрона в комплексе эозин - миоглобин» В.Р.Фогель, А.В.Пастухов,

A.И.Котельников, Б.Л.Психа, Биофизика, 1997, Т.42, В.5, с.1008-1014.

2. «Coupling of electron transfer and protein dynamics» A.I.Kotelnikov, V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, V.L.Voskoboinikov, E.S.Medvedev, In: Biological Electron Transfer Chains: Genetics, Composition and Mode of Operation, eds.: G.W.Canters, E.Vijgenboom, 1998, v.512, Kluwer Academic Publishers,.Dordrecht, p.29-49.

3. «Динамика спектральной релаксации фосфоресценции эозина в переохлажденных водных растворах этиленгликоля» А.В.Пастухов,

B.Р.Фогель, А.И.Котельников, Д.В.Худяков, Б.Л.Психа, Опт. и спектр., 1999, Т.86,№3, с.415-422.

4. «Catalysis of the back thermal cis-trans isomerization of stilbazolium betaine by metmyoglobin» V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, A.I.Kotelnikov,

J. Fluorescence, 1999, v.9, №3, p.209-211.

5. «Особенности низкотемпературной спектральной релаксации фосфоресценции эозина в глицерино-водной смеси» А.В.Пастухов, В.Р.Фогель, А.И.Котельников, Опт. и спектр., 2000, Т.88, №3, с.392-398.

6. «Катализ темновой стадии реакции цис-транс изомеризации бетаина стильбазола миоглобином» В.Р.Фогель, А.В.Пастухов, А.И.Котельников, Биофизика, 2000, Т.45, В.2, с.254-256.

7. «Enzyme-like effect of metmyoglobin on the thermal cis-trans isomerization of stibazolium betaine» A.V.Pastukhov, V.R.Vogel, A.I.Kotelnikov, J. Biol. Inorg. Chem., 2000, V.5, №3, p.307-312.

Диссертационная работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты №№ 00-04-48376, 98-04-48955, 97-04-48646)

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Пастухов, Александр Вениаминович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА! ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Исследование динамики полярных растворителей с использованием метода регистрации динамического стоксова сдвига. Теория и эксперимент.

1.2. Современные представления о структуре и динамике белков. Реакция переноса электрона в белках.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

2.1. Материалы. Способы приготовления образцов.

2.2. Экспериментальная установка.

2.3. Обработка результатов измерений.

ГЛАВА III. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ СОЛЬВАТАЦИОННАЯ ДИНАМИКА

ВЯЗКИХ СТЕКЛУЮЩИХСЯ ПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ

3.1. Особенности молекулярной динамики переохлажденных жидкостей и стекол.

3.2. Динамика спектральной релаксации фосфоресценции эозина в растворах этиленгликоля и глицерина.

ГЛАВА IV. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА МИОГЛОБИНА

4.1. Структура и функции миоглобина и апомиоглобина.

4.2. Динамика апомиоглобина в вязких, стеклующихся средах.

4.3. Внутримолекулярный перенос электрона в комплексе эозин-метмиоглобин.

ГЛАВА V. МИОГЛОБИН КАК МОДЕЛЬНАЯ ФЕРМЕНТАТИВНАЯ СИСТЕМА. СВЯЗЬ КОНФОРМАЦИОННОЙ ДИНАМИКИ

С ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Исследование молекулярной динамики в вязких полярных средах и белках методами фосфоресцентных и фотохромных зондов"

Сольватационная динамика является важным фактором в химии растворов. Динамические свойства полярного растворителя определяют реакционную динамику заряженных частиц, спектроскопические характеристики люминесцентных молекул, транспортные свойства. Поэтому значительные усилия направлены на исследование релаксационных свойств полярных растворителей.

Первоначально теории сольватационной динамики строились на континуальных моделях диэлектрика, рассматривающих растворитель как непрерывную однородную среду, характеризуемую одним макроскопическим параметром - диэлектрической проницаемостью. Развитие экспериментальной базы и теоретических представлений привело к созданию теорий, учитывающих молекулярную структуру растворителя. Их использование позволило предсказать и позднее экспериментально установить ряд эффектов. Примером может служить инерционный отклик растворителя, происходящий на фемтосекундной временной шкале. Тем не менее, сложность изучаемой системы, обусловленная большим количеством взаимодействий различной природы между молекулами в растворе, слабой пространственной и временной структурной корреляцией, оставляют эксперимент главным инструментом исследования динамических процессов в жидкостях. Это особенно актуально в случае многокомпонентных и гетерогенных систем, какими являются переохлажденные жидкости, стекла и белки.

