Конденсация ДНК в растворе, индуцируемая поликатионами и многозарядными ионами

Дрибинский, Борис Аркадьевич

Конденсация ДНК в растворе, индуцируемая поликатионами и многозарядными ионами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Дрибинский, Борис Аркадьевич АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Конденсация ДНК в растворе, индуцируемая поликатионами и многозарядными ионами»

Автореферат диссертации на тему "Конденсация ДНК в растворе, индуцируемая поликатионами и многозарядными ионами"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Дрибинский Борис Аркадьевич

КОНДЕНСАЦИЯ ДНК В РАСТВОРЕ, ИНДУЦИРУЕМАЯ ПОЛИКАТИОНАМИ И МНОГОЗАРЯДНЫМИ

ИОНАМИ

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

На правах рукописи

005056270

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

6 ДЕК 2012

Санкт - Петербург 2012 г

005056270

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор физ. - мат. наук, проф.

Касьяненко Нина Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор физ.- мат. наук,

заведующий лабораторией молекулярной физики полимеров

Филиппов Александр Павлович

(Институт высокомолекулярных соединений РАН)

доктор физ. - мат. наук,

ведущий научный сотрудник

Лушников Сергей Германович

(Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе РАН)

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

политехнический университету Защита диссертации состоится «|1 года в 11 часов на заседании

совета Д. 212.232.33 по защите докторских и кандидатских диссертаций при

Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 198504, Санкт-

Петербург, Петродворец, ул. Ульяновская д. 1, НИИФ СПбГУ, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГУ. Автореферат разослан « »'•I'». ¿2012 года

/ Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ. - мат. наук, проф

Актуальность темы исследования. Изучение конденсации ДНК in vitro (под конденсацией ДНК понимают конформационный переход из состояния набухшего молекулярного клубка в растворе в компактную форму с образованием наноразмерных частиц под действием различных агентов) обусловлен как необходимостью получения информации о молекулярном механизме эффективной упаковки ДНК в биологических структурах (хроматине, головках бактериофагов и др.), так и возможным использованием ДНК в новых технологиях. При создании наноструктур на основе ДНК часто необходимо провести компактизацию макромолекулы в растворе. Например, одной из задач генной инженерии является поиск способов формирования эффективных и нетоксичных генных векторов (наночастиц ДНК) для направленной передачи генетической информации в клетку. Для их получения в растворе необходимо преодолеть электростатическое расталкивание одноименно заряженных звеньев, приводящее к полиэлектролитному набуханию ДНК. Для формирования генных векторов широко используют синтетические поликатионы, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с другими конденсирующими агентами из-за возможности создания структур с заданными физико-химическими свойствами, низкой стоимости и простоты их получения, а также малой вероятности иммунного ответа со стороны организма. Таким образом, проведенное в работе исследование влияния природы и структурных особенностей конденсирующих агентов на процесс компактизации ДНК, размер и форму образуемых частиц является актуальным.

Научно-практическая значимость работы. Результат изучения влияния длины и зарядовых свойств поликатионов на процесс конденсации молекулы ДНК в растворе может служить основой для простого и эффективного способа отбора конденсирующих агентов для создания невирусных генных векторов и других наноструктур на основе ДНК с заданными свойствами. Водные растворы ДНК представляют собой удобные модельные системы для изучения комплексообразования макромолекулы с различными биологически активными

соединениями, так как вода является естественной средой функционирования биополимеров in vivo. Полученные в работе данные способствуют пониманию роли электростатических взаимодействий в процессе образования надмолекулярных структур в клетке. Способность ДНК формировать упорядоченные структуры под действием заряженных агентов может найти применение в наноэлектронике, компьютерных технологиях, при создании новых материалов.

Целью диссертационной работы является выявление особенностей формирования комплексов ДНК в растворе с поликатионами и малыми конденсирующими агентами в зависимости от длины цепочки, плотности заряда и структуры последних, а также изучение индуцированного этим комплексообразованием процесса конденсации ДНК и определение размера формируемых наночастиц.

В работе решаются следующие задачи:

1. Рассмотрено влияние степени полимеризации поли-Ь-лизина (далее -полилизина) на конформационные изменения молекулы ДНК, индуцированные его присутствием в растворе.

2. Проводится сравнение комплексообразования ДНК с олигопептидами и полиаминами для изучения роли локализации заряда поликатиона при конденсации ДНК.

3. Анализируется влияние ионной силы раствора на характер изучаемого взаимодействия ДНК с поликатионами.

4. Сравниваются конформационные изменения молекулы ДНК, предшествующие ее конденсации в растворе, при использовании поликатионов различной длины.

5. Проводится сопоставление результатов конденсации ДНК, индуцированной различными соединениями.

6. Изучаются временные характеристики процесса образования компактных структур при взаимодействии ДНК с конденсирующими агентами.

Научная новизна работы. Впервые построены фазовые диаграммы для систем ДНК-полилизии, ДНК-олигопептиды и ДНК-полиамины в растворе. Показано, что определяющим фактором для реализации конденсации ДНК, индуцированной присутствием в растворе молекул полилизина достаточной длины (для используемых в работе образцов от 17 мономерных звеньев) является достижение равенства концентраций ионогенных групп поликатионов (N) и ДНК (Р), N/P=l, а при использовании в качестве конденсирующих агентов олигопептидов и полиаминов - достижение их определенной концентрации в растворе ДНК вне зависимости от N/P (концентрации ДНК). Впервые показано, что перед конденсацией ДНК, вызванной присутствием в растворе полиаминов, происходит изменение конформации макромолекулы с появлением определенной упорядоченности в ориентации частей цепочки. Впервые проведено исследование временных характеристик процесса образования конденсированных структур при использовании полилизина различной степени полимеризации.

Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении экспериментов, в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов и в подготовке публикаций по теме исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (St.-Petersburg, 2008); XIV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Челябинск, 2008); XIII European conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Palermo, Italy, 2009); 5th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (St.-Petersburg, 2009); XV Симпозиуме no межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Петрозаводск, 2010); III Международной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 145

страницах, содержит 78 рисунков, 1 таблица. Список цитируемой литературы состоит из 121 наименования.

