Кинетика внутримолекулярного движения заряда при лазерном возбуждении бактериородопсина тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

р г Б од

1 российская академия наук

- о "I7 > Ч '■С"'' ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ФИЗИКИ I I 1. : • Ь '

На правах рукописи УДК [537.86:о30.145]":п77.344

ШАРОНОВ АЛЕКСЕЙ ЮРЬЕВИЧ

КИНЕТИКА ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО ДВИЖЕНИЯ ЗАРЯДА ПРИ ЛАЗЕРНОМ ВОЗБУЖДЕНИИ БАКТЕРИОРОДОПСИНА.

юциальность 01.04.21 - лазерная физика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте общей физики Российской Академии Наук

Научные руководители:

зав.лаб. лазерной биофизики, кандидат физико-математических наук В.В.Савранский;

кандидат физико-математических наук Н.В.Ткаченко.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук,

профессор,

А.А.Кононенко;

кандидат физико-математических наук Б.В.Зубов.

Ведущая организация:

Физический Институт РАН

Защита диссертации состоится " " Сессия 1995 г. в ^ часов на заседании Специализированного Ученого совета К.003.49.02 Института общей физики Российской Академии Наук по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института обще] физики Российской Академии Kay к.

Автореферат разослан "/¿Г" 1995 г.

¿f&S^ Т.Б.Воля

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность.

Бактериородопсин (БР) был открыт в 1973 году. Это природный мембранный белок, содержащийся в клетках На1оЪа&титп На1оЫит. Уникальность БР в том, что он является простейшей фотосинтезирую-щей системой - все процессы по преобразованию световой энергии в трансмембранную электрохимическую разность потенциалов осуществляются единственной молекулой. Хотя преобразование энергии в сложных организмах выполняется не одной молекулой, а целым набором органических соединений, кажущаяся простота БР весьма относительна - ее аминокислотная последовательность состоит из 248 аминокислотных остатков. Исследовательский интерес к принципам функционирования бактериородопсина объясняется еще и тем, что БР исключительно стабилен, он восстанавливает активность и после глубокого замораживания, и после воздействия сильных кислот и щелочей, и после вакуумного' высушивания. Выделенные в виде фрагментов клеточных мембран, образцы позволяют работать с ними как с обычным, хотя и сложным, органическим соединением, а не как с традиционными биологическими объектами. К изучению БР применялось множество, как чисто физических, так и физико-химических методов исследования. Исследованию функционирования БР посвящены тысячи научных публикаций, аспекты его активности неоднократно обсуждались на специализированных научных конференциях. Однако, несмотря на столь значительный исследовательский интерес и затраченные усилия, окончательный ответ о физических механизмах функционирования до сих пор не получен, и бактериородопсин продолжает оставатся объектом исследования во многих лабораториях.

Поскольку главная функция БР это перекачка протонов с цито-плазматической на внешнюю сторону мембраны, то особый интерес представляют внутримолекулярные изменения, связанные с перемещениями зарядов.

Изменения оптических характеристик среды, вызванные движением зарядов, не ограничиваются только изменениями в хорошо изу ченных спектрах поглощения видимого диапазона. Поглощение в других частях спектра отражает влияние локальных электрических полей на прочие, отличные от близкого окружения к хромофору, части белковой молекулы. Так поглощение БР в ближнем УФ диапазоне определяется наличием в аминокислотной последовательности ароматических аминокислот. Исследование возмущений вблизи отдельных аминокислот проводилось различными методами, однако результаты исследований зачастую противоречивы и вопрос о том, какие именно аминокис-

лотные остатки претерпевают возмущения и на каких стадиях фотоцикла, остается открытым. Экспериментальное исследование того, как движущийся заряд влияет на отдельные аминокислоты, на каких именно стадиях фотоцикла - одна из целей данной работы.

