Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13 С тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Ковалевский, Дмитрий Валерьевич
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1998
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
.Б
0 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М. В. Ломоносова
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи УДК 547.992.2
Ковалевский Дмитрий Валерьевич
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДАМИ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 1Н И ,3С
02.00.03 - Органическая химия
11.00.11 - Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва-1998
Работа выполнена в лаборатории физической органической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ им М. Б. Ломоносова.
Научные руководители: доктор химических наук, профессор
В. С. Петросян кандидат химических наук И. В. Перминова
Научный консультант: кандидат химических наук
А. Б. Пермин
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Г.А. Калабин
кандидат химических наук Ю. А. Стреленко
Ведущая организация: ГНИИХТЭОС
Защита состоится "3" декабря 1998 года в ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 053.045.46 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет, аудитория ш
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.
Автореферат разослан <гъ> ноября 1998 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук
Т. В. Магдесиева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Гумусовые кислоты (ГФК) представляют собой збширный класс органических соединений природного происхождения и ¡оставляют от 60 до 80% органического вещества водных и почвенных сред. Нерегулярность строения углеродного скелета ГФК в совокупности с эбогащенностью гетероэлементами (среди которых преобладает кислород - до 50% масс.) обусловливает разнообразие и переменный состав структурных фрагментов, образующих их молекулы. Однако диапазон вариаций фрагментного состава ограничен в связи с единством принципа строения ГФК различного происхождения, которое характеризуется наличием ароматического каркаса, замещенного функциональными группами и алкильными цепочками, и периферийного карбогидратно-пептидного комплекса. Указанное строение ГФК обеспечивает их высокую реакционную способность по отношению к тяжелым металлам и органическим экотоксикантам, поступающим в природные среды. Создание прогностических моделей поведения экотоксикантов с учетом влияния ГФК требует установления количественных соотношений между структурой и свойствами последних. Принимая во внимание нерегулярность строения ГФК, получение таких соотношений возможно только при условии корректного численного описания их структуры на основе данных по детальному фрагментному составу.
Данное обстоятельство определяет важность и актуальность изучения структуры ГФК методами 'Н и 13С ЯМР-спекгроскопии, комплексное использование которых позволяет охарактеризовать распределение основных конституционных элемешов между структурными фрагментами, составляющими макромолекулы. При этом в связи со сложностью объекта исследования до сих пор отсутствуют единые методические подходы к регистрации количественных спектров 13С ЯМР ГФК, не разработаны методы определения водорода функциональных групп из ПМР-спектров. Как следствие, имеющиеся сведения о детальном фрагментом составе ГФК весьма противоречивы и не могут быть использованы для количественного описания их структуры. Указанные проблемы определили постановку целей и задач настоящей работы.
Цель работы: исследовать структуру гумусовых кислот при помощи расчета детального фрагментного состава из данных спектроскопии ЯМР 'Н и 13С.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Качественно охарактеризовать фрагментный состав ГФК различного происхождения.
• Разработать методические подходы для количественного исследования структуры ГФК методами 'Н и |3С ЯМР спектроскопии:
• Провести комплексный анализ данных 'Н и 13С ЯМР спектроскопии да определения детального фрагментного состава ГФК различное происхождения.
• Применить данные по фрагментному составу для идентификации препарато] ГФК по источнику происхождения и продемонстрировать их применимосл для установления количественных соотношений структура-свойство.
Научная новизна.
Разработана схема расчета детального фрагментного состава ГФК н; основании комплексного анализа данных 13С и 'Н ЯМР спектроскопии. Пр1 этом содержание сложноэфирных и ароксильных фрагментов ГФК был< определено при помощи спектроскопии ЯМР впервые.
Разработан способ количественного анализа распределения водорода i структуре ГФК методом ПМР спектроскопии. При этом впервые предложи метод определения функциональных групп при помощи спектроскопии ПМР.
Установлены достоверные структурные различия ГФК важнейши: природных источников на основании статистического анализа данных п< детальному фрагментному составу. Показано, что в структуре ГФК торфа и поч] спиртовые гидроксилы в основном принадлежат полисахаридным фрагментам, ; в ГФК пресных вод до 50% этих групп не входит в состав полисахаридов.
На основании анализа одномерных и 'Н-'Н COSY ПМР спектро] установлено, что для структуры ГФК нехарактерно наличие длинноцепочечньп алкильных фрагментов.
Предложен способ использования данных по фрагментному составу да корректировки результатов гель-хроматографического определения молекулярньг масс, позволяющий учитывать структурные различия ГФК.
Установлена взаимосвязь меаду фрагментным составом ГФК и и: детоксицирующей способностью по отношению к Cu2+, Cd2+, Pb2+.
Практическая значимость работы.
Полученные данные по детальному фрагментному составу представительно! выборки препаратов ГФК различного происхождения могут быть использован! для создания атласов и баз данных по структуре ГФК, а также для построения i верификации их структурных формул.
Разработанные методические подходы к количественному исследовании ГФК методами 'Н и 13С ЯМР спектроскопии могут быть использованы да серийных анализов гуминовых веществ в практике исследовательски: лабораторий.
Установленные взаимосвязи между структурой ГФК и и: детоксицирующими свойствами по отношению к Cu2+, Cd2+ и РЬ2+ могут быт: использованы для создания прогностических моделей, учитывающих влияни
ГФК различного происхождения на развитие токсикологической ситуации в природных средах, загрязненных тяжелыми металлами.
Апробация работы. Отдельные части работы были представлены на Международном конгрессе "Вода: Экология и токсикология" (Москва, 1994), VII, VIII и IX Конференциях Международного общества по изучению гумусовых веществ (Санкт-АЕгустин, 1994; Вроцлав, 1996; Аделаида, 1998), Международном симпозиуме "Тяжелые металлы в окружающей среде" (Пущино, 1996), Ломоносовских чтениях (Москва, 1996), Симпозиуме "Refractory organic substances in the environment" (Карлсруэ, 1997), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), X Международной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (Суздаль, 1998).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 14 тезисов докладов.
Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы и приложений.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Краткая характеристика объекта исследования
Гумусовые кислоты, представляющие собой сумму гуминовых (ГК) и фульвокислот (ФК) образуются в природных средах в результате химического и биологического разложения растительных и животных остатков. В основе данного процесса лежит отбор кинетически устойчивых структур и объединение их в макромолекулы случайным образом.
Для структуры ГФК характерно наличие ароматического каркаса, замещенного алкильными цепочками и функциональными группами (главным образом, карбоксильными и гидроксильными), и полисахаридно-пептндной периферии. Данный принцип строения хорошо иллюстрируется структурной формулой, приведенной на рис. 1. Однако характерные для ГФК нерегулярное строение и переменный состав обуславливают низкую количественную достоверность этого традиционного способа представления структуры. Несмотря на то, что в последние годы появились единичные работы по использованию ЯМР 13С спектроскопии для моделирования строения углеродного скелета ГФК, о составе функциональных групп по-прежнему судят из результатов функционального анализа. В связи с изложенным представляет несомненный интерес комплексное исследование структуры ГФК при помощи 13С и 'Н ЯМР-спектроскопии, которое позволит охарактеризовать полное распределение углерода и водорода в молекулах ГФК. При этом типичный для ЯМР-спектроскопии способ представления структурных данных в виде фрагментного состава может оказаться весьма перспективным с точки зрения генерации численных структурных дескрипторов ГФК.
Рис. 1. Гипотетическая модель структурного фрагмента ГФК (*К1ет]1етре1, 1970).
Выделение и характеристика препаратов ГФК
Для проведения исследований был использован 31 препарат ГФК, выделенных по стандартным методикам из различных природных источников (табл. 1). Препараты РМХ-8 и ПХ-8 были выделены в рамках данной работы.
Выделенные твердые препараты ГФК представляли собой аморфные порошки коричневого цвета, не имеющие точки плавления и разлагающиеся при нагревании выше 150°С. Проведенные исследования показали, что они практически нерастворимы в большинстве органических растворителей, ограниченно растворимы в полярных апротонных растворителях (ДМСО и ДМФА) и воде (до 15 г/л), но хорошо растворимы в щелочах (до 30 г/л).
Все препараты ГФК были охарактеризованы методом элементного анализа (табл. 1). Результаты были пересчитаны на органическое вещество при помощи корректировки на несгораемый остаток (зольность), составлявший 1-15%, и равновесную влажность препаратов, составлявшую 6-10%.
Как видно из данных элементного анализа, основными элементами в структуре ГФК являются С, Н и О, содержание азота и серы на порядок ниже. В связи с этим азот- и серосодержащие фрагменты отдельно не рассматривали, а включали их при расчете в число аналогичных кислородсодержащих.
Качественная характеристика фрагментного состава ГФК.
