Изучение антигенной структуры адгезивных белков B. pertussis с помощью поликлональных антител к синтетическим пептидам тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

інститут біоорганічно! хімії та нафтохімії

-• . о

.. - на правах рукопису

БОРИСОВА Олена Георгіївна

ВИВЧЕННЯ антигенної будови адгезивних білків В. PERTUSSIS ЗА допомогою поліклональних антитіл до

СИНТЕТИЧНИХ ПЕПТИДІВ

02.00.10 - біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин

(■

Автореферат ' , дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії їм. О.В. Палладіна НАН України

Наукові керівникі: ’

доктор біологічних наук Радавський Ю.Л. академік НАН України Комісаре'нко С. В.,

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Кібірєв В.К. доктор медичних наук, професор Колєсніков М.М.

Провідна установа - ...

Київський науково-дослідний Інститут епідеміології та інфекційних захворювань їм. Л.В. Громашевського.

Захист відбудеться ^ ^________1994 р.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.016.65.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (253094. м. Київ. вул. Мурманська. 1).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Автореферат розісланий X 1994 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради ч >-л.. М. ФЕДОРЯК

НАЦІОНАЛЬНА ЛЯАДЕНІЯ ВШ УКРАЇЙИ ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІНІЇ ТА ПАОТОХШІІ

на правах рукопису

БОРИСОВА Олена Георгіївна

ВИВЧЕННЯ АНТИГЕННОЇ БУДОВИ АДГЕЗИВНИХ БІЛКІВ В. РЕігіи&К ЗА ДОПОМОГО!) ПОЛШОНАЛЫШ АНТИТІЛ ДО СИНТЕТИЧНИХ ПЕПТИДІВ

02.00.10 - біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

г

- з -

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЇ

Сучасна стратегія вакцинації базується на чотирьох типах репаратів: 1) убиті мікг. ;ргак1зми: ?) шві або послаблені

¡рганізки: 3), токсини; 4) комплексні вакцшш, що містять комбінацію детоксикованих антигенів. Зараз в Україні та в більшості країн світу для профілактики кашлюка застосовують АІСДП-Бакцішу. що являє собой детоксикований формальдегідом, каплзчннй мікроб в комплексі з дифтерійним та правцевим анатоксинами. Ця саіщпиа кас ряд недоліків, пов’язаних з виникненням ряду сторонніх ефестів місцевого та загального характеру, ідо зумозлені саме ігрисутністз антигенів кашлвчного мікробу. Проблема безпеки вгшлш меге бути вирішена шляхом розробки препарату, по сіхх’тіьсл з коротких синтетичних поптадів, які зідповілазть аптмггшшм д о тє рн 1 пан та; і протек-тііишх 6 5 лісі а бактерії.

Об'єктом ітгліх дссл1дг..?-г.ь бу^п "йд фактори адгезії В. регіиозіз - пертакглн (Р.еО).. та філажнтозниЯ гемаглютинін (СГА), лкі аІДіїооятьсл до наП51льп вз'ягших протектішшк білкових антигенів. Обидва білки експрзсовані на поверхні бактерії. їх первинна будова відома. Р.39 та СГА містять триплет Лгв-СІу-Лзр (?.ЗВ) - аміноізслотну послідовність, котра функціонує ліс пісц-з зв'язування з клітиною ряду маммі-ллрннх б і яків. Р. 69 иШить такоз так зезку Рго-збагачену ділянку в положенні 536-565 амінокислотної послідовності, яка с ікунодонінантнім районом Р.69.

Актуальність проблемі. Використання вакцин, що отримують

з природних джерел, супроводжується рядом проблем, пов’-язанішх як з труднощами в приготуванні матеріалу, так 1 з

міркуванням безпеки тих. хто вакцинується, та тих, хто вакцинує. Тому зараз в багатьох країнах світу ведеться розробка так званих синтетичних вакцин, що складаються з коротких пептидів, штучно синтезованих (матодами органічної хімії або генної інвеиерії). Такі пептиди відповідають за оіквенсрм антигенним детермінантам або епі'топам - ділянка«, які моауть розпізнаватися антитілами або певними клонами специфічних клітин імунної системи, ідо виробляють потім AT проти даного району. Суттєво, що створюючи синтетичну вакцину, можна відкидати ті ділянки білку, що відповідають за токсичність молекули та алергізацію організму. Першим кроком на шляху вибору пептидів для включення в склад вакцини є вивчення їх . і

антигенних та Імуногенних властивостей. В представленій роботі дається імунохімічна характеристика ряду синтетичних пептидів - фрагментів двох протективних білків В. pertussis.

Ступінь досліженності тематики. На поточний иоюзнт топа.

групами дослідників (P.Askelof з спів., Швеція, та І .