Кииетика движения зарядов может регистрироваться не только косвенным, как это имеет место при регистрации изменений оптических свойств среды, но и прямым путем - методом измерения кинетики индуцированного заряда. В этом случае необходимо иметь ансамбль одинаково сориентированных молекул. Известно несколько типов ориентированных систем, однако, наиболее интересны молекулярные ориентированные пленки, полученные методом Лэнгмюра- Блоджетт (ЛБ пленки). Такой выбор обусловлен все возрастающим интересом к устройствам "молекулярной электроники" - приборам, осуществляющим функции электронных элементов на молекулярном уровне.

БР один из вероятных кандидатов на использование в опто-электрониых приборах, т.к обладает хорошей устойчивостью к внешним воздействиям, высоким быстродействием (фемтосекунды), имеет высокий квантовый выход и большие спектральные различия фотопродуктов. Кроме того, БР сохраняет фотоактивность в условиях, далеких от естественных, например в сухом состоянии или помещенным в полимерную матриц.

Исследование фотоцикла БР в ЛБ структурах обычно ограничивается регистрацией фототока/фотонапряжения с многослойной системы с невысоким временным разрешением. Измеренная кинетика движущихся зарядов может быть искажена влиянием экспериментальных факторов, например взаимодействием с электродами измерительной ячейки или паразитными фотонаведенными окислительно-восстановительными реакциями. Задача данного исследования - создание высокооднородных искусственных БР-содержащих мембран молекулярной толщины, исследование фотоактивности БР и процессов, связанных с транспортом зарядов в молекулярных твердотельных пленках.

Цель работы.

Цель данной работы состояла в получении информации о внутримолекулярном движении зарядов при функционировании бактериоро-допсина как в естественных условиях, так и в сухих ориентированных структурах.

Научная новизна.________________

1. Кинетически разделены вклады в абсорбционные изменения от возмущений вблизи конкретных аминокислот в фотоцикле бактериородопсина.

2. Получена связь между стадиями фотоцикла и молекулярными событиями, вызывающими возмущения вблппи аминоютслотных остатков тирозина и триптофана.

В приближении линейной последовательности интермедиатов получены дифференциальные спектры в УФ области спектра Ь, М и О фотопродуктов для БР в нативных'условиях.

4. Продемонстрировано, что метод Лэнгмюра-Блоджетт позволяет получить высокооднородные пленки с молекулами БР противоположных ориентации.

5. Впервые получен разрешенный во времени сигнал фотопапря-жепии с единственного ЛБ-БР слоя. Показано, что кинетики фотонапряжения с монослоев различной молекулярной ориентацией полностью симметричны.

6. Из кинетических кривых фотоэлектрического отклика выделены вклады, связанные с движением зарядов. Показана идентичность временных констант, связанных с формированием и распадом М состояния, полученных из спектральных и фотоэлектрических ¡измерений.

7. Получена температурная зависимость временных констант фотоцикла. Вычислены энергии активаций процессов.

Научная и практическая цеппость работы.

Рассмотрены экспериментальные методы исследований, дающие информацию о внутримолекулярных событиях, связанных с движением зарядов при функционировании бактериородопсипа.

Результаты исследования возмущающего действия движущихся зарядов на аминокислотные остатки молекулы бактериородопсина позволили кинетически разделить вклады от отдельных аминокислот. Был решен вопрос о том, какие именно виды аминокислот подвержены влиянию локальных электрических полей от движущегося заряда. На основании полученных данных сделаны выводы о молекулярных событиях вблизи конкретных частей молекулы белка.

Исследована активность бактериородопсина в сухих пленках Лэнгмюра-Блоджетт, которые могут быть использованы в приборах молекулярной электроники. Разработаны методы, позволяющие регистрировать малые смещения заряда в мономолекулярных пленках. Получены монослойные образцы с противоположными ориентациями бактериородопсина. Исследованы кинетики фотопотенциала и абсорбцион-

пых изменений, связанные с функционированием бактериородопсина в пленках. Полученные данные позволили сделать выводы о перемещениях заряда в молекуле при малых значениях влажности. Вычислены активационные энергии микросекундных стадий.

Результаты исследований интересны с точки зрения понимания механизмов функционирования простейшей фотосинтезирующей системы.

