Конкурентные интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИМ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВВДШ УНИВЕРСИТЕТ Имени 111.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 541 (64+-183.12).53?.77

ШРЯКОВА Маряиа Вледимировна

КОИСУРЕНТШЕ ИИГЕРПОЛМЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ ДНК

02.00.06 - ХИМИЯ вис:окомол0кулярни* соодинопий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ив соискания ученой степони кандидата химических наук

МОСКВА - 19У5

РГБ ОД

е ■ • • - г г

Работа выполнена на химическом (1якугш«1ге -^зсковекош дарствонного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, в.и.с. В.А.Изумрудов;

кандидат химических наук, доцент С.И.Кергов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор И.М.Пенисов;

доктор химических наук, профессор Ю.М.Евдокимов

Видущая организация: Иедако-генотичеекий научный центр

Российской Академии Медицинских наук

засед . гееским наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: И9899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, яуд.601.

С диссертацией моасда ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им, М.В,Ломоносова.

Учения секретарь специализированного

совота, кандидат химических наук Т.К.Броиич

&о

час. на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Известно, что метаболизм и Функционирование клетки кяк целого в значительной море определяйся процессами образования и разрушения полиэлэктролитних комплексов - ггртдуктоп взаимодействия биологических полимеров противоположного знака заряда. В подавляпцем большинстве случаев яти процессы сопряжены с шггорполиэлектролитнимя реакциями обмана и замещения, сопропож-даемнми переносом заряженных макромолекул. Это обусловливает важность выявления общих кинетических н тормодалймлчепких факторов, ответственных па перестройку и перегруппировки биологически значимых макромолекулярных структур. Ввиду сложности биологических объектов путь к решению ятой проблемы пролеггет через исследование модельных систем, включащих как сиитетическио, так и природные полизлектролити.

Особое место в ряду таких модельных исслодовя>«гЯ звнимяют работы по изучен:«» растворов ДНК-соде рзеотих поли п л о ктролнтш/ х комплексов (ПЭК). Известно, что ПЭК природных поликатионов (протаманов, гистонов и др.) с ДНК служат важиеЯиими структуртмя олементамя упаковки генетического материала в клетках. Закономерности образования подобных элементов я их превращений - .'¡то, по-видимому, предмет Фундаментального исследования не только молекулярных генетиков, но и физикохимиков. Еще одним аспектом, привлекающим внимание к изучению ДНК-содоржотщх ПЭК, является перспективность их использования в биотехнологии и медицине. Это делает изучение модельных конкурентных интерполизлектролнтшх реакций в растворах ДНК-содортяч;их ГЕК, впервые предпринятое в данной работе, актуальной задачей.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в обнаружении и изучении шггернолиэлектро-литной реакции конкурентного связывания аниона ДНК и синтетического полианиопа с поликатиоцом а в выявлении Дикторов, влияпщих на кинетику и равновесие такой реакции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе на примере системы - флуоресцентно моченный полиметакрялатннй атгион (ПМЛ*) / поли-Ь'-зтил-4-вюгал-пиридгашевнй катион (ЛЭВП) / ДШС - впервые обнаружено дротеканиё" интерполизлектролитноа реакции замещения с участием водорастворимых нестехиометричных ПЭК (НПЭК) и ДНК. На основании результатов кинетических исследований подобраны условия (степень полимеризации полиионов, ионная сила раствора), при которых равновесное состояние в этой системе устанавливается за рвзуишое время.

Проводано систематическое изучение равновесия реакции кнтер-полиэлоктролитного зимецегтя в найденных условиях. Впервые показано, что изменением концннтрации и природа вводимого низкомолекулярного катионе, а также варьированием стопе ни полимеризации синтетических подикетиона и полнаниона (а точнее, соотношения их степеней полимеризации) можно эДОоктивно контролировать направление конкурентного связывания. В рамках термодинамического рассмотрения обсуздвни возмтвшв причины влияния обнаруженных факторов иа положение равновесия конкурентного замещения.

Исследованы реакции комшюксообразоваяия ДНК с (0ио)щщ1-котио?1ями в присутствии ^туоресцентного зонда бромистого этидия. Нпврныо показано, что электростатически связывавшиеся с ДНК положительно заряженные макромолекулы могут вытеснять интеркалироваи-ные молекулы зонда из двойной спирали в раствор. Выявлены условия. при которых такое вытеснение имеет место. На основании полученных результатов предложен новый перспективный путь исследования конкурентных реакций с участием нуклеиновых кислот (или шс аналогов) и заряженных объектов, в том числе и неполимерноЯ природа.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Обиаружошше в работе факторы, влияи^и» на кинетику и равновесие изученной реакции, является средствами эф^ктивного контроля конкурентного замещения. Эта информация необходим» для надавленного синтеза ДЩ-содержащих ПЗК. с заданными свойствами и прогнозирования поведения таких коы-струкциЯ In viuo. Практическая значимость ПЭК определяется их способностью повышать эффективность транслокации ДНК-шгазмид и адресной доставки генетического материала в клетки, а также защищать ДНК от расщепления клеточными нуклоазами (Кабанов A.B. и Др., 1991).

Полученные в работе результаты исследований смесей растворов ДНК-содораадих ПЭК и бромистого этидия могут иметь важное практическое значение для разработки систем рязЛелешя и очистки многокомпонентных биологических смесей и для создания простых, высокочувствительных и экспрессных методов диагностики. АПРОБАЩШ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации докладывались на 7-й Всесошной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 г.). 1-м немецко-российском симпозиуме по полимерам (Москва, 1993 г.) и не 35-м Международном симпозиуме Ш1ЛК по полимерам "Мякроякроя-94" (США, Акрон, 1994 г.). ПУБЛИКАЦИИ. Ito материалам диссертации опубликованы 3 стзтьи.

о.-

СТРУКТУРА И ОБЫМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из впадения, обзора литврптури, эксперимэнтальной часта, результатов я та обсуаденич. выводов н списка цитируемой литорптури ЦОД наименования). ГаОота изложена на 169 страницах, содпряит 41 рисунок и 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕКШИЕ РАБОТЫ

Во вводошш обоснована актуальность томи диссертационной работа, отре.тт/ о в научив я новизне и прйктотоская значимость.

обзор литерлоты

В этой главв проанализированы имеющиеся дпшшо о реакциях образования полиэлектролитшх комплексов из рззноиме!шо зоряжвн-них синтетических полиэлвктролитов. структуре и свойствах ГШ, ггатерполиэдектролйтшх реакциях оСмпаа и зпмецмгля с 1« участием, методах исследования кинетики и равновесия тяких реакций. Особое тшштм& уделено ряботам, посвящ,вмшм исслодоввнив комплексов Д1И с поликатионами и взэимодойстш» Д1-£К. с Оромистшл этидирм.

