Исследование процессов разделения моноклональных иммуноглобулинов методами электрофореза и ионообменной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ
|
Стоянов, Александр Владимирович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1993
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.20
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Российская Академия Наук Институт Физической Химии
На правая рукописи
Сто.таов Аяейсандг» Вгялкхотгкншч
КССГЕДОВШШ |Л^?53ССОВ РАЗДЕЛЕНИЯ Ю1ШЯ0ЯАЛЫ1йХ штукогговукпгоа КБНЩКЯ
эгкшчгсорЕзл я шгсопгатоя хгеттогткн
02.00.20 Хроматографик
Автореферат диссертации на соискание учсноа стрпени хандината комических наук
Москва 1093
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Научно-Производственного Центра Медицинской Биотехнологии МЗ РФ.
Научный руководитель: кандидат биологических наук
С.Н. Курочкин.
Официальные оппоненты: доктор химических наук
А.И. Катиничен,
канд»щит физико-математических наук Я. Л. Зворикин.
Врдугдая организация: Институт биохимии им. а.Н.Баха РАН
Защита состоится "—--" дехября 1993 г. в - часов
на заседания специализированного совета Д 002.95.02 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте Фкэичесхоп Химии РАН по адресу: 117915 Москва, В-312, Ленинский лроспект, 31, ИФХ.
С диссертацией могно ознакомиться в библиотеке Института Сиэи*' ;схой Химии РАН.
Автореферат разослан "-" декабря 1993 г.
Ученья секретарь специализированного совета кандидат химических наук
/Д
Л.Н. Коломийц
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Современная биохимия предлагает ряд высокоэффективный технология для очистки белков, чрезвычайно большое значение имеют хроматографические и
злектрофоретические методы, гтри я rot/ накоплен огромные фактический материал, полученный в каждом конкретном случае в результате трудоемких экспериментов. Использование такого рода экспериментальных данных я произвольном случае достаточно затруднительно, что делает актуальным исследование теоретических аспектов процессов, происходящих при разделении белков.
Среди других можно выделить группу методов, использующих зависимость поверхностного заряда молекулы от параметров водной среды. К таким методам относятся ионобменная хроматография и изоэлектрическое фокусирование. Эти методы обладают большой универсальностью, высокой потенциальной разрешающей способностью и высокой производительностью.
Теоретическому исследованию процессов разделения белков м етодами, использующими зависимость подвижности от рК, посвящена основная часть настоящей работы. Большинство теоретически полученных выводов для оптимизации процессов фракционирования было проиллюстрировано в данной работе на практике. Основным экспериментальным объектом исследований являлись моноклокальные иммуноглобулины (антитела) 2F7, 2Н2 2G5, специфичные к простагландинам серии Е.
' Достижение высокой степени разрешения возможно лишь при наличии информаци о свойствах разделяемых объектов. Теоретическое моделирование зависимости подвижности молекулы от рН среды дает возможность непосредственно оптимизировать выбор условий хроматографического разделения; полученные результаты, также, могут быть использованы для моделирования процессов, происходящих при электрофоретическом разделении белков. Применение последовательной схемы диссоциации для теоретического описания процесса формирования заряда белковой молекулы (Prusik, Knsicka, 1484) нельзя признать адекватным. Использование экспериментальных зависимостей подвижности от рН (Pharmacia Application Mote 1982; Остерман Л.А. 1985) для выбора оптимальных условий разделения требует учета дополнительных факторов (наличие вязкого трения;
молекулярно-ситовоЕ эффект, оказываемы? поддерживающей средой).
Ряд задач биохимии предъявляет очень высокие требования к чистоте выделяемых белков. Методом аналитического изоэлвкричвскаго фокусирования было обнаружено, что белки, подвергнутые тщательной очистке при помощи совокупности нескольких методов, тем ке менее, обладают микрогетерогенностью, свидетельствующей о гетерогенности белковых молекул по электрическому заряду, в то время как по другим параметрам они являются идентичными (молекулярный вес, биологическая активность). Проблема микрогетерогенности белков к настоящему времени теоретически не исследована: существуют лишь отдельные экспериментальные свидетельства различий иэоэлектрических точек отдельных изоформ с известным химическим строением. Не предпринимались попытки расчета влияния различия в химическом строении на сдвиг pi.