Во введении сформулированы цели и задачи работы, обоснована их актуальность, научная новизна и практическая значимость. Глава 1 содержит анализ современного состояния исследований, связанных с изучением компактизации ДНК в биологических системах и в растворе. В главе 2 рассмотрены теоретические основы используемых методов исследования (низкоградиентной вискозиметрии, динамического двулучепреломления (ДЛП), атомной силовой микроскопии (АСМ), динамического светорассеяния (ДСР), УФ спектрофотометрии, кругового дихроизма (КД), флюоресценции и приведена характеристика материалов. Использовали препараты фирмы "Sigma": тимусную ДНК (молекулярная масса М= 12,6-106 и 13,6-106 Да определялась вискозиметрически), поли-Ь-лизин гидрохлорид (со степенью полимеризации п = 2, 17, 20, 327), гидробромид (п = 270), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-1TFA-4 acetat (пентализин), Lys-Lys-Lys- 3 acetat (трилизин), полиамины -гидрохлориды спермина и спермидина (рис. 1), NaCl (х.ч). Глава 3 посвящена изучению конденсации ДНК в растворе, индуцированной присутствием полилизина различной степени полимеризации и природных полиаминов.

Вискозиметрические исследования растворов ДНК с поликатионами позволили условно разделить используемые соединения на две группы. Первую составляют образцы полилизина со степенью полимеризации более 16, индуцирующие компактизацию ДНК, которую фиксировали по резкому

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Рис. 1. Структурные формулы поли-Ь-лизина (1), спермидина (2). спермина (3).

падению приведенной вязкости г)пр растворов при достижении зарядового отношения Ы/Р>1 независимо от ионной силы раствора (Г4, Р - молярная концентрация ионогенных групп полилизина и фосфатов ДНК соответственно); вторую - более короткие олигомеры, не вызывающие компактизации ДНК в 1 М ЫаС1 (рис. 2 а,б).

1,0

0,5

V^A

□ I

о 2

* 3

о 4

0,04— 0,0

0,5

я N/p

'0.0 0.5 1.0 1,5

N/P

1,0

f—

1,5

2,0

а)

0,0

N/I -V

10"' 10"° 10'1

б)

1,5 1,0 0,5 0,0

YrY2/(7rT2),

\ \ ч

т\\

у. м

10"°

10""

в)

г)

Рис. 2. Зависимость относительного изменения приведенной вязкости растворов ДНК (а, б, г) и ее оптической анизотропии (в) в 0,005 М и IM NaCl (на врезках а, б, в) от N/P (а) , концентрации олигомеров С (б. в) и ДНК (врезка для г) в присутствии полилизина 17 (1), 20 (2), 270 (3), 327 (4); би-(5), три-(6) и пентализина (7), спермина (8), спермидина (9) На рис. (г) приведены данные для пентализина при разных С(ДНК), значения (С(ДНК) х 10\%) приведены у значков; там же на врезке указаны концентрации пентализина. (С х 10\М).

Падение вязкости раствора для всех систем сопровождается столь же резким падением оптической анизотропии ДНК (рис. 2в) и скачкообразным изменением (сдвигом положительной полосы) в спектре кругового дихроизма ДНК (рис. 3), при этом определенная методом динамического светорассеяния

функция распределения по размерам частиц имеет унимодальный характер (рис. 4). При этом АСМ изображения после фиксации ДНК из раствора на поверхность слюды с использованием 10~4 М MgCl2 свидетельствуют о формировании компактных частиц сферической и тороидальной формы (рис. 5).

• о

0.25 0.5 0.75 1

1.5 2

220 240 260 280 300

Рис. 3. Спектры КД ДНК в 0,005 М NaCl при разных концентрациях полилизина 20 (значения N/P даны на рисунке (а)), и пентализина (- приведены значения С х 105, М) (б).

При N/P < 1 вязкость раствора ДНК с полилизином, оптическая анизотропия и спектр КД ДНК меняются мало, а АСМ изображения ДНК после ее фиксации из таких растворов практически не отличаются от полученных для свободной ДНК (рис. 5).

Для поликатионов группы 2 (олигопептидов и полиаминов) определяющим фактором для начала конденсатами ДНК, которая происходит только в растворах малой ионной силы, является не значение N/P, а концентрация соединения в растворе (рис. 2г). Бипептид не компактизует ДНК в условиях эксперимента. Полиамины, в отличие от используемых олигопептидов, перед конденсацией ДНК вызывают сдвиг максимума положительной полосы спектра КД в коротковолновую область и возрастание оптической анизотропии макромолекулы (рис. 2в), которая для В-формьт имеет максимальное значение, а АСМ изображения демонстрируют образование структур с определенной ориентацией частей макромолекулы - своего рода

«закручивание» цепочки (рис. 5). Это может свидетельствовать об изменении ориентации сегментов ДНК и быть причиной роста ее оптической анизотропии.

D х 10 , см7с

R,„ мм

10°

■ 4 :

6 С(ДНК) х 103,%

600 400 200 0

1/т, с"

0,2 0,1

V-

RKHM 10т

..........*

I ,А-Ш -2

q х 10 ,см

а)

б)

Рис. 4. Концентрационная зависимость коэффициента поступательной диффузии ДНК в 0,005 М NaCl (М=13,6 х 1С)6 Да) (а) и угловая зависимость скорости релаксации для ДНК, конденсированной пентализином, С(ДНК)= 0,004%, С(пентализииа) = 2,4 х 10"^ М (б). На врезках - функции распределения по размерам, полученные при углах 90 градусов.

Рассмотренные для полиаминов данные согласуются с результатом аналогичных исследований, выполненных ранее в лаборатории с использованием иных конденсирующих агентов - ионов La3+, Fe3+ и Co(NH3)63+. Следует подчеркнуть, что при использовании олигопептидов возрастания оптической анизотропии и «закручивания» ДНК перед конденсацией не наблюдается, хотя АСМ изображения фиксируют появление структур с плотным ядром, окруженным несконденсированными частями макромолекулы, не характерных для систем ДНК-поликатион (для п>16). По-видимому, короткие пептидные цепочки выступают не только в качестве мостиков, связывающих удаленные участки ДНК (как это делают полиамины и точечные мультивалентные ионы), но и провоцируют появление «зародышей конденсации» при наличии некомпактизованной ДНК. Длинные полимерные цепочки полилизина имеют конформацию статистического клубка и окружены противоионами, что мешает им в разбавленном растворе вступать во взамодействие с также заэкранированной противоионами молекулой ДНК до достижения определенных условий (близких к N/P=l). По-видимому, этим

объясняется отсутствие видимых изменений в АСМ изображениях ДНК в области N/P<1 и в отсутствии полиионов.