Экспериментально информация о сольватационной динамике может быть получена тремя основными способами:

1. Регистрацией разрешенного во времени стоксова сдвига спектра люминесценции молекулы люминофора, растворенного в полярном растворителе. При мгновенном изменении дипольного момента люминофора под действием короткого возбуждающего импульса света окружающий растворитель оказывается в неравновесном состоянии. Последующая ориентационная релаксация молекул растворителя приводит к зависящему от времени длинноволновому сдвигу спектра люминесценции молекулы люминофора.

2. Путем исследования реакции переноса электрона в полярных средах. Релаксация растворителя является скоростьопределяющей стадией для внутримолекулярного переноса электрона, который характеризуется сильным перекрыванием электронных волновых функций реагентов в растворителях с большими временами диэлектрической релаксации.

3. С помощью метода разрешенной во времени абсорпционной спектроскопии избытка электронов в полярных растворителях. Сольватация локализованного электрона, контролируемая релаксацией растворителя, проявляется во временном сдвиге спектра поглощения электрона.

Использование метода регистрации разрешенного во времени стоксова сдвига спектра люминесценции позволяет проводить исследования сольватационной динамики на обширном классе объектов в широком временном интервале от сотен фемтосекунд до сотен секунд, а также в широком диапазоне температур, вязкости, давлений и т.д.

Химические реакции лежат в основе всех биологических процессов. Особая роль принадлежит ферментам - природным биополимерам, обладающим уникальными каталитическими свойствами. В два последние десятилетия концепция, связывающая функциональную активность белков с их конформационной подвижностью, находит все большее экспериментальное подтверждение. Сложность, которой обладают многие белковые макромолекулы, требует создания более простых модельных систем для проведения экспериментальных исследований. В частности, процесс переноса электрона в белках изучают в ходе внутримолекулярной реакции, происходящей в комплексе металлопротеина и присоединенного к нему люминофора. Использование метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии позволяет одновременно наблюдать кинетику реакции переноса и релаксационную динамику микроокружения хромофора и, таким образом, дает возможность определять влияние релаксационной динамики среды на процесс переноса электрона.

Расширение границ временной и пространственной областей изучения корреляции динамики и функций белков диктует необходимость развития новых методов исследования. Интересные результаты могут быть получены, например, при использовании метода фото и зо м ер и зую 1 ц и х с я меток в приложении к некоторым гемсодержащим белкам. Его применение позволяет установить временные и пространственные масштабы глобальных конформационных флуктуаций белковой глобулы, связанных с «каталитической» активностью белка.

Актуальность проблемы

Влияние, которое растворитель оказывает на химические реакции, протекающие в нем, в течение многих десятилетий является одной из фундаментальных проблем физической химии. Первоначально внимание исследователей было преимущественно сконцентрировано на равновесных эффектах растворителя таких, как изменение потенциальной энергии реагентов и продуктов реакции по сравнению с их энергиями в газовой фазе вследствие сольватации. Однако, в последние годы стало ясно, что во многих быстрых реакциях динамика полярного растворителя может иметь критическое значение для протекания реакции. Наиболее ярко динамический эффект полярного растворителя проявляется в реакциях с переносом заряда. Быстрота, с которой растворитель откликается на перераспределение заряда в реакционной системе, может оказывать влияние как на скорость, так и на выход реакции. Существующие на сегодняшний день теории неравновесной сольватации развиты для процессов в чистых, однородных растворителях. На практике большая часть химических реакций протекает в многокомпонентных растворах. Поэтому экспериментальное исследование многокомпонентных растворов является пока основным источником получения информации о молекулярной динамике таких сложных и гетерогенных систем, как переохлажденные жидкости, стекла и белки. Метод регистрации разрешенного во времени стоксова сдвига спектра люминесценции зонда, входящего в состав сложных, гетерогенных систем, позволяет изучать релаксационные процессы в этих системах в широком интервале времен от 10~14 до 102 с.

Стекла и переохлажденные жидкости образуют класс веществ, широко распространенных в природе. В стеклообразном или переохлажденном состоянии могут находиться различные материалы: полимеры, сплавы металлов, коллоиды, эмульсии, биологические макромолекулы - белки, многие органические жидкости и т.д. Таким образом, исследование структурных и динамических свойств стекол и переохлажденных жидкостей представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных знаний, а также для решения разнообразных прикладных задач.

Цель работы

Основной целью данной работы было исследование динамических свойств вязких полярных растворителей и белков, определение корреляции между молекулярной динамикой белков и осуществляемыми ими функциями. Используемые методы: кинетическая фосфоресцентная спектроскопия и регистрация кинетики термической изомеризации фотохрома, ассоциированного с белком, позволяют проводить одновременное изучение медленной молекулярной динамики и кинетики химических превращений, осуществляемых в этой же системе.

