Кинетика и механизмы дезактивации возбужденных электронных состояний порфиринов, встроенных в ДНК тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И АТОМНОЙ ФИЗИКИ

С 535.343.32:541.141.7+ 541.143

Р\х од

i- !/"П 2~>ид

ГАЛИЕВСКИЙ Виктор Антонович

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ДЕЗАКТИВАЦИИ ВОЗБУЖДЕННЫХ ЭЛЕКТРОННЫХ СОСТОЯНИЙ ПОРФИРИНОВ, ВСТРОЕННЫХ В ДНК

01.04.05 —Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Минск - 2000

Работа выполнена в Институте молекулярной и атомной физики HAH Беларуси.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник Чирвоный B.C.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Бушук Б. А.

доктор физико-математических наук, профессор Толсторожев Г.Б.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится 30 июня 2000 г. в 9 часов 30 минут на заседании совета по защите диссертаций Д 01.01.01 при Институте молекулярной и атомной физики НАН Беларуси (220072, Минск, пр-т Ф.Скорины, 70, тел. 284-17-25).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной и атомной физики НАН Беларуси.

Автореферат разослан « гнъ мая 2000 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, доктор физико-математических наук

В.А. Кузьмицкий

^ib о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Встраивание молекул порфиринов в ДНК было обнаружено в 1979 году, и с тех пор комплексы порфиринов с природными и синтетическими (модельными) ДНК являются объектом многочисленных исследований. Интерес к этим объектам обусловлен в первую очередь возможностями биомедицинского применения эффектов встраивания порфиринов в ДНК, таких как фотодинамическое действие, т. е. фотосенсибилизированное порфиринами направленное повреждение структуры ДНК. Такие эффекты могут найти применение в инактивации вирусов в организме человека, а также в фотодинамической терапии онкологических заболеваний. Кроме того, взаимодействия порфиринов с ДНК часто рассматриваются с точки зрения моделирования действия некоторых лекарственных противоопухолевых препаратов. С другой стороны, анализ публикаций на эту тему показал, что практически вся имевшаяся к началу выполнения данной работы (1993 г.) спектроскопическая литература, посвященная взаимодействию порфиринов с ДНК, касается изучения основного (невозбужденного) электронного состояния порфиринов. Первичные фотопроцессы с участием встроенных в ДНК порфиринов были изучены очень слабо, хотя потребность в этом велика, поскольку в литературе высказывалось много противоречивых сведений о возможных механизмах фотодинамического действия порфиринов на ДНК. Преобладающее в литературе мнение связывает высокую фотодинамическую активность ряда безметальных катионных порфиринов с генерируемым ими синглетным кислородом. Основывалось такое мнение в первую очередь на том, что эти порфирины, находясь в свободном состоянии в водном растворе, эффективно генерируют синглетный кислород.

В диссертационной работе предположено, что в порфиринах, связанных с ДНК, размен энергии электронного возбуждения может происходить не всегда по тем же каналам, по каким он осуществляется в свободных молекулах в растворе, и что конкретные пути этого размена могут сильно зависеть от места встраивания порфирина в ДНК. Выполненные в диссертации прямые эксперименты показали правильность этой точки зрения и позволили получить свидетельства в пользу возможности прямого фогоиндуцированного переноса электрона между гуанином и фотовозбужденным порфирином. Такой фотоперенос электрона может быть первым элементарным аюгом в цепи реакций, приводящих к повреждению ДНК без участия синглетного кислорода. Подтверждением этой идеи могут быть результаты ряда фотобиологических работ, в которых тушение триплетных состояний катионных порфиринов,

ответственных за образование синглетного кислорода, не приводило к уменьшению фотодинамического действия этих порфиринов на ДНК.

В отличие от вышеупомянутых безметальных катионных порфиринов (а также их комплексов с цинком), обладающих долгоживущим и эффективно заселяемым триплетным состоянием, и, как следствие, хорошо сенсибилизирующих образование синглетного кислорода, комплексы катионных порфиринов с ионами переходных металлов до недавнего времени не привлекали внимания исследователей с точки зрения изучения фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в них в связанном с ДНК состоянии. Действительно, такие металлопорфирины имеют пикосекундные времена жизни возбужденных состояний, что не только не дает возможности генерировать синглетный кислород, но и не давало, из общих соображений, больших надежд на то, что за столь короткие времена могут произойти какие-либо специфические фотореакции между этими металлопорфиринами и элементами ДНК. Тем не менее, в настоящей работе показано, что водорастворимые Си- и №-порфирины при фотовозбуждении обладают достаточно высокой специфичностью и селективностью взаимодействия с основаниями ДНК и другими молекулами из ближайшего окружения. Такая способность металлопорфиринов, содержащих переходные металлы, к специфическим фотореакциям с молекулами ближайшего окружения основана в первую очередь на свойстве возбужденных электронных состояний иона переходного металла, связанных с его ё-орбиталями (так называемых (с!,«!), (с!,л*) и (л,ф состояний), обратимо присоединять азот- и кислородосодержащие молекулы в качестве аксиального лиганда. В диссертационной работе предложена и подтверждена экспериментально идея использования металлопорфиринов, содержащих ионы переходных металлов, в качестве своеобразных зондов, чувствительных к ближайшему микроокружению, в котором находится встроенная в полинуклеотид молекула меташюпорфирина.

Связь с крупными научными программами, темами

Основные результаты, положенные в основу настоящей диссертационной работы, были получены при выполнении проектов Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований "Фотоиндуцирован-ные процессы в новых модельных биологических системах: исследование методом сверхбыстрой лазерной абсорбционной спектроскопии" (1995-1998 гг., № госрегистрации 19963828), "Изучение методами кинетической абсорбционной спектроскопии специфических взаимодействий между фотовозбужденными водорастворимыми порфиринами и ДНК" (1998-2000 гг., № госрегистрации 19982214) и Республиканской программы фундаментальных исследований «Лазерная кинетическая спектроскопия гембелков, модельных

биологических систем и координационных соединений: внутримолекулярные процессы и динамика связывания лигандов» (1996-2000 гг.).

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении спектрально-кинетических свойств возбужденных электронных состояний водорастворимых катионных порфиринов и металлопорфиринов в составе комплексов с природными и синтетическими ДНК.

Для выполнения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи:

- создание экспериментальной установки для измерения кинетических и спектральных характеристик наведенного поглощения во временном диапазоне от нескольких пикосекунд до нескольких наносекунд;

- определение фотофизических характеристик порфирина Н2(ТМру-Р4) и его Си(И)- и №(И)-меташюкомплексов в водном растворе и в составе их комплексов с ДНК;

- исследование процесса тушения молекулярным кислородом нижнего возбужденного триплетного состояния флуоресцирующих безметального порфирина Н2(ТМру-Р4) и его 2п(П)-комплекса, встроенных в нуклеиновые кислоты.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования служили комплексы катионных водорастворимых порфиринов и металлопорфиринов с ДНК и модельными поли- и олигонуклеотидами.