Рис. 5. АСМ изображения ДНК, высаженной из раствора 0,005 М NaCl (а) и из раствора ДНК с полилизином для n=270, N/P= 1,25 (б): п=327. N/P = 0,75 (в) и N/P = I (г); для п = 5,

О] ,2-10'5 М (д) и 2,4-10"5 М (е); для п = 3, Ol,8-Ю-5 М (ж) и 1,2- Ю"5 М (з>; спермидином,

05-10"5 М (и), 02-10"4М (к), спермином, О 5-Ю"6 М (л), О 1,3-10"5 М (м). Масштаб Jxl рт (а, в, д, ж, з, л), 0,6x0,6 Jim (б), 0,4x0,4 рт (г), 2x2 рт (е), 2x2 рт (и), 1,4x1,4 рт (к), 0,5x0,5 рт (м). Для обработки АСМ-изображений использовали программы Nanoscope IVa (а, в-и, л, м) и Femtoscan (б, к).

На рис. 6 приведены фазовые диаграммы для изучаемых систем, построенные с использованием всей совокупности экспериментальных данных, полученных разными методами (концентрация полимеров группы 2 дана в молях ионогенных групп). Для всех систем можно выделить три области. Первая соответствует состоянию ДНК в растворе до конденсации (малое падение вязкости раствора, неизменность оптической анизотропии

макромолекулы, отсутствие заметных спектральных изменений). Во второй области реализуется формирование комплексов и происходит конденсация ДНК, в третьей наблюдается выпадение ДНК в осадок. Для спермина и спермвдина выделена область IV, в которой наблюдается увеличение оптической анизотропии ДНК и появление «закрученных» участков макромолекулы на АСМ изображениях перед конденсацией.

JCx104,M(N)

10-

о-

Сх к/, M(N) .-----*тг

III

аднвдх 10,М(Р)

1G3 104 105 1Ö6-107-

QM(N)

• # Ш

3........... IV

С1ДЖ)Х%. М(Р)

га5, 10": ю1

V? 10е! га7-

GM(N)

.......о

ОД®)х1()?,М(Р)

Г) Д) е)

Рис. 6. Фазовые диаграммы для комплексов ДНК с полилизином при п=327 (а), 20 (б), 5 (в), 3 (г), спермином (д) и спермидином (е).

Из рисуиков видно принципиальное различие во влиянии поликатиоиов достаточной длины и олигомеров на состояние ДНК в растворе. Для поликатионов группы 1 вид диаграмм отражает важную роль отношения N/P при конденсации ДНК. С увеличением концентраций полиионов в растворе область 2 расширяется, но при малых N и Р ее границей является значение N/P=l. Для растворов ДНК с олигопептидами и полиаминами определяющим условием для перехода ДНК в конденсированное состояние является их концентрация в растворе, а не зарядовое отношение N/P.

Изучение временных зависимостей флюоресценции этидиума бромида, EthBr, предварительно связанного с ДНК перед добавлением поликатионов

(рис. 7а) и добавленного в готовый раствор ДНК с поликатионами (рис. 76) показало, что и в том, и в другом случае заметных изменений в системе при N/P < 1 нет. Иными словами, конденсации ДНК или иного изменения ее конформации, препятствующего связыванию с EthBr, в этих условиях не наблюдается. При N/P > 1, когда фиксируется образование конденсированных структур, интенсивность флюоресценции падает существенно. Известно, что в свободном состоянии EthBr (как и ДНК) флюоресцирует слабо, а при интеркаляции красителя в двойную спираль интенсивность флюоресценции меняется на порядок. Интересно отметить, что при добавлении EthBr к раствору ДНК с полилизином при N/P = 1 интенсивность флюоресценции падает вдвое по сравнению с системой при N/P=0. Возможно, это условие соответствует сосуществованию в растворе доступной для EthBr и конденсированной ДНК. При N/P =1,25 свободной ДНК в растворе уже нет. Подчеркнем, что при добавлении красителя после формирования конденсированных частиц при N/P >1 интенсивность флюоресценции не меняется со временем, что указывает на устойчивость таких структур.

После конденсации ДНК в комплексе с EthBr краситель либо выходит в раствор, либо не может флюоресцировать в таких условиях - наблюдается скачкообразное падение флюоресценции при N/P=l, а при N/P > 1,25 она падает до значений, совпадающих с флюоресценцией свободного EthBr. И в этом случае при N/P < 1 интенсивность флюоресценции практически не меняется, что подтверждает данные других методов об отсутствии заметного комплексообразования ДНК с полилизином в этих условиях. Подобные результаты были получены и при рассмотрении конденсации ДНК олигопептидами.

Интегральная интенсивность светорассеяния (рис. 7в), измеренная на спектрофлюориметре под углом 90 градусов при N/P < 1, очень низка (что указывает на отсутствие изменений в состоянии ДНК при добавлении поликатиона), при N/P > 1 она резко возрастает из-за конденсации, а затем снижается из-за агрегации и частичного выпадения ДНК в осадок. Ее

временные зависимости для систем с 1<N/P<2 могут быть аппроксимированы двумя экспонентами (с использованием математического пакета Origin 7.0), отражающими быстрое образование конденсированных частиц (характерное время порядка 20-30 сек.) и дальнейшее изменение их размера при N/P=l,25 (150-300 сек.).

200 400 600 т, С

1гх 10 [ÑTF^I

ÍN/P =

I N/P =1.25; 1,5; 2 I

0 200 400 600 т, С

а) б) В)

Рис. 7. Временные зависимости интенсивности флюоресценции EtBr (в отн. един.) растворов ДНК с полилизином, п = 327 (а, б) 0.005 М N301 [ЕШВг добавляли к готовому раствору ДНК с полилизином (а) и перед добавлением полилизина в раствор ДНК (б)], X = 600 нм, и интегральной интенсивности рассеяния под углом 90 градусов (в), А. = 400 нм.

150 100 50 0

R^, нм

X. с

О 250 500 750

150 100

R„. нм

250 500 760

а)

б)

.0.241

0,12

— 20 -о-200 -"-400 -'-600 -»-775

„НМ

R,„ нм

Üa.

