Коллоидные свойства водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

На правах рукописи

РОДИОНОВА Екатерина Юрьевна

Коллоидные свойства водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина

Специальность 02.00.11 - коллоидная химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2- ¿015

Санкт-Петербург 2014

005558254

005558254

-г-

Работа выполнена на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Дмитриева Ирина Борисовна

Доктор химических наук, доцент ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-

фармацевтическая академия»

Официальные оппоненты: Голикова Евгения Викторовна

Доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Новичков Роман Владимирович

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник ФГУП "Научно-исследовательский институт прикладной акустики"

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»

Защита диссертации состоится Р 20г. в /У часов на

заседании диссертационного совета Д 212.232.40 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199004 Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д.41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького СПбГУ, Университетская наб., 7/9. Автореферат и диссертация размещены на сайте www.spbu.ru.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Суходолов Николай Геннадьевич

Общая характеристика работы

Актуальность

Теоретические представления в коллоидной химии, как правило, разрабатывались для неживых дисперсных систем, примером чего является широко известная теория двойного электрического слоя Гуи, устанавливающая связь между зарядом, потенциалом и концентрацией электролита в растворе для границы ртуть - водные растворы электролитов. Специальных исследований, посвященных анализу возможностей использования классических законов коллоидной химии для описания свойств биологических дисперсных систем практически нет. Характерная особенность природных биологических систем состоит в их исключительной лабильности, то есть способности к изменчивости при воздействии внешних факторов, и узкий интервал физико-химических условий, в котором эти системы функционируют. Вне этого интервала биологические объекты теряют свою активность, а нестабильность, вызванная агрегацией, приводит к разрушению биологических дисперсных систем. Основными

параметрами, характеризующими стабильность дисперсных систем, являются электрокинетический потенциал и изоэлектрическая точка. Определение изоэлектрических точек различных белков, в частности, гемоглобина, позволит предсказать их устойчивость к агрегации, а, следовательно, и интервал биологической активности. Из-за сложности, многообразия и многофакторности таких систем сегодня еще не сложилось единой точки зрения на происходящие в них процессы адсорбции, агрегации, стабилизации, на их структурно-механические и реологические свойства. Отсутствуют единые теоретические представления, позволяющие надежно объяснять наблюдаемые явления и их прогнозировать.

Биологические дисперсные системы, примерами которых являются кровь, лимфа, кровеносные и лимфатические сосуды, в существенной мере определяют жизнеспособность живого организма, поэтому комплексное изучение их коллоидно-химических свойств актуально и имеет весьма большое практическое значение. Гемоглобин и билирубин являются важнейшими компонентами биологических дисперсных систем животного происхождения, хлорофилл - растительного. Гемоглобин, билирубин и хлорофилл, относятся к тетрапирролам и практически не изучены с позиции коллоидной химии. Изучение коллоидных свойств этих дисперсных систем и их поведения при изменении условий (состава дисперсионной среды, температуры, старении) способствует развитию коллоидной химии биологических дисперсных систем и решению целого ряда практических задач, в частности, разрушению тромбов и холестериновых бляшек, разработки условий, препятствующих образованию желчных камней (из билирубина), тромбов и холестериновых бляшек.

В соответствии с отмеченным выше, цель диссертационной работы состоит в установлении закономерностей изменений коллоидных свойств водных дисперсий гемоглобина, билирубина и хлорофилла в растворах

неорганических электролитов и простейших аминокислот.

Для достижения данной цели задачами диссертационной работы являются

изучение электрокинетических свойств водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина в растворах одно-, двух- и трёхзарядных электролитов и простейших аминокислот;

определение изоэлектрических точек гемоглобина, хлорофилла и билирубина в растворах НС1 и КОН, и оценка влияния на них одно-, двух- и трёхзарядных электролитов и простейших аминокислот;

изучение адсорбции ионов водорода и гидроксид-ионов на указанных сорбентах в растворах различных электролитов и простейших аминокислот;

вычисление, на основе адсорбционных данных, количества функциональных групп гемоглобина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, расчет средних констант диссоциации этих групп;

изучение устойчивости водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина в зависимости от состава дисперсионной среды.

