Изучение антигенной структуры коклюшного токсина из Bordetella pertussis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМ1Я НАУК УКРАТНИ 1НСТИТУТ Б100РГАН1ЧН0Т ХШ11 ТА НАФТ0Х1ЛШ

РГ6 од

- 9 ЛВГ 1393

На правах рукопису

ГАВРИШ Олег Генадшович

ВИВЧЕННЯ АНТИГЕННОТ БУДОВИ КАШЛЮЧНОГО ТОКСИНУ 3 ВОКйЕТЕЫА РЕП7и8818

02.00.10 — бшоргашчна Х1М1Я, х1м1я природничих та фЫолопчно активних речовин

Автореферат дисертацп на здобуття наукового ступеня кандидата бтлопчних наук

КиТв — 1993

Робота виконана в лабораторп структуры та функци бшка 1нституту бшоргашчно! хгмИ" та нафтох1мп АН Украпш.

Науковий кер1вник —

кандидат бюлопчних наук, старший науковий ствробггник Радавський Ю. Л.

Оф'щШт опоненти —

доктор бюлопчних наук, професор К1б1рев В. К-доктор медичних наук, професор Колеснжов М. М.

Пров1дна установа —

КиТвський науково-дослщний ¡нститут ешдемю-логп та ¡нфекцшних захворювань ¡м. Л. В. Гро-машевського.

Захист вщбудеться « _1993 року о /о1 годип1

на засщанш спецдалгзовано! вчено! ради Д 016.65.01 в 1нст.итут1 бюор-гатчноГ хшп та нафтох1-м1'г--АН УкраГни (253660, м. Ки1в, вул. Мур-манська, 1).

3 дисертац1ею можна ознайомитись у б1блютещ 1нституту бюорга-1Пчно1 х1мИ та нафтсшмп АН УкраГни.

Автореферат розкланий __ 1993 року.

Вчений секретар спец1ал|'зованс>1 вченоТ ради

ЕДОРЯК Д. М.

Шдписано до друку 25.05.93. 1,5 друк. л. Зам. 448 Друкарня К1ВПС

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТЛШI

Зараз в УкраШ та за кордоном для вахц!кац11 д!той эаото-совують, головним -даном, АКДП вакцину, яка склаласться з дифте-р1йного 1 правцевого анатоксин1в та обробленого фор>,:2льлвг1дом кашлвчного м1кроба. Однак, ця вакцина мае ряд негативных власти-воетей, як1 призводять до викккноння таких .яеид, як алерг!зац1я, свнсяс!1л1аац1я орган1зму, ураз^ння центрально! нервовоХ елстемм та такэ !кшо, Ш nodHiil ефекти пов'язан1 з ц1лыгокл1тшшнм компонентом АКЛЛ вакцяни ~ кашлпчнкм MiKpodo«. Вкасл1док аъого кон-чэ актуальной е проблема рсэросЗки вакцини, яка не ваклиг:?.ла б негативних поб1чних явищ. Бона вирПауеться шляхом с. горения eyd-одиничнях вакцин на основ! лротективгшх б!лкових антиген!в В. pertussis 1, у перспектив!, пе~т:цннх та генно1нгекерних вакцин.

Об'ектом наших досл1дхень буз кашлкчний токсин - НАД-эалэж-на АДФ-р1бозилтрансфераза, який е головним фактором патогенност! та найсЯльш важливим протектжним б!лковим антигечом В. pertvsa'ta. Кашлючняй токсин ( KT ) - найб!гаш складкий э э!домлх на сьогодн! бактер1аяьних токсин1в 61лкобо1 . прнро.та. В!н Мстить Ш1сть сусЗодиннць п'лти р1зних тип!в, молекулярное иасов в!д 9,3 до 20,7 кДа. Субодинкця S1 ( активаторна субодиниця, А-протомер ) е власне ферментом. Субодииац1 S2, S3, дв! S4 та S5 утворвпть В-ок1гомер, який в1Епов1дае за зв'язування токсина з иемйраноо кл1тини 1 забезпечуе перетка кеабрани субодиницес 31.

Актуальн!стъ и проблема. Вивчення антигенних властявостей б!лк!в - одна з ключових проблем сучасно! иолекулярно! 1муноло-г11. Зараз в1домо, но 1иуногенн1 та антигенн! властивост! б!лк!в визначаються 1хн1ыи антигеннимя летерм!нантами ado enlтопами. Не пор1вкяно нев®лик1 за po3i.flpai.ra д1яяжш ка поверхн1 б1лка,_ як1 мохуть розп!знаватися аятиг1лами ado певниьга клонами спеииф1чних кл!тин 1мунно1 сястеыи, ко виробляють пот1м антят1ла протя данного enirony. 3 вивчеиняы антиг?нност1 б1лк!в т!сно пов'язана проблема розробки та створення молекулярних та синтетичних вакцин. Так! вакцини складаються ке з ц!лих ElpyciB, <?актер!а 1 та-ке 1 H'ii'ö, а з штучно синтезсваних ( катодами орган 1чяо1 х!ы11 або генно! 1каенер11 ) ислекул, як1 кэсуть яа codi антигенн! дотер-м1нанти 1 здатн1 викликатп угЕсрення спецкф1чних нейтрал1зувчшг антат1я до 1нвазавнвх агент!»." Головное пвревагоя сшггеткчлЕХ

ьаяиин с иоияшЛсть введения ы1н!ыально1 к1лькост1 чуг»р1дкого

ыатер1алу, со дае смогу гранично знигити алерг! заи.!» орган!эму та суггеъо зж-нантл к1льх!сгь поб!чких б$энт!в.

Кота..дзслтд::вння. Метою робота було вивченяя 1мукояог!чних та антигенных ьластивостей хашличясго токсина та дек1яькох снктвтнчиих пептид!в катал1тично! субодккзгц! 31 КТ.

Задач! досд!д;:')Ш1я. Для досягненкя мети роботи необх1дно було вир1шити тзк1 завданкя:

- розробкти спос!б одэрхания з середовиаа куяьтивувакия В. регЧиаз(з ьисокоочиаеного кашлючного токсину;

- провести теоретичннй роэрахунок потенцШшх антигенних детерм!кант ьс1х субодиниць КТ;

-сдержати синтетичн1 пептиди, но ЫдпоЫдають наЯсЯлыа вак-ливкм 1куногекш;к д!ляккам та одерхати на 1хн1й основ1 1 муно-ксн'югати;

-одерхати пол!- та моноклональн! анткт1ла до 1нтактного КТ та 1мукокон'»гат1в на основ! синтетичных пептид1в 1 вквчити 1хн1 властивост1.

- вперше вид 1 лен 1 дв! фор ми кашлсчного токсину э одного вкробничого штаму В. рсПизз1з;

- проведений :юр!вняльний анал!з антигенност1 субодиниць КТ з Еикористакням пол!клональних антит1л проти ц!лого токсину за допомогоо методу елбктро!куноблот1нгу;

- за допомогою синтетичних пептид1в досл!дхэна 1муногек-К1сгь К-к1кцево1 д1ляшск 21 КТ.

Наукова та практична значки!сть результат!!?..

Одержан! ЫКА до 1нтактного КТ, як! напряилен! проти складно! конформаи1йно1 детерм!нанти б!яка;

Проведений тесреткчкиа роэрахунок потека !йнчх адтигенких детерм!на!;т вс!х субодиниць КТ:

Ка основ! п'яти скнтетичяих пептид!в з катал!тично! субоди-ккц1 31 та б!лк1в-нос!1в одержан! иг/нскон'ы як1 ножуть бута використан1 при розробц! синтетичная пептидних вакцин проти кашлака.

Одержан! пол!- та коноклокальн! антит1ла до КТ, як! мохуть бути вихористан! при створекн! !мунод!агностнчних тест-систем.

