Количественная спектроскопия ЯМР 13С, 17О и физиологическая активность гуминовых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

г" Го. ОЙ

ФЁДОРОВА Татьяна Евгеньевна

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР13С, 170 И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ

02. 00. 03 — органическая химия

Авторефер ат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Иркутск —

2000

Работа выполнена в лаборатории физических методов исследования Института нефте- и углехимического синтеза Иркутского государственного университета.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессо] Кушнарев Д. Ф.

кандидат химических Пройдаков Л.Г.

наук, доцен

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Евстафьев С.П.

доктор химических наук, профессо] Медведева СА.

Ведущая организация:

Иркутская сельскохозяйственная академия

Защита состоится "28" июня 2000 г. в 10.00 час. на заседали диссертационного совета Д 063.32.02 при Иркутском государственно университете по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126, химически факультет ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИГУ

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 664033, Иркутск-33, а/я 402 ИНУС, Ученому секретарю диссертационного совета, к.х.н. Шевченко Г.Г.

*' - * л п

Автореферат разослан "¿я-с>" мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук {¿у^Шевченко Г. Г.

ГУЪЗ, 2>-^с 46¿О

и-А П

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гуминовые кислоты (ГК) - природные высокомолекулярные системы нерегулярного строения, широко распространенные в природе (почва, вода, донные отложения и т.д.), играющие исключительно важную роль в обеспечении жизнедеятельности экосистем, в первую очередь, растений. Накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о положительном влиянии доступных и экологически чистых гуминовых удобрений и стимуляторов роста растений на урожайность и качество сельскохозяйственных культур, повышении ими резистентности растений .. к заболеваниям, ослаблении отрицательного действия высоких доз удобрений и почвоутомляющих веществ, тяжелых металлов, снятии токсикоза растений., •

Взгляды на природу физиологической активности (ФА) гуминовых кислот неоднозначны. Вопрос о связи структурных особенностей и свойств молекул ГК, уровня их ФА, требует дальнейшего изучения с привлечением новых современных методов. Количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) дает уникальную информацию о содержании структурных фрагментов гуминовых кислот, недоступную никаким другим химическим и физическим методам исследования, которая исключительно важна для установления генезиса гуминовых кислот и их роли как стимуляторов роста растений.

Работа выполнена при финансовой поддержке: Российского Фонда Фундаментальных исследований (грантами № 96-03-34297а и № 00-03-32965а), программы "Университеты России - фундаментальные исследования" (тема-21-211-08), фонда Roberta Havemanna (ФРГ).

Цель работы - разработка комплексного подхода к анализу химической структуры гуминовых кислот на основе методов количественной спектроскопии ЯМР на ядрах 'н, 13С, а также их водных растворов через структуру водной матрицы методом ЯМР 170 и оценка возможности использования этой информации для экспрессного мониторинга свойств ГК как биостимуляторов роста растений.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Разработан ряд новых методик определения состава (количества основных функциональных групп, фрагментов и связей) макромолекул гуминовых кислот на основе количественной спектроскопии ЯМР *Н и ЬС с редактированием спектров.

Проведен сравнительный анализ химического строения ГК, выделенных из органического материала различного происхождения и степени химической зрелости. Показано, что в ряду "продукты переработки древесины - торф - бурый уголь" основными процессами трансформации ГК являются нарастание количества ароматических фрагментов в составе их макромолекул, окисление ароматического скелета, постепенная деградация "лигнинных" и "углеводных" компонентов.

Для детализации сведений о составе и строении ГК проведено фракционирование ряда их препаратов избирательным .растворением в кислородсодержащих растворителях. Выявлены существенные изменения в составе ГК в ходе фракционирования.

Охарактеризованы изменения в составе и структуре ГК при различных воздействиях на источник их получения. Проведен анализ строения ГК, выделенных различными способами (органическими и неорганическими экстрагентами, с предварительной деминерализацией, окислительной механо-деструкцией, вермикомпостированием, обработкой электрическим газовым разрядом исходного вещества либо без этих процедур).

Предложен ряд приемов использования данных спектроскопии ЯМР О для определения механизмов взаимодействия ГК в воде и почве. Изучено влияние растворенных ГК из различного природного сырья на структуру воды. Впервые методом спектроскопии ЯМР 170 установлен диапазон концентраций ГК, в котором наблюдаются значительные изменения соотношения надмолекулярных и молекулярных их составляющих, что предопределяет их физиологическую активность.

Показана возможность использования метода ЯМР |3С и 170 для экспрессного мониторинга свойств гуминовых кислот как стимуляторов роста растений.

Апробация работы и публикации. Основные материалы доложены и обсуждены на международной конференции "Экологически чистые технологические процессы в решении проблем окружающей среды" - "Экотех-нология-96"(Иркутск, 1996), на Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-96"(Краснодар, 1996), на IV Всероссийском семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия и томография) (Ростов-на-Дону, 1998), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), на научно-практической конференции "Водные ресурсы Байкальского региона: проблемы формирования и использования на рубеже тысячелетий" (Иркутск, 1998), на Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (г. Москва, 2000).

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 8 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Спектроскопия ЯМР, строение и физиологическая активность гуминовых кислот (обзор литературы)

Обобщен экспериментальный материал, свидетельствующий о многофакторном положительном влиянии гуминовых кислот на урожайность и качество сельскохозяйственных культур. Имеющиеся подходы к решению фундаментальной проблемы физиологической активности ГК не позволяют объяснить какие их структурные особенности и свойства ее определяют. Существенным недостатком большинства этих подходов является то, что они базируются на

ограниченном наборе структурных параметров - количестве некоторых функциональных групп, косвенной оценке степени ароматичности из атомных отношений Н/С, данных по химической деградации и т.д.

Показано, что комплексное использование количественной спектроскопии ЯМР на ядрах всех элементов, входящих в ГК, может объяснять уникальные возможности идентификации и определения содержания в них практически всех структурных фрагментов. Проведен анализ таких работ, посвященных исследованию химического строения ГК в твердом теле и в растворе.

Сделано предположение о перспективности комплексного исследования структуры ГК методом спектроскопии ЯМР для прогнозирования свойств ГК как стимуляторов роста растений.