Работа проводилась по следующим направлениям:

Научная новизна работы

С использованием метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии изучена медленная динамика ориентационной релаксации в низкотемпературных полярных стеклующихся глицерино-водных и этиленгликоль-водных растворах в широком диапазоне температур. Показано существование широкого распределения времен релаксации в исследованных переохлажденных жидкостях и определены параметры, характеризующие эти распределения.

Получены данные, свидетельствующие о гетерогенной структуре низкотемпературных глицериновых растворов. Сделана оценка масштабов и времен реструктуризации гетерогенных областей в 94% глицерино-водном растворе.

Обнаружено и исследовано каталитическое действие миоглобина на реакцию термической цис —> транс изомеризации мероцианинового красителя, бетаина стильбазола М. На основе этой реакции предложена простая модельная ферментативная система, позволяющая изучать влияние различных факторов на процессы биологического катализа. На основании ускорения термической цис транс изомеризации бетаина стильбазола в присутствии некоторых гембелков разработан новый подход к оценке масштабов и времен медленной глобальной конформационной динамики этих белков.

Практическая значимость работы

В результате проделанной работы получены количественные данные, характеризующие динамику низкотемпературных, бинарных стеклующихся растворов. Обнаруженные в этих системах структурная гетерогенность и возможность существования нескольких аморфных фаз при одинаковых условиях имеют важное значение для понимания процессов, протекающих в стеклах и переохлажденных жидкостях.

Отработана методика использования регистрации динамического стоксова сдвига для определения диэлектрических параметров локального окружения в таких микрогетерогенных системах, как глобулярные гемсодержащие белки.

Предложена простая модельная ферментативная система на основе комплекса миоглобин - бетаин стильбазола. Эта система позволяет исследовать влияние большого набора факторов таких, как рН и ионная сила среды, температура, вязкость, структура активного центра, природа иона металла, конформационная динамика на «каталитическую» активность белка.

С использованием того факта, что некоторые гембелки способны ускорять термическую изомеризацию бетаина стильбазола, развита методика изучения медленной крупномасштабной конформационной динамики этих белков.

Личный вклад автора

В работе представлены результаты работы, выполненной лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением молекулярной динамики в гетерогенных системах - низкотемпературных, вязких бинарных растворах и белках - методами кинетической фосфоресцентной спектроскопии и изомеризующихся зондов. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, их проведении и в обобщении результатов исследований.

Апробация работы

По результатам работы опубликовано 7 статей и 12 тезисов докладов.

1. «Влияние молекулярной динамики на фотоиндуцированный перенос электрона в комплексе эозин - миоглобин» В.Р.Фогель, А.В.Пастухов, А.И.Котельников, Б.Л.Психа, Биофизика, 1997, Т.42, В.5, с.1008-1014.

2. «Coupling of electron transfer and protein dynamics» A.I.Kotelnikov, V.R. Vogel, A.V.Pastukhov, V.L.Voskoboinikov, E.S.Medvedev, in Biological Electron Transfer Chains: Genetics, Composition and Mode of Operation, eds.: G.W.Canters, E.Vijgenboom, 1998, v.512, p.29-49, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

3. «Динамика спектральной релаксации фосфоресценции эозина в переохлажденных водных растворах этиленгликоля» А.В.Пастухов, В.Р.Фогель, А.И.Котельников, Д.В.Худяков, Б.Л.Психа, Опт. и спектр., 1999, Т.86, №3, с.415-422.

4. «Catalysis of the back thermal cis-trans isomerization of stilbazolium betaine by metmyoglobin» V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, A.I.Kotelnikov, J. Fluorescence, 1999, v.9, №3, p.209-211.

7. «Enzyme-like effect of metmyoglobin on the thermal cis-trans isomerization of stibazolium betaine» A.V.Pastukhov, V.R.Vogel, A.I.Kotelnikov, J. Biol. Inorg. Chem. 2000, V.5, №3, p.307-312.

1. «Analysis of electron transfer in metal containing proteins in the framework of adiabatic approach of outer-sphere electron transfer theory» A.I.Kotelnikov, V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, J. Inorg. Biochem., 1995, 59, №2-3, p.267.

2. «Photoinduced electron transfer in eosin-myoglobin complex» A.V.Pastukhov, V.R.Vogel, A.I.Kotelnikov, Book of Abstracts of the XVI IUPAC Symposium on Photochemistry, Helsinki, Finland, 1996, p.490.

3. «Study of the coupling of photoinduced electron transfer and protein dynamics by phosphorescence label method» V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, V.L.Voskoboinikov, A.I.Kotelnikov, Book of Abstracts of the Vth International Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy, 21-24 September 1997, Berlin, Germany, p.P195.

4. «The role of protein molecular dynamics in the electron transfer reactions»

A.I.Kotelnikov, V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, V.L.Voskoboinikov, ,7. Inorg. Biochem., 1997,67, №l-4,p.408.