Апробация работы

Основные результаты исследований, вошедшие в диссертацию неоднократно докладывались на семинаре отдела колебаний ИОФ РАН; на IV международной конференции "Ретинальсодержащие белки" в (США, г.Санта-Круз, 1990); 14 симпозиуме IUPAC по фотохимии (Бельгия, г.Левен, 1992); IV международной конференции "Laser applications in life sciences" (Финляндия, г.Юваскула, 1992); V международной конференции "Ретинальсодержащие белки" (Франция, г.Дурдан, 1992).

Публикации.

По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитированной литературы из 236 наименований. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Во введении сформулирована проблема и поставлены задачи данного исследования.

Глава 1 посвящена обзору литературы и состоит из трех разделов. В первом разделе приводятся общие сведения о структуре и функционировании бактериородопсина, кратко описан молекулярный механизм работы молекулы как протонного насоса.

Во втором разделе описаны спектральные методы исследования фотоцикла бактериородопсина и как с помощью этих методов строятся кинетические модели фотоцикла. Кроме того, в этом разделе рассмот-

рено влияние движения зарядов при функционировании БР на его оптические характеристики и - приводится- связь между стадиями фотоцикла и фазами движения протона.

Третий раздел обзорной главы посвящен обзору фотоэлектрических методов исследования внутримолекулярного движения зарядов при функционировании БР. Приводятся требования к исследуемым образцам и рассмотрены известные типы ориентированных ВР-содерясащих систем и их краткие характеристики, включающие достоинства и недо-

Лв, М~1см"1литц т

А

-ЗООО

Г

Л

у (

Ж

Ч г'

2.-ЛО ¿Г>И нао 27« 280 2ЭО ЗОО ЗЮ 320 Д^ЛИВСС». ВОЛНЫ (им]

\

/

ч

Рис.1. Амплитудные спектры кинетических компонент ближнего УФ диапазона.

статки. Далее дан обзор электрогенных, т.е. сопровождающихся перемещением наряда, стадий фотоцикла бактериородопеина.

Глава 2 посвящена экспериментальному исследованию влияния, вызванного внутримолекулярным движением зарядов на спектры поглощения ароматических аминокислот.

В первом разделе рассмотрены известные данные о возмущениях вблизи тирозина и триптофана, полученные различными экспериментальными методами, изложены недостатки и сформулирована цель данных исследований.

Во втором разделе главы приводятся требования к экспериментальной установке, дается ее описание и параметры.

В третьем разделе описана методика получения кинетических сигналов абсорбционных изменений и способ анализа экспериментальных данных. Дается краткое описание работы алгоритма программы многокомпонентной многофайловой аппроксимации, созданной в нашей лаборатории, и преимущества такого подхода для получения достоверных данных о кинетических компонентах фотоцикла. Далее приводятся экспериментальные данные и результаты их аппроксимации. Аппроксимация данных проводилась раздельно для "хромофорной области" (370-630нм) и "области ароматических кислот" (250-315нм).

Для аппроксимации данных "хромофорного региона" во временном интервале от 100нс до 40мс необходимо и достаточно шести экспонент, их временные константы соответствуют ранее опубликованным данным. Мощная оптическая наводка от импульса возбуждения, особенно заметная на длинах волн короче 270нм, не позволила разрешить микросекундные времена, коррелирующие с временем К-Ъ перехода в "нехромофорной" части спектра. Всего в ультрафиолетовой кинетике поглощения удается выявить четыре процесса: две компоненты "роста" с последующим двухэкспоненциальным "распадом". Неразрешаемая по вышеизложенным причинам быстрая компонента роста соответствует по времени переходу БР-Ь, вторая (медленная) компонента роста аппроксимировалась экспонентой с константой времени 120+/-30 мкс. Две компоненты распада характеризуются временами 1.6+/-0.3мс и 8.7+/-0.4мс. Амплитудные спектры кинетических компонент ультрафиолетового диапазона в значениях дифференциальных экстинкций рассчитывались по разработанной ранее в нашей лаборатории методике и представлены на рис.1.