Глава 2. Количественная спектроскопия ЯМР 'Н и 13С в исследовании макромолекул гуминовых кислот

Выбор объектов исследования определялся тем, что источниками физиологически активных гуминовых кислот может служить различное природное и вторичное органическое сырье - торф, низкосортные бурые угли различной степени химической зрелости, многотоннажные промышленные отходы целлюлозно-бумажных производств и животноводческих предприятий. Образцами сравнения служили ГК почв различной зональности (дерново-подзолистые, дерново-карбонатные и черноземные). Все препараты ГК охарактеризованы методом элементного анализа (табл. 1).

Общий тип строения ГК, выделенных из перечисленных объектов, а именно: наличие ароматических и алифатических фрагментов, функциональных групп (>С=0, -СООН, СН30-, ОН-фенольных и спиртовых), подтверждается наличием сигналов атомов углерода в соответствующих областях спектров ЯМР 13С (рис.1).

Отличия наблюдаются лишь в значениях интегральных интенсивностеи этих сигналов в зависимости от природы исходного вещества.

Обнаружено, что спектры ЯМР 13С исследованных ГК бурых углей, в отличие от известных ранее, имеют хорошо разрешенные сигналы в области значений химических сдвигов (ХС) карбонилсодержащих фрагментов (220-160 м.д.), что позволило сделать более детальное их отнесение (табл.2). Анализ полученных количественных результатов из спектров ЯМР 13С (табл.3) позволил сделать ряд заключений о структурных особенностях ГК различного происхождения и их генетической связи с исходным органическим веществом.

Компоненты лигнина отмершей растительности деградируют с образованием ГК, о чем свидетельствуют сигналы "лигнинной" составляющей в диапазоне ХС 93-80 м.д., принадлежащие атомам углерода в а-О-4- и р-О-4-связях, а также сигналы СН30- групп (ХС 58-54 м.д.).

Таблица 1.

Элементный состав, источник и выход гуминовых кислот

Образец Источник гуминовых кислот Элементный состав,%

С4а/ (у,/ Н/С О/С Выход ГК, % на (1а)

Гуминоподобные вещества из технических лигнинов и биогумуса

ЛГК-1 Шлам-лигнин БЦБК 52,6 6,0 33,8 4,6 3,0 1,37 0,48 5,6

ЛГК-3 Гидролизный лигнин 68,9 9,9 20,2 0,2 0,7 1,73 0,22 4,2

ЛГК-5 Биогумус 52,1 I 6,0 37,3 1.4 3,2 1,37 0,54 6,4

Торф

ГКТ Хандинское ме- | ¿л , сторождение | ' 4,5 41,4 - - ' 0,99 0,57 41,3

Бурые угли

гкх Хандинское месторождение (марка Б1) 64,4 4,6 27,6 1,2 2,2 0,85 0,32 33,5

гк МБ1 Адуунчулуунское месторождение, Монголия (марка Б1) 54,6 3,8 39,1 1,3 1,2 0,83 0,54 30,6

ГК Б Березовское месторождение (марка Б2) 57,7 4,9 36,6 0,9 - 1,04 0,48 11,2

ГК МБ2 Тальбулагское месторождение, Монголия (марка Б2) 51,9 4,7 40,6 1,1 1,7 1,08 0,59 38,1

ГКЩ Щеткинское месторождение (марка Б2) 56,3 4,6 37,4 1,4 0,3 0,98 0,50 33,5

ГК МБЗ Увдугхудагкское месторождение, Монголия (марка БЗ) 55,1 4,3 36,4 1,3 2,9 0,94 0,50 42,3

-1 Почвы

ГК ДП Дерново-подзолистые 46,2 4,1 47,2 1,9 0,6 1,05 0,77 2,0

ГК дк Дерново-карбонатные 42,4 4,3 50,7 2,4 0,3 1,20 0,89 1,9

ГКЧ Чернозем 43,4 4,5 50,1 2,2 0,8 1,23 0,87 зд

Рис.1. Спектры ЯМР 13С ГК различного происхождения.

Таблица 2.

Диапазоны химических сдвигов (ХС) спектров ЯМР и С гуминовых кислот

ХС, м.д. Обозначение Отнесение сигналов

220-185 >С=0 Атомы углерода карбонильных групп

186-180 г хин Атомы углерода хиноидных групп

180-168, -соон Атомы углерода карбоксильных, сложноэфирных

162-160 групп

168-162 с ^неорг Атомы углерода неорганических карбонатов, не

160-140 >саро входящих в макромолекулу ГК Ароматические атомы углерода, связанные с атомами кислорода

140-106 >сар-с,н С- и Н-замещенные ароматические атомы углерода

106-93, 80-58 >СалкО Атомы углерода -СН2-0-, -СН2-ОН, -СН-О-фраг-ментов

93-80 "Са.р-О-4 Атомы углерода в а-О-4- и (З-О-4-связях "лигнинных" компонент

58-54 СН30- Атомы углерода метоксильных групп

54-0 -С Атомы углерода алкильных фрагментов

160-106 Л Степень ароматичности (СэдО+СарС,Н)

Долю ароматических атомов углерода, принадлежащих лигнину рассчитывали по формуле:

(1),

где #сню - относительное содержание атомов углерода в спектре ЯМР 13С, принадлежащих СН30-группам,

п - среднее значение количества атомов углерода СН30-групп, приходящееся на одно ароматическое кольцо в макромолекулах лигнинов. ^лигнина ~ сумму долей атомов углерода, принадлежащих фрагментам макромолекул лигнина рассчитывали по соотношению (2):

<?.|игнкна= <?Сар+ <?СН30+<7а,0-0-4 (2).

Для проверки корректности получаемой количественной структурной информации проведен расчет атомных отношений О/С из данных спектроскопии ЯМР 13С по известным из литературы соотношениям (3), (4) и предложенному нами (5). Сопоставление рассчитанных значений со значениями атомных отношений О/С, определенных из элементного состава, показало хорошее соответствие (г= 0,78; 0,81; 0,79).