Научная новизна работы:

впервые выполнено комплексное исследование адсорбции и электроповерхностных свойств биологических дисперсных систем — дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина в водных растворах неорганических электролитов и аминокислот;

показано, что положение изоэлектрической точки для различных гемоглобинов определяется составом их белковой части;

обнаружено, что в ряду хлорофилл—»билирубин—»гемоглобин изоэлектрические точки и точки нулевого заряда смещаются в щелочную область с увеличением вклада основных групп; выявлено, что основной причиной различия рНиэт и рНТНз этих веществ является специфический характер сорбции карбонат анионов.

впервые на основе адсорбционных данных вычислено количество функциональных групп гемоглобина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, рассчитаны средние константы диссоциации этих групп: для основных групп рК^ = 6,1 и кислотных - рКа! =9,4;

установлено, что для билирубина и гемоглобина при изменении рН и ионной силы растворов коагуляция происходит преимущественно по нейтрализационному механизму, а для хлорофилла коагуляция происходит по концентрационному механизму.

Практическая значимость исследования: знание коллоидно-химических закономерностей формирования и функционирования сложных биологически активных дисперсных систем позволит создать модель образования и роста тромбов и холестериновых бляшек в кровеносных сосудах, желчных камней, а также определить условия их устранения.

Полученные результаты могут быть использованы при подборе веществ, увеличивающих растворимость билирубина, и адсорбентов для

- э -

выведения избытка билирубина из организма. В случае гемоглобина данные исследования полезны при определении подходящих адсорбентов для удаления свободного гемоглобина, образующегося в результате разрушения эритроцитов при реинфузии, и в выборе консервантов для хранения крови.

Основные положения, выносимые на защиту:

одно-, двух- и трехзарядные противоионы влияют на электрокинетический потенциал гемоглобина, билирубина и хлорофилла в соответствии с их зарядом, располагаясь в обычные лиотропные ряды для одно- и двухзарядных ионов;

положение изоэлектрической точки для различных гемоглобинов определяется составом их белковой части;

в ряду хлорофилл—»билирубин—»гемоглобин изоэлектрические точки и точки нулевого заряда смещаются в щелочную область с увеличением вклада основных групп;

определено количество функциональных групп гемоглобина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, рассчитаны средние константы диссоциации этих групп: для основных группpKz = 6,1 и кислотных - pKai =9,4;

коагуляция водных дисперсий гемоглобина и билирубина происходит по нейтрализационному механизму, хлорофилла по концентрационному механизму.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:

• Научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств: сборник научных трудов (Санкт-Петербург, 2010)

• «Межвузовской научной конференции, посвященной 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова и 150-летию создания A.M. Бутлеровым теории химического строения органических соединений» (Санкт-Петербург, 29 ноября 2011 г).

• «Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», (Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2012 г)

• Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2012» (Москва, 2012)

• 16ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2012)

• «Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2013» (Москва, 2012)

• 17ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2013)

• III Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация — потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2013)

• I Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», (Санкт-Петербург, 2013)

• IV Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2014)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендуемых ВАК, 12 тезисов по материалам докладов, представленных на научно-практических конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, трех разделов, выводов, списка литературы и Приложения. Объем диссертации 229 страниц, включая 91 рисунок, 23 таблицы, 120 наименований списка литературы и 3 приложения (61 таблица).

Основное содержание диссертационной работы

Во Введении обоснована актуальность темы работы, сформулированы основные цели и задачи работы, рассмотрена научная новизна и практическая значимость работы.

В Первом разделе "Литературный обзор" рассмотрены особенности строения, свойств, природное распространение и области применения гемоглобина, хлорофилла, билирубина и их аналогов. Рассмотрены основные направления и результаты исследований в области коллоидной химии порфиринов и линейных тетрапирролов.

Во Втором разделе "Объекты и методы исследования" описаны вещества, использованные в работе, экспериментальные методики и способы обработки полученных данных.

В настоящей работе в качестве объектов исследования использовались водные дисперсии природных биологически активных веществ - билирубина (ЗАО "Вектон"), гемоглобина (Sigma-Aldrich и Fluka Analytical), хлорофилла (Arterium). Изучение коллоидных свойств водных дисперсий этих веществ проводилось в зависимости от состава дисперсионной среды (рН, присутствие различных ионов, аминокислот). В качестве аминокислот использовались глицин и аспарагиновая кислота (Sigma-Aldrich). Все используемые для приготовления дисперсионной среды вещества имеют квалификацию ХЧ.