В приближении линейной последовательности интермедиатов были получены дифференциальные спектры в УФ области Ь, М и О промежуточных состояний (см. рис.2.). Низкотемпературные дифференциальные спектры, публиковавшиеся другими группами для М и Ъ интермедиатов близки к полученным нами. Дифференциальный спектр О состояния в ультрафиолетовой области ранее опубликован не был, что связано с невозможностью использования низкотемпературных методов исследования начиная со стадии распада М интермедиата.

Четвертый раздел главы посвящен обсуждению полученных результатов. Амплитудный спектр "120мкс" компоненты отражает нарастание поглощения с минимумом 295 нм, изобестической точкой 285 нм и максимумом на 270 нм с уменьшением амплитуды при уменьшении длины волны. Более всего этот спектр похож на дифференциальный спектр титрования триптофана в растворе и, таким образом, отражает удаление положительного заряда от индолыюй группы. Таким образом, можно сделать вывод, что в течение перехода Ь-М положительный заряд удаляется от триптофана. Релаксация наведенного движущимся зарядом возмущения происходит во время перехода М-О с постоянной времени 8.7 мс. Форма амплитудного спектра этой компоненты практи-

Д£, М"1ст"1литр

Z4i> zen гм зоо 320

Длина волны [ нм ]

Рис.2. Вычисленные дифференциальные спектры L, M и О интерме-диатов в УФ диапазоне.

lecKii идентична форме спектра 120 мкс компоненты, хотя величина «шонения поглощения во время 8.7мс релаксации в два раза больше зеличины изменения 120мкс компоненты роста. Величина амплитуды >.7 мс компоненты соответствует изменению экетиикции примерно в 'ООО М'1 см"1 л на длине полны 295 нм. Такое большое изменение экс-'инкции в сравпегпш с изменениями при депротонировании карбоксильной (Л00 см-1 л) или амино группы (800 М"1 см-1 л) триптофана i растворе вряд ли связано с возмущением всех восьми имеющихся в юлекуле триптофанов, полученные большие изменения окстинкции, Корее всего, связаны с приближением и удалением возмущающего за->яда на очень близких к индольной группе триптофана расстояниях, кинетическая компонента, соответствующая релаксации изменений в :оглощении с временем 1.6 мс, имеет совершенно другой вид спектра. г этого спектра два максимума ( на 295 нм и длинах волн короче 50нм) и минимум на 280 нм. Кинетически эта компонента коррелирует распадом О интермедиата и вид ее спектра совпадает с возмущения-1и тирозина в растворе. Абсолютное изменение поглощения во время того процесса на 295 нм составляет примерно 80% от изменений помещения при протонировании тирозина гов в растворе. Компонента с ременем 1.6 мс является по-видимому вкладом от тирозина, отличного г Туг185, цикл протнирования /депротонирования которого в течение R-K-L-M переходов описан ранее. В обсуждение результатов включе-ы сопоставления с литературными данными, указаны возможные ричины несоответствия, связанные с применением других методов ис-чедования.

В Главе 3 описаны Лэнгмюровские пленки бактериородопсина и исследование БР в таких пленках спектральными методами.

В первом разделе сформулированы преимущества Лэнгмюровской технологии для получения ориентированных ансамблей белковых молекул и актуальность применения ЛБ структур для изучения процессов направленного переноса заряда фотоэлектрическими методами.

Следующий раздел посвящен описанию методов получения ЛБ-БР пленок, повторяющих структуру природных мембран. Приведены данные о формировании мономолекулярного слоя БР в окружении липид-ного (soya PC) бислоя на поверхности субфазы. Описаны требования к образцам для фотоэлектрических измерений и структура образцов х- и z-типа.

В третьем разделе приведены экспериментальные данные о свойствах БР в ЛБ пленках, полученные спектральными методами. На длине волны 570 нм (максимум поглощения нативных образцов) поглощение каждого нанесенного слоя составило (0.445+/-0.015)*10~3.