ЭКСПЕРКМЙГГАЛЬНЛЯ ЧАСТЬ

Приведет! способа получения и основние характеристики объектов исследования, отгасанн методики получения растворов ¡голл-электролатсшх .комплексов (в том числе ДНК-соде ржвдх ноли-кокплексов). Представлены использованные в рябото «{мчико-химичвскяэ метода исследований.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В а той главе обсуждсотся результаты кинетических измерений в дпщше по исследовании равновесия иптерполизлектролитнаИ реакции н смесях растворов НПЭК(ПМА*-ПЭВП) и ДИК. рассматриваются факторы, влиящио на скорость и направление конкурентного связывания, а тяга» особенности реакция комшшссообразевания в растворах ДНК, (био)поликятиотов и бромистого этидия.

Для исследования конкурентной интерполиэлектролитноа реакции в растворах ДНК-содержащих НПЭК использовали метод тушения флуоресценции, пользуясь свойством пирвдшшевых групп поля-Н-атил-4-винилпиридиниввого катиона эф|»ктав1ю тушить флуоресценция) шре-нових меток, ковалентно связанных с цепь» полиматакрилатного аниона.

За ходом штерналиэлектролитного замещения

ШЭК<ПМА*-ПЭВЯ) + ДНК <====> НГСЩД1Ш-ГШП) + ПМА* (1)

следили по юмтшшш интенсивности флуоресценции I смесей растворов соотвотствуицих ШЭК и полианиона (ДШ или ПМА*). так как перенос участков целей цоликатиова-тущятэля ПОВП с молекул ПМА* на ДК1С или и обратном направлении сопровождается изменением числа контактов мотка-тушитель. 1МА*-штон в условиях опытов (рН 9,5) полностью ионизован. Степень полимеризация (молекулярная масса) /I:К но н<::&х экспериментах была постоянна и существенно превышала стг!шШ1 полимеризации синтетических полиаояов.

Рассмотрим в качестве примера реакции Ко'СГ

ШЮЧС1Ш'100-Гй&1^0) + ДНК <=-=•=> НПЭК(ДНК-ПЭВП30) + ГШ*100. (2) в которой ДШ( и полианиты ЯУА*100 со средне весовой степенью ло-лимнризаиии Ря - 2.100 конкурируют за связывание с относателыс коротким (средаечиоловая степень полимеризации Рг = 30) ноликата-оном ПЭВП30 в растворах с различной концентрацией хлористого »атрия (Ми' - Ка*"). Результаты представлены на рис.1 в виде зависимо стл относительной интенсивности флуоресценции растворов реакци-о.>сих смосои I/I я раствора ШЭК(ПМЛ*~ГОВП) (10- интенсив-

ность флуоресценции раствора ПМА.* той же концентрации и в тег же условиях) от концентрации соли. Из положения начальных точек кривых 2 иЗ следует, что дооавлшше ДНК к раствору ШЭК(ПЛА"-ПЭВП) (кривая ?), равно как и 1ПШ(ДНК-ПЭЬП) к раствору ПМА* (кривая 3) не приводит к изменению интенсивности флуоресценции, то есть в отсутствие нязкомолекулириого электролита рпакция (2) но идет. В этом отноцошга поведение этой системы не отличается от поведения систем, построенных из гибкоцепных иолиионов, в которых илтерпо-ли.члект];юлитные реакции в отсутствие соли кинетически запрещены.

Введение в ему с и хлористого натрия, шзипэяцэго разрушение части солевых связей и ослаблямцэго интерполиэлектролитное взаимодействие, еопровоздается изменением интенсивности «{щуоресцец-ции. Начиная с некоторой концентрации соли кривые 2 и 3 на рис.1 сОлаяиются, а при (КаСИ ^ 0,1 И они практически совпадет-. Это свидетельствует о протекании интерполиэлектролитной реакции (2) и означает, что при [!.аО)1 > 0,1 К за время с момента приготовления растворов и до измерения (24 часа) в этой системе успевает установится равновесное состояние.

Итак, область изменения ионной сили раствор», доступная ' для изучения равновесия реакция (2). ограничена слева значением

Т/Д' 11%

о.е -

о.в

0.4

0 8

0.0

0.1

02

0.3

0.4

Рис.1. Ьаписимость относительной кито.чсивности ^уо-ресцонции Г((/10 в рястпоре

ШШ|Щ'100-[ШП30) (1) и

Г/% О

смосях

Ш1ЭК(11МА',00-ПЭВП30

растворов ) И Д11К

(2) и

ШЕщдак-пэвп.

растворе 1ЬМЛ* 100 и

) (3) от кон-

30

центрпцул МаС1. 1П'АА* 1 - ПМ = 4-10"° М. <р О,Л. 0,01 М ?рис~ОДг>р, рН 9,5. 25°С. К = 3« нм, К = 396 км.

6О30 . рсг.

Пупктиршш участки кривых соотгю тс тпу »т кинотич оски заторможенной области эксперимента.

Рис.2. Кюютичоскио кривые прямой роакцю» (2) в растворах 1ШЭК(ША2100-ПШГ30) и ДНК (1-3) и в растворах

шш(днк-говпэо) и гмл*100

(1 * —3'> при различных концентрациях- КаС]: (N401] = 0,125 М (1 И Г ). 0,2 М (2 и 2') и 0.25 И (3 я 3'). Условия те жв, что и рис. 1. Пунктирные» участки кривых соответствую? "мертвому вро-мшш" эксперимента.

48 чес

ч. 0.8

0.4

0.2

п

Рис.3. Зависимость р.'зпновос-ной степени превращения ^ в

реакции (2) от кошдэнтр'-ции с0.ч11 ШеС1): Ме = Ка (1 и Г ), К (2 и 2') и Ы (3 и 3' ). 1.2.3 - нотшшая ДНК. Г,2',3' - денатурированная ДНК. Условия те ЖГ), что и на рис.1.

о.зо [иссз]. и

(Ма01) а 0,1 И, шгаго которого исследование затруднено по кинетическим причинам. Правой границей является значение концентрации (№01] а о,26 М, выше кото[юго наблвдается резкий рост 1ы/10 (риси, крива« 1) из-за разрушения НПЭК(ПМА'-ПЗВП).

Из рш;.1 также следует, что при ШаСИ а 0,1 М значения 1/10 растворов смесей (кривые 2,3) и 1н/10 раствора НПЭК(ПМА*-ПЭВП) (кривая 1) практически совпадают. Зто значит, что равновесие реакции (2) нацело сдвинуто влево. Дальнейшее добавление соли приводит к увеличению значения 1/Т0, в при (КаС1) а 0,25 М, то есть на правой границе области доступных измерений, оно достигает ум» значительной величины, 1/10 а 0,8.

