Катионные α-спиральные олигопептиды - носители ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ГУРЬЯНОВ Иван Алексеевич

КАТИОННЫЕа-СПИРАЛЬНЫЕ ОЛИГОПЕПТИДЫ - НОСИТЕЛИ ДНК

Специальность - 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

Г. П. Власов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Т. Б. Тенникова

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Н. И. Колодкин

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный утЕверситет, химический факультет, кафедра высокомолекулярных соединений

Защита диссертации состоится 26 февраля 2004 г. в 10 часов на заседании диссертациотгого совета Д.002.229.01 при Институте высоко молекулярных соединений РАН по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан 23 января 2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физ.-мат. наук

Н. А. Долотова

2004-4 19958

Актуальность работы. В последнее время высокомолекулярные соединения получают все большее распространение в новых биомедицинских технологиях, в частности, в генной терапии, одной из главных задач которой является создание носителей ДНК для систематической доставки чужеродных генов в клетки определенного видз. Ряд недостатков вирусных носителей, в частности, возможность сильного иммунного ответа, делает очень важным развитие невирусных методов доставки ДНК в клетку. Перспективными с этой точки зрения могут, быть искусственные макромолекулярные системы, состоящие из синтетических поликатионных носителей и ДНК. При использовании пептидных носителей многообещающим является синтез многофункциональных пептидов (в том числе с дендримерной структурой), которые позволяют сочетать защитные и транспортные функции.

Целью данной работы являлся сшггез новых олигомерных соединений, как потенциальных носителей ДНК, на основе катионных олигопептидов с теоретически рассчитанной структурой, в том числе, модифицированных гидрофобными остатками каприновой (декановой) кислоты, что может как усилить их взаимодействие с внешней поверхностью клеточной мембраны, так и способствовать освобождению из эндосом их комплексов с ДНК, а также синтез носителей на основе фрагмента 48-60 белка Tat вируса иммунодефицита человека, по литературным данным обладающего способностью проникать через мембраны клетки и накапливаться в ядре. Звездообразная структура носителей с наличием нескольких таких фрагментов, а также введение лигандов для связывания с рецепторами на поверхности клетки может усилить эти свойства и способствовать более эффективной защите ДНК от ферментативного расщепления и целевой доставке в ядро клетки- Работа предусматривала изучение конформационных характеристик сгаггезироваиных носителей и изменения структуры ДНК при взаимодействии ДНК-пеггтид с помощью метода кругового дихроизма. Образование комплексов носитель-ДНК и защита нуклеиновой кислоты от действия гидролитических ферментов были изучены с помощью гель-электрофореза. Большое внимание в диссертации уделено исследованию способности синтезированных пептидов нарушать целостность

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

СПт, г де

VfcP/JL

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

биологических мембран (эритроцитарных и эндосомальных) и влиянию на протекание биохимических реакций в клетке на примере аденилатциклазной системы, что обычно упускается из внимания при создании и исследовании носителей.

Научная новизна- работы заключалась в теоретическом поиске наиболее оптимальных структур ДНК-связывающих пептидов и синтезе новых катиониых олигопептидов, гидрофильно-гидрофобный баланс которых варьировался от сильно гидрофобного пептида со структурой, способствующей формированию амфипатической а-спирали, до гидрофильных димеров и звездообразных тетрамеров на основе фрагмента HTV-1 Tat (48-60). Изучетше свойств синтезированных соединений показало зависимость содержания а-спиральиой конформации в структуре пептидов и увеличение размеров их комплекса с ДНК от гидрофобности пептида. Кроме того, было обнаружено, что переход от линейной структуры пептида к звездообразной, а также введение лиганда GRGDS, способного обеспечить специфическое связывание с рецепторами на поверхности клетки, резко меняет структуру пептида и его комплекса с ДНК. Впервые было рассмотрено влияние катионных олигопептидов - носителей ДНК - на протекание биохимических процессов в клетке на примере аденилатциклазной системы и был обнаружен рост базальной активности аденилатциклазы с увеличением гидрофобности пептидов, что можно объяснить усилением их взаимодействия с мембраной клетки. Эти данные подтверждаются также ростом гемолитической активности более гидрофобных пептидов и ярко выраженной способностью амфипатического олигопептида к проникновению через эндосомальную мембрану и их следует принимать во внимание при создании поликатионных носителей ДНК и других биологически активных веществ.

Эти результаты составляют основу выносимых на защиту диссертации положений.

Практическая значимость работы: в результате проведенной работы был синтезирован ряд новых катионных атигопептидов, потенциальных носителей ДНК, и изучены их свойства. Поиск новых компактизующих пептидов, модификация их лигандами, позволяющими осуществлять направленный транспорт к определенным типам клеток и транспорт ДНК в их ядра, а также поиск эндосомолитических

кошактизующих пептидов, которые могут существенно повысить эффективность проникновения чужеродной ДНК в клетку и достигнуть уровня вирусных носителей, избавившись от присущих им недостатков, является одной из главных задач генной терапии. Исследование механизмов проникновения невирусных векторов в клетку, взаимодействия их с клеточными структурами и влияния на биохимические реакции, протекающие в клетке в их присутствии, позволяет определить направление этого поиска. Поэтому проведенная работа является значимой как с научной, так и с практической точки зрения.

Диссертация состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, касающейся данной проблемы, обсуждения результатов проведенной работы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, который включает 137 наименований. Работа изложена на 126 страницах и содержит 38 рисунков и 9 таблиц.

Работа выполнена как часть исследований, проводящихся в ИВС РАН по теме "Гидрофильные синтетические и природные полимеры, биологически активные соединения и материалы на их основе".

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на ряде всероссийских и международных конференций: International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems" (St Petersburg, June 3-7, 2002), 21й1 European Peptide Symposium (Sorrento, Italy, August 3 - September 6, 2002), 20"' Conference of European comparative endocrinologists (Bonn, Germany, August 26-30, 2002), 10-я Международная конференция студентов и аспирантов (Казань, 22-24 мая, 2001), 10й1 German-Russian Peptide Symposium (Friedrichroda, Germany, October 2-5, 2003), Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (Москва, 17-19 ноября, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 11 тезисов докладов и 2 статьи.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность диссертационной работы, определены ее цели, сформулированы научная новизна и практическая значимость.

Глава 2 Обзор литературы содержит литературные данные о структуре белков и олигопептидов, особенностях взаимодействия ДНК с поликатионными пептидами и основных требованиях, предъявляемых к олигопептидам как к носителям ДНК.

Глава 3 Обсуждение результатов

3.1 Сшггез пептидов

Основные направления, по которым развивается поиск носителей ДНК при использовании синтетических пептидов - это создание амфипатических пептидов и липопептидов, модифицированных остатками гидрофобных кислот и стероидов, а также разветвленных структур на основе олигопептидных последовательностей, в том числе дендримерных, для усиления взаимодействия носителя как с ДНК, так и с мембранами, рецепторами и переносчиками макромолекул в клетке.

С учетом литературных данголх был синтезирован ряд олигопептидов на основе лизина с постепенным увеличением гидрофобности:

1Р1 С(Аст)- [К(С10)]-АЬх-УКАККККККК\¥К

ЕР4 С(Лст>АЬх-те[К(С10)]КК[К(С10)1ККК[К(С10)1КУК[К(С10)]КК

АЬх- е-амшогсксановая кислота,

Аст- ацетамидомегишая защитная группа остатка цистеша.

В случае пептида РР4 гидрофобные остатки находятся в положениях ¿Л+3(4)., что способствует появлению у структуры амфипатического характера - и является дополнительным фактором, способствующим спирализации. При этом образуется один гидрофобный сегмент, который не препятствует взаимодействию с ДНК (рис.1).

к к

к

к

Ah

Рис. 1. Распределение гидрофобных остатков пептида FP4 (проекция на плоскость, перпендикулярную оси а-спирали) (Edmundson wheel diagram).