Получены спектры поглощения BP:soyaPC пленок, помещенных в воду и в азотную атмосферу (сухих пленок), а также спектр поглощения БР в растворе. Видно, что в . сухих пленках происходит сдвиг максимума поглощения в синюю область (560нм вместо 570нм), это вызвано дегидратацией Шиффова основания хромофора белка. Спектры флюоресценции измерялись при возбуждении на длинах воли, соответствующих поглощениям тирозина (267 нм), триптофана (283 нм), свободного ретиналя (374 нм) и ретиналя в БР (565 нм).

При возбуждении в полосе поглощения тирозина (267 нм) наблюдалась флюоресценция в областях 315+/-4, 438+/-6 и 620+/-2 нм, подобный спектр, но с большей амплитудой пиков испускания, получался и при возбуждении длиной волны в 263нм (триптофан). Положения пиков флюоресценции согласуются с литературными данными и соответствуют флюоресценции тирозина (315 нм), ретиналя (437 нм) и ретиналя в опсине (622 нм). Возбуждение в полосу свободного ретиналя на длине волны 374 нм дает испускание только на длине волны в 438 нм. Интенсивность испускания на длине волны в 622 нм при возбуждении в полосе поглощения БР ретиналя (565 нм) уменьшается по сравнению с возбуждением в 283 нм, однако как форма, так и положение пика остается неизменным. Вид спектров флюоресценции демонстрирует, что существует эффективный процесс передачи энергии от ароматических аминокислот к ретинали хромофора и бактериородопсин сохраняет свои свойства в пленках Лэнгмюра - Блоджетт.

В четвертом разделе приведены краткие выводы о свойствах бактериородопсина в исследуемых ЛБ пленках.

Глава 4 посвящена исследованию процессов, связанных с движением зарядов в ЛБ пленках бактериородопсина. В ней приводятся результа-

Поглощение [* » О ]

А

0.0 0.2 0.4 0.« 0.8 1.0

Время 1'МС']

В

Поглощение [*1С 5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Время [сек]

Поглощение [*10 ] 0-0

50 100 150 200 ОремзЕ [мкс]

0.0 --Щ -0.5 --1.0 --1.5 --2.0

0.0

0.5 1.0 1.5 Время [сек]

2.0

11<ч .1;>|"Дг 11и<° 1*1

1.5

О 2 -1 В Я 10 Время [сек)

Поглощение [* ! О |

0.0

-0.5 -

-1.0

О 2 I Г. 8 10 Время [сск]

Рис. 3. Кинетические кривые изменений поглощения в фотоцикле БР в ЛБ пленках. (А). Образец помещен в воду .(В). Образец выдержан в насыщенной водой атмосфере и (С) в атмосфере 55% влажности. Длина волны зондирования для левых кривых 410 нм, для правых 540 нм

ты кинетических измерений, полученных как методом абсорбционной спектроскопии, так и фотоэлектрическим методом.

В первом разделе даны результаты исследований, полученные методами флэш-спектроскопии. Измерение кинетики абсорбционных изменений в оптически тонких пленках связано с рядом сложностей. В работе описан метод измерения, в котором зондирующий луч, проходя внутри кварцевой пластинки под углом полного внутреннего отражения с нанесенными на нее ЛБ БР слоями, испытывал многократные отра-

жения от поверхности кварц/ЛБ/воздух. Кинетика абсорбционных изменений изображена на рис.3. Результаты аппроксимации кинетик абсорбционных изменений при разных значениях влажности сведены в таблицу 1. Характерные временные константы, полученные для БР в ЛБ пленках хорошо согласуются с литературными данными о кинети-

Рис.4. Кинетики фотонапряжения от г-типа(а) и х-типа(Ь) ЛБ БР монослоев.

ческих компонентах фотоцикла БР в сухих образцах, полученных другими методами.