Пользуясь данными рис.1, можно рассчитать глубину превращения г) в реакции но формуле

находя величанн 1/10 из кривой 2 (или 3), в - из кривой 1.

Полученный таким образом профиль реакции (2) приведен на рис.3 (кривая 1). Нзддо, что замеаюние участков допей 11МА* в комплексе на учястки ДНК осуществляется кооиеретнвно, в достаточно узком интервале возрастания концентрации №С1.

Таким образом. методом тушения флуоресценции удается уверенно фиксировать нротекение интерполизлоктролитной реакции в смеси растворов 1Ш\ ПЭВМ и ДНК.

Тот же подход позволяет изучать кинотику этой реакции. Опиты проводили. добавляя раствор соли в смесь растворов ШШ(1МА*-ШВП) и ДНК ш, соответстаоиио, в смесь ИШДДЖ-ПЭВП) и 1!МА* и непрерывно измеряя I. На рис.2 приведены полученные таким обрезом кинетические кривые прямой (1-3) и обратной О'-З') реакции (2) в виде зависимости степени конверсии (] прямой реакции от концонтрвцин соли. Видно, что скорость обоих реакций существенно возрастем с ростом ионной силы раствора. Подобное ускорение инторшлиллектролитных реакций вводимыми малыми ионами хорошо известно для систем, оорпзовянных гио'коцешыми лоляиоиями.

Отличительной чертой интерцолизлектролитных реакций в растворах жестких двухенирялышх молекул ДМ является заторможенность процессов обмена и замощения. Так, скорость реакции (2) в 0,05 Ы ЯаС1 исчезааце мала, тогда как в смесях Ш1ЭК(ПМА'-ИЭВП) и гибко-цепного полианионч (цолифосфятного или нолиотиролсульфонзтного) время установления равновесного состояния при той же концентрации соли не превышает нескольких десятков секунд (Изумрудов В.А. и др.. 1988).

Увеличение стэшм полимеризации поликатиопа приводят, пик и в случяо гибкоцопшх полдаоисп, к замедлению шггерполизлжтролит-пой реакции. Однако, темп этого замедления оказывается гораздо болео высоким. Так, о ели в 0,25 М NaCl в систем» НМЛ* / ГОВП30/ДНК равновесие устанавливается зз время смешения рпагентоп (рис.2, кривые 3 И З'), то в системе галл2100/1ТЭВП /ДШ. то ость при пйраздпшниа цопи голмкатаопа всего в 4 рпзя (Ря = 130), ргт новоспоо состояние при тоЛ .тс концентрации соли па достигнутая даже в течение нескольких суток.

Столь медленное протекай;«» реакции затрудняет оо иседодош»-ияо, накладывал ограничения на длину догм ПЭВП. Изучит!, равнопе-сие реакции (1) с участием относительно высокомолекулярного ПЭВП|30 нем удалось лишь поело апмнгп« ilMAj(00 на короткий ПМЛ*0. Время установления равновесия реакции

Wo4 С Г'

ШЭК(ША*0-ШВП,30) + да НПЭК(ДНК-ПЭВП,30) + ПМА*0 (4)

в подло-солевых рястворах не превышало од;пк суток.

Указанные различия согласуются с известными представлениями о механизме земощопия полнионов в растворах НПЭК, согласно котором перенос полинатюна осуществляется при благоприятной подстройке копформацпЗ взаимодейстоугадах клубков ¡ШОК и полишшша и соответствующей перегруппировке кооперативной системы мехцопшх солевых связей в образующемся объединенном клубке. Попятно, что повышенная жесткость полиионов, в данном случае ДНК, затрудняот такой перенос.

Сложный характер кинетики штерполизлектролитной реакции (рис.2) не позволяет описать ее в терминах простых кинетических уравнений реакций первого или второго порядков. D первом приближении она может быть представлена суммой двух акспопент. Похожие результаты были получены при исследовании кинетики реакции замещения в системе ГОДА'у^/ПЭВПд^/полиэтиленсульфонат (Ря = 1300). Быструю стадию процесса, наблюдаемую сразу после смешения полимерных реагентов, приписывали реакции образования обгедицэнщх клубков, а медленную - перестройкам внутри них. В случае ДНК могут идти то же процессы, осложненные жесткостью двойной егшрали и невысокой скоростью ее конформационных превращений. Выяснение этих вопросов млеет фундаментальное значение для понимания механизма конкурентного связывания и требует специальных исследований, выходящее за рамки данной работы.

На основании кинетических измерений в каздой из изучошшх

систем подбирали условия, при которых равновесное состояние ?<> ведомо достигалось за сутки. Измеренные через 24 часа с момента приготовления растворов величины I, в значит и рассчитанные и:? них значения q, имеют смысл равновесных (Ie, qe).

Перейдем к рассмотрению результатов исследования равновесие реакции (2) и Акторов, влиямцих на него.

Ня рис.3 приведши зависимости qö, рассчитанные по формуле (3) из значения от концентрации хлоридов различных щелочных металлов IMoCl]. Вадю, что в области концентраций, па три и более порядка прев, чияглцих концентрацию звеньев взаимодействующих полиэлектролитов, положение равновесия реакция (2) решаидам образом зависит от химической природа вводимого катиона. В частности, при иошюй сило 0,25 Ii, создаваемой добавлением I1C1, ояо почти полностью сдвинуто шит: практически свободная ДНК сосуществует с 1!ПЭК(ПМЛ*-ПЭВН) (кривая 3), тогда как в растворах NaCl той я» концентрации (кривая 1) оно существенно сдвинуто вправо, то есть в сторону образования ШЭКЩНК—ПЭВГ1), который сосуществует с практически свободным ГШ*. Промежуточная ситуация реализуется в растворе KCl (кривая 2).

Таким образом, простой замени катионов одного щелочного металла нп катионы другого достаточно, чтобы вызвать кардинальную реорганизацию в систем« ПМА'/ПЭВП/ДНК, например, блокирование фрагментов ДНК полик«тионами путем их переселения из комплекса с ¡14А' и. наоборот, ее полное или частичное деблокирование в результате переноса поликотиоаоя в обратном неправленая.

Аналогична эффект был обнаружен ранее для системы НМЛ'/ ГОЫ1/нолифосфатша üiraoH (ПС), но с той лиль разницей, что способность катионов смещать положение равновесия (2) вправо ослабевает в ряду Na4 > К' > Li* (рис.3), тогда квк для реакции с участием М такой ряд имеет вид: LI' > Na' > К* (Изумрудов В.А. и др.. TJSd).