Электрокинетические свойства изучались методом

микроэлектрофореза; устойчивость - фотометрическим методом; определение сорбции протонов и гидроксид-ионов - методом непрерывного потенциометрического титрования; определение количества основных и кислотных групп гемоглобина проводилось методом кондуктометрического титрования; реологические свойства исследовались вискозиметрическим методом.

Погрешность измерений ¿¡-потенциала методом микроэлектрофореза в диапазоне 10 - 50 мВ составила ±10%, а в диапазоне 0 - 10 мВ - ±30%.

Случайная погрешность адсорбции (Г) составила 1%. Общая погрешность, с учетом погрешности методики, не превысила 5%.

Погрешность измерения рН составляла ± 0.02 единицы рН. Погрешность измерения рН изоэлектрической точки и точки нулевого заряда составила ±0,1 ед. рН (определялось среднее арифметическое отклонение рНиэтлто по результатам Зх опытов).

Погрешность фиксированных значений А, в спектрофотометрических исследованиях составила ± 0,1 мкм.

В Третьем разделе "Результаты и их обсуждение" представлены результаты экспериментов и их обсуждение.

3.1. Коллоидные свойства водных дисперсий гемоглобина

Исследования кинетики установления адсорбционного равновесия проводились по изменению удельной электропроводности, рН и электрокинетического потенциала во времени. Адсорбционное равновесие наступает менее чем за восемь часов. Для удобства все дальнейшие измерения проводились при времени контакта фаз - 24 часа.

Рассмотрим электрокинетические свойства на примере бычьего гемоглобина (рис.1). На поверхности гемоглобина в водных растворах адсорбируются одновременно ионы Н+ и ОН'. В общем виде можно записать две поверхностные реакции:

5Щ, +Я+ <-^->5М/3+(1);5ШОЯ+ОЯ" < >БСОО +Н20{2), где в - символ поверхности. Нулевому значению электрокинетического потенциала соответствует рНиэт (рН изоэлектрической точки). При значениях рН меньших рНиэт, электрокинетический потенциал положителен вследствие преобладания адсорбции ионов водорода, а при больших значениях - отрицателен из-за преобладания адсорбции ионов гидроксила. Влияние одно-, двух- и трёхзарядных ионов в области значений рН (рис. 1,2), где они являются противоионами соответствует их заряду и положению в лиотропном ряду (уменьшение электрокинетического потенциала по абсолютной величине в рядах Ыа+>К>1У^2+>Са2+ и НР0427Н2Р04'=СГ>8042' >СзН50(С00)з3-), а в области рН, где они не являются противоионами их влияние на электрокинетический потенциал сказывается через ионную силу раствора - увеличение ионной силы раствора вызывает сжатие диффузной части двойного электрического слоя, вследствие чего уменьшаются значения электрокинетического потенциала. Особое влияние оказывают на электрокинетический потенциал катионы железа II и III - не смещают положение изоэлектрической точки гемоглобина, но вызывают перезарядку поверхности (рис. 3) в отличие от катионов калия, натрия, магния и кальция.

-50

Рис. 1. Зависимость значений электрокинетического потенциала от рН водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии различных одно- и двухзарядных катионов металлов (концентрация моль/л).

Рис. 3. Зависимость значений электрокинетического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина от отрицательного логарифма концентрации катионов железа II и III.

Рис. 2. Зависимость электрокинетического потенциала

от рН для водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии

цитрат, сульфат и хлорид-ионов (концентрация солей 5-10"4моль/л).

Гемоглобины:

О лошадиный Д бычий человека рН

Рис.4. Зависимость электрокинетического потенциала водных дисперсий лошадиного, человеческого и бычьего гемоглобина от рН в растворах КС1 5'10"4моль/л.

Сравнение зависимости электрокинетического потенциала от рН для различных видов гемоглобина (рис. 4) показывает, что характер зависимости ^-потенциала от рН для всех видов гемоглобина одинаков, а состав белковой составляющей отражается на значении их изоэлектрических точек (смещение изоэлектрической точки гемоглобина в щелочную область соответствуют увеличению количества аминогрупп в белке).