0/С1ЯМР= [2х {Рс=о + Рс оон} + />СаРо] (3)

О/С ЯМР~ [Рс=0 + 2 Рсоон + -^СарО + РсалкО +0,25 Рсалко] (4)

0/С3ЯМр=[/'с-о+2 Рсоон +^саро+/5смко+0,25 РС1ЛкО^0,5РСнзо] (5) (Р - доли атомов углерода фрагментов от общего их количества в образце).

Результаты кластерного анализа параметров фрагментного состава ГК, позволяют выделить три группы препаратов с достоверными отличйями структуры: ГК вторичного сырья и торфа, ГК углей, ГК почв (рис.2). Охарактеризованы структурные особенности ГК каждой группы.

Таблица 3.

Фрагмешпный состав гуминовых кислот различного происхождения

гк Содержание атомов углерода в структурных фрагментах (относит, интенсивности , % отн.)

С=0 1 Схин соон Снсорг СарО | СарС.Н СалкО Ссс,Р-0-4 см3о Салк

Гуминоподобные вещества из технических лнгшпюв и биогумуса

ЛГК-1 2,8 2,7 6,9 0,4 7,9 24,1 10,1 3,1 5,3 36,7 32

ЛГК-3 2,0 1Д 3,4 0,4 11,1 26,8 4,2 2,5 4,9 43,6 38

ЛГК-5 1,5 2,0 6,7 0,6 7,0 24,0 12,9 3,6 5,7 36,0 31

Торф

ГК Т | 2,2 3,1 8,4 1,3 9,6 28,7 • 5,2 2,0 3,7 35,7 38

Бурые угли

ГК Х-1 2,4 1,9 5,7 0,8 7,6 49,3 1,4 0,4 0,8 29,7 57

ГКМБ1 0,5 1,9 7,9 - 7,5 58,9 0,9 0.5 1,1 20,9 66

ГК Б 2,6 2,2 7,1 - 8,4 41,5 5,2 1,0 0,4 31,6 50

ГКМБ2 1,2 3,1 8,9 1,1 12 47,6 1,8 0,6 0,7 22,8 60

гкщ 2,6 4,4 7,4 0,1 12,9 47,6 3,2 1,3 1,3 19,2 60

ГК МБЗ 3,8 3,9 7,4 - 12,9 43,8 1,1 0,9 0,9 25,2 57

Почвы

ГК ДП 7,7 3,7 15,3 - 17,5 35,9 6,1 1,6 1,1 11,1 53

ГК ДК 4,1 2,9 11,6 0,8 14,0 41,9 5,0 1,4 1,4 17,0 56

ГКЧ 3,8 3,6 13,4 2,5 11.7 36,9 10,6 1,4 1,8 14,6 48

гк\ Г К Б

i к мь:

I KIU

Г К МПЗ

г к дк гк ч гклп

ГК технических липжнов, торфов

-ГК бурых углей

>1_*

ч ПОЧВ

Степень различия

Рис.2. Классификация препаратов ГК при помощи кластерного анализа их фрагментного состава.

- Для гуминоподобных веществ вторичного сырья и ГК торфа характерна высокая степень окисленности ароматической и алифатической составляющей макромолекул. Низкая степень химической зрелости исходного вещества подтверждается большим количеством атомов углерода "лигнинных" (^30-40%) и "углеводных" (до 10%) компонентов в составе этих JITK и ГК.

- ГК углей характеризуются высокой ароматичностью (»50-60%), доля ароматических фрагментов в их составе в два раза превышает долю алифатических. Для них характерна самая низкая степень окисленности ароматической и алифатической составляющей, максимальное содержание фенольных фрагментов и минимальное - СалкО-фрагментов. Количество "лигнинных" составляющих в них не превышает 10%.

- ГК почв отличаются наибольшим содержанием всех кислородсодержащих функциональных групп, соотношение ароматической и алифатической составляющих в структуре ГК почв близко к таковому ГК бурых углей, но степень окисленности этих составляющих существенно выше. Доля "углеводной" и "лигнинной" компонент у ГК почв несколько выше, чем у ГК углей.

Для получения более детальной информации о структуре макромолекул ГК применили многоимпульсную последовательность GASPE (GAted Spin Echo), позволяющую получать количественные подспектры первичных и третичных (СН3 + СН), вторичных и четвертичных (СН2 + СЧетв) атомов углерода фрагментов без учета переноса поляризации (рис.3). Эта методика позволила уточнить распределение атомов углерода ароматического кольца по различным типам: атомам углерода, связанным с атомами водорода (СНар) и с атомами углерода (Сар-С), количественно определить соотношение СНОа.1к -, СНгО^«-фрагментов.

Обнаружено, что соотношение количества атомов углерода ацетальных, -СН2-0- и -СН-О-фрагментов в гуминоподобных веществах продуктов переработки древесины соответствует 1:1,2:3,9 (не учитывали содержание атомов углерода в а-О-4- и P-O-4-связях, характерных для лигнина) и близко к таковому в углеводах (гексозах). Распределение углеродных атомов по различным типам в диапазоне С^кО-фрагментов спектра ЯМР 13С ГК бурого угля не выявляет углеводного характера.

»llf

f."»;

й

У/

fV.

-..LW - -•• . о

220 180 140 100 60 20 0 м.д.

Рис.3. Подспектры: а - СН3, СН; б - CHj, С,,етв- атомов углерода фрагментов образца ЛГК шлам-лигнина.

Алкильная часть гуминоподобных веществ вторичного сырья и ГК бурых углей представлена преимущественно замещенными циклическими (нафтеновыми) структурами и/или короткими цепями.

Фракционирование препаратов ГК Один из путей детализации сведений о составе и строении ГК - разделение исходных гуминовых кислот на фракции, используя избирательное растворение их в кислородсодержащих растворителях - спирт, ацетон. Получаемые растворимые фракции, идентифицируют как гиматомелановые кислоты (ГМК), нерастворимые - гумусовые кислоты (ГУК).

Элементный состав фракций и исходных ГК представлен в табл.4. Гуми-новые кислоты выделены из бурых углей Хандинского месторождения гидроксидом натрия - ГК-1, гидроксндом аммония - ГК-2, гидроксидом натрия с предварительной деминерализацией угля соляной кислотой - ГК-3. Спектры ЯМР 13С ГК-1

и ее фракций приведены на рис.5, фрагментный состав гуминовых кислот и их фракций представлен в табл.5.