Методология и методы проведенного исследования

Основными методами исследования являлись методы стационарной и кинетической абсорбционной спектроскопии, люминесценции и спектроскопии РКР. С их помощью были измерены спектры поглощения, флуоресценции и РКР, определены квантовые выходы люминесценции и образования триплетного состояния, изучены кинетики заселения и дезактивации возбужденных электронных состояний.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Проведено всестороннее исследование возбужденных электронных состояний Си- и №-порфиринов, встроенных в природные и синтетические ДНК. Установлено, что образование комплексов в возбужденном состоянии (эксиплексов) между Си(ТМру-Р4), встроенным в ДНК, и элементами ДНК осуществляется через присоединение к Си(ТМру-Р4) СО-группы тимина в

качестве аксиального лиганда с одновременным заселением возбужденного (ё,с!)-состояния Си-порфирина. Обнаружено также образование подобного эксиплекса для Си(ТМру-Р4) с молекулами воды. Установлено, что время жизни эксиплекса зависит от места встраивания в биополимер и природы кислородосодержащего аксиального лиганда. Показано, что для №(ТМру-Р4) при фотовозбуждении также возможно обратимое присоединение аксиального лиганда (молекулы воды), которое определяется местом локализации этой молекулы в структуре ДНК. Предложено использовать высокоспецифические фотореакции аксиального лигандирования металлопорфиринов с ионами переходных металлов в качестве зондов для изучения микроокружения металлопорфиринов в их комплексах с нуклеиновыми кислотами.

Показано, что между фотовозбужденным порфирином Н2(ТМру-Р4), интеркалированным между парами вС оснований, и гуанином происходит быстрый фотоиндуцированный перенос электрона, который может быть первым элементарным актом в цепи реакций, приводящих к повреждению ДНК без участия синглетного кислорода.

Установлена взаимосвязь между типом встраивания Нг(ТМру-Р4) в ДНК и константой скорости тушения триплетного состояния порфирина молекулярным кислородом.

Показано, что при встраивании гп(ТМру-Р4) в ро1у(сЮ-с1С)2 при малой ионной силе раствора происходит интеркаляция металлопорфирина между парами нуклеиновых оснований, приводящая к потере металлопорфирином аксиального лиганда.

Практическая значимость полученных результатов

В ходе выполнения диссертационной работы был создан автоматизированный лазерный абсорбционный спектрометр, предназначенный для решения широкого круга как научных, так и прикладных задач в области молекулярной спектроскопии, фотохимии и фотобиологии.

Обоснован метод применения порфиринов и металлопорфиринов в качестве зондов, чувствительных к природе и расположению молекул ближайшего окружения либо к экранированности от контакта с молекулярным кислородом, то есть чувствительных к месту локализации порфиринов в ДНК. Данный метод может найти широкое применение для анализа структуры исследуемых комплексов порфирин-ДНК в биофизике, фотобиологии и спектроскопии биологических молекул.

Показана принципиальная возможность фотодинамической активности катионных порфиринов по механизму переноса электрона, без участия синглетного кислорода.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1) Созданный универсальный двухлучевой кинетический абсорбционный спектрометр, имеющий длительность импульсов возбуждения и зондирования 12 пс, позволяет исследовать кинетику фотоиндуцированных изменений поглощения света образцами в спектральном диапазоне 380-1400 нм при возбуждении на длинах волн 540 нм и 360 нм с погрешностью 1x10"3 единиц оптической плотности.

2) Пути и механизмы безызлучательной дезактивации нижних возбужденных электронных состояний нефлуоресцирующих металло-порфиринов Си(ТМру-Р4) и Ni(TMpy-P4), встроенных в ДНК, определяются структурой и составом ближайшего к порфирину окружения. В случае интеркаляции этих металлопорфиринов между парами GC оснований ДНК деградация энергии возбуждения носит внутримолекулярный характер и происходит без участия молекул окружения.

3) При внешнем встраивании в бороздки ДНК дезактивация возбужденных состояний Си(ТМру-Р4) и №(ТМру-Р4) происходит с образованием комплекса между металлопорфирином и кислородосодержащими молекулами тимина либо воды из ближайшего окружения, которые выступают в качестве аксиального лиганда иона металла.

4) Время жизни нижнего возбужденного триплетного состояния флуоресцирующих катионных порфиринов Нг(ТМру-Р4) и Zn(TMpy-P4) в их комплексах с ДНК в присутствии растворенного кислорода воздуха изменяется в ~7-10 раз в зависимости от места встраивания порфирина в ДНК, что может быть использовано для изучения распределения порфиринов по типам встраивания.

5) Тушение флуоресценции безметального катионного порфирина Н2(ТМру-Р4), интеркалированного между парами GC оснований ДНК, обусловлено обратимым переносом электрона с гуанина на фотовозбужденный порфирин.

Личный вклад соискателя

Все основные результаты, изложенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно. Постановка задач исследований и интерпретация полученных результатов осуществлялась автором совместно с научным руководителем канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. B.C. Чирвоным. Абсорбционные стационарные и пикосекундные кинетические измерения, а также люминесцентные эксперименты были выполнены и обработаны автором лично. И.В. Сазанович принимал участие в исследованиях комплексообразо-

вания Cu-порфирина с олигонуклеотидами на пнкосекундном абсорбционном спектрометре. Измерения характеристик триплетных состояний были выполнены совместно с канд. физ.-мат. наук H.H. Круком, канд. физ.-мат. наук С.М. Бачило и A.A. Коротким. С.М. Бачило участвовал также в работе по автоматизации пикосекундного абсорбционного спектрометра и помогал в обработке ряда экспериментальных результатов. Доктор физ.-мат. наук, профессор Б.М. Джагаров был инициатором исследований триплетных состояний порфиринов в их комплексах с ДНК и изучения тушения триплетных состояний молекулярным кислородом, принимал участие в обсуждении полученных результатов, консультировал и оказывал помощь на всех этапах работы. Измерения, выполненные методами колебательной спектроскопии, проводились канд. физ.-мат. наук С.Г. Кругликом, канд. физ.-мат. наук С.Н. Тереховым и В.В. Ермоленковым. В организации РКР экспериментов и обсуждении их результатов участвовали академик HAH Беларуси П.А. Апанасевич и член-корр. HAH Беларуси В.А. Орлович. В работах по РКР порфиринов автор принимал участие на этапах подготовки экспериментов и обсуждения полученных данных. Профессор П.-И. Турпин любезно предоставил все необходимые для исследований природные ДНК и синтетические поли- и олигонуклеотиды, организовал работу автора в Университете им. Пьери и Марии Кюри (г. Париж, Франция) с целью проведения там отдельных экспериментов и активно участвовал в обсуждении результатов работы на всем протяжении исследований. Водорастворимые катионные порфирины были синтезированы и предоставлены в распоряжение автора канд. хим. наук В.Л. Малиновским.

Апробация результатов работы

Результаты диссертационной работы докладывались на 8-м Международном симпозиуме "Сверхбыстрые процессы в спектроскопии" (Вильнюс, Литва, 1993), 5-й, 6-й, 7-й и 8-й Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Лутраки, Греция, 1993; Лилль, Франция, 1995; Мадрид, Испания, 1997; Энсхедэ, Нидерланды, 1999), Республиканской конференции молодых ученых по квантовой электронике (Минск, 1994), 5-й, 6-й и 7-й Международных конференциях "Применения лазеров в науках о жизни" (Минск, 1994; Йена, Германия, 1996; Братислава, Словакия, 1998), 14-й и 15-й Международных конференциях по комбинационному рассеянию света (Гонконг, 1994; Питсбург, США, 1996), 2-м и 3-м съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996, 1998), Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996), 16-м Симпозиуме IUPAC по фотохимии (Хельсинки, Финляндия, 1996), 8-й Международной конференции по спектроскопии и

химии порфиринов и их аналогов (Минск, 1998). В 1997 году цикл работ «Динамика и механизмы взаимодействий между фоговозбужденными порфиринами и ДНК» был отмечен дипломом первой степени на годовых чтениях ИМАФ HAH Беларуси.