По результатам потенциометрического титрования рассчитаны значения избыточной сорбции протонов или гидроксид-ионов на гемоглобине. Из рис. 5 видно, что в растворах хлорида калия не наблюдается смещения рНтнз, что свидетельствует об отсутствии специфической сорбции катионов калия и хлора на гемоглобине. При увеличении ионной силы раствора (концентрации хлорида калия) происходит увеличение обмена катионов и анионов на Н+, ОН", что отражается на увеличении сорбции Н+,

0Н\ Следовательно, хлориды щелочных и щелочноземельных металлов не сорбируются на гемоглобине специфически и влияют на сорбцию протонов и гидроксид-ионов только через изменение ионной силы раствора. По результатам электрокинетических и адсорбционных данных установлено, что карбонат-ион сорбируется специфически и смещает рНт]13 в щелочную область, арНиэт- в кислую.

Рис.5. Зависимость адсорбции протонов и гидроксид-ионов от рН в

водных растворах при различных концентрациях хлорида калия: 1-1,0 моль/л; 2 - МО'1 моль/л, 3 - 1-Ю"2 моль/л, 4 - 5-10'4моль/л.

Рис. 6. Зависимость изменения оптической плотности водных дисперсий лошадиного гемоглобина

от рН в растворах КС1 (1 -концентрация 1 • 10"3 моль/л, 2-5-10" 3 моль/л) для времени коагуляции 30 минут.

Из адсорбционных данных по уравнению Ленгмюра и из результатов кондуктометрического титрования рассчитаны значения предельной адсорбции протонов и гидроксид-ионов на бычьем гемоглобине, которые практически совпадают (таблица 1). Сравнение полученных значений с количеством амино- и карбоксильных групп, рассчитанных из теоретических данных показывает, что число свободных основных и кислотных групп, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами составляет лишь небольшую часть от общего количества. Определены средние константы диссоциации функциональных групп гемоглобина методом двойной экстраполяции (при степени диссоциации функциональных групп и концентрации соли, стремящихся к нулю): для основных -рК^ = 6,1 и для кислотных - рКа1 -9,4.

Процесс коагуляции изучался по изменению оптической плотности (АО) в зависимости от состава водной фазы и времени коагуляции (рис.6). Максимум на кривых зависимостей изменения оптической плотности водных дисперсий гемоглобина от рН соответствует значению изоэлектрической

точки (рис.6). Значение изоэлектрической точки лошадиного гемоглобина, определенного фотометрическим методом, совпадает с результатами электрокинетических измерений.

Таблица 1

Значения предельной адсорбции протонов и гидроксид-ионов на бычьем гемоглобине, полученные из адсорбционных данных и по результатам кондуктометрического титрования.__

Метод расчета Кислотные группы Основные группы

Из адсорбционных данных 1,18-10"3 моль/г 1,33'•10'"' моль/г

По результатам кондуктометрического титрования 1,25'Ю'3 моль/г 1,35-10"3 моль/г

Помимо простых электролитов для гемоглобина проведены исследования влияния структурных мономеров белков - аминокислот (глицина и аспарагиновой кислоты) на его электрокинетические свойства (рис.7,8). Влияние аминокислот на электрокинетические свойства гемоглобина определяется их кислотно-основными свойствами. В растворах аспарагиновой кислоты гемоглобин заряжен положительно вследствие большой концентрации протонов, а в растворах глицина больше содержание гидроксид-ионов (рис.7). Присутствие глицина и аспарагиновой кислоты не смещает значение изоэлектрической точки (рис.8), так как они входят в состав гемоглобина и их функциональные группы (-ТЧНг и -СООН) являются потенциалобразующими.

♦ Глицин

гшАспарагиновая кислота

мв

Рис.7. Зависимость значений электрокинетического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина от отрицательного логарифма концентрации глицина и аспарагиновой кислоты.

Рис.8. Зависимость значений электрокинетического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина от от рН в присутствии 5-10"4 моль/л аспарагиновой кислоты (1), глицина (2) и хлорида калия (3).

3.2. Коллоидные свойства хлорофилла

Влияние катионов на электрокинетический потенциал хлорофилла сказывается в области рН>3,3. Из рис. 9 видно, что влияние катионов одно- и двухзарядных металлов на электрокинетический потенциал хлорофилла соответствует их заряду и положению в лиотропном ряду: в ряду

- и -

Na+—>К+—>Mg —>Fe значения электрокинетического потенциала по абсолютной величине уменьшаются.