5. «Структурные и динамические особенности металлоферментов в реакциях переноса электронов» А.И.Котельников, В.Р.Фогель, А.В.Пастухов,

B.Л.Воскобойников, Э.С.Медведев, Тезисы докладов Всероссийского совещания «Высокоорганизованные каталитические системы», 9-10 июня 1998 г., Черноголовка, с. 13.

6. «Катализ темновой стадии цис-транс изомеризации стильбазолиум бетаина метмиоглобином» В.Р.Фогель, А.И.Котельников, А.В.Пастухов, Тезисы докладов Всероссийского совещания «Высокоорганизованные каталитические системы», 9-10 июня 1998 г., Черноголовка, с.51.

7. «The comparison of electron transfer and molecular dynamics in myoglobin and cytochrome с» A.I.Kotclnikov, V.R.Vogel, A.V.Pastukhov, V.L.Voskoboinikov, E.S.Medvedev, 4-th European

Biological Inorganic Chemistry Conference, Sevilla, Spain, 1998, p.26.

8. «Ферментативные свойства миоглобина в реакции термической цис-трапс изомеризации бетаина стильбазола» А.В.Пастухов, В.Р.Фогель,

A.И.Котельников, Тезисы докладов 2 Съезда Биофизиков России, 23-27 августа, 1999 г., Москва, Т.З, с. 1061.

9. «Исследование микросекундной молекулярной динамики белков с помощью кинетической фосфоресцентной спектроскопии» А.В.Пастухов,

B.Л.Воскобойников, В.Р.Фогель, Н.П.Акентьева, А.И.Котельников, Тезисы докчадов 2 Съезда Биофизиков России, 23-27 августа, 1999 г., Москва, Т.2, с. 615.

10. «Определение параметров медленной релаксационной динамики белков и вязких стекол методом фосфоресцентной спектроскопии» П.Ю.Литвинов, А.В.Пастухов, В.Л.Воскобойников, А.И.Котельников, Тезисы докладов XI Симпозиума "Современная химическая физика", 18-29 сентября 1999 г., Туапсе, с.77.

11. «Особенности переноса электрона в белках как высокоорганизованных молекулярных системах» А.И.Котельников, А.В.Пастухов, Н.С.Горячев, П.Ю.Литвинов, Э.С.Медведев, Тезисы докчадов 2 Всероссийского научного совещания «Высокоорганизованные каталитические системы», 2000 г., Москва, с. 18.

12. «А merocyanine dye as a probe of hemeprotein large-scale conformational dynamics» A.V.Pastukhov, A.I.Kotelnikov, A.P.Sadkov, N.P.Akentieva, Book of Abstracts of the XVI ¡1IUPAC Symposium on Photochemistry «Photochemistry into the new century», July 22-27, 2000, Drezden, Germany, p.489.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы.

Заключение диссертации по теме "Физическая химия"

Выводы

1. Методом регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина исследована релаксационная динамика вязких водных растворов этиленгликоля (50, 75, 90% по объему) и глицерина (60, 94% по массе) в температурном диапазоне 103 - 262 К. Показано существование широкого распределения времен релаксации в изученных системах. Отработаны методики определения параметров распределения времен релаксационной динамики. Средние времена ориентационной релаксации молекул растворителя исследованных образцов находятся в интервале 10~2 -=- 10° с при температурах регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина.

2. Получены данные, свидетельствующие о существовании пространственной гетерогенности в исследованных переохлажденных жидкостях и стеклах. В 94% глицерино-водном растворе для гетерогенных областей определено время реструктуризации 160 ± 20 мкс и сделана оценка характеристических масштабов неоднородностей - порядка 102 нм - при 237 К. Предложена модификация процедуры вычисления корреляционной функции стоксова сдвига для гетерогенных переохлажденных жидкостей.

3. Исследована динамика релаксационных процессов в апомиоглобине и миоглобине, растворенных в вязких стеклующихся растворителях, в температурном диапазоне 130 -251 К. Релаксационная динамика в изученных системах характеризуется значительной неэкспоненциальностью, что свидетельствует о распределении времен молекулярной подвижности в данных системах. Исследована кинетика внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-метмиоглобин. В температурном интервале Тст -ь Тст+30 К для данного растворителя показана количественная корреляция между временами диэлектрической релаксации микроокружения среды и временами внутримолекулярного переноса электрона. Сделан вывод о возможности адиабатического режима реакции переноса электрона в данных условиях.