Представай изменение свободной энергии в реакции (1) в виде

- 60. - AG + AG , (5)

Р с

где член ДЦр относится к замене контактного взаимодействия ША*-ПЭВП на взаимодействие ДНК-ПЭВП в отсутствие пизкомолекуляр-шх ионов, а AGc - разность свободных энергий взаимодействия назкомолйкулярпих противоионов с фрагментами полианиопов. Которые участвуют в реакции (1). Слагаемое Aüp по определении не зависит на от природа, ни от концентрации низкомолекулярных яротипоионов и поэтому но может быть ответственно за смещение равновесия. Сле-

доватедьпо, обращение знака tfi, которое следует из сравнения кривых 1 и 3 на рис.3, обусловлено изменением 4G , то ость различием свободных энергий взаимодействия вишнев ШЛ* и ДШ с вводимыми низкомолекулярнияи катионами различной природы.

Как следует из кривых разрушения ИШ <ДЖ~ГОВП,0) в растворах КеС1 (см. ряс.б, кривые г-3'), ряд связывания катионов с ДНК имеет вид Ы' > Na* > Местонахождение иона Li+ в этом ряду, диаметрально противополоаное ого положенно в рад' связывания катионов с фосфатным» группами Ш>. обусловлено извсстннм аномально высоким сродством Ll+ к двухсшгралыюй молекула ¡штанной ДИК. Можно полагать, что на фоне незначительных различий в свободной энергии взаимодействия анионов ПМЛ* и ДНК с вводимыми катионами, как это слодуот из близости кривых разрушения соответствующих НГОК в водно-солових растворах, этого дополнительного средства катиона Ы+ к ДНК оказывается достаточным для предотвращения переноса ПЭВП-катионя с макромолекул ПМЛ* на Д)П' в растворах L1C1 (рис.3, кривая 3). В пользу этого свидетельствуя« результаты про-делашшх нами огштов с участием денатурированной Л}¡К, приведенные на рис.3 (кривые Г-3'). Видно, что замена нативкой ДНК на дена-турированнув практически не отражается на положении равновесия (2) в рэстворах NaCL (кршые 1,1') И KCl (кривые 2,2'). Однако, в растворах ЫС1, где нативная ДНК исключается и:> интерполизлектро-литного взаимодействия (кривая 3), денатурированная ДНК, не обладающая столь высоким сродством к LI*, оказывается способной к конкурентному связыванию с полшсатионом (кривая 3'), что согласуется с приведенной вине схемой рассуадений.

Мы исследовали влияние степени полимеризации синтетических полиионов на равновесие реакции (1). Результаты приведены на рис.4 в вида зависимости qe от концентрации NaCL '(рис.4а), KCl (рис.46) и L1C1 (рис.4в) в системах R4A*tС0/ПЭВГ1;)0/ДНК (кривые 1), ШЛ;г0С/ПЭЫ130/ДНК (кривив 2), ЛМА*0/1Ш!730/Д!« (кривые 3) и ПМА* /ПЭВП110УДЛК (кривые 4). Как следует из этих рисунков, степень полимеризации полиэлектролитов Р„МА» и РПЭВ11. а точнее их соотношении Ф = ?ПМ4* / Гп?вп' може,г оказывать существеннее влия-пис на положение равновесия реакции (1).

При переходе от 3> » 1 к Ф < 1 во всем лселедовшшом интервале концентраций простых солей равновесие в реакции (1) смещается слева направо. Так, например, в 0.1 М растворе Naß] равновесие реакция (2) практически полностью смещено влево, тогда как равновесие реакции (4) в тех же условиях сдвинуто вправо более чем на

Ч. 1.0

0.00 (Ш (ГТо <Г7б ¡ПК о!б (По [Н«С1], М

ч. 1.о

о.а

(в)

°'о.(к1 ~¡ГЗв а£Г о.Зо [кст], к

ч. «.о -

П

|.г

о.йб ' о.Го "о.& То.&" оЗо [иа], и

Рис.4. Зависимость равновесной степени превращения че в реакции (1) от концентрации соли N»01 (а). Ш (й), ЫС1 (в) в различных системах: Ш*100/ПЭВНЗС/ДЖ, ® = 70 (1). ¡Ш'1гог/иЭВ111Г/ЛШ1, Ш -

40 (2), 1В1А^0/шап30/днк, Ф - 1.7 (3) и ША*0/ГОВП130/ДНК, Ф =

0.38 (4). Условия те же. что и на рис.1.

о.а -

о. г

о.в

70',?, как видно из сравнения кривых 1 и 4 ня рис. 4а. Качественно аналогичная кортина наблюдается и в растворах других солей, что следует аз сравнения кривых 1 и 4 на рис.¿6 и 4в. Вместо с том, в области Ф » 1 переход от Ф = 70 к 9 = 40 практически пе влияет че положение равновесия (1) (кривые 1 и 2 иа рио.4).

Поскольку в исследованном интервале концентрация соли все индивидуальные 1ШЭК устойчивы, общее число межцетшх солевых связей в системах, а значит и число выделяющихся малых противоионов. не зависят в данных условиях от степени полимеризации полиионов и от ® и сохраняются примерно постоянными. Поэтому нвблвдаомсе смещение равновесия реакции при варьировании ® нельзя отнести за счвт составляющей ДСо в уравнении (5). По той то причине его нельзя отнести и зэ счет энтальпийной соетовлящей в уравнении _

(6)

параметра

¿0 = ДН - ТЛБ . р р р

Следовательно, причшту надо искать во взаимосвязи

Ф с энтропийной составляющей ЛБр. Эта связь лопсо просматривается, если принять во внимание возможное изменение числа полимерных частиц при сдвиге равновесия в реакции (1).

Пусть в выбранных условиях равновесие реакции (1) оказывается сдвинутым справа палево, как это имеет место, например, в реакции (2) в 0,1 М растворе ШС1.

Очевидно, что в случае, когда Р{МА» значительно превышает РПЭЕП, то есть Ф >> 1, число полимерных частиц в системе не зависит от положения равновесия (схема (7)). Соответственно зависимости с^ от концентрации соля практически совппдоют друг с другом (рис.4, кривые 1 и 2).

ПИЛ

нпж

ДНИ

ПМЛ

В случае, когда Р^. < Рговп, то есть 'Г

I,

ДМ

смещегае рав-

новесия в реакции (1) слева направо приводит к увеличению общего числа полимерных частиц в системе, то есть к увеличению АБ^ (схема (8)).

Такая ситуация, в частности, реализуется в реакции (4) и обусловливает практически полный сдвиг равновесия слава направо в 0,1 М КаС1.