В водных дисперсиях хлорофилла, содержащих сульфат железа III, происходит перезарядка поверхности. Катионы железа III способны к сверхэквивалентной сорбции вследствие большого заряда ионов. Кроме того, катионы железа в растворе сильно гидролизуются, гидролизованные ионы поляризуются и их влияние усиливается. Это приводит сначала к уменьшению электрокинетического потенциала по абсолютной величине, а затем и перезарядке поверхности. Присутствие катионов железа III также смещает положение изоэлектрической точки (рис. 10), что также свидетельствует об их специфической сорбции. Кроме катионов железа III на хлорофилле специфически сорбируются анионные формы аминокислот, смещая рНИэт в кислую область.

Отличительной особенностью хлорофилла является уменьшение адсорбции гидроксил-ионов при увеличении ионной силы раствора, что связывается с усилением агрегации хлорофилла при увеличении концентрации хлорида калия и соответственным уменьшения числа активных адсорбционных центров.

Аналогично гемоглобину присутствие карбонат-ионов смещает точку нулевого заряда хлорофилла в щелочную область, причем, чем больше концентрация карбонат-ионов, тем сильнее смещение, что свидетельствует об их специфической сорбции. Предположительно СОг в виде гидрокарбонат-иона присоединяется перпендикулярно макрокольцу к атому магния.

❖ Сульфат железа II ■ Хлорид калия д Хлорид магния -1-1-

pH

▲ Сульфат железа III ф Хлорид калия

Рис. 9. Зависимость электрокинетического потенциала водных дисперсий хлорофилла от рН в присутствии хлоридов калия,

магния, сульфата железа II (концентрация солей 5-10"4моль/л).

Рис. 10. Зависимость значений электрокинетического потенциала водных дисперсий хлорофилла от рН в

присутствии хлорида калия (концентрация солей 5-10"4 моль/л, рН задается концентрацией соляной кислоты) и сульфата железа III (рН задается концентрацией сульфата железа III).

3.3. Коллоидные свойства билирубина

В отличие от хлорофилла и гемоглобина билирубин не содержит атома металла и способен образовывать комплексы с большинством двух- и трехзарядных элементов, особенно с (¿-элементами обладающими повышенной комплексообразующей способностью. Так сульфаты железа II и III смещают изоэлектрическую точку в щелочную область по сравнению с хлоридом калия, что свидетельствует о специфической сорбции двух- и трехзарядных катионов железа (рис. 11).

На билирубине также как и на хлорофилле специфически сорбируются анионные формы аминокислот, смещая рНИЭт в кислую область. Смещение изоэлектрической точки на зависимости электрокинетического потенциала от рН находит отражение в изменении устойчивости системы (рис.12): смещение максимума изменения оптической плотности соответствует смещению рНИэт, кроме того присутствие глицина или аспарагиновой кислоты усиливает коагуляцию.

Методом потенциометрического титрования определенно рНтнз=4,7±0,1 билирубина. Также как и для гемоглобина у билирубина происходит увеличение адсорбции гидроксид-ионов при увеличении ионной силы раствора. Карбонат-ионы смещают его рНХ1 говорит об их специфической сорбции.

I, мВ

в щелочную область, что

Рис. 11. Зависимость электрокинетического потенциала водных дисперсий билирубина от рН в растворах сульфата железа II (1) и хлорида калия (2) с концентрацией 5-10"4 моль/л.

Рис. 12. Зависимость изменения оптической плотности водных дисперсий билирубина от рН в растворах хлорида капия(1), глицина(2) (5-10"4 моль/л) для времени коагуляции 1 час.

3.4. Сравнение коллоидных свойств гемоглобина, билирубина и хлорофилла

Сравнивая зависимости электрокинетического потенциала от рН для бычьего гемоглобина, хлорофилла и билирубина (рис. 13), можно увидеть, что для хлорофилла и билирубина изоэлектрические точки лежат в кислой

области, а для гемоглобина - ближе к нейтральной. Такая разница в изоэлектрических точках обусловлена наличием в гемоглобине белковой части. Для исследуемых веществ влияние одно- и двухзарядных катионов соответствует классической теорией ДЭС: они вызывают уменьшение электрокинетического потенциала в соответствии с их зарядом и положением в лиотропном ряду, например, электрокинетический потенциал уменьшается в ряду Ка<К<]У^<Са.