0,4 0,2

250

500

-30 -200 -400 -600

"ir1"

250

500

250 500

г) Д) е)

Рис. 8. Временные зависимости относительного изменения гидродинамического радиуса (а-в) и функций распределения конденсированных частиц по размерам (г-е) при использовании полилизина, п = 327, N/P=l,25 (а,г), п = 5, О 1,8-Ю"4 М (N) (б,д), п = 3, С = 7,2-Ю"4 М (N) (в,е). Измерения проводили под углом 90 градусов. С(ДНК)= 0,004%.

Эти оценки в целом согласуются с данными динамического светорассеяния, представленными на рис. 8 (измерения проводили каждые 20 секунд). Гидродинамический радиус конденсированных частиц (60-70 нм.) не меняются со временем при использовании высокомолекулярного полилизина (п = 327), тогда как при использовании олигомеров после быстрой компактизации ДНК с образованием частиц того же размера, в течение 200- 300 сек. происходит возрастание размеров частиц от 70 до 140 нм, которые затем остаются неизменными.

Заключение.

По результатам работы можно сформулировать следующие выводы:

1. Показано, что полилизин со степенью полимеризации п более 16 вызывает конденсацию ДНК в растворах малой (0,005 М NaCl) и большой (1 М NaCl) ионной силы при зарядовом отношении N/P> 1.

2. Олигопептиды с тремя и пятью мономерными остатками лизина и полиамины (спермидин и спермин) вызывают конденсацию ДНК в растворах малой ионной силы (0,005 М NaCl) при достижении их определенной концентрации, характерной для каждого соединения. Бипептид не вызывает конденсации макромолекулы в используемой области концентраций.

3. Показано, что локализация заряда на цепочке олигомера играет роль при его комплексообразовании с ДНК, приводящем к последующей конденсации макромолекулы. Полиамины, в отличие от олигопептидов, индуцируют внутримолекулярное структурирование ДНК перед конденсацией, сопровождающееся уменьшением объема молекулярного клубка и увеличением его оптической анизотропии в растворе.

4. Гидродинамический радиус конденсированных частиц, образующихся при использовании сильно разбавленных растворов ДНК, по данным динамического светорассеяния составляет (70 ± 20) нм для поликатионов и (130 ± 30) нм для олигомеров.

5. При конденсации ДНК, индуцированной полилизином значительной длины (п>16), не наблюдается образования каких-либо промежуточных структур, тогда как при использовании олигопептидов методом атомной силовой микроскопии зафиксировано формирование плотных структур, окруженных несконденсированными частями макромолекул.

6. Конденсация ДНК, индуцированная поликатионами при N/P > 1, протекает быстро (менее 20 сек), размер конденсированных частиц не меняется с течением времени, тогда как при использовании олигопептидов после быстрой конденсации ДНК с образованием частиц такого же размера происходит их дальнейшее укрупнение, которое заканчивается через 250-300 секунд.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Kasyanenko N., Afanasieva D., Dribinsky В., Mukhin D., Nazarova O., Panarin E., DNA interaction with synthetic polymers in solution. Structural Chemistry, 2007, vol. 18, №4, P. 519-525.

2. Касьяненко H. A., Дрибинский Б. A., Компактизация ДНК в водных растворах индуцируема полилизином и спермидином. Журнал Структурной Химии, 2007, т. 48, № 4, с. 778-782.

3. Грищенко А. Е„ Кононов А. И., Наумова Л. В., Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А., Оптические свойства и ориентационный порядок молекул

дезоксирибонуклеиновой кислоты на межфазных границах, Высокомолекулярные соединения, 2010, Т. 52, № 1, с. 47 - 52.

4. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А., Влияние длины олигопептида на процесс конденсации ДНК в растворе. Журнал Структурной химии, 2011, т. 52, №6, 1239- 1245.

5. Mukhin D., Dribinsky В., Nazarova О., Zolotova Yu., Panarin E., Kasyanenko N.; DNA complexes with polycations as nonviral gene vectors; Book of abstracts of 6,h

International symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, St.Peterburg, 2008, p. 168.

6. Мухин Д. А., Дрибинский Б. А., Слита А. В., Назарова О. В., Панарин Е. Ф., Касьяненко Н. А.; Генные векторы на основе синтетических поликатионов: их свойства и условия формирования; XIV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Челябинск, 2008, с. 65.

7. Dovbeshko G., Fesenko О., Gnatiuk О., Dribinsky В., Kasyanenko N.; SEIRA markers of DNA condensations by La3+; XIII European conference on the spectroscopy of biological molecules, Palermo, Italy, 2009, p. 43.

8. Dribinsky В., Kasyanenko N.; Influence of degree of polymerisation poly-L-lysine on formation on DNA-polycation complexes; 5th Saint-Petersburg young scientists conference, Saint-Petersburg, 2009, p. 39.

9. Дрибинский Б. А., Касьяненко H. А.; Влияние длины цепочки поликатиона на процесс конденсации ДНК в водно-солевом растворе; XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Петрозаводск, 2010, с. 165.

10. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А.; Конформационные изменения молекулы ДНК в растворе, вызванные присутствием поликатионов и многозарядных ионов. III Международная конференция «Современные проблемы биофизики», Санкт-Петербург, 2011, с. 33.

Подписано в печать 08.11.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2865.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izdjema@mail.ru http://www.leniaprint.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Дрибинский, Борис Аркадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 .Компактизация ДНК IN VIVO и IN VITRO.

§ 1.1 Структура молекулы ДНК.

§1.2 Конденсация ДНК.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.

§ 2.1 Низкоградиентная вискозиметрия.

§ 2.2 Динамическое двойное лучепреломление.

§ 2.3 Атомная силовая микроскопия.

§ 2.4 Динамическое рассеяние света.

§ 2.5 Спектральные методы.

§ 2.6 Материалы.

ГЛАВА 3. КОНДЕНСАЦИЯ ДНК В РАСТВОРЕ, ИНДУЦИРОВАННАЯ

ПОЛИЛИЗИНОМ И ПОЛИАМИНАМИ.