ЦЕЛЬЮ данной работы являлось исследование процессов разделения белков электрофоретическими и хроматографическими методами и разработка методов получения вьсокочистых моноклональных антител и их антиген- связывающих фрагментов, а также, изучение их микрогетерогенностк.
В теоретической части работы были поставлены следующие основные задачи: 1) создание метода расчета зависимости заряда белховой молекулы от рН среды и исследование влияния возможных модификаций молекулы белка на значение ее изоэлектрической точки, и 2) теоретическое рассмотрение особенностей поведения молекул разделяемых белков при использовании электрофоретических способов разделения и анализа веществ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.
Разработан метод теоретического моделирования зависимости подвижности белковой молекулы от рН среды.
Сформулирован теоретический подход к анализу микрогетерогенности белков, позволяющий оценивать влияние вариаций в первичной структуте белковой молекулы на значение изоэлектрической точки. Получены формулы для частных случаев, охватывающих практически все возможные ситуации, связанные со знаком и величиной привнесенного электрического заряда, а также, количеством и типом различных ионогенных
групп, имеющихся в исчодкоР» молекуле.
- Предложена модель для численного расчета динамики процесса изоэлектхюбокусироваиня, позволяющая учесть зависимость годвкакости от рН и иилинрпнпсть электропроводности.
- В экспериментах" по очистке РаЬ-Фрагментоя при покори ионообменной хроматографии достигнуты результаты, препосходящие по степени разрешения известные ран«» для подобных объектов. Впервые били получены р1-гомогеннме составляющие спектротипа моноклинальных антител.
- Впервые теоретически описан специфический тип микрогетерогенности, надетектируемый при помощи метода ИЗО, при котором отдельные молекулы различайтея только местоположением односменных заряженных групп.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.
Развитый в работе метод расчета кривых титрования, в^тичающия способ числечого расчата для произвольной белкогой молекулы с известной первичной сгуктурои (или аминокислотном составом), мохег быть использован для выбора оптимальной схемл очистки какого-либо белка из произвольных исходных белковых смесей.
Сформулированной подход к теоретическому описанию проблемы микрогетерогенности белков, не только дает возможность описать часто встречающиеся на практике явления, но и, в ряде случаев, получить практические рекомендации по выделению исследуемых белков. Открытие микрогетерогенности, цедетектируемой методом изоэлектрического фокусирования, такае, имеет важное практическое значение, например, для кристаллизации белков.
Предложенный схемы очистки моноклональных антител и КаЪ-фрагментов могут применятся в иммунохимии в тех случаях, когда требуется очвно высокая степень чистоты конечных продуктов.
3 АИИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.
Разработай метод теоретического моделирования пзвксккости подвижности белковой молекулы от рН средн. Создана программа, позволяющая рассчитать дзкнуп зависимость для любой молекулы с известной лерпичм'оа структурой. Результаты теории использованы дгп выбора услззий раздельная
з
¿елкоь ми-годами иснообмшшоя лроматогрл^ии к арепарр.тивчого изопльчтрпчйского фокусирования.
?.. Предложен мвтог оценки вгипник вариации в первичной гтруктуге белковой молекулы на значение п.-адэяектричзской точки. Иояучьнь аюр..уяы для всех еопжкшяг частных случаев. Гцктыш„ё!Нк сравнения с опытными данными, известными из литературы. Ti'cpe тичсски проанализирован тип
микрогзтерогснности, при котором имеется рчень исакачкчельное различие R .суммарном эатектричесгом заряде монокул, сооткетстиувщих отдельным, компонентам ИЭФ-спактра. Показано, что специфический, тип микрогетарогенности при котором отдельные молекулы различаются годько иестопалахиным одноамгмншк ?«ряж<=ккы;< групп очень часто яьяяется неразрешаемым для метода ЮФ.
."5. Предложена модель для описания процесса •яэозлектрофокуСиров«'.нин, на основе которой выполнен численный- расчет. Результаты расчета позволили описать поведений фокусируемого вещества в среде с переменной ял£?ктропроводностью и оптимизировать условия разделения.