Опубликованность результатов

По материалам диссертации опубликовано 10 статей в научных журналах, 1 обзорная статья в коллективной монографии, 12 работ в сборниках трудов конференций и 11 тезисов докладов. Общий объем опубликованных материалов составляет 153 стр.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, заключения и списка использованных источников. Полный объем диссертации составляет 140 страниц, включая 7 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 255 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко определено направление диссертационного исследования.

В общей характеристике работы обсуждается актуальность темы исследований, сформулированы цель и задачи работы, определены научная новизна и практическая значимость работы, приведены защищаемые положения и сведения о публикациях по теме диссертации.

В Главе 1 обобщены литературные данные о структуре и свойствах комплексов порфиринов с ДНК. Кратко рассмотрены строение и спектральные свойства порфиринов и металлопорфиринов, а также химическая структура молекулы ДНК. Определены основные типы встраивания порфиринов в нуклеиновые кислоты и проанализирована структура образующихся комплексов. Подробно обсуждаются избирательность встраивания порфиринов в молекулу ДНК и причины, обуславливающие предпочтительность тех или иных типов связывания для конкретных порфиринов и полинуклеотидов. Приведен анализ работ по исследованию возбужденных состояний порфиринов в комплексах с ДНК. Показана актуальность таких исследований с точки зрения изучения возможных механизмов фотодинамического действия порфиринов на нуклеиновые кислоты, а также использования некоторых металлопорфиринов в качестве зондов для изучения микроокружения при их взаимодействии с нуклеиновыми кислотами.

В Главе 2 описываются экспериментальное оборудование, методики исследований и приготовления образцов.

Основное внимание уделяется методике и установке лазерного пшсосекундного флеш-фотолиза. Рассмотрен метод пассивной синхронизации мод лазера для получения пикосекундных световых импульсов. Описана созданная автором автоматизированная установка пикосекундной абсорбционной спектроскопии, состоящая из: 1) лазера на алюминате иттрия, активированного неодимом, с пассивной синхронизацией мод, внутрирезона-торными системами отрицательной обратной связи и выделения одиночного импульса, трех каскадов усиления с промежуточной пространственной фильтрацией лазерного излучения, после которых формировалось два канала выходного излучения - возбуждающий и зондирующий; 2) системы преобразования излучения на основе генераторов 2-й (540 нм) и 3-й (360 нм) гармоник в канале возбуждения и параметрического генератора света в канале зондирования; 3) системы регистрации и обработки данных на базе ПЭВМ. Примененная методика стробирования зондирующими импульсами позволяет измерять кинетики дезактивации возбужденных состояний с временным разрешением около 10 пс, а также регистрировать спектры поглощения возбужденных состояний в спектральном диапазоне 380 - 1400 нм. Погрешность измерений равна 1х10"3 единиц оптической плотности.

Результаты собственных исследований автора изложены в последующих двух (3 и 4) главах.

В Главе 3 представлены результаты исследования комплексов порфиринов с ионами переходных металлов Cu(II) и Ni(II), цель которых заключалась в выявлении специфических фотореакций между порфирином и ДНК. В работе использовались модельные поли- и олигонуклеотиды, что позволило получать молекулярные комплексы с определенной структурой и целенаправленно изменять условия встраивания порфирина в биополимер.

В 1990 году в литературе впервые появилось сообщение об обнаружении методом РКР специфического взаимодействия между фотовозбужденным Си(ТМру-Р4) и ДНК. При этом было предположено, что СО-группа тимина выступает в качестве аксиального лиганда Cu-порфирина. Тем не менее, электронная природа обнаруженного эксиплекса между фотовозбужденным Си(ТМру-Р4) и биополимером оставалась неясной. Раздел 3.1. посвящен выяснению этого вопроса. Кинетические измерения, выполненные для комплекса • Cu(TMpy-P4)-poly(dA-dT)2 на пикосекундном абсорбционном спектрометре при возбуждении на длине волны 540 нм, показали, что во всем исследуемом диапазоне длин волн 380 - 470 нм (область полосы поглощения Соре) наблюдаются обратимые изменения оптической плотности ДА исследуемых образцов. Обработка полученных кинетик изменения оптической

плотности ДА(0 показала, что затухание изменений поглощения хорошо описываются двухэкспоненциальным законом с постоянными времени Т| = 44 пс и т2 = 3,0 не. Анализ спектральных свойств наблюдаемых нестационарных форм, а также результатов специально проведенных РКР экспериментов при импульсном возбуждении, позволяют соотнести зарегистрированные спектральные формы, соответственно, возбужденным триплетному и (с1,с!)-состояниям молекулы металлопорфирина. Таким образом, реализуется следующая схема образования и гибели эксиллекса при фотовозбуждении 4-х координированного Си(ТМру-Р4), встроенного в ро1у(с!А-ёТ)2: После возбуждения в канале 2Бо -» происходит сверхбыстрый (по литературным данным - за сотни фемтосекунд) и поэтому спектрально нерегистрируемый в наших экспериментальных условиях процесс безызлучательной дезактивации в канале ^ 2'4Т]. Триплетное состояние 4-х координированного Си(ТМру-Р4) является исходным для последующего образования эксиплекса. Аксиальное лигандирование молекулы Си-порфир1ша близлежащей СО-группой тимина приводит к сокращению времени жизни триплетного состояния Си(ТМру-Р4) до 44 пс в результате заселения (с!,с1)-состояния образовавшегося пяти-координированного Си(ТМру-Р4). Данное (с1,с1)-состояние регистрируется в РКР экспериментах как "эксиплексное" возбужденное состояние. Время жизни такого эксиплекса составляет 3 не, и его дезактивация сопровождается диссоциацией комплекса "Си(ТМру-Р4) - тимин" на исходные компоненты.

Исследования методами РКР и кинетической абсорбционной спектроскопии показали, что при фотовозбуждении свободной молекулы Си(ТМру-Р4), находящейся в водном растворе, также образуется эксиплеке. Однако в данном случае Си-порфирин в качестве аксиального лиганда присоединяет молекулу воды. Время жизни эксиплекса [Си(ТМру-Р4)*<к1 - Н20] составляет около 10 пс.

Из данных экспериментов следует, что в комплексе Си(ТМру-Р4)~ ро1у(ёА-сГГ)2 молекула Си-порфирина не образует эксиплекс с молекулами воды, т. е. что по крайней мере центр молекулы порфирина, где находится ион меди, изолирован от контактов с водой. В то же время во многих природных биохимических реакциях принимают участие короткие нуклеиновые последовательности или фрагменты ДНК, чьи гидрофобные свойства отличаются от свойств модельных полинуклеопгидов. В таких системах реально возникновение ситуации, когда молекулы воды могут все же получить доступ к находящимся в ДНК хромофорам и оказывать влияние на их фотофизические свойства. С этой целью мы изучили кинетики затухания фотоиндуцированных абсорбционных изменений для Си(ТМру-Р4), связанного с олигонуклеотидами с1(рТ)п (где п = 1 - 18), т. е. с короткими отрезками нуклеиновой цепи, содержащей тимин в качестве нуклеинового основания. Регистрация

осуществлялась на длине волны 445 нм, соответствующей изобестической точке между спектрами поглощения возбужденного триллетного и основного состояний, что позволило наблюдать заселение и дезактивацию только эксиплексных состояний. Установлено, что Си(ТМру-Р4) в комплексах с короткими олигонуклеотидами способен образовывать эксиплексы как с СО-группами тимина, так и с молекулами окружающей воды. В комплексах Си(ТМру-Р4) с сЗ(рТ)] преобладает эксиплекс с водой. При увеличении длины олигонуклеотида относительный вклад эксиплекса с водой уменьшается, и в комплексах Си(ТМру-Р4) с с!(рТ)п (при п > 9) наблюдается только долгожи-вущий эксиплекс с СО-группой тимина. Изменение времени жизни эксиплекса с водой при увеличении длины олигонуклеотида (с 30 пс в с!(рТ)] до 160 пс в (ЦрТ)5), а также несколько меньшее время жизни эксиплекса с СО-группой в олигонуклеотидах (950 пс), чем в ро1у((1А-с!Т)2 (3 не), предположительно объяснено чувствительностью времени жизни (с1,ё)-состояния к полярности ближайшего окружения молекулы металлопорфирина.