Расчет баланса распределения структурных фрагментов в препаратах ГК до и после экстракции ацетоном по соотношению (6), как и баланс из элементного состава, выявил значительные изменения в составе гуминовых кислот в ходе разделения их на фракции.

z=z1x1+z2x2 (6),

где Z - содержание определяемого элемента в исходной кислоте, %; ХЬХ2 - весовая доля растворимой и нерастворимой фракции; zbz2 - содержание определяемого элемента в растворимой и нерастворимой фракциях, соответственно, %. Рассчитанные значения приведены в скобках табл. 4 и 5.

Таблица 4.

Элементный состав и выход гуминовых кислот и их фракций (%)

Образец Выход, % на (¡аГ СМ и"аГ О (по разности) Н/С О/С

ГК-1 40,9 64,4 (56,3) 4.6 (4,9) (1,2) (1.2) 31,0 (36,4) 0.85 0.36

ГМК-1 7,3 67,9 8,3 0,9 - 22.9 1,47 0,25

ГУК-1 92,7 55,4 4,6 1,2 1,2 37,6 0,99 0,51

ГК-2 19,5 61,5 (56,1) 5,6 (4,5) (1,4) _ (2,2) 32,9 (35,8) 1,10 0,40

ГМК-2 14,9 64,5 6,8 1,1 - 27,6 1,26 0,32

ГУК-2 85,1 54,7 4,1 1,4 2,2 37,6 0,90 0,52

ГК-3 63.6 63,1 (56,0) 5,2 (4, 7) 0,1) (1.0) 31,7 (37.3) 0,99 0,37

ГМК-3 12,5 64,7 7,3 0,8 - 27,3 1,35 0,32

ГУК-3 87.5 54,7 4,3 1,1 1.0 38,7 | 0,94 0,53

Мы полагаем, что неаддитивность фрагментного состава фракций ГК обусловлена высокой реакционной способностью ГК и их склонностью к реакциям окисления-восстановления (на это указывают высокие атомные отношения О/С нерастворимых фракций ГК). Это приводит к неоднозначной взаимосвязи состава и структуры исходных гуминовых кислот и их фракций.

г\

I \

Г\1 .V

240 200 160 120 80 40 0 м.д. Рис.4. Спектры ЯМР |3С препаратов из углей Хандинского месторождения а - ГК; б - фракции ГМК; в - фракции ГУК .

Таблица 5.

Параметры фрагментного состава гуминовых кислот и их фракций из спектров ЯМР пС

Образец Соде ржание углерода в структурных фрагментах , % отн.

с=о С хин соон Снеорг СарО CapC.H i СалкО* j СИ,О 1 Салк 1 fa

ГК-1 2,4 (2.2) 1,9 (1.5) 5,7 (3,8) 0,8 (3.3) 7,6 (И,6) 49,3 (38,9) 1,1 (6,2) 1.4 (1.2) 29.8 (31,3) 57 (51)

ГМК 1,8 1,7 4,1 0,7 3,9 23.9 3,4 1,9 58,6 28

ГУК 2,2 1,5 3,8 3,5 12,2 40.1 6.4 1,2 29,1 52

ГК-2 1,7 (3,2) 3,3 (2,0) 6,6 (3.7) 4,3 (3,4) 10,2 (7.2) 45.1 (44,4) 2,8 (7.2) 3.2 (1.2) 23,8 (27,7) 55 (52)

ГМК 3,6 3.5 5.2 0,9 6,9 29,2 4,9 1,4 44.4 36

ГУК 3,1 1,8 3,5 3,8 7,3 47,1 7,5 1,2 24,7 54

ГК-3 1,9 (4,9) 2,3 (2,1) 4,5 (3.0) 0,9 (0,7) 7.5 (5,9) 40,2 (42,2) 3,1 (3,7) 2,9 (1.5) 36,7 (36,0) 48 (48)

ГМК 2,4 2,1 5,9 - 9,5 34,6 3.2 1,4 40,9 44

ГУК 5.4 j 2,1 2,6 0,7 5,3 43,3 | 3,8 1,5 35,3 49

Диапазон СалкО* включает область Са,р-0-4 (93-80 м.д.)

Использование метода спектроскопии ЯМР С в твердой фазе показало, что основные параметры фрагментного состава нз спектров ЯМР ,3С ГК в твердой фазе и растворах при корректно подобранных количественных условиях эксперимента согласуются в пределах 10 % отн. (рис.5).

Тенденции изменения некоторых спектральных характеристик гумнно-вых кислот различного происхождения подтверждены результатами исследования структуры ГК методом ИК-спектроскопии и спектроскопии ЯМР 13С в твердой фазе.

СР. R0=3030

ЭОО 250 200 150 100 50 О -50

м.Д.

cp, no

Рис.5. Спектры ЯМР l3C CP/MAS препарата "Гумат", зарегистрированные с различными скоростями вращения образца (R0=3030 и 4000 Гц/с).

Спектроскопия ЯМР 'Я гуминовых кислот. Набор параметров фраг-ментного состава и структуры, дифференцировано характеризующих структурные особенности ГК, может быть существенно расширен с использованием данных ЯМР 'Н (рис.6).

Используя соотношения (7) и (8) рассчитано содержание углерод- и во-дородзамещенных ароматических фрагментов в составе гуминовых кислот, которое хорошо согласуется с результатами определения этих фрагментов в многоимпульсных экспериментах (табл. 6).

СНар=Нар(Н/С) (7),

(8),

где СарС,Н - содержание ароматических атомов углерода, связанных с атомами водорода и углерода, определенное из спектров ЯМР 13С ГК (% отн.).

По соотношению (9) рассчитаны атомные отношения Н/С в алифатическом диапазоне спектра ЯМР 13С (табл. 6):

(Н/СХЛ(1 - Нар)/(1 -/.)] (Н/С) (9).