С помощью полученных пептидов проследили изменение способности к связыванию ДНК и взаимодействия с мембранами клетки при переходе от катиониого пептида (FP), не содержащего гидрофобных радикалов, через пептид с одним остатком каприновой кислоты (FP1) к пептиду со структурой, способствующей формированию амфипатической -спирали с четырьмя гидрофобными фрагментами

Вторым важным рассмотренным в работе направлением в поиске носителей ДНК является синтез многофункциональных молекул с разветвленной структурой. Построепие дендримерной структуры на основе пептидов последовательным наращиванием полипептидной цепи имеет определенные сложности, связанные с синтезом и дальнейшей очисткой полученных высокомолекулярных соединений. Альтернативным путем является синтез с использованием небольших фрагмйггов, соединяемых далее в одну большую молекулу.

В качестве такого фрагмента был выбран фрагмент 48-60 пептидной. последовательности белка Tat вируса иммунодефицита человека (GRKKRRQRRRPPQ), который представляет собой сигнал ядерной локализации и обладает способностью к проникновению через мембраны клеток и транспорту в ядро. В данной работе был синтезирован димер на основе лизина, имеющий два фрагмента который был также модифицирован

лигандом, содержащим последовательность арттн-глицин-аспарагиновая кислота

(GRGDS) для специфического связывания с поверхностью клетки (RN2). Данные димеры служили основой для синтеза тетрамерной звездообразной структуры (N4 и RN4) !(рис. 2).

Для сгаггеза пептидов был использован твердофазный метод. В случае пептидов FP, FP1 И FP4 в растущую полипептидцую цепь вводили предварительно синтезированный а-1рсх^упиоксикарб01пс1-е-дека110иллизин. Аналогичным образом твердофазным методом с использованием BOC/Bzl стратегии были получены димеры на основе HIV-1 Tat (48-60). На месте разветвления в патипептидную цепь вводился ди(трет-бутилоксикарбонилл)лизин, что делало возможным удвоение последовательности растущего пептида.

GRKKRRQRRRPPQ \

GÄGMGRKKRRQRRRPPQ

\

K-e-Ahx-C(Acm) /

K-e-Ahx-C(Acm)

/

GRKKRRQRRRPPQ

GÄGZXSGRKKRRQRRRPPQ

N2

RN2

GRKKRRQRRRPPQ \

QPPRRRQRRKKRG /

K-&-Ahx-C-C-£-Ahx-K

/

GRKKRRQRRRPPQ

\

QPPRRRQRRKKRG

N4

GÄGDSGRKKRRQRRRPPQ \

QPPRRRQRRKKRGSÖGÄG /

K-e-Ahx-C-C-e-Ahx-K

/

GÄGÜSGRKKRRQRRRPPQ

\

QPPRRRQRRKKRGSDGÄG

RN4

Рис. 2. Пептиды на основе фрагме1гга HIV-I Tat (48-60).

Тетрамеры фрагмента IITV-1 Tat (48-60) были получены с помощью образования дисульфидпой связи между С-концевыми остатками цистеина днмеров. Вследствие большого количества побочных продуктов при непосредственном окислении пептидов N2 и RN2 с защищешшш остатком цистеина действием йода, Лет-группа была предварительно удалена с помощью раствора ацетата двухвалентной ртути. При этом анализ продукта реакции методом обращенно- фазовой ВЭЖХ показал наличие смеси димера со свободной SH-группой с тетрамером, образовавшимся вследствие частичного окисления SH-группы цистеина кислородом воздуха. Полученная смесь димера и тетрамера использовалась для полного окисления раствором йода в уксусной кислоте. Исходные соединения (N2 и RN2) и продукты реакции (N4 и RN4) имели одинаковый аминокислотный состав. Однако, масс-спектрометрический анализ подтвердил удвоение молекулярной массы полученных соединений.

3.2 Изучение вторичной структуры пептидов методом кругового дихроизма.

Дтя изучения структурных характеристик сгаггезированшлх пептидов был использован метод кругового дихроизма (табл. 1).

Как видно из приведенных данных, введение гидрофобных фрагментов декановой кислоты приводит к резкому увеличению содержания сс-спирали даже в водной среде. Максимальное содержание ос-спирали пептиды имеют в 80%-иом трифторэтаноле.

При взаимодействии пептидов с ДНК наблюдаются конформационные изменения ее структуры - при увеличении содержания пептида в системе положительный пик в длинноволновой области (260-290 нм), соответствующий полосе поглощения ДНК, уменьшается по интенсивности и смещается в длинноволновую область (рис. 3-6). Для сравнения были получены спектры кругового дихроизма системы, содержащей ДНК и анионный пептид В отличие от остальных пептидов, подобного

явления в этом случае не обнаруживается, что говорит о его неспособности к взаимодействию с ДНК. При увеличении концентрации пептида в системе происходит исчезновение полосы поглощения ДНК, свидетельствующее об образовании крупных агрегатов комплекса FP-ДНК, FPl-ДНК и РР4-ДПК и дальнейших изменений в спектрах нуклеиновой кислоты не наб:подается.

Табл. 1. Содержание различных форм вторичной структуры синтезированных пептидов.

РР Б? ЕР1 ГР1 ГР4 ГР4

80% 0,01Ы 80% 0,01Ы 80% о,ош

ТТЕ,% ЫаОН,% ТРЕ,% N3011,% '1ТН,% N3011,%

а-спираль 24,4± 5,4 6,7± 4,8 70,4± 4,8 25,1± 5,3 63,1± 4,6 27,7± 4,6

р-складАП" 16,7 33,1 3,3 18,7 3,6 10,3

р-склад.1ЪЧ" 5,7 5,3 2,8 6,3 3,3 10,2

Р-изгиб 17,4 22 12 17,5 14,7 17,9

Нсупоряд. 34,7 35,7 13,7 34,2 13,4 35,9

Сумма 99.0 98,7 101,8 101,7 96,6 102,0

N2 80% ТБЕ,% N2 0,0Ш ЫаОН,% N2 Вода,% 1«Ч2 80% ТРЕ,% RN2 0,0Ш N3011,% Ю*2 Вода,%

а-спираль 55,8± 6,6 4,6± 6,4 3,9+ 6,2 21,8+ 6,4 7,1+ 6,4 10,6± 6,2

Р-склад.АП* 4,2 38,3 24,2 9,6 32,5 30,7

З-склад."-4" 5,1 5,2 2,4 4,9 5,3 4,8

Р-ИЗГИб 11,8 21,2 35,8 32,6 20,4 25,8

Неупоряд. 19,1 34,9 41а 31,3 34,8 30,7

Сумма 95,9 104,2 107,4 100,2 100,3 102,5

N4' 80% ТТЕ,% N4 0,0Ш ЫаОН,% N4 Вода,% ШЧ4 80% ТТЕ,% К>4 0,0 ш ЫаОН,% ЮЧ4 Вода,%

а-спираль 6,0± 6,4 5,2+ 6,4 4,9± 6,2 13Д± 6,4 10,1± 6,5 14,1± 6,2

р-склад."11" 32,8 35,9 29,7 17,6 34,5 25,8

р-склад."-4" 5 Л 5,2 за 5,1 5,9 5,0

р-изгиб 23,1 21,7 28,5 30,8 17,7 26,6

Нсупоряд. 35,1 34,9 38,6 35,3 35,3 29,7

Сумма 102,1 103,0 104,9 102,0 103,4 101,1

*антипараллелъная * *параллельная

IS

Содержание а-спирали в случае пептидов па основе фрагмента HIV-1 Tat (48-60) значительно только в случае N2 - около 50% - в основном все пептиды имеют ß-складчатую структуру с довольно высокой неупорядоченностью. Введение в пептид N2 небольшого фрагмента из 5 аминокислот (GRGDS) (пептид RN2) приводит к значительному уменьшению содержания а-спир&чи в его структуре, а сдваивание молекул вызывает появление -структуры. Сдваивание же молекулы пептида RN2 на пространственную организацию влияет не так сильно, как у N2.