Качественная характеристика фрагментного состава была проведена на основании анализа 13С ЯМР спектров ГФК (рис.2), двумерных 'Н-|3С НМС>С и
" ЮешЬетрс! О. // А1ЬгесЫ-ТЬаег-АгсЫу. 1970. В<1. 14. Н. I. 5. 3-14
Таблица 1
Описание и элементный состав (% масс.) препаратов ГФК
Препарат Описание С Н N О Н/С О/С
ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв
HBW ГК дерново-подзолистой почвы (лес) 51.1 4.2 5.2 39.4 0.99 0.58
НВР ГК дерново-подзолистой почвы (пашня) 52.0 4.6 5.2 38.2 1.06 0.55
HBG ГК дерново-подзолистой почвы (огород) 55.1 5.1 4.7 35 1.11 0.48
HBWN ГК дерново-подзолистой почвы (лес) 54.3 4.6 4 37.1 1.02 0.51
HGW ГК серой лесной почвы (лес) 49.2 4.3 5.0 41.5 1.04 0.63
HGP ГК серой лесной почвы (пашня) 48.3 4.2 4.8 42.7 1.05 0.66
ГК черноземов
HS ГК чернозема лугового 54.3 3.9 4.6 37.2 0.86 0.51
HST ГК чернозема типичного 54.8 3.5 4.0 37.8 0.77 0.52
HMG ГК лугового-глеевого чернозема 54.9 4 2.6 38.5 0.87 0.53
ФК почв
FAIN ФК дерново-подзолистых почв (лес) 51.9 4.3 2 41.8 0.99 0.60
FA3N ФК дерново-подзолистых почв (огород) 50.7 4.4 2.6 42.3 1.04 0.63
ГФК торфа
Т1 ГФК верхового фускум-торфа 52.1 4.5 2.0 41.4 1.04 0.60
Т4 ГФК верхового сфагнум-торфа 54.0 4.8 2.3 38.9 1.07 0.54
Т5 ГФК верхового торфа 51.3 4.5 2.2 42 1.05 0.61
Тб ГФК верхового пушициевого торфа 53.5 4.2 1.3 41 0.94 0.57
Т7 ГФК верхового фрезерного торфа 54.8 4.4 1.7 39.1 0.96 0.54
Т10 ГФК низинного осокового торфа 50.9 4.2 3.2 41.7 0.99 0.61
HTL ГФК верхового сосново-пушициевого торфа 52.2 4.3 1.7 41.8 0.99 0.60
TTL ГФК низинного древесного торфа 51.1 4.1 2.5 42.3 0.96 0.62
НТО Коммерческий препарат НПО Биолар 52.7 4.6 2.8 39.9 1.05 0.57
ГФК природных вод
FMX-8 ГФК р.Москва 51.2 4.9 1.6 42.3 1.15 0.62
FIX-8 ГФК р.Истра 52.7 5 1.6 40.7 1.14 0.58
ГФК бурого угля
AG К Коммерческий препарат АО Спецбиотех 59 4.6 0.5 36 0.94 0.46
AHA Коммерческий препарат Aldricli 57.5 4.6 0.7 37.2 0.96 0.49
Прочее
BSIFA ФК водного экстракта почвы 53.2 4.5 0.7 41.6 1.02 0.59
FG1FA ФК грунтовых вод 54.6 5.2 1.0 39.2 1.14 0.54
H010FA ФК болотных вод 53.8 4.5 0.9 40.8 1.00 0.57
FV/ME-4 О В болотных вод 52.5 4.9 1.7 40.9 1.12 0.58
HTW ОВ водного экстракта верхового торфа 50.6 6.3 1.7 41.4 1.49 0.61
SEL ГФК чернозема 51.4 4.4 4.1 40 1.03 0.58
SWM4 ГФК донных отложений торфяных болот 50.1 4.5 1.9 43.5 1.08 0.65
Рис. 3. Подспектры СН3, СН2, СН, С и полный 13С ЯМР спектр препарата FA3
'Н-'Н COSY спектров (рис.3), и полученных при помощи импульсных последовательностей DEPT и QUAT подспектров СН3, СН2, СН и С фрагментов (рис.4). Регистрацию одномерных ПМР и 13С ЯМР спектров проводили на спектрометре VXR-400. Регистрация спектров DEPT и QUAT, а также двумерных спектров была выполнена автором на спектрометрах Bruker 400 и 500 МГц в институте экологической химии (IOEC GSF), Мюнхен, Германия. Обработку спектров проводили на ПК с использованием программ NUTS и WINNMR.
Как видно из рис.2, вне зависимости от источника происхождения ГФК, их 13С ЯМР спектры не содержат индивидуальных пиков, представляя собой суперпозицию большого числа сигналов. Поэтому общепринятым подходом к их обработке является разбиение на диапазоны химических сдвигов, которое для спектра 13С показано на рис. 2. Группам сигналов в выделенных диапазонах можно дать следующее отнесение:
187-220 м.д. - кетонные и хинонные группы; 165-187 мл. - карбоксильные и сложноэфирные группы;
108-165 м.д. - ароматические фрагменты. Из подспектров DEPT и QUAT видно, что в этой области невозможно разделить сигналы незамещенных и С-замещенных атомов углерода, однако можно с достаточной точностью выделить сигналы О-замещенных атомов углерода (145-165 м.д.).
90-108 мл. - ацетальные атомы углерода. Указанное отнесение было дано в нашей работе на основании анализа двумерных 'Н-13С HMQC ЯМР спектров (рис. За). Оно подтверждается и наличием корреляционных пиков в 1Н-1Н COSY спектре (рис. 36) между сигналами протонов указанных фрагментов и СН-ОН фрагментов. В литературе есть другие мнения по этому вопросу, в частности, эти сигналы относят к незамещенным атомам углерода ароматического кольца в орто-положении к которым находятся два ОН-заместителя.
90-48 мл- - другие гетерозамещенные алифатические фрагменты, включая сигналы вторичных спиртовых и эфирных СН-О фрагментов (90-65 м.д.), первичных спиртовых и эфирных СЬЬ-О фрагментов (62-67 м.д.), а также СН3-О групп (58 м.д.) Данные отнесения подтверждаются при рассмотрении двумерных 'Н-'3С HMQC спектров (рис. За). Раздельное определение перечисленных фрагментов не представляется возможным, поскольку группы сигналов в области 90-48 м.д. сильно перекрываются (рис. 4).
5-48 м.д. - алифатические фрагменты, не связанные с гетероатомами. Можно наблюдать сильно перекрывающиеся группы сигналов СН3 и СН2 фрагментов. Количество сигналов третичных атомов углерода существенно ниже. Сигналы четвертичных атомов углерода практически не наблюдаются как в области гетерозамещенного, так и незамещенного алифатического углерода. В Н-Н COSY двумерном спектре следует отметить интенсивный корреляционный пик в области 1.4—2.2 м.д., характерный для взаимодействия алифатических СН([.2) фрагментов в а- и (3-положениях к ароматическому кольцу или карбоксильной группе.
Приведенное рассмотрение показывает, что основными структурными фрагментами ГФК являются карбонильные (Сс=о). карбоксильные (Ссоон) и сложноэфирные (Ссооя) группы; атомы углерода ароматических колец с соответствующими заместитетлями: незамещенные (Сд^н), С-замещенные (Qv-c)> связанные с гидроксильной (Сд^он) и алкоксильной (Сдг-or) группами; вторичные (Ссн-он) и первичные (Сснг-он) спиртовые фрагменты, метоксильные группы (Соснз) и несвязанные с гетероатомами алифатические фрагменты (Сд^).
В ходе дальнейших исследований было установлено, что указанный фрагментный состав характерен для ГФК всех использованных источников.
Исследование структуры ГФК методом спектроскопии ЯМР 13С
Получение методом ЯМР ,3С количественных спектральных данных имеет особую важность для определения фрагментного состава. Основная проблема регистрации количественных спектров 13С ЯМР связана со значительными различиями в скоростях релаксации ядер 13С различного типа. Использование водорастворимых релаксантов, таких как соли переходных металлов, невозможно из-за образования малорастворимых гуматов. С другой стороны, малая подвижность молекул ГФК и присутствие в них парамагнитных центров приводят к существенному снижению и выравниванию Т[, хотя точные их значения неизвестны. В настоящий момент не существует единого мнения о приемлемых экспериментальных условиях, позволяющих получать количественные спектры 13С ГФК с высоким соотношением сигнал/шум при разумных затратах времени на регистрацию спектра. Используемые в литературе времена релаксационной задержки Та составляют от 0.5 до 10 сек.
В связи с этим нами был проведен эксперимент по выбору оптимального Тй на 12 препаратах ГФК различного происхождения. Для каждого из них регистрировали 5 спектров со временем задержки от 1 до 8 сек, и определяли изменение относительной интенсивности каждой спектральной области при увеличении Та- Результаты показаны на рис. 5. (1т/11 - отношение интенсивности спектральной области к таковой при Та = 1 с.)
Все зависимости ¡т/1 / (Т^) выходят на плато при Т^=4 с, что позволяет говорить о количественности спектров, получаемых в таких условиях. В связи с этим для проведения последующих экспериментов использовали время задержки 4 с. Для устранения ядерного эффекта Оверхаузера все спектры регистрировали при выключении развязки от протонов на период Т^.
Рис. 5. Зависимость относительной интегральной интенсивности сигнала различных спектральных областей от времени задержки.
В описанных условиях были получены количественные спектры 31 препарата ГФК, использованные в дальнейшем при расчете фрагментного состава (табл. 2).
Для оценки согласования получаемых спектральных данных с результатами элементного анализа нами был предложен способ расчета соотношения Н/С из данных спектроскопии ЯМР по уравнению:
Н/С=(2/3(САг.Н)С + Сдг-о) + 5/30^-0 + 2СА1к)/£С (1)
Формула (1) основана на предположении, что стуктурные фрагменты соединены в незамкнутую последовательность, при этом все атомы Сдлс-о рассматриваются как углерод циклических полисахаридных фрагментов С6Ню05. В связи с высокой молекулярной массой ГФК мы пренебрегали концевыми атомами водорода. Завышение результатов такого расчета по сравнению с данными элементного анализа будет указывать на неколичественные условия регистрации 13С ЯМР спектров за счет переопределения обогащенных водородом фрагментов с минимальными Т]. Сопоставление результатов расчета с данными элементного анализа продемонстрировало хорошее совпадение значений (рис.6).
ЯМР спектроскопии и элементного анализа.
