Кинетика ферментативного гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

003463485

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВ МИХАИЛ МИХАЙЛОВИЧ

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПОЛИПЕПТИДОВ И ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Специальность 02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2009

003463485

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор

Варфоломеев Сергей Дмитриевич

доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор

Валуева Татьяна Александровна

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « ^ ^—2009 г. в /! на заседании

диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.Э. Эмануэля РАН по адресу: 118334, г. Москва, ул. Косыгина, Д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан (^-¿-¿^f"-"! Л 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

М.А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время методы физической химии все шире применяются к комплексным объектам природного происхождения и сложным биохимическим процессам. Один из таких процессов - ферментативный гидролиз полимерных цепей полипептидов и белков (протеолиз) лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза пептидных связей от ограниченного протеолиза при активации ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении. Протеолизу принадлежит важная роль в процессах модификации пищевых белков и производстве белковых гидролизатов в пищевой промышленности. Получение биологически-активных пептидов протеолизом из неактивных белковых предшественников является перспективным методом получения биопептидов. Создание общей физико-химической модели протеолиза, включающей кинетическое описание процессов межцепочечных взаимодействий, приводящих к маскированию/демаскированию пептидных связей, и количественному выражению фермент-субстратного узнавания (специфичности) в отношении полимерного субстрата, является, таким образом, важнейшей задачей.

Гидрофобные явления играют ключевую роль в живой природе и в модельных полимерных водных системах, определяя гидрофобный коллапс полипептидных цепей в белках и переходы клубок-глобула в синтетических белковоподобных полимерах. Актуальной задачей является разработка методов анализа многокомпонентных водных смесей пептидов - в первую очередь с точки зрения количественного выражения гидрофобности пептидов и их склонности к гидрофобным взаимодействиям. Представляется перспективным определять параметры гидрофобности по упорядочению воды в гидратных оболочках неполярных групп, определяемому по поглощению электромагнитного излучения в миллиметровой части спектра.

Описание кинетики превращений смесей пептидных фрагментов требует компьютерного моделирования, которое должно учесть весь объем информации и представить результаты в форме, удобной для экспериментальной проверки. Понимание физико-химических закономерностей сложных процессов, таких как протеолиз, невозможно без создания компьютерных программ и комплексного экспериментального и теоретического подхода.

Все это делает исследование кинетики гидролиза полипептидов, компьютерное моделирование протеолиза и количественное изучение гидратации весьма актуальным. Целью работы является изучение физико-химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций, а также изучение гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах.

В рамках этого в диссертации решались следующие задачи:

1. Разработать аналитические методы и подходы, позволяющие определять константы скорости гидролиза пептидных субстратов протеолитическими ферментами в кинетических экспериментах, анализирующих как суммарную кинетику гидролиза пептидных связей, так и индивидуальную кинетику изменения концентраций пептидов по данным разделительных методов (обращеннофазная ЖХВД, количественный электрофорез, аминокислотный анализ).

2. Разработать пакет компьютерных программ, позволяющих предсказывать кинетику протеолиза для пептидных цепей, имеющих произвольную аминокислотную последовательность, с базой данных кинетических параметров для ряда протеолитических ферментов.

3. Разработать количественный метод определения гидратации методом миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, позволяющий изучать состояние воды в гидратных оболочках пептидов в различных водных системах и процессах, включая водные растворы глобулярных белков, протеолиз, взаимодействие полипептидов с казеиновыми мицеллами. Показать перспективность количественного изучения гидратации для определения шкал гидрофобности аминокислот, оценки стабильности полипептидных мицелл, оценки конформаций синтетических белковоподобиых сополимеров.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменений степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая - гидролиз.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза различных пептидных связей Р-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые предложен механизм демаскирования гидрофобного С-концевого участка при гидролизе р-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза химотрипсином пептидных связей по поглощению Л-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп. Впервые показано, что немонотонные участки нарастания аминного азота в ходе гидролиза связаны с маскированностью пептидных связей.

5. Изучена кинетика гидролиза панкреатином пептидов в реакторе открытого типа с удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярных фракций.

6. Показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка. Получена оценка для отношения констант демаскирования и гидролиза глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, которые описывают демаскирование и гидролиз пептидных связей. Программа позволяет удовлетворительно предсказывать кинетику протеолиза с различными параметрами специфичности и маскированности, а также состав продуктов протеолиза (состав гидролизатов), полученных при различных кинетических условиях.

8. Разработан метод определения параметров гидратации с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии. Метод имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, что впервые позволило использовать его для построения шкалы гидрофобности аминокислот и оценки количества неполярных групп, участвующих в гидрофобной гидратации или исключенных за счет гидрофобного взаимодействия. Метод позволяет определять кинетику развертывания белковой глобулы в ходе протеолиза.

9. Миллиметровая спектроскопия наряду с реологическими методами позволяет контролировать взаимодействие пептидов с казеиновыми мицеллами, в частности определять концентрации пептидов, при которых имеет место увеличение стабильности мицелл.

10. С помощью миллиметровой спектроскопии впервые показано, что гидрофобная модификация синтетических полимеров, не являющихся термочувствительными, приводит к меньшему изменению гидратации по сравнению с переходом клубок «-» глобула в термочувствительных полимерах.

Практическая значимость.

Кинетические параметры представлены в работе для таких практически важных протеаз как трипсин, химотрипсин, и пепсин при протеолизе белковых субстратов, выделенных из молока. Представленная общая методология анализа кинетики протеолиза дает возможность применить наработанные методы к другим белковым субстратам и протеазам, представляющим практический интерес. В работе рассмотрено применение модельных представлений для анализа кинетики образования низкомолекулярных продуктов протеолиза в реакторе открытого типа, моделирующего in vitro панкреатическую стадию пищеварения. Эта часть работы имеет практическое значение для количественных оценок пищевой ценности белков.

Детальное изложение принципов построения программы PROTEOLYSIS может быть полезным при разработке других компьютерных программ, моделирующих сложные биохимические процессы. Применение компьютерного моделирования протеолиза может

быть использовано для предсказания оптимальных кинетических условий получения белковых гидролизатов.

Использование метода количественного определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии открывает новые аналитические возможности при исследовании различных амфифильных систем (белковых и полимерных). Количественные измерения гидратации позволяют контролировать гидролиз пищевых белков и образование казеиновых гелей, что может быть использовано в пищевой промышленности. Защищаемые положения.

1. Расщепление пептидных связей в полипептидах происходит в две стадии: на первой осуществляется физический процесс информационной перестройки пептидной цепи (демаскирование); на второй происходит собственно химический процесс - гидролиз пептидных связей.

2. Стадия демаскирования дает немонотонные участки увеличения шинного азота в ходе гидролиза и обеспечивает наличие кинетики накопления некоторых пептидов с лагом.

3. Отношение констант скоростей демаскирования и гидролиза является важным параметром при количественном описании протеолиза,

4. Компьютерное моделирование протеолиза дает возможность предсказывать состав (главные компоненты) гидролизатов для различных гипотетических механизмов протеолиза.

5. Количество связанной воды растет с увеличением доступной для воды поверхности молекул, в частности, в начальной стадии протеолизе.

6. Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации.

7. Взаимодействие пептидов в небольшой концентрации с казеиновьми мицеллами приводит к увеличению стабильности мицелл, что определяется реологически и по изменению гидратации.

8. Гидратационные измерения позволяют дифференцировать конформационные состояния клубка и глобулы для синтетических белковоподобных полимеров.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке экспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов. Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по компьютерным вычислениям в химических исследованиях (Москва, Россия, 1996 г.); на V Симпозиуме по пищевым белкам (Потсдам, Германия, 1997 г.); на XIII Конференции Европейского коллоидного и поверхностного общества (Дублин, Ирландия, 1999 г.); на IX Симпозиуме по пищевым коллоидным системам, биополимерам и материалам (Вагенинген,

Голландия, 2002 г.); на VIII (Хельсинки, Финляндия, 1998 г.), IX (Зихрон Яков, Израиль, 2000 г.) Международных симпозиумах по свойствам воды; на Европейском полимерном конгрессе (Москва, Россия, 2005); на XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобини, Франция, 2007 г.); на XXIX Европейском конгрессе по спектроскопии молекул (Опатия, Хорватия, 2008 г.); на семинаре в научно-исследовательском центре фирмы «Нестле» (Лозанна, Швейцария, 1996 г.); на семинаре в Немецком федеральном центре по исследованиям в молочной промышленности (Киль, Германия, 1994 г.); на семинарах в Университете Лавадя (Квебек, Канада, 1992), Университетского колледжа Дублина (Дублин, Ирландия, 2002); на семинарах лаборатории физической химии полимеров ИНЭОС РАН.

Работа была выполнена при поддержке ряда проектов РФФИ, в том числе под руководством диссертанта: 98-03-32230 (Количественное изучение гидратации амфифяльных молекул) и 07-03-00131 (Количественное изучение гидратации ферментоподобных сополимеров с цвиттерионными группировками).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 статьях, а также в 7 тезисах указанных выше конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы из 291 наименования. Объем диссертации 273 страницы, включая 62 рисунка и 27 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы, приведены основные положения, выносимые на защиту, обсуждены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе рассмотрены литературные данные по кинетике ферментативного гидролиза полипептидов и белков, а также по экспериментальным методам определения гидратации и количественного выражения гидрофобных эффектов. Анализируются физико-химические предпосылки количественного описания гидролиза полипептидов с использованием методов химической кинетики.

Обосновано приближение, согласно которому эффективную константу скорости расщепления у'-ой связи (индекс ] обозначает различный тип гидролизуемых пептидных связей, СО группа которых входят в аминокислотный остаток ->ЩСН(1уСО-) можно представить в виде:

где к - константа гидролиза демаскированной связи определяемая аминокислотными остатками, расположенными около гидролизуемой связи и взаимодействующими с активным центром фермента, PJ -вероятность того, что у'-я связь демаскирована, т.е. доступна действию фермента. Р1 - определяется гидролизом других связей (не) -ой).

Проанализированы публикации по экспериментальному определению параметров гидрофобности (или в более широком смысле - гидратации) для аминокислот, пептидов и белков. Рассмотрены предпосылки разработки метода определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии. Рассмотрены гидрофобные эффекты с участием пептидов, в частности гидрофобный коллапс небольших белков и пептидов, который имеет значение для протеолиза.

Во второй главе описываются наши экспериментальные результаты по кинетике гидролиза различных полимерных пептидных субстратов различными протеолитическими ферментами в закрытых и открытых реакторах при изучении суммарной кинетики гидролиза пептидных связей и индивидуальной кинетики для отдельных компонентов.

Ферментативный гидролиз пептидных связей К^-ССМН-Иа + НгО ^СООН + КНгЯг был рассмотрен на примере ряда субстратов с различными аминокислотными последовательностями. Субстратами являлись природные полипептиды и белки, состоящие из природных аминокислотных остатков (таблица 1). Нас интересовали такие общие кинетические закономерности, которые бы не зависели от конкретного расположения аминокислотных остатков в последовательности, а были бы справедливы для любого полипептидного субстрата. В таблице 1 приведены значения гидрофобности аминокислот, полученные методом миллиметровой спектроскопии. Особенное внимание к гидрофобности обусловлено тем, что кластеры гидрофобных аминокислотных остатков могут обеспечивать маскирование пептидных связей, и таким образом замедлять протеолиз.

В разделе 2.1 приводятся экспериментальные данные по кинетике гидролиза Р-казеииа трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Интерес к продуктам протеолиза р-казеина, например, пептидам, образующимся из гидрофобного С-конца цели, обусловлен их физиологической активностью, в частности, способностью ингибировать ангиотензин-превращакмций фермент (АПФ).

Р-Казеин (вариант А1) в соответствующем буфере (рН от 7 до 10) был подвергнут гидролизу трипсином дикого типа или мутированными ферментами К188Н, К188Р, К188У, К188\У или К1880ЛЭ189К при 37°С. Отношения фермент/субстрат были 0.005, 0.005, 0.01, 0.02, 0.02 и 0.01 (в/в) для трипсина дикого типа и мутированных ферментов К188Н, К188Р, К188У, К188\У, К1880/ТИ89К, соответственно. Пробы отбирались через 30 мин, 1,2,4, 8,24 и 48 ч после начала реакции, затем закислялись чтобы остановить реакцию. Образующиеся в ходе протеолиза пептиды анализировались ЖХВД на обращенной фазе. Были обнаружены

кинетические кривые двух сортов: при гидролизе доступных пептидных связей получаются кривые, описываемые простыми экспоненциальными функциями. Для маскированных пептидных связей получаются кривые другого вида, - наблюдается кинетика с временной задержкой.

Таблица 1. Боковые радикалы и числа гидратации а-аминокислот (Нз>ГСНКСОО').

Аминокислота Боковой радикал Я №

Gly Н -1.3

Ala Ме 1.9

Val СН(Ме)2 6.2

Leu СН2СН(Ме)2 7.4

Ile СН(Ме)Е1 8.2

Asp СН2СООН 1.4

Ser СН2ОН 0.8

Trp СНг~!ПО н 7.1

Phe СН2РЬ 6.5

Asn СН2СОКН2 0.8

Arg (СН2)3ННС(=Ш)Ш2 2.5

His СН 1.9

Gin СН2СН2СОШ2 1.9

Glu СН2СН2СООН 1.4

Lys (СН2)4Ш2 3.4

Met СН2СН2ЗМе 3.9

Pro6 ^ хоон 2.2

Thr н СН(ОН)СН3 2.2

Тут СН2С6Н4ОН-р 5.4

" Числа гидратации цвиттерионов аминокислот определены методом миллиметровой спектроскопии.

8 Приведена формула для всей аминокислоты.

Пример хроматограммы трипсинового гидролизата р-казеияа представлен на рис. 1. В финальных гидролизатах были найдены следующие 12 моноблочных пептидов: А Агё25), В (11е26-Ьук28), С (Ьуз29-Ьуз32), Б (РЬеЗЗ-Ьу'548), Е (Ие49-Ьуз97), Р (ОМОО-

LyslOS), H (Glul08-Lysll3), I (Tyrll4-Lysl69), J (Val 170-Lysl76), К (Alal77-Argl83), L (Asp 184-Arg202), N (Gly203-Val209); четыре диблочных пептида: D-E (Phe33-Lys97), G-H (Hisl06-Lysl 13), Val-Lys-F (Val98-Lysl05), L-N (Aspl84-Val209) и один триблочный пептид G-H-I (Hisl06-Lysl69). Образование пептидов А и L-N определяется гидролизом связей Arg-X (Arg25-Ile26 и Argl83-Aspl84). Образование пептидов D, Е, Н, С, F, I, J определяется гидролизом связей Lys-X.

А214

"f

в ^

F 3 11

о4

Их

20

40

60

Время (мин)

1 А

H.Arg-Glu-Leu-Glu-G!u-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-GIu-Ser-IIe-Thr-25 В С D

Arg-i-Ile-Asn-Lys-^- Lys-i-Ile-Glu-Lys-|-Phe-Gln-SerP-Glu-Glu-Gta-Gto-Gta-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu-Gta-Asp-48 Е

Lys-i-Ile-His-Pro-Phe-Ala431n-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-I!c-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-73

AsnJ!c-Pro-Pro-Leu-Thi-Gln-Tíir-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phc-Leu-G!n-Pro-Glu-VaI-Met-Gly-Va!-Ser-Ly5-i-98 F G H

Val-Lys-J.-Glu-Ala-Met-AIa-Pro-Lys-i-His-Lys-i-GIu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys-1-Tyr-Pro-VaI-Gla-Pro-Phe-Thr-121 I

Glu-Sei-Gto-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Asp-Val-Glu-Asn-Leu-His-Leu-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-146

Gln-Pro-His-Gta-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-j-Val-171 J К L

I^ü-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-l-Ala-Val-Pro-Tyi-Pro-Gln-Arg-l-Asp-Met-Pro-Ile-Gln-AIa-Phe-Leu-Leu-Tyr-Gln-195 N 209

Glu-Pro-Val-Uu-Gly-Pro-Val-Arg-i-Gly-Pro-Phe-Pro-ne-Ile-Val.OH

Рис. 1. Обращеннофазная ЖХВД трипсинового гидролизата р-казеина. Расположение образующихся пептидов в аминокислотной последовательности р-казеина показано латинскими буквами. Пептиды были разделены на колонке Nucleosil Си (4.6 mm х 25 cm, SFCC, France) с линейным градиентом растворителя А (0.11% трифторуксусной кислоты ) к 100% растворителя В (60% ацетонитрил, 40% Н20,0.09% трифторуксусной кислоты) за 62.5 мин.

При мутациях 188 остаток лизина, находящийся вне активного центра трипсина, менялся на другой остаток (например, Phe в мутированном ферменте K188F). Поэтому первичная специфичность трипсина сохранялась, - гидролизовались связи, образованные аргинином и лизином. Отношение констант скоростей гидролиза второго порядка для субстратов, содержащих остатки Arg и Lys в позиции PI, отражают первичную специфичность фермента. Эти отношения представлены в таблице 2 для гидролиза доступных связей ß-казеина в сравнении с синтетическими амидными субстратами.

Таблица 2. Преимущество скоростей гидролиза субстратов, содержащих остаток Arg, над

субстратами, содержащими остаток Lys.

Фермент pH п-нитроанилид тетрапептида" fcaÄCArg) Субстрат пептиды из ß-казеина6 ÄArg(Arg25-IIe26)

fcaÄf(Lys) kL ys(max)

трипсин 7 22 7.4

дикого 8 7.0 8.0

типа 9 4.2 5.1

10 4.3 3.7

К188Н 7 - 1.3

8 8.7 1.5

9 - 1.4

10 ■ 3.8

K188F 7 8.7 1.1

8 8.2 1.2

9 6.3 1.2

10 6.0 0.7

К188 Y 7 10 7.3

8 5.2 14

9 7.7 11

10 8.8 10

K188W 7 8.8 4.3

8 10 13

9 15 И

10 - -

K188D/D189K 7 - 12

8 22.5 13

9 - 11

10 - 6.6

'Субстрат: Suc-AIa-AIa-Pro-X-pNA (X=Arg, Lys).

%_у5(тах) является средней константой скорости гидролиза связей Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glul 00, Lysl05-Hisl06, Lysll3-Tyrll4, Lysl69-Vall70, Lysl76-AIal77.

В случае синтетических субстратов для всех изученных мутированных трипсинов было найдено существенное преимущество гидролиза субстратов, содержащих остаток Arg,

над субстратами, содержащими остаток Lys. Для (3-казеина такого преимущества не было найдено для ферментов К188Н и K188F. По-видимому, изменение аминокислотного остатка вне активного центра может приводить к изменениям специфичности в рамках первичной специфичности за счет дополнительного связывания фермента с длинными пептидными субстратами.

Накопление пептида Gly203-Val209 (пептид N) при гидролизе связи Arg202-Gly203, происходит с временной задержкой (кинетика с лагом). Существенно, что это наблюдается для всех мутированных ферментов и трипсина дикого типа. Таким образом, мы приходим к необходимости привлечения понятия маскированности, определяющейся строением субстрата вне зависимости от специфичности фермента.