пзап

f-

-т. f~

mA^j

нпук

В случае, когда Р,

м

ПМЛ*

ДИК НМД" дни

ма* и Ргозп соизмерим«, то есть фи 1, оОз,ее число полимерных частиц в системе, на перни Л взгляд, также не должно зависеть от положения равновесия в реакции (1). Однако величины с^ в реакции

ГОВ!130) *■ ДНК <==

НШК{ДНК-ПЭВПз0) + ШЛ'0 (9) при всех исследованных ШеСИ выше, чем в реакции (4) (как видно из срашюиия кривых 3 и 1 на рис.4). . Кажущееся противоречие с приведенным выше термодинамическим объяснением снимается, если принять во внимание ранее установленный факт ассоциации растворимых кг1эк. образован! IH ми полигонами с близкими сто пешки полимеризации (Зозин A.B. и др, 1984). Тогда очевидно, что при протекании реакции типа (9) слова направо общее число полимерных частиц в системе, а следовательно, и ASp должны возрастать (схема (10)).

и

Н1Ш ДНК ПМА' ДНА

Это, по всей вероятности, и обусловливает сдвиг равновесия вправо при замене на ПМЛ^0 в исходном НИЭК(ПМЛ*-ПЭВП30).

Итак, из изложенных выше данных следуют два важных вывода. Во-первых, с.ущеетвешше перестройка НГШ, в том числе включающих ДНК, могут происходить в результате кооперативных интерполиэлектролитных реакций, контролируемых концентраций и природой низко-молекулярних протшюиопов. И во-вторых, конкуренция между поли-ионым в этих реакциях существенно зависит от соотношения степеней полимеризации. Из г;того следует, например, что связывание Д!И с положительно заряженным;» макромолекулами ш ее освобождегае из таких комплексов могут контролироваться факторами расцепления или укрущешш взаимодействующих мяк]>омолекуляршх партнеров. Послед-

няя ситуация часто встречается ln vivo, гдо роль таких факторов могут играть специфические форме irai.

В работе исследовано комшгаксообразовяние ДНК с (био)полика-тионами (ПК) в присутствии бромистого этидая (БЭ). Получешше результата покэзнпавт, что использование этого флуоресцентного зонда позволяет изучать равновесие и кинетику интерполнэлектролитпнх реакций с участием лпбих полизлектролнтов, но прибегая к трудоемкому синтезу (Jmyopecueimio меченных образцов и не ограничиваясь применением поличеров-тугсителей, как зто делалось в описашшх до сих пор экспериментах. Ноковалентное связившше БЭ с ДНК позволяет избежать сложной процедуры ковялентной "пршгившГ меток, используемых при изучении ДНК и ее соединений флуоресцентными методами.

Добавление наташой ДНК к раствору БЭ приводит к резкому увеличении интенсивности фяуоресцеицип I зонда из-за шггеркяляции его молекул между парами основания двойной спирали ДНК и образования комплекса (ДНК-БЭ). Резкий рост I наблюдается вплоть до соотношения г = (ВЗ }/1Р Î = О,?., гдо Г БЭ 3 -и (?) - модяртш концентрации БЭ и фосфатных групп ДНК. Одновременно меняется вид спектра поглощения зондз: по мере введения ДНК происходят смещение максимума поглощения от А. = 4£Ю m к А = 520 нм. На спектрах отчетливо видна изобестическая точка при А. = 500 им, свидетольствунцая о сосуществовании БЭ в свободном и и связатшом с ДНК состояниях. При г < 0,2 вид спектра практически не меняется, то ость весь зонд находится d связанной форме.

Опыты по изучению компдексообразоваиия ДНК с ПК в присутствии БЭ проводили, добавляя в рзствор комплекса (ДНК •БЭ ) состава г - 0,2 различные количества ПК - синтетического поликатиона, полипептида или основного белка (то есть белка с большим количеством положительно заряженных остатков в аминокислотной последовательности). Смесь инкубировали 24 часа и измеряли I.

Результаты приведены на рис.5 в виде зависимости I от соотношения <р - iriKJ/LP¡ (где ИЖЗ - молярная концентрация положительно заряженных груш ПК). Видно, что с ростом <р значегага I падает, причем это происходит при добавлении всех использованных нами ПК - будь то эффективны Я../тушитель флуоресценции ПЭВН (кривая 1 ) или на обладамцие этим свойством линейные синтетические поли -катионы - 5,6-ионен бромид (б,6-И) (кривая 2) и поли-N.N'-ди-метиддиаллилиммошлй хлорид (ПДМАА) (кривая 3), полипептид гидро-

бромид иши-Ь-лизина (IUI) (кривая 4), основные белки - гнетон Н! (Н1) (кривая 5) и проташнсульфат (ПАС) (кривая 6). Более того, во всех случаях, за исключением ПАС, наблюдается сходное изменение I по мере добавления раствора I1K - экспериментальные кривые 1 -6 состоят из двух практически линейных участков с разными наклонами. Значение составе смеси, соответствующее точке излома, является характеристическим для каждого ПК. Обозначим его .

Рассмотрим изменение состояния комплексных частиц до и после точки излома на примере системы ДНК/БЭ/ПЭВП.

Титрование раствора комплекса (ДНК-БЭ) раствором ПЭВП в области ф < фс (для этой системы фо а 1,0) сопровождается изменением спектра поглощения, максимум которого с ростом <р смещается от значения 520 им в коротковолновую область. На спектрах обнаруживается изобестическая точка, длина волны которой А, = 5t0 им отличается от длины волны изобостической точки на спектрах смесей ДНК и БЭ, Л. = 500 нм. Это несовпадение указывает на то, что в смесях ПЭВП и комплекса (ДНК• БЭ) при <р < <ро сосуществуют две формы БЭ, ни одна из которых не соответствует свободному красители. Разумно приписать одну из этих Форм молекулам вовда, штеркалировашшм в не связанные с ПЭВП участки ДНК, а другув - молекулам БЭ, которые встроены в участки тройного комплекса (ДНК-БЭ-ПЭВП).

Доказательством svoro служат результаты седимэнтациснннх исследований смесей комплекса (ДНК• БЭ) ц ПЭВП, в которых распределение зсада по седаментирущим фракциям определяли сканированием при К - 510 нм. На седиментограммах растворов, соответствующих введению 1ВВП вплоть до <р а о,5, обнаруживается один пик. Он соответствует растворимому HII3K (ДНК • БЭ-ПЭВП), который образуется в результате равномерного распределения ПЭВП между частицами комплекса (ДНК.'БЭ). При ф > 0,5 система даспропорциоаирует на частицы двух типов. С ростом ф доля медленноседаментаруицих частиц падает, бистроседиментирухщкх растет, а при ф 3 <ро практически весь БЭ обнаруживается в быстроседиментируюцей фракции. Диспропорцио-нирояаиие в смесях ДНК и ПЭВП наблшдвли авторы работ (Miller I., Fach В,, 196в; Кабанов A.B. и др., 1989), которые показали, что при ф ; 0,5 в растворе сосуществуют частицы НПЭК(ДНК-ПЭВП) и бы-строседиментируетцие частицы комплекса, обогвщенного поликатионом,

Итяк, при составах смесей комплекса (ДНК-БЭ) и ПЭВП, соот-ветстаувдп первому участку кривой фшу&риметрического титрование (рис.5, кривая 1), свободного зонда в растворе нет. Молекулы БЭ вкда-.ены либо в ННЭК, либо в комплексные частицы, . существенно

обогащешшо поликатионом.