Посте полной нейтрализации заряда ДНК пептидами N2 и RN2 и образования крупных агрегатов комплекса, при дальнейшем увеличении содержания пептида в системе, в отличие от пептидов FP, FP1 и FP4, происходит частичное возвращение полосы поглощения ДНК в первоначальное положение, что может свидетельствовать о диссоциации первоначально образовавшихся крупных агрегатов. В случае, же тетрамеров N4 и RN4 исчезновения полосы поглощения ДНК и образования крупных агрегатов комплексов вообще не наблюдается, однако, по данным спектров КД, они имеют различную структуру. Из полученных данных можно сделать вывод, что введение даже небольшого фрагмента из 5 аминокислот (GRGDS), обеспечивающего специфическое связывание с поверхностью клетки, резко меняет как структуру пептида, так И' структуру его комплекса с ДНК, что может существенно влиять на проникновение ДНК в клетку и ее дальнейшую экспрессию.

3.3 Исследование структуры и размеров комплексов синтезированных пептидов с ДНК методом электронной микроскопии.

Более полная информация о форме и размерах этих комплексов пептидов с ДНК была получена с помощью метода - просвечивающей электронной микроскопии. Размеры комплексов варьировали в широких пределах - от 15-30 нм до 50-100 нм, что совпадает с диапазоном размеров комплексов с литературными данными по использованию других компактизующих соединений (например, полилизина). Пептиды, модифицированные гидрофобными фрагментами, образуют с ДНК довольно большие комплексы, с агрегированной структурой, что может являться препятствием для проникновения их в клетку. По мере уменьшения количества гидрофобных остатков размеры частиц также уменьшаются. Наиболее мелкие

структуры образует тетрамерный пептид ИЧ4. При этом обнаруживаются как отдельные частицы комплекса, так и их агрегаты.

3.4 Исследование комплсксообразоваиия и защиты ДИК от иуклеазного расщепления методом гель-электрофореза. Поликатионные пептиды при образовании комплекса нейтрализуют отрицательный заряд ДНК, что сопровождается изменением ее электрофоретической подвижности (рис. 7).

Рис. 7. Гель-ретардация комплексов ДНК/FP (А) и ДНК/FPl (В) при различном зарядовом соотношении (К - нативная ДНК).

Полная задержка ДНК в случае пептида FP4 наблюдается при зарядовом соотношении ДНК/носитель 1/1 и выше, а пептиды FP и FP1 связывают ДНК уже в соотношении 1/0,7. Следует отметить, что при увеличении концентрации FP1 свечение комплексов в лунках уменьшается, что, видимо, означает увеличение их гаотности. При этом образующиеся комплексы ДНК-пептид становятся непроницаемыми для бромистого этидия, шггеркатирующего красителя, который использовался для обнаружения ДНК. Комплексы же с FP и FP4, как и в случае пептидов на основе фрагмента HIV-1 Tat (48-60), в достаточной степени «рыхлые» для его проникновения, и затухания флуоресценции комплекса не происходит.

При изучешш устойчивости комплексов плазмидной ДНК с пептидами к ферментативному гидролизу было обнаружено, что ее полная защита от действия ДНКазы I происходит при более высоком содержании пептидов в комплексе, чем необходимо для полной компактизащщ ДНК Однако для разветвленных пептидов

1/0.11/0.3 1/0.5 1/0.7 1/1 К

К 1/0.1 1/0.3 1/0.5 1/0.7 1/1 В

А

N4 и КМ эффективная защита наблюдается при том же соотношении, что и полная задержка плазмиды в геле.

Таким образом, исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза подтверждает данные, полученные методами кругового дихроизма и электронной микроскопии об особой структуре комплексов пептидов с разветвленной структурой по сравнению с линейными пептидами. Тем не менее, все пептиды обнаруживают способность к компактизапии и защите нуклеиновой кислоты от ферментативного гидролиза при довольно низком соотношении пептид/ДНК и могут являться носителями ДНК для ее доставки в клетку.

3.5 Исследование гемолитической активности пептидов.

Важным этапом работы являлось исследование взаимодействия полученных соединений с мембранами. В качестве модельных были выбраны мембраны эритроцитов, которые широко используются для изучения белково-липидных взаимодействий. Для сравнения при изучении гемолитической активности полученных пептидов использовался порообразующий пептид 1^-1, добавление которого в комплекс носителя с ДНК способствует освобождению комплекса из эндосом.

Н, %

1--

-0.06 0.00 0.09 0.10 0.15 0.20 0.26 0.30 0.36 0.40 0.45

С, шМ

Рис. 8. Гемолитическая активность пептидов.

Как видно из приведенных данных (рис. 8), гемолитическая активность находится в зависимости от гидрофобности пептидов и pH среды. С увеличением гидрофобности гемолитическая активность возрастает: FP4 « JTS-1 > FP1 > FP » N2, N4, RN2, RN4. При этом было обнаружено, что пептид FP и пептиды на основе фрагмента HTV-1 Tat (48-60) на мембраны эритроцитов влияния не оказывают, а пептид FP1 вызывает их агглютинацию (склеивание), что, вероятно, обусловлено возможностью встраивания в мембрану за счет гидрофобного фрагмента и нейтрализацией суммарного отрицательного заряда ее внешней поверхности. Максимальную гемолитическую активность показали пептиды FP4 и JTS-1. Однако такое действие проявляется при разных рН среды (рН 5,0 для FP4 и рН 7,8 для JTS-1). Таким образом, в данном случае способность пептидов к взаимодействию с мембраной зависит в большей степени не от спиральности (в кислой среде пептиды, модифицированные остатками декановой кислоты, практически не спирализованы), а от отсутствия их агрегации.

Таким образом, можно предполагать, что по способности проникновения через мембраны клетки пептиды и их комплексы с ДНК располагаются таким же образом:

то есть по увеличению гидрофобности и

спирализации.

3.6 Исследование эпдосомолитических свойств пептидов FP1 и ГР4.

Дтя исследования эндосомолитических свойств пептидов FP1 и FP4 был проведен ряд экспериментов, in vitro по доставке плазмидной ДНК комплексами ДНК/носитель как в присутствии хлорокина, так и без него. Это соединение широко используется для изучешм механизма проникновения комплексов в цитоплазму клетки и его действие заключается в основном в нарушении процесса закисления эндосом и тем самым в препятствии действию гидролитических ферментов. Обработка клеток хлорокином позволяет более полно проявиться собственным эндосомолитическим свойствам носителя. Добавление в систему хлорокина обнаруживает резкое отличие пептида FP4 от пептида FP1. Было показано, что присутствие хлорокина увеличивает эффективность трансфекции комплексом ДШС/FPl с 0,08±0,02% до 5,15±О,31%. На эффективность проникновения в клетку комплекса ДНК/РР4 хлорокин, напротив, действия почти не оказал (рис. 9).

На основании полученных результатов можно предположить наличие у амфипатического пептида РР4 собственных эндосомолитических свойств, которые выражены значительно более ярко, по сравнению с пептидом РР1, что согласуется с результатами экспериментов но гемолизу эритроцитов.

Рис. 9. Оценка - эффективности трансфекции клеток HeLa в зависимости от зарядовых соотношений комплексов ДНК/FPl и ДНК/РР4 в присутствии и отсутствии хлорокина.

3.7 Взаимодействие пептидов с адепилатциклазной системой клетки.

При синтезе носителей ДНК и изучении процесса проникновения невирусных векторов в клетку основное внимание уделяется, в основном, лишь увеличению эффективности проникновения ДНК в клетку я подбору условий для ее максимальной экспрессии. Однако открытым остается вопрос о побочных действиях катионных носителей на В11утриклеточные структуры и биохимические процессы, происходящие в клетке.

В данной работе было исследовано влияние синтезированных катионных пептидов на базальную активность фермента аденилатциклазы, то есть количество, циклического аденозинмонофосфата, вырабатывающегося в клетках в отсутствие внешнего воздействия (рис. 10).

При введении в систему пептидов РР, РР1 и РР4 базальная активность аденилатциклазы заметно повышается, проходя через максимум, что связано,

вероятно, с повышением общей концентрации циклического аденозинмонофосфата в системе и торможением его синтеза. В отличие от этого, пептиды на основе фрагмента HTV-1 Tat (48-60) практически никакого эффекта на базальную активность адештатниклазы не оказывают, несмотря на увеличение содержания катионных аминокислот и общего положительного заряда.