Рис. 2 показывает принципиально различную кинетику накопления N-, С-концевых пептидов, образующихся соответственно из гидрофильного и гидрофобного конца полипептидной цепи Р-казеина. Согласно данным миллиметровой спектроскопии средняя гидрофобность участков цепи р-казеина составляет 2.96 (участок 1-46), 3.53 (участок 44-92), 3.13 (участок 93-135), 3.61 (участок 136-178), 3.06 (участок 179-189) и 4.20 (участок 190-209). Приведены средние числа гидратации для смесей аминокислот, эквивалентных по аминокислотному составу соответствующим участкам цепи. Гидрофобные участки 44-92, 136-178 и 190-209 могут взаимодействовать, образуя гидрофобный кластер. Гидролиз связи Lys-X (например, Lys 105-His 106) или связи Argl83-Aspl84 может приводить к разрыву полипептидной цепи, связывающей один из этих гидрофобных участков с остальными. В результате следует ожидать увеличения конформационной подвижности и запуска механизма демаскирования пептидной связи Arg202-Gly203.

Образование С-концевого пептида было описано нами двухстадийной схемой. На первой стадии изначально недоступные для ферментативной атаки маскированные пептидные связи Вт превращаются в демаскированные связи Bj. На второй стадии эти связи гидролизуются в соответствии со специфичностью, определяемой аминокислотной последовательностью:

kd h

Вт (Схема!)

где ка - константа скорости демаскирования, к/, - константа скорости гидролиза демаскированных связей, Л'- аминный азот.

Согласно схеме 1, время задержки тпри гидролизе связи А^02 равно:

кЛк,

к, "г К

где к^'Я.ки- константы скоростей демаскирования и гидролиза связи А^202.

Время(ч)

Рис.2. Гидрофобный кластер, маскирующий С-концевой фрагмент полипептидной цепи р-казеина. Образование доступного для фермента И-концевого пептида описывается простым уравнением Л(0=Ло(1-е"*'). Образование С-концевого пептида С1у203-Уа1209 (пептид К) происходит по схеме 1, где пептидная связь А^202-01у203 является изначально недоступной (маскированной).

Эта формула была использована для вычисления констант скорости демаскирования по измеренным временам г для трипсина дикого типа и мутированных ферментов.

Нами предложено использовать отношение констант скоростей гидролиза и демаскирования для выявления той пептидной связи в расщепляемой полипептидной цепи,

гидролиз которой запускает демаскирование (таблица 3). Для такой связи константа скорости гидролиза должна быть близка к константе демаскирования. Как показывает таблица 3, гидролиз одной из связей Lys-X может запустить процесс демаскирования для всех ферментов кроме K188F. Для K188F лимитирующей стадией может быть гидролиз связи Argl 83-Aspl 84.

Из приведенных в разделе 2.1 кинетических данных следуют следующие отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза (kjfa) для пептидной связи Gly203-Val209: 11.5 (трипсин дикого типа); 20.5 (К188Н); 3.8 (K188F); 9.5 (K188Y) и 10.5 (K188D/D189K). То есть, для гидрофобного С конца р-казеина параметр демаскирования в среднем равен 10, в то время как для демаскированных пептидных связей kjk¿>> 1.

Таблица 3. Отношение константы скорости гидролиза к константе скорости демаскирования

fe.

Фермент рН Константа скорости / константа демаскирования

jfc(Arg25-11е2б )/fe hys-Л ¿(Argl 83-Aspl 84)/fe

трипсин 7 6.2 0.8 2.7

дикого 8 7.5 1.0 2.0

типа 9 5.0 1.0 2.0

10 2.7 0.7 0.7

К188Н 7 1.0 - 1.9

8 1.4 0.9 4.6

9 1.4 1.0 2.2

10 З.б 1.0 3.0

K188F 7 1.8 1.7 0.4

8 4.2 3.6 0.8

9 З.б 3.0 0.5

10 1.8 2.6 0.4

K188Y 7 1.0 1.3 1.1

8 8.9 0.7 2.1

9 11.0 1.0 2.3

10 11.6 1.2 2.6

K188D/D189K 7 9.5 0.7 3.1

8 10.7 0.8 2.9

9 10.1 0.9 3.6

10 5.9 0.9 -

В разделе 2.2 описываются протеолитические эксперименты с описанием кинетики по изменению концентрации суммы аминогрупп, образующихся при гидролизе пептидных связей. Определение суммарной кинетики проводили по поглощению ТЯ-тринитрофенильных производных всех продуктов гидролиза НгКЯ, получаемых с использованием тринитробензосульфокислоты:

Накопление аминного азота N при протеолизе суммарного казеина химотрипсином представляет немонотонную функцию (рис.3).

Время (мин)

Рис. 3. Кинетические кривые Щ) для протеолиза суммарного казеина химотрипсином. Концентрация субстрата 0.05 г/л (•) и 0.2 г/л (■).

Для объяснения причин возникновения немонотонных зависимостей N(7) (локальных максимумов скорости сММ) бьи использован оригинальный подход. Константу скорости второго порядка <кш/Км> и обратную величину эффективной константы Мяхаэлиса <\/Км> считали функциями степени гидролиза Ф=М8о (<...> - знак усреднения по всем разновидностям пептидных связей). Тогда выражение для скорости гидролиза пептидных связей принимает вид:

ав= (к)Р8аЕй

л 1 +

где N - концентрация аминного азота, В - концентрация пептидных связей, S(гB+N -общая концентрация всех аминокислотных остатков, Ец - общая концентрация фермента, о) - вероятность демаскирования субстрата (межмолекулярный процесс). <к> -усредненная величина по всей совокупности индивидуальных констант к' = к'ст / К'м:

(4)

где В - концентрация пептидных связей сорта} во всей совокупности пептидных связей, Р1 -вероятность демаскирования пептидных связей сорта/ (внутримолекулярный процесс). Член <£>, представляющий сумму произведений индивидуальных констант гидролиза на долю демаскированных связей, определяет изменение в ходе протеолиза вклада демаскирования в суммарную скорость процесса. По форме уравнение (3) имеет вид уравнения Михаэлиса-Ментен, но вместо постоянных величин (константы второго порядка и константы Михаэлиса), в него входят функции. Например, константа второго порядка является усредненной величиной по ансамблю демаскированных пептидных связей (уравнение 4). Описание протеолиза сводится, таким образом, к определению функциональных зависимостей усредненных величин.

Зависимость <к> от О// (ОН=с1\ 00%), измеренная по экспериментально определенной зависимости скорости У(ВН), представлена на рис. 4 для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4, 0.2, 0.1 г/л. Функция <к>, зависящая от индивидуальных констант гидролиза и процесса демаскирования, имеет локальный максимум в области 2-4% степени гидролиза. Таким образом, показано, что наблюдаемые немонотонные особенности суммарных кинетических кривых (рис. 3) связаны с демаскированием.

Примеры изменения в ходе протеолиза УфН) для индивидуальных казеинов представлены на Рис. 5, показывающем различные зависимости для а и Р казеинов. Для а-казеина имеет место убывающая монотонная зависимость, а для р-казеина зависимость У(ОН) имеет локальный максимум. По зависимостям скорости гидролиза от степени гидролиза в экспериментах, выполненных при низких концентрациях субстрата (<0.01 %), можно качественно определить уровень маскирования при гидролизе данного субстрата. Сравнение зависимостей для а- и р-казеинов показывает, что пептидные связи в Р-казеине маскированы больше.

| 1 средние значения]

| • 5о=0.1г/л !

! - ■ л - -Зо=0.2г/л

• | О Эо=0.4г/л

д •

л •

А

^

■ Ця Д-4' 4 • ^ЧЛЗП.сп п

2 4 6 8 10

Степень гидролиза пептидных связей (%)

12

Рис. 4. Зависимость <к> от О// для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4,0.2, и 0.1 г/л. £о=6.6-10"8М.

ОН (%)

Рис. 5. Зависимость К от ОН для протеолиза а-, р-казеина химотрипсином при

концентрации субстрата 0.05 г/л. £<г6.б-10"8М.

В разделах 2.3 и 2.4 рассмотрены другие количественные методы определения кинетических параметров протеолиза, связанные с использованием электрофореза в

ацетатцеллюлозных пленках и аминокислотного анализа низкомолекулярных фракций гидролизатов.

В разделе 2.3 показано, что логарифм концентрации исходного полипептида (белка) убывает линейно со временем протеолиза, т.е. формально наблюдается кинетика 1-го порядка.

Из таблицы 4 видно, что для обеих температур константы второго порядка скоростей гидролиза для казеинов больше, чем для глобулярных белков примерно на два-три порядка. В глобулярных белках, гидролиз лимитируется маскированием пептидных связей, связанным с упаковкой полипептидной цепи в белковой глобуле.

Таблица 4. Константы скоростей деградации полипептидных субстратов под действием химотрипсина.

Субстрат Т,°С Е0, мкг/мл к], мин"!хЮ"2 irtfficM-'c1

Р-казеин 35 0.2 9.2 2.9x10s

а-казеин 35 0.2 16.8 5.3x10s

р-лг 35 100 25 1.6xl03

БСА 35 12 2.3 1.2x103

а-ЛА 35 12 0.44 0.23x103

Р-казеин 25 0.6 3.6 0.38х105

а-казеин 25 0.6 7.4 0.78x10s

р-лг 25 95 3.3 2.2х102

БСА 25 7.5 0.21 1.75х102

а-ЛА 25 7.5 0.036 О.ЗхЮ2

В качестве верхней оценки отношения константы скорости демаскирования глобулы к средней константе скорости гидролиза одной доступной пептидной связи получаем kjh ~ Ан(сыв.)/Ап(каз.)хи = 0.0035x10 = 0.035 0.04 (где /¡=10 - оценка числа доступных специфичных пептидных связей в казеинах, гидролизуемых без временной задержки). Оценку п мы смогли выполнить только приближенно. Например, для гидролиза (J-казеина трипсином, рассмотренного в разделе 2.1, такими связями являются Arg25-Ile26, Argl83-Aspl84, Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glul00, Lysl05-Hisl06, Lysll3-Tyill4, Lysl69-Vall70, Lysl76-Alal77 (л=9).

Отдельная группа экспериментов (раздел 2.4) посвящена гидролизу в реакторе открытого типа, моделирующем in vitro панкреатическую стадию пищеварения. В диализном

мешке в качестве субстрата находилась смесь пептидов, полученная пепсиновым гидролизом пищевого белка, и панкреатин. Экспериментальная установка по гидролизу панкреатическими ферментами была предложена Савуа и Гаутье (Университет Лаваля, Квебек, Канада)1. Отобранные пробы представляли собой продукты гидролиза с молекулярной массой меньше 1000, вымытые из диализного мешка потоком буфера в разные моменты времени. После полного кислотного гидролиза проводили аминокислотный анализ отобранных проб. Накопление каждой аминокислоты / (1<1<16, число анализируемых аминокислот) в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза определялось по нарастанию величины Д=(содержание ; -ой аминокислоты в диализате) / (содержание той же аминокислоты в белке). Показано, что выход из реактора специфичных для трипсина и химотрипсина аргининовых, лизиновых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков опережал выход других аминокислотных остатков. Относительная константа скорости кь характеризующая обогащение низкомолекулярной фракции аминокислотными остатками ¿, определялась с помощью выражения:

taG^SJ

' la(l-D)

где D=£DiWi, а wt -молярная доля аминокислотных остатков i в белковом субстрате.

Сравнительный анализ проводился для пепсиновых гидролизатов суммарного казеина (СК) и относительно более маскированного изолята белков рапса (ИБР). Статистический анализ был применен ко всему массиву экспериментальных данных, полученных с различными отношениями E/S и временами отбора проб.

Для более маскированного субстрата наблюдалось более узкое распределение функции распределения вероятности для констант к, (Рис.6). Для демаскированного субстрата СК специфичные связи гидролизуются с максимально возможной скоростью, отсюда и широкое распределение Р(к,) для казеинового субстрата. С этим согласуются данные по разности констант обогащения низкомолекулярных фракций специфичными (Arg, Lys, Туг, Phe) и неспецифичными аминокислотными остатками.

Кроме субстратов СК и ИБР анализ кинетики протеолиза панкреатином в реакторе открытого типа был выполнен для пепсиновых гидролизатов нативного р-лактоглобулина, препарата сывороточЕпах белков молока и препарата термически обработанных сывороточных белков молока.

0

Рис. 6. Вероятность ?(£,) (%) того, что измеренные величины kt принимают значения, отложенные по осиХ.

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3

К

Таким образом, в главе 2 предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений для произвольных фермент-субстратных пар. Показано, что кинетика протеолиза в случае суммарной кинетики и кинетики образования индивидуальных продуктов соответствует двух стадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидной связи, а вторя стадия соответствует гидролизу. Таким образом, перспективной представляется модель, согласно которой имеется «резервуар» пептидных связей, которые демаскируются в ходе протеолиза и поступают в сферу реакции. Эта модель оказалась подходящей для описания протеолиза как глобулярных белков, так и относительно подвижных казеиновых полипептидных цепей.

Глава 3 посвящена описанию принципов компьютерного моделирования, заложенных нами при разработке пакета компьютерных программ, а также описанию результатов моделирования конкретных примеров протеолиза, описанных в главе 2.

В разделе 3.1 описывается пакет компьютерных программ, и демонстрируются его возможности.

Уравнения, описывающие гидролиз пептидных связей, имеют вид:

Z Щ,{ + j)kO{i,j + l,i + j)+ £N(m,i + j-m)k0(m,i + j-m,ï) £

i-l

-N(iJ)j:kO(iJ,i+p)E p-1

(6)

1 Savoie L., Gauthier S.F. // J. Food Sei. - 1986. - V.51. - P. 494.

Здесь Щ, ]) - концентрация фрагментов (1, /), имеющих г'-ый номер Скопца (К' - конец фрагмента образован гидролизом ¿-ой пептидной связи) и длиной] аминокислотных остатков (г изменяется от 0 до изменяется от 1, причем ¿+/<Л0, к0( 1,7,1) - обозначает константу скорости второго порядка гидролиза пептидной связи, имеющей номер /, в фрагменте (},]), Е - концентрация свободного фермента, N - число аминокислотных остатков в исходной полипептидной цепи.

Матрица констант скоростей была представлена в виде:

ЩШ) = кн (и,*)Ра , (7)

где - константа, вычисляемая по инкрементам специфичности Ку.з, К,-2, 11;-ь Ц/>

я^з, хад^ ад -

вероятность того, что атакуемая пептидная связь является демаскированной, ¿(/¡Л?) -концевая функция, уменьшающая константу скорости для пептидных связей, находящихся близко к концам цепи, г - номер пептидной связи, гидролиз которой образовал К-конец фрагмента длиной /, я - номер атакуемой пептидной связи.

Уравнение, описывающее демаскирование, имеет вид:

^ = ~к,ВтЕ, (8)

где Вт - концентрация маскированных пептидных связей (связей во всей цепи или части цепи), ка - константа скорости демаскирования.

Уравнениями материального баланса являются (небольшие концентрации субстрата):

Субстрат: = (9)

Фермент: £ = £0/[1 + 50/^м№], (10)

где Е0 - общая концентрация фермента, - константа Михаэлиса, которая

представляется в виде функциональной зависимости степени гидролиза пептидных связей; 80 - общая концентрация субстрата (суммарная концентрация всех аминокислотных остатков во всех компонентах гидролизата).

Алгоритм вычисления кинетических констант гидролиза пептидных связей в пептиде с произвольной последовательностью аминокислотных остатков по соответствующим

инкрементам для аминокислотных остатков был задан по аналогии с подходом, разработанным В.К. Антоновым, A.A. Зинченко и Л.Д. Румшем для пепсина2,3. Специфичность фермента по отношению к атакованной пептидной связи является аддитивной функцией вкладов аминокислотных остатков (максимум 10 остатков), взаимодействующих с сайтами фермента.

Рис.7. Блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS.

База данных, включающая инкременты для наиболее изученных протеолитических ферментов, входит в программу PROTEOLYSIS. Когда учитывается весь массив информации, константа гидролиза к-п вычисляется по 10 переменным:

h = f(Ri-4 > 3 > Щ-2 > ^i-l»Я,-, Я/+1, Я/+2, Я/+3, Л/+4, 5 ) , (11)

где ft ) - функциональная зависимость, определенная по экспериментальным данным гидролиза относительно коротких пептидов. Гипотетическое уменьшение размера активного центра фермента было промоделировано путем уменьшения размерности массива данных (например, с 10 до 5).

Главное меню программы PROTEOLYSIS включает следующие опции: HELP, PROTEIN, ENZYME, KINETIC CONDITIONS, SIMULATION, RESULTS, QUIT. На рис. 7

2 Зинченко A.A., Румш Л.Д., Антонов B.K. // Биоорган, химия. - 1997.-Т.З, №12. - С.1663.

3 Зинченко A.A., Румш Л.Д., Антонов В.К. Н Биоорган, химия, -1976.- Т.2, №6, - С. 803.

показана блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS. Пользователь задает фермент из списка, предлагаемого программой, и субстрат (определяет аминокислотную последовательность с помощью специальной процедуры, рис. 7, пункты 2 и 3). Кроме того, пользователь задает начальные концентрации субстрата и фермента, а также время протеолиза (пункт 1). Поскольку параметр демаскирования не определяется автоматически, пользователь должен выбрать то приближение, в котором проводится компьютерное моделирование.

. Help": prateiaЕмуше , Kinetic conditions Simulation- BesultB Quit .

Specificity

parameters

Run

Protein » beta-lactoglobulin в

Con^fent-xatlob. tog/ml) ; 8*5

5:Gzyir.es i

concentration [шд/ml) t al - 0.1

, Froteplyaie tine Gain) t tl - 12

pH i ■ pHl - 3

Temperature I'O t . T1 = 37

pepsin

-Step . C0.3C

■ Calculation -

Secondary •

• jiai-t, please ,. . SgC-ttert

Рис. 8. Главное меню и процедура вычислений при помощи программы PROTEOLYSIS (пункт меню SIMULATION/RUN).

На рис. 8 показана процедура вычислений (пункт меню SIMULATION), следующая после определения условий протеолиза (пункт меню KINETIC CONDITIONS). Перед началом счета необходимо определить приближение, в рамках которого представляется специфичность фермента (первичная или вторичная специфичность, пункт меню SIMULATION / SPECIFICITY). При моделирований в рамках первичной специфичности учитываются только аминокислотные остатки, находящиеся в позиции Р+ь Этот режим компьютерного моделирования, требующий наименьшего времени вычислений, применяется для грубой оценки результатов протеолиза. В приближении вторичной специфичности учитывается массив данных специфичности согласно уравнению (11).

После численного интегрирования дифференциальных уравнений (6) - (8) с использованием процедуры Рунге - Кутга (рис. 7, пункт 4, SIMULATION / RUN), программа представляет выходные данные в графической форме (рис. 7, пункт 5, RESULTS). Программа также осуществляет поиск главных компонент гидролизатов в любой момент времени и выводит их список (рис. 7, пункт 6, RESULTS). Предусмотрена возможность файлового способа хранения результатов вычислений и создание библиотеки данных

компьютерного моделирования протеолиза. Программа PROTEOLYSIS написана нами на языке С.