Особенное влияние на электрокинетические свойства хлорофилла, билирубина и гемоглобина оказывают катионы с1-металлов, для которых характерно наличие свободных атомных орбиталей и, следовательно, сильная способность к комплексообразованию. Влияние этих катионов исследовано на примере катионов железа II и III. Билирубин по сравнению с гемоглобином и хлорофиллом, уже имеющими хелатный комплекс, обладает способностью

образовывать комплексы с некоторыми двух- и трехзарядными катионами, поэтому и значение его изоэлектрической точки смещается в щелочную область и в растворах двухзарядного, и в растворах трехзарядного железа (Таблица 2). На положение изоэлектрической точки хлорофилла влияет только трехвалентное железо. У гемоглобина в присутствии сульфатов железа не происходит смещение рНиэт но причине того, что в его составе уже имеется железо, являющееся потенциал-образующим ионом наряду с - МН2 и -СООН-группами.

Для всех трех веществ увеличение концентрации трехзарядных катионов вызывает перезарядку поверхности вследствие сверхэквивалентной адсорбции, обусловленной высоким зарядом катионов и их гидролизом.

Таблица 2.

Значения рНИЭТ водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина в присутствии различных электролитов_

Электролит и его концентрация рНиэт

Бычий гемоглобин Билирубин Хлорофилл

Хлорид калия 5'Ю"4 моль/л 6,5 3,9 3,3

Сульфат железа II 5-10"4 моль/л 6,5 4,4 3,3

Сульфат железа III 5-10"4 моль/л 6,4 4,8 3,9

Рис. 13. Зависимость электрокинетического потенциала водных дисперсий хлорофилла, билирубина, бычьего гемоглобина от рН в растворе хлорида калия 5 ■ 10"4 моль/л.

Таблица 3

Значения рНтт водных дисперсий гемоглобина, хлорофилла и билирубина в растворе хлорида калия и в растворах аминокислот_

Электролит и его концентрация рНиэт

Бычий гемоглобин Билирубин Хлорофилл

Хлорид калия 5-10'4 моль/л 6,5 3,9 3,3

Глицин 5 • 10"4 моль/л 6,5 3,7 2,8

Аспарагиновая кислота 5-10'4 моль/л 6,5 3,6 2,8

На билирубине и хлорофилле специфически сорбируются анионные формы аминокислот, смещая и изоэлектрические точки в кислую область (Таблица 3).

Для гемоглобина характерна адсорбция протонов и гидроксид-ионов, а для хлорофилла и билирубина преобладает адсорбция гидроксид-ионов, что соответствующим образом сказывается на значениях рНтаз. Для гемоглобина (рис. 5) и билирубина наблюдается увеличение адсорбции с ростом ионной силы раствора, а для хлорофилла - обратная зависимость, что объясняется усилением агрегации хлорофилла при увеличении концентрации хлорида калия и соответственным уменьшения числа активных адсорбционных центров.

Установлено, что для гемоглобина, билирубина и хлорофилла значения рН изоэлектрической точки и точки нулевого заряда в растворах индифферентных электролитов не совпадают (Таблица 4). Более кислые значения изоэлектрических точек можно объяснить специфической адсорбцией углекислого газа (Таблица 5), который растворен в воде: потенциометрическое титрование проводилось без доступа углекислого газа в очищенных дисперсиях, тогда как при микроэлектрофорезе и фотометрии использовались дисперсии, содержащие растворенный углекислый газ. Хлорофилл, билирубин и гемоглобин в естественных условиях всегда контактируют с углекислым газом или карбонат-ионами, поэтому в реальных системах их устойчивость к агрегации определяются положением рНИэт-

Таблица 4

Значения рНтт и рНИЗт гемоглобина, хлорофилла и билирубина в растворах индиффирентных электролитов_

Вещество Бычий гемоглобин Билирубин Хлорофилл

рНтнз 7,4 4,7 4,2

рНиэт 6,5 3,9 3,3

ДрН 0,9 0,8 0,9

Таблица 5

Значения рНТнз гемоглобина, хлорофилла и билирубина в растворе хлорида калия и растворе карбоната калия_