Олернанкй ¡»-исокопродуятавниП токеикогешшЯ сероьар! ант штшлу В. р$г(пзз1'э. Вжцд васокоочтаеиого токсину а 1 л зв1лъне— кого з1д хл!?як середозина культивуьааня цього итак-/ сялгдае 2,1 -- 0,20 иг. ЦеП отгм захкаетай гвторським св1доцтьом [ АС СРСР, л IV31795 ] та могэ эгегосовуватюд для одерглш.'я кашлючного токсину - гояовчого компонента <5ез:сл1ташп;;с кашлвчних вакцин.

Геал{зац{я_результнг Гв.

Розройлечий в'.:робш«.чз!й регламент - Я$1:струкц1я по виготсз-лоннь та контролю кашлпччого токсина, сухого". На Йаэ1 1Б0НХ АН Укра1ни та НД1ВС 1м. 1.1, Млчч1ковь РАИ! впровадхений у внроб-нкцтво прояараТ ¡'Л', .тк;:Г: реал^у-ггься в Укра1к1 та за П мгканн.

Мг.тер1алч дисортац1йно1 росЗоти Оуля за-кладет та сс)говорен1 па 1 та II Всесоюких кон$ереиц1ях по <5ак-твр1альний токсинам ( Москва, 3635 р., Юрмала 1989 р. ),- VII Всесса-зкоку cKicra2ny1.1l по х1мИ 01лк1в та петкд1ь ( Талл1ня, 1937 р, ); I Всесоаансау зЧзд! 1чунолог1з ( Соч1, 1989 р. ); VII в'1зд1 УкрМкського м1хро<Э1олог1чного товаристаа С Чорн1вц1, 1332 р. >; РзспуСп1г.алсысМГ конф<?р<?ни11 "Застссування 1ФА у ме-ЯиаЕн1л, { Уар1с1в, 1089 р. ); VI М1хяаролному з'1зд1 по присно--рэякн методам I а*тома'гиз»ц11 у ШкройЮ.тогП та 1мукояог11 ( ХельоШси, 10УО р. ); VI ВоеросНйеьшдау а'1зя1 м1кроб!олог1в, еп!де«1ояог1в та пгразитологЛз ( РихпИ*. Новгород, 1091 р. ); XII Укра1кеькоиу з'!эя1 ы1кроб1олог1г, еп1к?-м1олог15 тз пар?,:<итоло-Пв < Харк1в , 1991 р. ).; иаукоэ1й кокференЩ 1, присвячен1Я 85-Л р1<шиц! Томського !!Д! вахцин та сироваток ( Тоцск"., 10Я1 р. >; на конфврешИ 1 нояоих вчеиих Ноекоаського НД1 еп1дем1олог11 та м1кро<51о;;ог11 Га{5р1Ч8Еського ( Москва, 1991 р. ).

Структура .та.обсяг. дисертац! I. Дисертац1я вихладеиа на 1Ь0 стор1нкл:'. машинописного тексту та сккадаеться 1з готупу, дво:с рсзд(л1з сгляду л1тэрагура, опясу метод!о досл!дяз!шя та дванад--цяти п1дро?д1л1в власних досл1дхэяь. Список виксристаних я1тера~ турнкх а&ерея м!стить каЯмвку»ань. У дисортацП та Лиги 1. 21 налснок та 4 додатки.

Пу0л1кацп. По тем! дисертапП олусЗя! ковано 17 росИт.

НАТЕР iAJffl ТА МЕТОЯМ .

В робот!, викориетовували сино агарозу ф!рми "КЕМОТЕХ Б!0И, Естон1я, сефарозу 4В та сефаягхе G-25 ф1рмк "Phannaoia", ШвоиДя, фету1н з телячо! бь:с5р1окалько1 сироватки ф!рк "Serv-a", ФРН та "Blo-Rad", США, nadlp реактив!в для еяектрофорсзу ф1рш "Kean&l", Угорашна. мкшач! актат1ла прота 1му:югло<5уд5н1в кролика, то бупк н1чен1 пероксидазою ;;рону та оиромтка д!агяостачяа кашлачяа аг-лвнинуюча, суха, п1дпраемства и вяробництва бакпрепарат1в НД1ЕМ 1ц. М.Ф. Гамале!, Pool я, Kisetxaii сироватковий аяьбуы1 н ( КОД ) п1дпряемства по ниробкицтэу <5актер1йн»х препаргт1в, м. Токсыс, Рос1я, кл1тяни Щелоки ХбЗ-АуЗ.6.5.3 - $1рми "Plow laboratorièc", США, ксн'вгати кролячих актимяшачих ахтит1л з иероксияаза» хрену та аф1нкоочяиел1 aimrrlna споцкф1чк1 до igG киш! "Beirrop БЮпро-духт LïD", и. Кольцове, Рос1Я, тест—система для визначення 1ао-1зот::п1в ьажхях та лэпскз: яакцюг1в актит'л <?>ipf,ffl "Calbiochera Iiarajaooheniicals", США.

Сорбент ф0к1л-сефарооа ( ФеиС ) був спитэзовакяй в 1МЕГ АН Укра1ни. Пептида, ао в1дпоь1ггить д1ляякам 1 - 17,- 4-17, 7 -17 та 163 - 187 катал 1т;гч;>;оХ су<5оди;;иц1 КТ буях синтез ов.алП твердофазовим методом в Ш АН Рос 11 I и. Москва ). У иаборато-pil синтезу iteirml» ibOHX штодами кдасичксго пептидного синтезу дуь одераалий пептид, ао в1дпоь!дае д1лянц1 31 - 17 N-;;i::uo-boï ос ласт 1 eyctoiiraaal si КТ.

Ькд1лення та очистка КГ. У культуралъяу р!дану, поаэрекльо эгЛльнену ь1д кл1тин, вносила сини агарозу а рсзрахунку 1.0 - 15 мл на i л р1данк. pli культураяьиа! р1дьна перед вкссенняи сор-dsirra знкгу&ала до ззмл'еакл 3,0. CycrreHsic синьо! агарози 1з культураяьноо pi явно» витрицуьали- при температур 1 4 — Î0 ù С протятсм 48 годин, постШю nspôuH'iya'ra. П1сля цього nepsaley4" гаки я приикялЕ i кс.тк сорбэкт поен! ста ос!дав на. дно, надссадо-ъу р1дкну ввдаляла. СорсЗент зОиралй 1 noaioiana в адаатерну ко-яогису, со м&аа дии&тр..3,2 су. Колонку прокяьали дасма об'емайи розчииу i-БР Î С » 0,25 йоьълч, рН 6,0 ) та двока осЗ'емаш Tpic-ВС1 ( С - 0,05 иолъ/л, pli 7.4 ) ( ТСП 3, ni спя чого елвввали лох <5у$ерж:и розтакой ТСБ I С = 0,03 иоль/л, pli 7,4 ), 1з вы1с-

том M^cio У кснцектраи.П 0,7ü ыоль/л. Прошвку колонки та елец In бiяковг« фракц1й проводили при швидкосг1 протоку 150 мя/тод. Пот1ы 01я:;оМ фраки!I, до äynzi еляЗован! ТСБ бугром э MgOlg У 0,7"; «о/гь/л, сб'едлугапп, розводили у два разя дистилъогаяс» водою 1 наносили на колонку з фзту1н-сефарозою ( ФэтС ). Ця колонка ( диметр 2 си ) стала сорбент з розрахукку 20 - 25 ад на 10 л початкозого об'гку хультурально1 р1лкж5 1 була зр1гдсва£ена ТС5. Шсля нанесения dimeesoro натер1аяу, шо micthb KT, колонку прошвали 1,1 -- 1,2 об'екаш таких буфорккх розчшйв: ТСБ, пот!м ТСБ з 1 моль/л Maci. П1сля цього KT олюпвали ТБС 1з мл:С12 у кон-цектрацП 4 коль/л. Нанесения матер 1алу на колоку з ФетС пропивания та еяюц1ю 61ma проводили при швидксст! протоку 60 мл/то л. Елюц1» б 1 лкових фрякц 1 й контролевали, кийрюючи оптичне погли-нання на спектрофотометр! при довгин1 хвил! 280 яи.