¿ПРОНАЦИЯ РАБОТЫ . И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты работы докладывались на IV Всесоюзном совещании по теории и практике электрофореза в 1987г, на III Биотекиологическом симпозиуме (Майами, США) в i.Q3ûr, на Всесоюзном совещании "Научный и практический аспекты электрофореза" в 199Сг, на XVI научной, конференции молодых ученых и специалистов МФТИ в 19S1P ни VI Всероссийском симпозиуме по' молекулярной жидкостной кроматографии в 1993г. По результатам диссертации опубликована 4 статьи. '
СТРУКТУРА'ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная, работа состоит из введения, обзора (1гл.), пяти глав оригинального содержания, приложения у. биияиографми. Общий объем диссертации составляет 139 страниц, из которых 34 занимают рисунки и сх&ин, 9 список лсполъэуемоя литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
H обзора Игл.) описани основные принципу некоторый методов разделения белков, которые использут различия Е подвижноетях разделяемых веществ в зависимости от рН сради: ионмИмдкной крометографии, изозлектро^кусирования i хроматосг1 куенролаьия. Приводятся способ» позше.нш
рязремтзд;; способности. Характеризуете»-: .'гсток^уй r~~n*irra-: теорйгкчесогл мод^льрочачиг. ЗР-ЧРСК^ЗСТ;' no«st'*W':7!' белхстюй иолекугм от кислотности гряд« s» ?.>';: v.*
изоэлектрофокусирозания. Применительно г рассмотренные методам, анализируются особенности очистки мпкоклоиалышх ачтител и пх антигенсяяэьтаювжх фрагм нтол.
Наличие информации о поведении зависимости чардда белковой молекулы от pli среды ингет чрезвычайно большое значение при выборе условия разделения при помоги ионообменной хроматографии, а также, при помощи различных эяектрофоретических методов.
Известен подход к моделирования кривых титрования, прк котором было предложено рассматривать диссоциации белковой ..элекулы в водном растворе как диссоциацию полиамфолита -многоступенчатой кислоты и основания (KasisVa, Pruzik <1984), Бабский и Жуков (1990)):
IIiR" +' fP
и-* +
где HXR- положительно заряженный ион, диссоциации, ''отрицательно заряжекныЯ ион, а* -константа диссоциации, и и м - количества кислотных и основных групп. При этом заряд белковой молекулы рассчитывался как среднее значение заряда ксех-существующих в растворе форм.
Такой подход можно объяснить механическим перенесением механизма ступенчатой диссоциации (справедливой для многоосновных хислот ,1 оснований ) на молекулу белка без учета природы объекта, где вышеупомянутая схема несправедлива в принципе, и существует Сольное количество групп, спосоГчых к диссоциации, значения рК хогорых могут быть одинаковыми (достаточно близкими). Данный подход являятся не только неправильным с точки эрзния формальной кинетики, но и внутренне противоречивым: первоначально делается "предположение об одновременном существовании в растворе мнояества различных иэоформ (различающихся значением заряда), после чего средней значение (единственное) приписывается молекуле белха. Кроме этого, возникает проблема неоднозначности априорного (в отсутствии информацииО о примерном значений иэозлектрической точки)
1-Х ...W 3.-1 ... м
bn. -константа
ныЗора нулевого состскниг. - <Н°Ю. Полученные таким образом эавис-мости могут иметь какое-либо сходство с действительностью лишь для аминокислот и олигопептидов, имеющие всего несколько групп, способных к диссоциации, - в этом случае среднее значение распределения состояний по величине заряда практически совпадает со значением концентрации доминирующей формы.
Э настоящей работе предлагается способ моделирования кривых титрования на основе схемы параллельной диссоциации ионогенных групп молакулы. Такой подход свободен от вышеперечисленных недостатков и позволяет рассчитывать зависимости заряда от рН преды для белковых молекул с самым различным количеством тногеньых групп.
Необходимость теоретического моделирования процесса разделения белков при помощи изоэлектрического фокусирования в каибольиея мере ощущается при проведении препаративно"о варианта этого метода в жидкой среде.
При разработке уникальных установок с большой производительностью,; универсальностью в используемых* амфолитах- носителях, а также, имеющих особенности в режиме работы, необходимо точно представлять ход всего процесса разделения, с тем чтобы добиться максимальной степени разрешения, исходя из технических возможностей аппаратуры.
В работе (Бабский и др., 1987) для упрощенного решения уравнения, описывавшего динамику фокусирования белка в одномерном случае -
Ct -.аСxx+f(x)Cx+fx(x)C - О, где С- концентрация фокусируемого вещества, т- коэффициент диффузии, fix)-скорость переноса вещества в электрическом поле, было предложено считать процесс происходящим в две стадии: на первой стадии идет процесс переноса в отсутствии диффузии, который описывается линейным уравнением первого порядка, лег:сс решаемым методом характеристик; на второй стадии конечнг я ширина зоны устанавливается в результате взаимного уравновешивания сил электрофоретического переноса к диффузии.