В разделе 3.2 приводятся результаты моделирования гидролиза пепсином -протеолитическим ферментом с хорошо выраженной вторичной специфичностью. Примеры результатов моделирования представлены на рис. 9 и 10 для пепсинолиза частично демаскированной цепи Р-ЛГ. Увеличение степени гидролиза по ходу протеолиза (рис.9) представлено при двух значениях отношения константы скорости демаскирования к константе скорости гидролиза.

Степень гидролиза d(t) 6.08

Рис. 9. Зависимости степени гидролиза от '■■/■". •/.г: времени. Условия численного

' а.о+эксперимента: S0 = 5 мг/мл,£0 = 0.1 мг/мл,

- l-kJkh=4,l-kd/kh=QM.

О.Й2

0 20 40 80 ВО 100 120

Время протеолиза (мин)

Концентрация N(ij)

Время протеолиза (мин)

Рис. 10. Изменения концентраций индивидуальных компонентов в ходе протеолиза: 1 - негидролизованный Р-ЛГ, 2 - Ьец'^-Ие162, 3 - Ьу515-Ис'62, 4 -01и157-11е162. Параметр демаскирования в численном эксперименте - 4.

В таблице 5 проведено сравнение сайтов расщепления, определенных экспериментально и предсказанных компьютерным моделированием. Восемь экспериментально определенных сайтов представляют собой сайты, которые были определены в экспериментах по гидролизу пепсином р-лактоглобулина, демаскированного высоким давлением и действием этанола. Эффективность предсказания 50% (четыре из восьми) существенно превышала вероятность угадывания (20/161х100%=12%).

Таблица 5. Влияние размерности активного центра пепсина на результат компьютерного моделирования расщепления пептидных связей Р-лактоглобулина.

Сайты расщепления* Вторичная Результаты компьютерного предсказания при структура размерности активного центра 3, 5, 10 аминокислотных остатков

3 5 10

Asp(ll)-Ile(12) +

Trp(19)-Tyr(20)

Leu(31)-Leu(32) + + +

Leu(54)-Glu(55) P

Phe(82)-Lys(83) P + +

Ala(132)-Leu(133) a + +

Leu(147)-Ser(148) P

Leu(156)-GIu(157) + +

* Совпадающие сайты, найденные в экспериментах по пепсиновому гидролизу, частично денатурированного высоким давлением и действием этанола.

В разделе 3.3 приведены данные по компьютерному моделированию протеолиза трипсином и химотрипсином, т.е. ферментами, обладающими в основном первичной специфичностью. Компьютерная программа PROTEOLYSIS была использована для предсказания гидролиза р-казеина трипсином дикого типа при различных предположениях относительно его субстратной специфичности. Было исследовано образование 17 основных пептидов в зависимости от степени гидролиза пептидных связей (таблица 6). Наборы кинетических констант менялись в зависимости от принятых предположений, относительно специфичности фермента. Данные таблицы 6 позволяют проследить, как увеличивается эффективность предсказания при учете более полной информации о специфичности (неспецифичный гидролиз —» только первичная специфичность —» первичная + вторичная специфичность —»демаскирование + первичная + вторичная специфичность).

Таблица 6. Предсказание основных продуктов протеолиза 6-казеина трипсином с помощью программы PROTEOLYSIS при различных моделях протекания протеолиза. DH DM _Продукты гидролиза_ ЕР

(%) (%) моноблочные диблочные высшие продукты (%)

неспецифичный протеолиз (клгг = kiyJ

3.3 41 A,D,E,I,K,L,N ВС, JK, CD, DE, IJ, EF, LN UK, BCD, HIJK 20

только первичная специфичность (клгг = б- kiys)

3.4 41 A, D, Е, I, К, L, N ВС, CD, DE, EF, HI, JK, LN BCD,IJK,HIJK 20 4.7 71 A,B,D,E,H,1,K,L,1S CD, DE, EF, HI, IJ, JK DEF.IJK 13 6.1 65 A, B, D, E, F, H, I, J, K, L, N CD, DE, EF, HI, IJ IJK 17

первичная специфичность+вторичная специфичность*

4.2 29 A, D, E, F, I CD, IJ, DE, KL, LN BCD, CDE, GHI, JflJ, KLN, GHU 25

5.0 35 A, D, E, F, I, J CD, U, DE, HI, KL, LN CDE, GHI, HIJ, KLN, GHIJ 27

6.1 53 A, D, E, F, I, J, K, L, N IJ, HI, KL, LN KLN, GHI, HIJ, GHU 25 6.4 65 А, В, C, D, E, F, I, J, K, L, N IJ,HI,KL,LN GHI.HIJ 33

первичная специфичность^вторичная специфичность * + маскирование** 6.3 65 А, В, С, D, Е, F, I, J, К, L, N DE, GH, Ш, LN, EF GHI 67

♦Использованы константы скоростей для вторичной специфичности из базы данных программы PROTEOLYSIS.

Вероятность демаскирования считалась обратно пропорциональной средней гидрофобности 6 аминокислотных остатков, ближайших к расщепляемой связи. Число основных компонентов - 17. Моноблочные продукты (А, В, С, F, D, J, Е, Н, К, N, I, L), диблочные продукты (L-N, D-E, G-H, E-F) и триблочный продукт G-H-I были определены экспериментально (выделены жирным шрифтом, рис.1).

DH - степень гидролиза (число гидролизованных связей / число аминокислотных остатков •100%).

DM -процент моноблочных пептидов в гидролизате.

ЕР - эффективность предсказания (отношение суммы правильно предсказанных диблочных и высших продуктов к общему количеству предсказанных диблочных и высших продуктов.

Из содержания таблицы 6 можно сделать вывод, что набор главных компонентов меняется в ходе протеолиза (от степени гидролиза пептидных связей). Наибольшее количество предсказанных продуктов протеолиза было когда учитывалась вторичная

специфичность и эффект демаскирования пептидных связей. Эффективность предсказания увеличивалась до 67% от уровня 20%.

В аналитическом виде была рассмотрена кинетика демаскирования маскированных пептидных связей В'т = X1 и кинетика гидролиза демаскированных связей BJd = Y1 (индекс j обозначает различный тип пептидных связей, СО группа которых входит в аминокислотный остаток -NHCH(Rj)CO-):

дуJ _-kJy-> +kdXJ dXJ -kdXJ '

где к - константа скорости гидролиза пептидных связей типа j, kj - константа скорости демаскирования, которая считается одинаковой для всех пептидных связей. Зависимость только от одного типа бокового радикала Rj (1</<20) показывает, что наше рассмотрение применимо к протеазам, обладающим первичной специфичностью.

Несколько характерных случаев гидролиза химотрипсином были рассмотрены и результаты представлены в виде зависимостей <к> от d (Рис. 11 и 12). В расчетах учтены кинетически значимые различия связей, образованных специфичными остатками Тгр, Туг, Phe и менее специфичными Leu, Met, Asn и Gin. Для прочих связей считалось, что Варьировались параметр т, выражающий начальную степень маскирования, индивидуальные константы и константа демаскирования кф Величина kj выбиралась с таким расчетом, чтобы параметр демаскирования kJ<kiP> был порядка 10, что соответствует экспериментально найденному значению этого параметра для демаскирования гидрофобного С-конца ß-казеина при протеолизе трипсином.

Протеолиз а-казеина (рис. 5) близок к случаю, когда большинство пептидных связей изначально демаскировано (рис.11). Протеолиз суммарного казеина (рис. 4) близок к случаю, изображенному на рис. 12, когда начальные концентрации маскированных и демаскированных связей были соизмеримы (т=0.6). При этом наблюдается заметное замедление, а затем увеличение скорости (вплоть до образования экстремумов) в районе d=2-4%, что было подтверждено экспериментально (рис.4).

Таким образом, в третьей главе описаны принципы компьютерного моделирования протеолиза. Описана программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту. Программа позволяет предсказывать кинетику гидролиза с различными параметрами специфичности и

маскированности, что позволяет проверять механизмы протеолиза. Программа удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) и состав гидролизатов.

i —•—kj={1. 0.58, 0.142, l 0.003}

0.36, 0.27,

0.07}

-kj={1, 1,1, 0.003}

0,05 0,1 0,15 0,2 Степень гидролиза

Рис. 11. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от (I для т~0.05 и ¿¿=1.1. Отношение *Л=32.5(«), 23.8(и), 13.1 (А).

Степень гидролиза

Рис. 12. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для »¡=0.6 и набора индивидуальных констант ¿Тгр=Ю, ¿Туг=0.5, 0.5, ¿Leu,Met,Asn,Gln=0.003. Отношение *А=3.3(»), 6.6(0), 12.1(A), 22(о), 55 (ш).

В четвертой главе описываются наши эксперименты по определению гидратации водных растворов аминокислот, белковых гидролизатов, казеиновых мицелл и синтетических белковоподобных полимеров с помощью метода миллиметровой спектроскопии. Метод миллиметровой спектроскопии сравнивается с методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяющей оценивать гидратацию по теплоемкостям гидратации.

В разделе 4.1 рассмотрен вариант метода миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, основанный на резонансном эффекте. При помощи миллиметровой спектроскопии возможно определить фракцию свободной воды - фракцию молекул НгО, обладающих вращательной подвижностью в соответствии с моделью «ожиданий и перескакиваний». Вращательные движения возможны из-за понижения активационного барьера вращений благодаря взаимодействию молекулы воды с дополнительной молекулой воды, т.е. с пятой соседней молекулой НгО в тетраэдрической сетке водородных связей. Параметры гидратации были определены по дефициту поглощения (в терминологии Ю.И. Хургина)4, т. е. разнице в поглощении невозмущенной воды и воды в растворе. Этот дефицит приписывался уменьшению подвижности воды вследствие присутствия растворенной молекулы. Число гидратации N, число связанных молекул воды, было вычислено согласно следующей формуле:

С, ~с{

дг=-L, (13)

где Ci - молярная концентрация водной компоненты, С/ - молярная концентрация свободной воды по данным поглощения миллиметрового излучения, Сг - молярная концентрация растворенного вещества.

Числа гидратации природных а-аминокислот (кроме цистеина), находящихся в форме цвиттерионов H3N+CHRCOO', были определены методом миллиметровой спектроскопии при частоте излучения 311Гц и малой мощности излучения (1мВт), обеспечивающей нетепловой режим измерений (рис. 13). Для аминокислот, известных как гидрофобные (Leu, Не, Trp, Phe), получаются относительно большие величины N. Это согласуется с фактом, что гидрофобная гидратация сопровождается стабилизацией сетки Н-связей воды в первом гидратном слое гидрофобных групп. Таким образом, микроволновой метод позволял количественно выражать гидрофобность аминокислот, и были все основания полагать, что

он мог бьггь эффективным для регистрации процессов, происходящих при изменении количества неполярных групп, экспонированных в сторону водного окружения.

Рис. 13. Зависимость чисел гидратации N от площади доступной поверхности неполярных групп (А2) для цвиттерионов природных а-аминокислот.

Шкала гидрофобности аминокислот по данным миллиметровой спектроскопии устанавливает следующий порядок уменьшения гидрофобности: Пе(8.2), Ьеи(7.4), Тгр(7.1), РЬе(б.5), Уа1(6.2), Туг(5.4), Ме^З.Э), 1^(3.4), Аг8(2.5), ТЩ2.2), Рго(2.2), А1а(1.9), 01п(1.9), №8(1.9), Авр(1.4), 01и(1.4), ви(0.8), Азп(0.8), 01у(-1.3).

Теплоемкость гидратации АСр,н= Ср>2 - Срв, представляющая собой разность между парциальной мольной теплоемкостью вещества в водном растворе (СР|г) и мольной теплоемкостью в газовой фазе (Сре), представлена для цвиттерионов а-аминокислот в таблице 7. Для глицина получено отрицательное значение ДСр>н (наименьшее среди всех аминокислот), что соответствует данным миллиметровой спектроскопии. Вычисления инкрементов функциональных групп были проведены из данных для цвиттерионов аминокислот (таблица 7), а не модельных незаряженных органических соединений.

4Khurgin Y.I., Kudiyashova V.A., Zavizion V.A., Betski O.V. //Advances in Chemical Physics Series, W. Coffey (Ed.). - V. 87. - New York: Wiley, 1994. - P. 483.

Таблица 7. Теплоемкости гидратации (ACPii,) цвиттерионов a-аминокислот при 298К.

Амино- R Cp, 2 ACph

кислота8 Дж-моль'-К"1 Дж-моль''-K"1

Gly H 35.9 -56.0

Ala Me 138.3 25.7

Abu CH2Me 225.9 90.2

Val CHMe2. 303.3 145.7

Leu CHjCHMej 387.1 206.5

lie CHMeCH2Me 395.6 215.0

Ser CH2OH 106.1 -19.6

Thr CHOHMe 205.5 54.6

Asn CH2CONH2 128.3 -27.9

Gin CH2CH2CONH2 181.6 2.4

Вклады в гидратацию неполярных и полярных групп, полученные миллиметровой спектроскопией, сравнены с термодинамическими данными, полученными нами для цвиттерионов аминокислот (таблица 8). Оба метода имеют близкую чувствительность по отношению к разным типам гидратации. Установлено, что вклады в гидратацию полярных групп на порядок меньше, чем вклад метиленовой группы. Вклад цвиттерионного фрагмента отрицателен, и по относительной величине сопоставим для обоих методов.

Таблица 8. Вклады в гидратацию различных групп по данным двух методов.

Тип Группа Вклад в гидратацию

гидратации Миллиметровая спектроскопия дек

AN AN/AN (СН2) ACp.h Дж-моль"1 К'1 ACp>h/ACp,h (СН2)

Гидрофобная гидратация СН2 2.6±0.2 1 75±4 1

Гидрофильная гидратация (не ионная) Гидрофильная гидратация (ионная) ОН conh2 СООН CHírrtyco О" 0.05±0.4 -3.4±1.2 0.02±0.2 -1.3±0.5 -6.5±12 -119±11 -.09±.1 -1.6±.2

Коэффициенты корреляции индексов гидрофобности для шкал гидрофобности, предложенных к настоящему времени, невелики (порядка 0.5-0.6). Наша шкала, построенная по данным миллиметровой спектроскопии (шкала 1, таблица 9), и шкала, построенная по теплоемкостям гидратации аминокислот (шкала 2), коррелируют с гораздо более высоким коэффициентом (0.973). Объяснение заключается в том, что обе представленные шкалы гидрофобности основаны на измерениях динамических свойств воды, хотя и на различных уровнях - микроскопическом и макроскопическом.

Таблица 9. Коэффициенты корреляция шкал гидрофобности аминокислот.

Вращательная Теплоемкость Растворимость в Доступная

подвижность воды гидратации по водно-органических поверхность

по данным данным ДСК системах (Тэнфорд) аминокислотных

миллиметровой остатков в белках

спектроскопии (Чотиа)

1 2 3 4

1 1 0.973 0.69 0.57

2 0.973 1 0.62 0.63

3 0.69 0.62 1 0.42

4 0.57 0.63 0.42 1

В разделе 4.2 на примере циклодекстринов и ароматических аминокислот рассмотрена гидратация ассоциирующих молекул, образующих обратимые комплексы. При конечных концентрациях, используемых в определениях гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии (2-100 г/л), перекрывание гидратных оболочек для ассоциирующих растворенных веществ или даже вытеснение воды из области взаимодействия функциональных групп является существенньм фактором, изменяющим гидратационные параметры по сравнению с неассоциирующими растворенными веществами.

Из гидратационных данных (таблица 10) следует, что а-циклодекстрин связывается с Туг и РЬе, поскольку удельное число гидратации щ' существенно меньше чем щ. Доля связанного а-циклодекстрина оказывается равной 0.17 для тирозина и 0.19 для фенилаланина. Эти значения согласуются с величинами, вычисленными из типичной величины константы связывания а-циклодекстрина с ароматическими группами аминокислот. Таким образом, при увеличении концентрации растворенных веществ, склонных к ассоциации, измеренное число гидратации уменьшается.

Таблица 10. Удельные числа гидратации лигандов в системе аминокислота + лиганд и доли связанного лиганда.

Лиганд/аминокислота Гидратация Гидратация лиганда Доля связанного

лиганда в в присутствии лиганда

отсутствие аминокислоты См-ь/О.0

аминокислоты (#2=0.107), из' = из -

(Х2=0), и3, г"1 Ап-См.-иСь0, г 1

Глюкоза/ фенилаланин 0.0195 0.0194 ~0

а-циклодекстрин/ тирозин 0.017 0.0112 0.17

а-циклодекстрин/ фенилаланин 0.017 0.0105 0.19

В разделе 4.3 приведены данные по гидратации белков и изменению гидратации при ферментативном гидролизе. Зависимость N от площади доступной для воды поверхности глобулярных белков можно считать пропорциональной (рис. 14). Количество связанной воды, выраженной в г связанной воды на г белка, в среднем для изученных глобулярных белков можно оценить как 0.3.

Сопоставление экспериментальных и теоретических значений N для рибонуклеазы и лизоцима, вычисленных по представленным в таблице 8 вкладам в N неполярной группы СН2 (2.6), усредненной полярной группы (около 0) и заряженной пары (-3.4), приведено в таблице 11. Как можно видеть, имеется неплохое согласие вычисленных и экспериментально полученных значений N.

Таблица 11. Вклад в гидратацию глобулярных белков функциональных групп, расположенных на поверхности белков.

Функциональные группы Вклад данной группы в N

Рибонуклеаза Лизоцим

Неполярные группы (СН2) 327(126)" 296(114)

Полярные группы 0(97) 0(103)

Пары заряженных групп -48 (14) -31 (9)

Суммарное значение N

Вьиисленное значение N 279 265

Экспериментальное значение N 220 236

аВ скобках приведены числа функциональных групп на поверхности белков.

1000 900 800 700

I 600

(9

| 500

и

5 400

5

У

300 200 100 о

О 5000 10000 15000 20000

Площадь поверхности белков, доступной для воды

Рис. 14. Зависимость чисел гидратации глобулярных белков от площади доступной поверхности (А2). Бычий сывороточный альбумин (1), яичный альбумин (2), пепсин (3), химотрипсиноген (4), а-химотрипсин (5), трипсин (б), соевый ингибитор трипсина (7), р-лакгоглобулин (димер) (8), а-лактальбумин (9), лизоцим (10), рибонуклеаза А (11).

Пример изменения гидратации при протеолизе представлен на рис. 15 для гидролиза трех субстратов трипсином. В начале процесса гидролиза как глобулярных белков (Р-лактоглобулина и БСА), так и р-казеина происходит заметное увеличение гидратации. При гидролизе трипсином БСА, р-лактоглобулина и р-казеина максимальное увеличение удельной гидратации составляет 36, 17 и 37% соответственно. При протеолизе глобулярных белков после гидролиза хотя бы одной пептидной связи происходит развертывание глобулы, внутренние пептидные связи становятся доступны воде, что и регистрируется при увеличении гидратации.

Явление заметного увеличения гидратации при гидролизе р-казеина согласуется с ролью демаскирования при протеолизе Р-казеина, которая была определена нами по кинетике образования продуктов гидролиза (раздел 2.1).