Роз чин KT, но йуъ отримашй п1сля елюцП з СетС зыльняля в!д хлориду «агн1ю, д1ал1эу»чя претя ФБР ( С = 0,01 моль/л, pH 7,0 ), 1з NaCl у концентрац!I 0,05 молъ/л. К!льк1сть б1лку п1сля д!ал1зу визяачалх за методов i о. Larry, 1951 ]. Шелл чого роз-чин KT л!оф!л1зувалк та збер1гали при темлератур1 4 - 10 0 С.

Електрофорэз у ПААГ упрясутност! ДСН проводили за методом U. Laorrmll, 1970 . У робот! використовували м!крометод подв!й-ноХ рад^ально! 1мунодифуз11 за 0. Ouöhterlony, 1962 .

Вкд!ддиня дзох форм KT з одного виробничого итзму Borcietcl -la pertussis. Дв1 р!зн! Форш: KT одержували в!д одного з вар!ан-т1в виробничого штаму 475. Звичайну форму Iii, ко була позначен а нам! як ш~КТ, вид1 ляли 1з середовада кулътивуваняя В. pertussis, як списано виде. .

П!сля цього б1лхи, но не сорбувалися на ФетС висадхувалн (ш4)2зо4, доеолячи його кокцектрац1ю у розч:га1 до 0,7 г/л. Б!лок екстрагували з осаду буфернкм розчинсм, яхий и1 став тр!с-НС1 у концентрацП 0,05 моль/л та NaCl у кокцентрап!I 1 ноль/л, pH 7,4. Екстракт наносили на колонку, д1аыетрсм 2 см, яка була запоЕнена фен1л-се$арозоп ( ФенС ). Лля о.ьергання друго! форыи кашлвчкфго токсину, но була позначна нага як n-КТ, на 10 я кад-осадово! р!дин:! сэредовиаа культивування В, pertussis викорас-товувалз близько 20 ил ФонС. Наяесення розчину з ехстрагованими з ссаду diяками, промиваяяя колонки та ел»ц1п б1лку проводили при швидкост! протоку ВО мл/год. Колонку проьшзали тли Sä буфер-

- в -

ним розчшюм, якиц екстрагували б!лок з осаду, I елюввали форму п--КТ роэчинск, якнй míстив Tpic у .<онцентрац1 i 0,05 коль/л та fací у коииенграцИ 0,1 коль/л, рН 10,0. Ежат. ш,о ы!стив п~П, siajuayba.'iK та ьианачали концептрац!« б!лку, як описало ehüs.

Вкдиенна окр--'?дт.ч суОодишщь КТ. Розд!лекня субодияиць КТ проводила в пластик! ПААГ з ДСН 3 ш завтовшки, ао маз я1н1йнйй град1ект пористоот! 10 - Z0%. По зак!ачен.ч1 електрофорезу б!яко~ в! емуга ь гел1 проявляли попередкьо охолодхешш резчиком хлориду кал!» ( С - 0,25 моль-'л ). Д1лянки геле, но ы1стили суболикк-ц1 КТ, вир1зали та доставали «51 лол шляхом електроелюцП.

Fosalлення субодшгач! SI Í А-щютомера ) та В-ол!гомера КТ'. с. яг КТ у 5 мл <К5? ( С - 0,01 моль/к, рН 7,0 ), ЯКЯЙ KÍCTHE ÍJaCl у концентратI 0,05 ыоль/л сечовину у конаентрацП 2,1 моль/л та А'ГФ у концентрац11 100 юсмоль/л витрикували на протяз! 15 хвилин з 2 и фегу!н-се$арози. Пот1« р1дину в1дд1яяли в!д сорбента, на цектркфуэ1. Розчин, яккй micthb субодиницв S1 КТ, д!ал!зували проти íBP ( С - 0,01 иопь/п, рН 7,0 ), !з ь*йстсм НаС1 у концен-тргш.11 0,05 коль/л п 1 с ля чого я1оф!лх>но висушували. Б-ся1гсмер егашва.та з фетуХн-сефарози г такий же cnocld, як 1 власно'КТ.

НсредОйченкя антигеньта лЫянок та структууко-^ункЩональ-. raix осрб-швостей КТ зе допомогод розрзхунковта методíb. розра-хукки проф!л1в акроф!льн.ост! та г1дроф!льност! субодиниць КТ проводили за методами, то áymi запропонован! у роботах I. Нсрр та к. ffoodr, [ 19üf, 1984 3. Кошгютернкй ана.я1з структуряо-функ-ц1ональких осо'блавостей субодиниць КТ, ао випливавть 1з 1хньо1 ам1нокислогкс! поси!довност1. виконували виксристовугчи пакет Програм PC Gene.

1мук1зац1в кролик!в та юпией эд1йсковали за загальнопряйня-тос -схемою, 1муноглобул!ни видIляли па методикою, ао описана Р. Аварийной. 1&67 . 1ыуноферштня2 акал1з проводили у неярякоыу вар1 ант1 [ А. Волер и др., 1977 )• Електро1куноблот1кг субодк-иищ. КТ проводили за методикою Н. To^bin et al., 1979.

Одерхання та характеристика кон'югаПв КТ~пептид!в 1з din— KáMH-Koclmi. Пентиди 1-17, 4-17, 7-17 та 169 - 187 кон'югували 1з к1нським сироватковим альбук!ком ( КСА ) за допомогов гвтеро-б1функц1ояальиого перехреснозишваючого реагента ш-тле!м1добен-зо!л-н~сухцин!ы1яного еф!ру ( МБС .Кон'отат синтетичного пеа-

таду 11 - 17 1з БСА одеркували за допсмсгоо глутгрового альдоп-ДУ-

Для визначення ам1:юкислотного складу кок'вгатн г1дрол1зу-вали у запаяних п)л вакумом ампулах у роз:(лк1 5,7 К 11С1 при 110— 112 0 С протягом ?Л годин, Ам1нсклслотнип склад" 61 лк1э та яон'п-гат1з визначалл на автоматичному англ 1 затор) амНюкчслот ААА-339 ' ЧСФР ). Еп1топну густину для кокнсго кон'агату роэраховува.та па. п1дстав1 сп)вв1днош«нкл вк1сту йудь-жсо! ам1нокислогч, яка е з склад! пептиду. у хои'сгат! та II вм!о ту у склад! сЯяка-ясс!я.

РЕЗУЛЬТАТ!! ТА IX СБГОВОРЭПШ

Одеряашя тэ очистка _КТ. Вал1лекия кашлвчного токсина з кадесадово! р!дякя ссрбдоазгца куяьтквукакия 13. регЧилвСэ прободали, вккористовуггж д£сстад1£ний метод очистка, но «Зазуетьсл на застосувамн! аф1као! хроматограф)I [ К. Зякига ?! а1., 19вЗ 1. 8&стосогувчи цеЯ квтод одорхаякл алаетьса досягта стур.зкя (тетки КТ у ООО - 800 раз!в.

. ОдорягяиЯ с'Ьюк 1 леиткф!кувалк як каш.точнкй токсин та од'.-ковали Я:'.1 с ."о йога очкстки, анал1эуючи за допсиогс» олоктофореаа у ПААГ-ДСИ ( Нал. 1 ). На фотограйИ олектрофорвэяого геля коича спостер!гати г'ять б'лковпх смуг у д!алзэон! в!д 9 до хДа, як! »!дяоп1дгьть сусЗодянидям 31 35 КТ. ¿'аектрофсрвтичка рух.та-в1сть еубодншщь 31, 33 тз йз зкэниуетьсл, нкщо эраяск КТ перед иакесекняи на гель <1ула в1днсвлена Й-иеркаптоотаяояоы £ Мал. 1 -5, 0, 7 ). ш,о св!дчить яро нажин! сть у цех суЗодинкиях анутрюа-

НЮЛаНЦЮГОВНЗ ДКСуЯХф1ДКИл ЭБ'жзк1».