Такой подход удовлетворительно описывает качественный ход процесса, в то же время, таким образом невозможно
е
адекватно описать поведение фокусируемого вещества вблизи игом: зктрической -очки. Для некоторых идеализированных случаев * возможно точное аналитическое решение рассматриваемого уравнения; решение получается в виде бесконечных рядов и переход к конкретным параметрам требует приближенных выч.чслнний. При численном методе решения задача может быть роыена, н принципе, с любой необходимой точностью, кроме того, при этом не требуется идеализации задачи и возможен учет догто/нителышх факторов (п т.ч., представленных в неаналктическог форме).
Очистка ионокгональншг аятктел (иммуноглобулинов) и их антиген-связывйкйдкх йрагментоп расмотренными вше методами имеет некоторые особенности. • Ноноклональные антитела представляют собой продукт секреции гибридом - гибридных клеток, полученных в результате слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных яивотных с культивируемыми в питательной среде клетками ниеломчнх штаммов (Köhler а Milstein, 1975). Слившиеся гибридные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенное антитпло' и от миеломного партнера прсобретают свойство бесконечно размножаться In vitro. Секретируемые одним клоном моноклональнье антитела могут Сыть размножены п неограниченном количестве. По всем параметрам они идентичны-по классу молекулы, ее типу, специфичности и авидности. Они взаимодействуют с • одним антигеном, одной антигенной детерминантой.
В зависимости от требований к чистоте конечного продукта, природы моноклональннх антител и источника, их выделения, выбирается стратегия очистки! В случае, когда рост сехретирующих антитела клеток происходит в брюмной полости мыши, асщпная жидкость содержит значительное количество примесных белков: альбумин, трансферрин, собственные иммуноглобулины мши, при этом концентрация альбумина превосходит концентрации других примесных белков.
В ряде случаев бывает необходимо получить аитиген-срязыва^ци'э фрагменты антител. Помимо чисто исследовательских задач, использование таких фрагментов может быть более предпочтительным в иммунофермвнгном анализе, в терапии. Стандартными процедурами является
пгасобь получения антиген-связываших фрагментов при номоци обработки антител следуйк;и«и Ферментами: папаином, пепсином и трипсином. Для очистки ГаЬ-Фрагмактав можно использовать ионообменную хроматографию, аффинную хроматографа 5 сочсгаи-и с гель-фильтрацией. В тек случаях, когда необходимо освободиться от ■кикрогнтерогенности
РяЬ-Фрагмантой (раздел 2.3 используют матоди,
обладающие очень высоким уаэреиениек: хроматофокусирсвание и изоэле/.трофокусирование. Если разница в иэоэлектрических точкак образовавшихся РаЬ-фрагмектсп не слишком мала, можно йссполе-зоваться конпобмэнной хроматографипй.
Моноклинальные антитела при анализа метдом ИЭФ почти всегда обнаруживают целый спектр полос. Такая картина может, н какой-то мере, служить своего рода паспортом для данник-нонокпонзльных аьтигел. Общее число полос и соотношение их интйнсивностой различны дль различных- иэотипов. Также, различны общий интервал и расстояние между соседними полосами.
Вопрос микрогетерогенности монок тональнык антител пч'ооко обсуждался в литератур« (Аис1еЬ еЬ а1 <1970) , ИПЦапвоп (1973), НогГиап (1977)). Среди возможных причин чаще всего упоминаются следующий причины: различная степень гликозклкронания заряженными сахарамн и деамидироиание аминокислот асгарагина и глютамина.
Подводя итог работам, посзященным экспериментальному ^изучению мккрогетерогенкости моноклональних антител, можно сказать, что единственным достоверным их результатом моясет быть топько следующий вывод: процессы деамидирования и утрата заряженных сахарных групп способны приводить к видимым изменениям в ИЗФ-картине.
Антиген-связыпающие фрагменты моноклональних антитая такхй проявляют микрогетерггенность. В эгок случае среди
возможных причин микрогетег: ценности необходимо
• *
рассматривать неравномерный пвотеолиз.