7 в 5 4 3

•to8[Cl

Рис. 10. Влияние синтезированных катионных олигопептидов на базальную активность аденилатциклазы.

Таким образом, увеличение активности пептидов в данном тесте происходит одновременно с увеличением их гидрофобности и спиральности (N2, N4, RN2, RN4<FP<FP1<FP4).

Полученные данные могут объяснить появление в ряде случаев токсичности подобного рода носителей при увеличении содержания их в комплексе с ДНК, что, вероятно, является одной из причин гибели клеток. Эти результаты следует учитывать при выборе структуры поликатиона и дальнейшей работе по созданию невирусных носителей чужеродных генов и терапевтических средств на их основе.

Глава 4 Экспериментальная часть содержит характеристики исходных реагентов, методики синтеза и исследования полученных соединашй.

Глава 5 Выводы.

1. С учетом литературных данных и теоретических расчетов, синтезирован ряд новых катионных олигопептидов, носителей ДИК, гадрофилыю-гадрофобпый баланс которых варьировался от сильно гидрофобного пептида (FP4) со структурой, способствующей формированию амфипатической а-спирали, до гидрофильных димеров и тетрамеров звездообразной структуры на основе фрагмента 48-60 белка Tat вируса иммунодефицита человека

2. Синтез димерной и тетрамерной. форм фрагмента 48-60 белка Tat вируса иммунодефицита человека был проведен по оригинальной методике, позволившей получить эти пептиды с высокой степенью чистоты.

3. При изучении с помощью гель-электрофореза (метод ретардации) комплексов пептидов с ДНК было показано, что все синтезированные пептиды способны как к связыванию и компактизации ДНК, так и к ее эффективной защите от ферментативного гидролиза.

4. Изучение вторичной структуры синтезированных пептидов методом кругового дихроизма показало увеличение а-спиральности при возрастании их гидрофобности. Переход от димерной к тетрамерной форме пептидов, фрагментов белка вируса иммуподефицита человека, а также введение лиганда GRGDS но данным кругового дихроизма резко меняет структуру пептида и его комплекса с ДНК.

5. С помощью метода электронной микроскопии было показано, что увеличение гидрофобности пептидов приводит к увеличению размеров комплекса пептида с ДНК.

6. Показано, что более гидрофобные пептиды обладают способностью разрушать биологические мембраны.

7. Впервые на примере адешлатциклазной системы было рассмотрено влияние катионных атигопептидов - носителей ДНК - на протекание биохимических процессов в клетке. Был обнаружен рост базальной активности аденилатциклазы с увеличением гидрофобности пептидов. В то же время гидрофильные, катионные пептиды аденилатцитклазную систему не активируют. Эти данные следует принимать во внимание при создании новых поликатиогашгх носителей ДНК и других биологически активных веществ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. I Guryanov, E. Vlasova, V. Korolicov, G. Vlasov, A. Kiselcv, E. Lesina, V. Baranov, E.

Avdeeva, E. Chihirgina, V. Varob'ev. Synthesis of amphipatic a-helical peptides with different contents and disposition of lipophilic fragments and their interaction with DNA and membranes of erythrocites. 4th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems" Si Petersburg, June 3-7,2002, P. 182

2. I. Guryanov, V. Korol'kov, G. Vlasov, A. Kiselev, E. Lesina, V. Baranov E. Avdeeva, E. Chihirgina, V. Vorob'ev. Synthesis of amphipatic a-helical peptides modified with hydrpophobic fragments and their interaction with DNA and erythrocites. Proc. of27th European Peptidc Symposium., Sorrento, Italy, August 31- September 6,2002, P. 764

3. Shpakov A. O., Korol'kov V. I, Guryanov I. A., Plesneva S. A., Kuznetsova L. A., Vlasova E. N., Vlasov G. P. The regulatory influence of the cationic helical peptides on the functional activity of the protein kinase A in the tissues of rat and mollusc. Proc. of20* Conference ofEuropean comparative endocrinologists, Bonn, Germany, August26-30,2002,P. Ill

4. И. А. Гурьянов, А. В. Киселев, В. И. Корольков, В. С. Баранов, Г. П. Власов. Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений. 10 Международная конференция студентов и аспирантов. Казань, 22-24 мая, 2001

5. A. Kiselev, E. Lesina, L Guryanov, A. Baranov, V. Korol'kov, G. Vlasov, V. Baranov. Development ofa new non-viral peptide vehicle for DNA delivery. 9 Annual meeting of ESGT, Turkey, Antalya, November 2-4,2001, P. 87

6. Г. П. Власов, И. А. Гурьянов, И. И. Тарасенко, Н. В. Баянова, Г. А. Панкова, В. И. Воробьев, Е. В. Авдеева, Е. В. Чихиржина. Синтез и изучение образования комплексов ДНК сгаггетическими невирусными носителями. Цитология. 2003. Т. 45. №9. С. 857

7. Шпаков А О., Гурьянов И. А., Власова Е. IL, Кузнецова Л. А., Плеснева С. А., Перцева М. Н., Власов Г. П. Разобщение функционального сопряжения рецепторов и ГТФ-связывающих белков катионными пептидами, содержащими

. гидрофобные радикаты. Цитология. 2003. Т. 45. №9. С. 948-949

8. Шпаков А. О., Корольков В. II, Гурьянов И. А., Власова Е. Н., Плеснева С. А., Кузнецова Л.А, Власов Г.П., Перцева М.Н. Регуляция синтетическими спиралеобразующими пептидами с различным распределением заряженных аминокислот и гидрофобных радикалов функциональной активности протеинкиназы А в мозге и скелетных мышцах крыс. Психофармакология и биологическая наркология. 2002. Т. 2. №3-4. С. 469

9. Shpakov A., Guryanov L, Korol'kov V. The involvement of helical cationic peptides with hydrophobic ClO-radicals in receptor-G protein interaction. The FEBS Journal.

2003.V.270. Suppl. 1.P.51

10. G. Vlasov, I. Guryanov, G. Pankova, L Tarasenko, N. Bajanova, O. Charenko, A. Zhukov, V. Baranov, A Kiselev, E. Lesina, V. Vorob'ev, E. Avdeeva, E. Chihirdghina. Synthesis and comparative study of carriers for DNA targeted delivery. 10th German-Russian Peptide Symposium. Germany, Friedrichroda. October 2-5,2003.

11. Шпаков А. О., Гурьянов И. А., Власова Е. Н., Корольков В. И., Кузнецова Л. А., Плеснева С. А., Власов Г. П., Перцева М. Н. Ингибирование сюггетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность адснилатциклазной сигнальной системы. Доклады Академии наук. 2003. Т. 389. №1. С. 127-130

12. Шпаков А. О., Гурьянов И. А, Воробьев В. И., Кузнецова Л. А., Плеснева С. А., Чубей Н. М., Перцева М. Н., Власов Г. П. Разобщающее влияние катионных пептидов, содержащих гидрофобные радикалы, на функциональное сопряжение рецепторов серпантинного типа с ПФ-связываюшими белками. Цитология.

2004. Т. 46. №3. С. 268-276

13. Гурьянов И. А., Лесина Е. А., Киселев А. В., Авдеева Е. В., Шпаков А. О., Власов Г. П., Баранов В. С, Воробьев В. И. Синтез новых олигопептидов звездообразной структуры на основе HTV-1 Tat (48-60) и возможность их использования для доставки ДНК в клетки. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Москва. 2003. Тезисы стендовых сообщений. С. 18

Бесплатно

»- 238 Г

РНБ Русский фонд

2004-4 19958

Автореферат отпечатан в ИВС РАН. Ризография. Тираж 100 экз.

Список используемых в тексте сокращений и терминов.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Молекулярная структура белков и олигопептидов.

2.1.1 Взаимодействие амфипатических олигопептидов с мембранами.