Время (мин)

Рис. 15. Изменение удельных чисел гидратации (число гидратации на единицу массы растворенного вещества) при гидролизе трипсином БСА (А), р-лактоглобулина (•) и Р-казеина (■).

Как известно, при гидролизе всего одной пептидной связи РЬе( 105)-Мег(106) в к-казеине ренином казеиновая мицелла теряет стабильность, и происходит коагуляция. Однако, это слишком сложная система для одновременного количественного описания протеолиза и изменения гидратации. Для моделирования закономерностей гидратации при агрегации казеиновых мицелл мы использовали агрегацию мицелл, индуцированную медленным закислением глюконовой кислотой (раздел 4.4). Использовались казеиновые мицеллы, восстановленные из обезжиренного молока. Изучали две разновидности мицелл: немодифицированные мицеллы с изоэлектрической точкой около 4.9 и модифицированные мицеллы с иммобилизованными белками на поверхности. Они дают значение изоэлектрической точки порядка 5.2. При уменьшении рН ниже значения 4.8-4.9 (изоэлектрическая точка казеиновых фосфопептидов находится в интервале 4.3-4.2) казеиновые мицеллы в таких растворах агрегируют за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к образованию мягких вязкоупругих гелей. Медленное уменьшение рН вызывалось самопроизвольным гидролизом 8-глюконолактояа с образованием I)-глюконовой кислота (рКа =3.56):

У белковая частица (1 мкм)

казеиновая мицелла (0.05мкм)

О

С-ОН

н-с-он но-с-н н-с-он н-с-он

СН2ОН

На рис. 16 представлены зависимости динамического модуля упругости и связанной воды от времени гелеобразования для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях 8-глюконолактона). Чем больше концентрация б-глюконолактона, тем раньше наступает начало гелеобразования. Взаимосвязано с <7 ведет себя параметр гидратации, увеличиваясь в ходе гелеобразования.

Время (мин)

Рис. 16. Зависимости модуля упругости С (Па) и связанной воды (г НгО/г препарата-100%) от времени гелеобразования немодифицированных казеиновых мицелл

(16%) для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях 5-глюконолактона). Концентрации 5-глюконолактона: 3.4% (о, •); 3% (А, А); 2.7% (□, м). Температура 43°С. Частота измерений со=1 рад с"1.

С начала гидролиза глюконолактона рН снижается от значения 5.5, поэтому сначала образуются тяжи из модифицированных мицелл. В промежуточной области рН может происходить разрыв геля, образованного модифицированными мицеллами, и замещение его гелем, образованным немодифицированными мицеллами. Поэтому имели место наблюдаемые нами немонотонные зависимости на графиках увеличения модуля накопления при гелеобразовании.

Эффект стабилизации казеиновых мицелл при добавлении смеси полипептидов был продемонстрирован с помощью описанной выше гелеобразующей системы, включающей агрегацию казеиновых мицелл при гидролизе 8-глюконолактона. Увеличение стабильности системы определялось по увеличению времени, требуемого до достижения точки гелеобразования при неизменной скорости уменьшения рН (рис. 17) или по величинам модуля упругости й и коэффициента вязкости ц, полученных при анализе частотных зависимостей динамических модулей С(б>) и в"(а) в рамках модели Максвелла.

Время (мин)

Рис. 17. Кинетика гелеобразования при добавлении к казеиновым мицеллам смеси полипептидов. Массовая доля полипептидов: 0 (□), 3.6% (о), 7.8% (•) и 10.4% (А). Концентрация 5-глюконолактона 3%, температура 43°С.

Представленные на рис. 18 зависимости показывают, что гидратационные и реологические параметры изменяются согласованно, а их минимумы достигаются в одной и

той же концентрационной области. Таким образом, максимум эффекта стабилизации казеиновых мицелл приходится на концентрацию добавленных пептидов порядка 6%.

2 4 6 8 10

Массовая доля полипептида (%)

Рис. 18. Зависимости реологических параметров 102-{3 (•) и 10'3->7 (■), а также зависимость

количества связанной воды в конце выбранного временного интервала гелеобразования (А) от концентрации добавленных полипептидов (вес

полипептидов/вес сухих веществ-100%).

В разделе 4.5 приведены данные по гидратации синтетических полимеров. Величины Л', приходящиеся на мономерное звено, представлены на рис. 19 для полиакриламида (ПАМ), полэтиленгликоля (ПЭГ) и термочувствительного поли-Ы-изопропилакриламида (ПНИПАА):

ПАМ: ПЭГ: ПНИПАА:

-(СНгСНЬ- -(СНгСН)п-

СОШ2 -(СН2-СН2-0)п- СОЫНчРг

Числа гидратации были интерпретированы как величины, зависящие только от числа неполярных групп и их доступности для воды. Измерения были сделаны при температурах ниже (30°С) и выше (43°С) температуры перехода клубок-глобула для макромолекулы ПНИПАА (около 32°С). Было найдено, что гидратация ПНИПАА различна в чистой воде и в воде с додецилсульфатом натрия (ДСН, 0.375 г/л), что согласуется с данными о чувствительности перехода клубок-глобула к присутствию в растворе ионных детергентов. Выше температуры перехода клубок-глобула, величина N для ПНИПАА в присутствии ДСН была выше, чем для ПНИПАА в чистой воде (рис. 19).

Число атомов углерода в неполярных группах

Рис. 19. Зависимость числа гидратации от количества атомов углерода в пеполярных группах (на звено) для ПЭГ (А), ПАМ(4), ПНИПАА в воде (■ 30°С, □ 43°С), и ПНИПАА с ДСН (• 30°С, о 43°С). Прямая линия соответствует алифатическим спиртам. Стрелки соответствуют переходу клубок —»глобула.

Другим примером применения миллиметровой спектроскопии к анализу конформационного состояния полимеров явилось изучение гидратации гидрофобно-модифицированных полиакриламидов и хитозанов, содержащих гидрофобные кластеры, но не способных образовывать глобулы.

Следующие гидрофобно-модифицированные полимеры были использованы в сравнительном анализе:

1. Гидрофобно-модифицированный хитозан (ГМХ)5

2. Сополимер акриламида и додецилметакрилата (АМ/ДДМК) [-СНгС(СОКН2)Н-]х-[-СН2-С(СНз)(СООС12Н25]у;6

3. Сополимер акриламида и нонилметакрилата (АМ/НМК) [-СН2-С(СОШ2)Н-]х-[-СН2-С(СНз)(СООС9Н19]у.

5 Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. // Colloids Surf. A. - 2005. -V.255. - P. 119.

6 Shashkina Y.A., Zaroslov Y.D., Smirnov V.A., Philipova O.E., Khokhlov A.R., Pryakhina T.A., Churochkina N.A. // Polymer. - 2003. - V.44. - P.22S9.

Для различных классов растворенных веществ с различными молекулярными массами и различной степенью доступности их неполярных групп для воды имеет смысл сравнивать удельные величины параметров гидратации п=Л7снп, где Л^ЛУАЛ^СНг), ДЛг(СНг) - вклад в гидратацию метиленовой группы, ст - число атомов углерода в неполярных группах.

Изменение п при вариации содержания гидрофобов обнаружено нами в следующих пределах (рис. 20): 0.29-0.21=0.08 (гидрофобно-модифицированные хитозаны), 0.72-0.53=0.19 (сополимеры АМ/НМК), 0.72-0.50=0.22 (сополимеры АМ/ДЦМК). Для перехода клубок —» глобула для ПНИПАА (стрелка на рис. 20) получаем больший диапазон изменения п (0.73-0.29=0.4). Для процесса экспонирования в водное окружение неполярных групп, содержащихся в БСА, получается еще большее значение и=0.7 (стрелка на рис. 20). Таким образом, методом миллиметровой спектроскопии показано, что гидрофобная модификация полиакриламидов и хитозанов приводит к меньшей вариации параметра удельной гидратации, чем кооперативные переходы, связанные с денатурацией белков и переходом клубок-глобула для термочувствительного ПНИПАА.

5 4,5 4

2 3,5 х

§ 3

га

| 2,5

5 к.

о 2 с и

т 1,5

1

0,5 О

0 2 4 6 В 10

Число атомов углерода в неполярных группах

Рис. 20. Зависимость относительного числа гидратации № от числа атомов углерода в неполярных группах в расчете на одно звено. ПАМ и гидрофобно-модифицированный ПАМ: АМ/НМК - ■, АМ/ДДМК - БСА - о; хигозан и гидрофобно-модифицированный хитозан -• ; ПНИПАА (клубок) - А; ПНИПАА (глобула) - А. Прямая линия соответствует алифатическим спиртам (♦).

Миллиметровая спектроскопия позволила дифференцировать также различные конформациоиные состояния сополимеров N-винилкапролактама и N-винилимидазола, полученные при сополимеризации в водной среде при температуре выше точки фазового расслоения полимерной системы.

Таким образом, в четвертой главе описан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. При протеолизе зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды, что логично, поскольку происходит разворачивание белковой глобулы и увеличение поверхности контакта функциональных групп с водой. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе 6-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. Показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Таким образом, измерение гидратации является перспективным методом, способствующим пониманию физико-химических закономерностей процессов, протекающих с участием гидрофобных эффектов.

В пятой главе описаны детали оригинальных методик, которые были предложены и использованы специально для решения поставленных в диссертационной работе задач. Среди них: методика определения общей кинетики протеолиза по накоплению аминного азота, определяемого фотометрированием N-триншрофенильных производных продуктов протеолиза; методика приготовления казеиновых гелей при одновременном определении динамических реологических модулей; методика определения параметров гидратации с помощью миллиметровой резонансной установки, работающей в диапазоне частот 26-37 ГГц. В разделе 5.2 в качестве примера приведены две подпрограммы, входящие в пакет программы PROTEOLYSIS.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменений степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая стадия соответствует собственно гидролизу пептидных связей.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе определены кинетические кривые для отдельных пептидов, образованных гидролизом пептидных связей трипсином. Получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза доступных и изначально маскированных пептидных связей Р-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые детально исследовано демаскирование гидрофобного С-концевого участка при гидролизе р-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Показано, что наличие кинетики накопления пептидов с лагом связаны с маскированностью пептидных связей. Предложен механизм демаскирования пептидных связей в кластере, образованном гидрофобными участками полипептидной цепи р-казеина.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза всех пептидных связей по поглощению Ы-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп при гидролизе казеиновых полипептидов химотрипсином. Впервые показано, что немонотонные участки зависимости нарастания аминного азота от степени гидролиза связаны с демаскированием пептидных связей. Экспериментально и теоретически определены области степени гидролиза, где находятся локальные максимумы скорости.

5. Изучена кинетика гидролиза пептидов в реакторе открытого типа с непрерывным удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза. Распределение констант скорости было шире для более демаскированного субстрата, и уже - для более маскированного пептидного субстрата.

6. Количественным электрофорезом показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка по субстрату. Получена оценка для отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза пептидных связей глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту.

8. Программа РРОТЕОЬУвК удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) для протеолитических ферментов. Достоверность предсказания продуктов протеолиза увеличивается при учете сначала вторичной специфичности, а затем и маскирования связей.

9. Разработан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. Измеряемой величиной было число гидратации, которое показывает количество молекул воды, потерявших вращательную подвижность из-за взаимодействия с растворенной молекулой.

10. Поскольку метод миллиметровой спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, нами впервые построена шкала гидрофобности природных а-аминокислот в цвиттерионной форме, т.е. аминокислоты ранжированы в порядке увеличения гидрофобности. Для чисел гидратации и теплоемкостей гидратации было проведено сравнение вкладов в гидратацию, соответствующих гидрофобной гидратации, гидрофильной неионной и гидрофильной ионной типов гидратации. При гидролизе полипептидов и белков зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды.

11. Показано, что для ассоциирующих молекул по данным миллиметровой спектроскопии функциональные группы контактируют, а гидратные оболочки перекрываются с исключением молекул воды. Количественные соотношения для связанной воды рассмотрены в работе на примере ассоциации циклодекстринов с ароматическими аминокислотами. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе 8-глюкополактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры в рамках модели Максвелла и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. При добавлении в небольших концентрациях полипептидов мицеллы становятся более стабильными. В этом же диапазоне концентраций добавленных полипептидов наблюдается уменьшение концентрации связанной воды.

12. Впервые показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Гидратационные изменения при переходах клубок-глобула сравнивали с изменением гидратации при введении гидрофобных групп в гидрофобно-модифицированные полимеры (гидрофобно-модифицированные хитозаны и полиакриламиды). Введение

гидрофобных групп в эти полимеры приводит к меньшему измепению связанной воды по сравнению с изменением гидратации при денатурации глобулярных белков (БСА) и переходе клубок-глобула термочувствительного поли-М-изопропилакр ил амида.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Vitt S.V., Vorob'ev М.М., Paskonova Е.А., Saporovskaya M.B. HPLC separation and determination of N-trinitrophenil derivatives of amino acids and peptides // J. High Resolution Chromatog. & Chrom. Com. - 1983. - V.6, N3. - P. 158-159.

2. Витт C.B., Воробьев M.M., Пасконова E.A., Сапоровская М.Б., Беликов В.М. Определение N-тринитрофенильных производных аминокислот и пептидов методом ЖХВД // Ж. Аналит. Химии. - 1983. - Т. 38, №8. - С. 1537-1540.

3. Пасконова Е.А., Воробьев М.М., Витт С.В., Беликов В.М. Установление аминокислотного состава N-тринитрофенильных производных пептидов // Ж. Аналит. Химии. - 1986. - Т. 41, №10. - С. 1895-1897.

4. Воробьев М.М., Пасконова Е.А., Витт С.В, Беликов В.М. Зависимость свойств хроматографических фракций протосубтилиновых гидролизатов казеина от условий протеолиза // Биотехнология. - 1986. - №4. С. 40-45.

5. Belikov V.M., Kudinova E.G., Vorob'ev M.M. Kinetic description of proteolysis. Parti. Peptic hydrolysis of proteins from chicken heart: Optimization in terms of time and substrate concentration//Nahrung. - 1986. - V. 30, N5. - P. 501-506.

6. Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 2. Substrate regulation of peptide bond demasking and hydrolysis. Liquid chromatography of hydrolyzates //Nahrung. - 1986. - V. 30, N10. - P. 995-1001.

7. Vorob'ev M.M., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 3. Total kinetics of peptide bond hydrolysis in peptide mixtures // Nahrung. - 1987. - V. 31, N4. - P. 331-340.

8. Vorob'ev M.M., Slobodyanikova L.S., Vitt S.V., Latov V.K., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 4. Hydrolysis kinetics of partial protein hydrolyzates // Nahrung. - 1987. - V. 31, N8, - P. 777-782.

9. Воробьев M.M., Федорова Е.Б., Черноглазова Н.И., Витт С.В., Беликов В.М. Регулирование функциональных свойств белковых гидролизатов // Тезисы докладов всесоюзной конференции «Химия пищевых добавок». 25-27 апреля 1989 г. -Черновцы, 1989. - С.54.

10. Хургин Ю.И., Баранов А.А., Воробьев М.М. Гидрофобная гидратация алифатических аминокислот// Изв. АН. Сер. хим. - 1994. - №11. - С. 2031-2033.

Н.Хургин Ю.И., Лебедев О.В., Максарева Е.Ю., Завизион В.А., Кудряшова В.А., Воробьев М.М., Орехова Г.А., Даниленко А.Н. Межмолекулярные взаимодействия в водных растворах мебикара // Изв. АН, Сер. хим. - 1995. - №6. - С. 1178-1179.

12. Воробьев М.М., Баранов А.А., Беликов В.М., Хургин Ю.И. Исследование гидратации а-аминокислот методом абсорбционной миллиметровой спектроскопии // Изв. АН, Сер. хим., - 1996. - №3. - С. 618-622.

13.Vorob'ev Computer simulation of hydrolysis kinetics of polymer degradation // International symposium Computer assistance to chemical research, 17-18 December 1996. -Moscow, 1996.-P. 82.

14. Воробьев M.M., Даниленко A.H. Оценка гидратации полярных групп а-аминокислот методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Изв. АН, Сер. хим. - 1996. - №9.. С. 2237-2242.

15. Воробьев М.М., Левичева И.Ю., Беликов В.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином // Прикл. биохим. микробиол. - 1996. - Т. 32,№2.-С. 237-241.

16. Vorob'ev М.М., Parent G., Savoie L. Quantitative comparison of casein and rapeseed proteolysis by pancreatin // Nahrung. -1996. - V.40, N5. - P. 248-255.

17. Vorob'ev M.M. The hydrophobicity scale of amino acids as determined by absorption millimeter spectroscopy: Correlation with heat capacities of aqueous solutions // Z. Naturforschung. - 1997. - V. 52c. - P. 227-234.

18. Vorob'ev M.M. General kinetic model of proteolysis //Nahrung. - 1998. - V. 42, N3/4. - P. 173.

19. Vorob'ev M.M, Goncharov D.V. Quantitative study of different states of bound water molecules in the hydration shells of peptides and proteins // Nahrung. - 1998. - V.42, N3/4. -P. 177-178.

20. Vorob'ev M.M., Goncharova I.A. Computer simulation of proteolysis. Peptic hydrolysis of partially demasked P-Lactoglobulin // Nahrung. - 1998. - V. 42, N2. - P. 60-66.

21. Vorob'ev M.M., Buckin V., Waghorne E. Evaluation of hydrophobicity of milk proteins by absorption millimeter spectroscopy // 13th Conference of the European colloid and interface society, 12-17 September 1999. - Dublin, Ireland, 1999. - P.91.

22. Vorob'ev M.M., Dalgalarrondo M., Chobert J.-M., Haertle T. Kinetics of p-casein hydrolysis by wild-type and engineered trypsin // Biopolymers. - 2000. - V. 54. - P. 355364.

23. Vorob'ev M.M. Bound water measurements in aqueous systems // 9th Symposium on Food colloids, biopolymers and materials, 14-17 April, 2002. - Wageningen, Netherlands, 2002. -P.37.

24. Vorob'ev M.M. Water mobility around kosmotropic and ehaotropie solutes: Absorption spectroscopy in the millimeter range // Water science for food, health, agriculture and environment. Z .Berk, R.B. Leslie, P.J. Lillford, & S. Mizrahi (Eds.) Lancaster & Basel: Technomic Publishing, 2001. - P. 59-72.

25. Vorob'ev M. Bound water measurements for aqueous protein solutions and food gels // Colloids and Surfaces B. - 2003. - V. 31. - P. 133-140.

26. Vorob'ev M.M., Faleev N.G. Water ordering measurements in the aqueous polymer systems by waveguide dielectric resonance method H Mendeleev Commirn. - 2005. - N6. - P. 259261.

27. M.M.Vorob'ev. Free water/bound water measurements in aqueous polymer systems // European polymer congress, 27 June - 1 July 2005. - Moscow, Russia, 2005. - P.99.

28. Vorob'ev M.M. Monitoring of water ordering in aqueous protein systems // Food Hydrocolloids. -2007. - V. 21. - P. 309-312.

29. Vorob'ev M.M. Quantitative comparison of the hydration of proteins with protein-like synthetic polymers by millimeter-wave spectroscopy // 12th European conference on the spectroscopy of biological molecules, 1-6 September, 2007. - Bobigny, France, 2007. - P. 139.