М.Oksenberg з спів., США) проводяться робота по розробці та

■створенню сучасної вакцини проти коклша на основі синтетичних пептидів, що входять в поліпептидний ланцюг деяких субо-диниць кашлючного токсину - одного з головних протективних білкових антигенів кашлючного мікроба. Дослідження Імуногенних властивостей синтетичних пептидів, «о відповідають епі-топам двох Інших антигенів В. pertussis - ФГА та Р.69 - проводяться тільки в ‘лабораторії структури та фукції білку Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України та у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії Ім.О.В. Палладіна НАН України. . * .

Мета роботи. Метою було вивчення антигенних та Імуноген-

' • - 5 - • ■

них' властивостей синтетичних пептидів - фрагментів білків

Р.69 та ФГА кашлючної бактерії. .. ’ •

Основні завдання дослідження. Для досягнейкя мети роботи необхідно.було вирішити такі завдання:

- одержати з культуральноі.ма’си бактерії В. pertussis ви-

сокоочищений Р. 69; '

■ - провести теоретичний розрахунок потенційних антигенних

детермінант Р. 69' та ФГА; '.

- одержати на основі синтетичних пептидів, які відповідають антигенним детермінантам білків, імунокон*вгати;

- одержати поліклональні антитіла до кон’югатів та аналізувати їх властивості. ......

; Теоретична та практична цінність.. В результаті експерименту на тваринах були обрані пептидні фрагменти протектив-шіх білків В.pertussis, .що мають добрі Імуногенні власти-

■ вості. Це дослідження є першим кроком-у напрямку створення синтетичної вакцини. . . : •

Наукова новизна полягає в тому, що вперше були обрані пептиди, як? мають добрі імуногенні.'властивості 1 е перспективними для подальшого вивчення як компонентів синтетичної вакцини проти кашлюку. Пептид - фрагмент ФГА, а також три пептиди з Р.69 ' В,pertussis викликали виробку антитіл при введенні в складі кон'югатів у кролів та мишей, при чому антитіла до пептидів розпізнавали натнвні білки.

4 Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були викладені та обговорені на II Російсько-Ізраїльському сннпо-зіумі по пептидах та білках (Москва, 1992), VI Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992). конференції молодих вчених інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (Ки-

Ів. 1993). семінарі відділу молекулярної Імунології Інтитуту біохімії їм. 0.В.Палладіна НАН України (Київ. 1993) та Евро-пейському Імунологічному з’їзді (Барселона, 1994).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 7 робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на г 115 стор. машинописного тексту та складається з вступу, двох розділів огляду літератури, опису матеріалів 1 методів дослідження та результатів 1 їх обговорення. Список використаних літературних джерел містить 120 найменувань. У дисертації 4 таблиці, ‘ 17 малюнків та,'4 додатки.

Конкретний особистий внесок дисертанта. Основна частина роботи, що представлена для захисту, виконана особисто пошу-кувачем.

Методологія, методи дослідження. . . '

Синтетичні пептиди - фрагменти ФГА та Р.69 одержані в ■ Інституті біоорганічної хімії їм. М.М. Шемякіна та Ю. А. Ов-чіннікова Російської АН, Москва. Культуральна маса Bordetella pertussis одержана в НДІВС їм.І.І.Мєчнікова, РАМН. Філамен-тозний гемаглютинін’В. pertussis був люб’язно наданий лабо: раторією структури 1 функції білка ІБОНХ НАН України.

Експерименти на тваринах проводилися у відповідності із рекомендаціями В003.

При виконанні дисертації використовували такі методи дослідження: . .

- аналіз білків електрофорезом в ПААГ в присутності доде-

цилоульфата На (Ьаеяіі, 1970): . "

- імуноелектроблотіиг (Towbln et аі., 1979);

- різноманітні модифікації твердофазного Імуноферментного

f . аналізу - ELISA;

- 7 - '

- отримання кон’югатів пептидів з білком-носієм за допомого» біфункціональннх реагентів;

- дослідження амінокислотного складу цих кон'югатів при ' кислотному гідролізі; •

, - фракціювання білків іонообмінно» хроматографією; •-

- імуноафінна хроматографія; ", .

- комп’ютерний аналіз структурно-функціональних' особли-

востей білків за їх амінокислотними послідовностями (програми PCGene та Genebee). .

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ.

Р. 69 (або пертактин) - адгезнзний білок В. pertussis з М. в. 60.5 кДа. амінокислотна судова якого відома. Вторинна структура білка не досліджена досконало, але згідно з даними •КД-спектрІв -він ■ містить антипаралельний p-лист та невелику кількість a-спіралей (Charles I.G. et al., 1988).

Два інших види Бордетелл, В.parapertussis та В. bronchlsepttea,котрі є тваринними патогена:®, також містять аглютинуючі білки Р..70 та Р.68 відповідно. Р.68. Р. 69 та.

Р.70'мають високий ступінь гомології (Charles I.G.' et al., ' 1991). •

Отримання лізату бактеріальної маси та його Юнобмінне розділення. Р.69 вилучали з лізату культурально! маси бактерій Bordetella pertussis штаму ВР 353, що брали на кінці експотенційної фази. Лізат отримували після термостатування клітинної маси при 60°С протягом-1 години у 0,01 М Тр1с-НС1 буфері, pH 8,0.

