Изучение пространственной организации цитохромоксидазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО знлмш ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ИОТЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ юл. И.В.ЛОМОНОСОВА

СшцполазнропшгиыЙ совет Д 003,41.01 На права" руяонгоп

• КОТЛОВА НАТАЛЬЯ ГЕОРТ^'Л ИЗУЧЕНИЕ ПРХТРАПС ТВЕНН02 ОРГАШШШИ

даотшксадш

Специальность 02.00,10 - Биоорганическзя химия, химия прйродаых а физиологически активных

вбщосте

Автор'в фара.г

диссертации на ооисканив ученой степени кандидата химических науя

Москва - 19Э0

p&öo'ra иь'голкеsa m кафедре химий и тйхлодогек зонжиж орга-а;:"?йяи5г соэдда.ену.к Московского ордена Трудового Красного Зявиока ийотигутА.тонкой глмотеексй технологии им. М.В.Ломоносова

НаучиыЛ р.»к^зсдкгель - кандвдат хииэтооких наук, довднт Кулига

Офйиичмьлыо отггсночты:

докгор хздхчавкях. каук, npoiieccop Мвроашхоь А,И.

Kftn.iv.г.-т л.шичвсйях наук, етарзкЛ ааучкый сотрудник Крлт H.A.

В;.1У.;;ал орг«лиз<ивга -- Мок^акулътегская щюдлвмяая яауадо-1:гп:с;;озатслю^-ая лаборатория молекулярной биологии с Зчсорг )НЕчеокоХ хггт/znt га/. А.Н.Бвлоззрского, МГУ.

Здотга счосартздич состоигся "jffi* juoßn~>cr 1991 г. а 15 часов на зимним» слецзалигароваиного совета Д 0G3.41,01 кря ККТХХ

и«. .Vi.E.JIo.voKocoaa,, II? 571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С мг;кно озяачомлгься в Огйлиетвко мИТХТ im.

'/МЗ./ммокооова.

. .М'.тор^рат разослан " " убрала ХЭ-У-^ г.

Учькнй сэкратарь спо^ад^гпрованнсго. оозйтч М.1Ш ям.

М,Б.Ломоносов» , / / А.И.Латпк

хкмвчвсктсс ./ еч_

наук, ст.н.с. ЛУ ■ . ~~

ДкЗ/адьно<^ть тто^емы. Цигэхрэиочсадаэа (пЬ&рргцитогром >г; ■кислород окпадорэцукгаэа, КФ 1.9.3.1) прб-да'эвяяйт соСо> йкыеЙ-аий формой? а дата ока^лзтэлъиого фсс$орил>:роашг/я, к.атялга:;р?-вщл& ъсестааоьлоета ¿сяслородд. Цагохрочсксхьача осстолг м нескольких оуйъэданид я содержит б с?оаи еотгазэ четира лозогетя-часквд группы: 2- гама а я 2 ы-ома меди. Яуницл? териента состоит в парздаче чазирех мзктронов, пзступздкх по лыхательноЛ изсп: чэроз вдтохром £ к кслокулэ кислорода:

4 (ци тс хром о2"1*) +• 4К*" + С. —^ 4 (цлтогром с34") - ¿И-.0

^ К,

Перенос эдэктроков сопряжан с трономамбраннш порзаосом. ротонов, формирующих меморанны4. потекшая - сснознуо дажущу» сипу Еиэргвгяческах цроцаосов в аэробных организмах.

Циго-хромоксвдаза явллзтся сложным трака»гням белхсч, У эукарлотов формент расда.г.&г&втсд во ънутрашай иа\;сс;^нг ховдрий, У прокариотов - в плазматической мэыЗрано. Б 5ав«з?&гсс-гя от песта жлвого ортшизма в эЕолшяанном процасса гатохром-> рксадаза илевт ршхчвуп степень еложяосэт. Так, у прокариотов шггохромотсоацаза постоит из 2-3 субьэдиняч. у дрока*?й - га 7-9 .вубьедизац, а формант, Евдэдэ.чний из различных тканей ьигакоии-•ганцздс, содержит 12-13 субъадяняд.

Срздн субъэдгяиц, »ходедос в сзотаа цятохрсмокоаз-я^н особый интерес представляет субъэдяггица й, синт^зяр/емая в млто-хогяркях. В этой суйьздшкзо находятся две ироймкгспсшб группы: гам з и атом кеди, а также участок, сгягтазник с ютохрочсм ¡¿. Эти факта свидмалъс*»уют о вакясм акаадв ос? в фун:да»оя.ю.-нуу активность одтохромсксвдазк б целом.

Данная работа являзтся часты» тлансдал исс-тадопавэй со госоюджэтной темо 10-865 "Синтез я веделэяи хромоаро-гвидоа, ю: фрагмолтсв, моделкруздях сястзмы фотосинтс-эд, транспорта элбк\"-. ровоэ, синтэз наптадов, пор$яфиасв и сэзданаэ на юс осноэо биологичаокм шстяаных препаратов" (А гогударствэиаой регистрации О- 1Ь7 001' 331) я проводилась Б соответствии с паутао-тгштзског программой ГОТ СССР 074.05, раздел 1Ш1 (Постачодлеиле ГКНТ СССР, АК СССР от 3.02,87 * 25/13).