2.2 Проникновение невирусных векторов в клетку.

2.2.1 Комплексообразование и компактизация ДНК.

2.2.2 Связывание с поверхностью клетки. г^ 2.2.3 Транспорт в ядро клетки.

2.3 Носители ДНК в генной терапии.

2.3.1 Использование катионных липидов в качестве носителей ДНК.

2.3.2 Катионные полимеры как носители ДНК.

2.3.3 Использование катионных олигопептидов как носителей ДНК.

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1 Синтез пептидов.

3.1.1 Синтез пептидов РР, РР1 и РР4.

3.1.2 Синтез пептидов N2 и

3.1.3 Синтез пептидов N4 и ЯЖ.

3.2 Изучение вторичной структуры пептидов методом кругового дихроизма.

3.3 Исследование структуры и размеров комплексов синтезированных пептидов с ДНК методом электронной микроскопии.

3.4 Исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза.

3.5 Исследование гемолитической активности пептидов.

3.6 Исследование эндосомолитических свойств пептидов

FP1 и FP4.

3.7 Взаимодействие пептидов с аденилатциклазной системой клетки.

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

14 4.1 Материалы.

4.2 Оборудование.

4.3 Методы.

4.3.1 Синтез пептидов FP, FP1, FP4, JTS-1, N2, RN2, N4, RN4.

4.3.2 Спектроскопия кругового дихроизма.

4.3.3 Электронная микроскопия комплексов пептид- ДНК.

4.3.4 Получение комплексов пептид-ДНК и изучение их устойчивости к ферментативному расщеплению методом гель-ретардации (DNase I protection assay).

4.3.5 Определение гемолитической активности.

4.3.6 Оценка эффективности трансфекции комплексами пептид pCMV-nlsLacZ.

4.3.7 Изучение влияния пептидов на аденилатциклазную систему.

5 ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. В последнее время высокомолекулярные соединения получают все большее распространение в новых биомедицинских технологиях, в частности, в генной терапии, целью которой является коррекция нарушений функционирования генома при помощи двух основных подходов: 1) замены дефектного участка генома нормальным и 2) введения в организм функционально активных генов, продуцирующих необходимые белки или гормоны, либо олигодезоксирибонукпеотидов, регулирующих функциональную активность целевых генов [1-2]. Наиболее распространенным в современной генотерапии способом введения в клетки и ткани терапевтических генов является использование рекомбинантных вирусных векторов, которые обеспечивают высокую эффективность трансфекции, то есть проникновения чужеродного гена. Однако у вирусных векторов есть ряд недостатков. Очень часто они вызывают иммунный ответ, вследствие чего проведение повторных курсов лечения затруднено. Такие векторы также могут встраиваться в геном, что может привести к повреждению других генов. Размер ДНК, которая может быть включена в состав вирусных векторов, ограничен. Кроме того, стоимость их довольно высока и может достигать в настоящее время 200-500 тысяч долларов [3]. Сообщение о смерти одного из пациентов при введении рекомбинантного аденовирусного вектора [4] существенно затормозило все клинические испытания с использованием вирусных векторов и привлекло внимание к поиску новых методов доставки ДНК в клетки и применению невирусных систем, моделирующих отдельные этапы проникновения в клетку вирусов, в том числе полностью синтетических векторов для систематической доставки генов.

Физические методы введения в клетку чужеродного гена (электропорация, бомбардировка микрочастицами с нанесенной на них ДНК и т.д.) не могут широко использоваться из-за низкой выживаемости клеток и невысокой эффективности - только в отдельных клетках, подвергнутых обработке, введенная ДНК оказывается способной к экспрессии, то есть к считыванию гена и синтезу соответствующего белка. Непосредственная инъекция в ядро хоть и является более эффективной [5], не может быть применена в условиях in vivo. Более перспективными являются искусственные макромолекулярные системы, состоящие из синтетических катионных носителей и ДНК. Идеальная система для невирусной доставки ДНК должна:

1) быть структурно хорошо охарактеризованной, нетоксичной, биодеградируемой системой, которая защищает ДНК от действия нуклеаз, t

2) обеспечивать доставку ДНК к определенным типам клеток, то есть иметь лиганд для связывания со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны данного типа клеток,

3) способствовать быстрому pH-зависимому освобождению комплекса из эндосом (клеточных образований, куда попадают из внешней среды крупные частицы и высокомолекулярные соединения) и транспорту ДНК в ядро клетки.

При использовании пептидных носителей ДНК многообещающим является синтез многофункциональных пептидов (в том числе с дендримерной структурой), которые позволяют выполнять несколько вышеупомянутых функций одновременно.

Целью данной работы являлся синтез новых олигомерных соединений, как потенциальных носителей ДНК, на основе катионных олигопептидов с теоретически рассчитанной структурой, в. том числе модифицированных гидрофобными остатками каприновой (декановой) кислоты, что позволяет как усилить их взаимодействие с внешней поверхностью клеточной мембраны, так и способствовать освобождению из эндосом их комплексов с ДНК, а также синтез носителей на основе фрагмента пептидной последовательности вируса иммунодефицита человека HIV-1 Tat (48-60), по литературным данным обладающего способностью проникать через мембраны клетки и накапливаться в ядре. Звездообразная структура носителей с наличием нескольких таких фрагментов, а также введение лигандов для связывания с рецепторами на поверхности клетки может усилить эти свойства и способствовать более эффективной защите ДНК от ферментативного расщепления и целевой доставке в ядро клетки. Диссертация предусматривала изучение конформационных характеристик синтезированных носителей и изменения структуры ДНК при взаимодействии ДНК-пептид с помощью метода кругового дихроизма. Образование комплексов носитель-ДНК и защита нуклеиновой кислоты от действия гидролитических ферментов также были изучены с помощью гель-электрофореза. Большое внимание в диссертации уделено исследованию способности синтезированных пептидов нарушать целостность биологических мембран (эритроцитарных и эндосомальных) и влиянию на протекание биохимических реакций в клетке на примере аденилатциклазной системы, что обычно упускается из внимания при создании и исследовании носителя.

Научная новизна работы заключалась в теоретическом поиске наиболее оптимальных структур ДНК-связывающих пептидов и синтезе новых катионных олигопептидов, гидрофильно-гидрофобный баланс которых варьировался от сильно гидрофобного пептида со структурой, способствующей формированию амфипатической а-спирали, до гидрофильных димеров и звездообразных тетрамеров на основе фрагмента 48-60 белка вируса иммунодефицита человека. Изучение свойств синтезированных соединений показало зависимость содержания а-спиральной конформации в структуре пептидов и увеличение размеров их комплекса с ДНК от гидрофобности пептида. Кроме того, было обнаружено, что переход от линейной структуры пептида к звездообразной, а также введение лиганда 01ЮВ8 резко меняет структуру пептида и его комплекса с

ДНК. Впервые было рассмотрено влияние катионных олигопептидов -носителей ДНК — на протекание биохимических процессов в клетке на примере аденилатциклазной системы и был обнаружен рост базальной активности аденилатциклазы с увеличением гидрофобности пептидов, что можно объяснить усилением их взаимодействия с мембраной клетки. Эти данные подтверждаются также ростом гемолитической активности более гидрофобных пептидов и ярко выраженной способностью амфипатического олигопептида к проникновению через эндосомальную мембрану и их следует принимать во внимание при создании поликатионных носителей ДНК и других биологически активных веществ.

Эти результаты составляют основу выносимых на защиту диссертации положений.

Практическая значимость работы: в результате проведенной работы был синтезирован ряд новых катионных олигопептидов, потенциальных носителей ДНК, и изучены их свойства. Поиск новых компактизующих пептидов, модификация их лигандами, позволяющими осуществлять направленный транспорт к определенным типам клеток и транспорт ДНК в их ядра, а также поиск эндосомолитических компактизующих пептидов, которые могут существенно повысить эффективность проникновения чужеродной ДНК в клетку и достигнуть уровня вирусных носителей, избавившись от присущих им недостатков, является одной из главных задач генной терапии. Исследование механизмов проникновения невирусных векторов в клетку, взаимодействия их с клеточными структурами и влияния на биохимические реакции, протекающие в клетке в их присутствии, позволяет определить направление этого поиска. Поэтому проведенная работа является значимой как с научной, так и с практической точки зрения.