Ферментативка та й1о;.>сг1чн! ?;кт;:ыюс'Г1 одержуваного КТ Лося1дзугаласа у НЛ1БП 1.1. Меча 1 ¡шва АМН Рсс11, 1нс?ктут! <51ооргак!чно1 xis.il I 1к. Х М. Шем.тк1;;а АН Рос!Х та ¡кслпуп х1н1чяо! та б1олсг!чко1 ф1зиг.и АН ЕстоиП.

Цатспатогечна яЫ КТ на культуру ¡шткки ягчнкка кэтайсько-го хои'ячка вняшялася у дозах в1д 03 до 73 мг/мя, лейкоаятоа-стамулюЕЧий та Г1стгм1исексий1л1зувчий еппив яри внутрииньочэ-ровнону за9деаз:1 <51 лик маавак ьяказуваяи дама 0,-- -0.7 ынг. & А5Ф-р1 йоэалтраксфераэиа акти1ш1сгь вгр1»вяяа у магах 55 - 120

' 67 кДа - "**

45 кДа - ^

25 кДа - sas» Ой «а»

12,3 кДе. - Z

12 3 4 5 6 7

Мал. 1. Електрофорез у ПААГ-ДСН зраэк1в очлщеного KT. 1 - маркерк! с51 лки: 2-4 - зразки KT без Е1яновлення; 5-7 - зразки КГ з1яяо2яви1 к-иврийптоёт&копоа. К1льк1сгь бику у кожк1й mpoíl - 20 tier.

67 кДа - в»» 45 кДа - .

кДа „«а®

12,3 кД» - CÏS! _

Д. ' «ffiSâBS» «ьзак®»»

I

te л. 2. Електрофорез у ПААГ-ДСН Л5 ох форм KT. 1 ~ rapxepül öir.r.i:; 2 -.и-КТ des 21дновленхя; 3 - п-КТ без з1двсЕлекяя; 4 - и-КТ, в1днов.тепа 2-ыэркаптоетзнолои; 5 -п-КТ, в í "новлека 2-иеркаэтсэтг2ояом.

- g -

феьсгомояь x зев"1 х te-1 [ Е. ПЬодаоа л др., 1089 Ь Отримзн! да-я1 св!дчгть, ко за ово!да властявестями одоржувл;«:й кат КТ уе поступаться аналог!чипы зразкам токсина, ао розпоьсюджувться прс»1днями ф1р?шга сз1ту ( налркхяая. "sikü:v ).

Сп!льно э 11Я!ВС 1м. 1. !. ;-'.0ч:;!ксва будо проведено гизчення р1вня продукувакня каилючних антиген1 в ( у перцу черту ~ каашюч-ного токсина 1 ф^акгяторпого гемагягтнйна ) р!зню.я штамаюл та . вариптам: шта«1з В. pertyssis. D результат! цих ;ося1дбув одержали;! б1лыд ефэктивикЯ штам - продуцент КТ.

На основ! наиого методу вня1л&иня КТ сп!ль:ю' !з НЛ1ВС lu. I.I. МочяНсова був розробленяй виробничий регламент 1 каяагодяо-кий зипуск кашлочного токсина, як препарата для dio:: Лччх/. доел! дзень .

Одержан! зразки КТ перев1ряяи за допомогов «1крс:,;этоду по-дв1йяс1 рад1ально1 1нунодя$уэ11. .Для визначэяня чкетоти препара-т!в КТ зикористовувади еярозатку д1ггнсстичну каалвчну аглстяяу-вчу, ао виробяяяася, як антясироватяа проти ц1лого м!кробу 3. pertuaais. Bel дерев!peni зраэкя КТ давали у мэтод! 1муноди$узЯ едину смугу ярец,яп!тац11.

В;зд}д81шя дпох форм КТ„з одного виробпичого 'дтзму Boróotella pertusais. 3 кадосадово! plлини середовицд культ::?,ування ви-робяичого штаку 475 В. pertussla, що була капрацьована у НЛ1ВС 1м. 1.1. Мечн1кова, наиа буяа сдержанJ дв1 форм» КТ.

Опечатку вид1ляли КТ за методом, со був описаний гите. Роз-чин, яккЯ м!стив «Ляг::;, дс не сорбуватя:ся ка фегу1н-сефарсз!, 'внеадяали сульфатом гмоч!ю. Фор:ду, ьо була вид1лена за звячайкоа процедурою, ми яезначили ш—КТ. Дал! осад к!лъха раз!в екстрагу-вали буферкик розчином 1 екстракт наносяли на колонку, со була запогнена сорбеято«"- аналогом фея1я-сефарози:

0

- га - (сн^ - ш - (сн2)5 - с ^ ^ СНг „

D результат l елюц11 з чьего сорбента \гл одержували другу форгау, яка була позкачека нами п—iCT. К1льк1сть п-КТ стаковила прибяиэио половязу в!д к1лекост1 адерганого перед тик ш-КТ.

Форш КТ в1лр1зняеться одна в1д одно! р!зною електрофорэ-тичноо рухливЮт» суоодкниа! Si при електрофорез 1 у ПААГ-ДСН, Результата аяая1зу двох форм КТ за допомогою еяектроборезу наведен! на Мал. 2. На фотограф!I гелю видно, ао si п-$орма КТ рухаеться 01 лью невольно у пор1внянн! з si и-форми КТ, причому каЯб1льш пом'.тка. ця р1зниця ка зразках КТ з нев'.дновяеними да-сульф1днпми св'язка»щ. Бри в1дновлен1 ьнутрашньоландюгового - S - S - зз'язку еяектрофоретична рухливЮтъ S1 п-КТ практично ае эиШоетъся, проте *>лэктрофоретичяа рух;гив1сть si и-КТ суттево эвикустьса 1 ыайхе вир!вшоеться з рухлквЮтю 61 п-КТ.

На п1дстав1 одерханих експериыентальких результат1в та ком-п'вгернсго аная1зу структурно-фунюиональнгх особливостей si КТ, ш припустили, so дз! р!зн1 форыи КТ в!дпов1да»тъ двом в! ючныся первиннии пося1довкостям, ао в1до:Л з л1тературп для S1 [ A. Nicosia et al.. 1966. С. boolit & J. Keith, 1986 3 . Сл1д за-, уважита, цо за обома с1квенса1.а: у склад 1 si е лише два залишка цистеХну, тобто дисуяьф1дний зв'язок мохе утворвватнея лаше к!х шши. iKOSlpHO, форма ш-КТ, в1дпо£1дае первикн1й косл1довност! [ A.Nioosia et al., 1936 ] ( Sll ), оск1лыси токсин для cboIx досл1дхеиь автори одерхували шляхон очистки на $ету1я-сс?$ароз1, а взаедау розтапуьакня субодикш» при електрофорез1 таке ж. саке, як у формл ш-КТ. Форма п-КТ, за . нашим припущэнням, в1япов1дае сИсвенсу [ С. Loch* & J. Keith, 1936 ] < S1A ). He прияуненкя з урахувзишям разультат1в комтютернорз анал1зу вторкнноГ будовк за методом Gamier, 1978, первккних посл1довкостей, ао в!дом1 для S1 КТ, дозволяе пояснити р!зжщю в електрсфоретичн! й рухли-hooti першо; субодиаяц! двох форм КТ. В субодишщ! si ш-КТ г-саг змогу утворюьатися внутривииоланцеговия дисульф1дний зв'язок, то п1дтверджуеться результатами електрофореза у ПААГ-ДСН зразк1в ia—КТ баз в1дновлення та в1днозлэинх 2-меркаптое'такояоы. У cyd-одшшШ S1 п-КТ вкутигзьолаяцюговий дис>,...ф1даий зв'язок, 1юв1рко, не утвороеться, осгЛлькн 11 електрофоретична рухли-в1сть без Ыдновлвнкл майле сп1впадае з електрофоретичков рух.та-bictd SI ш-КТ п!сля в1д;юзлання, а такох но зм!нветься при в!д-ковленн! 2-неркгптоетаколоы. Одн1ею з причин коже бути (Нгаворот