Целью тааботн является изучение просгрансздэнноЁ организации второй субъединзцы ютохромоксядазн мэтодом тритиевой пла-киграфки.

Кстчная новизна тбут^. Нрздлозен способ получения индивидуальной второй субъедшит щггохромоксидазы с помощью ВНХ.

Разработана чэтодивд выделения фрагментов второй субьэди-ницы цатохромоковдазн, полученных б результате-протеояитическо-го и химического расаеплэния.

С помощью метода тркткевой пяавигр&рии определено пространственное расположение второй оубъйдяницы цитохромокоздазн в молекулярных: кристаллах.

Прах?ичрск^я сенпост^ работа.Разработанные методика очистке второй оубъодикаги и ээ гидролитических фрагментов с помощью 23Х могут найти применений при изучении других ишорашшя белков в различиях олигопептидов.

Исследование пространственного расположения второй оубъеди-нивд с пекощьь метода тритиевой ялаяяграфии подтверждает применимость данного--подхода при изучении топографии олокных биологических систем,.

СсноРНЮ вд-ТО^кряг, №И?сеук<? м зеЗДТУ:

- выделена а изучена цитохромоксвдаза из ЕгшЬтдсе& 1м$ма1|

- разработан эффективный метод вц^элакич. второй субяедане-цц цигохромоксддаэы; ■

- определена простракстаенкая структура суб»едотгаш£ Ш питохромоксядазы с помощью- трятиеаой иланиграфна*.. .

. ^рооааая работы* Результаты5 работа били доложены! «е-5 Всесоюзном симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии (?нга, 1990 г.). •

Публикации Пс теме диссертации имеются1 3 публикации.-

О^ъем и структура гчаботы. Диссертационная работа изложена« яа ¿£1 о тр. машинописного текста и состоит из вваздншг*. литературного обзора, обсуждения экспериментального матэ^иана,. экеперямэнтеяьной часта, выводов и списка литературы, который' вкллчазт -15$ источников на русском и иностранных языках.. Работа йлдлотряровйна -37 рисунками и содержит Та&кс.

3.

ОШОВБЫВ РЕЗУЛЬТАТЫ РаБОТЫ Л ИХ ОЬСУ БДЕНИЕ

Выдзязнмэ йптотроуюк-окдаэц. В настоящей рюото от?эхромох'л-даза была выделена яз сердца Оьт.а по иетодляв, разработанной з МйТХТ им. М, В.Ломоносова, с чспользоьавиом ступенчатой по люб мазании мягохондргапьнух белков ::з час тип Койдина-Хартри, ссаждв-ниаи сульфатом аумояия и последунщэй очлсатой яа октилсебарозе СЬ 4В.

Выдэлеяпыб препарата нитохрсмокскдазн из сердца бнка содержали на I м.' балка Э~П ечоль тема я, 20-30 м/.г фосфоли'твдов.

Акгй5Нозгь фермэнта, измеренная полярограТ:с,кл в врчсутот--вии твина 80, составила 100-120 моль ютохрока о/моль цитохром-оксидазк в сахунду.

Спектр поглощения препаратов цктозсрсмоксэдазы акалсгячзи пркьодбняому в лятвратурэ (рио. Т). А ,,443

о,8- л I \

Аоо Боа ¿оо ' Рио. I, Спектр поглощения евдэлеяньгх препаратов цятохрок-оясидази (в 0.6$ теине 60)? ——— окис'лавдаяс форма, - т, восстановленная ферма,

Сйектрофорзж * подиакрякяивдмон галй э 'дигсутетадд додаиад--сульфата натрия. (ДСНУ и ккиввивд гюкагад евличкэ в врч^в^аде цолдаеитацов (¡рио* 2\.

{ольшад часть данных по структуре * махааазму дайствия |ер-. центе* была,, щзлучюад учэцами с исзользовякиач питохромококгазы, вддэлвпяойг вд* свьдечв.ой мысца быка, тогда как освоение бяоспц-тртдческмг цанаав- -». из исследоваазЗ ццусхромокоидазд дромзЗ ЗЬеоНэютц^вб- сегеуЫа«*- Дрэжте 3« гс/зют Солэо еяз-

кое содорвытв. ^рвевда,. чей., сердечная, ию .быка, Однако цкто.-. хромоксвдаза лэ иягзнсат». ас гюлъоу&тсч & <5иос»си

та'тачоских и геяатачеекшс исследованиях. из*-ьа;возможнее*« каяр-

пу.тироааяия ыитоховдрааиьной и ятеркой генатипэсккыа скотомааи, оастрсй споооокссти дрожжей к росту.

Нами была иолу чека цитохромокслдаза из дрожк&й 5.сегеу1з1ае а Vатаса авделенз к охарактэризовапа одтохромоксадаза. из дроасжай Еп^отусе? шадпиаП , из которых равев фермент не выделялся.

Злокгрофорэмчосйое исследование позволило установить поли-ывцтиляый состав ялогроуоксвдаэы, полученной из двух вздев дрох-жей, и аресести сравнгтбльный апализ (рис. 2). Оба препарата ци-тохромокоидазч разделен« на-8 суОгедкниц, семь из хоторшс проявляют аналогию £ элактрофоротическсй подянжпостл. Исклпчеаяз составила 13 субьздиааца 1.см. рис. 2).