рНтнз±0,1

Бычий

Вещество гемоглобин Билирубин Хлорофилл

Хлорид калия 1-10*2 моль/л 7,4 4,6 4,2

Карбонат калия МО"3 моль/л 8,2 7,7 5,5

АрНТНз 0,8 3,1 1.3

Нарушение устойчивости дисперсной обусловлено двумя факторами -агрегацией частиц и седиментацией. Агрегация и седиментация сопровождаются изменением оптической плотности (мутности) дисперсий. Исследование влияния состава дисперсионной среды на устойчивость позволяет определить параметры среды, при которых сохраняются свойства дисперсной системы. Для билирубина и гемоглобина максимум на кривой зависимости ДБ от рН приходится на значение изоэлектрической точки. Область максимума соответствует максимальной агрегации. Если построить зависимость изменения оптической плотности водной дисперсии от значений электрокинетического потенциала, то максимум изменения оптической плотности будет приходиться на значения электрокинетического потенциала близкие к 0 (рис. 6, 10), где между частицами дисперсной фазы будет минимальный потенциальный барьер сил отталкивания согласно теории ДЛФО.

Изучение влияния 1, 2 и Зх-зарядных ионов на коагуляцию показало, что для билирубина и гемоглобина коагуляция происходит преимущественно по нейтрализационному механизму (при изменении поверхностного и электрокинетического потенциалов в зависимости от рН), а для хлорофилла -по концентрационному механизму - при постоянном потенциале поверхности и уменьшении электрокинетического потенциала с ростом ионной силы раствора.

Выводы

В диссертации впервые проведено комплексное исследование коллоидных свойств водных дисперсий гемоглобина, билирубина и хлорофилла, включая исследование электрокинетического потенциала, адсорбции протонов и гидроксид-ионов, устойчивости в растворах НС1, КОН, КС1, №С1, СаС12, М8С12, Н3Р04, К2НР04, КН2Р04, Н2804, С3Н,0(С00Н)3 С3Н50(С00К)3, Ре504, Ре2(304)з, К2С03 глицина и аспарагиновой кислоты при вариации их концентрации и рН дисперсий. При этом получены следующие новые научные результаты.

• Впервые установлено, что одно-, двух- и трехзарядные противоионы влияют на электрокинетический потенциал гемоглобина, билирубина и хлорофилла в соответствии с их зарядом, располагаясь в обычные лиотропные ряды для одно- и двухзарядных ионов. Катионы железа II и III на

билирубине сорбируются специфически. Катионы железа III также смещают изоэлектрическую точку хлорофилла.

• Установлено, что изоэлектрические точки лошадиного гемоглобина равна 6,3, бычьего - 6,5 и человеческого - 6,8. Показано, что положение изоэлектрической точки для различных гемоглобинов определяется составом их белковой части.

• В ряду хлорофилл—»билирубин—»гемоглобин изоэлектрические точки и точки нулевого заряда смещаются в щелочную область с увеличением вклада основных групп. Выявлено, что основной причиной различия рНиэт и рНтаз этих веществ является специфический характер сорбции карбонат анионов.

• Исследование адсорбционных свойств гемоглобина и билирубина показало, что количества адсорбированных ионов И1" и ОН' зависит от рН и ионной силы растворов. По своему влиянию на величину адсорбции Н1" и ОН" ионов электролиты располагаются аналогично их влиянию на электрокинетические свойства гемоглобина. Для хлорофилла наблюдается уменьшение адсорбции Н+ и ОН" ионов с увеличением ионной силы растворов, что объясняется резким усилением агрегации хлорофилла при увеличении концентрации электролита и соответственным уменьшением числа доступных адсорбционных центров.

• Впервые на основе адсорбционных данных вычислено количество функциональных групп гемоглобина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, рассчитаны средние константы диссоциации этих групп: для основных групп рК1=6,1 и кислотных - рК2=9,4.

• Впервые обнаружено, что для билирубина и гемоглобина коагуляция происходит преимущественно по нейтрализационному механизму (изменение потенциала поверхности, а, следовательно, и электрокинетического потенциала в зависимости от рН) и идет наиболее интенсивно вблизи изоэлектрической точки. Для хлорофилла коагуляция происходит по концентрационному механизму - при постоянном потенциале поверхности и уменьшении электрокинетического потенциала с ростом ионной силы раствора согласно теории устойчивости ДЛФО.