Рассчитанные значения отношений (Н/С)ш по соотношению (9) и распределение протонов алкильной части ГК бурых углей подтверждают предположение о том, что ее состав сформирован, в основном, замещенными нафтеновыми циклами и короткими разветвленными алкильными цепями.

Таким .образом, исследование структуры ГК методом ЯМР 'Н в совокупности с ЯМР 13С расширяет базу данных для более детальной и надежной характеристики ароматической и алифатической составляющих.

Нар

! ГОО СНп-0 а-СНп;|3-СНп у-СНп

Н* ГК X

;ГКМБ1

10 987654 3210 м.д. Рис.6. Спектры ЯМР ]Н образцов ГК X, ГК МБ1 в 0,1 М ЫаСЮ/Н20.

Таблица 6.

Структурные параметры, рассчитанные из спектров ЯМР 'Н и 1!С ГК

ГК СарО (% отн.) СНар (% отн.) С„РС (% отн.) /а (Н/С)ц

гкх ' 7,6 ! 21,7 27.6 57 1,48

ГКМБ1 7,5 29,7 29,2 66 1,51

ГК МБ2 12,0 33,2 14,4 60 1,86

ГКМБЗ 12,9 25,0 18,8 57 1,36

ГКЩ 12,9 29,7 17,9 60 1,71

ГК Щм/о 18,8 32,9 6,6 58 1,74

Глава 3. Влияние методов обработки исходных веществ на структурные особенности гуминовых кислот

Окислительная механодеструкиия углей

Внедрение в сельскохозяйственную практику гуминовых удобрений ставит вопрос о создании новых технологий их получения и способах интенсификации процессов. Эффективным методом, повышения реакционной способности многокомпонентных систем природного происхождения и, как следствие, увеличения выхода ГК из них является метод диспергирования в различных средах (табл.7). В результате интенсивной механообработки углей отмечаются следующие изменения их физико-химических свойств: увеличение концентрации парамагнитных центров (ПМЦ), изменение макроскопической (надмолекулярной) структуры угля - уменьшение молекулярной массы элементарных структурных единиц угля, изменение элементного состава углей.

Под влиянием предварительной механоактивации углей в составе ГК возрастает количество карбонильных групп, Са1кО-фрагментов, уменьшается степень их ароматичности. В целом, происходит увеличение доли гидрофильных фрагментов и низкомолекулярных фракций в молекулах ГК (табл.8).

Таблица 7.

Выход ГК го исходных и механообработанных (м/о) углей (%)_

Уголь Березовский | Хандинский Щеткинский

исходный 11,2 1,0 33,5 1,0 33,5 1,0

м/о 47,8 4,3 54,9 1,6 73,9 2,2

Таблица 8.

Параметры фрагментного состава гуминовых кислот из спектров ЯМР13С

ГК Содержание углерода в структурных фрагментах , % отн.

с=о Схин соон Снеорг СярО СярС.Н Салк-О* си,о Салк

ГКХ 2,4 1,9 5,7 0,7 7,6 49,3 1,8 0,8 29,8 57

ГК Хм/о 3,2 3,5 6,3 - 7,3 31,1 7,7 3,9 37,2 38

ПС Б 2,6 2,2 7,1 - 8,3 41,5 6,2 0,4 31,6 48

ГК Бм/о 3,2 1,8 5,5 0,8 8,0 37,2 9,8 0,8 32,9 45

ГКЩ 2,6 4,4 7,4 0,1 12,9 47,6 4,5 1,3 19,2 60

ГК Щм/о 3,0 2,0 11,9 - 18,8 39,5 4,8 1,1 18,9 58

Вермикомпостирование и обработка электрическим газовым разрядом Низкая себестоимость и высокое содержание биологически активных компонентов таких многотоннажных промышленных отходов как гидролизный лигнин, шлам-лигнин и отходы сельскохозяйственных предприятий определяет перспективность разработки новых физиологически активных систем на базе вторичного органического сырья. Практическое применение гидролизного лигнина (ГЛ) в качестве удобрения ограничено в связи с высокой кислотностью и мутагеной активностью. Снижение мутагенной активности и токсичности отходов может быть достигнуто трансформацией вторичного сырья в процессе вермикомпостирования и обработки электрическим газовым разрядом.

Установлено, что биотрансформация вторичного сырья красными калифорнийскими червями сопровождается образованием лигногуминовых кислот (ЛГК), выход которых растет в течение первых пяти месяцев, а затем начинает снижаться. Сопоставление спектров ЯМР ,3С ЛГК, выделенных из отходов до и после вермикомпостирования, показало увеличение содержания кислородсодержащих функциональных групп и ароматических фрагментов в результате обработки (табл.9).

Под влиянием электрического газового разряда (ЭГР) на гидролизный лигнин в составе ЛГК увеличивается доля гидрофильных компонент, содержание ароматических фрагментов (табл.9). Данные изменения молекулярно-массового состава исследуемых образцов ЛГК показывают увеличение доли компонентов с молекулярной массой до 5000 а.у.е. в составе препаратов, что в совокупности с результатами ЯМР 13С спектроскопии свидетельствует о протекании окислительной деструкции гидролизного лигнина при действии ЭГР.

Изложенные в этой главе результаты позволяют заключить, что использованные приемы предварительного воздействия на исходное вещество могут не только интенсифицировать процесс извлечения из него ГК и существенно увеличить их выход, но и значительно модифицировать состав выделяемых физиологически активных веществ, что обусловит их новые свойства как биостимуляторов роста растений.

Таблица 9.

Фрагментпый состав лигногуминовых кислот, выделенных из исходного и обработанного гидролизного лигнина из спектров ЯМР 13С

ЛГК Содержание атомов углерода в структурных фрагментах , % отн.

с=о Схин соои Снеорг СарО СарС,Н флкО СНзО Салк

ЛГК 2,0 1,1 3,4 0,4 11,1 26,8 6,7 4,9 43,6 38

ЛГК верми-компоста 3,7 1,6 4,1 1,0 8,6 26,9 8,0 5,4 40,7 36

ЛГК ЭГР 7,2 3,7 7,0 1,5 9,6 19,4 12,2 3,3 36,1 29

Глава 4. Физиологическая активность (ФА) гуминовых кислот и ее связь со структурными параметрами

Одним из факторов плодородия почв является высокое содержание в них гумуса, физиологически активные вещества которого оказывают стимулирующее действие на развитие растений. Аналогичное действие присуще и гуминовым кислотам, выделенным из различных объектов растительного происхождения.