Таким образом, к настоящему моменту нй существует работ, в которых было бы установлено точное различие . з строении изоформ. С другой стороны, представляется достаточно очевидным, что вследствии того, что различные антитела значительно различаются сак строением белковых цеаей, так и
строением углеводного компонента, наблюдаема;:
микрогегерогечность можат быть обуслоплена в различных случаях различными причинами.ГГозтому одной из основных задач работы являлось теоретическое рассмотрения ko-jmoxmhv процессов, вызывающих явление микрагететогенности и создание модели, позволившей бы оценить влияни.-; любого кз возможных процессоз на изменение иасплнктрической точки белка. Ч экспериментальном плаке в данной работа, такж«, ставилась задача исследования корреляции между млкрогетерогеняоетье моноклональн^х анти-PG антител и их Fab фрагментов. ВшааЯ слава поевкяена вопросам Теоретического моделиротиишя зависимости заряда молекулы белка от рк. Рассмотрена «юпросн влияния модификация белковой молекулы нй :тчркир ае иэоэяепрической точки. Также, обсуждаются проблемы соответствия зкепериннитаяьных и теоретически полученных зависимостей. При этом делается практически важный я люд о небхздикости учета запискмости силы вязкого трения от размеров молекулы в случае использования экспериментальных зависимостей подвижности компонентов смеси белков с сильно различавшимися молекулярными весами.
Образование заряда бплковой молекулы в растворе моякг. рассматривать как результат диссоциации определенных груггп аминокислот, способных к образованию заряда. Ими могут быть свободные концевые группы всех аминокислот (карбоксильные и амино- группы), а также, боковые группы лизина, аргинина, гистидина, аспара;гиновой и глэтамугмопей кмелот, тирозина и цистерна. . ,
Для молекулы бллке, имеющей W + М групп, способных к образован:!» заряда, схема образования заряда имеет вид:
ъР; $1 ь5 + Н+ л «а.......М
аЙ 5й аЙ + П+ я шл.......гг
где Ь.8 и afi - состояния иоиогенннх групп в незаряженном виде, Ьй и аЙ - состояния ионогенных труп- з заряженном виде; Kj} и Кй - константы диссоциации.
Для зависимости заряда от рН получаем слецущее выражение:
о-- h tt^frr - ii '-¿§"цгг сз>
В качестве значений констант диссоциации можно использовать значения д(у свободных аминокислот. Как показало сравнение с
зкспйршентаяькыми даинь-ч. (р:»эд. 2.',, а та*'»:е, 2.5),
соэдаклая теория на;;о/-.ктпк а кзр?ш?м соотяотстбки с зксперимеитальнь'-ш результата^' при зто>? получается весьма сходные с экспериментальными тесраткчйскт: кривые титрования к .достаточно блкэкиа значения {.'.-иэгяктрическгс; точек.
Оценка плняиий единичного изменения количества иокогекнык групп в беакочой молекул»; на сдвиг кзозяектрическоя точки, п рамках данной ¡-¡одели, оенгвана иг. учете того обстоятельства,что ньибаксе сунестияяный вклад в компенсаций привнесенного заряда результате модификации) внесут те иопоген'-шс группы, рК каторих ( рГ, -1$; К ) наладятся вблизи р! молекулы. Используя соотпожани {следствие ур-я (1)):
^ ~ 77а> ..£ ~ ~ <2>
гда „ к » - кояичэсгза иокогаинюс групп разных видов, изменяющих споо степени диссоциации (образую:«»: г!0Л0я;>ге!ЛЫ!Ый к отрицательны»; заряды, соответственно), а4 л Ъ± - кояичзстыа чокогвнних групп каждого вида, ■
привнесенный заряд, я ппедены обозначений -
«¿»КГ/ О. [К4-] „, е - [Н+3 [П+] е., ( лрн» -1о а ),
мокко получить вьраяеяия длл иглсаиения значения .(зоэяйктрическок точки и комок вкйв при что дает
возможность описать практически яабыз ситуации, могупме иметь место прк кодификациях балкой.