Для полного понимания процессов, протекающих при фотовозбуждении Си-порфирина в ДНК, необходимо знать свойства его возбужденных состояний и при встраивании вблизи пар вС оснований. Для этого использовался другой ДНК-моделирующий полинуклеотид: ро1у(сЮ-с1С)2. Известно, что молекула Си(ТМру-Р4) интеркалирует по ОС-положениям, т. е. встраивается внутрь нуклеиновой спирали между гуанин-цитозиновыми парами оснований. В результате ион меди оказывается изолированным от контакта с тушащими кислородосодержащими молекулами (вода, СО-группы), и наблюдаемое нестационарное состояние интеркалированного Си-порфирина является нижним возбужденным триллетным состоянием, которое имеет время жизни около 17 не. Регистрируемая в кинетических абсорбционных экспериментах некоторая неэкспоненциальность затухания объяснена вкладом процесса остывания колебательно нагретого триллетного состояния и перераспределением населенностей между триплетными уровнями 2Т] и 4Т]. Неэкспоненциальность общего сигнала может также свидетельствовать, о присутствии структурных конформеров молекулы Си-порфирина.

В разделе 3.2. методами кинетической абсорбционной и стационарной РКР спектроскопии исследованы фотофизические свойства еще одного металлопорфирина, встроенного в полинуклеотиды: №(ТМру-Р4). В водном растворе №(ТМру-Р4) находится в виде смеси молекул 4-х и 6-ти координированных комплексов, причем роль лигандов выполняют молекулы воды. Показано, что в комплексе №(ТМру-Р4) с модельным полинуклеотидом ро1у(<Ю-с1С)2 хелатированный ион никеля является 4-х координированным как в основном электронном состоянии, так и при фотовозбуждении, т. е. интеркалированные молекулы №-порфирина недоступны для молекул воды,

которые могли бы обратимо лигандйровать их. Полученные кинетики изменения оптической плотности ДАО) хорошо аппроксимируются двухэкспоненпиальными кривыми с постоянными времени Т] ~ 10 пс и х2 = 350 пс. При этом долгоживущий компонент со временем жизни 350 пс соответствует релаксации возбуждения из 3(сЗ,с1)-состояния №-порфярина. Короткоживущий компонент в релаксационной кинетике с постоянной времени 10 пс, вероятно, обусловлен остыванием колебательно-нагретого 3(с!,с1)-состояния и конформационными релаксационными изменениями в порфириновом макроцикле, вызванными изменениями размера центра макроцикла в результате заселения ёх2.у2 орбитали.

В комплексе №(ТМру-Р4)-ро1у(с1А-с1Т)2, как известно, реализуется встраивание молекулы №-порфирина как в малую, так и большую бороздки полинуклеотида. Поэтому вполне объяснима обнаруженная неэкспоненци-альность кинетик дезактивации возбужденных состояний №-порфирина. При этом анализ полученных данных показывает, что большая часть молекул №(ТМру-Р4) не имеет аксиальных лигандов как в основном, так и в возбужденном состояниях, но некоторая часть молекул все же участвует в процессах обратимого фотоиндуцированного лигандирования (скорее всего с молекулами воды из окружения).

Глава 4 посвящена изучению нижних возбужденных (синглетного и триплетного) состояний фотодинамически активного катионного порфирина Нг(ТМру-Р4) и его Zn-кoмштeкca, встроенных в ДНК и синтетические по линуклеотиды.

В разделе 4.1. с целью выявления возможных специфических взаимодействий между фотовозбужденным катионным порфирином ЩТМру-Р4) и основаниями ДНК были определены фотофизические параметры данного порфирина, встроенного в ДНК и модельные полинуклеотиды, а также находящегося в свободном состоянии в фосфатном буфере.

В случае интеркаляции Нг(ТМру-Р4) по бС-положениям в ро1у(сЮ-с1С)2 и в ДНК обнаружена эффективная безызлучательная внутренняя конверсия ~> 80, что проявляется в сокращении длительности флуоресценции и уменьшении квантового выхода в триплетное состояние. Когда же порфирин находится в окружении пар АТ, длительность флуоресценции и квантовый выход в триплетное состояние имеют максимальные значения. В диссертации предположено, что наиболее вероятным механизмом тушения флуоресценции порфирина является фотоиндуцированный обратимый перенос электрона. Анализ потенциалов окисления и восстановления всех 4-х нуклеиновых оснований ДНК и порфирина показывает, что перенос электрона должен происходить с гуанина на порфирин ЩТМру-Р4), находящийся в

возбужденном Si-состоянии. Дополнительные эксперименты по влиянию комплексообразования с мононуклеотидами GMP и AMP на кинетику флуоресценции порфирина Н2(ТМру-Р4) подтвердили участие гуанина в тушении флуоресценции порфирина.

Полученные автором результаты хорошо согласуются с литературными данными по фотодинамическому действию катионных порфиринов на ДНК, свидетельствующими, что для ряда катионных водорастворимых порфиринов процесс фотодинамического повреждения ДНК может происходить без участия синглетного кислорода.

Таблица. Фотофизические параметры Н2(ТМру-Р4) в фосфатном буфере (рН = 6,8, )х = 0,1 М) и встроенного в полинуклеотиды и ДНК.

Соединение ®r Tf, не (%) Фт Л, мс tT, МКС (%) kqXlO"9, MV

Н2(ТМру-Р4) 0,044 4,6 0,85 0,17 2,0 1,86

Н2(ТМру-Р4)-ДНК 0,041 2,5 (50) 11,0(50) 0,77 0,47 4,5 (32) 18,0 (68) 0,83 0,20

Hz(TMpy-P4)~ poly(dA-dT)2 0,085 12,0 0,95 1,6 5,5 (22) 20,5 (78) 0,68 0,18

Н2(ТМру-Р4)~ poly(dG-dC)2 0,027 2,5 (70) 7,0 (30) 0,44 1,3 30,0 0,12

фг и Фт - квантовые выходы флуоресценции и образования триплетного состояния; тг - время жизни флуоресценции; тт и т°т - времена жизни триплетного состояния, соответственно, в присутствии и в отсутствии кислорода; кч - константа скорости тушения триплетного состояния кислородом. В скобках указаны относительные веса каждого из компонентов (в %).