Введение диссертация по химии, на тему "Конденсация ДНК в растворе, индуцируемая поликатионами и многозарядными ионами"

Молекула ДНК является полиионом с чрезвычайно высокой плотностью заряда и большой термодинамической жесткостью. В водном растворе высокомолекулярная ДНК имеет конформацию набухшего статистического клубка. В биологических структурах (ядрах клеток, вирусах, головках бактериофагов) макромолекула сильно компактизована и находится в упорядоченном состоянии. В ряде случаев в присутствии определенных агентов наблюдается конденсация высокомолекулярной ДНК в растворе -переход из конформации сильно набухшего статистического клубка в компактное состояние с образованием наночастиц определенной формы. Интерес к изучению явления конденсации ДНК in vitro обусловлен, прежде всего, стремлением понять молекулярный механизм эффективной упаковки ДНК в биологических системах. В последние годы интерес к изучению конденсации ДНК в растворе усилился в связи потребностями генетической инженерии. Это обусловлено необходимостью создания эффективных генных векторов - компактных структур, содержащих ДНК, и предназначенных для решения задач о направленной передаче генетической информации в клетку. Для формирования таких структур используют синтетические поликатионы, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с другими конденсирующими агентами из-за возможности получения генных векторов с заданными физико-химическими свойствами. Кроме того, простота получения комплексов и низкий риск иммунологических реакций со стороны организма по сравнению, например, с носителями на основе инактивированных вирусов также способствуют широкому использованию таких систем в биотехнологических разработках.

Увеличить эффективность трансфекции ДНК-полимерных комплексов можно за счет оптимизации структуры поликатионов и включения лигандов, имеющих большое сродство с клеточными мембранами. Однако для этого необходимо всестороннее исследование комплексообразования ДНК с поликатионами различной природы.

Проводимое в работе исследование влияния поликатионов (полилизина различной длины и полиаминов) на конформацию молекулы ДНК в растворе может служить простым и эффективным методом изучения молекулярного механизма конденсации ДНК in vitro, а также удобным способом моделирования взаимодействия ДНК с конденсирующими агентами in vivo.

Водные растворы ДНК представляют собой удобные модельные системы для изучения комплексообразования макромолекулы с различными биологически активными соединениями, так как вода является естественной средой функционирования биополимеров in vivo. Выделение основных объектов взаимодействия существенно упрощает систему и дает возможность получения более обоснованных выводов о причинах тех или иных конформационных изменений макромолекулы в процессе функционирования. Следует отметить также, что интерес к изучению конформационных изменений ДНК в растворе обусловлен в последнее время также возможностью использовать способность макромолекулы к организации упорядоченных структур в присутствии некоторых соединений для решения задач, выходящих за рамки интересов биологии и медицины. В частности, формирование наноструктур на основе ДНК может быть использовано в наноэлектронике, в компьютерных технологиях, при создании новых материалов. Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы работы и практической значимости выполненных исследований.

Целью диссертационной работы является выявление особенностей формирования комплексов ДНК с поликатиоными в зависимости от длины, плотности заряда и структуры последних, изучение влияния этих свойств на процесс конденсации ДНК и размеры формируемых наночастиц.

В работе решаются следующие задачи:

1. Рассматривается влияние степени полимеризации поли-L-лизина (далее - полилизина) на конформационные изменения молекулы ДНК, индуцированные его присутствием в растворе.

3. Анализируется влияние ионной силы раствора на характер изучаемого взаимодействия ДНК с поликатионами.

5. Проводится сопоставление результатов конденсации ДНК, индуцированной различными соединениями.

Научная новизна работы. Впервые построены фазовые диаграммы для систем ДНК-полилизин, ДНК-олигопептиды и ДНК-полиамины в растворе. Показано, что определяющим фактором для реализации конденсации ДНК, индуцированной присутствием в растворе молекул полилизина достаточной длины (для используемых в работе образцов от 17 мономерных звеньев) является достижение равенства концентраций ионогенных групп поликатионов (N) и ДНК (Р), N/P = 1, а при использовании в качестве конденсирующих агентов олигопептидов и полиаминов - достижение их определенной концентрации в растворе ДНК вне зависимости от N/P (концентрации ДНК). Впервые показано, что перед конденсацией ДНК, вызванной присутствием в растворе полиаминов, происходит изменение конформации макромолекулы с появлением определенной упорядоченности в ориентации частей цепочки. Впервые проведено исследование временных характеристик процесса образования конденсированных структур при использовании полилизина различной степени полимеризации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях:

- 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (St.-Petersburg, 2008);

- XIV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Челябинск, 2008);

- XIII European conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Palermo, Italy, 2009);

- 5th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (St.-Petersburg, 2009);

- XV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Петрозаводск, 2010);

- III Международной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 78 рисунков, 1 таблицу. Список цитируемой литературы состоит из 121 наименований.

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата физико-математических наук, Дрибинский, Борис Аркадьевич, Санкт-Петербург

1. Watson J.D., Crick F.H.C., A structure of deoxyribose nucleic acid.// Nature, 1953, 171,737-738.

2. Crick F.H.C., Watson J.D., The complementary structure of deoxyribonucleic acid.// Proc. Roy. Soc. (London), 1954, Ser.A, 223, 80-96.

3. Zamenhof S., Brawermann G., Chargaff E., On the desoxypentose nucleic acids from several microorganisms.// Biochim. Biophys. Acta, 1952, 9, 402405.

4. Leslie A.G.W., Arnott S., Chandrasekaran R., Ratliff R.L., Polymorphism of DNA double helices.// J. Mol Biol., 1980, 143, 49-72.

5. Lewitt M., How many base-pair per turn does DNA have in solution and in chromatin? Some theoretical calculations.// Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1978, 75, 640-644.

6. Calladine C.R., Mechanism of sequence-dependent stacking of bases in B-DNA.// J. Mol. Biol., 1982, 161, 343-352.

7. Кантор Ч., Шиммел П., Биофизическая химия.// т. 1, Москва, Мир, 1984.

8. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.// T.l, М., Мир, (1998), 373.

9. Lerman L. S., The polymer and salt-induced condensation of DNA.In: Physica-Chemical Properties of Nucleis Acids (J. Duchesne, ed.). // v.3, Acad. Press, New York (1973), 59-76.

10. Huey R. & Mohr S. C., Condensed states of nucleic acids. III. \|/+ and \|/-conformational transitions of DNA induced by ethanol and salt.// Biopolymers (1981), v. 20, 2533-2552.

11. Gosule L.C., Shellman J.A., Compact form of DNA induced by spermine.// Nature (1976), v.259, p. 333-335.

12. Montigny, W. J., Houchens, C. R., Illennye, S., Gilbert, J., Coonrod, E., Chang, Y.-C., Heintz, N. H., Condensation by DNA looping facilitates transfer of large DNA molecules into mammalian cells.// Nucl. Acid. Res.2001), 29, 1982-1988.