Активационная энергия формирования М-состояния вычислялась из Аррениусовской зависимости времени жизни от абсолютной температуры. Распад Ь-формы и формирование М-интермедиата аппроксимировались в моноэкспоненциальном приближении одновременно из кинетических кривых, полученных на длинах волн зондирования в 410 и 540 нм в диапазоне температур от 15 до 35 С при относительной влажности 55%. Значение энергии активации составило 70+/-7 кДж/моль, что несколько превышает таковую в нативных образцах. В ЛБ пленках более высокая энергия активации может быть связана с отсутствием в окружении молекул воды или водородных связей между спиралями белка и основанием Шиффа хромофора, эти взаимодействия замещаются на электростатическое взаимодействия аминокислот в соответствующих спиральных столбах.

Во втором разделе приведены результаты измерений фотопотенциала с ЛБ-БР структур. В первом пункте рассматривается связь между регистрируемыми сигналами и процессами их вызывающими. Далее содержится описание экспериментальной установки.

В третьем пункте приведены результаты измерений параметров исследуемых образцов. Из экспоненциальных кривых разряда конденса-

зра через заданные значения сопротивлений нагрузки и результатов Етлиза прохождения через образец сигналов различных форм емкость эразца была оценена^ "400 ~пФ" для монослойных БР:липид образцов и 130пФ для многослойных, что вполне соответствует рассчитанному пя случая идеального конденсатора.

Внутреннее сопротивление многослойного (5 слоев) образца превы-[ало, как минимум, 10 ГОм при относительной влажности 55%, это гачение выше полученных ранее для ЛБ структур. Сопротивление онослойных образцов, учитывая площадь контакта (1.5мм в диаметре), эевышало 50Мом/'смг.

Пункт четвертый содержит экспериментальные данные о фотоэлек-эическсм отклике. Измерен спектр действия фотоэлектрического от-така, его вид соответствует спектру поглощения БР, что позволяет (елать вывод о том, что природа возникающего фотонапряжения не->средственно связана с активностью белка в Лэнгмюровской пленке. Кинетика сигналов фотонапряжения в микросекундном временном 1апазоне для х- и z-типа ЛБ монослоев при комнатной температуре и гажности (20° С, 55%) представлена на рис.4. Амплитуда фотопотен-1ала линейно зависела от числа ЛБ БР слоев.

На статистически достоверном уровне имеются, как минимум, 'два юцесса во временном диапазоне от 1 мке до 1 мс, их временные кон-анты 10 мке и 70 мкс. Эти времена соответствуют L-M переходу фо-никла и находятся в хорошем соответствии с ранее опубликованными .иными.

Из зависимости максимальной амплитуды фотонапряжения от ин-нсивности лазерного импульса возбуждения сделана оценка сечения тлощения БР в пленке(2.1 А), что практически соответствует хорошо местному значению в 2.4 А для БР в пурпурных мембранах.

Распад фотонапряжения регистрировался с сопротивлениями на-узки 10 Мом, 100 Мом, 1 ГОм и 10 ГОм при значениях разверток от теп миллисекунд до десяти секунд. Записанные сигналы изображены рис. 5а. (нижние кривые). Для исключения влияния измерительных ектродов, в части экспериментов добавлялся добавочный изолирую-ш слой слюды между ЛБ пленкой и электродом (рис.5Ь). Считая параметры системы независящими от времени, кинетика, язанная с "чистым" движением протонов в ЛБ БР пленке, может гть получена путем численного интегрирования экспериментальных ивых:

i

fid^-A.ki.-.kn.t) = const * { V(t) + (1/RC) J V(t')dt'} ,

0

где f(d1,...,dn,k1,...,kn,t) есть функция, представляющая собой сумму шоненциальных процессов со скоростными константами kj и ампли-

мВ 1.0 -0.5 -0.0

0 10 20 30 40 Время [шс]

50 100 150

Время [мс]

Время [мс]

мВ

1 ГОм 1

0.0 0.5 1.0 1.5

Время [сек]

мВ 1.0 -

I I I

0.0 0.5 1.0 1.5 Время [сек]

ыВ 1.0 -

0.5 -

0.0

т

0.0

I I

2.5 5.0 7.5

Время [сек]

Рис. 5. Регистрируемые кинетики фотонапряжения (нижние кривые) и вычисленные кинетики смещения заряда (верхние кривые) для сухого монослоя БР г-типа.