30. Vorob'ev M., Churochkina N., Khokhlov A., Stepnova E. Hydration characterization of hydrophobically modified polymers by dielectric measurements in the millimeter range // Macromol. Bioscience. - 2007. - V.7. - P. 475-481.

31. Vorob'ev M.M. Microwave hydration measurements in aqueous systems of proteins and synthetic polymers // XXIX European congress on molecular spectroscopy, 31 August- 5 September, 2008. - Opatija, Croatia, 2008. - P. 187.

Подписано в печать: 27.01.2009

Заказ № 1501 Тираж -130 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА I. Физико-химические предпосылки количественного описания гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты.

1.1.1. Особенности протеолиза как процесса превращения пептидного полимерного субстрата и возможности его описания методами химической кинетики.

1.1.2. Р-Казеин как субстрат протеолиза.

1.1.3. Свойства пептидов, полученных ферментативным гидролизом.

1.2.1. Основные подходы к описанию гидрофобных явлений.

1.2.2. Экспериментальные методы определения гидратации.

1.2.3. Гидратация белков, гидрофобный коллапс пептидов.

ГЛАВА II. Кинетика ферментативного гидролиза полипептидных субстратов.

2.1. Гидролиз Р-казеина трипсином.

2.2. Суммарная кинетика гидролиза химотрипсином.

2.3. Кинетика деградации исходной полипептидной цепи.

2.4. Гидролиз пептидов в реакторе открытого типа.

ГЛАВА III. Компьютерное моделирование протеолиза.

3.1. Компьютерное моделирование гидролиза пептидных цепей — программа Proteolysis.

3.2. Компьютерное моделирование гидролиза пепсином.

3.3. Компьютерное моделирование кинетики гидролиза трипсином и химотрипсином.

ГЛАВА IV. Изучение гидратации в различных аминокислотно-пептиднобелковых системах.

4.1. Шкалы гидрофобности аминокислот. Сравнение методов миллиметровой спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии.

4.2. Оценка ассоциации по изменению гидратации.

4.3. Гидратация белков, изменение гидратации при ферментативном гидролизе.

4.4. Реология и гидратация гелей, образованных агрегатами казеиновых мицелл.

4.5. Гидратация белковоподобных синтетических полимеров.

ГЛАВА V. Методы исследования.

5.1. Гидролиз полипептидов и анализ продуктов гидролиза.

5.2. Измерение параметров гидратации.

5.3. Программа Proteolysis.

Актуальность проблемы. В настоящее время методы физической химии все шире применяются к комплексным объектам природного происхождения и сложным биохимическим процессам. Один из таких процессов -ферментативный гидролиз полимерных цепей полипептидов и белков (протеолиз) лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза пептидных связей от ограниченного протеолиза при активации ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении. Протеолизу принадлежит важная роль в процессах модификации пищевых белков и производстве белковых гидролизатов в пищевой промышленности. Создание общей физико-химической модели протеолиза, включающей кинетическое описание процессов межцепочечных взаимодействий, приводящих к маскированию/демаскированию пептидных связей, и количественному выражению фермент-субстратного узнавания (специфичности) в отношении полимерного субстрата, является, таким образом, важнейшей задачей.

Водные растворы и дисперсные системы пептидов и аминокислот широко распространены в живой природе и находят все возрастающее применение в биотехнологии. Из многочисленных примеров выделим только два: пептидные гормоны, осуществляющие регуляторные функции и обладающие уникальным сродством к рецепторам; биосовместимые пептидные материалы, образованные самосборкой пептидов. Эти и другие примеры из «мира пептидов» требуют разработки общих методологических подходов, применения современных методов анализа и компьютерного моделирования.

Полипептиды, обладающие существенной конформационной подвижностью по сравнению с глобулярными белками, также как и белки проявляют физиологическую активность, поскольку определенные аминокислотные последовательности пептидов (сайты) обладают повышенным сродством к другим биополимерам и клеточным структурам. Полипептиды, не имеющие определенной третичной структуры, представляют преимущественно полимерные клубки и являются предметом изучения широкого круга специалистов, включая физиков, биохимиков и специалистов пищевой химии.

Белки (ферменты) обладают третичной структурой, которая определяет пространственное расположение функциональных групп, участвующих в катализе. Поэтому роль ферментов как катализаторов химических реакций является определяющей для биологических систем, и их изучение является одной из основных задач биохимии. Необходимо отметить, что интерес к ферментам проявляют и химики, использующие ферментативный синтез (гидролиз) как альтернативный химическому метод синтеза в мягких условиях.

Протеолиз участвует в огромном количестве биологических процессов, - обеспечивает активацию проферментов, участвует в процессах регуляции на различных уровнях, наконец, осуществляет деградацию «ненужных» белков и пептидов. Участие протеолиза в процессах пищеварения пищевых белков хорошо известно. Протеолиз лежит также в основе важнейших биотехнологических процессов, включая получение белковых гидролизатов и отдельных биологически-активных пептидов из неактивных белковых предшественников. Взглянем на протеолиз с точки зрения физической химии.

С этой точки зрения интерес представляют, прежде всего, кинетические закономерности ферментативного гидролиза полипептидных цепей, определяемые как фермент-субстратным связыванием (субстратной специфичностью), так и межсегментными и межцепочечными взаимодействиями, препятствующими доступу фермента к атакуемым пептидным связям. Если первое явление широко изучается биохимиками в рамках изучения субстратной специфичности различных протеаз, то второе явление, известное как маскирование пептидных связей, представляет интерес для науки о полимерах, поскольку маскирование определяется полимерной природой полипептидного субстрата.

Гидролиз полимерной цепи в нескольких местах дает набор фрагментов, которые в свою очередь являются субстратами для последующего гидролиза. Описание кинетики превращений таких субстрато-продуктов требует компьютерного моделирования, которое должно учесть весь огромный объем информации и представить результаты в форме, удобной для экспериментальной проверки.

Гидрофобно-управляемые процессы играют огромную роль в живой природе, в частности, определяя глобулярную конформацию белка. Также, гидрофобные взаимодействия определяют переходы клубок-глобула для синтетических термочувствительных полимеров, часто называемых белковоподобными. Общие физико-химические механизмы гидрофобных явлений в белковых системах и амфифильных синтетических полимерах требуют разработки универсальных подходов и одних и тех же методов анализа. В частности, представляется актуальным определять параметры гидрофобности по состоянию воды в гидратных оболочках растворенных молекул. Для этого ключевой идеей, по нашему мнению, является идея о клатратном упорядочении воды в гидратных оболочках неполярных групп полимеров. В диссертационной работе описан наш опыт по использованию миллиметровой спектроскопии, регистрирующей упорядочение сетки воды по поглощению электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном (СВЧ) диапазоне.

В ходе гидролиза пептидных связей происходит разворачивание белковой глобулы, в результате чего меняется площадь поверхности групп, контактирующих с водой, т.е. меняться гидратация полипептидных цепей. Изменения гидратации сопровождаются конформационными изменениями и образованием агрегатов. Можно рассчитывать, что измерения гидратации позволят дополнить кинетические данные гидролиза пептидных связей и данные по реологии водно-пептидных систем.

Целью работы является изучение физико-химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций, а также изучение гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах.

В рамках этого в диссертации решались следующие задачи:

1. Разработать аналитические методы и подходы, позволяющие определять константы скорости гидролиза пептидных субстратов протеолитическими ферментами в кинетических экспериментах, анализирующих как суммарную кинетику гидролиза пептидных связей, так и индивидуальную кинетику изменения концентраций пептидов по данным разделительных методов (обращеннофазная ЖХВД, количественный электрофорез, аминокислотный анализ).

2. Разработать пакет компьютерных программ, позволяющих предсказывать кинетику протеолиза для пептидных цепей, имеющих произвольную аминокислотную последовательность, с базой данных кинетических параметров для ряда протеолитических ферментов.

3. Разработать количественный метод определения гидратации методом миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, позволяющий изучать состояние воды в гидратных оболочках пептидов в различных водных системах и процессах, включая водные растворы глобулярных белков, протеолиз, взаимодействие полипептидов с казеиновыми мицеллами. Показать перспективность количественного изучения гидратации для определения шкал гидрофобности аминокислот, оценки стабильности полипептидных мицелл, оценки конформаций синтетических белковоподобных сополимеров.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая - гидролиз.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза различных пептидных связей Р-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые предложен механизм демаскирования гидрофобного С-концевого участка при гидролизе Р-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза химотрипсином пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп. Впервые показано, что немонотонные участки нарастания аминного азота в ходе гидролиза связаны с маскированностью пептидных связей.

5. Изучена кинетика гидролиза панкреатином пептидов в реакторе открытого типа с удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярных фракций.

6. Показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка. Получена оценка для отношения констант демаскирования и гидролиза глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, которые описывают демаскирование и гидролиз пептидных связей. Программа позволяет удовлетворительно предсказывать кинетику протеолиза с различными параметрами специфичности и маскированности, а также состав продуктов протеолиза (состав гидролизатов), полученных при различных кинетических условиях.

8. Разработан метод определения параметров гидратации с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии. Метод имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, что впервые позволило использовать его для построения шкалы гидрофобности аминокислот и оценки количества неполярных групп, участвующих в гидрофобной гидратации или исключенных за счет гидрофобного взаимодействия. Метод позволяет определять кинетику развертывания белковой глобулы в ходе протеолиза.

9. Миллиметровая спектроскопия наряду с реологическими методами позволяет контролировать взаимодействие пептидов с казеиновыми мицеллами, в частности определять концентрации пептидов, при которых имеет место увеличение стабильности мицелл.

10. С помощью миллиметровой спектроскопии впервые показано, что гидрофобная модификация синтетических полимеров, не являющихся термочувствительными, приводит к меньшему изменению гидратации по сравнению с переходом клубок глобула в термочувствительных полимерах.

Практическая значимость.

Кинетические параметры представлены в работе для таких практически важных протеаз как трипсин, химотрипсин, и пепсин при протеолизе белковых субстратов, выделенных из молока. Представленная общая методология анализа кинетики протеолиза дает возможность применить наработанные методы к другим белковым субстратам и протеазам, представляющим практический интерес. В работе рассмотрено применение модельных представлений для анализа кинетики образования низкомолекулярных продуктов протеолиза в реакторе открытого типа, моделирующего in vitro панкреатическую стадию пищеварения. Эта часть работы имеет практическое значение для количественных оценок пищевой ценности белков.

Детальное изложение принципов построения программы PROTEOLYSIS может быть полезным при разработке других компьютерных программ, моделирующих сложные биохимические процессы. Применение компьютерного моделирования протеолиза может быть использовано для предсказания оптимальных кинетических условий получения белковых гидролизатов.

Использование метода количественного определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии открывает новые аналитические возможности при исследовании различных амфифильных систем (белковых и полимерных). Количественные измерения гидратации позволяют контролировать гидролиз пищевых белков и образование казеиновых гелей, что может быть использовано в пищевой промышленности. Защищаемые положения.

1. Расщепление пептидных связей в полипептидах происходит в две стадии: на первой осуществляется физический процесс конформационной перестройки пептидной цепи (демаскирование); на второй происходит собственно химический процесс - гидролиз пептидных связей.

2. Стадия демаскрования дает немонотонные участки увеличения аминного азота в ходе гидролиза и обеспечивает наличие кинетики накопления некоторых пептидов с лагом.

3. Отношение констант скоростей демаскирования и гидролиза является важным параметром при количественном описании протеолиза.

4. Компьютерное моделирование протеолиза дает возможность предсказывать состав (главные компоненты) гидролизатов для различных гипотетических механизмов протеолиза.

5. Количество связанной воды растет с увеличением доступной для воды поверхности молекул, в частности, в начальной стадии протеолизе.

6. Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации.

7. Взаимодействие пептидов в небольшой концентрации с казеиновыми мицеллами приводит к увеличению стабильности мицелл, что определяется реологически и по изменению гидратации.

8. Гидратационные измерения позволяют дифференцировать конформационные состояния клубка и глобулы для синтетических белковоподобных полимеров.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке экспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов. Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по компьютерным вычислениям в химических исследованиях (Москва, Россия, 1996 г.); на V Симпозиуме по пищевым белкам (Потсдам, Германия, 1997 г.); на XIII Конференции Европейского коллоидного и поверхностного общества (Дублин, Ирландия, 1999 г.); на IX Симпозиуме по пищевым коллоидным системам, биополимерам и материалам (Вагенинген, Голландия, 2002 г.); на VIII (Хельсинки, Финляндия, 1998 г.), IX (Зихрон Яков, Израиль, 2000 г.) Международных симпозиумах по свойствам воды; на Европейском полимерном конгрессе (Москва, Россия, 2005); на XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобини, Франция, 2007 г.); на XXIX Европейском конгрессе по спектроскопии молекул (Опатия, Хорватия, 2008 г.); на семинаре в научно-исследовательском центре фирмы «Нестле» (Лозанна, Швейцария, 1996 г.), на семинаре в Немецком федеральном центре по исследованиям в молочной промышленности (Киль, Германия, 1994 г.); на семинарах в Университете Лаваля (Квебек, Канада, 1992), Университетского колледжа Дублина (Дублин, Ирландия, 2002); на семинарах лаборатории физической химии полимеров ИНЭОС РАН.

Работа была выполнена при поддержке ряда проектов РФФИ, в том числе под руководством диссертанта: 98-03-32230 (Количественное изучение гидратации амфифильных молекул) и 07-03-00131 (Количественное изучение гидратации ферментоподобных сополимеров с цвиттерионными группировками).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 статьях, а также в 7 тезисах указанных выше конференций.

Диссертация построена следующим образом. Диссертационная работа представлена в 5-и главах, а также содержит введение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. В первой главе анализируется литература по гидролизу пептидов и определению гидрофобности. Во второй главе изложен наш экспериментальный материал по кинетике гидролиза. В третьей главе описаны возможности программы и приведены результаты компьютерного моделирования. В четвертой главе описан метод миллиметровой спектроскопии и приведены экспериментальные данные по гидратации водных смесей аминокислот, пептидов, белков и синтетических водорастворимых полимеров. В пятой главе описаны методы исследования.

Основные выводы и результаты диссертационной работы перечислены ниже:

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменений степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая стадия соответствует собственно гидролизу пептидных связей.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе определены кинетические кривые для отдельных пептидов, образованных гидролизом пептидных связей трипсином. Получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза доступных и изначально маскированных пептидных связей |3-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые детально исследовано демаскирование гидрофобного С-концевого участка при гидролизе Р-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Показано, что наличие кинетики накопления пептидов с лагом связаны с маскированностью пептидных связей. Предложен механизм демаскирования пептидных связей в кластере, образованном гидрофобными участками полипептидной цепи Р-казеина.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза всех пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп при гидролизе казеиновых полипептидов химотрипсином. Впервые показано, что немонотонные участки зависимости нарастания аминного азота от степени гидролиза связаны с демаскированием пептидных связей. Экспериментально и теоретически определены области степени гидролиза, где находятся локальные максимумы скорости.

5. Изучена кинетика гидролиза пептидов в реакторе открытого типа с непрерывным удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза. Распределение констант скорости было шире для более демаскированного субстрата, и уже - для более маскированного пептидного субстрата.

6. Количественным электрофорезом показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка по субстрату. Получена оценка для отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза пептидных связей глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту.

8. Программа PPOTEOLYSIS удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) для протеолитических ферментов. Достоверность предсказания продуктов протеолиза увеличивается при учете сначала вторичной специфичности, а затем и маскирования связей.

9. Разработан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. Измеряемой величиной было число гидратации, которое показывает количество молекул воды, потерявших вращательную подвижность из-за взаимодействия с растворенной молекулой.

10. Поскольку метод миллиметровой спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, нами впервые построена шкала гидрофобности природных а-аминокислот в цвиттерионной форме, т.е. аминокислоты ранжированы в порядке увеличения гидрофобности. Для чисел гидратации и теплоемкостей гидратации было проведено сравнение вкладов в гидратацию, соответствующих гидрофобной гидратации, гидрофильной неионной и гидрофильной ионной типов гидратации. При гидролизе полипептидов и белков зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды.

11. Показано, что для ассоциирующих молекул по данным миллиметровой спектроскопии функциональные группы контактируют, а гидратные оболочки перекрываются с исключением молекул воды. Количественные соотношения для связанной воды рассмотрены в работе на примере ассоциации циклодекстринов с ароматическими аминокислотами. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе 5-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры в рамках модели Максвелла и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. При добавлении в небольших концентрациях полипептидов мицеллы становятся более стабильными. В этом же диапазоне концентраций добавленных полипептидов наблюдается уменьшение концентрации связанной воды.

12. Впервые показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Гидратационные изменения при переходах клубок-глобула сравнивали с изменением гидратации при введении гидрофобных групп в гидрофобно-модифицированные полимеры (гидрофобно-модифицированные хитозаны и полиакрил амиды). Введение гидрофобных групп в эти полимеры приводит к меньшему изменению связанной воды по сравнению с изменением гидратации при денатурации глобулярных белков (БСА) и переходе клубок-глобула термочувствительного поли-М-изопропилакриламида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ферментативный гидролиз полипептидов важен с практической точки зрения, и интересен как процесс, где сосредоточены явления фермент-субстратного узнавания (количественного выражения специфичности полимерного субстрата), гидрофобной ассоциации, определяющей маскирование пептидных связей, а также имеет место сложная кинетика, требующая компьютерного моделирования. Кроме того, количественный анализ многокомпонентных пептидных смесей в водной среде представляет весьма актуальную задачу аналитической химии, требующую современных инструментальных методов анализа.

Работа над диссертацией убедила в том, что исследования на стыке наук, в данном случае в области физической химии, науки о полимерах, аналитической химии, биохимии и пищевой химии, требуют сочетания не обязательно большого числа методов, но максимально сочетаемых и дополняющих друг друга. В данном исследовании такими методами были миллиметровая спектроскопия, позволившая отслеживать гидратационные изменения в процессах, приводящих к существенным изменениям конформации, а также компьютерное моделирование гидролиза полипептидных цепей. Компьютерное моделирование дало в результате законченный программный продукт - программу PROTEOLYSIS, позволяющую даже неопытному пользователю (химику — экспериментатору) в диалоговом режиме получать кинетические кривые и списки образующихся пептидов для произвольной фермент-субстратной пары.

Специфика ферментативного гидролиза гетерополимерного субстрата заключалась в наличии большого количества различных пептидных продуктов, являющихся одновременно субстратами для последующего гидролиза. В работе продемонстрированы возможности описания кинетики процесса на уровне индивидуальных пептидов, исходной полипептидной цепи, группы продуктов в низкомолекулярных фракциях, а также суммы аминогрупп, образующихся при гидролизе всех пептидных связей. Разделительные методы анализа (ЖХВД на обращенной фазе, количественный электрофорез, аминокислотный анализ низкомолекулярных фракций) и определение аминного азота по поглощению N-тринитрофенильных производных продуктов гидролиза обеспечили достоверный экспериментальный материал по кинетике протеолиза. Теоретическое объяснение таких особенностей кинетики как наличие лага при образовании некоторых пептидов или немонотонное увеличение аминного азота в ходе реакции потребовало привлечения представлений о кинетически значимом процессе демаскирования пептидных связей. Детальный кинетический анализ гидролиза Р-казеина продемонстрировал роль гидрофобных взаимодействий, обеспечивающих маскирование/демаскирование в рамках двухстадийной схемы.