по л 1 пептидного ланцюгу поблизу с уз 200 ( 201 ), ¿кий пер<эдр!ка-еться кош'стеркос програмо» для с1квенсу БЫ, але не для с!к-Еонсу 311. Якцо поворот поя!пептидного лаяцпту у и!й д1лякц1 л1йоно в!дбувасться, - 3 - 3 - зв'язок у п-КТ мохе ке утворвва-тися ЕЕас.ч1док отерачвих перешкод. Нэ виклвчеко, ш.о розб!жлост! м!к двсьа формами КТ на вич&рпувться розсЯзкостяии у структур! активаторпо! субояиниц!, а тсркаються такох 1 В-ол1гокэра, оск1яькя ферма токсина по рЮнсму взаешдЮТь з фету1н-сефчро-зо». Нам вдавалсся розд1гаватн на колонн! э ФетС су>.<1 а двоя форм КТ. Хоча, моглпво просторопа будова 31 э незакянеиин дисульф1д-кт зв'язком перегякоджае взаеюдИ В-ол1 гокера 1з 4етС.

Дв1 фор>ш хашявадого токсина була проанал1зсваа! ¡шм за допокогою метолу електро!муноблот1нгу ( Е1Б )'з пол1хло:гальнишг аити-Лламя. Якдо ¡и-форыу КТ брали у в1дновленному стал!, пол1-кяоиаяыи АТ раагували з сооиа формами токсина одпакоао.

Одержанвя окрз?яис субодиниць КТ, Для одэржання скреиах субодиниць каангочниЯ токсин розд1яяки методом препаративного електрофорезу у б1льа товстоыу ( 3 ш ) ПААГ-ДСН. И! ела завершения етактрофор»за б!яков! смути проявляли розчино« охояоджоного К01 1 вир1зали з геля. Шматочки геля, як! ы!стили субодикиц1 КТ перекосили у склзн! трубки прибору "КевпаЗ." дяз вертикального еяе.строфореэу I проводили електрсеящ1в. П1сля цього роячшш, як! н1стйли еягюьван! субодиниц!, д1ал!зува)ш та л1о$1льио ьису-вугаяи. Одерлак! ¿разки субодиниць аиатзубалк за дспоыого» ана-Л1ТИЧК0Г0 варианту електрофорезу у ПААГ-ДСН. Результата аяая1эу 'заев!дчияи, до перша субодинпця була отрикана практично у чистому вкгляд!, друга та тратя субодияшЦ м!стять суттев! доШиаи ояка сдио!, чегверта пае кеэначнаЛ доы1мок п'ято! субодиниц1, а п'ята отрицала у сум!ш1 э четвертою субодиницеп.

Розд!язння активаториоТ субодаштц! та В-олГгог.'.ара 1СГ. Зав-дякя $ун;сц!окольин!/ ссоблигостям будовя КТ його активаторну суб-одяшшв ( 31, А-яротошр > колка пор1 гжко легко в1дд1литя ' в!д В-огЛгсира. Ulz.cs«, ко КТ стаб1льккй у раэчяках сечовшш з кон-цептрац1ею я"эта 3 моль/л ( V. Гапанга ег а1., 1302 ]. 3 робот! Б. Вигла et а1., 1987 було понизано, то нукл.эотадфосфати экс-аю пояегЕ'/ггть гиссоц1ац1п 21 в1д В-ол! говору у яруоттност! сэчоёи-пз. Прзчощ нгйб1лъЕи2 эфггст цала АТФ. В цятсьаьча робот! яял

copduil вав1лъненого в!д активаторно! субодиниц1 В-ол1гоыерг. аз-тори Ешсоркстовувади Cií-Sephaross.

te брага фету!к-ое$арозу як сорйект для В-ол1гоыера 1 1нку~ tí у?, а ли II у буферному розчян! разом з КТ. На-фосфатний оуферниЗ резчик С С = 0,01 коль/л, рй 7,0 ) и1стив Z,1 М сечовини та АТФ у концентрат i 100 «кколь/д. П!сля 15 хгшшн 1нкубац11 ttiel сус-пегэИ при к!;л-:атн1й те:шератур1 ми Е1дд!ляли розчин, який мЮ-ткв А-лротоыер е!д ФетС шляхоы иектрифугувгдкя. Шсхя emu.ll в-ол1гокэра з ФэтС ррэчкк», эд ы1стяни А-вротокар та Б-сл1грмеу п!ддавали д1ал1зу та л1оф1яьно висущуЕали. 0дерган1 аразки S1 суо'сдлшш! та В-сл1 гокеру а;;ал! зрает за доломогою електрофорезу у ПААГ-ДСП. Результата електрсфорезу глы-neni на Мал.З. На фотограф! i електрофорезного геля видно, до за допоиого» залропокова-кого s/етоду класться розд1литк А-сротоыер та В-ол) гомер.

Передбачення антигопг.зс дотер:Лнант та сттактурно^ужЩо-яальних особтавостей будовк sí КТ за докомогои розрахунковах кетод!в. 2а методами К, Норр та Т. Woods бутаi вш:онян1 розрахун-ки ярс$1л1ь а.кроф1лькост! та г!дро<*!яькост! tclx суйодикиаь КТ. На Шдсгаг! лгредбачекня кай51льш 1наэ!рнжх антлгеннлх д!ляиок нам;: для подальше! роботи з використаккям екктетичних пептид1в гула odpajis ааЯ<31лъш вав/кза та !кукогекна субодкниця КТ - 51 та, аокррма П М-х1ниэьа д!ляяк& Í див. Мал. 4 ).

Як ки вх& згадуьаяа, к!ж ам1кс.кислотнкми посл1дськостяыа 01 КТ, м бул;: ытаначен! дво!» трупам досл!дник1в !сну»ть роэб!«-кос-т! у c-KiKueBlñ д1лянц1. Ц1 posoijsaocTi пояягають у-тому, в» ка Ыдтинку klx 193 ! 198 ам1кокисястквка зашшеаыи п'ять з i::ix в!др1зкяогься, а залищех Gly у положена! 189 за с!квенсок S1A biscytkiñ гзггал!.. Таким чиноы, поел!доенiсть S1A на один aiílKO-i;;ic;:oT;'.nii зглишок коротка. Ях euomo, ( каприклад, [ Т. Katada & и. üi. i гэг j ) эд! бн! ста яератинатн глазматачку «ембрану е Фуяки!овально,веойх!дно» рисов актаваторно! субодиниц! КТ. Тик diraiae-, so с?.м& c-KlEüesa д1я.чш;а S1, виходячк з даких я^ер&ту-рн bisaosiдае за II тракслокап!с у соредану кя!тюж. Тоыу, при~ редкьо, кае ц1казяяи результата пор!»вякая передбачення ыогишво-ст! молекул за ciKfcarcaiza filí та. si А ' г.загмод1яти з кл!танй5аш р.рн обра.-сужу г.ер?ички:< структур sil та si А за мато-дои kiei-л ег al,, iss?. програка "soap" 1дектаф1кузала пол!-пеот-«, с.0 б!дпсь1лге с!квенсу sli, .^к !нтегралький С!йок 1 se-

I 2 3

Мая. 3 Електрофорез у ПААГ-ДСН А-про^омера та B-cnlroMspa KT. 1 - вразок KT. 2 - А-яротсыер ( сус5одиниия 61 ), 3 - В™ ол1гоывр.

lian. А. ГексаиэятидШ профШ акрс$1 яьност! та г1дро$1льяо-

ст» суйодин::ц1 sí KT. —- - проф1ль акро$1льност1,

---- яроф1яь г1дроф1&йосг!, 2—ï - д1яхйкй, ас оули

сОраи! для «кктбэу пептидiв.