тудами пропорциональными смещению заряда на расстояние <1,, а У(г) - напряжение на электродах.

Кинетики процессов, полученные таким путем, изображены на том же рисунке, что и экспериментально измеренные кривые (рис. 5, верхние кривые). Компьютерная аппроксимация позволила выделить характерные временные константы процессов, независящие от параметров образцов и измерительной аппаратуры, а связанные именно с

Таблица 1.

Т][мкс] т2[мкс] т3[мс] т^мс]

абсорбционные изменения

в воде ( 40+//"2 3.3+/-о.у —

во влажной атмосфере " 1 ~ 120"/-10 КНИГ"110

при с | в''-2 влажности | 73' /-¿ь 1 50 '' зтоо-1/-3"

фотопотенциал

при 55% влажности Ю+/-0-» 70+/'-3 160'г/~п 2000+/'400

;ижением зарядов внутри БР моле-'лы. Кинетика, связанная с движени-[ зарядов в Лэнгмюровских пленках

ктериородопсина, характеризуется временном интервале от 1 икс до сек четырьмя процессами: двумя мпонентами роста с характерными еменами 10 мкс и 70 мкс и двумя 'оцессами распада с временными истантами 150 мс и 2 сек (см. табли-

В интервале от 17° С до 35° С были лучены температурные зависимости эростных констант микросекундных мпонент (рнс.С). Они подчиняются кону Аррениуса и полученная ергия активации для обоих процес-а равна 75 +/- 5 кДж/моль. Третий раздел главы посвящен оГ>-ждешно полученных результатов, сравнению данных с результатами лученными другими исследователями с различных типов ориентиро-:шых БР систем, рассмотрены молекулярные модели. В четвертом разделе подведены итоги кинетических исследований > БР структур.

3 Заключении изложены основные результаты и выводы диссерта-и.

3! 3 2 3 3 3 1 3,5

Те«перат»ра (10 К ')

Рис. б. Зависимости скоростей кинетических компонент фото-напряжения в Аррениу-совских координатах (влажность 55%). _

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Настоящая работа посвящена исследованию процессов внутримолекулярного движения зарядов при функционировании бактериородоп-сина. Природный мембранный белок бактериородопсин осуществляет функции протонного насоса - поглощение им световой энергии приводит к переносу протона с внутренней не внешнюю поверхность мембраны. Процесс транспорта заряда носит комплексный характер, его движение внутри молекулы и являлось предметом экспериментального исследования.

Первая часть работы - исследование движения зарядов по оказываемому им возмущению на оптические характеристики среды выполнена с помощью методов кинетической абсорбционной спектроскопии на суспензии фрагментов природных клеточных мембран. Получены экспериментальные данные в широком спектральном и времешюм диапазонах. Аппроксимация кинетических кривых осуществлялась одновременно для всех зондирующих длин волн, такой подход позволил существенно увеличить достоверность получаемых результатов и произвести анализ амплитудных спектров кинетических компонент.

Во второй части работы экспериментально исследовалась кинетика транспорта зарядов прямым путем - регистрацией индуцированного им электрического заряда на измерительных электродах. Измерения проводились на сухих, искусственно созданных мономолекулярных структурах, полученных методами Лэнгмюра-Блоджетт. Разработанные экспериментальные методы позволяют регистрировать смещения заряда в монослойных пленках на десятые доли Ангстрема.

ВЫВОДЫ

1. В нативных условиях кинетически разделены вклады от возмущений, оказываемых движущимся зарядом, на близкое окружение ароматических аминокислот молекулы бактериородопсина. Получены дифференциальные спектры в УФ области спектра для Ъ, М и О ин-термедиатов фотоцикла. Спектр О- интермедиата в этой части спектра получен впервые.