При пароходе за критический состав, то есть при ф > 1,0. на спектрах поглощения появляется полоса с максимумом при А. - 480 чм, характерная для свободного БЭ, а на седимеятограммах присутствуют практически неседиментируициа молекулы несвязанного красителя, доля которых растот с ростом (р. Это означает, что второй участок кривой фяуориметрического титрования с большим наклоном (рис.5, кривая 1) отражает процесс вытеснения из . частиц ГОК и накопления в растворе свободных молекул БЭ, практически не флуоресцирующих в воде.

Проведенные нами аналогичные эксперименты с другими ПК показывают, что все системы с ростом <р претерпевают те же изменения, отличаясь друг от друга только значением характеристического

состава <р . тс

Таким образом, нам впервые удалось зарегистрировать вытеснение интеркалировашшх молекул БЭ в раствор молекулами (био)поли-катионов и выявить условия, при которых оно происходит. Этот результат может иметь важное значение для разработки метода сравнительной оценки связывания ДНК с положительно заряженными объектами. Его использование может быть положено й основу создания высокочувствительного экспресс-анализа биологически активных веществ, основанного на конкурентных иятерполиэлектролитных взаимодействиях.

Моего полагать, что обнаруженное нами вытеснение интеркали-рованного БЭ в раствор является результатом совместного действия различных по своей природе сил, главным образом, электростатических и гидрофобных взаимодействий. Известно, что иитеркаляция катиона зтидия в двойную спираль, которая характеризуется весьма . высокой константой комшюксообразсвания К = 2,5- 10б М~1, в значительной степени обусловлена специфическими взаимодействиями плоской молекулы БЭ с основаниями. Поэтому электростатическое связывание ПК с таким стабильным комплексом (ДНК • БЭ) моагет и не приводить к конкурентному вытеснению катионов зонда, глубоко "спрятанных" в остове нуклеиновой кислоты. Такая ситуация наблюдается в опытах в растворах смесей состава ф < фс-

Отсутствие замотпых различий между приведенными на рис.5 кривыми титрования комплекса (ДНК-БЭ) эф$зктивннм тушителем флуоресценции ПЭВН (кривая 1 ) и ШИЛА (кривая 3), не являюидася тяко-служит прямым доказательством того, что молекулы БД в часта-<чх ПЭК ивдежно экранировали от цепей ПК. Совпадение кривых сви-

дэтольствует о недоступности штеркалированного зонда для контакта с ГОШ, включенным в комплекс. В противном случав следовало ожидать образования КТО между молекулой БЭ (донор) и пирадшшевым звеном ПЭВП (акцептор) и эффективного тушения флуоресценции по механизму электронного переноса.

Уменьшение I на начальных участках кривых на рис.5 можно объяснить неблагоприятным для интеркалировашшх молекул зонда изменением их локального окружения под влиянием ПК, экранирующего отрицательно заряженную двойную сгшраль ДНК. Такое опосредованное влияние ПК можно уподооить влиянию на инторкалировашшй зонд низкомолекулярных катионов. Добавление простой соли к раствору комплекса (Д!К•БЭ) сопровождается уменьшением I из-за изменения локального окружения иптерквлированных молекул БЭ без изменения числа мест их связывания (Le Pecq J.-В.. Paolettl С., 1967). Очевидно, что в случае ПК, образующего с ДНК кооперативную систему шгеерполимерных солевых связей,' экранирующее действие должно быть выше. Этим огштняется более высокий теш тушения при титровании комплекса (ДНК-БЭ) раствором ПК по сравнению с титрованием его солью. Так, из рис.5 следует, что введение = 3-Ю""5 М заряженных звеньев Щ приводит к уменьшению I приблизительно на ЗОЯ». Добавление в раствор комплекса (ДНК-БЭ) NaCl той же концентрации практически не влияет на величину I.

Еще одним свойством цепей ПК, которое может вносить дополнительный вклад в тушение флуоресценции, является их способность участвовать в гидрофобных взаимодействиях, что определяется наличием в молекулах ПК гидрофобного остова и гидрофобных боковых цепей. Из рис.,5 следует, что эффективность воздействия линейных I1K на состояние интернированного БЭ зависит от химической природа их цепей. Так, для ПЭВП (кривая 1) и ПДМАА (кривая 3), имеющих весьма сходную структуру мономериых остатков, наклон начальных участков кривых практически' одинаков. Этот наклон заметно Ш1ве у более гидрофобных 5,6-И (кривая 2) и ПЛ (кривая 4).

Кооперативное электростатическое связывание ПК с ДНК, сопровождаемое компенсацией зарядов фосфатных групп, включает гидро-Фобяыг! взаимодействия и приводит к формированию гидрофобного участка. !Ъ-видимому, это ведет к еще более значительному нарушению "правильной" укладки оснований, изначально обеспечивающей их оитАччдьюе гидрофобное взаимодействие с инторкалированными молот кулями ч значит, сникает значение I. В случае относительно гид[--1>л5ннх 6,6-М и III вклад этого фактора в возмущающее влияние

I 100

Рис.5. .Зависимость интенсивности флуоресценции I в система ДЖ/ЕЭ/ПК от соотношении <р для различиях ПК: ПЗВП (1), 5,6-И (2), 1ЩМАЛ (3). ai (4), Н1 L5), ПАС (6>. tP) = 4 -10" М, г -0,2. 0,01 И Трис-Oyiep, р!1 9,5. 25°С. X

г ноэб.

535 т. К = 595 т.

per.

Рас.6. Зависимость относительной интенсивности Флуоресценции 1к/10 раствора

комплекса (ДНК • БЭ-11ЭИ1) состава ср.= 0,8 (1-3) и определенной из седименто-грамм доли Q выделившегося из НГОК (ДЖ-ГОВП) состава ® = 0,4 поликатаона (I'-3') от концентрации соли ШеС1.1: Ио = Na (1 и Г ), К (2 и 2' ) и L1 (3 и 3'). Условия проведения флуоресцентных измороннй то жа, что и на рис.5.

q. о а

0.2

0.0 О

05

Ряс .7. Зависимость глубины превращения qe в иптерполи-

электролатннх реакциях в смесях растворов: 1шк(та1гоо-пэвпзо) и ком-

плекса

(ДНК-БЭ)

шэк(пмл,г00-ггап30)

(D и

и

ДНК

(2) от концентрации NaCl. ÜMAI/IPI = 2, ср шэвги/

С Р J - 0,8 (кривая 1); tüMA'J/íP) 1. ф = ,-0,4 (кривая 2). tPl - I-ю*J м. г -■ 0,2. Остялыгае условия то же, что и на рис.5.