Исследование структуры ГФК методом спектроскопии ПМР
На сегодняшний день проблема количественной характеристики распределения водорода в структуре ГФК остается нерешенной. В первую очередь это обусловлено наличием в структуре ГФК водорода двух типов -подвижных протонов функциональных групп, положение сигналов которых может изменяться в зависимости от условий, и скелетных СН-протонов. Проблема определения подвижных протонов, возникает в результате:
- перехода всех сигналов протонов функциональных групп ГФК в пик остаточных протонов растворителя НБО при регистрации спектров в 0.1М МаСЮ/ОгО из-за быстрого (в шкале времени ЯМР) обмена;
Таблица 2
Распределение углерода (% от общего) в структуре ГФК по данным спектроскопии ЯМР 13С.
Препарат___Спектральная область_
ГФК 220 - 187 187-165 165-145 145-108 108-90 90-48 48-5
Сс=о Ссоон(ю САГ-О САг-Н,С Со-А1к-0 СА1к-0 СА11С
ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв
НВ\У 1 17 13 32 2 18 18
НВР 2 16 12 32 4 17 17
НВС 1 15 13 33 3 18 17
НвХУ 1 19 13 34 2 14 17
НОР 2 15 12 34 3 15 19
нв\т 2 15 13 30 3 17 20
ГК черноземов
НБ 2 14 9 48 2 12 14
НБТ 3 16 11 43 3 12 13
НМО 2 15 11 46 ■2 10 15
ФК дерново-подзолистых почв
РАШ 3 20 12 23 2 17 24
РАЗИ 3 18 12 29 2 17 19
ГФК торфа
Т1 1 15 10 29 3 22 20
Т4 1 16 12 31 4 21 16
Т5 1 16 10 27 3 19 24
Т6 2 15 14 36 2 16 15
Т7 2 17 15 34 2 16 15
Т10 2 16 15 33 1 16 16
HTL 1 15 14 31 3 18 17
ТТЬ 3 15 13 32 3 17 17
НТО 3 13 13 31 4 20 16
ГФК природных вод
РМХ-8 2 19 11 25 3 16 24
Р1Х-8 2 18 12 26 3 19 20
Р01РА 1 16 9 25 4 20 26
ОН ЮРА 1 18 13 30 4 17 18
ГФК бурого угля
АвК 1 17 10 48 0 4 21
АНА 1 15 13 43 0 7 21
Прочее
БЕЬ 1 18 13 32 4 18 14
Р\УМЕ-4 2 17 11 19 6 28 18
SWM4 2 16 12 26 5 25 14
НТ\У 0 11 3 13 9 50 15
ВБ1РА 3 17 10 35 2 14 19
- перекрывания пиков протонов функциональных групп с сигналами скелетных С-Н протонов ГФК при регистрации ПМР спектров в ДМСО-<36;
- изменения химических сдвигов сигналов протонов фунциональных групп ГФК в органическом растворителе в присутствии следовых количеств воды.
Помимо этого в ПМР спектрах ГФК присутствует сигнал протонов растворителя, перекрывающийся с сигналами протонов ГФК и препятствующий определению их полной интегральной интенсивности.
Для решения перечисленных проблем нами было предложена схема комплексного ПМР эксперимента, основанная на:
- регистрации ПМР спектров ГФК в условиях медленного (в шкале времени ЯМР) обмена в ДМСО-с36 (рис. 7а), позволяющих наблюдать разделенные сигналы протонов карбоксильных, фенольных и спиртовых групп.
- регистрации спектров в ДМСО-б^ в условиях быстрого обмена в присутствии избытка сильной кислоты СР3СООБ (рис. 76), позволяющих определить количество С-Н протонов, сигналы которых перекрываются с сигналами протонов функциональных групп в спектре в ДМСО-с1б.
- регистрации ПМР-спектров ГФК в 0.1 М КаСШ/ОгО (рис. 7в) и их сопоставления со спектрами в ДМСО-ё6 , позволяющего определить в последних долю сигналов алифатических протонов ГФК, закрытую пиком ДМСО, и рассчитать суммарную интенсивность сигналов протонов ГФК.
Сопоставление спектров в ДМСО-<36 до и после добавки СРзСОСЮ позволяет определить доли сигналов скелетных и подвижных протонов в интервалах (11.5-6 м.д.) и (6-3.2 м.д.) в спектре ГФК в ДМСО-сЗ^. Для проведения такого сопоставления интенсивности этих областей нормировали на не изменяющуюся в этих условиях интенсивность области 3.2-2.05 м.д.
_ , гОМЗО тСШО»СГ,СООО Сд,—ин/ _ 11.5-6 "'3.2-2 05_
/С. — Н тОкСО+С^СОСЖ тС№0
-1 (2)
3.2-2.05
„ / тОМЗО тОМЗО+СПСОСФ 1-дц — ин/ _ 15-3 2 ' 3 2-1.05_
/СН —О тОМЗО+СЮСООО т[-----
' » '1т
-1 (3)
3.2-2.05
где 1^(0 М50) и ^фМБО+СРзСООО) - относительные интенсивности данных спектральных диапазонов в спектрах в ДМСО-с1б и ДМСО-с1б+СРзСООО.
Для исследования полноты разделения подвижных и скелетных протонов при добавлении СРзСООО были проведены эксперименты на модельных соединениях - 2,4-дигидроксибензойной кислоте и полидекстране. Результаты расчета хорошо совпали с теоретическими значениями.
Корректность предложенного метода разделения подвижных и скелетных протонов была также проверена при помощи проведения дейтерообмена ГФК. Соотношения Сдг-ОН/Сдг-Н и Сдцс-0Н/СНп-0, рассчитанные из сопоставления спектра препарата ГФК, подвергнутого исчерпывающему обмену с БгО, со спектром без дейтерообмена, хорошо совпали с рассчитанными согласно (2, 3).
Рис.7. Спектры ПМР препарата НМО в ДМСО-с)6 (а), ДМСО-с)6 с добавкой СИзСОСЮ (б) и в 0.1 М На00/Б20 (в).
При сопоставлении спектров в ДМСО-(Зб и ШСЮ/ОгО вычисляли отношение интенсивностей сигналов а-СНп-протонов ГФК и остаточных протонов ДМСО в области 2.05-3.2 м.д. (Нормирование выполняли на область 0.5-2.05 м.д., которая в данных условиях не изменяется.)
„ / IОМЗО тС,0
"ОМБО/ _ , '2.05-05 ' 3 2-2 05 ,д\
/а-С Н ' 1°:° I омм
" '2.05.0 5 ' '3 2-2.05
Это позволило вычесть из спектра в ДМСО-<Зб сигнал остаточных протонов растворителя и рассчитать абсолютные величины содержаний каждого из рассмотренных типов протонов в структуре ГФК. Общая схема эксперимента и обработки результатов представлена на рис. 8.
Рис. 8. Схема расчета распределения водорода в структуре ГФК.
При использовании ДМСО-с!^ высокой изотопной чистоты (99.95 ат.%Э) с высоким постоянством изотопного состава, можно избежать регистрации спектров в КаОЦ/БгО. В этом случае доля сигналов остаточных протонов ДМСО в интегральной интенсивности спектра а рассчитывается как
адмсо= (тдмсо* Ндмсо) / (мдмсо* Ндмсо +тГФК*НГФК) (5) где тдмсо и тГФК ~ масса внесенного ДМСО-с16 и навеска препарата ГФК; Ндмсо и Нгфк~ массовое содержание протонов в ДМСО-с1б и ГФК.
В условиях нашего эксперимента (навеска ГФК 15 мг с содержанием водорода 3.5—5%, количество ДМСО-с16 0.7 мл 99.95 ат.%Э) сигнал остаточных протонов ДМСО составлял 2-3.5% от общей интенсивности спектра.
Справедливость расчета при помощи формулы (5) была подтверждена сопоставлением его результатов с полученными из спектров в ДМСО-ё^ и ИзОО/Т^О. Результаты определения совпадали в пределах 5% от величины.
Согласно разработанной схеме ПМР эксперимента было охарактеризовано распределение водорода в структуре 21 препарата ГФК (табл. 3).
Описание структуры ГФК при помощи фрагментного состава
Описание структуры ГФК проводили, рассчитывая содержание основных структурных фрагментов. При этом комплексный анализ данных 13С ЯМР и ПМР спектроскопии позволил расширить набор определяемых фрагментов (по сравнению с каждым методом) до двенадцати, которые приведены ниже: Сс=о. Ссоон. Ссоок. Сдюн. слюя. Смн, Са/с. Со-дис-о. Сснон. Ссшон. Соснз. Саш
Содержание фрагментов Сд^, Со-аис-о и Сс=о было получено непосредственно из данных 13С ЯМР спектроскопии. Содержание остальных фрагментов было рассчитано согласно следующим уравнениям:
Таблица 3
Распределение водорода в структуре ГФК по данным спектроскопии ПМР.
Препарат ГФК
Доля протонов, %
СООН Сдг-Н CArOH СНп-0 CaiitOH
ot-CHn
ГК дерново-подзолистых почв
HBW 9 13.5 7 27.5 9 15.5
HBWNd 8 12 7 29 6 17
ГК чернозема
HMG 11 20 8.5 22 6.5 17
ФК дерново-подзолистых почв
FAIN 13 8.5 7.5 24 8 19
FA3N 13.5 9.5 8 27 8 17
ГФК торфа
Т5 8 10 5 30 9 18
Тб 9.5 15.5 10 29 9 14
Т7 10 16 9 30 9 13
Т10 9 13.5 10.5 30 8 14
HTL 8 13 8 32 9 14
TTL 9 13 9 29.5 8.5 16
НТО 7 12 8 34 9 15
ГФК природных вод
FMX-8 12 7 5 28 8 19
FIX-S 12.5 7.5 8 29 7 18
FG1FA 11 6.5 4 28 9 21
HOIOFA 11 11 9 29 9 15
ГФК бурого угля
АйК 14 23 6.5 13 0 20.5
АНА 12 19.5 8.5 19.5 1 19
Прочее
БЕЬ 10.5 12.5 7 32.5 11.5 14
В51РА 14.5 12 8.5 29 6 16
SWM4 10 9 8 36 14 12
Ссоон _ Нсоон (ПМР) / Н/С( эл.ан.)