Розділення компонентів лізату проводили за допомогою іо-

нообмінної хроматографії на колонці з ДЕАЕ-сефарозою. для чого проводили градієнтну елюцію білків за допомогою розчину НаСІ з концентрацією від нуля до 0,1 И в 0,25 И Tplc-HCl буфері, pH 8,8, збираючи елюат у вигляді фракційпоЗ мл. В результаті хроматографії були отримані три піки (Нал. 1, А)* Фракції, що містили пікові кйнцентрації білка (Н 6-9, 11-13. 18-20). об'єднували, після чого діалізували проти води та ліофілізували. - , \

Для ідентифікації Р.69 в пробах проводили ДСН-електоо-Форєз в 12 % ПААГ за стандартної) методикою (Laennll ü. . ■1970), - ' ■ ■ . • , - ; ■

Відомо, що Р.69 має аномальну електрофоретичну .рухливість, що відповідає 69 кДа, нззвагавчи на меншу молекулярну вагу (Falrthweather et al., 1990). Смуака, попередньо ідентифікована як Р.69, містилась в 3 пікові (Кал.і. А).

Для елімінації фракцій низькомолекулярних білків проводили повторну .іонобмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі. для .

• ’ • • • . . -чого фракцію н 3 наносили на колонку. В результаті хроматографії були отримані два піки білка (Мал. 1, Б). Електрофора-тичне дослідження цих двох фракцій показало. .що в другому пікові знаходилась смуга, що відповідала Р.69, причому д(£-' мішки виходили з першим піком. Чистота препарату Р.69 була підтвердаена методом імуноблотінгу з афінно очищении анти- . тілами кролів, що були вилучені з АС до кон'югатів пептидів Юп, 14п, 17п з' KLH та специфічно розпізнавали іюптиди в

тесті ELISA. : . . ■ ' . .

Р.69 містить дві важливі в функціональному відношенні ділянки: 1) RGB-сайт. що локалізований в районі 225-227 та

відповідає за міжмолекулярний зв'язок з рецепторами маммі-

Мал. 1. Хроматограма виділення Р. 69- на ДЕАЕ-сефарозІ в градієнті НаСІ від 0 до 0,08 М (А - перший етап. Б - другий етап хроматографії). Вміст білка у фракціях вимірювали спектрофотометрично при Х-280 нм.

. І МАРКЕРИ, ' МАРКЕРИ,

. 1 кДА . В гДл

Кал. 2. Електрофорез у ПААГ-ДСН лізату бактерій В.pertussis, фракцій N 1, 2, 3 після першої стадії очистки

(А) та після другої (Б) на ДЕАЕ-сефзрозі.

NaCl

' - 10 - • лярних.клітин; 2) Рго-збагачена область в районі 536-566: КАРРАРКРАРОРСРйРРОРРйРОРЕАРАРйР. антитіла (АТ) до якої ефективно знинують (до 104 разів) колонізацію мікроорганізмів в легенях в моделі з мишами. Цей район впізнається більшістю існуючих моноклональних АТ до Р. 69. За допомогою синтетичних пептидів було показано, що зв’язування Р.69 з В- та Т-лімфоцитами людини та тварин відбувається через РЦР-вмісну ділянку, а не {ЮБ-сайт (Сіїагіез І.Є. ес аі., 1991). ' .

Оскільки пролін-збагачена область Р.69 проявляє протєк-тивні властивості, саме на неї була націлена наша увага в плані пошуку синтетичних пептидів - кандидатів для включення в склад синтетичної вакцини. ‘

Комп'ютерне дослідження амінокислотної послідовності Р.69 за допомогою пакета програм РС бЕІІ показало, що на Рго-зба-гачену ділянку припадає половина всіх передбачених високо' рухливих сегментів молекули. Тому слід було очікувати локалізації в цьому районі лінійних В-епітопів. Разом з тим, алгоритм дослідження Імунодомінантних районів по Хопу і Вудсу. що бере за основу гідрофільність амінокислотних залишків, не відносив Рго-збагачену область до найбільш Імуногенних районів пертактину. ’

На сьогодняшні точно встановлена лише лінійна антнгенна де-

•

термії,анта РйРОРР (амінокислотні залишки 547-552, на схемі' умовно бп). яка розпізнається моноклональними АТ ВВ05, що мають протектпвну активність при пасивній імунізації

* ■ • - С

(СЛаПеэ І. 0. еІ аі., 1991). Тому було цікаво отримати та проаналізувати антитіла до відповідного гексапептиду, а та-

- 11 - ,

цок до більш крупних пептидів для уточнення антигенної будови району 536-566 Р.69.