• Далек подробно рассматривается частный случаи: целочисленный и пгзцелочкеленный привнесенные заряды, различные количястпа и т;дГ нокогенкнк-групп, изменяющих сбои степень диссоциации. Так например, учет изакмодепствиг. двух различных видок кокагакиик групп пркподит к уравнение второй степени относительно с. Е игом случае искочоо
значение о определяется по сорю'-ктО а)/2А,
гди *., В, С - соотЕзтстнуиздо ;соьффпцпе;;ты уравнения
¿с.э+а * +С ~0, палучскхога .путей редуцирования кскодного
уракнен«:; (2). гоз.:>.;;кп:;--пт2г к,в ;; с йыглкд;п следукак;" ойразем, сска прг.»к«с£киыс заряд имеет целочисленное
:нйчм»к*{ {«¡»ил):
Д» ) «г {»-5+1)
(3.3 )
Здэсь ^ » 1'э - количества 'гагси-г.-ншпс групп каждого из диух раэл«чшя? ткюг, » _ значения « или р для ионогенных групп данного тмм. Так, например, если я выражении (2) х1=0 и „'о, тс ^»ьг, £а-ьа и Фх-Вх, гак что коэффициенты имеют вид:
А- Ь1Ра.(Ра-И.) +ЬаР3(Эь+1) +а(23.+1) (Рэ+1! (3.1*)
3= ЪхРз(Эг-1)+ЬаР1(Э2-1 > +(1(Рг + Ра) (01 + 1) (0Э+-1) (3.2*)
С= Р1Р3[-Ь1(Ра + И-Ьа(Р^-!-1) +«<3*+') (Ра+Ш (3-3«)
Учет действия ионогенник групп только какого-либо одного вида, дает для 6 следующие выражения: (•!)- для случая иочогэннмх групп, образуют« положительный заряд, (5)--отрицательный (р^с.1) .
в = а (а-а(1+а)) /(аоич(1+а)) (4)
Рис. 1. Зависимость величину сдвига лзоэлектрическоя точки белка при модификации, сопровождающейся привнесением единичного заряда, от количества содержащихся а молекуле ионогеннык групп, изменяющих свою степень диссоциации. (В молекуле существуют чоногенные группы, изменяющие свою степень диссоциации, только одного типа.)
На рис 2а представлены теоретически расчитанные кривые ~итрования цепей гемоглобина. Картины кривых титрования для а- и 3-цегей гемоглобина, очень похожие на изображенный на рис 2а, были получены экспериментально в работе К1дЬеМ1, Стапагга (1980) -рис 2в.
® - Р (Ь-а(1+р))/(Ьр+ч(1+р>)
(5)
- др;
го
а} . О. и
Рис. 2а. теоретически я зависимость заряда молегсулы от рй среды для а и з -цепа:-: гемоглобина.
Рш:. 2а. Экспериментальный кривые подвижности (кривые титрования} а и р-пелен гемоглобина.
С.раииснае расчетных величин сдвига изозлектрической точка при единичных кодификациях аминокислот для белкой с известными различиями в химическом строении с экспериментальными значениями, также демонстрирует достаточно хорошее совпадение.
При сопоставлении экспериментальных кривы.'! подвижности различных белков (имеюцих разные молекулярные нассы), полученных методом двумерного здактрофс;реза <п естественной рН-грядпенте). с истиньми кривыми титрования (как экспериментальными, так и теоретическими) следует принимать во внимание наличие явления вязкого трения. Использование ♦поправс-чного коэффициента - Н"1/3 (и* М-1-'3) позволяет привести в хороаее соответствие картины, получаемы« д!?умя этими методами (II- подвижность, К- масса мо'лекулы).
Третья глава посвящена вопросам очист: >: моноклональных антител методам:: ионообменной хроматографии и препаративного изоэлектрофокусярованкя в жидкой соеде.
Показано, как на основе результатов теоретичЕ»сгого моделирования зависимостей подви*ноаги от рН срьды для компонентов, входящих в состаз исходной смьси (полученной добавлением сульфата аммония к асцитнои жидкости)' можно осуществить выбор условий для очистки моноклональнык антител при помощи ионообменной хроматограф'»!.
Результат:»* (¿ад-ш'рсванил пргаедени на рис 3. Из рис 3 видно, что можно ныбрать следуцш: Еозио&ныа способы разделен:.'?.: при уепольгов&чил сильно из аш<анообченни.>:а можно попытаться поочередно элэтироьать с колонки в градиенте концентрации соли последовательно дититела и примесные белки □ диапазон:; " 7.5-0.5, г.'/.бо собрать антитела в проскоке при рЧ стартового буфера мрньи.я сйми (ип бодяге примерно мести) . Второй способ яучие не использовать при одноступенчатой очистке, так как при сборе нужного белка в проскоке можно, также, собрать вместо с ним некоторое количество примесных белков (каждня из которых «ояйт быть в очень небольшой концентрации) , имякздих' газоэлектрические точки п гаироком диапазоне рК.
