Изучение субстратной специфичности фосфодиэстеразы из клеток асцитной карциномы Кребс II, катализирующей гидролиз ковалентной связи между белком ВПг и РНК пикорнавирусов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНО]

РГЙ ОД

Химический факультет _ ^

На правах рукописи

ГУЛЕВИЧ Андрей Юрьевич

ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ИЗ КЛЕТОК АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМЫ КРЕБС II, КАТАЛИЗИРУЮЩЕЙ ГИДРОЛИЗ КОВАЛЕНТНОЙ СВЯЗИ МЕЖДУ БЕЛКОМ ВПг И РНК ПИКОРНАВИРУСОВ.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук Дрыгин Ю.Ф.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Доброе Е.Н.,

кандидат химических наук Кубарева Е.А.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 19 декабря 2000 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899. Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан \Ц-ноября 2000 г. Ученый секретарь

/7

диссертационного совета,

кандидат химических наук {'.с!^ И.Г. Смирнова

г

С

I

ЕоЩЗЧ* 9/, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирионная и реплицирующаяся РНК пикорнавирусов ковалентно связана с небольшим вирусным белком ВПг (вирусный «протеин», связанный с геномом). Однако, пикорнавирусная РНК, выделенная из полисом, свободна от белка ВПг. Фермент, гидролизующий связь между белком ВПг и пикорнавирусной РНК , был обнаружен в клетках НеЬа, а затем и в других эукариотических клетках. При этом активность фермента, названного 'расщепляющим', была обнаружена как в инфицированных, так и неинфицированных клетках.

Фермент катализирует гидролиз фосфодиэфирной межполимерной связи, образованной остатком тирозина белка ВПг и остатком 5'-концевой уридиловой кислоты вирусной РНК. Считается, что фермент проявляет уникальную специфичность именно к межполимерной фосфодиэфирной связи.

Было установлено, что целостность ВПг в комплексе ВПг-РНК не является существенной для катализа, в то время как протяженная олиго- или полирибонуклеотидная часть является необходимой.

Клеточные мишени этой необычной фосфодиэстеразы неизвестны. Так же неизвестна роль фермента в клетке и в пикорнавирусной инфекции. Вместе с тем, логично предположить, что эндогенные субстраты фермента должны быть структурно подобны ковалентным комплексам вирусного происхождения. Таким образом, исследование субстратной специфичности фермента - задача, решение которой необходимо для поиска клеточных субстратов и понимания его роли в пикорнавирусной инфекции.

Цель работы. Целью данной работы были - получение и характеристика высокоэффективного субстрата и высокоочищенного препарата 'расщепляющего' фермента из клеток асцитной карциномы мышей Кребс II, изучение субстратных свойств комплексов, производных соединения ВПг-РНК вируса энцефаломиокардита (ВЭМК), а именно, определение минимального размера нуклеиновой части субстрата.

Научная новизна и практическая значимость, В результате исследования установлена способность 'расщепляющего' фермента из клеток асцитной карциномы Кребс II катализировать гидролиз ковалентной связи между пептидами, производными

белка ВПг вируса энцефаломиокардита, и короткими олигонуклеотидами, производными вирусной РНК.

Минимальным фрагментом нуклеиновой части комплексов, сохраняющим их субстратные свойства, является 5',3'-уридиндифосфат. Увеличение нуклеиновой части комплекса до размера олигонуклеотида ведет к резкому росту эффективности ферментативной реакции. Комплексы пептидов и 5'-концевого тринуклеотида вирусной РНК расщепляются ферментом с той же эффективностью, что и комплексы, содержащие полноразмерную РНК. В то же время комплекс тринуклеотида и белка ВПг ферментом не расщепляется. На основании этого сделан вывод, что ВПг блокирует нуклеиновую часть комплекса, препятствуя связыванию фермента с субстратом.

Показано, что фермент специфически гидролизует исключительно «узловую» фосфодиэфирную связь в комплексах пептидов и тринуклеотида, образованную остатком тирозина и 5'-концевой уридиловой кислотой.

Выполненное исследование дает основание предположить, что хорошим синтетическим субстратом, способным заменить сложный природный субстрат, будет фосфодиэфир тирозина и pUpUpG. Оценивая полученные результаты, можно, во-первых, сделать предположение о новых клеточных мишенях "расщепляющего" фермента. Возможно, это необычные клеточные соединения пептидов и нуклеотидов или же пептидов и олиго(поли)нуклеотидов.

Во-вторых, можно предположить, что 'расщепляющий' фермент принимает участие в инициации деградации пикорнавирусной РНК.

Публикации и апробация работы. Материалы работы были представлены на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), 10 международном форуме "Xth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, EUROPIC'98" (Йена, Германия, 1998), Школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Москва, 2000).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на Дб страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитированной литературы. Материал иллюстрирован 24рисунками и таблицами. Библиографический указатель включает (Ч<?цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение вирусных субстратов 'расщепляющего' фермента с высокой удельной радиоактивностью.

В качестве субстратов 'расщепляющего' фермента в данной работе использовались производные ковалентного комплекса ВПг-РНК вируса энцефаломиокардита мышей, относящегося к семейству пикорнавирусов.

Поскольку известно, что протеолитическая обработка комплекса не изменяет его с> бс 1 ратных свойств, соединение ВПг-РНК в жестких условиях обрабатывали лротенназой К, получая комплексы К-пептидов, производных ВПг, и вирусной РНК (Кп-РНК). Использование в качестве субстратов таких соединений позволяет обойти проблему, связанную с влиянием на результаты определения активности 'расщепляющего' фермента клеточных протеаз, соочищающихся с целевым ферментом на ранних стадиях выделения.

Использовавшиеся ранее субстраты 'расщепляющего' фермента, меченные тритием ¡р. у;уп. имели удельную радиоактивность порядка 1000 импульсов з мин. на мкг РНК. Меченные же т \-itro реагентом Болтона-Хантора - порядка 10000 импульсов мни. на мкг РНК. В данной работе была использована разработанная нами модификация процедуры Болтона и Хантора лля селективного введения радиоактивного иода в пептидную часть комплекса. Реакцию проводили в две стадии. Па первом этапе соединение Кп-РНК ацилировалн по аминогруппам пептида гидроксисукпннимидным эфиром гидроксифенилпропионовой кислоты. На этой стадии можно было использовать 10-кратный избыток дешевого холодного реагента длл более полного ацилнрования аминогрупп К-пептида. Затем полученные соединения иодировали Ка':51 в присутствии хлорамина Т. Оптимизация процедуры введения метки позволила получить производные с удельной радиоактивностью порядка 800000 импульсов з мин. на мкг РНК. Таким образом удалось значительно ¡более, чем в 50 раз) повысить чувствительность метода анализа активности 'расщепляющего' фермента.

Для характеристики полученных субстратов и анализа активности расщепляющего' фермента использовали разработанный в лаборзтории высокоэффективный метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на кизельгеле в системе бутанол-вода-уксусная кислота. Ранее было показано, что в данной системе

происходит хорошее разделение свооодных пептидов и пептидов связанных с моно-. ди- и олигофосфатами.