Моделирование на уровне индивидуальных пептидов и конкретных сайтов расщепления пептидных связей перспективно с точки зрения биологических приложений и формулировки тонких механизмов протеолиза. Кроме того, такой подход перспективен, учитывая огромный прогресс в методах ЖХВД и масс-спектрометрии, и востребован в связи с бурным развитием протеомики.

Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, основанный на том, что поглощение электромагнитного излучения в миллиметровом диапазоне различно для объемной воды, и связанной воды, был использован для построения шкалы гидрофобности аминокислот и определения гидратации в водных системах, содержащих пептиды. Измеряемой величиной были числа гидратации, показывающие количество молекул воды, потерявших вращательную подвижность из-за взаимодействия с данной молекулой.

Хорошая корреляция различных шкал гидрофобности аминокислот, соответствующих различным физико-химическим принципам, скорее исключение, чем правило. Коэффициент корреляции между шкалами, построенными с помощью миллиметровой спектроскопии и ДСК на базе теплоемкостей гидратации, был достаточно высок, поскольку обе эти шкалы основаны на измерениях динамических свойств воды, хотя и разными методами.

При гидролизе полипептидов и белков происходило увеличение удельной величины связанной воды, поскольку имело место развертывание белковой глобулы и увеличение поверхности контакта функциональных групп с водой. При гидролизе Р-казеина увеличение поверхности также происходило, что согласуется с полученными представлениями о роли демаскирования пептидных связей не только при гидролизе глобулярных белков, но и при гидролизе Р-казеина.

Гидратация неассоциирующих молекул была рассмотрена на примере цвиттерионов природных а-аминокислот и показано, что гидрофобность можно измерить по эффекту упорядочения структуры воды. В случае ассоциирующих молекул картина иная, поскольку при ассоциации функциональные группы контактируют друг с другом, а молекулы воды исключаются. Количественные соотношения для ассоциирующих молекул рассмотрены в работе на примере ассоциации циклодекстринов с ароматическими группами аминокислот.

При расщеплении пептидной цепи существенно меняется гидратация, однако, это слишком сложная система для количественного изучения закономерностей гидратации и протеолиза в одной системе. Более простая водно-пептидная система состояла из казеиновых мицелл, стабилизированных коллоидным фосфатом, в которую добавляли 8-глюконолактон. При медленном снижении рН, вызванном гидролизом 8-глюконолактона, происходило слипание мицелл с образованием частиц и вязкоупругого геля. Изменения реологических и гидратационных параметров в этой системе вели себя согласованным образом. Свойства гелей можно было менять при добавлении немицеллярных полипептидов. При их добавлении в небольших концентрациях мицеллы становились более стабильными, а количество связанной воды уменьшалось.

При изучении гидратации был применен один и тот же метод к веществам различной химической природы, поскольку изучалось воздействие этих веществ на окружающую воду, а сами вещества не поглощали в миллиметровом диапазоне электромагнитных волн. Изучение гидратации водорастворимых синтетических полимеров, в том числе термочувствительных полимеров, показало универсальность метода миллиметровой спектроскопии для регистрации процессов, проходящих с изменением конформации цепей полимеров. Этим методом была определена разница в гидратации, соответствующая переходам клубок-глобула, в синтетических белковоподобных полимерах.

1. М. von Smoluchowski. Versuch einer mathematischen theorie der koagulationskinetik kolloider losungen // Zeitschrift fur Physikalische Chemie.-1917. - V.92. -P.129-168.

2. P. Meakin. Formation of fractal clusters and networks by irreversible diffusion-limited aggregation // Phys. Rev. Letter. 1983. - V. 51, N13. - P. 1119-1122.

3. P. Meakin. Fractal aggregation // Adv. Coll. Interface Science. 1988. - V. 28, N4.-P. 249-331.

4. W. Russel, D. Saville, W. Schowalter. Colloidal dispersions. London: Cambridge University Press, 1989.

5. S. Axford. Aggregation of colloidal silica: reaction-limited kernel, stability ratio and distribution moments // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1997. - V. 93. -P. 303-311.

6. M. Tirado-Miranda, A. Schmitt, J. Callejas-Fernandez, A. Fernandez-Barbero. Aggregation of protein-coated colloidal particles: Interaction energy, cluster morphology, and aggregation kinetics // J. Chem. Phys. 2003. -V. 119, N17. -P. 9251-9259.

7. G. Odriozola, R. Leone, A. Schmitt, J. Callejas-Fernandez, R. Martinez-Garcia, R. Hidalgo-Alvarez. Irreversible versus reversible aggregation: Mean field theory and experiments // J. Chem. Phys. 2004. - V. 121, N11. - P. 5468-5481.

8. P. Sandkuhler, J. Sefcik, M. Morbidelli. Kinetics of gel formation in dilute dispersions with strong attractive particle interactions // Adv. Coll. Interface Science. 2004. - V. 108-109, May. - P. 133-143.

9. M. Lattuada, H. Wu, P. Sandkuhler, J. Sefcik, M. Morbidelli. Modelling of aggregation kinetics of colloidal systems and its validation by light scattering measurements // Chem. Engineering Sc. 2004. - V. 59, N9. - P. 1783-1798.

10. M. Kolb, Herrmann. The sol-gel transition modeled by irreversible aggregation of clusters // J. Phys. A. 1985. - V. 18, N3. - P. 435-441.

11. M. Lattuada, P.Sandkuhler, H. Wu, J. Sefcik, M. Morbidelli. Aggregation kinetics of polymer colloids in reaction-limited regime: experiments and simulations // Adv. Coll. Interface Sc. 2003. - V. 103, N1. - P. 33-56.

12. M. Lattuada, H. Wu, M. Morbidelli. Hydrodynamic radius of fractal clusters // J. Coll. Interface Sc. 2003. - V. 268, N1. - P. 96-105.

13. J.M. Bailey, D. French. The significance of multiple reactions in enzyme — polymer systems // J. Biol. Chem. 1957. - V. 226, N1. - P. 1-14.

14. B.K. Антонов. Химия протеолиза. M. : Наука, 1983.

15. М. Диксон, Э. Уэбб. Ферменты. М.: Иностранная литература, 1961.

16. С. Niemann. Alpha-Chymotripsin and the nature of enzyme catalysis // Science. 1964. - V. 143, N 3612. - P. 1287-1296.

17. R.F. Rekker. The hydrophobic fragmental constants. Amsterdam: Elsevier, 1977.-P. 301-348.

18. C. Hansch, C. Grieco С., C. Silipo, A. Vittoria. Quantitative structure -activity relationship of chymotrypsin — ligand interaction // J. Med. Chem. — 1977.-V. 20, N 11.-P. 1420-1435.

19. M.M. Vorob'ev, E.A. Paskonova, S.V. Vitt, V.M. Belikov. Kinetic description of proteolysis, Part 2. Substrate regulation of peptide bond demasking and hydrolysis. Liquid chromatorgaphy of hydrolysis // Nahrung. 1986. - V. 30, №10.-P. 995-1001.

20. M.M. Vorob'ev, S.V. Vitt, V.M. Belikov. Kinetic description of proteolysis, Part 3. Total kinetics of peptide bonds hydrolysis in peptide mixtures // Nahrung. 1987. - V. 31, №4. - P. 331-340.

21. M.M. Vorob'ev, L.S. Slobodyanikova, S.V. Vitt, V.K. Latov, V.M. Belikov. Kinetic description of proteolysis. Part 4. Hydrolysis kinetics of partial protein hydrolysates //Nahrung. 1987. - V. 31, №8. - P. 777-782.

22. M.M. Воробьев. Кинетика и математическое моделирование протеолиза: Дисс. канд. хим. наук. М.: Химфак МГУ, 1987. - 143с.

23. А.Д. Неклюдов, А.Н. Иванкин, А.В. Бердутина. Свойства и применение белковых гидролизатов // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - Т. 36, №5. - С. 452-459.

24. М.П. Черников. Протеолиз и биологическая ценность белков (казенны как собственно пищевые белки). М.: Медицина, 1975.

25. В.К. Антонов. Специфичность и механизм действия протеолитических ферментов // Биоорган. Химия. 1980. - Т. 6, №6. - С. 805-839.

26. J. Adler-Nissen. Studies of intermediates produced during peptic digestion of bovine serum albumin, ribonuclease and trypsin // J. Agric. Food Chem. 1976. - V. 24, N6. - P. 1090-1093.

27. N.L. Klyachko, A.V. Levashov. Bioorganic synthesis in reverse micelles and related systems // Current Opin. Colloid Interface Sci. 2003. - V. 8, N 2. - P. 179-186.

28. K.U. Linderstrom-Lang. Lane Medical Lectures, v.6. Stanford: Stanford University Press, 1952. - P. 53-72.

29. G. Chabanon, I. Chevalot, X. Framboisier, S. Chenu, I. Marc. Hydrolysis of rapeseed protein isolates: Kinetics, characterization and functional properties of hydrolysates // Proc. Biochem. 2007. - V. 42, N10. - P. 1419-1428.

30. J. Srividhya, S. Schnell. Why substrate depletion has apparent first-order kinetics in enzymatic digestion // Сотр. Biol. Chem. 2006. - V. 30, N3. - P. 209-214.

31. R. Hinch, S. Schnell. Mechanism equivalence in enzyme-substrate reactions: distributed differential delay in enzyme kinetics // J. Math. Chem. 2004. - V. 35, N3.-P. 253-264.

32. S. Roufik, S.F. Gauthier, S.L. Turgeon. In vitro digestibility of bioactive peptides derived from bovine P-lactoglobulin // Int. Dairy J. 2006. - V. 16, N4. - P. 294-302.

33. Y.I. Kinekawa, N. Kitabatake. Purification of (3-lactoglobulin from whey protein concentrate by pepsin treatment // J. Dairy Sci. 1996. - V. 79, N3. - P. 350-356.

34. P.E. Groleau, S.F. Gauthier, Y. Pouliot. Effect of residual chymotryptic activity in a trypsin preparation on peptide aggregation in a p-lactoglobulin hydrolysate // Int. Dairy J. 2003. - V. 13, N11. - P. 887-895.

35. J.-M. Chobert, L. Briand, V. Tran, T. Haertle. How the substitution of K188 of trypsin binding site by aromatic amino acids can influence the processing of P~ casein // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1998. - V. 246, N3. - P. 847-858.

36. A. Vaintraub, D. Morari. Applying the increase in rate constants of cooperative proteolysis to the determination of transition curves of protein denaturation // J. Biochem. Biophys. Methods. 2003. - V. 57, N3. - P. 191201.

37. E. Dufour, G. Herve, T. Haertle. Hydrolysis of P-lactoglobulin by thermolysin and pepsin under high hydrostatic pressure // Biopolymers. 1995. - V. 35, N5. -P. 475-483.

38. С.Д. Варфоломеев. Химическая энзимология. M.: Academia, 2005.

39. E. Dickinson, S. Krishna. Aggregation in a concentrated model protein system: a mesoscopic simulation of P-casein self-assembly // Food Hydrocolloids. -2001.-V. 15,N2.-P. 107-115.

40. H.M. Farrel, T.F. Kumosinski, P. Paulaski, M.P. Thompson. Calcium induced association of the caseins: a thermodynamic linkage approach to precipitationand resolubilization // Arch. Biochem. Biophys. 1988. - V. 265, №1. - P. 146158.

41. L.K. Creamer, T. Richardson, D.A.D. Parry. Secondary structure of bovine asr and P-casein in solution // Arch. Biochem. Biophys. 1981. - V. 211. - P. 689-696.

42. D.M. Byler, H.M. Jr. Farrell, H. Susi. Raman spectroscopic study of casein structure // J. Dairy Sci. 1988. - V. 71. - P. 2622-2629.

43. T.F. Kumosinski, E.M. Brown, H.M. Farrell. Three-dimentional molecular modeling of bovine caseins: an energy-minimized P-casein structure // J. Dairy Sci. 1993. - V. 76. - P. 931-945.

44. P.F. Fox. Proteinases in dairy technology // Neth. Milk Dairy J. 1981. - V. 35. - P. 233.

45. S. Visser. Proteolytic enzymes and their actions on milk proteins. A review // Neth. Milk Dairy J. 1981. - V. 35. - P. 65.

46. L.K. Creamer. A study of the action of rennin on P-casein // N.Z. J. Dairy Sci. Technol. 1976. - V. 11.-P. 30.

47. M.S. Tai, G. Kegeles. A micelle model for the sedimentation behavior of bovine P-casein // Biophys. Chem. 1984. - V. 20, N1-2. - P. 81-87.

48. D.F. Waugh, L.K. Creamer, C.W. Slattery, G.W. Dresder. Core polymers of casein micelles // Biochemistry. 1970. - V. 9, N4. - P. 786-795.

49. S. Dauphas, N. Mouhous-Riou, B. Metro, A.R. Mackie, P.J. Wilde, M. Anton, A. Riaublanc. The supramolecular organization of P-casein: effect of interfacial properties // Food Hydrocolloids. 2005. - V. 19, N3. - P. 387-393.

50. D.V. Home. Casein micelle structure: Models and muddles // Current Opin. Colloid Interface Sci. 2006. - V. 11. - P. 148-153.

51. Т.А. Валуева, В.В. Мосолов. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биол. химии. — 2002. — Т. 42. — С. 193-216.

52. S. Maruyama, Н. Suzuki. A peptide inhibitor of angiotensin I-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein // Agricultural Biol. Chem. 1982. -V. 46,N2.-P. 393-1394.

53. H. Meisel, E. Schlimme. Inhibitors of angiotensin-converting-enzyme derived from bovine casein (casokinins) // P-Casomorphins and related peptides: Recent developments. V. Brantl, H. Teschemacher (Eds.) Weinheim: VCH, 1994. - P. 27-33.

54. R.J. FitzGerald, H. Meisel. Lactokinins: Whey protein-derived ACE inhibitory peptides //Nahrung. 1999. - V. 43, N3. - P. 165-167.

55. S.V. Silva, F.X. Malcata. Caseins as source of bioactive peptides // Int. Dairy J. 2005. - V. 15, N1.-P. 1-15.

56. A. Pihlanto-Leppala, T. Rokka, H. Korhonen. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins // Int. Dairy J. -1998.-V. 8, N4.-P. 325-331.

57. S. H. Maruyama, H. Mitachi, J. Awaja, M. Kurono, N. Tomizaka, H. Suzuki. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor activity of the C-terminal hexapeptide of asl-casein // Agricultural Biol. Chem. 1987. - V. 51, N9. - P. 2557-2561.

58. Y. Nakamura, N. Yamamoto, K. Sakai, A. Okubo, S. Yamazaki, T. Takano. Purification and characterization of angiotensin-I-converting enzyme inhibitors from sour milk // J. Dairy Sci. 1995. - V. 78, N4. - P. 777-783.

59. M.M. Mullaly, H. Meisel, R.J. FitzGerald. Identification of a novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to a tryptic fragment of bovine P-lactoglobulin // FEBS Letters. 1997. - V. 402, N2-3. - P. 99-101.

60. M.M. Mullaly, H. Meisel, R.J. FitzGerald. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins // Int. Dairy J. 1997. - V. 7, N5. - P. 299-303.

61. M.M. Mullaly, H. Meisel, RJ. FitzGerald. Synthetic peptides corresponding to a-lactalbumin and (3-lactoglobulin sequences with angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1996. - V. 377. - P. 259-260.

62. M. Kuba, C. Tana, S. Tawata, M. Yasuda. Production of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from soybean protein with Monascus purpures acid proteinase // Process Biochem. 2005. - V. 40, N6. - P. 21912196.

63. Y. Eto, T. Ito, S. Nishioka. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory dipeptides in an alkaline protease hydrolysate of whey protein // J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sci. 1998. - V. 51, N4. - P. 355-359.

64. C.C. Bigelow. On the average hydrophobicity of proteins, and the relation between it and protein structure / J. Theor. Biol. 1967. - V. 16, N 2. - P. 187211.

65. P. Antila, I. Paakkari, AJarvinen, M.J. Matilla, M. Laukkanen, A. Pihlanto-Leppala, P. Mantsalla, J. Hellman./ Opioid peptides derived from in-virto proteolysis of bovine whey proteins // Int. Dairy J. 1991. - V. 1, N4. - P. 215229.

66. A. Pihlanto-Leppala. Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: Opioid and ACE-inhibitory // Tr. Food Sc. Tech. 2001. - V. 11, N9-10. - P. 347-356.

67. J.-F. Lapointe, S.F. Gauthier, Y. Pouliot, C.R. Bouchard. Effect of hydrodynamic conditions on fractionation of (3-lactoglobulin tryptic peptidesusing nanofiltration membranes // J. Membrane Sci. 2003. - V. 212, N1-2. - P. 55-67.

68. S. Roufik, S. F. Gauthier, S.L. Turgeon. In vitro digestibility of bioactive peptides derived from bovine P-lactoglobulin // Int. Dairy J. 2006. - V. 16, N4.- P. 294-302.

69. H. Teschemacher, G. Koch, V. Brantl. Milk protein-derived opioid receptor ligands //Biopolymers. 1997. - V. 43, N1. - P. 99-117.

70. H. Teschemacher. Opioid receptor ligands derived from food proteins // Cur. Pharmaceutical Design. 2003. - V. 9, N 16. - P. 1331-1344.

71. M. Tomita, M. Takase, W. Belllami, S. Shimamura. A review: The active peptide of lactoferrin // Acta Paediatrica Japonica. 1994. - V. 36, N6. - P. 585591.

72. H.D. Zucht, M. Raida, K. Adermann, H.J. Magert, W.G. Forssman. Casocidin I: A casein as2-derived peptide exhibits antibacterial activity // FEBS Let. -1995.-V.372.-P. 185-188.

73. P. Jolles, F. Parker, F. Floch, D. Migliore, P. Alliel, A. Zerial, G.H. Werner. Immunostimulating substances from human casein // J. Immunopharmacology.- 1981. -V. 3, N4. P. 363-369.

74. M. Kuba, K. Tanaka, S. Tawata, S. Takeda, M. Yasuda. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. - V. 67, N6. - P. 1278-1283.

75. D.D. Kitts, K. Weiler. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery // Current Pharmaceutical Design. 2003. - V. 9, N16. - P. 1309-1323.

76. E. D. Marczak, H. Usui, H. Fujita, Y. Yang, M. Yokoo, A.W. Lipkowski. New antihypertensive peptides isolated from rapeseed // Peptides. 2003. - V. 24, N 6.-P. 791-798.

77. P.A. Nazarova, V.P. Yamskova, M.S. Krasnov, I.A. Yamskov. Analysis of regulatory protein isolated from the bovine prostate // Dokl. Biol. Sci. 2005. -V. 405.-P. 467-468.

78. T. Matsui. Production of hypotensive peptide, SVY, from 7S globulin of soybean protein and its physiological functions // Soy Protein Res. 2003. - V. 6, No 1. - P. 73-77.