яа^людовцав моле куля г,«на массы (кДа)

Vll.Vla vii»

J

- 3R.0

16,3

23..0

15,8 4iJ мп.о

а.о 4.5

Н 61

'.v ✓

VI

vii .vua vnt

38. о

27. о 23.0

<ZA U. 7

ЪЛ

4.7 Л.Ъ

v5

п

vnf

v*

4-5.0

27.S-26.0

<8,0

40.7

* 5 в,О 7.9 5.1 >

4.7

3

4.9 4.S

Рас. 2. Электрофорез в 165-ном ПААГа в присутствие ДСН и шчзвянк; а) цихохроиоксядаза м З сегеУ151аег <5) цитохроыокои-дааа иа £. та£гш&Н; с) цитохромокеидаза из сердечной шлицы быка. Названая суСъэдайщ цитохромоксилаза даны яо Кад'энбаху.

Построение калибровочного графика на основании■электрофо-ретяческой дадвкяностя Селкоз с известной молекулярной массой позволило рассчитать наблюдаемую молзкуляряую массу полипептидоз 1У, У, У1 одг'охромокскдазы ез £• magnusii {12.9, II.8, 9. 3 кДа, соотБотсгвеняо) к 38 S.cerevisicie (15.8, II.7, 10.0 хДа).

Исследования по получению лсо.таевоЯ аиоюгтохромокдилазн

Серьезной проблемой в изучении структуры иктсхромоксряаэы язллется выяснение расположения ге»а 3 внутри сложного <?о нового комплекса. Одним из подходов к реаек.та этоЗ проблемы '/одет оыть получение ааоферкента, т.о. пятсхромоксздазы, лишенной гама а.

Im работы в эгом направлении мы вкбрали дрожки час. объ'-.кт, позволяющий быструю наработку значительного количества баомаосн. Среди птаыков □ Пущяаеко-Гатчйнсжой коллекции нами Пыли выбраны мутанты -дрояжэй Saccharomyces cerevisiae о каруязаизн функции дыхательной цгаа:

875 F/2-13 МАТ ot ade mit"

87o. P/Iô-Iô MAT oc adc ale 9,

876 P/20-22 MAT с*. ade ale <Ь.

Анализ низкотемпературных днаборенциальдых спектров. ¿?кп:г-уназаннах типов дрожгсей саилзтзлъсгву»!' о нарусовгл синтеза гама т.к. в спектрам отсутствуют я го полосы поглощения. Проведенные лолчрографичаекие исследования по определение дыхатэльяой активности каждого из трех типов дрожжей подтвердили нэзянв спектрального анализа.

Однако оказалось, что при яирадпзйник в колбах на полноценной срадо с 2% глюкозы в качества субстрата мутанте ровэртвруюг в дикий штамм S.cerevisiaç. поэтов накопить необходимый дяя вы-двленоя шгаохромоксияаза биоматериал не удалось.

Второй подход к получена» апсфврмэнта из дрожжей состоял э добавлении к питательной срода гризеофульвива. АнткОкотик грздео-фульвин. но литературным дакннм, ингибирувт у головастиков некоторых видов .лягушек феррохолатазу - фярмэкт, геэталкзируший встраивание железа в йорфаркновое кольцо (конечная стадия г ома Это свойство гризеос?ульвнна ш лслодьэовали на дроялах. Ячя этого Зылл'вкбрэчы три вида дрогжзЗ, разлгчаэдихсл по тэту обмена и по чувствительности к дефициту оттохровдоксясази.

Эксперимент показал, что уиеяьагэнм захода йиэмясск, с ни ян-'лил скорости дыхания или яереключентл на аяътеряаткзный путь на происходит. Было сделано зреяярлохерт, что грчзеофульвкн нв проникает черзз клеточные мембраны лролжввых клеток, что исключает его кнгкбдрующее действие.

Дд1 получения апопятохромэксвдазы, видзмо,- следует искать бо^еа устойчлваэ мутантныэ шта-лш и изменять условия ингибкрова-мя. ллбо потеснят* новые подходы.

Получгнл' ирзлагж'ов хшстатлов цктохромэксидаз». обработанных тоигяем

В оостаь 'аитохромоксацазк ¿а САрдаа быка входят 13 полипеп-'лиов. взр;мноа расположение кстор'ах, а таккэ конформадконаые /знэнеаья :срапт яэкнуа роЙ> в мехайййй действия форманта.

Обработка ач-:лзиров&яшйл Тратйой 'грапаратоь датохроыокзода-за в форме двумерных кристаллов, ж.юлциг. упоряцочвнную структуру, ,'.!Ож-зт дать инфоркйлш о топологии цитохромоксизазы. Кргс-таллц сосюят из молекул цито?ролоксидп?ы, имеющих статистически шш цдтоалэокатическ/ю, или :латрикскуго ориентация, до раеположйцдых упорядочэнко по о'.'лошеняю друг к другу к в з з имо цй #с гз у эдях гядро-д'ооыми частям:' кап з лшэдком бколое.

