Исследование пространственной структуры нейротоксина II Naja naja oxiana в растворе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

- F Г 6

ОД

' ' 1 ' ' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОГДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧВСКОИ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И П.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 543.422.25,/577.322.23/5, 577.332.4, 59I.I45.2

ГОЛОВАНОВ Александр Павлович

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕИРОГСШИА II Naja лaja oxiana В РАСТВОРЕ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ИОСКВЗ - 1994

Работа выполнена в груше ядерного магнитного резонанса Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Б.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук А.С.Арсеньев

Официальные оппоненты: |

доктор биологических наук, вед.н.с. В.Н.Бушуев \

кандидат химических наук, с.н.с. Т.М.Волкова

Ведущая организация: - Московский Государственный

университет им. Ы.В.Ломоносова, Химический факультет.

Защита состоится Ш" х^имр^Л 1994 г. вЮчасов на заседании специализированного совета Д.002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и П.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437. ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " <ре6.1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

Актуальность проблемы. В настоящее время одно из центральных мест в современной биологии занимает вопрос о механизмах "узнавания" одних биологических молекул другими.

Очень удобной системой для исследования механизмов узнавания является рецепторная система. Одним из наиболее хорошо изученье мембранных рецепторов является никотиновый ацеталголиновый рецептор (АХР), который участвует в процессе передачи нервного импульса. Он представляет собой ион-проводящий канал, управляемый нейротрансмиттером ацетилхолином и блокируемый нейротоксинами из яда змей. До конца не ясно, какие именно черты структуры и/или какие аминокислотные остатки токсина и ацетилхолинового рецептора важны для их связывания. Однако известно, что разные нейро-токсины связываются с рецептором по-разному. Для выяснения причин этого следует установить пространственную структуру как можно большего числа токсинов, а также установить структуру их места связывания на ацетилхолиновом рецепторе.

Цель работы. Установление пространственной структуры нейротоксина II (HTII) из яда Naja naja oriana, изучение связи мевду его пространственной структурой и функцией, а также исследование связывания длинных и коротких токсинов с пептидными фрагментами а-субъединицы ацетилхолинового'рецептора методом ядерного магнитного резонанса.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании данных 'Н-ЯМР спектроскопии получена детальная пространственная структура нейротоксина II Naja naja oxiana. Впервые показано, что нейротоксин II в растворе может образовывать димеры. С помощью анализа гидрофобных потенциалов выявлены аминокислотные остатки, ответственные за дамериза шло нейротоксинов, а также остатки, ответственные за поддержание нативной пространственной структуры нейротоксина II и его связывание с ацетаяхоливовым рецептором. Изучено взаимодействие некоторых длинных и коротких токсинов с пептидными фрагментами а-субъединкцы ацетилхолинового рецептора. Полученные результаты позволяют лучше понять связь структуры и функции нейротоксинов, а также выяснить роль гидрофобных взаимодействий в поддержании пространственной структуры белков. Созданное математическое обеспечение позволяет существенно ускорить процесс обработки экспериментальных данных спектроскопии 'Н-ЯМР.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на 10 Международном конгрессе по животным, растительным и микробным токсинам (Сингапур, 1991) и II двустороннем Российско-Израильском симпозиуме "Пептиды и белки" (Москва. 1932). Полученный набор структур нейротоксина II депонирован в Брукхевенскув Базу Данных по белкам. По теме -диссертации опубликована I статья.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. В первой главе (литературном обзоре) дана общая характеристика объектов исследования, изложены основные результаты, полученные при изучении пространственной структуры различных нзйротоксинов из ядов змей, проведен анализ функциональной роли аминокислотных остатков, а такав рассмотрены результаты, полученные ранее при изучении взаимодействия токсинов с ацегилхолиновыми рецепторами и их фрагментам. Во второй главе диссертации изложены отнесение сигналов в спектрах ЯМР нейротоксина II Naja naja oxiana и расчет его пространственной структуры по данным ЯМР, анализ полученного набора конформаций, а тахсже рассмотрена роль различных аминокислотных остатков в поддержании пространственной структуры нейротоксина II и во взаимодействии с ацетилхолиновнм рецептором. Третья глава посвящена исследовании взаимодействия длинных и коротких нейротоксинов с пептидными фрагментами ацеткяхолпнового рецептора. В экспериментальной части приведены сведения об используемых в диссертационной работе оборудовании, веществах, методах получения и обработки спектров 'н-ЯМР, а также методах теоретических рассчетов. Диссертация изложена на 180 страницах, содержит 49 рисунков и 9 таблиц, список цитированной литературы содержит 140 названий.