СсООЯ = (ССООЯ+СООн)(С-13) " НсоОН (ПМР) / Н/С(эл,ан.)
Сдгон = Ндюн (ПМР) / Н/С(ЭЛ.!1Н.)
САГОЯ = Сдг-О (С-13) - НдрОН (ПМР) / Н/С(эл.ан) (6)
СагН = НдгН (ПМР) / Н/С(ЭЛлн.)
СагС = САГ(С-В) - НдгН (ПМР) / Н/Сфл.ан.)
{ССНОН + ССН20Н + Соснз = СА1к-0(С-13)
2/5ССнон + Ожон = сА1к-°Н(пмР) I Н/С(эл ан )
Сснон + 2Ссн2он + 3 Соснз = СНп-0(пмр) / Н/С( эл.ан.) ~ 0-а1к-0(с-13)
Также были рассчитаны атомные соотношения Н/С в ароматических, алифатических и карбогидратных фрагментах.
(Н/С)аг = Ндг(ПМР) / (САГ(С-13) САГ-0(С-13)) / Н/С(эл ан.)
(Н/С)А1к = (СНЯ + а-СНп) щмР) / сд1к(С-13) / Н/С(эл.ан.) (7)
(Н/С)А1к-0 = СНП-0(ПМР) / СА1к-0(С-13) / Н/С( эл.ан.)
Рассчитанный фрагментный состав препаратов ГФК приведен в табл. 4.
Таблица 4
Распределение структурных фрагментов в исследованных препаратах ГФК.
Шифр Ссо Ссоон Ссоол САг-ОН Саг-ОЯ Саг-Н Саг-С Со-А1к О Сснзо Ссн-он Ссшон Сд1к Н/Сдис Н/Саг Н/СА1к-0
ГК дерново-подзолистых почв
НВУ/ 1.0 9.0 8.0 7.0 5.0 13.4 18.6 3.0 14.3 2.7 18.0 1.88 0.30 1.37
НВУ/Ш 2.0 8.2 6.8 7.1 5.9 12.3 17.7 4.5 12.9 2.6 20.0 1.94 0.29 1.48
ГК чернозема
НМО 2.0 9.6 5.4 7.4 3.1 17.5 28.0 3.0 7.5 1.5 15.0 1.87 0.27 1.60
ФК дерново-подзолистых почв
ИАШ 3.0 13.0 7.0 7.5 4.5 8.5 13.5 3.0 13.5 2.5 24.0 1.62 0.25 1.26
РАЗИ 3.0 14.2 3.8 8.4 3.6 10.0 19.0 3.5 13.0 2.5 19.0 1.88 0.26 1.49
ГФК торфа
Т5 1.0 8.4 7.6 5.3 4.7 10.5 17.5 3.0 16.0 3.0 23.0 1.74 0.29 1.44
Т6 2.0 8.9 5.1 9.4 4.6 14.6 23.4 3.0 12.5 2.5 14.0 1.82 0.26 1.52
Т7 2.0 9.6 7.4 8.7 6.3 15.4 18.6 4.0 11.0 2.0 15.0 1.67 0.30 1.70
Т10 2.0 8.9 7.1 10.4 4.6 13.4 19.6 4.0 11.5 2.5 16.0 1.79 0.28 1.65
ШЪ 2.0 7.9 7.1 7.9 6.1 12.9 18.1 4.0 14.0 3.0 17.0 1.74 0.28 1.51
ТТЬ 3.0 8.6 6.4 8.6 4.4 12.4 19.6 3.5 13.5 3.0 17.0 1.75 0.26 1.41
НТО 3.0 7.3 5.7 8.4 4.6 12.6 18.4 5.0 15.8 3.2 16.0 1.96 0.30 1.48
ГФК природных вод
РМХ-8 2.0 13.5 5.5 5.6 5.4 7.9 17.1 5.0 10.0 4.0 24.0 1.87 0.25 1.65
Р1Х-8 3.0 14.2 3.8 9.1 2.9 8.5 17.5 5.5 8.5 4.0 23.0 1.78 0.26 1.83
Р01РА 1.0 12.6 3.4 4.6 4.4 7.4 17.6 3.0 15.5 4.5 26.0 1.82 0.25 1.39
НО ЮРА 1.0 11.0 7.0 9.0 4.0 11.0 19.0 3.0 13.5 4.0 17.5 1.78 0.26 1.42
ГФК бурого угля
АвК 1.0 13.1 2.9 6.1 3.9 21.5 26.5 4.0 0.0 0.0 21.0 1.94 0.35 3.04
АНА 1.0 12.0 3.5 8.5 4.0 19.5 23.5 6.0 0.0 1.0 21.0 1.88 0.35 2.79
Прочее
ВБША 3.0 ' 14.7 2.3 8.6 2.4 12.2 25.8 5.5 8.5 2.0 15.0 2.03 0.25 1.84
БЕЬ 1.0 10.8 7.2 7.2 5.8 12.9 19.1 4.0 15.0 3.0 14.0 1.92 0.30 1.53
Б\УМ4 2.0 10.8 6.2 8.6 3.4 9.7 16.3 2.0 22.0 6.0 13.0 1.91 0.28 1.29
Максимальное содержание СООН групп характерно для препаратов ФК почв, ГФК природных вод и ГК угля. Соотношение Ссоон/Охкж резко отличается для разных групп препаратов, составляя 1.1-1.8 для ГК почв и ГФК торфа, 1.7-3.8 для ФК почв и ГФК природных вод и 3.5-4.5 для ГФК угля. Коэффициент корреляции между содержанием Ссоон и Ccoor в исследованных препаратах ГФК составляет -0.68.
Содержание ароматических фрагментов в исследованных препаратах ГФК снижалось в ряду:
ГК бурого угля>ГК черноземов>ГК Пд и Л почв>ГФК торфа>ГФК природных вод>ФК почв.
В то же время соотношение Сд^оДСагн+С^с+Саго) возрастало при уменьшении содержания ароматических структур. Коэффициент корреляции между этими параметрами составляет -0.68.
Соотношение (Н/С)аг, было минимально для ГФК природных вод и ФК почв и максимально в случае ГК угля. Как видно из табл. 4, более трети атомов углерода ароматических колец имеют С-заместители. 17-35% ароматических атомов углерода приходится на долю О-замещенных. Характер замещения «среднего» ароматического кольца для исследовавшихся препаратов ГФК описывается следующим образом: 2.6 Сдгс. 1-7 САго и 1.7 СдгН-
Для ГФК Пд почв и торфа содержание карбогидратных Сснон> ацетальных Co-aik-o и первичных спиртовых Ссн20Н фрагментов соотносятся в среднем как 4:1:1 и в ряду препаратов изменяются симбатно. В связи с этим был сделан вывод о принадлежности всех СНОН и СН2ОН фрагментов в этих препаратах к полисахаридным циклам. Напротив, для препаратов ГФК природных вод до 50% спиртовых групп не относятся к полисахаридам. Практически не содержат полисахаридов ГК угля, а ГК черноземов характеризуются низким их содержанием. Высокая обратная корреляция между содержанием полисахаридных и ароматических структур свидетельствует о том, что увеличение доли ароматических фрагментов в структуре ГФК в значительной степени обуславливается отщеплением полисахаридов.
Содержание алифатических фрагментов выше для ГФК природных вод и ГК угля, в то время как их наименьшие количества обнаружены в ГФК торфа. Для всех исследованных препаратов около 50% алифатических протонов принадлежит а-СНп группам. Это свидетельствует о том, что для алифатической части ГФК нехарактерно наличие длинноцепочечных алифатических фрагментов. Данное предположение подтверждается анализом 1Н-1Н COSY спектров, в которых пик полиметиленовых цепей не имеет высокой интенсивности.
На основании приведенного фрагментного состава могут быть рассчитаны характеристические параметры, описывающие наиболее существенные различия структуры ГФК различного происхождения (рис. 9). Отношение содержания полисахаридов и ароматической части СзАСдгн+СагС+Саг-о) характеризует
степень гумификации ГФК. Отношение Ссоон/Ссосж отражае гидролизованность структуры. Отношение САг_о/(СагН+СагС+Саг-о)> позволяе судить об окисленности ароматических колец.
Соотношения Саг.о/(САгН+САгС+СА1Г.о)и Сз/СС^н+Сд^+Саг.о) возрастаю симбатно в ряду от ГК бурого угля до ФК почв. Соотношение Ссоон/Оюо снижается в ряду от ГК бурого угля до ГФК торфа. Однако для ГФК природны вод и ФК почв это соотношение довольно высоко.
Рис. 9. Характеристические параметры структуры ГФК различного происхождения.
Для установления значимости различий фрагментного состава ГФ1 различного происхождения полученные результаты были подвергнуть кластерному анализу (рис. 10). Как видно из рисунка, можно выделить 4 группь препаратов с достоверными различиями структуры. При этом полученное распределение по кластерам соответствует распределению препаратов п< источникам происхождения.
ГК Пд и Л почв, ГФК торфа
ГФК пресных вод
ГК черноземов
ГК бурого угля
Рис.10. Классификация препаратов ГФК при помощи кластерного анализа.
Обращает на себя внимание сходство структуры ФК почв и ГФК природньс вод. Это может служить указанием на высокий вклад ФК почв в формирован» ГФК природных вод. Сходную структуру также имеют ГК Пд и Л почв и ГФЬ
торфа. Структура препаратов ГК черноземов и бурых углей резко отличается от остальных препаратов. Полученные закономерности согласуются с представлениями о специфике образования ГФК в различных природных средах.