13. Dunlap, D. P. Maggi, A., Soria, M. R., Monaco, L., Nanscopic structure of DNA condensed for gene delivery. //Nucl. Acid. Res. (1997), 25, 3095-3101.

14. Schmutz, M., Durand. D., Debin, A., Palvadeau, Y., Etienne, A., Thierry, A. R. DNA packing in stable lipid complexes designed for gene transfer imitates DNA compaction bacteriophage.// Proc. Natl. Acad. USA (1999), 96, 1229312298.

15. Vijayanathan, V., Thomas, T., Thomas, T. J., DNA nanoparticles and development of DNA delivery vehicles for gene therapy. //Biochemistry2002), 41,14087-14094.

16. Kindt, J., Tzlil, S., Ben-Shaul, A., Gelbart, W. M., DNA packaging and ejection forces in bacteriophage.// Proc. Natl. Acad. USA (2001), 98, 1367113674.

17. Pesavento, J. B., Lawton, J. A., Estes, M. K., Prasad, B. V. V., The reversible condensation and expansion of the rotavirus genome.// Proc. Natl. Acad. USA (2001), 98, 1381-1386.

18. Smith, D. E., Tans, S. J., Smith, S. B., Grimes, S., Anderson, D. L., Bustamante, C., The bacteriophage straight phi29 portal motor can package DNA against a large internal force.//Nature (2001), 413, 748-752.

19. Cockell, M., Gasser, S. M. Nuclear compartments and gene regulation.// Curr. Opin. Genet. Develop. (1999), 9, 199-205.

20. Ansari, A., Gartenberg, M. R., Persistence of an Alternate Chromatin Structure at Silenced Loci in vitro.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999), 96, 343-348.

21. Wolf, S. G., Frenkiel, D., Arad, T., Finkel, S. E., Kolter, R., Minsky, A., DNA protection by stress-induced biocrystallization.// Nature (1999), 400, 83-85.

22. Levin-Zaidman, S., Englander, J., Shimoni, E., Sharma, A. K., Minton, K. W., Minsky, A., Ringlike structure of the Deinococcus radiodurans genome: a key to radioresistance?// Science (2003), 299, 254-256.

23. Klimenko, S. M., Tikchonenko, T. I., Andreev, V. M., Packing of DNA in the head of bacteriophage T2.il J. Mol. Biol. (1967), 23, 523-533.

24. Lepault, J., Dubochet, J., Baschong, W., Kellenberger, E., Organization of double-stranded DNA in bacteriophages: a study by cryo-electron microscopy of vitrified samples.//EMBO J. (1987), 6, 1507-1512.

25. Hud, N. V., Double-stranded DNA organization in bacteriophage heads: An alternative toroid-based model. Biophys. J. (1995), 69, 1355-1362.

26. Schellman, J. A., Parthasarathy, N. J., X-ray diffraction studies on cation-collapsed DNA.// J. Mol. Biol. (1984), 175, 313-329.

27. Strzelecka, T.E., Davidson, M.W., Rill, R.L, Multiple liquid crystal phases of DNA at high concentrations.// Nature (1988), 331, 457-465.

28. Odijk, T., "DNA and Chromosomes: Physical and Biological Approaches". //Second International Summer School. Cargese, France, August 12-24, 2002.

29. Beato, M., Eisfeld, K., Transcription factor access to chromatin. Nucleic Acids Res.//Nucleic. Acids Res. (1997), 25, 3559-3563.

30. Davey, C., Pennings, S., Meersseman, G., Wess, T. J., Allan, J., Periodicity of Strong Nucleosome Positioning Sites around the Chicken adult ß-Globin gene may Encode Regularly Spaced Chromatin.// Proc. Natl. Acad. USA (1995), 95, 11210-11214.

31. Becker, P. B., Nucleosome sliding: facts and fiction.// EMBO J. (2002), 21, 4749-4753.

32. Meersseman, G., Pennings, S., Bradbury, E. M., Mobile nucleosomes—a general behavior.// EMBO J. (1992), 11, 2951-2959.

33. Lerman, L. S., A transition to a Compact Form of DNA in Polymer Solutions.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1971), 68, 1886-1890.

34. Jary, D., Sikorav, J.-L., Cyclization of globular DNA. Implications for DNADNA interactions in vivo.// Biochemistry (1999), 38, 3223-3227.

35. Wilson, R., Bloomfield, V. A., (1978), Biochemistry, 18, 2192-2196.

36. Bloomfield, V. A., He, S., Li, A.-Z., Arscott, P. B., Light scattering studies on DNA condensation.//Biochem. Soc. Trans. (1991), 19, 496.

37. Vijayanathan, V., Thomas, T., Shirahata, A., Thomas, T. J., DNA condensation by polyamines: a laser light scattering study of structural effects.//Biochemistry, (2001), 40, 13644-13651.

38. Kasyanenko, N., Arikainen, N., Frisman, E., Investigation of DNA complexes with iron ions in solution.// Biophys. Chem., (1998), 70, 93-100.

39. Kasyanenko N., Afanasieva D., Dribinsky B. et al., DNA interaction with synthetic polymers in solution. // J. Struct. Chem. (2007), 18, 519 525.

40. Parsegian, V. A., Rand, R. P., Rau, D. C., Osmotic stress, crowding, preferential hydration, and binding: A comparison of perspectives.// Proc. Natl. Acad. USA, (2000), 97, 3987-3992.

41. Tajmur-Riahi, H.-A., Ahmad, R., Naoui, M. J., Interaction of calf-thymus DNA with trivalent La, Eu and Tb ions. Metal ion binding, DNAcondensation and structural features.// (1993), J. Biomol. Struct. Dynam. 10, 865-877.

42. Ahmad, R., Naoui, M., Neault, J. F., Dimantoglou, S., Tajmur-Riahi, H. A., An FTIR spectroscopic study of calf-thymus DNA complexation with Al(III) and Ga(III) cations.// J. Biomol. Struct. Dynam., (1996), 13, 795-802.

43. Votavova H., Kucerova, D., Felsberg, J., Sponar, J., Changes in conformation, stability and condensation of DNA by univalent and divalent cations in methanol-water mixtures.// J. Biomol. Struct. Dynam., (1986), 4, 477-489.