Ділянка 536-566 Р. ?9 В.pertussis (Вр) містить триплет Pro-Gln-Pro. повторении 5 разів. Функціональне значення цієї послідовності невідоме, але ця :« послідовність існує 1..В

білках Р. 70 та Р.68 В.parapertussis (Врр) та

B.bronchiseptica (ВЬ), що повторюється 9 та 7 разів (Charles

I. G. et аі.. 1991):

Вр --545PQP - PQP PQP POP------------------PQP -

ВЬ . POP - POP - PQP РйР POP PQP PQP PQP-----POP -

Epp PQP - PQP - POP PQP POP PQP--------------PQP -

Длл експерименту були Обр-ГІІ КОПТИЛИ ЛОВКІШОЮ 10, 14 та

17 амінокислотних залишків (10л, 14п та 17п, відповідно). їх смінохкслотоа структура та розта.-'-'ваым наведені никче:

! 7п 36КАРГ АРКРЛгй?№ОРР" 5'

МП 3 5 3 ОРГОРОі‘ЕАРЛі Р5"5

■Оп . п ^СРОРРОРРОР'-7

«Її -г'17 РСРОРР552

Гс •: г .г.ептид 17п включає г? еоГ: = • :кпп являє собою іі'-ім'л . . , ■:Г’;. менг поалІдогіч..-.-і і V" -ірута П частина

г;р<;/,г г пептидом 14и. а гх. ''а Юп частково присутня :і 17п і в іЛ. Внкорлс.;.;- в нексн'югованому

стані для імунізації тварин суло аедоьл/.ьно в зв’язку з тим, що він є дуже коротким та не може нести в своєму складі Т-епітоп.

Для дослідження Імуногенних властивостей пептидів - фрагі ментів Р.69 в вільному стані мишей ліній ВАЬВ/с та СВА . п 6 тварин в групі, Імунізували згідно з загальною схемою пеп тидами 17п, 14п та 10п.

В результаті аналізу антисироваток (АС) було виявлено, ц тільки миші ВАЬВ/с (Н-24 гаплотий) здатні давати гуморальн; відповідь до 17п. До двох Інших пептидів - І4п та Юп - ут-

4 ’

ворення АТ не 'спостерігалось. У мишей лінії СВА (Н-2к гапло-тип)' жоден з пептидів не викликав антитілоутворення.

Таким чином, пептиди 14п та ІОп при імунізації даних ліній мишей імуногенних властивостей не виявляли. Що стосується І7п, то утворення АТ до нього у мишей ВАЬВ/с. очевидно, зв’язано з присутністю Т-епітопу в його складі. Відповідь, однак, рестриктована по головному комплексу гістосумісності.

Таким чином, отримані результати свідчать, .що дані пептиди не можна використовувати як компоненти протйкашлючної вакцини у вільному стані, хоча є дані, що пептиди "підготов-люють" імунну систему навіть тоді, коли не спостерігається

• виробка специфічних АТ. При цьому при другій імунізації на-тивним антигеном чи організмом спостерігається дуже високий титр антитіл до цих антигенів в порівнянні з титром АТ тварин, що.не були "підготовлені" пептидами (В.Лгпоп. 1991).■

Для того, щоб отримати антитіла (АТ), специфічні до пептидів - фрагментів Р.69, були синтезовані за допомогою глу-тарового альдегіду їх кон’югати з гемоцианіном равлика, КЬН. (КІН-17П, КЬН-14в. КІН-ІОП. КЬН-бп).

Для аналізу взаємодії антисироваток з пептидними епітопа-ми були синтезовані кон’югат;: пептидів з Ова.'

, »

Для отримання імунної сироватки до кон’югатів КЬН-17п.

KLH-l4n. KLH-I0n. KLH-вп кролів імунізували двічі кон’югата-ми в ПАФ та НАФ. " ■

Дослідження наявності імунно! відповіді До кон'югатій KLH-17n. KLH-14n. KLH-lOn. KLH-бп. Сироватки кролів аналізували методами непрямого ELISA та дот-блотінгу. Титр АТ до KLH, обробленого глутаральдегідой (KLH-ra), вважався критерієм для оцінки загального рівня антитілоутворення. Всі сироватки взаємодіяли з KLH-ra,. але не розпізнавали контрольні антигени. Відсутність розпізнавання контрольного АГ сирова-точними АТ свідчила про високу специфічність отриманих анти-сироваток. . •

Взаємодія антисиповаток з пептидами, ио входять до складу кон'югатів .КШ-17п. KLH-14n. KLH-lOn. KLH-бп. Взаємодія си-

роваток з '"рідними" пептидами вивчалась в непрямому ELISA. Надзвичайно високий титр АТ був отриманий до KLH-17n -

1:4x10е. До інших пептидів титри АТ також були досить високі: і:256хі03 до Юп, 1:64ХІ03 до І4п. АТ з сироватки до KLH-бп не взаємодіяли з планшетами, сенсибілізованими 6п. Можливо це зв'язано в значній мірі з тим, що досить короткий