4. Установлен эффект ускорения термической цис -> транс изомеризации мероцианинового красителя, бетаина стильбазола М, в присутствии метмиоглобина. Исследовано влияние различных факторов: рН, ионной силы, присутствия анионных гемовых лигандов, полярности микроокружения, природы иона металла на процесс ускорения термической цис транс изомеризации бетаина стильбазола. Определено, что ускорение реакции термической изомеризации обусловлено координированием молекулы фотохрома по шестому лигандному положению гемового железа. Предложены возможные механизмы ускорения реакции. Определены константа связывания бетаина стильбазола, Ка I *104 М-1, константа Михаэлиса, Км= 5,6*10"5 М, константа скорости «каталитической» стадии, кса(=8*10"4 с"1 при рН 6,0.

5. На основе эффекта ускорения реакции термической цис транс изомеризации бетаина стильбазола, ассоциированного с гемом метмиоглобина, предложен метод оценки времен и масштабов медленных крупномасштабных конформационных флуктуаций белковой глобулы в области гемового кармана. Показано существование конформационных движений макромолекулы с о О амплитудой 2 - 4 А и характеристическими временами порядка 10 - 10 с.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Пастухов, Александр Вениаминович, Черноголовка

1. Н.Г.Бахшиев, Спектроскопия межлюлекулярных взаимодействий, Ленинград, Наука, 1972, 265 с.

2. M.Maroncelli, J.MacInnis, G.R.Fleming, Science, 1989, 243, 1674-1681.

3. Н.Г.Бахшиев, Ю.Т.Мазуренко, И.В.Питерская, Изв. АН СССР, сер. физ., 1968, 32, 1360-1365.

4. P.F.Barbara, W.Jarzeba, Adv. Photochem., 1990, 15, 1-68.

5. R.M.Stratt, M.Maroncelli, J. Phys. Chem., 1996. 100, 12981-12996.

6. Н.Г.Бахшиев, Ю.Т.Мазуренко, Опт. и спектр., 1970, 28, 905-913.

7. B.Bagchi, D.W.Oxtoby, G.R.Fleming, Chem. Phys., 1984, 257, 257-267.

8. E.W.Castner, G.R.Fleming, B.Bagchi, Chem. Phys. Lett., 1988, 243, 270-276.

9. E.W.Castner, G.R.Fleming, B.Bagchi, M.Maroncelli,. J. Chem. Phys., 1988, 89, 3519-3534.10. van derZwan, J.T.Hynes, J. Phys. Chem., 1985, 89, 4181-4188.

10. C.-P.Hsu, X.Song, R.A.Marcus, J. Phys. Chem. B, 1997,101, 2546-2551.

11. P.G.Wolynes, J. Chem. Phys., 1987, 86, 5133-5136.

12. I.Rips, J.Klafter, JJortner, J. Chem. Phys., 1988, 88, 3246-3252.

13. I.Rips, J.Klafter, J.Jortner, J. Chem. Phys., 1988, 89, 4288-4299.

14. M.Maroncelli, G.R.Fleming, J. Chem. Phys., 1988, 89, 875-881.

15. W.R.Ware, R.Chow, S.K.Lee, Chem. Phys. Lett., 1968, 2, 356-358.

16. J.D.Simon, Acc. Chem. Res., 1988, 21, 128-134.

17. M.L.Horng, J.A.Gardecki, A.Papazyan, M.Maroncelli, J. Phys. Chem., 1995, 99, 17311-17337.

18. Ю.Т.Мазуренко, В.С.Удальцов, Опт. и спеткр., 1978, 44, 714-719.

19. Ю.Т.Мазуренко, В.С.Удальцов, Опт. и спектр., 1978, 45, 909-913.

20. M.Maroncelli, G.R.Fleming, J. Chem. Phys., 1987, 86, 6221-6239.

21. W.Jarzeba, G.C.Walker, A.E.Johnson, P.F.Barbara, Chem. Phys., 1991,152, 5768.

22. M.A.Kahlow, W Jarzeba, T.J.Kang, P.F.Barbara, J. Chem. Phys., 1989, 90, 151-L 58.

23. N.A.Smith, S.R.Meech, I.V.Rubtsov, K.Yoshihara, Chem. Phys. Lett., 1999, 303, 209-217.

24. C.F.Chapman, R.S.Fee, M.Maroncelli, J. Phys. Chem., 1995,99,4811-4819.

25. В.С.Павлович, П.П.Першукевич, Л.Г.Пикулик, Жури, прикл. спектр., 1983, 32, 779-785.

26. R.Richert, Chem. Phys. Lett., 1990,171, 222-228.

27. Ю.Т.Мазуренко, В.С.Удальцов, Опт. и спектр., 1978, 44, 400-402.

28. N.K.Petrov, A.Wiessner, H.Staerk J .Chem. Phys., 1998,108, 2326-2330.

29. J.A.Gardecki, M.Maroncelli, Chem. Phys. Lett., 1999, 301, 571-578.

30. Л.А.Блюменфельд, Проблемы биологической физики, Москва, Наука, 1977, 320 с.