0.30 [NaCl], 11

связывакщегося ПК особенно овдтим.

Ясно, что по мере увеличения степени заполнения ДЕК цепями ПК, то есть с ростом ¡р, в силу действия обоих этих факторов преимущество ГОС в конкурентной борьбе должно нарастать. В конце концов оно может стать столь значительным, что обеспечит решающий перевес ПК и приведет к полному вытеснении интеркалированных молекул БЭ в раствор. Из опытов следует, что такая ситуация действительно реализуется и имеет место при достижении состава фс. В случае ПЭВП и ПДМЛА это происходит вблизи точки зкшшалентности зарядов, ф а 1,0 (рис.5, кривыо 1,3), а для более гидрофобных 5,6-И и ПЛ заметно раньше, при <ро а 0,8 (рис.5, кривые 2,4).

О важной роли гидрофобных взаимодействий в этой конкурентной реакции свидетельствует и тот факт, что во всех системах начало выделения иатеркалированного БЭ в раствор совпадало с тшиюшюм опалесцопцш. Образование при фс крупных агрегатов частиц НЭК фиксировалось резким поднятием спектров поглощения из-за релеев-ского рассеяния свота, а в специально изученной нами системе ДНК/БЭ/ГОВП - и измонегшем спектра кругового дихроизма. Возшпшо-вотш нерастворимых комплексных частиц можот служить еще одним Фяктором, способствующим вытеснению интеркалированного зонда. Рост числа свободных молекул БЭ компенсирует проигрыш в энтропии системы, обусловленный уменьшением общего числа частиц в растворе из-за перевода комплексов в осадок.

Аргументом в пользу изложенных выие представлений служат приведенные в диссертации результаты флуориметрического титрования смеси (ДНК-БЭ) и ПЭВП состава ц> = 1,5 раствором соли. Исходное значение I этой смеси мало, так как весь БЭ находится в свободном состоянии (рис.5, кривая '). Добавление уже первых порций раствора На€1 приводит к возгоранию флуоресценции, свидетельствующему о встраивании зонда в частицы ПЭК, которое завершается в 0,06 М ИаС1. Вводимые противоаонн образуют с закрепленными не цепях зарядами ионнно пары, разрушая интерполизлектролитше солевые связи и ослабляя гидрофобные взаимодействия, и тем самым снижают конкурентную способность ПК.

Особую группу среди изученных нами ПК составляют белки. Их поведение, если судить по наклонам начальных участков и положения точек излома кривых на рас.5, не укладывается в рамки этих представлений. Так, влияние богатого лизином тастона Н1 на шггеркали-ровашшй зонд (кривая 5) оказывается значительно слабее по сравнении с гомополимером ПЛ (кривая 4), а богатый аргинином гидро-

филышй ПАС (кривая б) проявляет себя более актив;шм конкурентом, чем !11 (крапая 5). Эти несоответствия могут бить обусловлены сио-щфшой структуры белков и особенностями их взаимодействия с ДНК. Выяснение этих вопросов - предает дальнейших исследования:.

Систематического изучения заслуживает и система, в которой роль ПК играет основной белок протаминсульфот. На первый взгляд, она кажется исклвчением из общего провала: кривая флуориматричес-кого титрования комплекса (ДНК-БЭ) раствором ПАС (рис.5, кривая б) не имеет точки излома. Однако, судя по содимэнтогрвммам и спектрам поглощения, вытеснение БЭ все за имеет место и происходит при относительно высоком значении ф (<fc и 1). Из-за весьма значительного наклона первого участка кривой титрования такому составу соответствуют невысокие значения I, что может сглаживать переход меэду двумя участками. Но и в этом случав остается неясным сравнительно небольшой наклон кривой на втором участке, при <р > фо. Не исключено, что подробное изучение этой системы может пролить свет на особенности взаимодействия этого функционально значимого белка с ДНК.

Важно, что комшгсксообразование в растворах смесей ДНК, БЭ и ПК.полностью обратимо. В специальных оштах мы установили, что порядок смешетя реагентов но влияет на конечное состояние систем, а равновесие в них заведомо достигается к моменту измерений, то ость спустя сутки. Это в полной море относится и к водно -солевым растворам, в которых изучали влияние малых ионов на состояние комплексных частиц.

На рис.6 в качество примера приведены зависимости относительной интенсивности флуоресценции Ik/Iü раствора смеси комплексе (ДНК-БЭ) и ПЭВП состава ф - 0,8 от концентрации NaCl (кривзя 1), KCl (кривая 2) и ИС1 (кривая 3) (где IQ- ¡штенсивность флуоресценции раствора (ДНК-БЭ) в тех же условиях). Там же представлены Кривые Г-3' разрушения НПЭН(ДНК-ПЭВП) состава ф = 0,4 в тех же солях в виде доли Q выделившегося из ШЭК поликатиона, которую определяли из седимоятограмм водно-солевых растворов смесей. Видаю, что во всех случаях при полной диссоциации НГОН (Q = 1) происходит полное восстановление интенсивности флуоресценции (Гк/10 1), а способность солей разрушать контакты ДИК-ПЭВП, определяемая обоими способами, возрастает в ряду Kv < Na* < ГЦ4, совпадающем с рядом возрастания аффинности этих катионов к ДИС.

Наблюдаемое на рис.6 расположение кривых 1-3 левее кривых Г-3' ио шкале ионной силы свидетельствует о том, что использова-

ние БЭ позволяет расширить границы наблюдения за процессом разрыва связей ДНК-ПК до малых масштабов (участков, сегментов), что недоступно при применении метода скоростной седиментации, так как фиксируемый с его помощью отрыв молекулы ПК от комплексной частицы происходит лишь после глубокого разрушения кооперзтиппой системы мощенных солевых связей.

Таким образом, измеряя интенсивность флуоресценции раствора смесей ДНК. БЭ и ПК, можно делать вывода об образовании или разрушении солевых связей ДНК-Г1К. что особенно удобно при изучении равновесия, кинетики и механизма конкурентных интерполиэлектро-литных реакций с участием ДНК-содержащих НЭК.