Лрелмучастрь «тода трктиевой плзлотрафга кэрея методами, ксиельзупщауа делиАясфуэдяе агента иля антггала, очэвэдны. Во-ьзрвцх, грптгй ссЗчац-эет нышояьи-эй спадафхчногтью по отношению к разливши а^номолотным остаткам Еотеэ тою, эту специфичность можно учесть ВЕ9ДЭкиэм для каждого амикоклслотиого остатка коэффиии&ита, характеризующего способность 'его прогонов замечаться ил атойш трития. Бо-вторых, благодаря малым размерил тритий оказывает нг^-меньаао йозаиущащзэ дейотвяз на структуру объактз по ир&ваоцка с другими мода^ткруюшими средс+ваМй* что повышаэт достоверность получаемой информации Метод вкачает Ь озия: обработку екгивирэвзнням трктйэл! дол&кулярнах крастааЯов пйтохром-оксйаазы, дасоцаа^а фАрмена-а-, выделзягэ меченых суб'.^диЕяц в чистоь; вице, ах чослэдунцез расщепление и получение индивидуальны;: гезтидов. ото позволяв!- установить фрагменты, имеюкиа сравнительно большую ратеоактивность и, следовательно, расположенные на поверхности молекулы фэр.мглтэ. Этот метод оправдан себя при исследовании пространственной организации ляэотама я бздтйрао-родоисЕаа - белксв, для которых '.глээтея результате рзнтгепо-. структурного анализа, а такяэ при изучении топографии влтохрои £ - ;даохрекохсяцааяого ко-лплэкса, пгюзеденкого в МИТХТ ям, М.В.Ломоносова.

Про д варите ль но препараты иитохромоксздазы осБобоядали от тритона Х-100 на колонка с амберлэтом ДД-2, уравновешенной буфером, содержащим 1,5» долата натрия. Крясталлн цнтохро^онсдцази, полученное з результате медленного удаленкя холата натрия о помощью диализа и последуощего ззморатсиваняя три -IG С, кпатчльяо промывали дистиллированной водой. Затей облучали гктгнвяроБапным 1при Т 2000 К) тритием два раза по 20 сок. Общая молатсулярняя активность препарата t^Kj -цзтохромоксидазв составила 35-40 Кд/ ммоль. Далее препарат освобождали от лабильного трития. Мэтод многократного промывания кристаллов золой л осаждения с ломодыи центрифугирования был затем заменен четырехкратной лиофилизадией ралиоактнзных препаратов, раствэрэкных в буфере, содержащем ICH. При этом радиоактивность после первой лаофилизашя уменьшилась и затем существенно но изменялась. Конечная активность 3 -цитохроиоксвдазы составила 20-25 КиДгаоль.

Препарат цитохромоксвдаэы после обработки додегалсульфатом натрия (ДСН) и £-меркапюэтанолом делили на У^ырагеле Ас А-о 4 на 7 франций (рис. 3).

Fnc. 3, Разделение меченной тритием цатохромоксидазы на Улвтрагело АсА-54 (колонка 2.6 х 90 см), урагнозеиэняом 0.05 М тр»с - H2SC4 - буфером (рК З.^). ооларжащем 3? ДСН, C.OEi чядда натрия, I мЙ ЕД'ГД. Скорость элюшга 6 кл/i. Образок пр^таорит-эдь-но инк^бдроваот 13 течение Х6 часоз пря t ¿0°С а присустпии ДСН (5 'иг/кг бнлка> it 4Х ^-^скаптоэтаяола.

' о

Субъедшичный состав &тях" фракций иссвадозалв злек^рофоретичаски б пояиакриламадком геле (ru.tr) а'присутствии ДСК (рис. 4).

цитохром-окскдаза

Ркс. 4. ЗяектрофорагичасКЕй анализ фракций, пслучэйных пра хроиатогугфлк Цйтохрошксядазы. Предварительно образдн инкубированы з 0.05И трио - КС!-буфере (рН 7.0), содержащем 455 ДСН в. 8И '»■очевшшГ в течаякя 14 ч при 20°С. Электрофорез вели в 18.5? ПЛАТ. Нумерация трэксв соответствует номерам фракций за рис. 5» ? - •адекгрофореграаша субьадшшцк П, очлщэнясй о помощью МХ*

¡Еара.1Л§льно нами была проведана авторадкография полученный «лактэафорегпамм на радиографической шшкко типа РМ-В (произвол-стао'"Саама"). На радиографической гтланке отчетливо кшуш есэ ттешэса в состаье молекулы субъедишщы* Однако наелсдаются 1,умоньа9.ЧЕЭ интенсивности полос в области I, Ш, 1У суОьединйц * »«алмчие полосы, соотвэтствуэдей полиюптиду с молекулярной массой" • выше, чам у субьедингцы I. На основании этого эксперимента иожяо сдалать слэдущте выводы, Бо-парвых, зев субъодиницн доступны актиЕ/рован.чоь^ тритше, следовательно, как. и предполагалось, молекулы з кристаллах и:/ест как матрвкснуи, так 2 цатослазмаичес-куа ориенгацшо. Во-вторых. вероятно, образуются ьысоталолакуля]*-кыэ агрегаты, видтше верхней полосой на радиографической пленке. Б-третьих, субьодкншй I, 1С, 17, по всей видимости, расположены внухрь крясгалла цятохромонс «наэы к поэтому слабее подваргайтея облучению. '