Пространственная структура нейротоксина II Naja naja oríana.

Для того, чтобы установить пространственную структуру нейротоксина II по данным спектроскопии ЯМР, на первом этапе проведено отнесение сигналов в спектрах к положению в аминокислотной последовательности. Данная процедура состояла из двух частей: идентификации спиновых систем и последующего последовательного отнесения сигналов. На начальном этапе отнесения, выделены сигналы спиновых систем отдельных аминокислотных остатков нейротоксина

о • .

О о о

О >

• I

О

е

с

<

0-0(3

"07 о о

о

¡0 &

0 « 0« О

"о • 0 0» • • К 00

о ° "о

ос о 0 9

ч

'о с 0 •0?5в Н1--р-оЛо оЩ

\й« . |о л

« б I

П . .

0(1° К9'0О о

А » 0 Л

О^П • П 0 •

ИДо 0§

о»^о° о > 0. «о 4|» ' •<> I

»0^28 .

в 23

,26. О" 1<) -

»2?

С

б I

О Г\]

о го

О 3

о

1Л

о <0

10.0 9.0 8.0

И'2 и.д.

• *

Рис. I. Фрагмент спектра моебу, на котором показан пример последовательного отнесения кросс-пиков аминокислотных остатков 22-28 нейротоксина II.

II в двумерных спектрах dqf-cosy (корреляционная спектроскопия с двухквантовым фильтром) и tocsy (тотальная корреляционная спектроскопия). Отнесение сигналов к определенному половению остатков в первичной структуре выполнено путем анализа а^-, ари- и d^-связей ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЗО) между амидиыми протонами (i+i)—го остатка и, соответственно, протонами сан, сен и nh предыдущего по последовательности i-ro остатка. В качестве стартовых точек для последовательного отнесения взяты сигналы ароматических остатков тгр27 и тгр28, а также туг24, которые легко однозначно идентифицировать из-зэ характерных кросс-пиков в ароматической области. На рис. I представлен фрагмент спектра noesy (спектроскопия ЯЗО), на котором показано.последовательное отнесение нескольких аминокислотных остатков пейротоксина II, а на рис. 2 показан фрагмент dqf-cosy - спектра с полученным отнесением сигналов.

Анализ d^-, и dm- связей позволил на первом этапе установить в обоих чертах вторичную структуру нейротоксина II. На рис. 3 представлена карта d-связей, на которой отмечено местоположение медленно обмениваются амядных протонов и величины ви-цинальвых констант спин-спинового взаимодействия 3J(C|. Качественный анализ ЯЭО-контактов меаду протонами основной цепи и времени дейтерообмена амилныт протонов позволил определить участки антипараллельной р-структуры и водородные связи, принимающие участие в ее образовании. Вторичная структура нейротоксина II характеризуется короткой двухцепочечной е-структурой (остатки 1-5 и 13-17) и трехцепочечной э-структурой (участок 22-30, 33-41 и 50-54).

Для наиболее полного учета всех экспериментальных данных кросс-пики в спектрах noesy были проинтегрированы и соответствующие значения интегральных интенсивностей записаны в специальную базу данных вместе с отнесением этих кросс-пиков для после-дущего анализа. После интегрирования-база данных включала в себя информацию о 822 кросс-пиках. На этом этапе 594 из них были однозначно отнесены. Среди них было обнаружено 272 внутриостаточ-ных контакта. 137 последовательных и 185 контактов между протонами, удаленными друг от друга по первичной последовательности более чем на один остаток.

П5В I

8 ©

ге

10. О

си

Н3! - Г

51вгК15

N61

Е37

М

К26

Р У^*-С59

^ Г34 057 ' ГМ .030 £20

С5? 4

еа - 8

С51 С40 я?9

СЧ2

1.5/

г С23

6 С 53

б й Н27

То

136 в

8

N22 ..