значила поел! дон! сть зануренсго у мембрану сегмента у дозах 1SB - 203 а?Лнокж.7отшгх залитав. lieíi сегмент вкльчае я1л.тнку, яка в1др1зняеться Ыд анадог1тао! у cüceskcí si А. Пол i пептид, ко описуеться посл!довн1ст& S1A буз 1дентиф1коьанкй программ» як цери$зричний, прете не iнтегралънгЛ tílлок. При розрахунках для двсх гайнокисяотких поел 1 довкостзй Б1 за методом J. Яас & р. Argos, 1986 nporpauoD "RAOARGOS" було передбачоно для сИсвенсу S11 утверення транскембракно! петл! в мехах 184 - 203 аы!нокис-вотних залшзк1» год! як для с1квенса si А та:са коглиа1сть не була.

Визнечсння оптимально! концентрацИ антипл для вивчення антигенное?;_ КТ..катодами 1фа та 1муноблотшгу. Для антигенного авал!зу субедшшаь КТ застосогуваяк антит1пз ( АТ ) у екгляд! IgG, цс о'уга-: вид!лен! з кролячо! антисиросатхи протв КТ та акти-сарог-атку ( АС ) до токсину, яка буяа одержана у НД1ВС lis. í.í. Мечникова ( и. Москва ). Кролячу анткейроватху до КТ у ЩЦВС одзркузаял, введячи тваржгам кашвочний токсин у сум1ш1 !з бластол!зикоы [Г. Кириллова и др., 1989 j: перший раз - детокси-коьажй КТ, а падал! - катиышй С!лох.

Оптакальну концаитратя АТ в метод! i ФА вв&начаии за какешалъноз р!з1шцег; у забарвлен1 в1дпов1дййх лукок контрольного та доел!Д2ого ряд1д у адакшетах. Дяя АТ, дкихк* ш корйстуьа-леся опткыаяьна робоча концентрация стаяовияа 20 ггкг 1ыуногяобу-л1н!в в 1 мл розчику. На тйдстав! результат1в 'хитрувалкя АТ та ÍÍT була псйуяоьаЕа кал!брозочкэ. крива дяя :-;1льк1сиого визначокня токсина.

Оплшакьну концентрат» АТ та оптимально розведення АС для ьакорастання у иетод! 1иувоблот1кга ьизн&чаяа эа допомогою дот-блот1нх-у. 1!а скупки н1троцелслоз:»их меибран накосили ф!ксовану к1лък!сть токсина у ¡¡ежах sis 0,25 тг до 0,01 ыкг га тестували sz допомогсс ан?ет1л. В уиовах наших доол1д1в оптакадьна кокцея-траа!я ДТ стаяоьала 50 исг игуноглобулШв в 1 мл в!дпов'дного. розчнну, а оетммаяъне розводення АС Дйр1вксвзло 1 : 5 ООО.

Внвчзкня взаааодп 11ол!клоналъакг антит'.л 1з._. су^дижгцями КТ методом Е?Б. йзае:.'сдп> субодишшь КТ вкачали за дозскогов методу елж'рс11\укоб,*.от1нга з вякоргстанняи АТ та АС. Едектрофоргз прогодила у гъад!ёй7но«у ПАА1' з ЛСН «а прдбор! АЗГЕ-З. у льох гнгаеткЕах одь-cwacao. Ка к охну пластаяу ге.тс наносила по 12 зраз-

kie KT: теть зразк!в - без »1дновяення та и1сть зразк!в. &о перед 'нанесениям на гель дула ?.1дновлея1 2-меркантоетаяолом. В кот!?, cepil з шести зрззк1з три м1 стали по 15 «кг КТ, четвертой зразок - 1,5 кг КТ, и'ятий - 0.15 ккг КТ, шостий - 0,015 мкг КТ. 131 сля проведеняя елехгрофорезу 1 переносу розл1лених субоди-яяць на 15Ц, сщикм з дзсма зразха\гл, до miстили яо 15 мсг КТ, в1дтияали. Одну з них яас<чргл»вали ам!яо чоряим, другу впкорлс-товувяяи для 1мунолог1чного контроля. Листки я1троцелйлози 1з чотяркэ зразкзлк розд!ленная л!д час елеятрофорезу субодиняоь КТ niсля п1дсушування блокували у розчин1 БСА 1 проводили 1муяоФер-меяткий анал1з. АТ для 1муксблот1нгу брали у *кондеятрац1I 50 ккя/мя, АС - у розведенн! 1 : 5 ООО. Для 1нунояог1чг.:го кснтроп» другкй зразок з когно! серп iккубували або з АТ, ео були вид1-пен! 1з скроваткк кроМ кроликов за 7 дн1в до початку 1мун1зац11, або з ¡ктактко» кролячо» сироваткоо у в1дпог1дних рсзведеянях.

Було встановлэко, цо !з антителами реагуигь перевахно nepral три субодиняц1 КТ: si, S2 та S3. Результата реакцИ з АТ кев1д-новленах зразк'.в КТ вказуэть, ао найб1яьи íhtshcübho з аятоллами реагуе S2, дешо слаб!во S3 1 в яезначн1й Mlpl субодяяхщя S1. При в1дновяен1 ЕнутряшяьолаЕЦоговлх дясульф1дних зв'язгЛв токсину за допокогою 2-меркаптоетанслу картона 'зм!кюеться: взаемод!я S2 та S3 1з noniклокаяьнимя акт::т1ламя п1сяя в1дновлоння суттезо прядушуеться, тод! як 1нтенсивн1стъ взаемодИ si навпгг.а р1зко зростае. Пря обробц!-таких же блог!в АС у яе»1дновденях зразкаг найбхльш сильно роагувть з актит1лаю$ S2 та S3 i девд слаб Пае -31. Kpi:.! того, на НЦ з'являеться смузка, но в1дясв1дае в1дяозло--Si, яка можливо присутяя у нев1дновленях зразках в дуге назначит к1лькост1 1 тому при забарзлеян: ЯААГ я i сля еяектрофорв-зу не Еиявляеться. При в1дясвленн1 КТ характер взаемодП субодя-янць зм1ноетьея под1бно до того, ео 1 в раз1 з АТ: •1кткнсявн1сть розп1зяаваяяя 31 антит1лакя значко п1дсилюеться, а £2 та S3 сут-tseo змеяшуеться.

1мунох1м1чни£ знзл!з КТ зз - допсжогов моноклоналъних ентит!л (МКА). Пеа розд1л робота був викояаяий сп!льно 1з з1дд!~ лом шлекулярно! 1мунояог11 1БХ АН Укра1ни. 3 багатьох гибридом одержаних п1сля 1мун1ззи!1 ыхшеа анатоксином КТ стаб1яьио проду-кували МКА т!льки два клоня: 1-5с та П-5с.

.'¡уяо показано, ио МКА îksoï специф!чност1, а також 1муж>-ruodynïни з сяроваткк крои! не'.мурЛзованпх мишей з кагалочнж тскоиком вэа-с.'.одШк незначное к)рс». а МОЛ 1-5с та И~5с у непрямому EapiaHTî 1ФЛ не иали перохресннх рэакиДЛ з контрольными б! лко.чшя аитигенами : сироватковиы аяьбу,м!ном лвдкнн,. цитохромом с, та з ФГА 1з 3. рег£ияз(з. Висока спездф'чкЮтъ актат1я буяа яШ'&ерджека такох давима конкурентного 1 ыуиоферментного анач1зу: K'f ектаьно перешкодхав эв'язуваннс антит1л 1з сорбоваким ант;!-геном, тод1 як БСЛ не ьпливав на взаемод1» мояоклональних анти-tiл з КТ ( мал. 5 ).