_ Малый К-пептид

J Свободные К-пептиды

- Кп-р - KrrpU_

Kn-pUp

старт

1 2 3 4 5 6

Рис. 1 Специфичность мечения и субстратные свойства меченого комплекса Кп-РНК вируса энцефаломиокардита. (ТСХна кизелъгелс)

Обработка Кп-РНК: 1 - контроль, инкубация в воде; 2 - нуклеазой Р1: 3 -нуклеазой Р1 н последовательно ФДЭ I; 4 -препаратом 1 расщепляющего' фермента; 5 - последовательно нуклеазой Р1, ФДЭ 1 н протеиназой К; б - контроль, обработка протеиназой К

Рис. 1 демонстрирует специфичность мечения и субстратные свойства комплекса [':51]Кп-РНК. Действие 'расщепляющего' фермента может быть промоделировано последовательным или совокупным действием на субстрат нуклеазы Р1 и фосфоднэстеразы змеиного яда (ФДЭ I). Гидролиз комплекса Кп-РНК нуклеазой Р1 приводит к образованию соединения Кп-р11 (дорожка 2), гидролиз же соединения Кп-рЬ7 ФДЭ I приводит к образованию свободных К-пептидов (дорожка 3).

Гетерогенность свободных К-пептидов объясняется тем, что протяженная РНК. связанная с ВПг, протестирует белок от полного прогеолиза даже при очень жестких условиях обработки.

При этом, обработка продуктов, полученных совокупным гидролизом комплекса Кп-РНК нуклеазой Р1 и ФДЭ I (дорожка 3), протеиназой К приводит к изменению их подвижности (дорожка 5). что свидетельствует о пептидной природе материма. Таким образом, изотоп содержит именно пептидная, но не нуклеиновая часть комплекса.

Пептиды, полученные нуклеазным гидролизом ковалентного комплекса Кп-РНК (дорожка 3), и пептиды, полученные обработкой его 'расщепляющим' ферментом (дорожка 4), имели идентичную хроматофафическую подвижность. Таким образом, полученные субстраты и метод анализа отвечают требованиям, необходимым для обнаружения активности 'расщепляющего' фермента

Выделение п характеристика препарата 'расщепляющего' фермента из клеток .1сшшю1'| кариипомы Кребс II.

Одной из задач работы было получение и характеристика высокоочишениого препарата 'расщепляющего" фермента. Фермент выделяли из клеток асцитной карциномы Кребс II.

Ранее использовавшиеся методы очистки 'расщепляющего' фермента были недостаточно эффективны. Например, применение схемы очистки, разработанной для ферчета из клеток НеЬа, при выделении фермента из клеток Кребс II приводило к получению гетерогенного препарата.

В данной работе для выделения 'расщепляющего' фермента из клеток мышиной асшгшой карциномы Кребс II была использована недавно разработанная в лаборатории новая, более эффективная схема очистки. Эта схема включала фракционирование клеточного экстракта сульфатом аммония, рН-фракционирование, катионообменную хроматографию г I а карбоксиметил-целлюлозе, хроматофокусирование и дысокоэффективную жидкостную хроматографию белков по размеру.

На стадии хроматофокусирования происходило разделение двух форм расщепляющего' фермента с изоэлектрическими точками в районе 4,5 и 5.

При этом, как было показано ранее, обе формы обладают ферментативной активностью и имеют подобные биохимические свойства. Точные причины появления этих форм пока неизвестны. Полученный по данной схеме конечный препарат 'рас-:и£п.',яи>щего' фермента обогащен поллпептидами с мол. массой около 30 кДа (Рис. 2).

12 3 Рис. 2 Электрофоретический анализ

66 кЭа — - препарата 'расщепляющего' фермента в

45кОа- 12% БОБ-ПАЛИ.

24 кОа 1 - смесь маркеров; 2 - 'расщепляющий'

5 КО" »- ; ' *•':"'фермент. 4 мкг препарата;

3 - 'расщепляющий' фермент, 8 мкг препарата.

Стадия хроматофокусирования позволяет в значительной степени очистить ррепапат фермента о г примесей неспецифически.х нуклеаз, гидролизующих комплекс Юг-РНК до К-пепгид-мононуклеотидов (сравнить Рис.3 и Рис. 1, дорожка 2).

16 18 20 22 24 26 23 30 32

Рис. 3 Анализ активности 'расщепляющего фермента во фракциях после хроматофокусирования. (ТСХ на кизельгелс) Подчеркнуты фракции, содержащие фермент.

Однако, с помощью высокомечешюго с\бстрата наряд) с исследуемой активностью в препарате 'расщепляющего' фермента была выявлена нешлчигельнля примесь пуринспецлфической нуклеачы.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 4 Кинетика образования свободного ВПг при гидролизе комплекса ВПг-РНК 'расщепляющим' ферментом. (15% ПААГ-'Ммочевина/ Обработка ВПг-РНК. 1 - контроль, инкубация в воде; 2- нуклеазой Р1: 3 - нуклеазой Р1 и :аюм ФДЭ I;

4 - 'расщепляющим' ферментом 30 мин.; 5 - 'расщепляющим' ферментом 20 мин.: 6 - 'расщепляющим' ферментом 15 мин.; 7 - 'расщеп.чяюншм' ферменюм 10 мни.;

5 - РНКазой Т1.

Рис. 4 иллюстрируют кинетику образования свободного ВПг при гидролизе комплекса ВПг-РНК препаратом 'расщепляющего' фермента. Как видно, у.ке ;а

короткие времена инкубации ВПг-РНК с 'расщепляющим' ферментом появляется свободный ВПг (дорожки 7.6). Частичный же гидролиз РНК проходит с образованием связанных с ВПг протяженных олигонуклеотидов. которые, также, как и исходный комплекс, являются субстратами 'расщепляющего' фермента и гидролизуются с образованием свободного ВПг (сравнить дорожки 7 и 4). Быстро мигрирующие к аноду продукты, образующиеся при продолжительной инкубации ВПг-РНК с препаратом расщепляющего' фермента (дорожки 5 и 4), являются результатом действия примесной пуринспецифической нуклеазы. Эти продукты совпадают с продуктами гидролиза ВПг-РНК РНКазой Т1 и представляют собой, в соответствии с первичной структурой РНК ВЭМК (Рис. 5),

ВПг-гепта- (Рис 4. дорожка 5) и ВПг-тринуклеотид (Рис. 4, дорожка 4). Их появление указывает на устойчивость к 'расщепляющему' ферменту.

Отсутствие среди продуктов ферментативной реакции комплексов ВПг с мононуклеогидами, и отличных от ВПг-три- и гептануклеотида комплексов с короткими олигонуклеотидами, говорит о том. что полученный препарат 'расщепляющего' фермента свободен от неспецифических экзо- и эндонуклеаз.

Аномальное поведение слабо основного по своей природе белка ВПг при электрофорезе в лолиакриламидном геле (ПААГ) объясняется отсутствием • юложитслыюго заряда на ацнлированиых в процессе мечения аминогруппах белка, остаточный отрицательный заряд карбоксильных групп обуславливает миграцию белка к аноду.