2. Сделаны выводы о движении заряда внутри молекулы. Возмущающий заряд проходит на очень близких к триптофану(ам) расстояниях. Удаление положительного заряда от триптофана(ов) носит двухстадийный характер и кинетически связано с ВР-Ь и Ь-М переходами фотоцикла. Релаксация возмущений вблизи триптофана носит одностадийный характер и связана с М-О переходом. О-БР переход фотоцикла сопровождается зарядовыми возмущениями вблизи одного единственного тирозина, рост этих возмущений происходит до возник-

овс1шя L-интормедиата. Движущиеся заряды не оказывают влияния

а близкое окружение'~тчфозина(ов) в течениеL.-M перехода;--------------------

'¿. Разработаны экспериментальные методы исследования направ-енного транспорта зарядов в структурах молекулярной толщины с а.чличной ориентацией активных молекул. Впервые получены разре-юнные во времени сигналы фотонапряжения с монослоев БР различ-ых ориептацттй.

4. Из кинетических кривых фотоэлектрического отклика выделе-ы вклады, связанные с даткенисл! заряда. Показана идентичность ременных констант, соответствующих формированию и распаду М нтермедиата, полученных из спсктрплытьтх и фотоэлектрических иа~ ерений. Микросекундные стадии фотоцикла (характерные времена Омкс и 70мкс при 55% влажности и 20° С) коррелируют с движениями ротона на сравнительно небольшие расстояния глубоко внутри моле-улы. Релаксационная часть кинетики движения протона состоит из вух медленных компонент (150 мс и 2 сек) и обусловлена обратными нещениями заряда(ов) к исходному состоянию.

5. Из температурной зависимости скоростных констант получены тергии активаций переходов микросекундных стадий. Полученная из чектрических измерений величина в 75 4-/-S кДж/моль совпадает с \ковой. вычисленной из оптических измерений (70 +/~ 7 кДж/моль).

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Tkachenko N.V, Savransky V.V, Sharonov A.Y (1989) Eur. Biophys. J. Г:131-13в Time-resolved refractive index changes during the icteriohrodopsin photocycle.

2. Sharonov AY. Tkachenko NV. Savransky W. Dioumaev AK (1991) hotochem. Photobiol. 54:889-893 Time-resolved ultraviolet absorption langes in the photocycle o£ baoteriurliodopsin.

3. Ikonen M, Sharonov A. Tkachenko N, Lemmetyinen H. (1993) dv.Mat.Opt.Electr. 2:115-122 The photovoltage signals of ícteriorhodopsin in Langmuir-Blodgctt films with different molecular 'icntation-

4. Ikonen M, Sharonov A, Tkachenko N, Lemmetyinen H. (1993) dv.Mal.Opt.Electr. 2:211-220 The kinetiks of charges in dry ícteriorhodopsin Langmuir-Blodgett films - an analysis and comparison

electrical and optical signals.

5. Савранский B.B, Ткаченко H.B, Чухарев В.И, Шаронов А.Ю. (1992) оуды ИОФАН т.38:108-130 Исследование кинетики изменения пока-;теля преломления в фотоцикле бактериородопсина.

6. Sharonov AY, Tkachenko NV, Savransky VV and Dioumaev AK (1990) Abstract book of the 4th International Conference on Retina] Proteins. Time-resolved UV absorbtion changes in the photocycle oi bacteriorhodopsin.

7. Ikonen M, Sharonov A, Tkachenko N, Lemmetyinen H (1992' Structures and Functions of Retinal Proteins 221:189-192. The photovoltage of bacteriorhodopsin in x- and z-type monolayers and z-typc multilayer Langmuir-Blodgett film.

8. Ikonen M, Sharonov A, Tkachenko N, Lemmetyinen E (1992).Proceedings of 14 th IUP AC Symposium on Photochemistry. pp494-495. The photoresponce signal of bacteriorhodopsin in mono- anc multylayer Langmuir-Blodgett film.

9. Lemmetyinen H, Ikonen M, Sharonov A, Tkachenko N (1992 Proceedings of the 4th International Conference on Laser Applications ir Life Sciences, pp.209-220. Time resolved transient absorption anc photoresponce studies of orientd bacteriorhodopsin in Languir-Blodget' film.