Диссертация состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, касающейся данной проблемы, обсуждения результатов проведенной работы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, который включает 137 наименований.

Работа выполнена как часть исследований, проводящихся в ИВС РАН по теме "Гидрофильные синтетические и природные полимеры, биологически активные соединения и материалы на их основе". и

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5 ВЫВОДЫ

1. С учетом литературных данных и теоретических расчетов, синтезирован ряд новых катионных олигопептидов, носителей ДНК, гидрофильно-гидрофобный баланс которых варьировался от сильно гидрофобного пептида (FP4) со структурой, способствующей формированию амфипатической ос-спирали, до гидрофильных димеров и тетрамеров звездообразной структуры на основе фрагмента 48-60 белка Tat вируса иммунодефицита человека.

2. Синтез димерной и тетрамерной форм фрагмента 48-60 белка Tat вируса иммунодефицита человека был проведен по оригинальной методике, позволившей получить эти пептиды с высокой степенью чистоты.

3. При изучении с помощью гель-электрофореза (метод ретардации) комплексов пептидов с ДНК было показано, что все синтезированные пептиды способны как к связыванию и компактизации ДНК, так и к ее эффективной защите от ферментативного гидролиза.

4. Изучение вторичной структуры синтезированных пептидов методом кругового дихроизма показало увеличение а-спиральности при возрастании их гидрофобности. Переход от димерной к тетрамерной форме пептидов, фрагментов белка вируса иммунодефицита человека, а также введение лиганда GRGDS по данным кругового дихроизма резко меняет структуру пептида и его комплекса с ДНК.

5. С помощью метода электронной микроскопии было показано, что увеличение гидрофобности пептидов приводит к увеличению размеров комплекса пептида с ДНК.

6. Показано, что более гидрофобные пептиды обладают способностью разрушать биологические мембраны.

7. Впервые на примере аденилатциклазной системы было рассмотрено влияние катионных олигопептидов - носителей ДНК - на протекание биохимических процессов в клетке. Был обнаружен рост базальной активности аденилатциклазы с увеличением гидрофобности пептидов. В то же время гидрофильные катионные пептиды аденилатцитклазную систему не активируют. Эти данные следует принимать во внимание при создании новых поликатионных носителей ДНК и других биологически активных веществ.

1. Агат Kh., Aubertin А.-М., Roche А.-С., Monsigny М., Mayer R. Synthesis and antiviral activity of peptide-oligonucleotide conjugates prepared by using ^-(bromoacetyOpeptides. Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 573-577

2. Zauner W., Ogris M., Wagner E. Polylysine-based transfection systems utilizing receptor-mediated delivery. Adv. Drug Delivery Rev. 1998. V. 30. P. 97-113

3. Богданенко E. В., Свиридов Ю. В., Московцев А. А., Жданов Р. И. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии. Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 46. С. 226-245

4. Smaglik P. Gene therapy death may delay new trials. The Scientist. 1999. V. 13. P. 9-14

5. Capecchi M. R. High efficiency transformation by direct microinjektion of DNA into mammalian cells. Cell. 1980. V. 22. P. 479-483

6. Кнорре Д., Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. Москва. "Высшая школа". 1998

7. Никифорович Г. В., Галактионов С. Г., Чипенс Г. И. Конформациипептидных биорегуляторов. Москва. "Медицина". 1983

8. Терентьев А.П., Потапов В.М. Основы стереохимии. Москва. "Химия". 1964

9. Кочетков Н.К., Торгов И.В., Ботвиник М.М. Химия природных соединений. Москва. Издательство Академии Наук СССР. 1961

10. Hruby V., Udenfriend S., Meienhofer J. The peptides. Analysis, synthesis, biology. V.7. London. Academic press, Inc. 1985

11. Xiong H., Buckwalter B. L., Shieh H. M., Hecht M. N. Periodicity of polar and nonpolar amino acids is the major determinant of secondary structure in self-assembling oligomeric peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6349-6353

12. L-P. Liu, Sh.-Ch. Li, N. K. Goto, and Ch. M. Deber. Threshold hydrophobicity dictates helical conformations of peptides in membrane environments. Biopolimers. 1996. V. 39. P. 465-470

13. Honda S., Morii H., Uedaira H. Design of membrane protein consisting of a metal binding loop and a transmembrane helix. Proc. 23th EPS. 1994. P. 447

14. Tripet B., Zhou N., Sonnichsen F., Hodges R. S. Hybritein 1: A de novo designed protein displaying cooperative interactions between a metal-ion binding loop and a helix-helix dimerization motif. Proc. 23th EPS, 1994, P. 79

15. Renold P., Tsang K. Y., Shimizu L., Kemp D. S. For short alanine-lysine peptides the helical propensities of lysine residues (s values) are strongly temperature dependent. J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 12234-12235

16. Yumoto N., Murase S., Petukhov M. G., Yamamoto H., Tatsu Y., Taguchi T., Yoshikawa S. Effect of the N-terminal modification on the stability of cx-helix in the C-terminal fragment of neuropeptide Y. Proc. 23th EPS, 1994. P. 555

17. Marqusee S., Baldwin R. L. Helix stabilisation by Glu".Lis+ salt bridges in short peptides of de novo design. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987. V. 84. P. 8898-8902

18. Holtz J. S., Holtz J. H., Chi Z., Asher S. A. Ultraviolet raman examination ofthe environmental dependence of bombolitin I and bombolitin III secondary structure. Biophys. J. 1999. V. 76. №6. P. 3227-323

19. Ruan F., Chen Y., Hopkins P. B. Metal ion enhanced helicity in synthetic peptides containing unnatural, metal-ligating residues. J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 9403-9404

20. Ghadiri M. R., Feraholz A. K. Peptide architecture. Design of stable a-helical metallopeptides via a novel exchange-inert Ru3+ complex. J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 9633-9635 J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 9403-9404

21. Vogel H., Dhanapal B., Pawlak M., Meseth U., Eggleston., Mutter M. Membrane channel forming properties of melittin-TASP. Proc. 23th EPS, 1994, P. 449

22. Coraut I., Buttner K., Dasseux J-L., Dufourcq J. The amphipatic alpha- helix concept. Application to the de novo design of ideally amphipatic Leu, Lys peptides with hemolytic activity higher than the melittin. FEBS Letters. 1994. V. 349. P. 29-33

23. Niidome T., Anzai Sh., Sonoda J., Tokunaga Y., Nakahara M., Hatakeyama T., Ayoagi H. Effect of amino acid substitution in amphiphilic alpha- helical peptides on peptide-phospholipid membrane interaction. J. Pep. Sci. 1999. V. 5. P. 298-305

24. Ohmori N., Niidome T., Hatakeyama T., Mihara H., Aoyagi H. Interaction of alpha- helical peptides with phospholipid membrane: effects of chain length and hydrophobicity of peptides. J. Peptide Res. 1998. V. 51. P. 103-109

25. Blondelle S. E., Takahashi E., Houghten R. A., Perez-Paya E. Design of conformationally defined combinatorial libraries. Proc. 23th EPS, 1994, P. 85

26. Krause E., Rothemund S., Dathe M., Beyermann M., Mark-Kross L. J., Ennis M., Bienert M. Influence of amphipaticity and helicity on the peptide-induced mast cell activation. Proc. 23th EPS, 1994. P. 387

27. R. Epand, Y. Shai, J. Segrest, and G. M. Anantharamaian. Mechanisms for the modulation of membrane bilayer properties by amphipatic helical peptides. Biopolimers. 1995. V. 37. P. 319-338

28. Epand R., Shai Y., Segrest J., Anantharamaian G. M. Mechanisms for the modulation of membrane bilayer properties by amphipatic helical peptides. Biopolimers. 1995. V. 37. P. 319-338