Таким образом, рассчитанный фрагментный состав позволил охарактеризовать основные закономерности строения ГФК. На заключительном этапе работы была исследована его применимость для установления количественных соотношений структура-свойство. Для этой цели данные по фрагментному составу были использованы для коррекции результатов гель-хроматографического анализа и описания детоксицирующих свойств ГФК.
Применение данных по фрагментному составу ГФК для коррекции результатов гель-хроматографического определения молекулярных масс
Традиционным методом определения молекулярных масс (ММ) ГФК является гель-хроматография. Экспериментально определяемой величиной служит хроматографический коэффициент распределения К^, характеризующий объем пор геля, доступный для молекул данного размера. Расчет ММ из К^ осуществляется из калибровочной зависимости, получаемой для стандартных веществ. Условием правильного определения ММ является сходство структуры анализируемого вещества и стандарта. В связи с тем, что для ГФК подходящих стандартов не существует (обычно используют полидекстраны), нами был предложен способ учета структурных различий, основанный на представлении экспериментально определяемого К^ в виде:
КЙ = Као+ДК^ (7),
где К<й - "идеальный" коэффициент распределения, определяемый из калибровки по полидекстранам, ДК^ - поправка на структурные различия.
Уравнение связи между ДК^ и структурой анализируемого вещества было получено на основании регрессионного анализа соответствующих данных (К^ и фрагментный состав) для низкомолекулярных соединений, моделирующих основные структурные фрагменты ГФК, и имело следующий вид:
ДК^ = 0.21 -1.24Саюк +0.35ССООн -0.18С/0 +0.07С/Н (8)
Соответствие рассчитанных согласно уравнению (8) и экспериментально определенных ДК<1 проиллюстрировано на рис. 11.
Применимость данного подхода для полиэлектролитов была проверена на модельных полимерах. Как видно из рис. 12, молекулярные массы, определяемые из калибровки по полидекстранам, на порядок выше истинных. Введение поправки на структурные различия существенно улучшает результаты определения, свидетельствуя об адекватности способа корректировки.
Разработанный способ корректировки был использован при определении средних молекулярных масс препаратов ГФК (рис. 13). ДК<1 рассчитывали по уравнению (8) из данных по фрагментному составу (табл. 4). Было показано, что введение поправки снижает определяемые ММ на 1-4 тысячи дальтон.
Г2=0.84О4 0.2 г/ ■ У Jf ■ ^ ■ ■ л»* мс п ■
в -0.4 -0.2 Jr ш / ' ■ ■ / « / 44 / | 02 0.4 i
Рис. 11. Сопоставление экспериментально полученных и рассчитанных согласно (8) величин ДКй для низкомолекулярных модельных соединений.
100000 10000 мм, Дальтон Полиметакр иловая кислота 100000 ММ, Дальтон Лолистиролсульфоновая кислота
1000 10000
100 экспериментальная 1000 экспериментальная
10 расчетная без коррекции К4 -»- расчетная без коррекции
1 i 1 t i
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.1 0.2 0.3 0.4 0.S
Рис. 12: Применение метода расчета для полиэлектролитов.
Ц* Дальтон а « g
25000 g g | |
" г 2 Sc
$ я ^ £ и £
— М I i гч_ П4
15000 £ в ^ г-№ ¡¡|
-li ifBllJH
Рис. 13 Средние молекулярные массы ГФК различного происхождения.
Q - исходные, Н - скорректированные на структурные различия.
Исследование взаимосвязи между структурой ГФК и их детокснцирующими
свойствами по отношению к тяжелым металлам Влияние ГФК на токсичность тяжелых металлов (ТМ) было исследовано по отношению к Cu2+, Cd2+ и РЬ2+. Токсичность ТМ определяли методом альгологического биотестирования, в качестве биотеста использовали зеленую микроводоросль Chlorella vulgaris. Тест-откликом служил относительный выход переменной флуоресценции, характеризующий фотосинтетическую активность
водоросли. Для исследования детоксицирующих свойств ГФК использовали концентрации металлов, вызывающие 100% подавление фотосинтеза.
Для оценки детоксицирующего действия ГФК был введен коэффициент детоксикации (D), рассчитываемый как
f _R,(R,-R<J],100%) (10)
I Rd(R0-R,)J
где R - тест-отклик: Ro - в контрольных экспериментах, R<j - в присутствии ГФК, Rt - в присутствии токсиканта, Rd+t - в присутствии токсиханта и ГФК.
Зависимости D от концентрации ГФК различного происхождения для Си2+ и Cd2+ приведены на рис. 14. Препарат ФК морских вод и данные о его структуре были предоставлены NAOML (Miami, USA). ГФК торфа (HTL), ГК почв (HBW) и ФК речных вод (FMX8) оказались довольно близки по детоксицирующей способности, вызывая полное снятие токсического эффекта в концентрациях 10-20 мг/л. В то же время ФК морских вод не обеспечивают полной детоксикации металлов во всем диапазоне исследованных концентраций.
Рис. 14. Детоксикация тяжелых металлов препаратами ГФК.
ГФК торфа -♦-ГФК речных вод ГК № почеы -«-ФК морских вод
Для сопоставления детоксицирующих свойств препаратов использовали параметр ДК50 - концентрацию ГФК, вызывающую 50% снижение токсичности. Для установления взаимосвязи со структурой проводили корреляционный анализ ДК50 с данными по фрагментному составу (табл.5).
Таблица 5
Коэффициенты корреляции между ДК50 и параметрами структуры ГФК.
<Ссоон+Саюн)*Саг (Сс00н+Саг0н)*САг Cs
Сдис-о Сдг
ДК»(Си) ДК50(Сс1) -0.99 -0.98 -0.93 -0.70 -0.65 -0.94
Максимальные значения коэффициентов корреляции были получены для параметров, отражающих обогащенность ГФК ароматическими структурами с СООН и ОН заместителями. Это подтверждает предположение о высоком вкладе салицильных фрагментов в комплексообразование ГФК с металлами.
ВЫВОДЫ
1. Количественно охарактеризован детальный фрагментный состав ГФК вод почв, торфа и угля. Определены общие закономерности строения I установлены достоверные структурные различия ГФК указанных основнье природных источников. Показано, что в структуре ГФК торфа и поч] спиртовые гвдроксилы в основном принадлежат полисахаридным фрагментам а в ГФК пресных вод до 50% этих групп не входит в состав полисахаридов Показано, что содержание сложноэфирных групп в ГК выше, чем в ФК.
2. Разработана схема расчета детального фрагментного состава ГФК, основанна: на комплексном анализе данных 'Н и 13С ЯМР спектроскопии. Предложе] набор из 12 структурных фрагментов, позволяющих детально описат структуру ГФК различного происхождения:
Сс=о. Ссоон. Ссооя. Сдгон. Сакж. Сагн- Сак:. Со-аис-о. Сснон. Ссн20н. Соснз* саш
3. Разработан метод количественной характеристики распределения водород функциональных групп и углеродного скелета ГФК при помощ: спектроскопии 'Н.
4. Экспериментально обоснованы оптимальные условия регистраци: количественных 13С ЯМР спектров ГФК.
5. Предложен способ использования данных по фрагментному составу дл корректировки результатов гель-хроматографического определени молекулярных масс ГФК.
6. Установлена взаимосвязь структуры и детоксицирующих свойств ГФК п отношению к Си2+, С<12+, РЬ2+.
Список работ
1. Perminova I.V., D.V. Kovaievskii et al. Humic substances as natural detoxicants. In: Humic substances and organic matter in soil and water environments: characterization, transformations and interactions. Eds. C.E.CIapp., M.H.B. Hayes et al. 1996, p. 399-406.
2. Perminova I. V., Frtmmel F., Kova/evsky D.V., et af. Depelopment of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances. Water Research, 1997, v. 31, p. 314.
3. Д.В. Ковалевский, А.Б. Пермин, И В. Перминова, B.C. Петросян. Выбор времени задержки импульса для количественной "С ЯМР спектроскопии гумусовых кислот. Вестник МГУ, сер. хим. (в печати)
4. Д.В. Ковхтевский, А.Б. Пермнн, И.В. Перминова, Д.В. Конноз, B.C. Петросян, Количественное определение обменных и скелетных протонов гумусовых кислот с помощью спектроскопии ПМР. Вестник МГУ, сер. хим. (в печати)
5. Ковалевский Д.В., Перминова И.В., Пермин А.Б., Петросян B.C. Исследование структуры гумусовых кислот различного происхождения при помощи спектроскопии 13С ЯМР. XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Реф., докл. и сообщ, Т.З, М„ 1998, с. 122.
6. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Конноз Д.В., Петросян B.C. Определение подвижных и скелетных протонов в структуре гумусовых кислот при помощи спектроскопии ПМР. XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Реф., докл. и сообщ, Т.З, М., 1998, с. 123.
7. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Коннов Д.В., Петросян B.C. Применение спектроскопии ПМР для исследования функционального составз гумусовых кислот. X Междунаровная конференция "Магнитный резонанс в химии и биологии". Суздаль'98, 1-7 июня 1998. с.189-190.
8. Ковалевский Д.В., Перминова И.В., Пермин А.Б., Петросян B.C. Выбор условий для получения количественных 13С ЯМР спектров гумусовых кислот. X Междунаровная конференция "Магнитный резонанс в химии и биологии". Суздаль'98, 1-7 июня 1998. с. 190-191.
9. D.V. Kovaievskii, I.V. Perminova, А.В. Permin, and V.S. Petrosyan, "C-NMR characterisation of structural features of humic substances of different origin. Abstract Book, 9th Meeting of IHSS, 21-25 Sept. 1998, Adelaida, Australia.