В разделе 4.2. обосновывается предположение, что время жизни триплетного состояния и соответствующая величина константы скорости тушения триплетного состояния молекулярным кислородом отражают степень защищенности порфиринов от столкновения с молекулой кислорода и последующего акта тушения. В диссертации выделено три типа встраивания Н2(ТМру-Р4) в ДНК и модельные полинуклеотиды, которые различаются по степени защищенности порфиринов от тушения молекулярным кислородом. Тип встраивания А связан с интеркаляцией по ОС-положениям, которая среди всех способов встраивания молекулы Н?(ТМру-Р4) в полинуклеотид обеспечивает наилучшую защиту порфиринового макроцикла от доступа 1 кислорода, при этом время жизни триплетного состояния максимально и равно 28-30 мкс. Типу Б приписано встраивание порфирина в большую (широкую и неглубокую) бороздку по АТ-положениям, доступ кислорода к молекуле

порфирина в этом случае облегчен, и время жизни триллетного состояния минимально - 4-6 мкс. Тип В реализуется, когда порфирин встраивается в малую (узкую и глубокую) бороздку по АТ-положениям. Время жизни триплетного состояния в этом случае 14-20 мкс.

В разделе 4.3. исследовано влияние ионной силы буферного раствора на способ встраивания 2п-порфирина в ДНК и ро1у(сЮ-(1С)2. Известно, что 5-ти координированный 2п(ТМру-Р4) является типичным представителем молекул, которые образуют комплексы с ДНК исключительно путем встраивания в бороздки. Считалось также, что в комплексе с ро1у(сЮ-с1С)2 7п(ТМру-Р4) никогда не интеркалирует, как это делает большинство порфиринов, а скорее слабо связывается электростатическими силами у поверхности полинуклеотида. В дисертадионной работе установлено, что уменьшение ионной силы раствора Еп(ТМру-Р4) с ро1у(ёО-(1С)2 с 0,20 М до 0,03 М приводит к существенным изменениям спектра поглощения. Наблюдается сильное уменьшение интенсивности полосы Соре и сдвиг ее максимума с 436 до 446 нм. Быстрый 3,5-мкс компонент в кинетике затухания триплетного состояния 2п(ТМру-Р4) (в присутствии кислорода воздуха) при этом удлиняется до 12 мкс, а вклад 35-мкс компонента увеличивается с 10% до 60%. Таким образом, делается вывод, что при малой ионной силе молекулы 2п(ТМру-Р4) связаны не на поверхности ро1у(сЮ-(1С)2, а интеркалированы между нуклеиновыми основаниями в ро1у((Ю-(1С)2; причем часть из них интеркалирована частично.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты и выводы настящей работы могут быть сформулированы следующим образом.

1. Создан пикосекундный частотный лазер на алюминате иттрия, активированном неодимом, с пассивной синхронизацией мод и внутрирезонаторной системой выделения одиночного импульса. Стабилизация выходного излучения и одновременное укорочение длительности импульсов до 12 пс осуществляется внутрирезонаторной электрооптической системой отрицательной обратной связи. Энергия импульсов на выходе усилительной системы составляет 10-25 мДж.

На основе указанного пикосекундного лазера, параметрических генераторов света и преобразователей лазерного излучения во 2-ю и 3-ю гармоники создан автоматизированный абсорбционный спектрометр, позволяющий измерять кинетики дезактивации возбужденных состояний с временным разрешением -10 пс, а также спектры поглощения возбужденных

состояний в спектральном диапазоне 380 - 1400 нм. Погрешность измерений равна 1х10"3 единиц оптической плотности [3].

2. Использование синтетических поли- и олигонуклеотидов позволило целенаправленно измененять условия встраивания металлопорфиринов в биополимер. В результате в комплексах Си(П)- и №(И)-порфиринов с нуклеиновыми кислотами выявлен ряд специфических фотореакций:

- В комплексе с ро1у((1А-с1Т)2, в котором молекула Си(ТМру-Р4) встраивается в бороздки полинуклеотида, фотовозбуждение порфирина приводит к аксиальному лигандированию иона меди близлежащей СО-группой тимина, что сокращает время жизни триплетного состояния до 44 пс, с одновременным заселением (с!,с1)-состояния образовавшегося 5-ти координированного Си(ТМру-Р4). Время жизни такого эксиплекса составляет 3 не [1-3, 12-14, 16,24,25].

- При фотовозбуждении молекул Си(ТМру-Р4), находящихся в свободном состоянии в водном растворе, также образуется эксиплекс, в котором к иону меди в качестве аксиального лиганда присоединяется молекула воды. Время жизни эксиплекса [Си(ТМру-Р4)*<и - НгО] составляет около 10 пс [5, 18, 30].

- Молекулы Си(ТМру-Р4) в комплексах с короткими олигонуклеотидами с!(рТ)п (где п = 1 - 18) участвуют в образовании эксиплексов как с СО-группами тимина (время жизни эксиплекса 950 пс), так и с молекулами окружающей воды. В комплексах Си(ТМру-Р4) с с1(рТ)] преобладает эксиплекс с водой. При увеличении длины олигонуклеотида относительный вклад эксиплекса с водой уменьшается, и в комплексах Си(ТМру-Р4) с с1(рТ)п (при п > 9) остается только долгоживущий эксиплекс с СО-группой тимина [9,22].

- В комплексе Си(ТМру-Р4)-ро1у(сЮ-с1С)2, где молекула Си-порфирина интеркалирована между нуклеиновыми основаниями и изолирована от контакта с тушащими кислородсодержащими молекулами (вода, СО-группы), наблюдается долгоживущее триплетное (я, л*) состояние Си-порфирина со временем жизни около 17 не [15,28].

- Молекулы ЩТМру-Р4), интеркалированные между парами ОС в комплексе с ро1у(сЮ-с1С)2, недоступны для аксиального лигандирования молекулами воды. Дезактивация энергии электронного возбуждения в этом случае осуществляется через низколежащее 3(с1,с1)-состояние, время жизни которого составляет 350 пс [4,17, 19,29].

- В.' комплексе ЩТМру-Р4)-ро1у((1А-(1Т)2, где реализуется внешнее встраивание молекул №-порфирина в большую и малую бороздки полинуклеотида, часть молекул №(ТМру-Р4) участвует в процессах фотоиндуцированного лигандирования молекулой воды из окружения [4, 17,19,29].

Таким образом, установлено, что низколежащие возбужденные состояния №- и Си-порфиринов чувствительны к месту и способу встраивания порфирита в полинуклеотид, а также к его структуре. Предложено использовать данные металлопорфирины в качестве зондов, реагирующих своими фотофизическими параметрами на природу и расположение молекул ближайшего окружения, то есть на место локализации порфиринов в ДНК [21, 32].

3. Показано, что при встраивании безметального катионного порфирина ЩТМру-Р4) в полинуклеотиды и ДНК, содержащие гуанин, наблюдается тушение флуоресценции порфирина и существенное уменьшение квантового выхода образования триплетного состояния, что обусловлено обратимым переносом электрона с гуанина на порфирин, находящийся в возбужденном Бг состоянии. Полученные данные свидетельствуют о том, что фотодинамическое воздействие катионных порфиринов на ДНК может осуществляться по механизму переноса электрона, без участия синглетного кислорода [6, 8, 11, 26, 33, 34].

4. Установлены три типа (А, Б и В) встраивания молекулы Н2(ТМру-Р4) в ДНК, которые различаются степенью защищенности порфиринов от тушения молекулярным кислородом. Тип А соответствует интеркаляции по ОС положениям, которая обеспечивает наилучшую защиту порфиринового макроцикла от доступа кислорода, при этом время жизни триплетного состояния равно 28 - 30 мкс. Типы А и Б соответствуют встраиванию порфирит соответственно в большую и малую бороздки по АТ положениям со временами жизни триплетного состояния 4-6 мкс и 14 - 20 мкс [7, 20,27].