Г24

М.Д.

8. О

о гО

о гп

о 2

о

1Л

о со

Рис. 2. Фрагмент оог-собу - спектра нейротоксина II. Показано отнесение кросс-пиков мн-сан.

f

x,—.ii ГТтШт

bECHMQOSSQPt X ¿Л1Ц>и£1»ДСЮРГй50ВИЛ1ХРи^ХС?СТГОеДПД^ССЯ1РЯОИ

Нт т т т

H-D oOuea

Рис. 3. Карта а-связей нейротоксина II. Толщина прямоугольников отражает разбиение интенсивностей ЯЭО на классы: сильные, средние и слабые. Отмечено местоположение медленно обменивающихся амидных протонов (□ - время дейтерообмена от 2 до 45 ч, » -время дейтерообмена свыше 45 ч) и величины еицинзльных констант спин-спинового взаимодействия Злач ("+" - константа > 8 Гц: "-" - константа < 5 Гц). Стрелками обозначена идентиЗицированные водородные связи в направлении донор-акцептор.

Процедура расчета пространственной структуры нейротоксина II по данным спектроскопии ЯМР включала в себя шесть этапов: анализ локальной пространственной структуры с помощью программы confornmr для расчета ограничений на углы v, 0 и а также времени корреляции т; предварительный расчет пространственной структуры с помощью дистанционного геометрического алгоритма (программа diana) ; автоматическое переотнесение кросс-пиков спектра noesy на основе полученных структур; точное вычисление ограничений сверху на межпротонные расстояния, полученных из noesy спектров с использованием программы mardigras; расчет набора конфорыаций с уточненными ограничениями; минимизация кон-формационной энергии структур с помощью программы fantom.

Локальная структура нейротоксина II получена путем согласования полной матрицы релаксации протонов каждого из дипептидных фрагментов, включащих протоны данного остатка и hn протон еле-

дующего по последовательности аминокислотного остатка, с экспериментальными интенсивностями кросс-пиков спектров noesy. Ограничения на углы »>, ф и х рассчитаны при анализе локальной структуры с учетом стерически разрешенных величин двугранных углов, а также с учетом измеренных констант спин-спинового взаимодействия ВИЦИНЭЛЬНЫХ ПРОТОНОВ NH-CoH И CocH-CßH.

Для предварительного расчета трехмерной структуры нейроток-синз II ограничения на меяпротонные расстояния получены путем эмпирической калиОровки, основанной на i/r6- зависимости объема кросс-пика от межпротонного расстояния. Для выявленных водородных связей вводились дополнительные ограничения на межатомные расстояния. В результате этого расчета был получен набор из 20 структур с достаточно низкими значениями штрафных функций. Среднеквадратичное отклонение положения атомов для этого набора структур составило 0,77±0,I7 X для атомов основной цепи и 1,52 ± 0,31 Ü для всех тяжелых атомов.

Для исключения возможных ошибок в отнесении кросс-пиков набор структур, полученных на предыдущем этапе, использован для автоматического переотнесения сигналов с использованием базы данных по химически.) сдвигам сигналов протонов. На основании информации о химических сдвигах сигналов протонов перебирались все возможные варианты отнесения кросс-пиков, и если соответствующие минимальные по набору из 20 структур нежпротоннне расстояния были меньше 6 Ä, такое отнесение считалось возможным. Файл интен-сивностей с уточненным отнесением использовался программой MARDiGRAs для расчета ограничений на межпротонные расстояния путем анализа полной матрицы релаксации протонов. Окончательный расчет программой diana проводился с учетом 489 ограничений на максимальные межпротонные расстояния, ограничений сверху и снизу на четыре дисульфдаые связи и 27 водородных связей, а также с учетом ограничений на углы, полученных при анализе локальной структуры.