29. Nir S., Nieva J. L. Interacton of peptides with liposomes: pore formation and fusion. Progress in lipid research. 2000. V. 39. P. 181-206

30. T. Niidome, M. Wakamatsu, A. Wada, T. Hirayama, and H. Aoyagi. Required structure of cationic peptide for oligonucleotide- binding and -delivering into cells. J. Pep. Sci. 2000. V. 6. P. 271-279

31. Ряднова И. Ю. Интерполимерные комплексы нуклеиновых кислот с белками. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. С-Петербург. 1999

32. Smith L. С., Duguid J., Manpreed S. W., Logan M. J., Tung Ch.-H., Edwards V., Sparrow J. T. Synthetic peptide-based DNA complexes for nonviral gene delivery. Adv. Drug Delivery Rev. 1998. V. 30. P. 115-131

33. De Smedt S. C., Demeester J., Hennink W. E. Cationic Polymer Based Gene Delivery Systems. Pharm. Res. 2000. V. 17. P. 113-126

34. Porschke D., Ronnenberg J. The reaction of aromatic peptides with double helical DNA. Quantitative characterization of a two step reaction scheme. Biophys. Chem. 1981. V.13. P. 283-290

35. Porschke D. Dynamics of DNA condensation. Biochemistry. 1984. V. 23. P. 4821-4828

36. Yaroslavov A. A., Sukhishvili S. A., Obolsky O. L., Yaroslavova E. G., Kabanov A. V., Kabanov V. A. DNA affinity to biological membranes is enhanced due to complexation with hydrophobized polycation. FEBS lett. 1996. V. 384. P. 177-180

37. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., Birnstiel M. L. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 3410-3414

38. Mervin J. R., Noell G. S., Thomas W. L. Targeted delivery of DNA using YEE(GalNAcAH)3 a synthetic glycopeptide ligand for the asialoglycoprotein receptor. Bioconjug. Chem. 1994. V. 5. P. 612-620

39. Niidome T., Urakawa M., Sato H., Takahara Y., Anai T., Hatakeyama T., Wada A., Hirayama T., Ayoagi H. Gene transfer into hepatoma cells mediated by galactose-modified alpha-helical peptides. Biomaterials. 2000. V.21.P. 1811-1819

40. Feero W. G., Li S., Rosenblatt J. D. Selection and use of ligands for receptor-mediated gene delivery to myogenic cells. Gene Therapy. 1997. V. 4. P. 664674

41. Wagner E., Zenke M. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 3410-3414

42. Gottschalk S., Cristiano R. G., Smith L. S., Woo S. L. Folate receptor mediated DNA delivery into tumor cells: potosomal disruption results in enhanced gene expression. Gene Therapy. 1994. V. 1 P. 185-191

43. Schneider H., Huse K., Birkenmeier G., Otto A., Scholz G. H., Gene transferimediated by a2-macroglobulin. Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3873-3874

44. Huckett В., Ariatti M., Hawtrey A. O., Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis. Stable expression following insulin-directed entry of NEO into HepG2 cells. Biochem. Pharm. 1990. V. 40. P. 253-263

45. Rosenkranz A. A., Yachmenev S. V., Jans D. A. Serebryakova N. V., Murav'ev V. I., Peters R., Sobolev A. S. Receptor- mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA construct Exp. Cell Res. 1992. V. 199. P. 323-329

46. Trubetskoy V. S., Torchilin V. P., Kennel S. J., Huang L., Use of N-terminal modified poly(L-lysine)-antibody conjugate as a carrier for targeted gene delivery in mouse lung endothelial cells. Bioconjug. Chem. 1992. V. 3. P. 323-327

47. Геннис P. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва. "Мир". 1997

48. Wang K., Guan T., Cheresh D. A., Nemerow G. R. Regulation of adenovirus membrane penetration by the cytoplasmic tail of integrin £5. J. Virology.2000. V. 74. P. 2731-2739

49. Nemerov G., Steward Ph. Role of av integrins in adenovirus cell entry and gene delivery. Microbiol. Molecular Biol. Rev. 1999. V. 63. P. 725-734

50. Scott E. S., Wiseman J. W., Evans M. J., Colledge W. H. Enhanced gene delivery to human airway epithelial cells using an integrin- targeting lipoplex. J. Gene Medicine. 2001. V. 3. P. 125-134

51. Jenkins R. G., Herrik S. E., Meng Q.-H., Kinnon C., Laurent G. J., McAnulty R. J., and Hart S. L. An integrin- targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy. Gene therapy. 2000. V.7. P. 393-400

52. Subramanian A., Ranganathan P., Diamond S. L. Nuclear targeting peptide scaffolds for lipofection of nondividing mammalian cells. Nature Biotechnology. 1999. V. 17. P. 873- 877

53. Cartier R., Reszka R. Utilisation of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems. Gene Therapy. 2002. V.9. P. 157-167

54. Pouton C. W. Nuclear import of polypeptides, polynucleotides and supramolecular complexes. Adv. Drug Delivery Rev. 1998. V. 34. P. 51-64

55. Reed M. W., Fraga D., Schwartz D. E., Scholler J., Hinrichsen R. D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide- antisense oligodeoxynucleotide conjugates. Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 101-108

56. Gariepy J., Kawamura K. Vectorial delivery of macromolecules into cells using peptide- based vehicles. Trends in Biotechnology. 2001. V. 19. P. 21-28

57. Chan C.-K., Senden T., Jans D. A. Supramolecular structure and nuclear targeting efficiency determine the enhancement of transfection by modified polylysines. Gene Therapy. 2000. V. 7. P. 1690-1697

58. Singh D., Kiarash R., Kawamura K., LaCasse E. C., Gariepy J. Penetrationand intracellular routing of nucleus-directed peptide-based shuttles (loligomers) in eukaiyotic cells. Biochemistry. 1998. V. 37. P. 5798-5809

59. Ritter W, Plank C, Lausier J, Rudolph C, Zink D, Reinhardt D, Rosenecker J.

60. A novel transfecting peptide comprising a tetrameric nuclear localization sequence. J. Mol. Med. 2003. V. 81. P. 708-717

61. LimaM. C., Simoes S., Pires P., GasparR., Slepushkin V., Duzgunes N. Genedelivery mediated by cationic liposomes: from biophysical aspects to enhancement of transfection. Mol. Membr. Biol. 1999. V. 16. №1. P. 103109

62. Radler J. O., Koltover I., Salditt T., Safinya C. R. Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes in distinct interhelical packing regimes. Science. 1997. V. 275. P. 810-814

63. Faneca H., Simoes S., Pedroso de Lima M.C. Evaluation of lipid-based reagents to mediate intracellular gene delivery. Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1567. P. 23-33

64. Simoes S., Slepushkin V., Pires P. Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides. Gene Therapy. 1999. V. 6. P. 1798-1807

65. Zelphati O., Uyechi L. S., Barron L. G., Szoka Jr F. C. Effect of serum components on the physico-chemical properties of cationiclipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells. Bioch. Bioph. Acta. 1998. V. 1390. P. 119-133

66. Kabanov A. V., Kabanov V. A. DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells. Bioconjug. Chem. 1995. V. 6. P. 7-20

67. Zauner W., Ogris M., Wagner E. Polylysine-based transfection systems utilizing receptor-mediated delivery. Adv. Drug Del. Rev. 1998. V. 30. P. 97113

68. Wagner E., Cotten M., Foisner R., Bimstiel M. L. Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex andI

69. DNA delivery to cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 4255^259

70. Remy J. S., Abdallah B., Zanta M. A., Boussif O., Behr J. P., Demeneix B. Gene transfer with lipospermines and polyethyleneimines. Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. V. 30. P. 85-95

71. Haensler J. Szoka F. C. J. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 1993. V. 4. P. 372379

72. Ohsaki M., Okuda T., Wada A., Hirayama T., Niidome T., Aoyagi H. In vitro gene transfection using dendritic poly(l-lysine). Bioconjug. Chem. 2002. V. 13. P. 510-517

73. Maruyama A., Ishihara T., Kim J. S., Kim S. W., Akaike T. Nanoparticle DNAcarrier with poly(L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly(D,L-lactic acid). Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 735-742

74. Midoux P., Monsigny M. Efficient gene transfer by histidilated polylisine/ pDNA complexes. Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. P. 406-411

75. Gottschalk S., Sparrow J. T., Hauer J. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. Gene Therapy. 1996. V. 3. P. 448-457

76. Choi J. S., Lee E. J., Choi Y. H. Polyethylene glycol)-block-poly(l-lysine) dendrimer: novel linear polymer/dendrimer block copolymer forming a spherical water-soluble polyionic complex with DNA. Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. P. 62-65

77. Huddle T., Rayner SA., Comer RM. Activated polyamidoamine dendrimers, a non-viral vector for gene transfer to the corneal endothelium. Gene Therapy. 1999. V. 6. P. 939-943

78. Richardson S., Ferruti P., Duncan R. Poly(amidoamine)s as potential endosomolytic polymers: evaluation in vitro and body distribution in normal and tumour-bearing animals. J. Drug Target. 1999.