íhv4<\vim ггроетранствояного рзсдалакэния второй суб>вд;тш{ рчтохромоксндазн одом трдтиезоР °

JiSMiLCESíiSH

Среди 13 субъэдикиц цитохррмокоядазн субгединйпа ГГ занимает в йермантэ особое мзото, Учитывая наличке в субгэдингцз нескольких проотет/лэеккх групп, а такте места связывания с цлтохрсмсм 2, некоторые ученые отеодят этой субъедгаицз роль мтагялалыяо? функциональной единица фермента. Д/тя второй суб^едингшн иззестча полная аминокислотная последовательность, и предложена модель вероятного распслогсенчя части полипэпгяда ° липкдком бпслив ( ín vivo ), полученная о помощью модифтгируздих агынтон.

Для выделения и очистки субъадлнитш П здтсхрококсидача ifpa:c-цил 1-3 (.ряс. 3, 4) подвергли дальнейшему хро^атогр^^ческс^ разделения, Первоначально кы исттользозааи колонку TSK G-- 3000 SW ( LK3, Швеция). Раздолвква проводили в 0.5V тркс.НС! буфере (рК 7.2), содэргацем 0.5Ы UC1 п 2% ДСП, скорости потока 0.2 млАгаи. Недостаток этого метода состоял в необходимости последующего удаления солей и детергента из фракции, содержащее субъедянпцу П. Обэссоливание проводили на Блогелэ ?«4, ссдерна-ние ДСН контролировали спектрофотометрическкм методом, ясиольку-ездим mstiuishobüíi синий.

.С целью дальнейшего улучшения метода очистки субъедляичн 1 проводили сбращенно-фазоЕую ВSL на слэдукаж: колонкам: Aquapore ВиШ (2.1x220 мм), МПС-300 (4x500 км), FTÍS (4.6x250 ш), Beckman C-I8 (4.1x220 им). Для элшровазяя использовала IM муравьиную кислоту, апетонитрчл, игопропанол. Путам по-бора градиента удалось получить сходные профили элюции, опии из пиков в которых соответствовал индивидуальной субъесинице. Однако наилучшее разреэ:гние пиков йыло получено. на колонке UJtra.spbere XI. C-I8 (4.6x75 мм;, бесктап) (рис, 5), Гомогенность полипоптч» да. ¡1 провэрллк с помощью эл»хтр0'Тюр<?за (рие. 4).

На рис. 5 пи 2 соответствует, субъедиинцэ а, геях 3 - оуогеаи-нипе I (согласно данным электрофореза). Пик 4 сод-эретт высоко-;.юл?.кулярнь,'о млцеллы ДСН, частично содзржзщяе белок.

Из 40 мг мэленогс препарата цитохроиокс/щазк удалось Бьца-лить 3 мг субъзтаияш Л с р^яоакти'вностлв 1.5-2.0 Кл/>гаслъ , ?то

ъ

o, ло -

г

о,os.

U_J

SO МИц

Рис. Ь. KOL фракций, содержащих субъедиякш I п П. Коленка BecKman UJtrutpSereДС--18 (4.6x75; Змкм).Скорость потока I г.я/гиик. Еуфор А: I мМ фосфат (pH .3.0); буфер Б: смась ааото-нлтр-ила и муравьиной кис.,юта (1:1 v/v ), содержащая 5$ хлористого мвпыэаа; градлонг 0-6 мин IOC'?, ójáepa А, 6-00 мин 100? будара Б,

позволило продолжить исследования по определении уровня радиоактивности участков полипептидной иепи субъедшшш Л.

Субъгдкишу П подвергли расщэплвнкп трипсином при соотноие-нии фермент-белок 1:50 и 37°С в течение 4 час в 0.1^-ном гидро-кзрбокатыом буфере (рК 6.0), содлркаявм 0.1$ ДСК, Описанное в литература добавление окгилглюкозида на приводило к улучшение расцепления я поэтому в дальнейшем не использовалось. Химическое р&сщ&члзние субъэдиницы П бромциаяом проводили яа стеклянном фяльтро в газовой фазе 70£-нсй ТФУ в течение 25 часов при соотношении бэлок-ре&гент 1:1500 (при 100-кратном избытке бром-циана на каждый остаток метиокина).

Фрагменты выделяли методом ВХХ на колонке Aquapore Phenyl {'¿,1x220 км; 300 X; 7 ¡.дал).

Путем подбора ггедвиякой фазы удалось выделять 9 групгкчэс-кях $p£jvзнтов (рис. 6).

Сложной проблемой сказалось отнесение сыаэленных пептидов к определении/у участку полипептланий цепи сусъздикичы П. Невозможность исаользования для. каждого фрагмента ебквенлропания

OMtf

ото.

U

n n

и . и

п

и

3 к"

» 11

и » M . II

и

I! II II I! II li I!