Рис. 3. Теоретически рассчитанные зависимости заряди молекул от рН срады (кривив титрования) для основных примосиш компонентов и примерное) , расположение кривая титрования мо но к по на ль них антител.
При работе с сильным катионообменником в данной ситуации представляется наиболее целесообразным выбрать г)Н стартового буфера так, чтобы основной компонент примеси оказался в проскоке и затем элюировать антитела п плавном градиент* соли. .
Эксперименты проводились с антителами 2?! и 2И2. После высаливания сульфатом аммония (40 и 33% ласищения), иммуноглобулины диализовались в течение 10-12 часов при 4С против стартового буфера. Перед нгнесением на колонку
образцы центэкфугкпосааксь в.. 'течение .10 мин при ЮООСс. Использовались кололлк Кмо Q с Mono 3 <(5x20} к <5x5).).. Поведение раэ^елямкх белков ь экспериментах хорошо согласовывалось с теоретическими предсказаниями; были полу 4ены препера гы иммуноглобулинов, свободные от примесей (по данным SOS-электроф^еза>'.
Для описана»: 'дья&уикк , .игогшжтрофокуснроз&шш белка мспольэоьадос«» одномерное уравнение диффузии с • перенесом
C^C^fixlC^KjC* 0, . ' j
где С-концентрация фокусируемого вещества, коэффициент дифйузии, f(x)-cKopocTb переноса вещества в. электрическом поле. Начальное распределение концентрации предполагается изпастнкм - С'(х,0)=Со(х). ■
Краевые условия отвечают отсутствию потока всцества на концах колонки. -пСх+f (х) С*0 (x>«0,L > ( L- длина
эшктрофоретичесхой колонки, ) Скорость переноса f(x) определяется соотношением - f(x)= I • у(х)/с(х), где у(я)-подвижность белковой молекулы, с(х)-проводимость среды, I -„электрический ток. • . -
Для численного реэтения задачи использовалась неявная четырехточечная разностная схема с аппроксимацией конвективного члена центральными разностями. Для случая линейной зависимости профиля скорости разностная схема выглядела следующим образом:
а b f
к К-а. К к к k-t-A ic
»
a »-ra/L:2Ha-(B-ALh(H-3.')/2I,h it
Ь -2m/I.2ha-A +1 /1
к ■ •
с •=>-ra/Laha+ (B-ALh (k-t)) /2Lh к
f =фЯ/х я и
. - значения концентрации в точке x^h-k в момент времени t3*i-3, 1 и h представляют собой шаги сетки по времени и координате. Константы А и В представляют собой соответствующие коэффициенты при линейной интерполяции кривой титрования.
Численные расчеты пргводились для различных белков Как
n.Tf идезлиг'чропаичьк ч-лдпдьчых np:*t«>pon. -лк и ;;.~rt ;.\;г.-.н;я-, счлпдкпгш'лихся з пронесся . Для рас-кт;::!.
~.1'г~<., Сралис:» различные татлнял: распр^::*:^';:*";! :-п!:псптрлц!г/ фокусируемые бдлкоч.
7"эт неоднородности электропроводности nos"-!тел огуы.гнй-к илСлодазксз на практика явление :<■:у.хv.п :с''н
(с?:. ;:.тс.4) . Яри начальном рлспрслилтаии белка !; яолоикр, соотпотствующем локализации болычев части -шосрмого препарата п одчоч *пе?.кй , л елу ;ае яер?п»а1п>ркоР ило.гтропрогодности (со значительно гмрдупякыч ¡«"^¡¡мумом п центральной части градиента), фиохко иабладлть сильно» улкрение зоны на начальной этапе фскгустрожшая, т« ка-: передний фронт лвизгатся быстрее чем .чадг.гг-, чтг. и • е-ызывапт разчыгие. На основе результатов чнелтшкх расчотоа. были тмбрзны диапазон рН-грпдиента к врем«.«« разделе^!:;!.
Р;яг. //.?■: v.iauHtI прежняя го'Щетрзцт: б^п ха я кпд г>
'П"ст<?шлзго зкепврхмянта по иокажфопапкъ /¡;шан:::<я <г-я:>.т<?кгго^окускропа»«гя (¿зраамаегь скороспг псрзноса от r:nr>p.4>vr,izn - /гл'.'лл^.-.'о-"1 распределена/»
гот:;(^ 'гг *