31. H.Frauenfelder, S.G.Sligar, P.G.Wolynes, Science, 1991, 252, 1598-1603.

32. M.F.Pemtz, G.Fermi, B.Luisi, B.Shaaman, R.C.Liddington, Acc. Chem. Res., 1987,20, 309-321.

33. H.Frauenfelder, P.G.Wolynes, Physics Today, 1994, 47, 58-64.

34. В.Н.Кулезнев, В.А.Шершнев. Химия и физика полимеров. Высш. школа, Москва, 1988, 312 с.

35. J.M.Vanderkooi, Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1386, 241-253.

36. J.E.T.Iben, D.Braunstein, W.Doster, H.Frauenfelder, M.W.Hong, J.B.Johson, S.Luck, P.Onnos, A.Schulte, P.J.Steinbach, A.H.Xie, R.D.Young, Phys. Rev. Lett., 1989, 62, 1916-1919.

37. В.И.Гольданский, Ю.Ф.Крупянский, В.Н.Флеров, Докл. Акад. Наук СССР, 1983,272, 978-981.

38. F.Parak, G.U.Nienhaus,,/. Non-Cryst. Solids, 1991, 131-133, part 1, 362-368.

39. А.П.Демченко, Люминесценция и динамика структуры белков. Наукова Думка, Киев, 1988, 280 с.

40. G.Sartor, E.Mayer, G.P.Johan, Biophys./., 1994, 66, 249-258.

41. А.Б.Рубин, Биофизика. Т.1, Высшая, школа, Москва, 1987, 319 с.

42. S.Papp, J.M.Vanderkooi, Photochem. Photobiol., 1989, 49, 775-784.

43. J.R.Lakowicz, G.Weber, Biochemistry, 1973,12, 4171-4179.

44. S.Beckham, M.P.Cook, L.Karki, M.M.Luchsinger, V.R.Whitlock, Y.Wu, Q.Zhang, M.D.Schuh, Arch. Biochem. Biophys., 1994, 310, 440-447.

45. R.H.Austin, K.W.Beeson, L.Eisenstein, H.Frauenfelder, I.C.Gunsalus, Biochemistry, 1975, 14, 5355-5373.

46. H.Frauenfelder, F.Parak, R.D.Young, Annu. Rev. Biophys. Biophys. ('hem., 1988, 17, 451-479.

47. F.Parak, E.W.Knapp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 7088-7092.

48. A.Schulte, R.Murray, Phys. Rev., 1987, B36, 1772-1774.

49. K.Fritsch, J.Friedrich, F.Parak, J.J.Skinner, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1996, 93, 15141-15145.

50. A.Ansari, J.Berendzen, S.F.Bowne, H.Frauenfelder, J.E.T.Iben, T.B.Sauke, E.Shyamsunder, R.D.Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5000-5004.

51. J.Schlichter, K.-D.Fritsch, J.Friedrich, J.M.Vanderkooi, J. Chem. Phys., 1999, 110, 3229-3234.

52. J.Deak, H.-L.Chin, C.M.Lewis, R.J.D.Miller, J. Phys. Chem. B, 1998, 102, 66216634.

53. M.-L.Groot, J.-Y.Yu, R.Agarwi, J.R.Norris, G.R.Fleming, J. Phys. Chem. В, 1998, 102,5923-5931.

54. D.W.Pierce, S.G.Boxer, J. Phys. Chem., 1992, 96, 5560-5566.

55. J.S.Bashkin, G.McLendon, S.Mukamel, J.Marohn,,/. Phys. Chem., 1990, 94, 4757-4761.

56. Е.Н.Фролов, О.В.Белоногова, Г.И.Лихтенштейн, В сб.: Равновеснаядинамика нашивной структуры белка, Пущино, 1977, 99-142. 58 S.Kaminaka, T.Ogura, T.Kitagawa,. J. Am. Chem. Soc., 1990,112, 23-27.

57. W.E.Hull, B.D.Sykes, J. Mol. Biol., 1975, 98, 121-153.

58. F.A.Ferrone, J.J.Hopfield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73, 4497-4501.

59. R.L.Baldwin, Annu. Rev. Biochem., 1975, 44, 453-475.

60. H.P.Lu, L.Xun, X.S.Xie, Science, 1998, 282, 1877-1882.

61. H.Yang, D.L.Smith, Biochemistry 1997, 36, 14992-14999.

62. R.A.Marcus, J. Chem. Phys., 1956, 24, 966-978.

63. В.Г.Левич, P.P.Догонадзе, Докл. Акад. Наук СССР, 1959, 142, 123-126.