С...С С...С С I С I

7-► О...С

А..11

РНКазэ Т1 А..и -- 80

ЧА..1! 3—- С...С и..А II..А

/ СбивАА... ВПг

Рис. 5 Фрагмент первичной и вторичной структуры 5'-концевой области РНК ВЭМК.

Полученный препарат фермента не содержал протеаз: во-первых, соединения Кр-р1' и ВПг-рЬ" не гидролизуются препаратом 'расщепляющего' фермента. А во-

вторых, ингибиторы протеаз не влияли на картину гидролиза данным препаратом комплекса ВПг-РНК.

Таким образом, качественные характеристики полученного препарата 'расщепляющего' фермента позволяли приступить к исследованию его субстратной специфичности.

Присутствие в препарате, наряду с исследуемой активностью, незначительной примеси пуринспецифической нуклеазы не имело значения при работе с комплексами, содержащими короткие (три и короче) олигонуклеотиды.

3. Исследование субстратных свойств ковалентных комплексов вирусной природы, содержащих короткие олигонуклеотиды, и определение минимального размера нуклеиновой части комплекса - субстрата 'расщепляющего' фермента.

Ранее было показано, что комплекс белка ВПг и 5'-концевого нонануклеотида РНК вируса полиомиелита гидролизуется 'расщепляющим' ферментом в 2,5 раза хуже соединения, содержащего полноразмерную РНК. Можно было предположить, что укорочение до определенного предела нуклеиновой компоненты ковалентного комплекса должно блокировать ферментативную реакцию.

Рис. 6 ВПг-рирЬтрОр и ВПг-рЬ' не являются субстратами 'расщепляющего' фермента. (ТСХиа кизельгеле) Обработка ВПг-РНК: 1 - контроль, инкубация в реакционном буфере; 2 - нуклеазой Р1; 3 - последовательно нуклеазой Р1 и ФДЭ I; 4 - РНКачой Т!; 5 - нуклеазой Р1 и затем 'расщепляющим' ферментом; 6 - РНКазой Т1 и затем 'расщепляющим' ферментом; 7 'расщепляющим' ферментом.

В соответствии с первичной структурой РНК ВЭМК (Рис. 5), исчерпывающий гидролиз вирусного соединени ВПг-РНК гуанилспецифической рибонуклеазой Т1 приводит к образованию комплекса белка ВПг и 5'-концевого тринуклеотида ририрСр. Принимая во внимание вышесказанное, комплекс ВПг-РНК ВЭМК

12 3 4 567

подвергали исчерпывающему гидролизу РНКазой Т1 с последующей обработкой препаратом исследуемого фермента. Анализ полученных продуктов показал, что расщепляющий' фермент не гидролизует «межполимерную» фосфодиэфирную связь в комплексе ВПг и тринуклеотида (Рис. б, сравнить дорожки б и 3).

С одной стороны, этот факт может объясняться недостаточной протяженностью нуклеиновой площадки для посадки фермента. С другой стороны, объяснение может заключаться в экранировании белком ВПг этой площадки.

Очевидно, что разрушение ВПг в комплексе могло бы дать ответ на вопрос является ли устойчивость комплекса белка ВПг и тринуклеотида к действию расщепляющего' фермента следствием недостаточной протяженности нуклеиновой части или следствием ее защиты белком. Для этого комплекс ВПг-РНК был обработан протеиназой К, и полученное соединение Кп-РНК ВЭМК было подвергнуто последовательному гидролизу РНКазой Т1 и 'расщепляющим' ферментом. Параллельно 'расщепляющим' ферментом обрабатывали комплекс Кп-РНК после его исчерпывающего гидролиза нуклеазой Р1. Образцы анализировали как ТСХ, так и денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле.

1 2 3 4 5 6 7 В

. Кп-ририрСрАрАрАрСр

• Кп-ририрСрАрАр

• Кп-рирУрСр

Свободные К-пептиды

Кп-ри

Рис. 7 Кп-рирЬ'рОр является субстратом 'расщепляющего' фермента. [!5°<1 ПЛЛГ-7Ммочевина) Обработка Кп-РНК: 1 - контроль, инкубация в реакционном буфере; 2 - нуклеазой Р1; 3 - нуклеазой Р! и затем ФДЭ I; 4 - РНКазой Т1; 5 -расщепляющим' ферментом; 6 - нуклеазой Р1 и затем 'расщепляющим' ферментом; 7 -РНКазой Т1 и затем 'расщепляющим' ферментом; 8 - РНКазой Т1 в условиях исчерпывающего гидролиза.

Сравнение результатов разделения продуктов в ПЛАГ и в тонком слое кизельгеля дало возможность идентифицировать в геле зоны, соответствующие свободным К-пептидам и соединению Кп-ри.

Электрофорезом в высокоразрешающем ПААГ были обнаружены 4 зоны, соответсвующие свободным К-пептидам (Рис. 7, дорожка 3). Гетерогенность пептидов объясняется, как уже упоминалось, защитой белка ВПг от полного про1еолиза вирусной РНК. При этом с ростом заряда и массы 5'-концевых фрагментов РНК. связанных с К-петидами, различие в подвижностях таких производных нивелируется. Так, комплекс Кп-ри представлен 3-мя пятнами (дорожка 2). а Кп-гринуклеошд (дорожка 4) уже одной широкой зоной.

Зона, соответствующая соединению Кп-тринуклеотид, идентифицировалась как зона, соответствующая продукту исчерпывающего специфического гидролиза исходного комплекса РНКазой Т1.

Результаты последовательного гидролиза Кп-РНК нуклеазой Р1 и "расщепляющим' ферментом говорят о том, что соединение Кд-рЬ' (дорожка 2) не расщепляется исследуемым ферментом с образованием свободных К-пептидов. и подвижность Кп-ри, обработанного 'расщепляющим' ферментом не изменяется (сравнить дорожки 2 и 6). Последнее еще раз подтверждает вывод об отсутствии в препарате 'расщепляющего' фермента неспецифических фосфолиэстераз и продуцирующих 5'-нуклеотиды 3'->5' экзонуклеаз.

В то же время, в отличие от соединения ВПг-тринуклсотид, комплекс К-папила и тринуклеотида хорошо гидролизуется 'расщепляющим' ферментом с образованием свободных К-пептидов (сравнить дорожки 4 и 7). При этом комплекс Кп-тринуклсошд является ничуть не худшим субстратом, чем комплекс содержащий полноразмерную РНК. Таким образом, удалось обозначить границы для минимального фрагмента нуклеиновой части ковалентного комплекса, придающего ему свойства субстрат 'расщепляющего' фермента. Для его определения комплекс Кп-РНК обрабатывали последовательно панкреатической РНКазой, получая соединение Кл-р1,гр (Рис. X. дорожка 5), и полученным препаратом исследуемого фермента. Последовательный гидролиз Кп-РНК панкреатической РНКазой и 'расщепляющим' ферментом (дорожка 8) показал, что соединение Кп-р1)р медленно, но гидролизуется 'расщепляющим ферментом с образованием свободных К-пептидов. В соответствии с эгим. можно заключить, что 5'-концевой уридиндифосфат, связанный с К-пептидом (амн). является

минимальным фрагментом нуклеиновой части комплекса, сохраняющего его свойства как с\бстрата 'расщепляющего' фермента.