Среди нетрадиционных методов оценки ФА веществ имеются подходы, основанные на использовании культур клеток, субклеточных культур, растительных тест-объектов.

Проведен иитогенетический анализ влияния ГК на прорастание семян кукурузы, который выявляет возможные цитогенетические изменения, происходящие под влиянием мутагенных факторов, в том числе химических веществ. Цитогенетический анализ, основывался на учете хромосомных нарушений анафазным методом путем определения доли аберрантных клеток. Цитогенети-ческая оценка действия образцов изучаемых ГК на семена кукурузы не выявила существенных различий хромосомных аберраций анализируемых клеток с контрольными, указывая на отсутствие мутагенной активности в исследуемых концентрациях. Установлено снятие мутагенной активности ЛГК гидролизного лигнина при действии электрического газового разряда, которое приводит к получению биологически активного продукта, не проявляющего отрицательного влияния на поколения растений.

Физиологическую активность ряда ГК в лабораторных условиях оценивали по их воздействию на семена (в условиях 100%-ного прорастания) и дальнейший рост проростков. Методика позволяет выявить вещества стимулирующие прорастание семян, а также рост растений в начальный этап их развития. В качестве тест-объектов использованы семена кукурузы - одной из основных сельскохозяйственной культур.

Исследование физиологической активности гуминовых кислот в диапазоне концентраций 0,0001-0,1% показало, что высокие концентрации гуминовых кислот в растворе (0,025-0,1%) ингибируют прорастание семян кукурузы, а стимулирующий эффект малых концентраций (<0,0004%) существенно снижен. Установлен диапазон оптимальных концентраций гуминовых кислот -0,0004-0,016% (табл.10).

Анализ результатов биотестирования показал, что гуминовые кислоты различного происхождения обнаруживают существенные отличия по уровню физиологической активности. Предварительная механообработка угля приводит к получению ГК с более высоким уровнем физиологической активности («=8-50%), несколько снижает стимулирующие свойства ГК предварительная деминерализация угля (»15%).

Таблица 10.

Влияние 1 'К исходных и подвергнутых предварительной обработке бурых углей Хандинского и Щеткинского месторождений на прорастание семян кукурузы

Концентрация ГК, % Средняя длина главного корня проростков кукурузы (см)

Контроль ГКХ ГК Хм/о ГК Хдем. гкщ ГК Щм/о

0,016 5,4+0,3 5,1±0,2 4,5±0,2 5,3±0,4 5,7±0,4 7,1±0,1

0,0032 5,8±0,3 6,5±0,3 5,2±0,1 6,8±0,3 6,0±0,3 7,8±0,5

0,0016 6,3±0,3 7,5±0,3 7,4±0,2 6,3±0,3 6,2+0,3 8,5±0,3

0,0004 6,9+0,3 7,3±0,2 7,9+0,1 6,2+0,1 6,6±0,3 9,7±0,3

В целях апробации гуминовых кислот в качестве биостимуляторов проведены агротехнические испытания в полевых условиях. Оценено влияние гуминовых кислот на урожайность широко распространенных сельскохозяйственных культур: пшеница, ячмень, кукуруза, горох.

Результаты агротехнических испытаний подтверждают положительное физиологическое действие гуминовых и лигногуминовых кислот на урожайность культур. Процесс вермикомпостирования несколько снижает физиологическую активность лигногуминовых кислот, а действие электрогазового разряда - значительно улучшает (рис.7).

А%

д%

б

100 •

80 ; 60 -40 20 ,

0 —О - СТ

-20 < с

п

Я

г с

с % 5 *

5 £■

в пшеница □ ячмень О горох ■ кукуруза

Рис.7. Влияние на урожайность культур в полевых испытаниях: а - ГК углей; б - ЛГК вторичного сырья (А% - прирост урожая к контролю).

Параметры фрагментного состава и физиологическая активность ГК

Спектроскопия ЯМР13С

На' основе многомерного статистического анализа обнаружены устойчивые (по двум выборкам - лабораторные и полевые испытания) и значимые взаимосвязи ФА и структурных параметров ГК. Статистические показатели этих взаимосвязей, охарактеризованных зависимостями (10):

у = а + Ьх (10),

где у - показатель ФА ГК (Д'%-лабораторные испытания - прирост корня семян кукурузы под влиянием растворов ГК с концентрацией 0,0004%; Д"%-полевые испытания - прирост урожая пшеницы и кукурузы), х - параметр фрагментного состава, характеризующий структуру ГК.

Найдена устойчивая по двум выборкам (лабораторные и полевые испытания) тесная взаимосвязь между показателями физиологической активности и комплексным структурным параметром Ф1, который характеризует отношение в ГК количества активных функциональных групп (ФГ) и Сш,кО-фрагментов к ароматической составляющей. Ф1 может характеризовать соотношение гидрофильно-гидрофобных свойств макромолекул ГК и отражать реакционную способность их отдельных активных центров при взаимодействии с клетками растений:

Ф1=(СС00н+Сонфен+Са.1КО)/ХСарС,Н (11)

(«= 34,13; Ь= 104,4; г=0,85; 50=16,3; п=8 и д= 19,01; Ъ= 0,74; г=0,96; 5,-3,7;

п-6 лабораторные и полевые испытания, соответственно).

Таким образом, результаты биотестирования показывают, что соотношение гидрофильных/гидрофобных фрагментов в структуре ГК является одним из определяющих факторов их физиологической активности. Полученные результаты позволяют предполагать, что спектроскопия ЯМР 13С может быть успешно использована для прогнозирования свойств ГК, как биостимуляторов.

20

Ф1 Ф1

Рис.8. Взаимосвязь показателей ФА (а - лабораторные испытания Д% -прирост корня проростков кукурузы; б - полевые испытания А% - прирост урожая зерновых) и комплексного параметра Ф1.