6п не сорбувався на планшеті. Але антитіла до KLH-бп добре

розпізнавали Ова-бп. ' . •

Чіткої залежності між рівнем АТ до пептидів та KLH не спостерігалось. Титр АТ, що досліджували в тесті ELISA при використанні кон’югатів пептидів з Ова. інколи був в кілька разів нижчий, ніж при використанні пептидів; сорбованих на планшеті (результати дослідів підсумовані в Табл. 1). Цей Факт- можна пояснити тим, що кількість пептидних епітопів після сорбції на планшеті була більшою при використанні вільного пептиду, ніж його кон’югатів з БСА. Але, все ж та-

Табл. 1. Загальний аналіз антнсироваток до кон'югатів пептидів з Рго-збагаченої ділянки пертактину В. pertussis з KLH.

АГ імуні- зація день забору крові 1 / титр AT до АГ ' •

KLH-ra Ова БСА 6П Ова-бп Р. 69

KLH-бП І 10 <250, н.д. н. Д. н.д. 2x10? н.д.

II 8 8x10® 0 0 0 8x10^ н.д.

II 12 8x103 0 0 0 8x10 250

III 13 6ІХІ О3 0 0 0 16x103

Юп 0ва-10п

KLH-lOn І 10 4x103 Н. П. н. д. н.д.. 250 н.д.

II 8 123X103 0 0 256X1О3 128X10? н.д.

їх 12 253x10 к.д. п. д. п. д.. і ооян ft* 0J

Мп 0ва-14п

KLH-14n I 7 16x10? H. Д. н. д. н.д 4ХІ03 н. д.

II 7 512x10" 0 0 64x1О3 16X103 2X10

II 14 512ХІ03 н.д. н. д. н.д. 16ХІ03 н.д.

III 7 512x10? н.д. н. д. н.д. н.д. н. д.

III 14 128x10 н. д. н.д. н.д. - н.д. н.д.

. * 17 л 0ва-17п

KLH-17n l 10 32X10? н. д. н. д. н.д.. н.д.,. Н.д.

II 8 1X10° 0 0 256x1О3 4X10° 2x10і

II 12 ІХІ0 н.д. н.д. к.д. н.д. н.д.

н.д. - не досліджувався

ки, використання кон'югатів пептидів з альтернативним носієм для аналізу в тесті ELISA було привабливим в методичному плані, тому що фізичні .характеристики полістирольної поверхні дуже сильно вплітали на сорбційну здатність малих пептид-них молекул: • при використанні пластиків різних фірм було необхідно кожного разу підбирати умови-для - сорбції пептидів, деякі пластики навіть не сорбували пептиди взагалі, або я

- 15 - .

їін змивався під час■ промивки планшету. Приц використанні тон’югатів пептидів з білками такої проблеми не виникало.

Всі сироватки були перевірені на взаємодію з наганним Р. 69 методами непрямого, ELISA та дот-блоту (Див. Табл. 1).

Аналіз взаємодії антисигюваток до KLH-17n. KLH-14n. KLH-ІОп. KLH-бп з ггоотективния епІтоГюм ^-PGPQPP^-. Анал 1 з проводили методом ELISA. Титр специфічних до 6п антитіл оцінювали за взаємодією АС з Ова-бп відносно Ова-га, щоб виключити AT. спрямовані проти модифікованих глутаровим альдегідом амінокислотних залишків. АС, отримана на кон'югат KLH-ІОп не взаємодіяла з Ова-бп. АС до кон’югату KLH-бп та KLH-17n взаємодіяли з Ова-бп (титр відносно Ова-га був 5 х іО3 та 10* відповідно). В АС до KLH-14n не було специфічних до 6п AT.

На підставі цього дослідження був зроблений висновок, що до складу І7п входить епітоп бп. ’

Розрахунок ВТ0РИНН0Й СТРУКТУРИ фга. ФГА. являс собою велику білкову молекулу, М. в.=220 кДа, амінокислотна послідовність.якої відома- В положенні' 1097-1099 амінокислотного ланцюгу знаходиться триплет амінокислот Arg-Gly-Asp, що с сайтом адгезії ФГА за механізмом, зв’язаннии з •CR3-iHTerpu-ном альвеолярних макрофагів ссавців (Reiman D. etal., 1990).- Був проведений розрахунок вторинної структури ФГА за методом Гарн'є (пакет програм PCGen). котрий вияв’-з наявність двох ^-поворотів в даному районі, що свідчить про меж-' . лив}сть експонування його на поверхні білкової глобули, ми аналізували антигенні властивості фрагменту ФГА, що містив RGD-сайт. з метою дослідження його перспективності як компонента синтетичної вакцини проти кашлюка.

- 10 -

Для Імунізації кролів як антигени були використані ФГА. синтетичний пептид TVGRGDPHQ та його кон'югати з БСА та ЧСА.