79. O. Masuda, Y. Nakamura, T. Takano. Antihypertensive peptides are present in aorta after oral administration of sour milk containing these peptides to spontaneously hypertensive rats // J. Nutr. 1996. - V. 126, N 12. - P. 30633068.

80. J. Dziuba, P. Minkiewicz, D. Nalecz, A. Iwaniak. Database of biologically active peptide sequences //Nahrung. 1999. - V. 43, N3. - P. 190-195.

81. V. Vermerssen, J. V. Camp, K. Decroos, L. Van Wijmelbeke, W. Verstraete. The impact of fermentation and in vitro digestion on the formation of ACE inhibitory activity from pea and whey protein // J. Dairy, Sci. 2003. - V. 86, -P. 429-438.

82. J.S. Madsen, Т.О. Ahmt, J. Otte, T. Halkier, K.B. Qvist. Hydrolysis of P~ lactoglobulin by four different proteinases monitored by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography // Int. Dairy J. -1997.-V. 7,N5. -P. 399-409.

83. J. Leaver, D.G. Dalgleish. The topography of bovine P-casein at an oil-water interface as determined by the kinetics of trypsin-catalysed hydrolisis // Biochim. Biophis. Acta. 1990. - V. 1041, N2. - P. 317-322.

84. В. Thiede, B. Wittmann-Liebold, M. Bienert, E. Krause. MALDI-MS for the C-terminal sequence determination of peptides and proteins degraded by carboxypeptidases Y and P // FEBS Lett. 1995. - V. 357. - P. 65-69.

85. O. Diaz, A.M. Gouldsworthy, J. Leaver. Identification of peptides released from casein micelles by limited trypsinolysis // J. Agric. Food Chem. 1966. -V. 44,N9.-P. 2517-2522.

86. C.E.H. Schmelzer, R. Schops, R. Ulbrich-Hofmann, R. Neubert, K. Raith. Mass-spectrometric characterization of peptides derived by peptic cleavage of bovine P-casein // J. Chromatography A. 2004. - V. 1055, N1-2. - P. 87-92.

87. J. Samskog, D. Bylund, S.P. Jacobsson, K.E. Markides. Miniaturized on-line proteolysis-capillary liquid chromatography mass spectrometry for peptide mapping of lactate dehydrogenase // J. Chromatography A. - 2003. - V. 998, N1-2.-P. 83-91.

88. H.W. Vesper, L. Mi, A. Enada, G.L. Myers. Assessment of microwave-assisted enzymatic digestion by measuring glycated hemoglobin Ale by massspectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. - V. 19, N20. - P. 2865-287.

89. B. Pramanik, U. Mirza, Y. Ing, Y. Liu, P. Bartner, P. Weber, A. Bose. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes // Protein Sci. -2002. V. 11, N10. - P. 2676-2687.

90. J.-C. Rochet, P.T. Lansbury. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations // Current Opinion Structural Biol. 2000. - V. 10, N1. - P. 60-68.

91. J. Goers, S.E. Permyakov, E.A. Permyakov, V.N. Uversky, A.L. Fink. Conformational prerequisites for a-lactalbumin fibrillation // Biochemistry. -2002.-V. 41,N41.-P. 12546-12551.

92. R. Ipsen, J. Otte. Nano-structuring by means of proteolysis: rheology of novel gels from a-lactalbumin // Ann. Trans. Nordic Rheology Soc. 2003. -V.l 1, N1. - P. 89-93.

93. R. Ipsen, J. Otte, K.B. Qvist. Molecular self-assembly of partially hydrolysed a-lactalbumin resulting in strong gels with a novel microstructure // J. Dairy Res. 2001. - V.68. - P. 277-286.

94. R. Ipsen, J. Otte, K.B. Qvist. Protease-induced nano-tubular gels from a-lactalbumin // Food colloids, biopolymers and materials. E. Dickinson, T. van Vliet (Eds.) Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2003. - P. 84-92.

95. J. Otte, R. Ipsen, R. Bauer, MJ. Bjerrum, R. Waninge. Formation of amyloid-like fibrils upon limited proteolysis of bovine a-lactalbumin // Int. Dairy J. 2005. - V. 15, N3. - P. 219-229.

96. J. Otte, R. Ipsen, A.M. Ladefoged, J. Sorensen. Protease-induced aggregation of a-lactalbumin: identification of the primary associating fragment // J. Dairy Res. 2004. - V. 71. - P. 88-97.

97. M. Reches, Y. Porat, E. Gazit. Amyloid fibril formation by pentapeptide and tetrapeptide fragments of human calcitonin // J. Biol. Chem. 2002. -V.277, N38. - P. 35475-35480.

98. S. Vauthey, S. Santoso, H. Gong, N. Watson, S. Zhang. Molecular self-assembly of surfactant-like peptides to form nanotubes and nanovesicles // Proc. Natl. Acad. Science. 2002. - V. 99, N8. - P. 5355-5360.

99. I. Svendsen, K. Breddam. Isolation and amino acid sequence of glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis // Eur. J. Biochem.1992.-V. 204,N1. -P. 165-171.

100. L.C. Wu, P.S. Kim. A specific hydrophobic core in the a-lactalbumin molten globule // J. Mol. Biol. 1998. - V. 280, N1. - P. 175-182.

101. E.D. Chrysina, K. Brew, K.R. Acharya. Crystal structures of apo- and holo-bovine a-lactalbumin at 2. 2k resolution reveal an effect of calcium on inter-lobe interactions // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, N47. - P. 37021-37029.

102. J.T. Jarrett, P.T. Lansbury. Seeding "one-dimentional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie // Cell.1993. V. 73, No 6. - P. 1055-1058.

103. R.L. Baldwin. Temperature dependence of the hydrophobic interaction in protein folding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83, N21. - P. 80698072.

104. P.L. Privalov. Stability of proteins. Small globular proteins // Adv. Protein Chem. 1979. - V. 33. - P. 167-241.

105. J.A. Schellman. Temperature, stability, and the hydrophobic interaction // Biophys. J. 1997. - V. 73, N6. - P. 2960-2964.

106. J.M. Sturtevant. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74, No 6. - P. 2236-2240.

107. P.J. Flory. Principles of polymer chemistry. Cornell University Press: Ithaca, NY, 1953.

108. G.I. Makhatadze, P.L. Privalov. Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acids residues in aqueous solution: hydration effect//J. Mol. Biol. 1990. - V. 213, No 2. - P. 375-384.

109. P.L. Privalov, G.I. Makhatadze. Contribution of hydration and non-covalent interactions to the heat capacity effect on protein unfolding // J. Mol. Biol. -1992. V. 224, No 3. - P. 715-723.

110. H.S. Chan, K.A. Dill. Polymer principles in protein structure and stability // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1991. - V. 20. - P. 447-490.

111. R.B. Hermann. Therory of hydrophobic bonding. II. Correlation of hydrocarbon solubility in water with solvent cavity surface area // J. Phys. Chem. 1972. - V. 76, N19. - P. 2754-2759.

112. A. Ben-Naim. Solvation thermodynamics. New York: Plenum Press, 1987.

113. T. Ooi, M. Oobatake, G. Nemethy, H.A. Scheraga. Accessible surface areas as a measure of the thermodynamic parameters of hydration of peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84, N10. - P. 3086-3090.

114. M. Renner, H.-J. Hinz, M. Scharf, J.W. Engels. Thermodynamics of unfolding of the a-amylase inhibitor tendamistat. Correlation between accessible surface area and heat capacity // J. Mol. Biol. 1992. - V. 223, N3. -P. 769-779.

115. E. Gallicchio, M.M. Kubo, R.M. Levy. Enthalpy-entropy and cavity decomposition of alkane hydration free energies: numerical results and implications for theories of hydrophobic solution // J. Phys. Chem. B. 2000. -V. 104,N26.-P. 6271-6285.

116. H.S. Ashbaugh, S. Garde, G. Hummer, E.W. Kaler, M.E. Paulaitis. Conformational equilibria of alkanes in aqueous solution: relationship to waterstructure near hydrophobic solutes // Biophys. J. 1999. - V. 77, N2. - P. 645654.

117. H.S. Ashbaugh, E.W. Kaler, M.E. Paulaitis. A universal sufrace area correalation for molecular hydrophobic phenomena // J. Am. Chem. Soc. -1999. V. 121, N39. - P. 9243-9244.

118. W. Kauzmann. Some factors in the interpretation of protein denaturation // Adv. Prot. Chem. 1959. - V. 14. - P. 1-63.

119. C. Tanford. The hydrophobic effect formation of micelles and biological membranes, 2nd Ed. New York: Wiley, 1980.

120. A. Ben-Naim. Hydrophobic interactions. New York: Plenum Press, 1980.

121. K. Soda. Structural and thermodynamic aspects of the hydrophobic effects // Adv. Biophys. 1993. - V.29. - P. 1-54.

122. D. W. Urry, D.C. Gowda, T.M. Parker, C.H. Luan, M.C. Reid, C.M. Harris, A. Patanaik, R.D. Harris. Hydrophobicity scale for proteins based on inverse temperature transitions // Biopolymers. 1992. - V.32. - P.1243-1250.

123. K.A. Dill. Dominant forces in protein folding // Biochemistry. 1990. -V.29, No. 31. - P.7133-7155.

124. K.A. Dill. The meaning of hydrophobicity // Science. 1990. - V.250, (4978). - P.297-298.

125. M.M. Vorob'ev. Hydrophobicity scale of amino acids as determined by absorption millimeter spectroscopy: correlation with heat capacities of aqueous solutions // Z. Naturforsch. 1997. - V.52c. - P.227-234.

126. C. Tenford. Contribution of hydrophobic interactions to the stability of the globular conformation of proteins // J. Am. Chem. Soc. 1962. - V. 84, N22. -P. 4240-4247.

127. P.A. Karplus. Hydrophobicity regained // Prot. Sci. 1997. - V. 6, No. 6. - P. 1302-1307.

128. N.T. Southall, K.A. Dill, A.D.J. Haymet. A view of hydrophobic effect // J. Phys. Chem. B. 2002. - V. 106. - P. 521-533.

129. M. Munson, S. Balasubramanian, K.G. Fleming, A.D. Nagi, R. Obrien, J.M. Sturtevant, L. Regan. What makes a protein protein? Hydrophobic core designs that specify stability and structural properties // Protein Sci. 1996. - V. 5, No 8.-P. 1584-1593.

130. M. Munson, K.S. Anderson, L. Regan. Speeding up protein folding: mutations that increace the rate at which Rop folds and unfolds by over four orders of magnitude // Folding Des. 1997. - V.2. - P.77-87.

131. Y. Maeda, H. Kitano. The structure of water in polymer systems as. revealed by Raman spectroscopy // Spectrosc. Acta A. 1995. - V.51. No. 14. - P.2433-2446.

132. M. Ide, Y. Maeda, H. Kitano. Effect of hydrophobicity of amino acids on the structure of water // J. Phys. Chem. B. 1997. - V.101, No. 35. - P. 70227026.

133. G.E. Walrafen, M.R. Fisher, M.S. Hokmabadi, W.-H. Yang. Temperature dependence of the low- and high-frequency Raman scattering from liquid water // J. Chem. Phys. 1986. - V. 85. - P. 6070.

134. J.L. Green, A.R. Lacey, M.G. Sceats. Spectroscopic evidence for special correlations of hydrogen bonds in liquid water // J. Phys. Chem. 1986. - V.90, N17.-P. 3958-3964.

135. H. Kitano, M. Imai, K. Sudo, M. Ide. Hydrogen-bonded network structure of water in aqueous solution of sulfobetaine polymers // J. Phys. Chem. B. -2002. V.106, No. 43. - P. 11391-11396.

136. D. Hecht, L. Tadesse, L. Walters. Correlating hydration shell structure with amino acid hydrophobicity II J. Am. Chem. Soc. 1993. - V. 115, No. 8. - P. 3336-3337.

137. G.C. Pimentel, A. McClellan. The hydrogen bond. San Francisco, CA: W.H. Freeeman & Co., 1960.

138. D. Hecht, L. Tadesse, L. Walters. Defining hydrophobicity: probing the structure of solute-induced hydration shells by Fourier transform infrared spectroscopy // J. Am. Chem. Soc. 1992. - V. 114, No. 11. - P. 4336-4339.

139. R.A. Atkinson, B. Kieffer. The role of protein motions in molecular recognition: insights from heteronuclear NMR relaxation measurements // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2004. - V.44. - P. 141-187.

140. K. Hallenga, S.H. Koenig. Protein rotation relaxation as studied by solvent lH and 2H magnetic relaxation // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 4255-4264.

141. С.И. Аксенов. Вода и ее роль в регуляции биологических процессов. — М.: Наука, 1990.

142. В. Sierra-Martin, M.S. Romero-Cano, Т. Cosgrove, В. Vincent, А. Fernandez-Barbero. Solvent relaxation of swelling PNIPAM microgels by NMR// Colloids'Surf. A. -2005. V.270-271. - P. 296-300.

143. R.R. Ruan, J. Han, P.L. Chen, B.C. Martinez. Pulse NMR study of structural characteristic of temperature-sensitive hydrogel // Biotechnol. Techniques. -1997.-V. 11. P. 257-260.

144. U. Kaatze. The dielectric properties of water in its different states of interaction II J. Solution Chem. 1997. - V.26, No. 11. - P. 1049-1112.

145. U. Kaatze, H. Bieler, R. Pottel. Dielectric spectroscopy on aqueous solutions of some zwitterionic amino acids // J. Mol. Liquids. 1985. - V. 30, N2.-P. 101-113.

146. R. Buchner, J. Barthel. Dielectric relaxation in solutions // Annu. Rep. Prog. Chem., Sect. C. 2001. - V. 97. - P. 349-382.

147. А.К. Лященко, B.C. Харькин, А.С. Лилеев, П.В. Ефремов. Комплексная диэлектрическая проницаемость и релаксация в водных растворах метилэтилкетонаю // Журн. физ. химии. 2001. - Т. 75, № 2. - С. 250-256.

148. А. А. Потапов. Двухуровневая диполь-сольватонная модельгдиэлестрической поляризации (квазистатическое поведение) // Журн. физ. химии. 1996. - Т.15, № 12. - С. 45-55.

149. Т. Kamei, М. Oobatake, М. Suzuki. Hydration of apomyoglobin in native, molten globule, and unfolded states by using microwave dielectric spectroscopy // Biophys. J. 2002. - V. 82. - P. 418-425.

150. P. Potong, R. Pottel, U. Kaatze. Water-ethanol mixtures at different compositions and temperatures. A dielectric relaxation study // J. Phys. Chem. A. 2000. - V. 104. - P. 7420-7428.

151. E. Hanke, K. von Roden, U. Kaatze. Hydrogen network fluctuations of associating liquids: Dielectric relaxation of ethylene glycol oligomers and their mixtures with water // J. Chem. Phys. 2006. - V. 125, N8, P. 84507.

152. T. Sato, R. Buchner. Cooperative and molecular dynamics of alcohol/water mixtures: the view of dielectric spectroscopy // J. Mol. Liquids. 2005. - V. 117.-P. 23-31.

153. B.A. Гайдук, B.A. Кудряшова, Л.А. Паршина, А.С. Фалеев, Ю.И. Хургин. Поглощение ММ излучения водными растворами глицина. Влияние состояния ионизации аминокислот // Докл. Акад. Наук СССР. -1974.-Т. 214.-С. 135-138.

154. U. Kaatze, R. Behrends, R. Pottel. Hydrogen network fluctuations and dielectric apectrometry of liquids // J. Non-Crystalline Solids. 2002. - V. 305, N1-3.-P. 19-28.

155. R. Pottel, D. Adolph, U. Kaatze. Dielectric relaxation in aqueous solutions of some dipolar organic molecules // Ber. Bunsenges. Physik. Chem. 1975. -V. 79, N3. - P. 278-285.

156. Ю.И. Хургин. Гидратация глобулярных белков // Ж. Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. — 1976. N 6. - 684-690.

157. А.С. Фалеев, В.А. Кудряшова, В.И. Гайдук, Н.М. Росуканый, А.Б. Григорьев. Исследование ближней гидратации ионов в водных растворах электролитов методом ММ спектроскопии. // Ж. физ. химии. 1977. - N 5. -С. 1153-1158.

158. Ю.И. Хургин, О.В. Лебедев, Е.Ю. Максарева, В.А. Завизион, В.А. Кудряшова, М.М. Воробьев, Г. А. Орехова, А.Н. Даниленко. Межмолекулярные взаимодействия в водных растворах мебикара // Известия АН, Сер. хим. 1995. - №6. - С. 1178-1179.

159. А.К. Lyashchenko, Т.А. Novskova. Structural dynamics of water and its dielectric and absorption spectra in the range 0-800 cm"1 // J. Mol. Liquids. -2006.- V. 125, N2-3.-P. 130-138.

160. В.Я. Малеев, В.А. Кашпур, Е.Ю. Щеголева. Диэлектриметрия в миллиметровом диапазоне длин волн как метод исследования взаимодействия биополимеров с водой // Нетепловые эффекты миллиметрового излучения (ред. Н.Д. Девятков) М: ИРЭ АН СССР, 1981.-С. 26-41.

161. Y.I. Khurgin, E.Y. Maksareva. Urea generated free rotating watermolecules are active in the protein unfolding process // FEBS Let. - 1993. -V. 315, N2. P. 149-152.

162. А.А. Замятнин, Дилатометрия растворов белков, Наука, Москва, 1973.

163. Ю.И.Хургин, А.А.Баранов, М.М.Воробьев. Гидрофобная гидратация алифатических аминокислот // Изв. АН. Сер. хим. 1994. - №11. - С. 20312033.

164. В.А. Завизион, В.А. Кудряшова, Ю.И.Хургин. Влияние а-аминокислот на взаимодействие ММ-излучения с водой // Миллиметровые волны в биологии и медицине. — 1994. №3. - С. 46-51.

165. М.М. Воробьев, А.Н.Даниленко, Ю.И.Хургин. Корреляция индексов гидрофобной гидратации с теплоемкостями водных растворов алифатических аминокислот //10 Конференция «Миллиметровые волны в медицине» М.: ИРЭ РАН, 1995. - С. 216.

166. М.М. Воробьев, А.А. Баранов, В.М. Беликов, Ю.И. Хургин. Исследование гидратации а-аминокислот методом абсорбционной миллиметровой спектроскопии // Изв. АН, Сер. хим. 1996. - Т. 45. - С. 618-622.

167. М.М. Vorob'ev. Bound water measurements for aqueous protein solutions and food gels//Colloids Surf. B. 2003.-V.31, No. 1-4.-P. 133-140.

168. J.B. Hasted // Aqueous Dielectrics A.D. Buckingham (Ed.) London: Chapman and Hall, 1973.

169. M. Kent. Complex permittivity of protein powders at 9.4 GHz as a function of temperature and hydration // J. Phys. D: Appl. Phys. 1972. - V. 5, No. 2. -P. 394-409.

170. F. Henry, A.J. Berteaud. New measurement technique for the dielectric study of solutions and suspensions // J. Microwave Power. 1980. - V.15. -P.65-72.