44. Grasso, D., Gabriele-Campisi, R., (1993), Liquid Crystals., 15, 701-708.

45. Kagemoto, A., Nakazaki, M., Kimura, S., Momohara, Y., Ueno, K.-I., Baba, Y., Calorimetric Investigation on Liquid Crystals of Deoxyribonucleic Acid in Concentrated Solutions.// Thermochim. Acta., (1996), 286, 309-324.

46. Esposito, D., Vecchio, P. D., Barone, G. J., (1997), J. Am. Chem. Soc., 119, 2606-2613.

47. Hud, N. V., Downing, K. H., Cryoelectron microscopy of lambda phage DNA condensates in vitreous Ice: The fine structure of DNA toroids.// Proc. Natl. Acad. USA, (2001), 98, 4925-14930.

48. Golan, R., Pietrasanta, L. I., Hsieh, W., Hansma, H. G., DNA toroids: stages in condensation.// Biochemistry, (1999), 38, 14069-14076.

49. Hansma, H. G., Golan, R., Hsieh, W., Lollo, C. P., Mullen-Ley, P., Kwoh, D., DNA condensation for gene therapy as monitored by atomic force microscopy.//Nucl. Acid. Res., (1998), 26, 2481-2487.

50. Gosule, L. C. & J. A. Schellman., DNA condensation with polyamines. II. Electron microscopic studies.// J. Mol. Biol., 1978, 21:311-326.

51. Bloomfield V. A., Condensation of DNA by multivalent cations: Consideration on Mechanism.// Biopolymers (1991), v.31, No3, p. 1471 -1481.

52. Chattoraj, D. K., L. C. Gosule & J. A. Schellman., DNA condensation with polyamines. II. Electron microscopic studies.// J. Mol. Biol., 1978, 121: 327337.

53. Laemmli, U. K., Characterization of DNA condensates induced by poly(ethylene oxide) and polylysine.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1975, 72: 4288-4292.

54. Wu,G.Y., Wu,C.H., The gradually decreasing NaCl concentration results in 10 binding of the DNA to the carrier.// J.Biol.Chem., 1987 ,262 ,4429 4432.

55. Polyanichko, A. M., Chikhirzhina, E. V., Skvortsov, A. N., Kostyleva, E. I., Colson, P., Houssier, C., Vorob'ev, V. I., The HMG1 Ta(i)le.// J. Biomol. Struct. Dynam., (2002), 19, 1053-1062

56. Ali, В. M. J., Amit, R., Braslavsky, I., Oppenheim, Gileadi, O., Stavans, J., Compaction of single DNA molecules induced by binding of integration host factor (IHF).// Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (2001), 98, 10658-10663.

57. Zheng, R., Ghirlando, R., Lee, M. S., Mizuuchi, K., Krause, M., Craigie, R., Barrier-to-autointegration factor (BAF) bridges DNA in a discrete, higherorder nucleoprotein complex.// Proc. Natl. Acad. USA, (2000), 97, 89979002.

58. Widom J., Baldwin R. L. Cation-induced toroidal condensation of DNA: studies with Co3+(NH3)6.// J. Mol.Biol.(1980), v. 144, p.431-453.

59. Pelta J., Livolant F., Sikorav J.-L., DNA aggregation induced by polyamines and cobalthexamine.// J. Biol. Chem. (1996) v.271, No 8, p.5656-5662.

60. Kasyanenko N., Zanina A., Nazarova O., Panarin E., DNA Interaction with Complex Ions in Solution.// Langmuir, 1999, 15, 7912-7917.

61. H. А. Касьяненко, В. В. Сморыго, Компактизация ДНК в растворе, индуцрованная её связыванием с поликатионами и точечными мультивалентными ионами.// Вестник СПбГУ, 2007, стр. 10-16.

62. Porschke, D., Dynamics of DNA condensation.// Biochemistry, 1984, 23, 4821-4828.

63. Bloomfield V. A., DNA condensation.// Current Opinion in Structural Biology, 1996

64. Plum G. E., Arscott P. G., Bloomfield V. A., Condensation of DNA by trivalent cations. Effect of cations structure.// Biopolymers, 1990, 30, 631643.

65. Endlich N., Greulich K. O., Observation and manipulation of different structural variants of individual cation-DNA complex in the light microscope.//J. Biotechology, 1995,41, 149-153.

66. Arcott P. G., Ma C., Wenner J. R., Bloomfield V. A., DNA condensation by cobalt hexamine(III) in alcohol-water mixtures: dielectric constant and other solvent effects.//Biopolymers, 1995, 36: 345-364

67. Marx, K. A., Structure and Dynamics of Biopolymers.// 1987, 133, 137-168.

68. Hud N. V., Downing K. H., Balhorn R., A constant radius of curvature model for the organization of DNA in toroidal condensates.// Proc. Nan. Acad. Sei. USA, 1995,92,3581-3585.

69. M. Takahashi, K. Yoshikawa, V. V. Vasilevskaya, and A. R. Khokhlov, Discrete coil-global transition of single duplex DNAs induced.// J. Phys. Chem. B 1997, 101, 9396-9401.

70. Reimer, S.C., Bloomfield, V.A., Packaging of DNA in bacteriophage heads: some considerations on energetics.// Biopolymers, 17, 1978, 785-794.

71. Wilson R. W., Bloomfield V.A., Counterion-induced condesation of deoxyribonucleic acid, a light-scattering study.// Biochemistry, 18, 1979, 2192-2196.

72. Burak Y., Ariel G, and Andelman D, Competition between condensation of monovalent and multivalent ions in DNA aggregation.// Current Opinion in Colloid and Interface Science, 9, 2004, 53-58.

73. Lyubartsev A. P., NordenskiÖld L., Monte Carlo Simulation Study of DNA Polyelectrolyte. Properties in the Presence of Multivalent Polyamines Ions.// J. Phys. Chem. B, 101, 1997, 4335-4342.

74. Masato Yamagata, Takahito Kawano,Kouhei Shiba,Takeshi Mori,Yoshiki Katayama and Takuro Niidome, Structural advantage of dendritic poly(l-lysine) for gene delivery into cells.// Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15, 2007, 526 -532.

75. Dalluge R., Haberland A., Zaitsev S., Schneider M., Zastrow H., Sukhorukov G., Bötter M., Characterization of structure and mechanism of transfectionactive peptide-DNA complexes.// Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1576, 45-52.