64. P.P.Догонадзе, А.М.Кузнецов, А.А.Черненко, Усп. химии, 1965, 34, 17791812.

65. L.D.Zusman, Chem. Phys., 1980, 49, 295-304. 68.1.V.Alexandrov, Chem. Phys., 1980, 51, 449-457.

66. Л.Д.Зусман, Теорет. и эксперим. химия, 1983,19, 413-419.

67. L.Zusman, J. Chem. Phys., 1995, 102, 2580-2584.

68. Rips, J.Jortner, J. Chem. Phys., 1987, 87, 2090-2104.

69. R.A.Marcus, N.Sutin, Biochim. Biophys. Acta, 1985, 811, 265-322.

70. C.C.Moser, J.M.Keske, K.Warnicke, R.S.Farid, P.L.Datton, Nature, 1992, 355, 796-802.

71. А.И.Котельников, Биофизика, 1993, 38, 228-232.

72. D.S.Wuttke, M.J.Bjerrum, I.J.Chang, J.R.Winkler, H.B.Gray, Biochim. Biophys. Acta, 1992,1101, 168-173.

73. D.N.Beratan, J.N.Onuchic, J.N.Betts, B.E.Bowler, H.B.Gray, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112,7915-7921.

74. D.N.Beratan, J.N.Onuchic, J.J.Hopfield, J. Chem. Phys., 1987, 86, 4488-4498.

75. D.R.Casimiro, L.-L.Wong, J.L.Colon, T.E.Zewert, J.H.Richards, 1.-J.Chang, J.R.Winkler, H.B.Gray,,/. Am. Chem. Soc., 1993, 1485-1489.

76. D.R.Casimiro, J.H.Richards, J.R.Winkler, H.B.Gray, J. Phys. Chem., 1993, 97, 13073-13078.

77. D.N.Beratan, J.N.Onuchic, J.N.Betts, Science, 1991, 252, 1285-1288.

78. P.Siddarth, R.A.Marcus, J. Phys. Chem., 1993, 97, 13078-13082.

79. А.И.Котельников, В.Р.Фогель, Биофизика, 1996, 41, 596-605.

80. V.L.Davidson, Biochemistry, 1996, 35, 14035-14039.

81. V.L.Davidson, Acc. Chem. Res., 2000, 33, 87-93.

82. Rips, J.Jortner, Chem. Phys. Lett., 1987, 133, 411-414.

83. M.S.Graige, G.Feher, M.Y.Okamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 11679-1 1684.

84. W.Lanzilotta, V.D.Parker, L.C.Seefeld, Biochemistry, 1998, 37, 399-407.

85. R.E.Sharp, S.K.Chapman, Biochim. Biophys.Acta, 1999,1432, 143-158.

86. F.W.J.Teale, Biochim. Biophys. Acta, 1959, 35, 543.

87. R.J.Cherry, A.Cogoli, M.Oppliger, G.Sclmeider, Biochemistry, 1976, 15, 36543661.

88. V.Nagarajan, A.M.Brearley, T.-J.Kang, P.F.Barbara,/. Chem. Phys., 1987, 86, 3183-3196.

89. D.B.Siano, D.E.Metzler, J. Chem. Phys., 1969, 51, 1856-1863.

90. А.Н.Рубинов, В.И.Томин, Препринт №348, Ин-т физики АН БССР, Минск, 1984. 40 с.

91. С.А.Дзюба, Ю.Д.Цветков, Журн. структур, химии, 1987, 28, 15-38.

92. M.D.Ediger, C.A.Angell, S.R.Nagel,J. Phys. Chem., 1996,100, 13200-13212.

93. C.A.Angell, J. Non-C.ryst. Solids, 1991, 131-133, 13-18.

94. R.Richert, J. Phys. Chem. B, 1997, 101, 6323-6326.

95. R.Bohmer, R.V.Chamberlin, G.Diezemann, B.Geil, A.Heuer, G.Hinze, S.C.Kuebler, R.Richert, B.Schiener, H.Sillescu, H.W.Spiess, U.Tracht, M.Wilhelm, J. Non-Cryst. Solids, 1998, 235-237,1-9.

96. M.T.Cicerone, M.D.Ediger, J. Chem. Phys., 1996, 104, 7210-7218.

97. B.Jerome, J.Commandeur, Nature, 1997, 386, 589-592.

98. Н.Г.Бахшиев, Ю.Т.Мазуренко, И.В.Питерская, Опт. и спектр., 1966, 21, 550-554.

99. A.Wagener, R.Richert, Chem. Phys. Lett., 1991, 176, 329-334.

100. В.С.Павлович, П,П.Першукевич, Л.Г.Пикулик, Ю.И.Каулакис, Опт. и спектр., 1984, 57, 30-33.