Для отримання антисироватки. специфічної до ФГА. кролів імунізували за двома різними схемами: по першій схемі Імуні- г зацію проводили, використовуючи ПАФ (кролі 2, 3, 4/ Табл. 2), по другій - без ад’ювантів (кріль 1, Табл. 2).

Антисироватки аналізували методами дот-блоту та непрямого ELISA, коли на планшет наносили спочатку антиген, потім ан-тисироватку та, нарешті, кон'югат анти-видоспецифічних антитіл з пероксидазою.

Відомо, що сорбція коротких пептидів нд полімерній по-

І k .

верхні в ряді випадків призводить до'ускладнення їх впізнавання в тесті ELISA внаслідок того, що пептиди змінюють конформацію при взаємодії з полістирольною поверхнею. Для того, щоб виявити специфічні до пептида антитіла, були синтезовані два його конъюгата з білковими носіями. Кон'югат пептида з . ЧСА (ЧСА-пФГА) отримували за допомогою N-сукцинІл-З-(2-піри-дил-дітіопропіонату) - SPDP. Пептид пФГА не містить залишків цистеїну. При синтезі кон’югату керувались методикою, де спочатку в пептид та ЧСА вводили за допомогою SPDP 2-пірй-дилдисульфідні групи. Потім 2-піридилдисульфІдне похідне ЧСА відновлювали дитіотреїтолом з утворенням SH-похІдного. котре далі реагує з модифікованим пептидом шляхом дисульфідного обміну. Отримання кон'югату БСА-пФГА здійснювали за допомогою глутарового альдегіду. Використання альтернативного зшиваючого агента дає можливість адекватно оцінити виробку гуморальної відповіді до пептиду, виключаючи відповідь до модифікованих глутаровим альдегідом залишків амінокислот 61л-

. ’ - 17 - ■ *

а-носія.

Активність антисироватки до ФІГА досліджували по відношен-d до цілого M’A. пептиду та його нон'югатів з БСА та ЧСА.

Титри антитіл до нативно ; ФГА відрізлялись в аятисиро-атках в залежності від схеми Імунізації та кількості ін’єк-/-ІІЙ (Табл. 2). Впізнавання, пептиду, що сорбувався на планшв-•1, було меяа ефективним. хоча, в цілому, було пропорційним іагальнону рівно антитіл до ФГА. .

Табл. 2.. Порівняння титрів AT до натавного ФГА та його

■ пептиду, що містить RGD-сайт. в тесті нещирого

■ изтоду ELISA,

номер кроля номер ' АС . кіль- кість ін'єкцій день отримання АС (*> lg титра АТ ДО ФГА lg титра АТ ДО ПФГА (♦*)

і 1 5 7 5.56 4,60

2 д 2 3 7 4.61 0

3 • 3 ■ 4 7 3,67 0

4 4 14 4.13 0

4 5 2 ■ 7 5.56 4,13

6 3 7 5,56 4,13

7 '4 7 4,61 4,13

3 4 14 5,03 4,60"

(») - після чергової іонізації ..

• (**)- титр антитіл до пептиду в АС досліджували за їх’ . озаемодієв з кон'вгатом БСА-пФГА

Найбільш ефективно пептид в складі кон'вгату з БСА роз-ізнавався сироваткам;? Н 1 та 8 тобто тами, що найбільш їектптю розпізнавали 1 натавігаГі ФГА. Антитіла контрольної ,фоватки кролів не розпізнавали вищезгадані антигени,

3 кон'вгатами БСА-пФГА та ЧСА-пФГА антитіла з імунної си-зватки взаємодіяли ефективніша, ніж з пептидом, що сорбува-< на планшеті. В той же час антитіла з контрольної сироват-

- 18 - -

ки з даними АГ не взаємодіяли.

Таким чином, виходячи з результатів аналізу, мовна сказати, що сироватка кролів містила специфічні до RGD-ділянки ФГА антитіла, відносно невисокий рівень сигналу до лептиду можна пояснити тим, що розмір даного епітощг є незначним в порівнянні з розміром всієї молекулі, в той ке час відомо, що практично вся поверхня білкових антигенів є потенційно Імуногеною (Ы. Geysen, et al.. 1987). Виходячи з того, що молекулярна вага ФГА 220 кДа. доля епітопспецифічних антитіл не повніша перевищувати кількох відсотків од всіх АТ. спря-мованних до ФГА.

Афінна хроматографія АС до ФГА була використана для підтвердження наявності саме таких АТ-,' котрі впізнають епі-топ в районі RGD-сайту, а не є поліреактивними. Агарозу, активовану BrCN, на якій був імобілізований пептид, використовували як афінний сорбент (агароза-TVGRGDPHd).

Для афінно! хроматографії використовували антисироватки кролів, які мали титр в непрямому метод! ELISA не менший ній 1:364000 до ФГА та 1:40500 до пептиду (Ні та 8 в Табл. 2).