10. D.V. Kovaievskii, I.V. Perminova, A.B. Permin, and V.S. Petrosyan. 'H-NMR spectroscopic determination of excharsgable and skeleton protons in the structure of humic substances. Abstract Book, 9th Meeting of IHSS, 21-25 Sept. 1998, Adelaida, Australia.
11. Ковалевский Д.В. Описание структуры гумусовых кислот в виде набора структурных параметров. - 30-я международная конф. молодых ученых "Ломоносов-96", 03-06 Апр. 1996, Москва, с 46.
12. Kovalevski D. V., Perminova I. V., Kudryavtsev A. V., A new approach to description of structure of humic substances and its application to estimating a quantitative structure - property relationship. Abstr. of8'h meeting of IHSS, Wroclaw, 1996, P. 99.
13. Perminova I.V., Kovalevski D.V., Kudryavtsev A.V., Petrosyan V.S. Structural parameters for correction of SEC-data of HS? Report at the 8Л meeting of IHSS, Wroclaw, 1996
14. I.V. Perminova, F.N. Frimmel, D.V. Kovaievskii, et al. Predictive model for the molar mass of humic substances. Abstr. of Symposium on Refractory organic substances in the environment (ROSE) Karlsmhe, Germany, Oct. 6-8, 1997, p. 11.
15. Ковалегский Д.В., Перминова И В., Петросян B.C. В.ъиатг структуры гумусовых кислот на их дегоксицирующую способность по отношению к тяжелым металлам. Тез. докл. междунар. конф. 'Тяжелые металлы в окружающей среде". Пущино, 1996, С. 164.
16. Perminova I.V., D.V. Kovalevski, et al., Humic acids as natural detoxicants. - Transactions of the 7th International Meeting of the IHSS, July 3-8, 1994, St. Augustine. Trinidad&Tobago, Teil 2. P.F7-F8.
17. Perminova I.V., D.V. Kovalevskiy, et al., Toxicological behaviour of heavy metals in the presence of humic acids of different origin. - Abstracts of the Fourth SETAC - Europe Congress. Brussels, Belgium, Apr. 11-14, 1994. P.763.
18. Петросян B.C., Перминова И.В., Ковалевский Д.В., и др. Детоксикация тяжелых металлов, ПАУ и пестицидов гумусовыми веществами в водах и почвах. Материалы международного конгресса "Вода: Экология и токсикология". Москва, 6-9 сентября 1994, том 4, 1136-1143.
26 » * *
Работа была выполнена при поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований (гранты №96-04-49838 и №98-03-33186а), Госкомитета Российской Федерации по высшему образованию (грант в области фундаментальных проблем охраны окружающей среды и экологии №4-26), Министерства науки и технологий РФ (совместный российско-германский проект RUS-I43-97), а также Robert Havemann Scholarship.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Структура гумусовых кислот: общая характеристика, способы описания и методы исследования.
1.1.1. Элементный состав гумусовых кислот.
1.1.2. Функциональный состав гумусовых кислот.
1.1.3. Строение углеродного скелета ГФК: каркасная и периферическая части молекулы.
1.1.4. Молекулярный уровень описания структуры ГФК.
Средние структурные формулы
1.2. Исследование структуры ГФК методом спектроскопии ЯМР.
1.2.1. Спектроскопия 13С ЯМР.
1.2.2. Спектроскопия ПМР.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
2.1. Выбор препаратов ГФК и характеристика их элементного состава.-.
2.2. Качественная характеристика фрагментного состава ГФК.
2.2.1.13С ЯМР спектры.
2.2.2. Подспектры, полученные при помощи импульсных последовательностей БЕРТ и СШАТ.
2.2.3. Двумерные спеКтры ЯМР.
2.3. Исследование Структуры ГФК методом количественной спектроскопии ЯМР 13С.
2.3.1.Условия получения количественных 13С ЯМР спектров.
2.3.2. Распределение углерода в структуре ГФК различного происхождений.
2.4. Исследование структуры ГФК методом спектроскопии ПМР
2.4.1. Разработка метода количественной характеристики распределения водорода функциональных групп и углеродного скелета ГФК.
2.4.2. Распределение водорода в структуре ГФК.
2.5. Фрагментный состав ГФК.
2.5.1. Схема расчета фрагментного состава ГФК из данных спектроскопии ЯМР и 13С.
2.5.2. Характеристика закономерностей строения ГФК различного происхождения на основании фрагментного состава.
2.6. Применение данных по фрагментному составу ГФК для установления зависимостей структура - свойство.
2.6.1. Установление взаимосвязи между структурой и гель-хроматографическими характеристиками ГФК.
2.6.2. Исследование взаимосвязи между структурой ГФК и их детоксицирующими свойствами по отношению к тяжелым металлам.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы и оборудование.
3.2. Выделение препаратов ГФК.
3.3. Регистрация спектров ЯМР.
3.4. Методика токсикологических экспериментов.
ВЫВОДЫ.
ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ.
Гумусовые кислоты (ГФК) представляют собой обширный класс органических соединений природного происхождения и составляют от 60 до 80% органического вещества водных и почвенных сред. Нерегулярность строения углеродного скелета ГФК в совокупности с обогащенностью гетероэлементами (среди которых преобладает кислород - до 50% масс.) обусловливает разнообразие и переменный состав структурных фрагментов, образующих их молекулы. Однако диапазон вариаций функционального и количественного состава ограничен в связи с единством принципов строения ГФК различного происхождения. Строение ГФК характеризуется наличием ароматического каркаса, замещенного функциональными группами и алкильными цепочками, и периферийного карбогидратно-пептидного комплекса. Указанное строение ГФК обеспечивает их высокую реакционную способность по Отношению к тяжелым металлам и органическим экотоксикантам, поступающим в природные среды. Создание прогностических моделей поведения экотоксикантов с учетом влияния ГФК требует установления количественных соотношений между их структурой и свойствами. Принимая во внимание нерегулярность строения ГФК, получение таких соотношений возможно только при условии корректного численного описания их структуры на основе данных по детальному фрагментному составу.
Данное обстоятельство определяет важность и актуальность изучения структуры ГФК методами *Н и 13С ЯМР-спектроскопии, комплексное использование которых позволяет охарактеризовать распределение основных конституционных элементов между структурными фрагментами, составляющими макромолекулы. При этом в связи со сложностью объекта исследования до сих пор отсутствуют единые методические подходы к регистрации количественных спектров 13С ЯМР ГФК, не разработаны методы определения водорода функциональных групп из ПМР-спектров. Как следствие, имеющиеся сведения о детальном фрагментом составе ГФК весьма противоречивы и не могут быть использованы для количественного описания их структуры. Указанные проблемы определили постановку целей и задач настоящей работы. 5
Целью работы было исследование структуры гумусовых кислот при помощи расчета детального фрагментного состава из данных спектроскопии ЯМР ХН и 13С.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Качественно охарактеризовать фрагментный состав ГФК различного происхождения.
• Разработать методические подходы для количественного исследования структуры ГФК методами и 13С ЯМР спектроскопии:
• Провести комплексный анализ данных Щ и 13С ЯМР спектроскопии для определения детального фрагментного состава ГФК различного происхождения.
• Применить данйые по фрагментному составу для идентификации препаратов ГФК по источнику происхождения и продемонстрировать их применимость для установления количественных соотношений структура-свойство. 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
120 ВЫВОДЫ
1. Количественно охарактеризован детальный фрагментный состав ГФК вод, почв, торфа и угля. Определены общие закономерности строения и установлены достоверные структурные различия ГФК указанных основных природных источников. Показано, что в структуре ГФК торфа и почв спиртовые гидроксилы в основном принадлежат полисахаридным фрагментам, а в ГФК пресных вод до 50% этих групп не входит в состав полисахаридов. Показано, что содержание сложноэфирных групп в ГК выше, чем в ФК.
2. Разработана схема расчета детального фрагментного состава ГФК, основанная на комплексном анализе данных ХН и 13С ЯМР спектроскопии. Предложен набор из 12 структурных фрагментов, позволяющих детально описать структуру ГФК различного происхождения:
О>0> СсООНэ СсО(Ж> СдгОН, СагСЖ, СагН, СагС> Со-А1к-СЬ Сснон? СсН20Н>
СоСНЗ> СА1к
3. Разработан метод количественной характеристики распределения водорода функциональных групп и углеродного скелета ГФК при помощи спектроскопии 1Н.
4. Экспериментально обоснованы оптимальные условия регистрации количественных 13С ЯМР спектров ГФК.
5. Предложен способ использования данных по фрагментному составу для корректировки результатов гель-хроматографического определения молекулярных масс ГФК.
6. Установлена взаимосвязь структуры и детоксицирующих свойств ГФК по отношению к Си2+, Сй2+, РЬ2+.
121
ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ
Автор выражает глубокую признательность:
• Сотрудникам кафедры биофизики Биологического факультета МГУ д.б.н. Маторину Д.Н., д.б.н. Бенедиктову П.С. и к.б.н. Вавилину Д.В. за оказанную помощь в организации токсикологических экспериментов.
• Сотруднику Института Экологической Химии (ЮС), Мюнхен, Германия, Dr. N. Hertkorn за оказанную помощь в постановке двумерных ЯМР экспериментов и обсуждению полученных результатов.
• Сотруднику кафедры общего земледелия и охраны почв факультета почвоведения МГУ к.б.н. Лебедевой Г.Ф. за предоставленные препараты гумусовых кислот почв.
А также организациям, оказавшим финансовую поддержку при выполнении данной работы:
• Robert Havemann Scholarship
• Российскому Фонду фундаментальных исследований (гранты №96-04-49838 и №98-03-33186а),
• Госкомитету Российской Федерации по высшему образованию (грант в области фундаментальных проблем охраны окружающей среды и экологии №4-26).