Спектроскопия ЯМР17 О

Поскольку при изучении физиологической активности ГК всегда использовали их водные растворы, нами изучены системы "ПС-Ма0Н-Н20" на ядрах структурообразующего элемента воды - кислорода. Установленные различия в строении и составе ГК в зависимости от исходного вещества и способа их выделения могли проявиться в характере взаимодействия гуминовых кислот с водой, отражая особенности их физиологического действия.

Для каждой серии растворов гуматов зарегистрированы спектры ЯМР О, измерены времена спин-спиновой релаксации (Т2) ядер кислорода 170 воды, выраженные через значения ширин линии на полувысоте сигнала (Ду1/2 'О) и характеризующие состояние воды непосредственно через атом кислорода. Значения полуширины линий сигналов ЯМР |70 нативной воды и водных растворов гуматов связаны со временем спин-спиновой релаксации Т, ядер 170 соотношением (12):

Т2= Ш-А\>т (12).

Общий вид взаимосвязи Ду1/2 170 - С[К обнаруживает сходство для всех ГК: в области высоких концентраций (>0,025 %) значения параметра Лу1/2 170 для растворов ГК близки к значению для исходной воды (Лу1/2170№о=62,1 Гц); с уменьшением концентраций гуминовых кислот в растворе величина Ду1/2 170 возрастает, проходя через максимум кривой, причем наибольшие значения параметра Ду1/2 170 для некоторых ГК соответствуют концентрациям ГК в диапазоне и 0,0004% (рис.9).

Ду,Гц

_Сгк,%

0.03

Рис.9. Зависимость значений Д\'1/2 О (Гц) воды от концентрации ГК в растворе (%).

Поскольку ГК имеют исключительно сложный химический состав, их структурные фрагменты можно условно разделить на гидрофильные (функциональные группы и С^О-фрагменты) и гидрофобные (водород- и углеродзамещенные ароматические и алифатические фрагменты). Механизм взаимодействия воды с гидрофильными фрагментами связан с разрушением водородных связей между молекулами воды, а значит с уменьшением параметра Д\'1/2 |70. На примере ряда модельных ароматических и алифатических соединений показано проявление стабилизации водородных связей воды молекулами углеводородов, особенно сильное в случае алифатических. Следовательно, гидрофобные фрагменты будут способствовать упрочнению структуры воды, что выражается в увеличении параметра А\М2 |70. Таким образом, доминирующее направление взаимодействий ГК с водой будет определяться конкурирующими эффектами гидрофильной и гидрофобной частей.

0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 —•— ГК МЫ-«— ГК Щ»/о —*— ГК X

/-

о

В области высоких концентраций ГК влияние полярных групп на энергию взаимодействия растворенных молекул ГК с растворителем всегда велико, что определяет малые значения Д\'1/2 170. С уменьшением концентраций, особенно в случае сильно разбавленных растворов, т.е. при сохраняющейся в целом сетке Н-связей, эффект полярных групп компенсируется преимущественным проявлением эффекта гидрофобной гидратации неполярных фрагментов, что выражается в росте значений параметра Ду1/2 |70.

Данные предположения подтверждены на примере межмолекулярного взаимодействия в водных бинарных системах при использовании ряда индивидуальных соединений (ароматических кислот, фенолов, углеводов) и их смесей, моделирующих активные центры и фрагменты ГК.

При концентрации ГК в растворе 0,0004% зависимость Ду1/2 170=Г(С| к) проходит через максимум. Мы считаем, что это является следствием постепенного разрушения ассоциатов макромолекул ГК молекулами воды при уменьшении концентрации ГК в растворе и изменения соотношения надмолекулярных и молекулярных компонент ГК, влияющих на параметр Ду1/2 О. Чем ниже значения Ам\И О в максимуме, тем больше доля молекулярной составляющей и выше физиологическая активность гумшювых кислот. Более высокий уровень физиологической активности в данном случае может быть обусловлен меньшей молекулярной массой частиц ГК и большей реакционной способностью их активных центров при взаимодействии с клетками растений.

Результаты количественной оценки межмолекулярного взаимодействия в системах ТК-КаОН-НгО", представленные в виде разности значений параметров Лу1/2 ,70 для растворов различных ГК с концентрацией 0,0004% и исходной воды, приведены в табл.11.

Таблица 11.

Взаимосвязь релаксационных характеристик воды в системе :ТК-Ма0Н-Н20",

структурных параметров и показателей физиологической активности ГК

ГК Д\'1/2 170, Гц А, Гц ФА (Д',%) Структурный параметр Ф1

гкх 99,9 35,8 20,1 0,29

ГК Хдем 110,4 46,3 2,8 0,30

гкщ 116,8 52,7 -4,3 0,49

ГК Щм/о 81,4 17,3 40,6 0,87

ГКМБ1 120,4 56,3 -23,2 0,27

ГК МБ2 87,6 23,3 14,5 0,48

ГК МБЗ 119.3 55,2 1 -15,9 0,36

Статистические показатели взаимосвязи параметров ФА, Ф1 и разности Д, Гц Уравнение: у = а + Ьх а = 44,28; Ь -0,67; г =0,93; Зо=6,48; п. = 7 а = 63,98; Ъ = -52,61; г = 0,70; 80=12,4; п = 7

\ - отклонения от значений Ду1/2 170 волы , выбранной в качестве образца сравнения (Ду 1/2 ''ОнзО-62-1 Гц три рН=6,1). Все растворы ГК характеризовались значением рН = 6,1±0,2.

Для подтверждения влияния соотношения надмолекулярной и молекулярной составляющей гуминовых кислот нами при регистрации спектров ЯМР |3С в систему "ГК-На0Н-Н20" вводился эталон - вещество постоянной концентрации, хорошо растворимое в водных растворах - 4,4-диметил 4-силапентан сульфонат натрия (ДСС) - (СН3)з8)(СН2)з80зКта.

Обнаружено уширение линий эталонного диамагнитного вещества (Д\'') за счет его взаимодействия с парамагнитными центрами гуминовых кислот, которое может отражать концентрацию высокомолекулярных компонент ПС с высокой степенью парамагнетизма, делокализованного на 71-связях ароматических систем. Если в растворе "ДСС-ЫаОН-НгО" значение Ду 1/2 !3С ~ 1,1 Гц, то в системах "ГК-Ма0Н-Н2О-ДСС'' значения Ду' варьируются в диапазоне 10-12 Гц.