79. Ohmori N., Niidome T., Kiyota T., Lee S., Sugihara G., Wada A., Hirayama

80. T., Aoyagi H. Importance of hydrophobic region in amphipatic structures of alpha-helical peptides for their gene transfer-ability into cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 245. №1. P. 259-265

81. Forminaya J., Gasset M., Garcia R., Roncal F., Albar J. P., Bernad A. An optimized amphiphilic cationic peptide as an afficient non-viral gene delivery vector. J. Gene Medicine. 2000. V. 2. P. 455-464

82. Niidome T., Takaji K., Urakawa M., Ohmori N., and Wada A. Chain length of cationic a-helical peptide sufficient for gene delivery into cells. Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. P. 773-780

83. Niidome T., Urakava M., Takaji K. et. al. Influence of lipophilic groups in cationic a-helical peptides on their abilities to bind with DNA and deliver genes into cells. J. Peptide Res. 1999. V. 54. P. 361-367

84. Morris M. C., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery. Current Opinion in Biotechnology. 2000. V. 11. P. 461-466

85. Rittner K., Benavente A., Bombard-Sorlet A., Heitz F., Divita G., Brasseur R., Jacobs E. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo. Molecular Therapy. 2002. V. 5. P. 104-114

86. Vaysse L., Arveiler B. Transfection using synthetic peptides: comparison of three DNA-compacting peptides and effect of centrifugation. Bioch. Bioph. Acta. 2000. V. 1474. P. 244-250

87. Gottschalk S., Sparrow J. T., Hauer J., Mims M. P., Leland F. E., Woo S. L. C., Smith L. C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. Gene Therapy. 1996. V.3. P. 448-457

88. Vaysse L., Burgelin I., Merlio J. P., Arveiler B. Improved transfection usingepithelial cell line-selected ligands and fusogenic peptides. Biochim.

89. Biophys. Acta. 2000. V. 1475. P. 369-376

90. Sheldon K., Liu D., Ferguson J., Gariepy J. Loligomers: Design of de novo peptide-based intracellular vehicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 2056-2060

91. Okuda Т., Sigiyama A., Niidome Т., Ayoagi H. Characters of dendritic poly(l-lysine) analogues with the terminal lysines replaced with arginines and histidines as gene carriers in vitro. Biomaterials. 2004. V. 25. P.537-544

92. Rodryguez-Hernandez J., Gatti М., Klok Н-А. Highly branched poly(l-lysine). Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 249-258

93. Lee H. J., Pardrige W. M. Pharmacokinetics and delivery of Tat and Tatprotein conjugates to tissues in vivo. Bioconjugate Chem. 2001. V. 12. P. 995-999

94. Torchilin V., Rammohan R., Weissig V., Levchenko T. Tat peptide on the surface of liposomes affords their efficient intracellular delivery even at low temperature and in presence of metabolic inhibitors. PNAS. 2001. V. 98. №15. P. 8786-8791

95. Rudolph C., Plank C., Lausier J., Schillinger U., Muller R., Rosenecker J. Oligomers of the arginine-rich motif of the HIV-1 Tat protein are capable of transferring plasmid DNA into cells. J. Biol. Chem. 2003. V. 128. №13. P. 11411-11418

96. Perutz M. F., Johnson Т., Suzuki M., Finch J. Glutamine repeats as polar zippers: their possible role in inherited neurodegenerative deseases. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1994. V. 91. P. 5355-5358

97. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы "А" и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea. Ж. эволюц. биохим. физиол. 2001. Т. 37. №5. С. 395-400

98. Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., Underwood D., Dixon R.A.F. Structure and function of G protein-coupled receptors Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 101-132

99. Wess J. G protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G protein recognition FASEB J. 1997. V. 11. P. 346-354

100. Flawia M.M., Torres H.N. Adenylate cyclase activity in Neurospora crassa. III. Modulation by glucagon and insulin. J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 4517-4520

101. Galperin M.Y., Nikolskaya A.N., Koonin E.V. Novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems. FEMS Microbiol Lett. 2001. V. 203. P. 11-21

102. Paveto C., Mallo G., Egidy G., Galvagno M.A., Passeron S. Activation of the cAMP cascade by steroidogenic hormones and glucagon in the pathogenic fungus Candida albicans. Cell Biol Int. Rep. 1991. V. 15. P. 169-178

103. Simon M.I., Strathmann M.P., Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction. Science. 1991. V. 252. P. 802-808

104. Inoue H., Yoshioka T. Purification of a regulatory subunit of type II cAMP-dependent protein kinase from Drosophila heads Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 235. P. 692-696

105. Kariya K., Saito K., Iwata H. Adrenergic mechanism in Tetrahymena. III. cAMP and cell proliferation. Jap. J. Pharmacol. 1974. V. 24. P. 129-134

106. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов. Ж. эволюц. биохим. физиол. 1996. Т. 32. №3. С. 318-340

107. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающих белков, определяющие специфичность взаимодействий между ними. Журн. эволюц. биохим. физиол. 1996. Т. 32. №4. С. 488-511

108. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных. Журн. эволюц. биохшл. физиол. 2002. Т. 38. №5. С. 430-441

109. Brzostowski J.A., Kimmel A.R. Signaling at zero G: G-protein-independent functions for 7-TM receptors Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. P. 291-297

110. Gudermann Т., Kalkbrenner F., Schultz G. Diversity and selectivity of receptor-G protein interaction.Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996. V. 36. P. 429-460

111. Bourret R.B., Borkovich K.A., Simon M.J. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Ann. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 401-441

112. Janetopoulos C., Jin Т., Devreotes P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 2001. V. 291. P. 24082411

113. Srinivasan J., Gundersen R.E., Hadwiger J.A. Activated G subunits can inhibit multiple signal transduction pathways during Dictyostelium development. Dev. Biol. 1999. V. 215. P. 443-452

114. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных Журн. эволюц. биохим. физиол. 1993. Т. 29. №5-6. С. 635-653

115. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика Ру-субъединиц G-белков и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами систем сигнальной трансдукции Журн. эволюц. биохим. физиол. 1997. Т. 33. №6. С. 669688

116. Shpakov А.О. Molecular basis of the functional coupling of receptors to GTP-binding proteins. Membr. and Cell Biol. 1996. V. 9. P. 467-488

117. Wess J. Molecular basis of receptor/G protein-coupling selectivity Pharmacol. Ther. 1998. V. 80. P. 231-264

118. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев. "Наукова думка". 1987

119. Додсон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва. "Мир". 1991

120. Kamber В., Hartmann A., Riniker К., Rink В., Sieber P., Rittel W. Helv. Chem. Acta. 1980. V. 63. P. 899-914

121. Маниатис E., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Москва, "Мир", 1984

122. Kidwai A.M., Radcliffe A.M., Lee E.V., Daniel E.E. Isolation and properties of skeletal muscle membrane. Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 289. P. 593607

123. Salomon Y., Londos C., Rodbell M.A. Highly sensitive adenylate cyclase assay. Anal. Biochem. 1974. V. 58. P. 541-548