101. R.S.Fee, J.A.Milsom, M.Maroncelli, J. Phys. Chem., 1991, 95, 5170-5181.

102. C.P.Lindsey, G.D.Patterson, J. Chem. Phys., 1980, 73, 3348-3357.

103. R.Richert, Phys. Rev., B54, 15762-15766.

104. M.Oguni, J. Non-Cryst. Solids, 1997, 210, 171-177.

105. G.U.Nienhaus, H.Frauenfelder, F.Parak, Phys. Rev., 1991, B43, 3345-3350.

106. С.И.Кузина, А.И.Михайлов, Докл. Акад. Наук СССР, 1976, 231, 1395-1398.

107. A.Jena, H.E.Lessing, Chem. Phys., 1979, 40, 245-256.

108. N.Agmon,,/. Phys. Chem., 1990, 94, 2959-2963.

109. J.Cohen, A.Ha, X.Zhao, M.Lee, T.Fischer, M.J.Strouse, D.Kivelson, J. Phys. Chem., 1996, 100, 8518-8526.

110. M.Mizukami, K.Kobashi, M.Hanaya, M.Oguni, J. Chem. Phys. B, 1999, 103, 4078-4088.

111. T.J.F.Day, G.N.Patey, J. Chem. Phys., 1997, 106, 2782-2791.

112. T.Takano, J. Mol. Biol., 1977, 110, 537-584.

113. E.Antonini, M.Brunori, Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands, Amsterdam, North-Holland, 1971, 496 p.

114. E.Breslow, S.Beychok, K.D.Hardman, F.R.N.Gurd, J. Biol. Chem., 1965, 240, 304-309.

115. Y.V.Griko, P.L.Privalov, S.Y.Venyaminov, V.P.Kutyshenko, J. Mol. Biol., 1988, 202, 127-138.

116. M.J.Cocco, J.T.J.Lecomte, Biochemistry, 1990, 29, 11067-11072.

117. Y.V.Griko, P.L.Privalov, J. Mol. Biol., 1994, 238, 1318-1325.

118. C.L.Brooks, J. Mol. Biol, 1992, 227, 375-380.

119. J.Frado-Rives, W.L.Jorgenson, Biochemistry, 1993, 32, 4175-4184.

120. D.Ellezer, P.E.Wright, J. Mol. Biol, 1996, 263, 531-538.

121. T.Simonson, C.L.Brooks, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 8452-8458.

122. Дж.Лакович, Основы флуоресцентной спектроскопии, Москва, Мир, 1986, 496 с.

123. J.L.Green, J.Fan, С.А.Angell, J. Phys. Chem., 1994, 98, 13780-13790.1271.Chang, H.Hartmann, Yu.Krapyanskii, A.Zharikov, F.Parak, Chem. Phys., 1996, 212, 221-229.

124. D.F.Calef, P.G.Wolynes,Phys. Chem., 1983, 87, 3387-3400.

125. P.Siddarth, R.A.Marcus, J. Phys. Chem., 1993, 97, 6111-6114.

126. J.A.Cowan, R.K.Upmacis, D.N.Beratan, J.N.Onuchic, H.B.Gray, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1988, 550, 68-84.

127. R.Tsukahara, K.Kiguchi, Chem. Lett., 1998, 9, 913-914.

128. U.Steiner, M.H.Abdel-Kader, P.Fischer, H.E.A.Kramer, J. Am. Chem. Soc., 1978, 100,3190-3197.

129. S.T.Abdel-Halim, M.H.Abdel-Kader, U.E.Steiner, J. Phys. Chem., 1988, 92, 4324-4328.

130. L.Stiyer, J. Mol. Biol., 1965, 13, 482-495.

131. D.C.Carter, X.M.He, S.H.Munson, P.D.Twigg, K.M.Gernert, M.B.Broom, T.Y.Miller, Science, 1989, 244, 1195-1198.

132. L.Zhu, J.T.Sage, A.A.Rigos, D.Morikis, P.A.Champion, J. Mol. Biol., 1992, 224, 207-215.

133. Э.Маршелл, Биофизическая химия, Т.2, Москва, Мир, 1981, 456 с.

134. D.Morikis, P.M.Champion, P.A.Springer, S.G.Sligar, Biochemistry, 1989, 28, 4791-4800.

135. К.Райхардт, Растворители и эффект среды в органической химии, Москва, Мир, 1991, 763 с.

136. M.Tada, T.Katsu, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1972, 45, 2558-2559.

137. V.M.Kothari, J.J.Tazmni, J. Catal., 1976, 41, 180-189.

138. Л.Страйер, Биохимия, T.l, Москва, Мир, 1985, с.

139. Ю.О.Лебедев, К.Ш.Джинория, А.В.Абатуров, В сб.: Равновесная динамика нашивной структуры белка, Пущино, 1977, 22-42.