171. D. Rosen. Dielectric properties of protein powders with adsorbed water // Trans. Faraday Soc. 1963. - V. 59. - P.2178-2191.

172. A.W. Kraszewski, S.O. Nelson. Resonant cavity perturbation some new applications of an old measuring technique // J. Microwave Pow. Electromagn. Ener. - 1996. - V. 31, P. 178-187.

173. F. Henry, L.C. Costa, M. Serpelloni. Dielectric method for the determination of aw // Food Chem. 2003. - V.82, No. 1. - P.73-77.

174. F. Henry, M. Gaudillat, L.C. Costa, F. Lakkis. Free and/or bound water by dielectric measurements // Food Chem. 2003. - V.82, No. 1. - P. 29-34.

175. T.Sato, A.Chiba, R.Nozaki. Hydrophobic hydration and molecular association in methanol-water mixtures studied by microwave dielectric analysis // J. Chem. Phys. 2000. V. 112, No. 6. - P. 2924-2932.

176. H-X. Zhou. A unified picture of protein hydration: prediction of hydrodynamic properties from known structures // Biophys. Chem. 2001. - V. 93,No. 2-3.-P. 171-179.

177. M.M. Teeter. Water-protein interactions: theory and experiment // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1991. - V. 20. - P. 577-600.

178. H. Durchschlag, P. Zipper. Modeling the hydration of proteins: prediction of structural and hydrodynamic parameters from X-ray diffraction and scattering data // Eur. Biophys. J. 2003. - V. 32, No. 5. - P. 487-502.

179. I.D. Kuntz, W. Kauzmann. Hydration of proteins and polypeptides // Adv. Protein Chem. 1974. - V. 28. - P. 239-345.

180. I.D. Kuntz. Hydration of macromiolecules. III. Hydration of polypeptides // J. Am. Chem. Soc. 1971. - V. 93. - P. 514-516.

181. S. Pal, J. Peon, A. Zewail. Biological water at the protein interface: dynamical solvation probed directly with femosecond resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99, No. 4. - P. 1763-1768.

182. W. Kauzmann, K. Moore, D. Sculz. Protein densities from X-ray crystallographic coordinates //Nature. 1974. - V. 248, No. 5448. - P. 447-449.

183. Д.С. Чернавский, Ю.И. Хургин, С.Э. Шноль. Об упругих деформациях белка-фермента// Молекулярная биология. 1967. - Т. 1. - С. 419-424.

184. М.В. Волькенштейн. Молекулярная биофизика. М: Наука, 1975. - С. 616.

185. I.M. Klotz. Comparison of molecular structure of proteins: helix content, distribution of apolar residues // Arch. Biochem. Biophys. 1970. - V. 138, No. 2. - P. 704-706.

186. M. Oobatake, T. Ooi. Hydration and heat stability effects of protein unfolding // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1993. - V. 59, No. 3. - P. 237-284.

187. N. Thanki, J. Thornton, J. Goodfellow. Distributions of water around amino acid residues in proteins // J. Mol. Biol. 1988. - V. 202, No. 3. - P. 637657.

188. L. Kuhn, M. Siani, M. Pique, C. Fisher, E. Getzoff, J. Tainer. The interdependence of protein sufrace topography and bound water molecules revealed by surface accessibility and fractal density measures // J. Mol. Biol. -1992.-V. 228, No. l.-P. 13-22.

189. H. Durchschlag, P. Zipper. Modelling of protein hydration // J. Phys. Condens. Matter. 2002. - V. 14. - P. 2439-2452.

190. M. Connolly. The molecular surface package // J. Mol. Graph. 1993. - V. 11.-P. 139-141.

191. Y. Vorobjev, SIMS: computation of a smooth invariant molecular surface // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 722-732.

192. H. Durchschlag, P. Zipper. Modeling of protein hydration with respect to X-ray scattering and hydrodynamics // Prog. Colloid Polym. Sci. 2002. V. 119.-P. 131-140.

193. R.H. Henchman, J.A. McCammon. Extracting hydration sites around proteins from explicit water simulations // J. Comput. Chem. 2002. - V. 23. -P. 861-869.

194. C. Bon, M.S. Lehmann, C. Wilkinson. Quasi-Laue neutron diffraction study of the water arrangement in crystals of triclinic hen egg-white lysozyme // Acta Crystallogr. Sect. D. 1999. - V. 55. - P. 978-987.

195. Y. Tamai, H. Tanaka, K. Nakanishi. Molecular dynamics study of polymer-water interaction in hydrogels. 1. Hydrogen-bond structure // Macromolecules. -1996. V. 29, N21. - P. 6750-6760.

196. V.V. Vasilevskaya, P.G. Khalatur, A.R. Khokhlov. Conformational polymorphism of amphiphilic polymers in poor solvent // Macromolecules. -2003. V. 36, N26. - P. 10103-10111.

197. F. Bruge, S.L. Fornili, G.G. Malenkov, M.B. Palma-Vittorelli, M.U. Palma. Solvent-induced forces on a molecular scale: non-additivity, modulation and causal relation to hydration // Chem. Phys. Letters. 1996. - V. 254, N5-6. - P. 283-291.

198. C. Rocchi, A.R. Bizzarri, S. Cannistraro. Water residence times around copper plastocyanin: a molecular dynamics simulation approach // Chem. Phys. 1997.-V. 214. - P. 261-276.

199. F. Bruge, G. Cottone, S.L. Fornili. Solute-solute solvent-induced interaction: molecular dynamics simulation of a mixed model system in water // Chem. Phys. Letters. 1995. - V. 235, N5-6. - P. 402-409.

200. V. Martorana, G. Corongiu, M.U. Palma. Correlated solvent-induced forces on a protein at single residue resolution: relation to conformation, stability, dynamics and function // Chem. Phys. Letters. 1996. - V. 254. - P. 292-301.

201. R. W. Impey, P.A. Madden, I.R. McDonald. Hydration and mobility of ions in solution // J. Phys. Chem. 1983. - V. 87, N 8. - P. 5071-5083.

202. A.E. Garcia, L. Stiller. Computation of the mean residence time of water in the hydration shells of biomolecules // J. Comput. Chem. 1993. V. 14, N11. -P. 1396-1406.

203. C.L. Brooks, M. Karplus. Solvent effects on protein motion and protein effects on solvent motion: Dynamics of the active site region of lysozyme // J. Mol. Biol. 1989. - V. 208, N1. - P.159-181.

204. Y. Tamai, H. Tanaka, K. Nakanishi. Molecular dynamics study of polymer-water interaction in hydrogels: Hydrogen-bond structure // Macromolecules. -1996. -V. 29, N21. P. 6750-6760.

205. Y. Tamai, H. Tanaka, K. Nakanishi. Molecular dynamics study of polymer water interaction in hydrogels. 2. Hydrogen — bond dynamics // Macromolecules. - 1996. - V. 29, N21. - P. 6761-6769.

206. Y. Hirokawa, T. Tanaka. Volume phase transition in a nonionic gel // J. Chem. Phys. 1984. - V. 81, N12. - P. 6379-6380.

207. P.G. de Gennes. Kinetics of collapse for a flexible coil // Journal de Physique Lettres. 1985. - V. 46, N 14. - P. 639-642.

208. R. Motokawa, M. Annaka, T. Nakahira, S. Koizumi Small-angle neutron acattering study on microstructure of poly(N-isopropylacrylamide)-blok-poly(ethyleneglycol) in water // Colloids Surf. B. 2004. V. 38. - P. 213-219.

209. B. Zagrovic, C.D. Snow, M.R. Shirts, V.S. Pande. Simulation of folding of a small alpha-helical protein in atomistic detail using worldwide-distributed computing // J. Mol. Biol. 2002. - V. 323, N5. - P. 927-937.

210. S. Williams, T.P. Gausgrove, R. Gilmanshin, K.S. Fang, R.H. Callender, R.H. Woodruff, R.B. Dyer. Fast events in protein folding: Helix melting and formation in small peptide // Biochemistry. 1996. - V. 35, N3. - P. 691-697.

211. M.R. Caplan, E.M. Schwartzfarb, S. Zhang, R.D. Kamm, D.A. Lauffenburger. Control of self-assembling oligopeptide matrix formation through systematic variation of amino acid sequence // Biomaterials. 2002. -V.23, N1. - P.219-227.

212. Y. Zhu, X. Fu, T. Wang, A. Tamura, S. Takada, J.G. Saven, F. Dai. Guiding the search for a protein's maximum rate of folding // Chem. Physics. 2004. -V. 307.-P. 99-109.

213. M. Sadqi, L.J. Lapidus, V. Munoz. How fast is protein hydrophobic collapse //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, N21. -P. 12117-12122.

214. Y. Duan, P.A. Kollman. Pathways to a protein folding intermediate observed in a 1-microsecond simulation in aqueous solution // Science. 1998. - V. 282, N5390.-P. 740-744.

215. J. Klein-Seetharaman, M. Oikawa, S.B. Grimshaw, J. Wirmer, E. Duchardt, T. Ueda. Long-range interactions within a non-native protein // Science. 2002. — V. 295,N5560. -P. 1719-1722.

216. S.S. Plotkin. Speeding protein folding beyond the Go model: how a little frustration sometimes helps // Proteins: Struct. Funct. Gent. 2001. V. 45. - P. 337-345.

217. M.M. Vorob'ev, M. Dalgalarrondo, J.-M. Chobert, T. Haertle. Kinetics of p-casein hydrolysis by wild-type and engineered trypsin // Biopolymers. 2000. -V. 54,N5.-P. 355-364.

218. V. Shellenberger, G.W. Turch, L. Hedstrom, W. Rutter, Mapping the S' subsites of serine proteases using acyl transfer to mixtures of peptide nucleophiles. Biochemistry, 1993, 32, N16, 4349-4353.

219. G.P. Hess, J. McConn, Ku.E. McConkey. Studies of the activity of a-chymotrypsin // Phil. Trans. Roy. Soc. London. 1970. - V. B257, N 813. - P. 89-104.

220. L. Hedstrom, T.-Y. Lin, W. Fast. Hydrophobic interactions control zymogen activation in the trypsin family of serine proteases // Biochemistry. — 1996. V. 35, N14. -P. 4515-4523.

221. A.R. Fersht. Conformational equlibria in a- anf 5-chymotiypsin: The energetics and importance of the salt bridge // J. Mol. Biol. 1972. - V. 64, N2. - P. 497-509.

222. E.T. Денисов. Кинетика гомогенных химических реакций. М.: Высшая школа, 1978.

223. М.М. Воробьев, Е.А. Пасконова, С.В. Витт, В.М. Беликов. Зависимость свойств хроматографических фракций протосубтилиновых гидролизатов казеина от условий протеолиза // Биотехнология. 1986. - №4. - С. 40-45.

224. М.М. Воробьев, И.Ю. Левичева, В.М. Беликов. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином // Прикл. биохимия микробиол. 1996. - Т. 32, №2, - С. 242-246.

225. A. Kato, К. Komatsu, К. Fujimoto, К. Kobayashi. Relationship between surface functional properties and flexibility of proteins detected by the protease susceptibility // J. Agric. Food Chem. 1985. - V. 33, N5. - P. 931-934.

226. L. Savoie, S.F. Gauthier. Dialysis cell for the in vitro measurements of protein digestibility // J. Food Sci. 1986. - V. 51. - P. 494-498.

227. M.M. Vorob'ev, G. Parent, L. Savoie. Quantitative comparison of casein and repeseed proteolysis by pancreatin // Nahrung. 1996. - V. 40, N 5. - P. 248-255.

228. M.M.Vorob'ev, I.A. Goncharova. Computer simulation of proteolysis. Peptic hydrolysis of partially demasked P-Lactoglobulin // Nahrung. 1998. -V. 42, N 2, - P. 60-66.

229. J.C. Powers, D. Harley, D.V. Myers. Substrate specificity of porcine pepsin //Adv. Exp. Biol. Med. 1977. - V. 95. N1. - P. 141-157.

230. M. Dalgalarrondo, E. Dufour, J.M. Chobert, C. Bertrand Harb, T. Haertle. Proteolysis of P-lactoglobulin and P-casein by pepsin in ethanolic media // Int. Dairy J. 1995.-V. 5,N l.-P. 1-14.

231. P. Minkiewicz, J. Dziuba, M. Darewicz, A. Iwaniak, M. Dziuba, D. Nalecz. Food peptidomics // Food Technol. Biotechnol. 2008. - V. 46, N 1. - P. 1-10.

232. S. Miller, J.Janin, A.M. Lesk, C. Chothia. Interior and surface of monomeric proteins // J. Mol. Biol. 1987. - V. 196, N 3. - P. 641-656.

233. R.D. Wanchope, R. Haque. Aqueous solutions of nonpolar compounds. Heat-capacity effects // Can. J. Chem. 1972. - V. 50, N1, - P. 133-138.

234. S. Cabani, P. Gianni, V. Mollica, L. Lepori. Group contributions to the thermodynamic properties of non-ionic organic solutions in dilute aqueous solutions//J. Sol. Chem.-1981.-V. 10, N8.-P. 563-595.

235. P.L. Privalov, G.I. Makhatadze. Contribution of hydration and non-covalent interactions to the heast capacity effect of protein unfolding // J. Mol. Biol. -1992. -V. 224, N 3. P. 715-723.

236. S.W. Benson. Thermochemical kinetics. New York: J.Wiley and Sons, INC., 1968. P. 308.

237. M.M. Воробьев, A.H. Даниленко. Оценка гидратации полярных групп а-аминокислот методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Изв. АН, Сер. хим. 1996. - №9. - С. 2237-2242.

238. A.W. Hakin, M.M. Duke, S.A. Klassen, R.M. McKay, K.E. Prenss. Apparent molar heat capacities and volumes of some aqueous solutions of aliphatic amino acids at 288.15, 298.15, 313.15, and 328.15 К // Can. J. Chem. 1994. - V. 72, N 2. - P. 362-368.

239. S. Cabani, G. Conti, E. Matteoli, A.Tani. Apparent molal heat capacities of organic compounds in aqueous solution. Part 3. — co-Amino acids and related compounds // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1. 1977. - V. 73. - P. 476-486.

240. A. Cooper, D.D. MacNicol. Chiral host-guest complexes: interaction of a-cyclodextrin with optically active benzene derivatives // J. Chem. Soc. Perkin II.- 1978.-P 760-763.

241. A. Cooper, К. E. McAuley-Hecht. Microcalorimetry and the molecular recognition of peptides and proteins // Phil. Trans. R. Soc. London, A. 1993. -V. 345. - P. 23-35.

242. J. Janin. Surface area of globular proteins // J. Mol. Biol. 1976. - V. 105, Nl.-P. 13-14.

243. T. van Vliet, C.J.A.M. Keetels. Effect of preheating of milk on the structure of acidified milk gels // Neth. Milk Dairy J. 1995. - V. 49. - P. 27-35.

244. M. Kalab, D.B. Emmons, A.G. Sargant. Milk gel structure. V. Microstructure of yoghurt as related to heating of milk // Milchwissenscnschaft. 1976.-V. 31.-P. 402-408.

245. F.L. Davies, P.A. Shankar, P.E. Brooker, D.G. Hobs. A heat induced change in the ultrastructure of milk and its effect on gel formation in yoghurt // J. Dairy Res. 1978. - V. 45. - P. 53-58.

246. Б.И. Курганов. Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков // Успехи биол. химии. 2002. - Т. 42. - С. 89-138.

247. М. Meewes, J. Ricka, М. De Silva, R. Nyffenegger and T. Binkert, Coil-globule transition of the poly(N-isopropylacrylamide): a study of surfactant effects by light scattering // Macromolecules. 1991. - V. 24, N 21. - P. 58115816.

248. M.M. Vorob'ev, N.G. Faleev. Water ordering measurements in the aqueous polymer systems by waveguide dielectric resonance method // Mendeleev Commun. 2005. - N6. - P. 259-261.

249. M.M. Vorob'ev, N. Churochkina, A. Khokhlov, E. Stepnova. Hydration characterization of hydrophobically modified polymers by dielectric measurements in the millimeter range // Macromol. Bioscience. — 2007. V. 7, N4.-P. 475-481.

250. C.E. Flynn, J.W. Goodwin. Association of acrylamide dodecylmethacrylate copolymers in aqueous solution // Polymers as rheological modifiers. D.N. Schultz, J.E. Glass (Eds.) - New York: American Chemical Society, 1991. -P.191.

251. V.G. Babak, J. Desbrieres, V.E. Tikhonov. Dynamic surface tension and dilational viscoelasticity of absorption layers of a hydrophobically modified chitosan // Colloids Surfaces A. 2005. - V. 255, N1-3. - P. 119-130.

252. В.И. Лозинский, И.А. Сименел, E.A. Курская, B.K. Кулакова, В.Я. Гринберг, А.С. Дубовик, И.Ю. Галаев, Б. Маттиассон, А.Р.Хохлов. Синтез и свойства «белковоподобного» сополимера // Докл. Акад. наук. -2000. Т. 375. - С. 637-640.

253. V.I. Lozinsky, I.A. Simenel, E.A. Kurskaya, V.K. Kulakova, I.Yu. Galaev, B. Mattiasson, V.Ya. Grinberg, N.V. Grinberg, A.R. Khokhlov. Synthesis of N-vinylcaprolactam polymers in aqueous media // Polymer. 2000. - V. 41. - P. 6507-6518.

254. V.I. Lozinsky, I.A. Simenel, V.K. Kulakova, E.A. Kurskaya, T.A. Babushkina, T.P. Klimova, T.V. Burova, A.S. Dubovik, V.Ya. Grinberg, I.Yu.

255. Galaev, В. Mattiasson, A.R. KhokHIbv.^ Synthesis and studies of N-vinylcaprolactam / N-vinylimidazole copolymers that exhibit the "proteinlike" behaviour in aqueous media // Macromolecules. 2003. - V.36. - P. 73087323.

256. L. Briand, J.-M. Chobert, J. Tauzin, N. Declerck, J. Leonil, D. Molle, V. Tran, T. Haertle. Regulation of trypsin activity by Cu chelation of the substrate binding site // Protein Eng. 1997. - V. 10, N5. - P. 551-560.

257. C.A. Zittle, J.H. Custer. Purification and some of the properties of as-casein and к-casein//J. Dairy Sci. 1963. - V. 46, N 11.-P. 1183-1188.

258. H. Altschuler, Dielectric constant. Chapter 9 // Handbook of microwave measurements (M. Sucher and J. Fox, eds.) New York: Brooklyn Polytechnic Press, 1963.-P. 530-536.

259. H.E. Bussey. Measurement of RF properties of materials a survey // Proc. IEEE. - 1967. - V. 55, N6. - P. 1046-1053.

260. S. Trabelsi, S.O. Nelson. Temperature-dependent behaviour of dielectric properties of bound water in grain at microwave frequencies // Meas. Sci. Technol. 2006. - V.17, N8. - P. 2289-2293.

261. Беляков E.B. A.c. №1465749 // Изобретения и открытия. 1989. - №10. -С. 182-183.

262. А.А. Зинченко, Л.Д. Румш, В.К. Антонов Кинетический и термодинамический анализ специфичности пепсина // Биоорган, химия. -1977. Т. 3. № 12. С. 1663 - 1670.