1 2 3 4 5 6 7 8

W Щ ЬФ

:V;-¿4 KrrPUpUpGpApApApGp Кп-pUpUpGpApAp?

¿ í Кп-pUpUpGp

К-пептиды

Кп-pU

Кп-pUp

Рис. 8 Комплекс Кп-рЬ'р является субстратом 'расщепляющего' фермента. (15% 11ААГ с ГЛ/ мочевиной) Обработка Кп-РНК: 1 - контроль, инкубация в реакционном буфере; 2 - нуклеазой Р1; 3 - нуклеазой Р1 и затем ФДЭ 1;4 - РНКазой Т1; 5 - РНКазой А; б - 'расщепляющим' ферментом; 7 - нуклеазой Р1 и затем 'расщепляющим' ферментом; 8 - РНКазой А и затем 'расщепляющим' ферментом.

В связи с этим, важно отметить, что если для осуществления реакции гидролиза в принципе достаточно присутствия в комплексе с пептидом уридиндифосфата, то минимальный размер пептидной части не определен. При этом удлинение нуклеиновой части, связанной с К-пептндом(ами). до тринуклеотида ведет к резкому росту эффективности каталитической реакции. Таким образом, можно заключить, что определяющую роль з эффективности ферментативного гидролиза «межполимерной» фосфодиэфирнон связи играет нуклеиновая составляющая ковалентного комплекса.

Известно, что целостность ВПг не влияет на субстратные свойства ковалентного комплекса. Можно предположить, что необходимой и достаточной белковой составляющей субстрата может быть остаток тирозина.

С другой стороны, полноразмерный белок ВПг, связанный с тринуклеотидом, полностью блокирует протекание реакции специфического гидролиза. Описанное в литературе падение эффективности ферментативной реакции, в случае комплекса белка ВПг с нонануклеотидом, объясняется, по-видимому, влиянием белка ВПг на короткий олигонуклеотид, но не размером нуклеиновой части комплекса. Это предположение подтверждают наблюдаемые нами близкие степени гидролиза комплекса К-пептида(ов) и тринуклеотида и соединения К-пептида с полноразмерной РНК в одинаковых условиях. Можно сделать заключение, что полноразмернын белок ВПг в составе комплекса с коротким олигонуклеотидом защищает нуклеиновую часть комплекса, препятствуя связыванию фермента с субстратом. В связи с этим находят свое объяснение литературные данные о том, что соединение ВПг-рОтр не гидролизуется 'расщепляющим' ферментом.

Совокупность полученных данных позволяет предположить, что хорошим субстратом для 'расщепляющего' фермента будет служить комплекс тирозина и тринуклеотида рирЬ'рОр. Поскольку основные трудности при работе с исследуемой фосфодиэстеразой обусловлены сложностью и труднодоступностью природного вирусного субстрата, синтез указанного фосфодиэфира и использование последнего в качестве субстрата может значительно облегчить дальнейшее изучение этого необычного клеточного фермента.

4. Доказательство специфичности гидролиза 'расщепляющим' ферментом «межполнмернои» фосфодиэфирной связи.

Определение того, что комплекс К-пептида и тринуклеотида является хорошим субстратом для 'расщепляющего' фермента, значительно упростило необходимую проверку специфичности фермента. Адекватного метода для решения этой задачи непосредственно на сложном природном комплексе не существует. Поэтому анализируется структура четко определенного «узла» межполимерной связи до и после обработки расщепляющим «узел» ферментом.

Получение препарата фермента необходимой для решения этой задачи чистоты и определение подходящей для доказательства «узловой» структуры в ковалентном комплексе вируса энцефаломиокардита позволили перейти к анализу специфичности исследуемой фосфодиэстеразы.

В работе был использован классический подход для определения 5'-концевого нуклеотида в олигорибонуклеотидах с помощью полинуклеотидкиназы и РНКаз.

Принцип этого подхода заключается в том, что с помощью полинуклеотидкиназы радиоактивная метка вводится исключительно в 5'-концевой нуклеогид. Последующий гидролиз олигонуклеотида РНКазами приводит к образованию набора мононуклеотидов и радиоактивно меченного нуклеозид-5'-3'-дифосфата.

Это структурное исследование схематически изображено на Рис. 9.

[ !]Кп-РНК

I

| РНКаза Т1

У

Электрофорез в ПААГ [,25l]Kn-pUpUpGp

I

! 'расщепляющий' фермент,

| инактивация

ТСХ анализ - [125l]Kn-?UpUpGp + [1251]Кп + pUpUpGp на кизельгеле i

| СИР

[125l]Kn-pUpUpG + [,25l]Kn + UpUpG

/ 1г32Р]-АТР,

/ Т4 полинуклеотидкиназа

/

5'-[32P]pUptlpG

i

| РНКаза А

Т

5'-[32Р]ри-2',3'-циклофосфат

5'-[32Р]р11-2'-фосфат ^ 5'-[32Р]р1_1-3'-фосфат

У

Двумерный ТСХ анализ на ПЭИ-целлюлозе

Рис. 9 С\ема доказательства специфичности 'расщепляющего' фермента к межполимерной» связи.

Исчерпывающим гидролизом РНКазой Т1 комплекса Кп-РНК было по.тучено соединение Kri-трипуклеотид. Продукты гидролиза фракционировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ, Кп-тринуклеотид выделяли элюцией вещества из соответсвующей зоны (Рис. 10). Полученный Кп-тринуклеотид обрабатывали

_ старт

Рис. 10 Выделение комплекса ['~1]Кп-ририрСр после

исчерпывающего гидролиза

[,:51]Кп-РНК ВЭМК РНКаюи Т1. (15% ПЛЛГ-7 А/мочевина)

Кп-ририрвр

высокоочищеиным препаратом 'расщепляющего' фермента, и продукт дефосфорилировали термолабильной фосфатазой. Оба фермента инактпвировали прогреванием. Продукты обработки комплекса Кп-гринуклеотид 'расщепляющим' ферментом анализировали ТСХ на кизельгеде (Рис. 11)

Рис. 11 Анализ продуктов гидролиза ['"Ч]Кп-рир1.!рОр 'расщепляющим ферментом.

I , (ТСХна кизсяьгеле!

I Свооодные К-пептеды

■ 1 - контроль, инкубация в

реакционном буфере; 2 - обработка 'расщепляющим' ферментом.

— старт

Образование свободных К-пептидов не сопровождалось образованием продуктов неспецифпческого нуклеазного гидролиза (сравнить Рис. 1, дорожка 2 и Рис. И, дорожка 2). Образующийся после дефосфорилпрования тринуклеошд ир1.'рО

фосфорилировали в смеси [у-'гР]-АТФ в присутствии Т4 полинуклеотидкиназы.

Определение места включения радиоактивного фосфора определяли гидролизом полученного продукта РНКазой А и анализом образующихся нуклеотидов двумерной ТСХ на полиэтиленимнн-целлюлозе (Рис. 12).