Виділені АТ перевіряли в тесті ELISA на взаємодію з ФГА, пептидом, БСА-пФГА та БСА, як контрольним АГ. Незважаючи нг те, . що АТ були афінно очищені на сорбенті з Імобілізовані» пептидом, вони розпізнавали нативний ФГА значно ефективніше, ніж вільний пептид або si його кон'югат (Мал. 3). Це. можливе є результатом конформаційних змін в RGD-послідовності е складі білка, кон’югату та у вільному пептиді. Конформаційн! зміни ділянок поліпептидних антигенів, що знаходяться в формі пептидів, були показані раніш-1 "для інших АГ. ,

Для вивчення імуногенних властивостей пептиду пФГА тваріи

. Алао

3,2.

ід.

1.0.

0.0.

0.0.

0.7.

0.0.

0.3.

0.4.

0.3.

0.2.

О.Х.

Мал. 3. Специфічність афінно очищених АТ кроля, що отри-ші при імунізації ФГА в тесті непрямого ELISA.

Л490

0,7

0,6

0>s

0.4

0.3

0,2

0.1

■ 3 6 12 24 48 ТФБ

J _ . •

' РОЗВЕДЕННЯ ЕЛИАТУ (РАЗГВ) •

Мал. 4. Специфічність афінно очищёних АТ кроля, Імунізо-аного БСА-пФГА, в тесті непрямого ELISA; .

З l/'O 1S27 lsaí

Т И.Т Г" Е Л В А Т У

• . ' ’ ' ■ -.20,- , . • імунізували кон’югатом БСА-пФГА, використовуюча ПАФ.

Для експерименту'брали мишей лійій BALB/c та СВА. по тварин в групі. Сироватку мишей до Імунізації викорйстовувг ли як контрольну. • ' , .

Для йналізу : АС був отриманий за допомогою глутарової альдегіду кон’югат пептида з оваяьбУиінои - Ова-ііФГА. Сире ватрі аналізували за допомогою методу дот-блоту та ELISA.

Після повторної Імунізації був спостережений високий таї АТ в сироватці мишей BALB/c по відношенню до ФГА ,<і:1600( та БСА (1:6000).. Миші BALB/c продемонстрували високий тиі такоа до Ова-пФГА - більш ніж 1:6000.

Подалі було визначено, що антисироватка проти БСА-ПФІ після повторної імунізації розпізнавала також 1 контролы АГ - цитохром £ та Фібриноген. .

Такий чином,, імунізація мишей кон’югатом БСА-пФГА призв< ла до Імунної відповіді з широким спектром специфічності АЧ

' Для виділення за допомогою афінної хроматограф! І на art розі-TVGRGDPHQ специфічних до пептида AT брали 0.5 мл зі гальної сироватки'нишей BALB/c. розведеної в 10 разів -ЗФІ що містив її БСА; БСА додавали для того, щоб блокувати А’ що неспецифічно взаємодіють з пептидом. •

Афінно виділені АТ було проаналізовано в непрямому тес ELISA. ФГА, БСА-пФГА, ЧСА-пФГА та БСА використовували як аі тигени. Ефективність розпізнавання, цих антигенів зменшуві лась в ряду: пФГА,'БСА-пФГА, ФГА. Взаємодія з БСА була не: начною, що можна вважати критерієм ступеню очистки АТ, сп цифічних до пептида. .

Картина імунно-і відповіді мишей СВА була подібна до ві, і

повіді у BALB/c. Імунна сироватка також виявилась полїспец

- 21 - •

Ячною. Після афінної очистки пептид-специфічних АТ з АС ми-аей СВА, котру проводили так ге само, як 1 в разі вторинної сироватки мишей BALB/c. були отримані антитіла, ідо проявляли ' специфічність до пФГА та *ГА. Картина аналізу специфічності була подібна до специфічності АТ ииией BALB/c. г

Була такса отримана іцунна.сироватка.кролів до пФГА. В результаті іиунізації кролів кон'югатом БСА-пФГА була отримана сироватка. 150 ефективно розпізнавала пептид в складі БСА-пФГА. та.неня ефективно пептид та ФГА. Сироватка не реагувала- з контрольними АГ. Тест з афінно виділеними на _ага-розі-TYGRGDFHQ штітілаїя підтвердив, цо їй кали справу з спецкфічніїки до пептиду та 2ГА антитілами (Кал. 4).

Таким чином, було доведено, ¡до АТ ¡.шлей ліній BALB/c та СВА. та кроля, які спрямовані проти RCD-лепгнду з ФГА, впізнають молекулу ФГА. а то:іу кояуть вести до блокування взаємодії В. pertussis з альвеолярная каврофагаии (D. Relman. et al.. 1990). е;о здійсиаеться через CR-3 зале:ший механізм.

• ВИСНОВКИ

1. За допомогою Іонобмінної хроматографії із культураль-. ноі клітинної маси Bordetella pertussis виділений у високоо- • чищеному стані пертактин (білок Р.69).

2. Проведений теоретичний аналіз антигешшх детермінант

. ' ‘*м*

пертактину та філаментозного гемаглютиніну, а також їх антигенної будови.