Для ьгзначгккя еп!топно! специф!чност1 аф1ккоочищеч1 МКА були проб1отлн1льоБан1 по ам1когрупам з використанням N-OKdcyK-ш:1м1дного еф1ру ОЮтиьа. П1сля цього 1мунолог1чн1 планшета сен-сиб1я!зуеали ^онкпа з клон 1 в МКА та додавали у лунки розчия ХТ. У третьему linpi накосилися б1отнн1лк.Еан1 AT iKtioro клока. !хню ьзлемод1» !э эь'язаним кашлгчшш токсином анал1зувалн за допемо-гос кон'огату пероксидази 1з стрептзвШнои. Як негативнпй контроль ь одног.7 вкпадку н<з вносили антиген, а у другому - п1сяя эв'яаувакня токсина у лунки доцавали рбэчкк 6îothh1 льоганих ак-ткт1я того х самого клона, я:.::й ьжористоьували для секснб1л!за-luI пчаглсоту. Б1отгн1лъован1 автит!ла усп1шво Езаемод1ялц 1з tokcv-hom лпде у тому раз1, коли вони налеуалм до р1зних клон1ь. Обидва контрол! дала негативней результат. ot;îo МКА клок!в i-Sc та Х1-5с рооп1знакт!> р1зк1. еп1топи на поверхн! КТ, но дооволяг. ствсритк систему детекцП карточного токсину.

Чутл;:Е1сть аная!зу зас5?зпечуеться спор 1днен1 cru антит1я, що ¡жсорисгов/вться, до визначаекого актигэка. Аф1нн1сть МКА розра-ховуьали за тангенсом кута кахилу tg а = K,JB л\н1йно! д1лянки " в класиччих координатах Скетчарда, зпайденого за результатам! ткт-руванкя МКД ка КТ у непрямому вар1ант1 !ФА. Було визначено, -в;о для 1-ос К^ = 1,£ х 108 моль""1, а для II-5c ILB = 1.1 х 108 моль"1!'

Для зкаходхення чутлпвост1 назначения КТ викорисговували сеидв1ч-анал1з ( див. Мая. б ), у жому абрхк! та ккжя! МКА налегали до р1эних клон1в. За результатами т1трування антигена КТ ыохе наЛйко виз начатая, починавчи з концентрац11 50 иг/кл.

Концентрация антигена, наномол!

Мал. 5. а - конкурентке гальмування зв'язуваяня I~5c, ó -конкурентно гальмування зв'зування п-5е на планшет 1 1з сорйованим КТ. Як конкуруючий антигэн використовуваля КТ (1), я:с контрольной антиген,-БСА (2). Я ГЦ/ № û,7

Û,S Û,J Û,V 4J 42

û,r

0¡f ff,OSР/ЩМff Концентра^я токсина, «кг/мл

Han. 3. Вязнаяэняя КТ проводили э використанням других гНстин1льоваяих алтит1л I-5c (1) та П-5с (2). Планшет у кояноыу западку соксяЗШзузаяи МКА lsaioro-кяояа.

- 1 Ъ -

Характеристика кон'вгпт1в скнтеткчних пептад?в|д1з ,б1яками-

НОС^ЯМИд.

Кон'вгатити п'яти сиатетичиих пептид1з ( Нал. 7 ) бути одержан1, ж описано у рсзд!л$ "Матер!али та метод к". Ляг бс1х кон'югат1в <5уь зробяекий аШкокислотаий ана;т1з та за йоге результатами розраховака еп1толн& густика дня кохного кок/югату. Еп1топка густкна стаковила дял ьс!х кок'сгат1ь у середньоыу в!д 15 до 30 ыояекуя пептиду ка с-,.ку молекулу <31йку-яос1я.

Одердаяня^та. .{мунолог* онвд!з онтит!л до кон' югату_леп-•ГИД. 11-17 - БСА.

Кок'югатсм р11-1т - £СА зува/ги кролик'в та одержувалн кол1кяокаяьк1 аитиПда. Методом твердофазового 1ФА <5уяо вкзиач©-, ко, ¡¡¡.о ¡«'Пика льна концентрация антит1л, як1 реагувть 1о кои'сгг~ том пептад-тЗСА, складаяа йО"икг/кл. При робоч1й'кокцентрац!11 акте Пл 10С' ыкг/-'кл чутлкв1сть ыотоду складаяа 8 яг коя'вгату и«ттид-БСА.

Шяяхем 1муколог1чного акал1эу & вакористакням 1ФА та Е1Б ¿у по виэкачено. аатит1ла проти аього кон'югату зове!» не реагу-етъ о БОА 1 дуяе слабо роагуртъ кативким кашлвчниу токсином. Ос:с: поя1клональк! антиПла протн КТ не реагувалч такой 1з кок'вгатом р11 - 17 - БСА и1 у (¿етод1 К'А, н1 у кетод! дот-йлот1нгу, коета зройэти ьескомк, ад д1ляика 11 - 17 31 КТ пе е антигенное де-д-рш кактов.

Доел Цокания взаемодп кон' вгэт!в синтетичних пептид1В-КСА 5 а полз.'отональикми энппЧлгш до КТ. Певния 5нтерес г точке зо -ру точно! лакал!?ац11 аяткге.таего сайту у к-к1нцев!й д1яянц! сусодашиц! 31 КТ стаиовияа експгримеят» 1с коя'вгатами оштатач-ких пептид!в, яю нЛдпови&ять д1ллнкак 81 1-17, 4-17, 7 - 17, !з к1кськя« скроватковйы алъбуганом ( КСА ) ( в1ялов!дно, р1-17 - КСА, р4-17 - КСА та р7~17 - КСА ). Кр1н того, перев1ряли взае-иод1в з аиткт! лэкз-: кон'»гать попт/ла 168 - 187 1з КСА.

Авал1з кок'югаив еявгтетачлих пептидИ» 1э КСА проводили за дс.яоиогос методу твердофазного 1ФЛ у неяркому ьар!аит1. Поя!-кюналъна АС до КТ досиь акглг.но реагуьала 1з р1—17 - КСА, нан-вму; реглд!« г.вткт!я 1з р4-1? - КСА та ссоблнво >"-!« - КСА. ка-Оагато с.чаб1ив ( Мал. 8, а ). Цэ тдтвеваьуе, ао 1кукодоа1какт-вор чбглств в Х-к1аиев1й д1д5ка1 51 £ сайт 1 - 17 год! ак <Мльш

DDPPATVYKYDSRPPED-C 1 17

PATYYKYDSRPPED-C 4 17

VYRYDSRPPED-C 7 17

■DSRPPEÍ 11 17

Q Q I К А И P Л P Y T S R R S V A S - С Î69 137

Мал. 7. Пептшш, ш булу. сиктезован1 для вивчеяня антиген-soï буяоаи суоодг.нжИ 51 карточного токсина. а

ЛÍJO . '

I.S 1.2 0.1 0.*

loo ш ¡seo woo ¿коо loa Аоч is« owo' isgco

ч

Розведення. рад1в

Мал. 8. Зв'язузання пол1клональнг.: airorrin 1з коп'пгатами. а - ээ'язування АС 1з кон'югатамь синтетнчних пептид1в N-kihussoï д1лянки SI KT. 1 - як антагоя використевували KT, 2 - pl-17 - К CA, 3 - р4-17 - КСА, 4 - р7-17 - КСА, 5 - КСА. tí - 1 - KT. г - Р109-187 - КСА, 3 - КСА.

KopoTKi с 1 някки но cTKuyiTDDTb напрацввання актит1л.

Кок'сгат plö9 - 1S7 ( Мал. О, ö У таког; реагуе 1э пол 1 клопа лыкаш антит1лаиа до КТ, ад узгояхуеться 1з результатам, як1 булн одерзши \каа«и.досп1хкикама С Р. As&elöi et al. ,1938. ¡990 ].