Рис. 12 Анализ продуктов последовательных обработок [':Т]Кп-ририрСр: 'расщепляющим' ферментом. Т4 полинуклеогидкиназой в присутствии [у-:2Р]-ЛТФ, и РНКазой А.

IДвумерная ТСХ на ПЭИ-целлюлозс)

Хроматография: в первом направлении - ступенчатый градиент концентрации 1дС1; зо втором направлении - ступенчатый градиент концентрации СН3СООКа, рН 3.2. —- продукты гидролиза фосфорилированного соединения РНКазой А; ■ продукты гидролиза [у-'3Р]-АТФ

Хроматографию в первом направлении вели ступенчатым градиентом концентрации 1лС1. Во втором направлении - градиентом концентрации ацетата натрия.

Используя такую систему, удалось хорошо разделить продукты гидролиза трииуклеотида РНКазой А и производные [у-1:Р]-АТФ. При этом было выявлено предпочтительное образование 5'-фосфоуридин-2',3'-циклофосфата. а так же образование уридин-5',3'-дифосфата н уридин-5',2'-дифосфата. Подвижность этих соединений совпадала с подвижностью свидетелей, полученных обработкой уридии-2',3'-циклофосфата РНКазой А с последующим мечением [у-):Р]-АГФ в присутствии полинуклеотидкиназы. Подвижность уридин-5',3'-дифосфата совпадала с подвижностью немеченого маркера pl.Jp. Преимущественное образование 5'-фосфоуридин-2',3'-циклофосфата объясняется известным ингибированием РНКазы А на стадии образования циклического интермедиата высокой концентрацией в реакционной смеси солей калия и магния.

В соответствии с этим необходимо отметить, что любой из полученных продуктов (5'-фосфоуридин-2',3'-циклофосфат. уридин-5',3'-дифосфат или уридин-5\2'-дифосфат) мог образоваться лишь из соединения, предварительно вступившего в реакцию кэширования. Таким соединением является исключительно тринуклеотид, образующийся в результате специфического гидролиза межполимерной связи расщепляющим' ферментом. Как упоминалось, препарат 'расщепляющего' фермента лишен примесей неспецифических эндонуклеаз, способных привести к образованию в смеси динуклеотидов. Действительно, при гидролизе препаратом 'расщепляющего' фермента комплекса Кп-тринуклеотид образование свободных пептидов не сопровождается появлением соединений Кп-рЬ! и Кп-р11р (Рис. 11), способных возникнуть, в частности, в результате неспецифического гидролиза трииуклеотида эндонуклеазами. Препарат фермента свободен также от неспецифических экзонуклеаз, поскольку комплексы Кп-ри (Рис. 7) и ВПг-ри (Рис. 6) устойчивы в условиях ферментативной обработки. Более того, мононуклеотиды, способные образоваться в результате экзонуклеазного гидролиза трииуклеотида, при обработке фосфатазой переходят в соответсвующие нуклеозиды и не вступают в реакцию кинирования.

Следовательно, образование в результате последнего эксперимента 5'-фосфоуридин-2' ,3' -циклофосфата. уриднн-5' ,3' -дифосфата и уридин-5' ,2' -дифосфата говорит о специфическом гидролизе ферментом «межполимерной» связи в комплексе Кп-тринуклеотид.

выводы

!. С использованием в качестве субстратов избирательно и высокоэффективно радиоактивно меченных по пептидной части ковалентных комплексов ВПг-РНК и Кп-РНК вируса энцефаломиокардита получен и охарактеризован препарат фосфодизстеразы из клеток асцитной карциномы Кребс II мышей, гидролизующей связь между белком(пептидом) и РНК.

2. Установлено, что соединение белка ВПг и 5'-концевого тринуклеотида pUpUpGp не гидролизуется ферментом. Белок ВПг экранирует концевой олигонукдеотид, блокируя связывание фермента с субстратом.

3. Установлено, что соединение Kn-pUpUpGp является хорошим субстратом для фермента, в то время как соединение Кп-рПр гидролнзуется ферментом медленно, а соединение Kn-pU им не гидролнзуется. Таким образом, 5'-концевой уридиндифосфат, связанный с К-пептидом(ами), является минимальным фрагментом нуклеиновой части комплекса, придающим ему свойства субстрата исследумой фосфодизстеразы. На основании собственных и литературных данных сделан вывод о том, что удлинение нуклеиновой части «узлового» фрагмента комплекса ведет к росту эффективности ферментативной реакции.

4. Установлено, что фермент проявляет специфичность именно к «узловой» межполнмерной фосфолнэфирной связи, образованной остатком тирозина и 5'-концевой уридиловой кислотой, в исследуемых субстратах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Р.А Юсупова, А.Ю.Гулевич, Ю.Ф.Дрыгин. «Новый метод выделения фермента, катализирующего гидролиз ковалентной связи между РНК и белком ВПг пнкррнавирусов. из клеток асцитной карциномы мышеи Кребс И»//Биохимия (2000)65, 1440-1449.

2. P.A. Юсупова, Г.С. Шатская, A.A. Шабанов, М.Б. Вирясов, А.Ю.Гулевич, В.П. Вейко, 10.Ф. Дрыгин. «Уридилилполинуклеотид-(5'Р—>0)-тирозин фосфодиэстераза представитель фосфодиэстераз нового типа»// Тезисы 2 съезда Биохимического Общества РАН, (1497), 4.1, с.78.

3. Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина, P.A. Юсупова, Г.С. Шатская, А.Ю. Гулевич, O.A.

17

Бордунова. «Природные ковалентные соединения нуклеиновых кислот и белков: ог исследования вирусных соединений к клеточным»// Тезисы 2 съезда Биохимического Общества РАН, (1997), ч.1, с.87-88.

4. Yu.F. Drygin, G.S. Shatskaya, R.A.Yusupova, A.Yu. Gulevich, A.A. Shabanov. «Some properties of the unlinking enzyme which splitts off VPg from picomavirus RNA»// «EUROP1C' 98» Abstr. Xth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picomaviruses, Jena, Germany, 5-11 September 1998, V35.

5. А.Ю. Гулевич, P.А. Юсупова, Г.С. Шатская, Ю.Ф. Дрыгин. «Фермент, расщеплящий связь между белком ВПг и РНК пикорнавирусов: минимальный субстрат»// Тезисы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», (2000). т. 1, с. 140-

141.

1. Список используемых сокращений

2. Введение

3. Рибонуклеазы эукариот и пути распада мРНК (Обзор литературы)

3.1. Рибонуклеазы эукариот

3.2. Механизмы распада мРНК в эукариотах

4. Результаты и их обсуждение

4.1. Субстраты "расщепляющего" фермента.

4.2. Анализ активности фермента

4.3. Выделение 'расщепляющего" фермента из клеток асцитной карциномы мышей Кребс II.

4.4. Фермент, отщепляющий ВПг от пикорновирусной РНК представитель фосфодиэстераз нового типа.

4.5. Определение минимального размера нуклеиновой части субстрата "расщепляющего" фермента.

4.6. Доказательство специфичности гидролиза "расщепляющим" ферментом «межполимерной» фосфодиэфирной связи.