76. Mannistosto M., Vanderkerken S., Toncheva V., Elomaa M., Ruponen M., Schacht E., Urtti A., J. Of controlled release, 2002, 83, 169-182

77. Huggins M., The viscosity of dilute solutions of long chain molecules. IV. Dependence on concentration.// J. Am. Chem. Soc., 1942, 64, 11.

78. Цветков B.H., Эскин B.E., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворах// М., Наука, 1964.

79. Птицын О.Б., Эйзнер Ю.Е., Гидродинамика растворов полимеров. IV. О влиянии объемных эффектов на рассеяние света и константу трения макромолекул в растворе.//Высокомол. соед., 1959, 1(7), 966-977.

80. Птицын О.Б., Эйзнер Ю.Е., Гидродинамика растворов полимеров. II. Гидродинамические свойства макромолекул в хороших растворителях.// Журнал Тех. Физ., 1959, 29, 1117-1134.

81. Yamakawa Н., Fujii М., Intrinsic viscosity of wormlike chains determination of the salt factor.// Macromol., 1974, 7(1), 128-135.

82. Цветков B.H., Фрисман Э.В., Геометрическая форма и оптические свойства цепных макромолекул в растворе.// ДАН СССР, 1954, 47(4), 647-650.

83. Frisman E.V., Tsvetkov V.N., The effects of shape in streaming birefrigence of polymer solutions.//J. Polym. Sci., 1958, 30(121), 297-314.

84. Peterlin A., Viscosity and streaming birefrigence in the non-linear concentration range of macromolecular solutions.// J. Polym. Sci., 1954, 12, 45-51.

85. Фрисман Э.В., Сибилева M.A., Красноперова A.B., Гидродинамические и оптические свойства растворов полимеров в области больших концентраций.//Высокомол. соед., 1959, 1(4), 597-606.

86. Цветков В.Н., Жесткоцепные полимерные молекулы.// JI-д, Наука, 1986, 380.

87. Фрисман Э.В., Исследование оптического и гидродинамического поведения макромолекул в растворах синтетических и биологических полимеров.// Докт. дисс., JI-д, 1964.

88. Фрисман Э.В., Щагина Л.В., Воробьев В.И., Стеклянный ротационный вискозиметр.//Коллоид, журн., 1965, 27(2), 130-134.

89. Berne B.J., Pecora R., Dynamic Light Scattering With Applications to Chemistry, Biology, and Physics.// Dover Ed., Mineola, New York, 2000.

90. Веллюз П., Легран M., Грожан М., Оптический круговой дихроизм.// М., Мир, 1969.

91. Снатцке Г., Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм в органической химии.// М., Мир, 1970.

92. Кантор Ч., Шиммел П., Биофизическая химия.// М., Мир, 2, 1984.

93. Спирин А.С., Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. // Биохимия, 1958, 23(5), 656-662.

94. Фрисман Э.В., Касьяненко Н.А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в растворах большой ионной силы. Молек. биология (1990), вып.2, С.301-317.

95. Feuerstein, В. G., Pattabiraman, N., and Marton, L. J., Molecular mechanics of the interactions of spermine with DNA: DNA bending as a result of ligand binding.//Nucleic Acids Res., (1990), 18, 1271-1282.

96. Pattabiraman, N., Langridge, R., and Kollman, P. A., An iterative approach to placing counterions around DNA.// J. Biomol. Struct. Dyn., (1984), 1, 15251533.

97. Korolev, N., Lyubartsev, A. P., Nordenskio"ld, L., and Laaksonen, A.,

98. Competitive Substitution of Hexammine Cobalt(III) for Na+ and K+ Ions in Oriented DNA Fibers.// J. Mol. Biol., (2001), 308, 907-917.

99. Korolev, N., Lyubartsev, A. P., Laaksonen, A., and Nordenskio"ld, L., On the competition between water, sodium ions and spermine in binding to DNA. A molecular dynamics computer simulation study.// Biophys. J., (2002), 82, 2860-2875.

100. Suwalsky,M., Traub,W., Shmueli,U., Subirana,J.A., An X-ray study of the interaction of DNA with spermine.// J. Mol. Biol., 1969, 42, 363-373.

101. H. А. Касьяненко, В. В. Сморыго, Компактизация ДНК в растворе, индуцированная ее связыванием с поликатионами и точечными многовалентными ионами.// Вестник СПбГУ, 2007, 4, 2, 10-16.

102. Н. А. Касьяненко, Д. А. Мухин, Конформационные изменения молекулы ДНК, индуцированные формированием металлокомплексов в растворе.// Высокомолекулярные соединения, 2010, 52,7, 1360-1372.

103. Greenfield, N.; Fasman, G. D.; Computed circular dichroism spectra for evalution of protein conformation; Biochemistry, v. 8, N. 10, 1969, 4108 -4115.

104. J.A. Morrow, M.L. Segall, S. Lund-Katz et al., Differences in stability among the human apolipoprotein E isoforms determined by the amino-terminal domain.//Biochemistry, 2000, 38, 11657-11666.

105. Дрибинский Б. А., Касьяненко H. А., Влияние длины олигопептида на процесс конденсации ДНК в растворе.// Журнал Структурной химии (2011), т. 52, № 6,1239 1245.

106. Porschke, D., Structure and dynamics of double helices in solution: modes of DNA bending.// J. Biomol. Struct. Dynam. (1986), 4, 373-389.

107. J.-B. LePecq, C. Paoletti, A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids. Physical-chemical characterization.// J. Mol. Biol. (1967), 27, 87-106.

108. E. Nordmeier, Absorption spectroscopy and dynamic and static light DNA: implications for outside binding and intercalation.// J. Phys. Chem. (1992), 96, 6045-6055.

109. H.-P. Hsieh, J.G. Muller, C.J. Burrows, Synthesis and DNA binding properties of C3-, C12- and C24-substituted amino-steroids derived from bile acids.// Bioorg. Med. Chem. (1995), 3, 823-838.

110. Y. Xu., F.C. Szoka, Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection.// Biochemistry (1996), 35, 5616-5623.

111. C. N. N'soukpoe' -Kossi, A. Ahmed Ouameur, T. Thomas, A. Shirahata, T. J. Thomas, and H. A. Tajmir-Riahi, DNA Interaction with Antitumor Polyamine Analogues: A Comparison with Biogenic Polyamines.// Biomacromolecules (2008), 9, 2712-2718.