’3. Отримані поліклональні антитіла до чотирьох синтетичних пептидів - фрагментів Рго-збагаченої ділянки пертактину, антитіла до трьох з них взаємодіють з Інтактним пертактином.

4. Аналіз антитіл до 6п та 17п підтвердив наявність анти-

- 22 -

генної детермінанти в районі послідовності PQPQPP.

5. Виявлено В-епІтоп в районі фрагменту TVGRGDPHQ ФГА, ідо відповідає за взаємодію з Ш-Інтегршш клітин ссавців.

6. Отримані поліклональні- антитіла до ноиапептиду - фрагменту філаііентозного гемаглзтиніну. які розпізнають катишпійг

f

білок. ' ■ ■ ■

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Анализ антигенных свойств RGD-содержавізго. участка . фи-

ламентозного гемагглатгапша Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с СНЗ-интегршои какрофагоз./ Пхлкалзэ Е.Г.. Кави; ЕЛ.. Чечот В. А. и др’.-V/ Биополшзры к клетка. -1993,-N9.-С.39-44. ‘

2. Анализ шмуногенних свойств нонапептида из ©акшентоз-

ного гемаггдотишша В. pertussis. / Кавун Э. М., Пхякалзо Е. Г.. Ыаринец А.В. и др.// Укр. биохкм. жури.-1994.- Н Z.-

С. 98-101. 1 '

3. Пхакапзе Е. Г.. Кавун Э.М., Макаров Е. А., Радавский'

Ю. Л. / Анализ ишуногенных свойств трех синтетических пептидов из последовательности 536-566 пертактина В. pertussis.//-Доповіді АН України. - 1994.- N 7,- С. 75-88. •'

4. Кавун Э. М.. Пхакадзе Е. Г.. . Колесникова И. Н.. Гаврш

о. Г., Чечот В.А., Радавский Ю.Л. / Изучение антигенной структуры протективных белков Bordetella pertussis.// Кикро-биол. журн. - 1994. - Т. 56. N 2.. С. 82-83. •

5. Tlie RGD-contalnlng peptide of filamentous hemagglutinin (FHA) Is a potential*component of the peptide vaccine against whooping cough./ Kavoon E.M.. Pkhakadze

H.gI. Marlnetz A. V.. et al.// II Russlan-IsraerJ symposium on ' ‘ * . peptides and proteins. Moskow, June 2-9, 1992.- P. 19.

6. Kavoon E.M.. Pkhakadze E.G.. Makarov e:A. . Radavsky

Yu.L. / Analysis of antibodies to four synthetic peptides

from Pro-rich sequence of B.pertussis pertactln (P. 69). //-

Materials,of 12th European .Immunolo'gy Meeting. P.390.

' 7. Antibodies to TVGRGDPHU peptide recognize B-epitope

1094-1102 of Bordetella pertussis filamentous

hemagglutinlne. / Kavoon E.M..’ Pkhakadze E.G.. Marlnets A. et

al. // Materials of 12th European Immunology Meeting. P.

Борисова Е.Г. Изучение антигенной структуры адгезивны белков В., pertussis с помощью поликлональных антител к си тетическим пептидам.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биол гических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическ химия, химия природных и физиологически активных вещест Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, К ев, 1994..

Защищается 8 научных работ, в которых анализируется ант генная структура двух протективных белков В. pertussis - ф ламентозного гемагглютинина (ФГА) и Р.69 - с помощь» синт тических пептидов и антител к ним! Показано, что три пептид из пролин-богатой последовательности Р. 69 и один из ФГА спс собны индуцировать выработку антител, распознающих интактні белки, что . свидетельствует о возможности их использован! при разработке и создании синтетических вакцин против коша ша. .

Borisova E.G. Analysis or В.pertussis adhesive proteli structure by the use of polyclonal antibodies again; synthetic peptides. ’

Dissertation has been presented for the receiving t degree of the Candidate of Sciences (Biology).

Speciality is 02.00.10 - Bioorganlc Chemistry. Chemistry Natural and Physlologlcaly ActlveSubstances. Institute Bioorganlc Chemistry and Petrochemistry qf National Acade of Sciences of Ukraine. Kiev. 1994.

The 5 scientific works are defended. In which antlger structure or two adhesive B.pertussis proteins - filamente hemagglutinin (FHA) and P. 69 - is analysed by.the use synthetic-peptides and antibodies to them. It was shown tt three peptides from prolyne-rlch region of P.69 and ( peptide from FHA were capable to . Induce, the Abs. wh! dlcsern Intact proteins, that gives evidence of th< use during creating synthetic vaccine against whooping coi

Ключові слова: Імунохімічний аналіз. В.pertussis, ан

генна детермінанта, синтетичні пептиди.

Пошукувач

Подписано к печати Л-' Зак.

размножено I'Uii (кшястата ~і кпаг.ни

VHD'.

ЧлГ