4.7. Возможная роль "расщепляющего" фермента в цикорнавирусной инфекции и эукариотической клетке.

5. Экспериментальная часть

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

В работе использованы следующие сокращения: б.о.е. бляшкообразующая еденица

БСА бычий сывороточный альбумин

ВПг вирусный белок связанный с геномом

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭМК вирус эндефаломиокардита

ГСЭГФПК М-гидроксисукцинимид гидроксифенилпропионовой кислоты додецилсульфат натрия дитиотрейтол единица килодальтон

Импульсов/мин пептид, полученный обработкой белка ВПг протеиназой К

ПААГ полиакриламидный гель рСр цитидин-б^З'-дифосфат р11р уридин-5' ,3' -дифосфат

ПБ полибуфер

ПБИ полибуфер-ионообменник ПЭИ-целлюлоза полиэтиленимин-целлюлоза

ПЭГ-6000 полиэтиленгликоль Мг=6000 ТЕМЕД -тетраметилэтилендиамин

Трис 2-амино-2-(гидрокси-метил)- 1,3-пропандиол

ТСХ тонкослойная хроматография

ФДЭ I фосфодиэстераза змеиного яда

ФМСФ фенилметансульфонилфторид

ИЕРЕЯ М-2-гидроксиэтилпиперазин->Г -этансульфо кислота

ЭДТА этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дсн дтт ед. кВа ерш. Кп

6. выводы

1. С использованием в качестве субстратов избирательно и высокоэффективно радиоактивно меченных по пептидной части ковалентных комплексов ВПг-РНК и Кп-РНК вируса энцефаломиокардита получен и охарактеризован препарат фосфодиэстеразы из клеток асцитной карциномы Кребс II мышей, гидролизующей связь между белком (пептидом) и РНК.

2. Установлено, что соединение белка ВПг и 5'-концевого тринуклеотида рирИрОр не гидролизуется ферментом. Белок ВПг экранирует концевой олигонуклеотид, блокируя связывание фермента с субстратом.

3. Установлено, что соединение Кп-рир11рОр является хорошим субстратом для фермента, в то время как соединение Кп-р11р гидролизуется ферментом медленно, а соединение Кп-ри им не гидролизуется. Таким образом, 5'-концевой уридиндифосфат, связанный с К-пептидом(ами), является минимальным фрагментом нуклеиновой части комплекса, придающим ему свойства субстрата исследумой фосфодиэстеразы. На основании собственных и литературных данных сделан вывод о том, что удлинение нуклеиновой части «узлового» фрагмента комплекса ведет к росту эффективности ферментативной реакции.

4. Установлено, что фермент проявляет специфичность именно к «узловой» фосфодиэфирной связи, образованной остатком тирозина и 5"-концевой уридиловой кислотой, в исследуемых субстратах.

1. Lee, Y.F., Nomoto, A., Wimmer, Е. II Progr. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1976. V. 19. P. 89-96.

2. Flanegan, J.B., Petterson, R.F., Ambros, V., Hewlet, M.G., Baltimore, D. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977. 74. P. 961-965.

3. Sangar, D.V., Rowlands, D.L., Harris, T.J.R., Brown, F. II Nature. 1977. V. 268. P. 648-650.

4. Дрыгин Ю.Ф., Вартапетян А.Б., Чумаков KM. // Мол. Биол. 1979. V. 13. P. 777-787.

5. Takegami, Т., Semler, B.L., Anderson, C.W., Wimmer, E. II Virology. 1983. V. 128. P. 33-47.

6. Vartapetian, A.B., Koonin, E.V., Agol, V.I., Bogdanov, A.A. II EMBO J. 1984. V. 3. P. 2583-2588.

7. Hewlet, M.J., Rose, J.K., Baltimore, D. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 327-330.

8. Ambros, V., Petterson, R.F., Baltimore, D. II Cell. 1978. V. 15. P. 1439-1446. 9Дрыгин, Ю.Ф., Сиянова, Е.Ю. II Биохимия. 1986. V. 51. P. 249-258.

9. Crawford N.M., Baltimore, D. I/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80 P. 7452-7455.

10. Rueckert R.R. Picornaviridae: the viruses and their replication. In Fields B.(ed.), Virology. Raven Press, New York, N.Y., 1996, P. 609-654.

11. Sporn, M.B., Lazarus, H.M., Smith, J.M., Henderson, W.R. //Biochemistry. 1969. V. 8. P. 1698-1706.

12. Kumagi, H., Igarshi, K, Tanaka, K., Nakao, H., Hirose, S. II Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 566. P. 192-199.

13. NingKwan, C. II Biochim. Biophys. Acta, 1977. V. 479. P. 322-331.

14. Kumagi, H., Nakamura, M., Ozaki, N., Igarshi, K., Hirose, S. II Biochim. Biophys. Acta, 1985. V. 827. P. 431-438.

15. Futai, M., Mizuno, D. II J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 5301-5307.

16. Schroder, HC., Zahn, R.K., Dose, K, Muller, W.E.G. II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 4535-4538.

17. Ohtaka, F., Uchida, K„ Sakai, T. II J. Biochem. 1963. V. 54. P. 322-327.

18. Shetty, J.K., Weaver, R.C., Kinsella, J.E. II Biochem. J. 1980. V. 189. P. 363-366.

19. Oka, J., Ueda, K, Hayaishi, O. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. V. 80. P. 841-848.

20. Ballario, P., Bergami, M„ Pedone, F. II Anal. Biochem. 1977. V. 80. P. 646-651.

21. Philipps, G.R. //Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 432. P. 237-244.

22. Zielinski, W.S., Niewiarowski, W. II Nucl. Acid. Res. 1981. V. 9. P. 235-237.

23. Margison, G.P., O^Connor, P.J., Cornish-Bowden, A. II Biochem. J. 1975. V. 151. P. 249-256.

24. Flanagan, P.R., Zbarsky, S.H. //Biochem. J. 1974. V. 142. P. 545-553.

25. Miller, H.I., Perkins, LA., Rosenfeld, M.G. //Biochemistry 1975. V. 14. P. 19641970.

26. Rech, J., Cathala, G., Jeanteur, P. //Nucl. Acid. Res. 1976. V.3. P. 2055-2065.

27. Rech, J., Cathala, G., Jeanteur, P. II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 6700-6706.

28. Eder, P.S., Walder, JA. II J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 6472-6479.

29. Eder, P.S., Walder, R. Y„ Walder, JA. II Biochimie. V. 1993. V. 75. P. 123-126.

30. Frank, P., Albert, S„ Cazenave, C„ Toulme, J.J. //Nucl. Acid. Res. 1994. V. 22. P. 5247-5254.

31. Busen, W., Peters, J.H., Hausen, P. //Eur. J. Biochem. 1977. V. 74. P. 203-208.

32. Robertson, H.D., Altman, S„ Smith, J.D. II J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 52435251.

33. Talbot, S.J., Altman, S. II Biochemistry. 1994. V. 33. P. 1399-1405.

34. Altman, S. II J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 20053-20056.

35. Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N., Altman, S. II Cell. 1983. V. 35. P. 849-857.