Проиллюстрируем это на примере изученной нами ранее методом тушения (ЗДоресценщш реакции (1). однако на этот раз в качестве конкурента ДНК за связывание с поликатионом ПЗВП30 используем немеченый ПМА.,^:

1200 NaCl

НПЭК(ПМА1гоо-ПЭВПэо) + (ДИК-БЭ) <====> . (11)

<====> ПМА1200 + НПЭК (ДНК • БЭ-ПЭВПэо).

Опыта проводили, добавляя раствор ША к смеси водно-солевых растворов комплекса (ДНК-БЭ) и ПЭВП состава (р = 0,8. смесь инкубировали 24 часа и измеряли I. Концентрация карбоксилятных групп ПМА вдвое превышала концентрации ДНК [PJ и составляла 8-Ю"5 И.

Присутствие ПМА приводило к росту равновесных значений I, что свидетельствует об уменьшении числа солевых связей ЛНК-ПЭВП в результате их замены на связи ША-ГОВП. С ростом ионной силы этот эффект ослабляется. Полученные результаты представлены на рис.7 в виде зависимости степени конверсии q^ = (L0-I)/(I0-Ik) от концентрации соли (кривая )). Видно, что эта кривая практически совпадает с кривой 2, представлявшей собой профиль реакции (1) с участием меченого ПМАJ£00 в растворе хлористого натрия, заимствованный из рис.4а. Незначительное расхождение кривых 1 и 2 при малых иошшх силах может быть обусловлено предпочтительным связыванием ПЭВП с мечеными участками ПМА*. Известно, что причиной подобной избирательности является стремление гидрофобных ггареновых меток находится в гил{юфобном окружили, создаваемом углеводородными остовами ияеимодействувцих полиионои. В относительно концентрированных растворах соли, где кооперативная система мезкцепних соленых связей значительно разрушена, гидрофобность двутяюшх участков комплекса снижается, избирательность связывания Падает и разниц» в поведении ПМА н 1ЫА* нивэлируотся.

Замена в реакции (11) ГЩ-ашша на нодистиродсули|онатаиа анион (I1CC) приводит к разрушении связей ДНК-ПЭЮ1 и полному переносу поликатиона на синтетический полшшиои в результате реакции:

Пай

(ДНК-БЭ-ПЭВП) + ПСС <====> (ДНК-БЭ) + (ПСС-ШШ1), (12)

Это следует из полного совпадения кривых флуоримотрического титрования смеси (ДНК• БЭ)/ПЭБП/ПСС и комплекса ЩИ-ВЭ) при (NaCl) > 0,1 Ми согласуется с хорошо известным фактом высокой конкурентноспособности сульфосодержащих полианионов в инторполиэлектролит-шх реакциях.

Интересно, что подобная реакция в смесях ДНК, ПСС я основного Оалка, как объекта конкурентного связывания этих полианионов, оказывается чувствительной к природе белка. Так, в реакции с участием лроташнсульфата

NaCl

(ДНК• БЭ-ПМЗ) + ИСО <--—> (ДНК-БЭ) + (ПСС-ПАС) (13)

совпадение кривых титрования см&си (ДШ{.-ёЗ)/ПАС/ПСО и комплекса (ДНК-БЭ) происходит ужэ при ÜlaCl) > 0,02 И, а для полного перехода гистона с ДНК на ЯСС в ходе реакции NaCl

(ДНК-БЭ-Ш) + ПСС <====> (ДНК-БЭ) +- (ПСС-Н1 ) (14)

требуется гораздо более высокая концентрация соли INaCl) = 0,2 И.

Эти результаты позволяют делать определенные звклвчония о силе связывания различных (био)полик8тионов с ДНК а могут представлять интерес для разработки методик очистки и шделвния кок ДНК, так и белков из природных объектов.

Безусловно, следует отдавать себе отчет в том, что предлагаемый подход неприменим для получения количественных параметров комплексообразования нативной ДНК с ПК, так как иятеркаляция БЭ приводят к частичному раскручиванию двойную спираль и может влиять на ¡штерполизлектродитное взаимодействие. Однако, как следует го приведенных выше примеров, он вполне пригоден для сравнительной оценки реакционной способности ДНК в различных условиях.

Очевидно, что аналогичным образом можно изучать реакции в растворах ДНК-содержащих ГОК и других отрицательно заряженных конкурентов, в том числе и неполимерной природа - например, анионных ПАВ, модифицированных латексов и т.п. Ясно также, что предлагаемый метод применим для исследования комплексообразования и конкурентных реакций в растворах РНК и синтетических полинуклео твдов, иятеркаляция БЭ в молекулы которых сопровождается возгоро кием флуоресценции.

вывода

1. Изучена реакция конкурентного связывания анионов ДНК и меченых полиметвкршштшх внионов с пода-Н-этшьА-вшштиридшшввими кйтионачи. Зафиксировало протекание реакции, выявлены факторы, влияющие на во скорость и определены условия, шзволявдио исследовать ее равновесие.

2. Проведено систематическое изучение равновесия реакции. Обнаружено, что природа вводимого катиона щелочного металла (Ll+, Na+. К1) и отношение степеней полимеризации синтетических поликатнопа и нолиенионо являются факторами эффективного контроля ее положения рашовосня.

3. В рейсах термодинамического рассмотрения проанализированы воз-можпые причины смещения равновесия реакции под влиянием указашшх факторов.

4. Изучены реакции образования и свойства ДНК-содержавдгх ноли-электролитшх комплексов, вклвчающих в себя бромистый этидаа. Впервые обнаружено вытеснение интеркалировашшх молекул зонда вводимыми (био)поликятионами и определены услов!м, при которых оно происходит. На основании получеиных данных предложен новый перспективный подход к исследованию кинетики и равновесия интер-далиэлектролитных реакций с участием ДНК и широкого круга синтетических и природных полинонов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. В.А.Кабанов, М.В.Хирякова, С.И.Каргою, А.Б.Зезип, В.А.Изумру-дов. Влияние низкомолекулярннх солей на конкурентное связывание шлишшонов ДНК и полиметакрилат-вниопов с поли-И-этил-4-виши1-гюридшгаем в водных растворах.// ДАН, 1993, т.329, Л 1, с.66-70.

2. В.А.Кабанов, И.В.Жирякова. С.И.Кергов, А.Б.Зезин. й.А.Изумрудов. Возможность определяющего влияния степени полимеризации полиионов на направление конкурентной реакции в растворах посте-хисметричннх интераолиэлектролиг1ШХ комплексов и ДНК.// ДАН, 1УЧЗ, Т.332, * 6, С.722-726.

3. V.A.lf.umrudoY, S.I.KargoT, M.V.Zhiryakova, A.B.Zezln, V.A.Ka-fcanov. Competitive Reactions in Solution oi DNA and Water-Soluble lnierpolyelectrolyte Complexes.// Biopolymera. 1995, v.35, No.1.