1. Кононова M. М. Органическое вещество почвы. М., Изд-во МГУ, 1963.
2. Орлов Д. С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992, 259 с.
3. Орлов Д. С. Свойства и функции гуминовых веществ. В сб.: Гуминовые вещества в биосфере. М., Наука, 1993, с. 16-27.
4. Rashid М.А. Geocliemistry of marine humic compounds. Springer-Verlag, Oxford, 1985, 243 p.
5. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Гидрометеоиздат. Л., 1986, 268 с.
6. Schnitzer M., Khan S.U. Humic substances in the environment. N.Y., Marcel Decker, 1972, p. 12-17.
7. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв. М., Изд-во МГУ, 1974, 287 с.
8. S. Stevenson F.J.//Geochemistry of Soil Humic Substances. In: Humic substances in soil, sediment and water. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), N.Y., John Wiley & Sons, 1985, p. 13-52.
9. Humic substances and their rôle in the environment. Rep. of Dahlem workshop, Berlin, 1987. John Wiley & Sons Limited. S. Bernhard. Dahlem Konferenzen. 1988, p. 133-148.
10. Bollag J.-M., Mayers K.//Sci. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 357-366.
11. Ziechman W.//Huminstoffen. Problemen, Methoden, Ergebniss. Weicheim: Chemie, 1980, 480 p.
12. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. Изд-во МГУ, М., 1990, 325 с.
13. Нефтепродукты: методы испытаний. Ч.1.-М., изд. стандартов, 1977, 379 с.
14. Coal Science. Corbaty M.L., Larsen J.W., Wender I., Academic Press, N.Y.,
15. Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса природного органического сырья и продуктов его переработки. Дисс. докт. хим. наук. Иркутск, 1997, 267 с.
16. Данченко Н.Н. Функциональный состав гумусовых кислот: определение и взаимосвязь с реакционной способностью. Дисс. канд. хим. наук., Москва, 1997, 138 с.
17. Rice J.A., MacCarthy P.//Org. Geochem., 1991, v. 17, N. 5, p. 635-648.
18. Perdue E.M. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1984, v. 48, p. 1435-1442.
19. Harvey G.R., Boran D. A., Tokar J.M. // Mar. Chem., 1983, N. 12, p. 119-132.
20. Buffle J., Altmann R.S.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1988, v. 52, p. 1505-1508.
21. Stuermer D. H., Payne J. R.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1976, v. 40, p, 1109-1114.
22. Wilson M.A., Philip R.P., Gillam A.H., Tate R.R. // Geochim. Cosmochim, Acta, 1983, v. 47, p. 497-502.
23. Wilson M. A., Gillam A. H., Collin P. J. // Chem. Geol., 1983, v. 60, N. 3-4, p. 181-201.
24. Stuermer D. H., Peters K.E., Kaplan I.R. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1978, v. 42, p. 989-997.
25. Piotrowicz S.R., Harvey G.R., Boran D.A. et al. // Marine Chem., 1984, v. 14, p. 333-346.
26. Van Krevelen D.W. // Fuel, 1950, v. 29, p. 269-284.
27. Visser S.A. // Environ. Sei. Technol., 1983, v. 17, N. 7, p. 412-417.
28. Abbt-Braun G., Schmiedel U., Frimmel F.H. // Vom Wasser, 1990, В. 75, S. 59-73.
29. Beyer L. // Z. Pflanzenernahr. Bodenk., 1996, v. 159, p. 527-539.
30. Stevenson F.J., Goh К. M. // Soil Sei., 1972, v. 113, N. 5, p. 334-345.
31. Stevenson F.J. Humus chemistry. Genesis, composition, reactions. N.Y., Wiley Interscience, 1982, p. 221-237.
32. Драгунов, C.C. Методы исследования гумусовых веществ. Труды почв, инст. им. Докучаева, 1951, т. 38, с. 86-98.
33. Brunelot J., Adrian P., Rouiller J., Guillet В., Andreux F. // Chemosphere, 1989, v. 19, N. 8/9, p.1413-1419.
34. Piccolo A., Camici L. // Int. J. Environ. Anal. Chem., 1990, v. 41, p. 65-69.
35. Right J.R., Schnitzer M.//Trans. 7th Intern. Congr. Soil Sei., 1960, v. 2, p. 120-123.
36. Stevenson F. J., Butler I. H. A., In: Organic Geochemistry, New York: 1969, p. 534-535.124
37. Schnitzer M., Desjardins J.G. // Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1970, v. 34, p. 77-79.
38. Herbert B.E., Bortsch M., Novak, J.M. // Environ. Sei. Technol., 1993., v. 27 p. 398-403.
39. RufFaldi R., Schnitzer M. // Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1972, v. 36, N. 1, p. 301-305.
40. Wright, J.R., Schnitzer M. // Nature, 1959, v. 184, No. 4697, p. 1462-1463.
41. Кухаренко T.A. // Хим. Тверд. Топл., 1937, т. 8, N 9, с. 803-813.
42. Кухаренко Т.А. // Хим. Тверд. Топл., 1937, т. 8, N 12, с. 1064-1072.
43. Сысков К.И. // Хим. Тверд. Топл., 1936, т. 7, N 6, с. 566-574.
44. Gillam А.Н., Riley J.P. // Anal. Chim. Acta, 1982, v. 141, p. 287-299.
45. Schnitzer M. ,Gupta U.C. // Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1965, v. 29, p. 274-278.
46. Arsenie I., Boren H., Allard B. // Sei. Total Environ., 1992, v. 116, p. 213-220.
47. Herzog, H.; Burba, P.; Buddrus, J. // Fresenius J. Anal.Chem., 1996, v. 354, N. 3, p. 375-377.
48. Ephraim J.H., Boren H., Arsenie I., Pettersson C., Allard В. // Sei. Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 615-624.
49. Schnitzer M., Desjardins J.G. // Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1962, v. 26, p. 362-368.
50. Perdue E.M. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1984, v. 48, p. 1435-1442.
51. Norwood, D.L. Critical comparison of structural implications from degradative and nondegradative approaches. In: Humic substances and their role in the environment, Eds: Frimmel, F.H. and Christman, R.F., John Wiley & Sons Limited, 1988, p. 133-148.
52. Ogner G. // Soil Sei., 1970, v. 110, N 2, p. 86.
53. Hayashi Т., Nagai T. // Soil Sei. Plant Nutr., 1962, v. 8, N. 4, p. 22.
54. Clark F.E., Tan K.H. // Soil Biol. Biochem., 1969, v. 1, p. 75.125
55. Зырин Н.Г., Овчинникова М.Ф., Орлов Д.С. // Агрохимия, 1964, N. 4, с. 168.
56. Григорьева Е.А., Кухаренко Т.А. // Методы анализа и контроля производства в химической промышленности. 1968, т. 13, с. 10.
57. Kumada К. Chemistry in soil organic matter. Tokyo, 1988.
58. Pauli F.W. Soil fertility. L., 1967.
59. Felbeck G.T. // Soil Sci., 1971, v. Ill, N. 1, p. 42.
60. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. // Труды Тюменского СХИ, 1970, т. XIV, с. 131.
61. Ziechmann, W. Evolution of structural models from consideration of physical and chemical properties. In: Humic substances and their role in the environment, edited by Frimmel, F.H. and Christman, R.F. John Wiley & Sons Limited, 1988, p. 113-132.
62. Kleinhempel D. // Albrecht-Thaer-Archiv., 1970, Bd. 14, H. 1, S. 3-14.
63. Humic substances in the Suwannee river, Georgiaa: Interactions, properties, and proposed structures. Averett R.C., Leenheer J.A., McKnight D.M., and Thorn K.A. (Eds.) U.S. Geological survey water-supply paper 2373, 1994.
64. Shin H.S., Moon H. // Soil Sci., 1996, v. 161, N. 4, p. 250-256.
65. Stuermer D.H., Paine J.R. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1976, v.40, p. 1109-1114.
66. Ricca G. and Severini F. // Geodenna, 1993, v. 58, p. 233-244.
67. Skjemstad J.O., Frost R.L., Barron P.F. // Austr. J. Soil Res., 1983, v. 21, p. 539.
68. Wershaw R.L. In: Humic Substances in Soil, Sediment and Water. Eds. G.R. Aiken, D.M. McKnight, R.L. Wershaw and P. MacCarthy. Wiley, N.Y., 1985, p. 561-582.
69. Wilson, M.A. NMR techniques and applications in geochemistry and soil chemistry, Ch.8. Humic substances. Oxford, Pergamon Press, 1987, p. 182-216.
70. Wilson M.A. In: Humic Substances in Soil and Crop Sciences: Selected Readings. Ed P. MacCarthy, Madison, USA, 1990, p. 221-260.126
71. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C. // Anal. Chem., 1983, V 55, p. 782-787.
72. Михайленко В.И., Михальчук B.B. // Ж. Прикл. Спектр., 1987, т. 46, N. 4, с.535-543.
73. Preston С.М., Schnitzer М. // J.Soil Sei., 1987, v. 38, p. 667-678.
74. Wilson M.A., Pugmire R.J. and Grant D.M. // Org.Geochem., 1983, v. 5, N. 3, p. 121-129.
75. Swift R.S., Leonard, R.L., Newman R.H. and Theng B.K.G. // Sci.Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 53-61.