36. Yuan, Y„ Altman, S. //EMBO J. 1995. V. 14. P. 159-168.

37. Smith, D., Pace, N.R. //Biochemistry 1993. V. 32. P. 5273-5281.

38. Karwan, R. II Febs Lett. 1993. V.319. P. 1-4/

39. Muller, W.E.G. II Eur. J. Biochem. 1976. V. 70. P. 241-248.

40. Bachmann, M., Trautmann, F., Messer, R., Zahn, R.K., Meyer zum Buschenfelde, K.-H., Muller, W.E.G. II Eur. J. Biochem. 1983. V. 136. P. 447-451.

41. Pietrzak, M., Cundy, H., Maluszynski, M. II Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 614. P. 102-112.

42. Kanaya, S., Uchida, Т. II J. Biochem. 1981/V. 90. P. 473-481.

43. Sierakowska, H., Shugar, D. II Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1977. V. 20. P. 59-130.

44. Безбородова, С.И. //Прикл. Биохимия и Микробиология. 1991. V. 27. Р. 308329.

45. Dalaly, В.К., Eitenmiller, R.R., Friend\ В.А., Shahani, K.M. II Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 615. P. 381-391.

46. Fett, J.W., Strydom, D.J., Lobb, R.R., Alderman, E.M., Bethune, J.L., Riordan, J.F., Vallee, B.L. //Biochemistry. 1985. V. 24. P. 5480-5486.

47. Shapiro, R., Strydom, D.J., Olsen, К.A., Vallee, B.L. II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5141-5146.

48. Strydom, D.J., Fett, J.W., Lobb, R.R., Alderman, E.M., Bethune, J.L., Riordan, J.F., Vallee, B.L. //Biochemistry. 1985. V. 24. P. 5486-5494.

49. Shapiro, R., D.J., Riordan, J.F., Vallee, B.L. II Biochemistry. 1986. V. 25. P. 3527-3532.

50. Shapiro, R„ Vallee, B.L. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V. 84. P. 22382241.

51. Gullberg, U., Widegren, В., Arnason, U., Egesten, A., Olsson, I. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 139. P. 1239-1242.

52. Sorrentino, S., Glitz, D.G., Hamann, K.J., Loegering, DA., Checkel, J.L., Gleich, G.J. //J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P 14859-14865.

53. Sorrentino, S., Libonati, M. II Febs. Lett. 1997. V. 404. P .1-5.

54. Власов, A.B. II Биохимия. 1998. V. 63. P. 1587-1599.

55. Schroeder, H.C., Dose, K„ Zahn, R.K., Mueller, W.E.G. II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 5108-5112.

56. Peebles, C.L., Gegenheimer, P., Abelson, J. II Cell. 1983. V. 32. P. 525-536.

57. Stange, N. Gross, H.J., Beier, H. // EMBO J. 1988. V. 7. P. 3823-3828.

58. Attardi, D.G., Margarit, I., Tocchini-Valentini, G.P. II EMBO J. 1985. V. 4. P. 3289-3297.

59. Harada, F., Dahlberg, J.E. //Nucl. Acid. Res. 1975. V. 2. P. 865-871.

60. Tomkinson., A.E., Linn, S. //Nucl. Acid. Res. 1986. V. 14. P. 9579-9593.

61. Wang, E.C., Furth, J.J., Rose, J.A. //Biochemistry. 1978. V. 17. P. 544-549.

62. Vogt, V.M. II Eur. J. Biochem. 1973. V. 33. P. 192-200.

63. Oleson, A.E., Janski, A.M., Clark, E.T. II Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 366. P. 89-100.

64. Bernstain, P., Ross, J. II Trends Biochem. Sei. 1989. V. 14. P. 373-377.

65. Bernstain, P., Peltz, S. W„ Ross, J. II Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. P. 659-670.

66. Zeevi, M., Nevins, J.R, Darnell, J.E. Jr. II Mol. Cell Biol. 1982. V. 2. P. 517-525.

67. Brewer, G., Ross, J. II Mol. Cell Biol. 1988. V. 8. P. 1697-1708.

68. Swartwout, S.G., Kinniburg, A.J. //Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. P. 288-295.

69. Shyu, A.-B., Greenberg, M.E., Belasco, J.G. II Genes. Dev. 1989. V. 3. P. 60-72.

70. Pandey, N.B., Sun, J.-H., Marzluff, W.F. //Nucl. Acid. Res. 1991. V. 19. P. 56535659.

71. Peltz, S. W., Ross, J. II Mol. Cell Biol. 1987. V. 7. P. 4345-4356.

72. Shyu, A.-B., Belasco, J.G., Greenberg, M.E. II Genes. Dev. 1991. V. 5. P. 221231.

73. Alberta, J.A., Rundell, K„ Stiles, C.D. II J.Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 45324538.

74. Chen, C.-Y., Chen, T.-M., Shyu, A.-B. //Mol. Cell Biol. 1994. V. 14. P. 416-426.

75. Lachman, H.M., Cheng, G., Skoultchi, A.I. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 6480-6484.

76. Fort, P., Rech, J., Vie, A., Piechaczyk, M., Bonnieu, A., Jeanteur, P., Blanchard, J.-M. //Nucl. Acid Res. 1987. V. 15. P. 5657-5667.

77. Schiavi, S.C., Wellington, C.L., Shyu, A.-B., Chen, C.-Y., Greenberg, M.E. II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3441-3448.

78. Herrick, D., Ross, J. //Mol. Cell Biol. 1994. V. 14. P. 2119-2128.

79. Bachurski, C.J, Theodorakis, N.G., Coulson, R.M., Cleveland, D.W. II Mol. Cell Biol. 1994. V. 14 P. 4076-4086.

80. Peltz, S.W., He, F., Welch, E., Jacobson, A. II Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1994. V. 47 P. 271-298.

81. Decker, C.J., Parker, R. II Genes. Dev. 1993. V. 7. P. 1632-1643.

82. Sachs, A.B., Davis, R.W., Kornberg, R.D. // Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 32683276.

83. Allmang, C., Petfalski, E., Podtelejnikov, A., Mann, M., Tollervey, D., Mitchell, P. II Genes. Dev. 1999. V. 13. P. 2148-2158.

84. Mitchell, P., Petfalski, E., Shevchenko, A., Mann, M„ Tollervey, D. II Cell. 1997. P. 91. V. 457-466.

85. Mian, I.S. //Nucl. Acid. Res. 1997. V. 25. P. 3187-3195.

86. Zanchin, N.I., Goldfarb, D.S. //Nucl. Acid. Res. 1999. V. 27. P. 1283-1288.

87. Noguchi, E., Hayashi, N., Azuma, Y., Seki, T., Nakamura, M., Nakashima, N., Yanagida, M„ He, X., Mueller, U., Sazer, S., Nishimoto, T. II EMBO. J. 1996. V. 15. P.5595-5605.