Для стереоспецифаческого отнесения сигналов протонов метиле-новых и изопропильных метальных групп использовалась программа glomsa. Отнесения получены для двух о-ме галеновых групп ciy-si и Gly48, 17 ß-метилёновых групп остатков Cys3, His4, Ser8, GlnlO,

Proll, Cysl7, Asn22, Cys23, Tyr24, Trp27, Trp28, Cys40, Asn50, Cys53, Суп54, Arg55 И Cys59, ДВУХ Cr меТИЛвНОВЫХ групп Proll И

- S -

Pro43, ОДНОЙ ИЗОЩЮПИЛЬНОЙ группы Val49 и ^ шести амидных групп боковых цепей остатков asл. Принимая во внимание информация о всех стереохимических отнесениях и водородных связях, определенных для 34 амидных протонов, имещих замедленную скорость дейте-рообмена, рассчитан набор из 19 структур нейротоксина II.

. Для последующей минимизации конформационной энергии этого набора структур применялась программа fактом, использующая систему потенциалов есерр/2 . Ограничения на расстояния и двугранные углы включались в энергию с помощью псевдо-энергетических членов. Минимизации проводилась без ограничений на водородные связи, поскольку энергия водородных связей непосредственно учитывалась во время минимизации. Это позволяет избежать ошибок, если были введены "липшие" ограничения для водородных связей. Среднеквадратичное отклонение положения атомов 19 конформаций нейро-токсина II, минимизированных по энергии с учетом экспериментальных ограничений, составило 0,86 ± 0,16 X для атомов основной цепи и 1,48 ± 0,19 & для всех тяжелых атсмов. Максимальные по набору структур нарушения ограничений на расстояния не превышают 0,37 X, нарушения ограничений на углы 7,3°, перекрывания Ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов 0,38 X.

На рис. 4 показано стереоизображение набора из 19 энергетически уточненных конформаций нейро токсина II. Пространственная структура НЕйротоксина II включает два фрагмента правозакручен-ной р-структуры, состоящей из короткого двухцепочечного (остатки 1-5 и 13-17) и трехцепочечного (остатки 22-30 , 33-41 и 50-54) антипараллельного р-складчатого листа. Эти два фрагмента связаны двумя водородными СВЯЗЯМИ (Ser8 NH. . .0 ИеЗб И ИеЗб NH...O0 sers). Ядро молекулы образовано четырьмя дисульфидными связями (на рис. 4 расположено сверху), из ядра выходят три пальцеобразные петли. Основная цепь молекулы образует плоский диск примерно круглой форш.

Конфоркация нейротоксина II в растворе очень похожа на кристаллическую структуру зрабутоксина ь, а также на структуры токсина л Naja nigricollis И а-НеЙрОТОКСИНЭ Dendroaspis polylepis poiyiepis в растворе, которые были получены ранее методом ЯМР. Среднеквадратичное отклонение координат С« атомов зрабутоксина ь и 19 конформаций нейротоксина II составило 1,57 ±0,15 X.

Как видно из рис. 4, ряд участков нейротоксина II (17-20,

Рис. 4. Стереоизображение набора из 19 конфорыацЕй нейроток-:ина II, полученных в результате минимизации конфэрмационной энергии.

30-33. 46-49 н 59-61) определился несколько xyss. Для того, чтобы выяснить ■ «шлется ли такой разброс структур следствием шд-ышности основной цепи на данном участке или он является следствием недостаточного количества зкспериментзльных данных, провален расчет кавфорыации петлевах участков 17-22 , 29-35 и 41-50 методом Монте-Карло. В результате получены наборы из 20 структур для каждой из петель. Стереоизображение структур петлевых участков приведено на рис. 5. В результате расчета методом Монте-Карло на рассмотренных петлевах участках не обнаружено каккх-либо вярагеннах конформаций с минимальной энергией. Разброс структур в этом случае отражает юзвфорыационнув подвеяность петель. Петля 17-22 соединяет два участка молекулы, которые жестко зафиксированы! друг относительно друга- Ее длина несколько больше, чем нузно для соединения двух "частей молекулы. Доступность петли растворители и наличие в вей остатка Giyi9 приводит к ее увеличенной вддвинности.

Для петлн 29-35, образующей р-поворот между двумя э-тягами, подвижность, видимо, определяется наличием Giy33. Известно, что этот участок участвует в связывании с рецептором. Можно предположить, что дополнительная подвижность данного участка необходима для более точной подстройки взаиыодействупцих между собой поверхностей тагеина и рецептора.