5. Из анализа определенных спектроскопических и фотофизических свойств комплексов катионных порфиринов с ДНК следует, что способ встраивания молекулы 2п(ТМру-Р4) в ро1у(сЮ-(1С)2 зависит от величины ионной силы ц буферного раствора. При больших и средних ионных силах (¡л >0,2 М) молекула 2п(ТМру-Р4) слабо взаимодействует с ро1у(сЮ-<1С)2, будучи в основном связанной с поверхностью полинуклеотида электростатическими силами. При малой ионной силе (р ~ 0,03 М) большинство молекул 7л-порфирина интеркалировано в ро1у(сЮ-с!С)2, хотя наблюдается и дополнительный тип встраивания ("частичная интеркаляция"). Встраивание 2п(ТМру-Р4) в ро1у(с!0-с!С)2 при малой ионной силе сопровождается отрывом от металлопорфирина аксиального лиганда (воды) [10,23, 31].

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах

1. Transient absorption and resonance Raman investigation of picosecond dynamics of the exciplex formation between excited Cu(H)-porphyrin and DNA model compounds / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, S.G. Kruglik, I,V. Pilipovich, L. Chinsky, P.-Y. Turpin // Lithuanian Journal of Physics. - 1994.- V. 34, № 1-2.- P. 98-102.

2. Пикосекундная динамика и механизм взаимодействия фотовозбужденного Си(П)-порфирина с ДНК-моделирующим полинуклеотидом 1 В.А. Галиевский, B.C. Чирвоный, С.Г. Круглик, П.А. Апанасевич, В.В. Ермоленков, В.А. Орлович, JI. Чински, П.-И. Турпин//Журн. прикл. спектр,-1995,- Т. 62, №2,-С. 111-122.

3. Dynamics and mechanism of the exciplex formation between Cu(TMpy-P4) and DNA model compounds revealed by time-resolved transient absorption and resonance Raman spectroscopies / S.G. Kruglik, V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, P.A. Apanasevich, V.V. Ermolenkov, V.A. Orlovich, L. Chinsky, P.-Y. Turpin // J. Phys. Chem.- 1995,- Vol. 99,- P. 5732-5741.

4. Excited states of water-soluble metal porphyrins as microenvironmental probes for DNA and DNA-model compounds: Time-resolved transient absorption and resonance Raman studies of Ni(Tmpy-P4) in [Poly(dG-dC)J2 and [Poly(dA-dT)]2 / V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, S.G. Kruglik, V.V. Ermolenkov, V.A. Orlovich, C. Otto, P. Mojzes, P.-Y. Turpin // J. Phys. Chem.- 1996,- Vol. 100,- P. 12649-12659.

5. Intermolecular interaction of photoexcited Cu(TMpy-P4) with water studied by transient resonance Raman and picosecond absorption spectroscopies / S.G. Kruglik, V.V. Ermolenkov, A.G. Shvedko, V.A. Orlovich, V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, C. Otto, P.-Y. Turpin // Chem. Phys. Lett.- 1997.-Vol. 270. P. 293-298.

6. Photophysics of cationic 5,10,15,20-tetrakis-(4-N-methylpyridyl) porphyrin bound to DNA, [poly-(dA-dT)]2 and [poly(dG-dC)]2: on a possible charge transfer process between guanine and porphyrin in its excited singlet state / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, N.N. Kruk, B.M. Dzhagarov, P.-Y. Turpin // J. Photochem. Photobiol. B: Biology.- 1997,- Vol. 40,- P. 154-162.

7. Photophysics of cationic 5,10,15,20-tetrakis-(4-N-methylpyridyl) porphyrin bound to DNA, [poly-(dA-dT)]2 and [poly(dG-dC)]2: interaction with molecular oxygen studied by porphyrin triplet-triplet absorption and singlet oxygen luminescence / N.N. Kruk, B.M. Dzhagarov, V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, P.-Y. Turpin // J. Photochem. Photobiol. B: Biology.- 1998,- Vol. 42,- P. 181-190.

8. Binding of the cationic 5,10,15,20-tetrakis-(4-N-methylpyridyl) porphyrin at 5'CG3' and 5'GC3' sequences of hexadeoxyribonucleotides: triplet-triplet transient absorption, steady-state and time-resolved fluorescence and resonance Raman studies / N.N. Kruk, S.I. Shishporenok, A.A. Korotky, V.A. Galievsky, V.S.

Chirvony, P.-Y. Turpin// J. Photochem. Photobiol. B: Biology.- 1998,- Vol. 45,- P. 67-74.

9. Dynamics of formation and decay of the exciplex created between excited Cu(II)-5,I0,I5,20-tetrakis(4-N-metfaylpyridyl)porphyrin and thymine C=0 groups in short oligothymidylates and double-stranded [Poly(dA-dT)]2 / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, I.V. Sazanovich, P.-Y. Turpin // J. Photochem. Photobiol. B: Biol.-1999,- Vol. 52, №1-3.. p. 43.50.

10.Binding of the cationic 5-coordinate Zn(II)-5,10,15,20-tetrakis(4-N-methylpyridyl) porphyrin to DNA and model polynucleotides: ionic-strength dependent intercalation to [Poly(dG-dC)]2 / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, S.N. Terekhov, B.M. Dzhagarov, V.V. Ermolenkov, P.-Y. Turpin // Biospectroscopy.- 1999,- Vol. 5, №5,-P. 302-312.

11. Комплексы порфиринов с нуклеиновыми кислотами типа гость-хозяин: каналы дезактивации энергии электронного возбуждения порфиринов и взаимодействие с молекулярным кислородом / Б.М. Джагаров, Н.Н. Крук, B.C. Чирвоный, В.А. Галиевский, П.И. Турпен У/ Успехи химии порфиринов: В 3 т. / Отв. ред. О.А. Голубчиков,- СПб.:НИИ химии СПбГУ, 1999,- Т. 2,- С. 50-69.

12.Picosecond dynamics and mechanism of the exciplex formation between electronically excited copper(II)-porphyrin and polynucleotide / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, S.G. Kruglik, P.-Y. Turpin, L. Chinsky // 5th International Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules: Proceedings / T. Theophanides, J. Anastassopoulou, N. Fotopoulos, Eds. - Kluwer Academic Publishers, 1993,- P. 87-88.

13.Time resolved resonance Raman and transient absorption studies on the excited states of copper-porphyrin bound to DNA model compounds / S.G. Kruglik, V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, V.A. Orlovich, I.V. Pilipovich, L. Chinsky, P.-Y. Turpin // 14th International Conference on Raman Spectroscopy: Proceedings / N.T. Yu, X.-Y. Li, Eds.- Hong-Kong, August 22-26,1994,- P. 472-473.

14.Photophysics of water-soluble Cu(II)-porphyrin: groove-bounding to polynucleotide as compared to dissolving in neat buffer solution / V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, L. Chinsky, P.-Y. Turpin // Laser Applications in Life Sciences / N.I. Koroteev, P.A. Apanasevich, Eds. - Proceedings SPIE, Bellingham, WA, 1994,- Vol. 2370,-P. 263-267.

15.Picosecond transient absorption study of a water-soluble porphyrin Cu(TMPy-P4) photophysics: the complex with poly(dG-dC) in a comparison with the neat water buffer solution / V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, P. Mojzes, P.-Y. Turpin // 6th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules: Proceedings / J.C. Merlin, S. Turrell, J.P. Huvenne, Eds - Lille, France, September 3-8, 1995,- P. 213-214.