88. Carpousis, A.J., van Houwe, G., Ehretsmann, C., Krish, H.M. II Cell. 1994. V. 76. P.889-900.

89. Larimer, F. W., Stevens, A. II Gene. 1990. V. 95. P. 85-90.

90. Muhlrad, D„ Decker, C.J., Parker, R. // Genes. Dev. 1994. V. 8. P. 855-866.

91. Hsu, C.L., Stevens, A. //Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 4826-4835.

92. Furuichi, Y„ LaFiandra, A., Shatkin, A.J. //Nature. 1977. V. 266. P. 235-239.

93. Taneja, K.L., Lifshitz, L.M., Fay, F.S., Singer, R.H. II J. Cell. Biol. 1992. V. 119. P. 1245-1260.

94. Sachs, A.B., Davis, R.W. II Cell. 1989. V. 58. P. 857-867.

95. Stevens, A. II Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. P. 2005-2010.

96. Stevens, A. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V. 96. P. 1150-1155.

97. Nuss, D.L., Alt schul er, R.E., Peterson, A.J. II J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 6224-6230.

98. Blanc, A., Goyer, C., Sonenberg, N. II Mol. Cell Biol. 1992. V. 12. P. 33903398.

99. Masison, D.C., Blanc, A., Ribas, J.C., Carrol, K., Sonenberg, N., Wicker, R.B. II Mol. Cell Biol. 1995. V. 15. P. 2763-2771.

100. Blanc, A., Ribas, J.C., Wickner, R.B,. Sonenberg, N. II Mol. Cell Biol. 1994. V. 14. P. 2664-2674.

101. Muhlrad, D„ Parker, R. //Nature. 1994. V. 370. P. 578-581.

102. Stevens, A. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 86. P. 1126-1132. 107Stevens, A. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. V. 81. P. 656-661.

103. Larimer, F.W., Hsu, C.L., Maupin, M.K., Stevens, A. II Gene. 1992. V. 120. P. 51-57.

104. Muhlrad, D„ Decker, C.J., Parker, R. II Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 21452156.

105. Amberg, D.C., Goldstein, A.L., Cole, C.N. // Genes. Dev., 1992. V. 6. P. 11731189.

106. Ross, J., Peltz, S.W., Kobs, G., Brewer, G. II Mol. Cell Biol. 1986. V. 6. P. 43624371.

107. Presutti, C., Villa, T„ Hall, D., Pertica, Bozzoni, I. II EMBO J. 1995. V. 14. P. 4022-4030.

108. Decker, C.J., Parker, R. II TIBS. 1994. V. 19. P. 336-340.

109. Muhlrad, D„ Parker, R. II Genes. Dev. 1992. V. 6. P. 2100-2111.

110. Brown, B.D., Zipkin, I.D., Harland, R.M. II Genes. Dev. 1993. V. 7. P. 16201631.

111. Meinsma, D., Scheper, W., Holthuizen, P.E., Van den Brande, J.L., Sussenbach, J.S. II Nucl. Acid. Res., 1992. V. 20. P. 5003-5009.

112. Lowell, J.E., Rudner, D.Z., Sachs, A.B. II Genes. Dev. 1992. V. 6. P. 2088-2099.

113. Sachs, A.B., Deardorff, J.A. II Cell. 1992. V. 70. P. 961-973.

114. Binder, R., Horowitz, J.A., Basilion, J.P., Koeller, D.M., Klausner, R.D., Harford, J.B. II EMBO J. 1994. V. 13. P. 1969-1980.

115. Doan L, Handa B, Roberts NA, Klumpp K. II Biochemistry. 1999 V. 38. P. 56125619.

116. Pettersson, J.L., Holloway, B., Kolakofsky, D. HJ. Virol. 1984. V. 52. P. 215222.

117. Cleveland, D.R., Zarbl, H„ Millward, S. II J. Virol. 1986. V. 60. P. 307-311.

118. Scheidel, L.M., Durbin, R.K., Stollar, V. //Virolog. 1989. V. 173. P. 408-414.

119. Nomoto, A., Kitamura, N, Golini, F., Wimmer, E. II. Proc Natl Acad Sei USA. 1977. V. 74. P. 5345-5349.

120. Pelletier, J„ Sonenberg. N. //Nature. 1988. V. 334. P. 320-335.

121. Jang, S.K., Krausslich, H.-G., Nickiin, M.J.H., Duke, G.M., Palmenberg, A.C., Wimmer, E. II J. Virol. 1988. V. 62. P. 2636-2643.

122. Liu, D.X., Inglis, S.C. II J. Virol. 1992. V. 66. P. 6143-6154.

123. Xinhao Cynthia Fan, Myer, V.E., Steitz, J.A // Genes. Dev. 1997. V. 11. P. 2557-2568.

124. Karr, B.M., Read, G.S. // Virology. 1999. V. 264. P. 195-204.

125. Ambros, V., Baltimore, D. II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 6739-6744.

126. Дрыгин, Ю.Ф., Шабанов, А.А., Богданов, A.A. II Биохимия. 1988. V. 53. P. 1371-1379.

127. Dry gin, Yu.F. II Nucl. Acid. Res. 1998. V. 26. P. 4791-4796.

128. Drygin, Yu.F., Shabanov, A., Bogdanov, A. II FEBS Lett. 1988. V. 239. P. 343346.

129. Vartapetian A.B., Mankin, A.S., Skripkin, E.A., Chumakov, K.M., Smirnov, V.D., Bogdanov, A.A. // Gene. 1983. V. 26. P. 189-195.

130. Duke, G.M., Hoffman, M.A., Palmenberg, A.C. II J. Virol. 1992. V. 66. P. 16021609.

131. Шабанов, A.A., Калюжный, A.A., Готтих М.Б., Дрыгин, Ю.Ф. II Биохимия. 1996. V. 61. Р. 1106-1118.

132. Viryasov, М.В., Yusupova, R.A., Shatskaya, G.S., Drygin, Yu.F. II Chromatographia. 1997. V. 45. P. 133-137.

133. Юсупова, P.A, Гулевич, А.Ю., Дрыгин, Ю.Ф. II Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1440-1449.

134. Калюжный, А.А. Выделение и идентификация фермента, специфически расщепляющего фосфодиэфирную связь между ВПг и РНК пикорнавирусов.

135. Дипломная работа. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 1991.

136. Pettersson, R.F., Flanegan, J.B., Rose, J.К., Baltimore, D. //Nature. 1977. V. 268. P. 270-272.

137. Sideris, D.S., Fragoulis, E.G. //Eur. J. Biochem. 1987. V. 164. P. 309-315.

138. Weickmann, J.L., Elson, M„ Glitz, D.G. // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 12721278.

139. Shu-wei Yang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 11534-11539.

140. Sangar, D.V., Bryant, J., Harris, T.J.R., Brown, F., Rowlands, D.J. II J. Virol. 1981. V. 39. P. 67-74.

141. Jang, S.K., Davies, M.V., Kaufman R.J., Wimmer, E. II J. Virol. 1989. V. 63. P. 1651-1660.150Laemmli, U.K. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

142. Damerval, C., Guilloux, M., Blaisonneau, J., Vienne, D. //Electrophoresis. 1987. V. 8. P. 158-159.

143. Методы исследования нуклеиновых кислот (под ред. Белозерского А.Н.). М.: Мир, 1970. С. 44-45.