Петлевой участок 42-49 соединяет между собой противоположные стороны р-листа п так же, как петля 18-22, имеет "избыточную" длину. Характерной особенностью этой петли является наличие в ней большого количества гидрофобных аминокислотных остатков, а также двух остатков Lys, несущих положительный заряд. Подвижность этой петли также может облегчить "узнавание" рецептором токсина и обеспечить точную взаимную подстройку их структур.

Для всех, кроие трех, медленно обыениваодахся протонов гмид-ных групп в энергетически уточненных структурах обнаружены водородные связи с участием этих протонов. Сигналы от гмидных протонов остатков vai-is. Lys 4 б и Leusi сохранялись в спектрах TOCS Y спустя 2 ч после растворения токсина в d,o. Данные протоны экспонированы в растворитель и для шах следовало бы ожидать быстрый обмен. Интересно, что структурно гомологичные им амидные протоны у а-нейротоксина, токсина « н кардиотоксина стхиь также медленно обмениваются с раствором. В то же время известно, что длин-

Рис. 5. Стереоизображение петлевых участков нейротоксина II, конформация которых была ргсчитзЕз методом Монте-Карло.

Рис. 6. Стереоизображение модели димера нейротоксина II. А. Показаны тяжелые атомы основной цепи димера и отмечены номера аминокислотных остатков, участвующих в образовании межмолекулярных водородных связей; Б. Показаны все тяжелые атомы димера.

кый нейрональный а-бунгаротоксин образует в растворе димеры. Для него обнаружены характерные для симметричного димера кросс-пики ЯЭО в районе остатков 55-59. Кроме того, а-кобратоксин и а-бунгаротоксин в кристаллах, как известно, также димеризуются. Участки молекул этих токсинов, на которых происходит димериза-ция, соответствуют участку 42-54 нейротоксина II, и замедленный дейтерообмен амидных протонов УаИ5, ьеизх и сусбэ в принципе можно объяснить образованием димера.

Для более точного анализа эффекта димеризации из двух мономеров нейротоксина II создана симметричная модель димера, в которой медленно обмениващиеся амидные протоны каждого мономера замыкаются в водородные связи со вторым мономером. Полученная в процессе минимизации информационной энергии модель димера представлена на рис. 6. Данная модель имеет низкое значение энергии, не противоречит экспериментальным ШР-данным и объясняет замедленный дейтерообмен ряда амидных протонов.

Исследование зо-профилей нейротоксина 11.

При расчете пространственной структуры белков различными методами всегда возникает вопрос - насколько полученная модель соответствует действительности. Айзенбергом с сотр. (1992) предложен метод для оценки качества полученной структуры, который проверяет соответствие пространственной модели аминокислотной последовательности белка на основе Зо-профиля, рассчитываемого из атомных координат молекулы и специальной калибровочной таблицы. Мерой соответствия пространственной модели аминокислотной последовательности является параметр s. Для правильно найденных структур величина s велика и приближается к своему ожидаемому значению sTe0p. вычисляемому по эмпирической формуле.

Величина s рассчитана для всех 19 энергетически уточненных структур нейротоксина II. Среднее значение s составило 20,44 ± 2,03. Для нейротоксина II (61 аминокислотный остаток) ожидаемая величина sreop составляет 27,32. Таким образом, средняя для набора структур величина s отличается от своего теоретического значения всего на 2Ъ%. Величина s для эрабутоксина ь, структура которого была определена в кристалле с разрешением 1,4 Я (файл ЗеЬх В базе данных Brookhaven Data Bank), СОСТЭВИЛа 22,89 И 21,60 для структур А и В (с альтернативным расположением атомов) соответственно. Для набора структур токсина и наja nigricoiis среднее значение s несколько ниже и составило 16,05 ± 1,67, что говорит о том, что данная структура определена менее точно.

Изучение гидрофобных потенциалов) лолекум. нейротоксина II.

После получения пространственной структуры нейротоксина II необходимо решить вопрос о связи структуры молекулы и ее функции. Для этого следует выяснить роль различных аминокислотных остатков. Такая роль может быть двоякой: остатки могут участво-