II "

/0

¿0

J0

50

U,0iQ

Рис. 6. .ВдХ пептидов, полученных в результате расцепления трипсином субъедишчцы IT цитохромоксидазк, на колонке Муазраге Phenyl (2.1х2?.0 мм; 300 А, 7 икм). Подвитая фазе..: 10-мМ три' эткламмоний-фосфатныЛ буфер (рН 2.1) , содержаний О,I М l/CIO^, в градиента 0-6CW ацатонитршм за 60 .мин. Скорость потока I мл/мич.

атл

О РОС

12

и

. г. «

____Л-»--4—

£О

20

50

Л

яг

и

|А1ии I н п

а *

л ч II II II

.л-Л......Л--..,

. 11 11 11 I)

I *

I !

I | I ■

---С-

4

I

II

К ¡1

480

\aois

(0

50

во

ТО мин

1оша

Рис. 7. ВЖХ пептидов; получении* б результате расцепления брсмцчаноы еубтодиницы П цитохромоксцдаза, на коленке Ауиараее РЬепуб ( 2,1x220 ми; 300 А, 7 «км). Подвижная фаза: 1С ыМ триэ^илгаоточлй-Фосфатный буфер ,(ра 2.1), содержащий 0.1 М

Ьс С1С з градиенте 0-60* адетонитрила за 80 мин. Скорость потока I мк/миы.

ввиду его трудоемкости заставило пас использовать другие псдходы.

В связи о этим мы рас г читал;: теоретические коэффгщкеятн зкстинкции ггри 280 и 214 км для пептидов, возмяных при трпИСиьо-лизе субъединивд П, используя коэффициенты экстяакции от дальних аминокислот при этих длинах волк (табл. I). Таким образом, 6Ш определен фрагмент 2 (табл. I), имеющий наибольшее эначенйв равной 17900 и, следовательно, наибольшую высоту на хрематограм-ио (рпс. 6). Второй по высоте пик на хрематограчмз Очк определен как фрагмент I, яуекщий g 280 9600. Спорным явилось выярлолиэ пиков 5 и 9, равных по высоте, а тага» никои 3, 4, 5, отсутствующих на хрок«атограшо, полученной при 280 нм, и п.''э?>'пгх равную высоту на- хроматографе с 214 ш.

Для решения этих спорных вопросов нами был пркмэнби другой прием. Провоцекио анализа смеси шпткднах стандартов на колонке Aqua pore Phenyl, поззолило скорректировать результаты разделения итсролиз&тов с результатам» чсслздоьаний №жа (Моек, 1980), определявшего на колонка 'Bio Rad ьромя выхода пептидов з зависимости от их аминокислотного состава, и рассчитать теореъпэское время икхеда фрагментов для колонки Aquapore Phenyl (тнДл. I). Было замочено, однако, что это праьяло справедливо для тптидоэ но ¿голеэ 30 амийскяслот,

1 а б л и д а I

Характеристика пецТгдээ, полученных в пезультате трююшолиза суоъеДий/цй ТГ питихромоксидази ж выделенных с иомощ:«з HCL

iMirit-m , ■ -f-.-,-" ' "■" ""•-—Т

■Место пеп-|Колич&- ¡ТеоретичвскнЙ ШэЛфяамйТ ! эестйпйй

Ш ¡»гида'л no-!cfto ______

л/пг}слэдов&- ,'амино- { т *

! (м-1 х иГ1}

ter-и-

шхот

(»eswj

ксуоьодянг-,]ны' ¡ных ;— , остатков j,. 260 Kit* i» * 2 l4£i ьм - ,,-tfmi rm-i.f.

I •1-98 9600* • 142400 ж.л1 70; ой

2 99-134 >114600' 7'Ш 7Ш-

3 1S5-I4I ■7 . "0 5Ж

4 I42-151 ТО 'С 6390 Ч5Л МЗ.Ув

5 152-171 20 "5700 39SÜD i60.97

6 172-178 7 0 Я260

7 179-217 39 . 2SOO 53S0O 32J8 75.27

8 218-221 4 1300 8.43

о 222-227 6 5700 Й75Ш ге.о 26.ДЗ

Сходимость значений теоретических КГ фрагментов 3, 4, 5» 6, 8, 9 со значениями КГ полученных пиков (табл. I) подтвердила пре- ' жкке 1градаоложеьу,я к позволила идентифицировать неизвестные фрагменты, Выборочное саккопирование фрагментов 2, 7, 8 и 9 доказало правоту ьаших предположений.'

Следует учитывать, что связи К( 49)-1.(50), Ж82)-1(83), К(1^)-Р(130), К( 1У8)-?(103) не подвергаются расцеплению трилсг-нсм (см. ркс. 7). Эти результаты совпадают о другими работами, в которых выделяли фрагыеиты трипсияолиза субьедингш П,

4

« |30

р м О О »• 11 0 А * 5 Р I М Е £ 1- 1. н Г И 0 Н 14 И 1

4 л ¿о

I 3 О с' ч ь V I 1 в 1- м и т Т • ,1- Т н т 5 Т М 0 А О Е

* 4 «>

I м т X 1. р А I I 1_ т и т А и р Б V ИНОЕ!