• Адсорбция аминокислот, входящих в состав гемоглобина, не влияет на его изоэлектрическую точку, в отличие от их адсорбции на хлорофилле и билирубине. В присутствии аминокислот их изоэлектрические точки смещаются в сторону уменьшения рН, что свидетельствует о специфической адсорбции анионных форм аминокислот. Для дисперсий билирубина присутствие аминокислот усиливает коагуляцию: коагулирующая способность возрастает в ряду хлорид калия - аспарагановая кислота -глицин.

Статъи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах HCl и KCl // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т.30. - №6. - С.103-107.

2. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Электрокинетические свойства хлорофилла в водных растворах 1-, 2- и 3-зарядных катионов // Бутлеровские сообщения. - 2013. - Т.34. - №6. - С.130-134.

3. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах 1-, 2- и 3-зарядных ионов // Бутлеровские сообщения. - 2013. - Т.34. - №6. - С.135-140.

4. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Влияние состава дисперсионной среды на устойчивость и электрокинетические свойства билирубина / Е. Ю. Родионова, И. Б. Дмитриева, А. С. Чухно // Бутлеровские сообщения. - 2014. - Т.37. - №1. - С.55-61.

Прочие публикации по теме диссертации:

5. Крайник И.И., Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б. Исследование электроповерхностных свойств водных дисперсий гемоглобина // Молодой ученый. - 2014. - 14-1. - С. 20-24.

6. Дмитриева И.Б., Родионова Е.Ю., Чухно A.C. Изучение реологических свойств гемоглобина // Научно-практическая конференция, посвященная 65-летию факультета промышленной технологии лекарств: сборник научных трудов. Часть 1. - СПб: Изд-во СПХФА, 2010. - С.52-55.

7. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б. Электроповерхностные свойства билирубина // Межвузовская научная конференция, посвященная 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова и 150-летию создания A.M. Бутлеровым теории химического строения органических соединений. -СПб.: Изд-во СПХФА, 2011. - С.67-68.

8. Родионова Е.Ю. Электроповерхностные свойства гемоглобина в водных растворах однозарядных электролитов // Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» Ч.И - СПб: Изд-во СПХФА, 2012. — С. 1617.

9. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Определение изоэлектрической точки природных порфиринов // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2012» / Отв. ред. А.И. Андреев, A.B. Андриянов, Е.А. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. - М.: МАКС Пресс, 2012. - Секция Химия. - С.466.

10. Назипова А.Р., Алиева Е.А., Базанова H.A., Дергунова A.C., Чухно A.C., Родионова Е.Ю. Изучение устойчивости хлорофилла // 16 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - 2012. -С.473-474.

11. Сенина A.C., Силаева Д.С., Кошевенко A.C., Чухно A.C., Родионова Е.Ю. Изучение физико-химических свойств хлорофилла методом непрерывного потенциометрического титрования // 16 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - 2012. - С.476-477.

12. Родионова, Е.Ю. Влияние 1-, 2- и 3-зарядных ионов на электрокинетические свойства гемоглобина // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2013». - М.: Макс Пресс. - 2013. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM).

13. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно A.C. Влияние одно-, двух-и трехзарядных катионов на электрокинетические свойства хлорофилла / Е. Ю. Родионова, И. Б. Дмитриева, А. С. Чухно // 17 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - 2013. - С. 146-147.

14. Алексеева В.А., Егорова М.С., Родионова Е.Ю. Изучение адсорбции Н* И ОН" ионов на бычьем гемоглобине //17 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - 2013. - С. 256.

15. Родионова, Е.Ю. Электрокинетические свойства водных дисперсий хлорофилла // III Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - СПб: Изд-во СПХФА, 2013. - С. 269.

16. Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б. Электрокинетические свойства водных дисперсий билирубина // I Всероссийская научная конференция с международным участием «Инновации в здоровье нации». - СПб: Изд-во СПХФА, 2013.-С. 191-193.

17. Егорова М.С., Родионова Е.Ю. Влияние электролитов на адсорбцию протонов и гидроксил-ионов на бычьем гемоглобине // IV Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - СПб: Изд-во СПХФА, 2014. -С. 531-534.

Подписано в печать 22.12.14 Формат 60x48 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. 197022, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр. 54 Типография «Сан Принт»