76. Wilson M.A., Heng S., Goh K.M., Pugmire R.J. and Grant D.M. // J. Soil Sei., 1983, v. 34, p. 83-97.
77. Newman R.H., Tate K.R., Barron P.F. and Wilson M.A. // J. Soil Sei., 1980, v. 31, p. 623-631.
78. Cook R.L., Langford C.H. // Environ. Sei. Technol., 1998, v. 32, p. 719-725.
79. Frund R. and Ludemann H.-D. // Sci.Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 157-168.
80. Lobartini J.C. and Tan K.H. // Soil Sci.Soc.Amer.J., 1988, v. 52, p. 125-130.
81. Schnitzer M. and Preston C.M. // Soil Sci.Soc.Amer.J., 1986, v. 50, p. 326-331.
82. Lobartini J.C., Tan K.H., Rema J.A., Gingle A.R., Pape С. and Himmelsbach D.S. // Sci.Total Environ., 1992, v. 113, p. 1-15.
83. Malcolm R.L. Variations between humic substances isolated from soils, stream waters and groundwaters as revealed by 13C NMR spectroscopy. In: Humic substances in soil and crop science. Eds. P. MacCarthy, C.E. Clapp,
84. R.L. Malcolm and P.R. Bloom. 1990, p. 13-37.
85. Hatcher P.G., Rowan R. and Mattingly M. // Org.Geochem., 1980, v. 2, p. 77-85.
86. Krosshavn M., Bjorgum J.O., Krane J. and Steinnes E. J. // Soil Sei., 1990, v. 41, p. 371-377.
87. Preston C.M. and Schnitzer M. J. // Soil Sei., 1987, v. 38, p. 667-678.
88. Preston C.M. and Blackwell B.A. // Soil Sei., 1985, v. 139, N. 1, p. 88-96.
89. Stearman G.K., Lewis R.J., Tortorelli L.J. and Tyler D.D. // Soil Sei. Soc. Amer. J., 1989, v. 53, p. 744-748.
90. Zech W. et al. // Z.Pflanzenernahr.Bodenk. 1997, v. 160, p. 563-571.
91. Piccolo A.? Campanella L. and Petronio B.M. // Soil Sei. Soc. Amer. J., 1990 v. 54, p. 750-756.
92. Ricca G. and Severini F. // Geoderma, 1993, v. 58, p. 233-244.
93. Conte P., Piccolo A., Van Lagen B., Buurman P. and De Jager P.A. // Geoderma, 1997, v. 80, p. 339-352.
94. Wilson M.A., Vassallo A.M., Perdue E.M. and Reuter J.H. // Anal. Chem., 1987, v. 59, p. 551-558.
95. Preston C.M. and Schnitzer M. // Soil Sei. Soc. Amer. J., 1984, v. 48, p. 305-311.
96. Watanabe A., Tsutsuki K. and Kuwatsuka S. // Sei. Total Environ., 1989, v. 81/81, p. 195-200.
97. Choudhry G.G. and Webster, G.R.B. // Toxicol. Environ. Chem., 1989, v. 23, p. 227-242.
98. Frund R, Haider K. and Ludemann, H.-D. // Z. Pflanzenernahr. Bodenk., 1994, p. 29-35.
99. Zech W., Ziegler F., Kogel-Knabner I. and Haumaier L. // Sei. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 155-174.
100. Wilson M.A. and Goh K.M., // J. Soil Sei., 1983, v. 34, p. 305-313.
101. Knulst J.C., Boershke R.C., Loemo S. // Environ. Sei. Tech., 1998, v. 32, N 1, p. 8-12.
102. Wilson M.A., Gillam A.H. and Collin P.J. // Chem.Geology, 1983, v. 40, p. 187-201.
103. Sohn M.L. // Org.Geochem., 1985, v. 8, N. 3, p. 203-206.
104. Wilson M.A., Heng S., Goh K.M., Pugmire R.J. and Grant D.M. // J. Soil Sei., 1983, v. 34, p. 83-97.
105. Malcolm R.L., MacCarthy P. // Environ Sei. Technol., 1986, v. 20, p. 904-911.
106. Wershaw R.L., Mikita M.A. and Steelink C. // Environ.Sci.Technol., 1981, v.15, N. 12, p. 1461-1463.
107. Steelink, C., Wershaw, R.L., Thorn, K.A. and Wilson, M.A. Application of liquid-state NMR spectroscopy to humic substances. In: Humic Substances II.
108. Search of Structure, edited by Hayes, M.H.B., MacCarthy, P., Malcolm, R.L. and Swift, R.S. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley & Sons, 1989, p. 281-309.
109. Ernst R.R. // Adv. Magn. Res., 1966, v. 2, p. 1-35.
110. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C. // Anal. Chem., 1983, v. 55, N 4, p. 782-787.
111. Hoult D.I., Chen C.N., Eden H., Eden M. // J. Magn. Res., 1983, v. 51, N 1, p. 110-117.
112. Pearson G.A. // J. Magn. Res., 1977, v. 27, N 2, p. 265-272.
113. Shoolery J.N. // Progress in NMR spectroscopy. 1977, v. 11, p. 79-83.
114. Thiault В., Messerman M. // Org. Magn. Reson., 1976, v. 8, N 1, p. 28-33.
115. Ernst RR, Morgan R.E., // Mol. Phys., 1971, v. 26, N 1, p. 49-74.
116. Noggle J.H., Schirmer R.E. The nuclear Overhauser effect. NY, Academ. Press, 1971, 259 p.
117. Knight S.A. // Chem. Ind., 1967, N 45, p. 1920-1923.
118. Conte P., Piccolo A., Van Lagen В., Buurman P. and De Jager P.A. // Geoderma, 1997, v. 80, p. 327-338.
119. Freeman R., Pachler K.G.R., La Mar G.N. //J. Chem Phys., 1971, v. 55, N 9, p. 4586-4593.
120. Levy G.C., Komorovsky R.A. // J. Am. Chem. Soc., 1974, v. 96, N 3, p. 678-681.
121. Смирнов М.Б., Крапивин A.M. Методика анализа углеводородных фрагментов высших фракций нефти с помощью спектроскопии ЯМР. В: Методы исследования состава органических соединений нефти и битумоидов. 1985, с. 138-181.
122. Kinchesh Р, Powlson D.S., Randan E.W. //Europian J. Soil Sci., 1995, v.46, pp. 125-138.
123. Frund R., Guggenberger G., Haider K., et al. Z. Pflanzenernaehr. Bodenkd. // 1994, v. 157, p. 175-186.
124. Alemany L.B., Grant D.M., Pigmure R.J., Alger T.D. and Zilm K.W.// J. Am.Chem.Soc., v. 105, p. 2133-2141.
125. Alemany L.B., Grant D.M., Pigmure R.J., Alger T.D. and Zilm K.W.// J. Am.Chem.Soc., v. 105, p. 2142-2147.
126. Wilson M.A., Pugmire R.J, Grant D.M. // Org. Geochem., 1983, v. 5, p. 121-129.129
127. Hatcher P.G. // Org. Geochem., 1987, v. 11, p. 31-39.
128. Frund R., Ludemann H.-D. // Sei. Total Environ., 1989, v. 81/82, p.157-168.
129. Earl W.L., Wershaw R.L., Thorn K.A.//J. Magn. Res., 1987, v. 74, p. 264-274
130. NMR of Humic Substances and Coal Techniques, Problems and Solutions. Eds. Wershaw R.L., Mikita M.A., Lewis Publishers, Chelsea, 236 p.
131. Ruggiero P., Interesse F.S., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1979. v. 43., p. 1771-1775.
132. Ishiwatari R. // Chem. Geol., 1973., v. 12, p. 113-126.
133. Wilson M.A., Gillam A.H., Collin P.J. // Chem. Geol. 1983,. v. 40, p. 187-201.
134. Wilson M.A., Collin P.J., Tate K.R. // J. of Soil Sei., 1983, v. 34, p. 297-304.
135. Yonebayashi K., Hattori T. // Soil Sei. Plant Nutr., 1989, v. 35, p. 383-392.
136. Kawahigashi M. Fujitake N. Takahashi T. // Soil Sei. Plant Nutr., 1996, v. 42, p. 355-360.
137. Ruggiero P., Interesse F.S., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1979, v .43, v. 1771-1775.
138. Ruggiero P., Sciacovelli O., Testini C., Interesse F.S. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1978, v. 42, p. 411-416.
139. Wershaw R.L. In: Humic Substances in Soil, Sediments, and Water. N.Y.: Wilev Interscience., 1985, p. 561-578.
140. Luedemann H.-D., Lentz H., Ziechmann W. // Erdoel und Kohle, 1973, v. 26, p. 506-509.
141. Ruggiero P., Interesse F.S., Cassidei L., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1980, v. 44, p. 603-609.
142. Leenheer J.A., Noves T.I. In: Humic Substances II. John Wiley & Sons Ltd., 1989, p. 257-279.
143. Lambert J., Buddrus J. // Magn. Reson. Chem., 1996, v. 34, №. 4, p. 276-282.
144. Kanitskaya L.V., Rokliin A.V., Gogotov A.F., Kushnarev D.F., Kalabin G.A. // Chem. Sustainable Develop., 1996, N. 4, p. 281-288.
145. Kanitskaya L.V., Ivanova N.V., Gorokhova V.G., Babkin V.A. // Chem. Sustainable Develop., 1996, N. 4, p. 275-280.
146. Two-Dimensional NMR Spectroscopy Eds. Croasmun W. R., and Carlson R. M. K., WILEY-VCH, Weinheim, 1996.130
147. Buddrus J., Burba P., Herzog H., Lambert J. // Anal. Chem., 1989, p. 628-631.
148. Schmitt-Kopplin, P., Hertkorn, N:, Schulten, H.-R., Kettrup, A. // Environ, Sei. Technol., 1998, v. 32, p. 2531-2541.
149. Büffle J., Altmann R.S. // Geochem. Cosmochim. Acta, 1988, v. 52, p. 1505-1508.