1 120

8 с. т v/ V Г1 13 И с и м В У В V Е т 0 У £ с ь б р в &

4 * 150 НЕ М*Т 1 >ео

р г Е 1. к р с 1. У 1. Ц у в М V V 1— р

V в Б Е и v ь н В « А V р 5 и в L к г в А I р а к 1 Т 210 р мтр i V

1

(. м 1> В 1 ' 1 в L У V э а с С £ 1 с с 5 N Н 3

4227

V р 1- К^У Р Е е А В И и

у

к.п и t

Рис. 7. Аминокислотная последовательность субьедиипзд П штохромокскдааы: 4 - места фактического расцепления псд действием трипсина; * - места теоретического расщепления под действием трипсина; | - места бромциакового расщепления.

Оба описанных выше приема бшш использованы при идентификации 13-ти фрагментов, аолучепкых в результате химического расцепления суйъвдикшы П брошшансм. Данные- о теоретических-я & 224 отдельных фрагментов и, соответственно,, их теоретических КГ, рассчитанных доя. хроматографического разделения рагкен-тов в такой же г.сдвтпсЖ фазе, г?р::ведени в табл. 2.- Аналитическое определение 4-5 шагов &\скокислотноЙ нсгледовате,пьности фрагментов 3, 7, 2, 8, 13 подтвердило теоретические предположения.

Пссле кдвнтиа »:-:аиг.ч Зрагконтов раслэплешш ш переаут к определении кх радиобкивност/. йэ.'/.ерен.!е рэ.циоактивнбста .-проведал'/. с поколыв проточного радиоппотопного дотекчсра ЬосКгоап 171 (й!!А); Б табл. .3 I, -1 ари»е;;бкц а:шчзк::я фргп/еатов зэ начетом уровня радиационного фона. .

Т а 6 л и a a 2

Характеристика Пэптйдое, полученных е результате расщепления броодгаакой оубъэдинжы P глтсхрсуакслдаза п выделении! с помощью S¿Lt

Mo с то шп-^Количест-Т^ёЬрэтический коэффициент

7Г~

й j тид.» в по-i во ая1Чо~1 •следова- ¡кислотных^ п/а;тельности .....~

зксти&кшпг

(М-

Врэит экходн яэптаг;а (мин)

\ еубъедйнк-; ! ! 1 «80 ш ; i'Ii RM ......— ■ j теор. : фЭКГ

з: 2-5 4 1300 J0I00 17 Г? Г.\

2 fi-I7 12 0 Ш СО 40.1 42.53

3 18-29 12 0 18700 40.7 40.

4 30-45. Ï& 1300 23500 83.0 r-t tt aJL

5 46-56 II 0 ОООЭ 27.7 27.3?

G 57-85 30 7000 53000 103. t 76, ¿5

7 88-100 13 0 9300 16/' 15. ïM

8 ï01-122 22 I7S00 II0400 62.S 60,1o

9 I23-I4Ô 24 G Ï6300 54. с 52. ÍS

10 149-152 4 0 2300 J.I.3 11.52

II I53-I8& 33 570О 498С0 6Й.7 Св, 31

12 186-207 22 2500 34600 ьз.з 32.11

13 208-226 18 7000 48900 Go.7 G5.I7

Т а 6 л у ц а, 3

Абсолютная и относительная радиоактивность понтлдоз, полученных в результате то:шспнсвого расщег£ле?.ия субъеп.яниш П

цктохремохеддо.'зн

Номер! фрагмента} Участок з субъедишзд ' Молекулярная j масса (Да) f 1 Радиоактивность Габ со пятная" 'относи тёльн яя v лчып/кгн) !(ИМП/глен^«ожь)

I 1-Э8 ' III37 G7987 G.0S

2 99-134 4440 72108 Ii).24

з I35-Í4I 85Е Ï442T Ï6.81

4 142-151 ÍI83 20602 17.34

5 ■ 152-171. 2168 ÏB542 3.50

6. '172-178 729 Ï4422 19. ?й

7 17Э-217 4122 47385 П. 50

8 218-221 586 S240 1.4.06

9 222-227 693 . 13361 17. SI

>

¿c.

Абсолютная лэлучэннах б рэ

Таблица 4

л относительная радиоактивность пептидов, зулътате химического сасщэплбши бро.^цианом оубъединкш 11 илтохромоксидазк

г hOM-jpi г, oar--; ;.-.бнта) Участок в субъединице г..........—......... | Í Молекулярная i ! масса (Да) j i i i 1 "1 ■ j Радиоактивность [абсолютная ¡относительная !(ИМЯ/МИН) ! (ИМП/МЖИКМОЛТЛ

i. 481 8240 17.13

2 (J-.I7 1307 24722 18.91

3 I3-2S 1522 I030I• 6.77

<1 .'íO-4 5 1822 - -

'iZ-Ъ'б 1234 4120 7.34

й о 7 -со 3400 18542 5.45

7 85-.ICC 1462 - -

о 10 [-122 2886 . 45325 15.71

9 123-146 2719 4Э445 18.18 .

ii,' II

I4S-I52 153-185 I50-20V '¿08-225

520 , 3550 2218 2251

15210 47385 13542 ЗОЭОЗ

15.79 13.35 8.35 13.73

С поу.оаьв полученных данных рацлоакгизкости фрагментов я ;)^с::Чйтаниь;х величин относительной радиоактивности были построена гг.й-'огр;уол радиоактивности отдельных участков полипептидной цели,• получуtiiitíx в результате прогеолигачэского и хкмечэского раадеоле- -mi (рис. 9). Ma основании двух гистограмм была построена совмещенная гисгограмма (рис. 9), дающая представление о доступности стда^Нс;:-: участков полипептида атомам трятяя и, соответственно, об их поверхностном расположения в молекулярных кристаллах. Анализ согмешзнной гистограммы показал, что наиболее доступными для Оомбаодирозки атомов трития являвтся. 4 участка полкпоптида П: с I ло 17. с 101 по 152, с 172 по 135, с 208 по 227 аминокислоту.