Д\лякки KT, но були вганачеШ як антигенк! у досгЛлах з сшгтетЕчнйыа пептидами, кохуть бути викорястгк1 у пояаяьиш досл1джвикзп: при розробц! синтетичних всй^кк т^-ота кашлэка.

висновки

1. За доясмогов двоотад1йко1 очистки • з використанняк ао;1нно! хроматограф:I 1з середоашаа иуяьтивуваняя Bordetella pertussis вид!лений у високоочхаеному стан! каалпчккй токскк.

2. Вперше вид1лек1 дв! форда кашлэткого токстку з виробни-чого штаму Borästella pertussis.

3. Проведений теоретичиий анал1з антигенних детэрм!кант п'яти субодкниць карточного токсину.

4. Одержан1 пол!кяональн1 аятолла, яК1 взаемод1ють з ус1ма субодившями КТ. встало: лено, цс найбътьшоэ 1ыуногенн1ств харак-теркзуються субодияиц1 31, S2 та S3.

5. Одераая! два кяоля МКА до 1ьтактвого карточного токсину, як! напряштен! проти конформац1 йних детери1кант цього сЯлка.

8. За допомогов скнтегдчкях п<?йтид!в встановлено, цо най-б1льи активно аитат1лаыи розпЪокаеться д1ялнка 1 - 17 в Н-к1нцв~ в12 облает! Sl КТ.

7. На осков! п'ятк сиктетичних пептид!», ио в1дпов1дашъ окремим дЬтяккак sl, та б1лк!в-яос11в синтезовак! 1ыунокон'вгатн -1- розраховака 1хня еп!топка густина.

.8. Сеяб1сц1Явии шляхом одеряанкй вясокопродуктявиий токсшсо-гекннй серогар!ант штаму Bordetella pertussis.

ochobhi результат дисортзц!йно1 роботи викладея! у пубя1кац1ях:

1. Радавсияй Ю.Л., Гаврил О.Г. Экзотоксин Bordetella pertиз-э1з. // Тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции "Молокулярнпя структура сактеряилкак токсшюз я генетический контроль их оио-сштоза'Ч 1-2 октября 1У85 г., Москва. - 0. 90-91.

2. Фракционирование экзотоксина Bordstella pertussis. / К).Л. РадавсгаШ, О.Г, Гаврил. В.л. Чзчот и др. // Тезисы докладов 3. Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза", 1-2 октября 1985 г.. Москва. - 0. 91.

3. Рэдазекий Ю.Л., Гаврии О.Г. НоклшяыЯ 'токсин Bordetella pertussis. // ö сборнике ннучн. трудов под ред. Ю.В. Езепчука "Бантзряалыше тойсйля", Москва. - 1987. - С. 125 - 135.

4. Антсгзяшй анализ коклваного токсина. / О.Г. Гаврии, В.Л. Чочст, 11,11, Турова.и др. // Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума но хчгах бсдкоэ и пептидов. 19 ~ 23 октября 1987 г.. Таллин. - С. -10 -41.

Б. Антагеняий анал1а субодиккць коклюшного токсина. / О.Г. Гаврии, В. 0. Чечет, 0. А. За1к1я та Ю. Л. Радаз&съкий // Доп. АН УРСР,' Сер, Б. - 1939. - С. 61 -04.

3. Изучение двух форм коклшного токсина, выделенных из .одного штага,:а Bordetella pcrtuaniä. / О.Г. Гавриш, В.А. Чечот. A.A. Звикмн и др. // Тезиса. 2 Всесоюзная конференция "Бвктерпалыс:9 тексты27 - 30 ноября, 1989 г., Юрмала. - С. 26.

?. Характеристика высокоочкщенного токсина Bordetella pertussis с экспериментах in vivo я in vitro. / в соевг. Е.й. Шмелеве, Г..У. МерцалоБо, К.С. Захарова и др.// Тезисы. 2 Всесоюзная коиферзкция ''Бактериальные токсины". 27 - 30 ноября, 1989 г,.Крмэла. Латвия - С.15Я.

8. Клиукохи.-личесний анализ г.оклгшюго токсина и его субъединиц. / О.Г. Гаврш, Ö.A. Чечот, A.A. Заикин я др. // Тезисы секц. к стенд. СООС1Д., Первый Всесоазний шлмуноясгичосккй огезд, 15 -17 ноября 1S89 г., Сочи. - том I. - С. £07.

9. К^туноферментный еиоляз токсшообраяушеЯ активности гатаялоп Bordetella репина is а остаточной акггености бесклеточ-

шг. кокшшых препаратов. / в соавт. Г.А. Кириллова, E.H. Шмелева il.У- Мерцалова и др. // Материалы республиканской конференции "ПрШенеиле 1©А б медицине", Харьков. - 1939, - С. 84 - 85.

10. Изучение антигенной структуры кокстпного токсина. / v.T. Гаврш. В.А. Чечот, A.A. Заикии а др. // Тезисц докладов УН съезда Украинского кахраОкслогического общества, сентябрь 1989, Черновцы. - Ч. 2. - С. 135.

11. Evaluation ol' the degree of cmtosliîcation of accelidar pertussin vaooin by tho mettiod of th« ELISA. / co-aath. with M.S. ZaJüharova, S.I. Shselova, Eemova et al. /7 Sixth International Congress on Hapici Kethod mû Automation in liiorcDiology and Irasuriology. Kolsinki - Esnoo, fiiilantf, 7-10 «Time, 1990.- ?. 315.

12. разработка вакцин нового поколения: некоторые итоги и перспектива. / в соавт. Н.С. Захарова, Е.И. Шмелева» Ю.Л. Радаьс-kîis и др. п Тезисы докладов ?! Всерссжйского съоида кккроОколо-гов. эпвдемиологов и паразитологов. - Нкянкй Новгород. - Ы. -1991. - Т.Н. - С. Ш - 176. '

13. ПаТО&ЗЮЛОГЕЧйСКЗЯ к протективная активность КОКШПЙНУ. бактерия. / в соэвт. Е.И. Железа, К.У. Мерцалова, Е.Е. Сузшяоза а др. // Тезисы докладов XII Украинского республиканского съезда микробиологов. эпидемиологов и паразитологов. - Харьков.-- 1991. -Ч. I - С. 179.

14. Экзотоксин и антитоксин Bordetella pertwstst технология получения, »слушззологичэскиэ характеристикис исследование в составе захиет и диягностичзскга: препаратов. / в соавт. Е.И, Шкело-вз, Н.С. Захарова. В.Л. Рздзвсккй к др. // в сб. "Актуальный вопроси ыедкинской бяотехяслогвй". - Материалы научной коифзрвяцщ, посвяцвееоз об-лэ'пш тойсксго ним вахдак к сывороток. нпо "Вяри-он". - Томск. - 1991, - 0. 120 - 121.

15. Гл. Кирилова, О.Г. Газрил. Высокочувствительна« систе-ка и^вофэриешгного анализа для диагностики хоклша. // Катеряа-ды конференции 'мо-лолнх уоддо. Московского НШ эпидемиологии к микробиологии им. Габричевского. - PS£S. - 1991. -н 4-6, разд. in, К 1417.

16. Штата бактерий Burâexellç. pertusvls - продуцент кокжхс-кого токаэа. / в cosbï. Е.И. Шдальва, Н.У. Мзрцалова, Е.£. Оухи-кова а др. /у Авторское свидетельство СССР ы 1721795 от 15 мая

199? г.

17. Получение и анализ моксшшолышх антител к коклюшному токсину Boräst ella pertussis. / £.Г. Пхзкадзе, Э.М. Кавун, И.Н. Колэстег.юзй, О.Г. Гкприа. A.n. Вухановяч, Е.Д. Ляшко, D.JI. Радав-ский, C.B. кскиссорвико // Бкотехяологяя. - 1992. - N 6. - С. S3 - 36.

По!яукувач О.Г. Гаврки