Представленные выше результаты позволяют предполагать, что спектроскопия ЯМР на ядрах 13С и 170 может быть успешно использована для прогнозирования свойств ГК, как биостимуляторов. Это способствует существенному ускорению экспериментальной оценки различных свойств ГК для практического применения.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема количественного определения состава и строения гуминовых кислот на основе совокупности структурных параметров количественных спектров ЯМР 'Н и |3С.

2. Методом ЯМР ЬС охарактеризован фрагментный состав препаратов гуминовых кислот различного происхождения и установлены основные изменения структурных характеристик ГК и ЛГК п ряду "продукты переработки древесины-торф-бурый уголь", среди которых доминируют процессы, связанные с ростом количества ароматических фрагментов, деградацией "лигнннных" и "углеводных" фрагментов.

3. Установлено, что фракционирование препаратов гуминовых кислот, выделенных из бурых углей, избирательным растворением их в кислородсодержащих растворителях (ацетоне) сопровождается существенным изменением параметров фрагментного состава фракций, что обусловлено высокой реакционной способностью ГК и их склонностью к реакциям окисления-восстановления.

4. Проведена оценка относительных изменений структуры ГК при различных способах воздействий на исходное органическое вещество (органические и неорганические экстрагенты, предварительная деминерализация, окисление перманганатом калия, окислительная механодеструкция, вермикомпостиро-вание, обработка электрическим газовым разрядом).

5. Установлены взаимосвязи параметров фрагментного состава из спектров ЯМР 13С и физиологической активности гуминовых кислот, характеризующие их стимулирующие, а также, в ряде случаев, ингибирующие рост растений свойства.

6. Впервые методом спектроскопии ЯМР пО обнаружен диапазон концентраций ГК в водной матрице, в котором наблюдаются значительные изменения соотношения их надмолекулярных и молекулярных компонент, что существенным образом предопределяет их физиологическую активность.

7. Показана возможность использования параметров фрагментного состава ЯМР 13С и релаксационных характеристик структурообразующего элемента воды - ядер |70 для экспрессного мониторинга свойств ГК как стимуляторов роста растений.

Публикации по теме диссертации

1. Калабин Г.А., Чечешша Т.Е., Парамонова Т.Г., Кушнарев Д.Ф. Анализ гуминовых кислот Хандинского месторождения методом спектроскопии ЯМР// Химия твердого топлива. - 1997. - № 2. - С. 19-24.

2. Чеченина Т.Е., Пройдаков А.Г., Кушнарев Д.Ф., Парамонова Т.Г., Калабин Г.А. Спектроскопия ЯМР 13С фракций гуминовых кислот бурых углей Хандинского месторождения И Химия твердого топлива. - 1998. - № 2. - С. 40-47.

3. Новикова Л.Н., Чеченина Т.Е, Яковлева Ю.Н., Островская P.M., Кушнарев Д.Ф., Серышев В.А. Структурные особенности и биологические свойства гуминовых кислот// Почвоведение, (в печати).

4. Калабин Г.А., Чсчеиина Т.Е., Кушнарев Д.Ф., Ч. Иньшен. Изучение структурных особенностей гуминовых кислот бурых углей методом спектроскопии ЯМР 13С и ,70 // Тез. докл. Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-96".-Краснодар, 1996. - С. 223-225.

5. Пройдаксв А.Г., Калабин Г.А., Чеченина Т.Е.. Кушнарев Д.Ф., Ч. Иньшен. Спектроскопии ЯМР ЬС и 170 как метод экологического мониторинга гуминовых кислот // Тез. докл. Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-96". - Краснодар, 1996. - С. 246-247.

6. Калабин P.A., Чеченина Т.Е.. Кушнарев Д.Ф.. Ч. Иньшен. Новый метод контроля состава гуминовых кислот // Тез. докл. Международной конференции "Экологически чистые технологические процессы в решении проблем окружающей среды" -"Экотехнология-96", Иркутск, 1996. - Т. 2. - С. 97-99.

7. Пройдаков А.Г., Калабин Г.А., Чеченина Т.Е., Кушнарев Д.Ф., Ч. Иньшен. Анализ состава, и мсханохимические преобразования гуминовых кислот - экологически безопасных удобрений и сорбентов // Тез. докл. Международной конференции "Экологически чистые технологические процессы в решении проблем окружаю' щей среды" - "Экотехнология-96", Иркутск, 1996.-Т. 2.-С. 113-115.

8. Кушнарев Д.Ф., Чеченина Т.Е., Пройдаков А.Г., Калабин Г.А. Новые подходы спектроскопии ЯМР к анализу состава и свойств гуматов// Тез. докл. XVI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Санкт-Петербург, 1998. - С. 124.

9. Калабин P.A., Козлов 10. П., Кушнарев Д.Ф., Чеченина Т. Е., Пройдаков А.Г. Анализ состава и свойств гуматов: новые подходы спектроскопии ЯМР//' Тез. докл. IV Всероссийского семинара по магнитному резонансу (спектроскопия и томография). - Ростов-на-Дону, 1998. - с. 16.

10. Калабин P.A., Кушнарев Д.Ф., Чеченина Т.Е. Фрагменшый состав - метод адекватного описания строения и некоторых свойств нефтей и нефтепродуктов// Тез. докл. Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов". -Москва, 2000.-С. 221.

11-Каницкая JI.B.. Рохин A.B., Чеченина Т.Е., Кушнарев Д.Ф., Калабин Г.А. Количественная спектроскопия ЯМР 'Н и 13С лигнинов// Тез. докл. Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов". - Москва, 2000. -С. 137-138.

4 В настоящее время автор поменяла фамилию Чеченина на Фёдорова

Отпечатано в Глазковской типографии. Подписано в печать .05.2000 г. Формат бумаги 60x90 1/16. Усл. печ.л. Уч.-изд.л. 1.5 Тираж 100 экз. Заказ г^с?.