Снижение радиоактивности на участках: I) 26-54, Л) 88-.Т00, Ш) 1Ь2-1.73, 1У) 179-207 моют свидетельствовать об экранировании яолипалтхдной цепи при обработке тритием кристаллов цитохрсэдкси-дазы.

Расположение первых двух участков согласуется с предыдущими структурными работами по определении пространственно;! организации

оорядтсознв номера аминокислот суоьадикицн П

Рас, Й. Глдтогроиш ратаоактизностй фрагментов, получению: после трипсзасвого растоплена (а},и после бромцЕаномго расцэпяенпя (б) субъедашлда С; совхощснная гистограмма (в).

ь-

-О •

суОъединаци EL С Bisson R., 1982).

О наличии еще двух экраЕирэвайн;« участков ранее не сообца-лось. Однако, обработка с помощь» 5ВД даредх аминокислотной поел ь до в aï эль кос ï к субгедкиицы с дспольаовькты программы (Саг.т.ецад R. 5., /985), показывающей: I) гэдрофоййца, Я) подв^даые, Ш) доступные поверхности участки коляяэптадеоК цепи, а такие 1У) возможные оС -счяраакзозанные, £ -сдлздчадад и цаупорйдоченщне явеньл аминокислотной последовательности, указываю? на щадвчиа пяти, мыюдосгудиах участков: ï> 25-3,2:, 59-74, 3) ДбЭ-ДЩ, 4) 19Ï-2M, 5,) 207-213,. .

Кроме ior., участч® суб>едкздвд 3 в связададщ о простатическими грушима,. в. частот«, с адомаад мед«, 'Дчгаадщи, которые является 3 Ï6I, С 1&6, H 204, С 200, дрвдщдагает наличие определенно? вространстззакоЕ уклался полицептида.

Вероятно^ С-коддавоЯ остаток патеоеитада П ддяноа в 12? аминокислот сохраня&т св,ос оярздзданаим образом свернутую структуру в крясталлах додобро той, которая существует в натщщом белде.

Таким образом, лередадн радиоактивности в "хвостовой* части подвшитвда, начиная с Э.б-ой аминокислоты, моано использовать для построения модели пространственного'расположения полипадти-де. 2 1рко. 10).

Рнс. 10. Гипотетическая модель npoçтраяотвакцого расположения суоьедикжщ П цктохроиоксидазы в «авдадач бедке; С/, -атом меди, i---i - et -спдрадаэднАкаке ад«»

В прелюлагасадой модели нолипептид С дьаадн пронизывает липиданП Стелой, образуя на участках 22-52 г 65-95 Л--спираль . С-коншвой "хвост" гголнпаптвда (с 06-ой аминокислоты) теот свернутую в клубок структуру. При этой участки вблизи алигчскаслот 161, 197, 200, 204, являющиеся литаидама атома меди, оказывается внутри "клубка", а сама простетическая группа сильно экранирована.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделена пятсхромоксидага из дрояжэй £пс(о/пусж тидгтИ.

2. Разработана методика виделонкя суйьвдяяиаы и вдтохрои-оксэдазы, содержащая радиоактивную мотку.

3. Разработана методика подучекмя 13Ь']-фрахмэ-дтоа трднтэтас-кого и брсмцяановогс гидролиза субъбдин;пщ Л цигохроиоксидазы.

4. Нзупэна степень включения трития в разлкчныэ участка субъединкцн П цитохрсмоксвдааы,

5. Ка основании данных радиоакжнозти фрагментов расщепления и компызтерной обработки аминокислотной последоватэльности субъединицы Я лострозна модель пространственного расположения

в молекуле цигохромоковдиэы,

Основныо результаты работы изложены в следующих

публикациях; •

1. йоетоэа Н.Г., Давлена Д.В. Вякянив гризвофулъвива иа дрожввву» цитохроыохсвдаэу. // Материалы пятой конференции иало-дшг ученых? № <шециа*ие*св Московского института конкой химической- техиоловии;.- 16.,. 1986.- С. Ю-П.'--Дец. в (ВИИТЭХШ 5.10,87, Р 1243' хп-87,

2. Котлов» Кулию Миронов А.Ф.Веделенга мэчекнбм тритием субгединица П1 цктоэфомоксичазы,// Вюору» химия,- 1968, ~ Т. 14, Вып. К.--С. 1695-1697»

3. Котлоаа Н. Г., Кулиш ¡¡.к., Рубцов К,СГ- Использование ВНХ для очистки субкуцяищ II цитохроиоксидааи^// Таскск докладов пятого Всесоюзного симпозиума по иолекулярноА хкдвосткой хроматографии.- Рига, 1990.,- С. 137,