16.Time-resolved resonance Raman and transient absorption studies of the exciplex formation between major groove-bound photoexcited Cu(TMPy-P4) and thymine of poly(dA-dT) / S.G. Kruglik, V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, L. Chinsky, P.-Y.

. Turpin, P.A. Apanasevich 11 6th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules: Proceedings / J.C. Merlin, S. Turrell, J.P. Huvenne, Eds.-Lille, France, September 3-8, 1995,- P. 215-216.

17.Resonance Raman and transient absorption studies on Ni(TMPy-P4) in a water buffer and bound to DNA model compounds: excited states dynamics and state of coordination / V.V. Ermolenkov, S.G. Kruglik, V.A. Orlovich, V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, P. Mojzes, L. Chinsky, P.-Y. Turpin // 6th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules: Proceedings / J.C. Merlin, S. Turrell, J.P. Huvenne, Eds.- Lille, France, September 3-8, 1995,- P. 221-223.

18.Picosecond transient absorption and nanosecond RR studies of excited electronic states of water-soluble Cu(II) porphyrin /'V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, S.G. Kruglik, V.V. Ermolenkov, V.A. Orlovich, C. Otto, P.-Y. Turpin // 14th Intern. Conf. on Raman Spectroscopy: Proceedings / S.A. Asher, P. Stein, Eds.-Pittsburgh, USA, August 11-16,1996,- P. 128-129.

19. Time-resolved resonance Raman and transient absorption studies on the excited states of Ni(TMpy-P4) in interaction with Poly(dG-dCh and Poly(dA-dT)2 / V.V. Ermolenkov, S.G. Kruglik, V.A. Orlovich, V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, C. Otto, P. Mojzes, P.-Y. Turpin // 14th Intern. Conf. on Raman Spectroscopy: Proceedings / S.A. Asher, P. Stein, Eds - Pittsburgh, USA, August 11-16,1996,- P. 130-131.

20 Фотосенсибилизированное образование синглетного молекулярного кислорода комплексами порфиринов с ДНК и полинуклеотидами / Н.Н. Крук, В.А. Галиевский, Б.М. Джагаров, B.C. Чирвоный, П.-И. Турпен, А.А. Короткий // Кислород и свободные радикалы: Материалы Международного симпозиума, Гродно, Беларусь, 1996,- С. 20-21.

21. Role of the porphyrin excited states in their interactions with DNA and DNAmodel compounds in aqueous solutions / V. Galievsky, V. Chirvony, V. Ermolenkov, S. Kruglik, P. Mojzes, P.-Y. Turpin // Spectroscopy of Biological Molecules: Modem Trends / P. Carmona, R. Navarro, A. Hernanz, Eds.- Kluwer Academic Publishers, 1997,- P. 351-354.

22.Dynamics of the exciplex formation and decay between excited CuTMpyP'l+ and thymine C=0 groups of short oligothymidylates / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, IV. Sazanovich, P.-Y. Turpin // Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions / J. Greve, G.J. Puppels, C. Otto, Eds.- Kluwer Academic Publishers, 1999,- P. 285-286.

23.Binding of the cationic 5-coordinate Zn(II)-5,10,15,20-tetrakis(4-N-methylpyridyl) porphyrin (ZnTMpyP4*) to DNA and model polynucleotides: ionic-strength

dependent intercalation in [Poly(dG-dC)]2 / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, S.N. Terekhov, B.M. Dzhagarov, V.V. Ermolenkov, P.-Y. Turpin // Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions / J. Greve, G.J. Puppels, C. Otto, Eds.-Kluwer Academic Publishers, 1999,- P. 287-288.

24.Пикосекундная динамика образования комплексов между возбужденными состояниями Си(Н)-порфиринов и ДНК / В.А. Галиевский, С.Г. Круглик, II-И. Турпин, Л. Чински, B.C. Чирвоный // Современные проблемы лазерной физики и спектроскопии: Тез. докл. науч. конф,- Гродно, 5-7 июля 1993,- С. 167-169.

25.Галиевский В.А., Чирвоный B.C. Фотофизика водорастворимого Cu(II)-порфирина, встроенного в ДНК - моделирующий полинуклеотид // Республ. конф. молодых ученых по квант, электронике: Тез. докл. науч. конф., Минск, 24-25 мая 1994,-С. 41.

26.Фотофизика водорастворимого порфирина Н2(ТМРу-Р4), связанного с ДНК, Poly(dA-dT)2, и Poly(dG-dC)2 и взаимодействие триплетного состояния порфирина с молекулярным кислородом / B.C. Чирвоный, Н.Н. Крук, В.А. Галиевский, Б.М. Джагаров, П.-И. Тюрпэн // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем. II съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 25-27 июня 1996.- С. 97.

27.Oxygen quenching of the triplet states of porphyrins bound to DNA and polynucleotides, and singlet oxygen photosensitized generation / N.N. Kruk, V.A. Galievsky, B.M. Dzhagarov, V.S. Chirvony, P.-Y. Turpin // XVIth HIPAC Symposium on Photochemistry: Book of abstracts, Helsinki, Finland, July 21-26, 1996,-P. 339-340.

28.Excited states of cationic copper(II) porphyrins used as structural and conformational probes for nucleic acids: Photophysics of Cu(Tmpy-P4) bound to short oligothymidilates and Poly(dG-dC) / V.S. Chirvony, V.A. Galievsky, P. Mojzes, P.-Y. Turpin // Laser Applications in Life Sciences: Abstr. of the 6th Intern. Conf.- Jena, Germany, September 23-27, 1996. - P. Pl-34.

29.Transient resonance Raman and picosecond absorption studies of Ni(TMpy-P4) in interaction with Poly(dG-dC)2, Poly(dA-dT)2, and in a phosphate water buffer / V.V. Ermolenkov, V.A. Galievsky, S.G. Kruglik, P. Mojzes, V.S. Chirvony, V.A. Orlovich, C. Otto, P.-Y. Turpin // Laser Applications in Life Sciences: Abstr. of the 6th Intern. Conf.- Jena, Germany, September 23-27, 1996. - P. Pl-44.

30.1ntermolecular interaction between photoexcited Cu(TMpy-P4) and water in a phosphate buffer solution studied by time-resolved transient absorption and resonance Raman spectroscopies / V.A. Galievsky, V.V. Ermolenkov, A.G. Shvedko, S.G. Kruglik, V.S. Chirvony, V.A. Orlovich, C. Otto, P.-Y. Turpin // Laser Applications in Life Sciences: Abstr. of the 6th Intern. Conf.- Jena, Germany, September 23-27, 1996. - P. Pl-45.

31. The influence of ionic strength on the binding of Zn(TMpy-P4) to polynucleotides studied by resonance Raman and absorption spectroscopies / V.A. Galievsky, S.N. Terekhov, V.V. Ermolenkov, V.S. Chirvony, V.A. Orlovich, P.Y. Turpin // Laser Applications in Life Sciences: Abstr. of the 7th Intern. Conf.- Bratislava, Slovak, August 24-28,1998.-P. Pl-1.

32.Photophysics of water-soluble cationic porphyrins complexed with DNA and DNAmodel polynucleotides / V.A. Galievsky, V.S. Chirvony, B.M. Dzhagarov, N.N. Kruk, V.L. Malinovsky, P.Y. Turpin // Spectroscopy and chemistry of porphyrins and their analogs. 8th Intern. Conference: Abstr.- Minsk, Belarus, 1998,- P. 59.

33.Связывание катионного H2TMpyP4+ порфирина с 5'CG3' и 5'GC3' последовательностями в гексадезоксирибонуклеотидах / Н.Н. Крук, С.И. Шишпоренок, А.А. Короткий, В.А. Галиевский, B.C. Чирвоный, П.-И. Турпен // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем. III съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 1998,- С. 57.

34.Определение локальной полярности в местах связывания катионного Н2ТМруР4+ порфирина в [poly(dA-dT)]2 и [poly(dG-dC)]2 полинуклеотидах / С.И. Шишпоренок, Н.Н. Крук, В.А. Галиевский, B.C. Чирвоный, П.-И. Турпен // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем. III съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 1998,-С. 81.

РЭЗЮМЭ Га.шеуск! В1ктар Антонав1ч

К1НЕТЫКАI МЕХАН13МЫ ДЭЗАКТЫВАЦЫ1 УЗБУДЖАНЫХ ЭЛЕКТРОННЫХ СТАНАУ ПАРФ1РЫНАУ, УБУДАВАНЫХ У ДНК

Ключавыя словы: юнетычная абсарбцыйная спектраскатя, люмшесцэнцыя, узбуджаныя элекгронныя станы, воднарастваральныя катыённыя парф1рыны, ДНК.

Метадам1 стацыянарнай 1 юнетычнай (пка- 1 нанасекунднай) абсарбцыйнай 1 люмшесцэнтнай спектраскалп даследваны спектральна-юнетычныя уласщвасщ шжшх узбуджаных электронных станау воднарастваральнага катыённага 5,10,15,20-тэтраюс(4-М-метылтрыдыл) иарф^рыну (Н2(ТМру-Р4))) яго комплексау з 2а(1Г), Си(П), N¿(11), убудаваных у прыродныя альбо ппучныя малекулы ДНК. Устаноулена, што шлях1 размена энерги электроннага узбуджэння убудаванага парф1рыну залежаць ад бл1жэйшага да парф1рыну акружэння 1 вызначаюцца месцам убудоування пapфipынy у структуру ДНК. Паказана, што фотаузбуджаныя Си- i парф1'рыны пры пэунай лакал1зацьн у структуры ДНК далучаюць трупу СО ты мшу альбо малекулу вады у якасщ акаальнага лгганда юна металу, што можа быць выкарыстана для защЫравання бл1жэйшага акружэння у комплексе парф1рын-ДНК. Паказана, што флуарэсцэнцыя безметальнага парф1рыну Нг(ТМру-Р4), 1нтэркал]раванага пам1ж парам1 6С асноу, тушыцца дзякуючы пераносу электрона з гуашну на фотаузбуджаны парф1"рын, што сведчыць на карысць прынцыпЬшьнай магчымасщ фотадынам1чнага разбурэння ДНК без удзелу сшглетнага юслароду. Устаноулена, што у прысутнасщ исларода паветра час жыцця трыплетнага стану парф1рыну Н2(ТМру-Р4) залежыць ад месца убудоування парф1рыну у ДНК \ вызначаецца абароненасцю парф1рынавага макрацыкла ад сутыкненняй з малекулам1 юслароду, што можа быць выкарыстана для вывучэння размеркавання малекул парфгрыну па розным тыпам убудоування.

РЕЗЮМЕ Галиевский Виктор Антонович

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ДЕЗАКТИВАЦИИ ВОЗБУЖДЕННЫХ ЭЛЕКТРОННЫХ СОСТОЯНИЙ ПОРФИРИНОВ, ВСТРОЕННЫХ В ДНК

Ключевые слова: кинетическая абсорбционная спектроскопия, люминесценция, возбужденные электронные состояния, водорастворимые катионные порфирины, ДНК.

Методами стационарной и кинетической (пико- и наносекундной) абсорбционной и люминесцентной спектроскопии исследованы спектрально-кинетические свойства нижних возбужденных электронных состояний водорастворимого катионного 5,10,15,20-тетракис(4-Ы-метилпиридил) порфирина (Н2(ТМру-Р4)) и его комплексов с 2п(11), Си(П), N¡(11), встроенных в молекулы ДНК и их синтетические аналоги. Установлено, что пути размет энергии электронного возбуждения встроенного порфирина зависят от ближайшего к порфирину окружения и определяются местом встраивания порфирина в структуру ДНК. Показано, что фотовозбужденные Си- и порфирины при определенной локализации в структуре ДНК присоединяют группу СО тимина либо молекулу воды в качестве аксиального лиганда, что может быть использовано для зондирования ближайшего окружения в комплексе порфирин-ДНК. Показано, что флуоресценция безметального порфирина Н2(ТМру-Р4), интеркалированного между парами ОС оснований, тушится благодаря переносу электрона с гуанина на фотовозбужденный порфирин, что свидетельствует в пользу принципиальной возможности фотодинамического разрушения ДНК без участия синглетного кислорода. Установлено, что в присутствии кислорода воздуха время жизни триплетного состояния порфирина Н2(ТМру-Р4) зависит от места встраивания порфирина в ДНК и определяется защищенностью порфиринового макроцикла от столкновений с молекулами кислорода, что может быть использовано для изучения распределения молекул порфирина по различным типам встраивания.

ABSTRACT Galievsky Victor Antonovich

KINETICS AND MECHANISMS OF THE EXCITED ELECTRONIC STATES DEACTIVATION OF PORPHYRINS BOUND TO DNA

Key words: time-resolved absorption spectroscopy, luminescence, excited electronic states, water-soluble cationic porphyrins, DNA.

The spectral and kinetic properties of the lowest excited electronic states of water-soluble cationic 5,10,15,20-tetrakis(4-N-methylpyridyl)porphyrin (H2(TMpy-P4)) and its Zn(II), Cu(II), Ni(II) complexes bound to the native or synthetic DNA molecules have been studied using stationary and time-resolved (pico- and nanosecond) absorption and luminescence spectroscopies. It is found that the pathways of excitation energy relaxation of the bound porphyrin depend on the porphyrin nearest environment and are determined by the position where the porphyrin is bound to DNA structure. It is shown that the photoexcited Cu- and Ni-porphyrins are axially ligated by the CO group of thymine or water molecule to the metal atom at the certain porphyrin localisation into DNA structure. This can be used to probe the nearest porphyrin-DNA complex environmental. It is shown that fluorescence of the free base porphyrin intercalated between GC base pairs is quenched due to the reversible intermolecular electron transfer from guanine to the porphyrin in the excited state. These observations support the principal possibility of the photodynamic DNA destruction withoutparticipation of the singlet oxygen. It is shown that in air-saturated solutions H2(TMpy-P4) triplet state lifetime depends on the position where the porphyrin is bound to DNA and is determined by the protection of porphyrin from oxygen molecules. This can be used to study the porphyrin molecules distribution between different interaction sites.

ГАЛИЕВСКИЙ Виктор Антонович

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ДЕЗАКТИВАЦИИ ВОЗБУЖДЕННЫХ ЭЛЕКТРОННЫХ СОСТОЯНИЙ ПОРФИРИНОВ, ВСТРОЕННЫХ В ДНК

Отпечатано с оригинал-макета Заказчика на УП «Технопринт» Лицензия ЛП № 203 Заказ 206 Тираж 100 шт. Усл. печ. л. 1,395. Формат 60 х 84/16 пр. Ф. Скорины, 65, корп. 14, комн. 209. Тел. 239-91-57