Лазерно-флюоресцентные исследования эффективности фотосенсибилизаторов в онкологической диагностике тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ФИЗИИ

На правах рукописи

УДК 615.849.1Э:[ 535.2:621.373.8]

ЖАРКОВА Наталья Николаевна

ЛАЗЕРНО-ФЛШРЕСЦЕГОШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МФЕКТИВНОСТИ Ф0ТХЕНСИБЙЛИЗАТ0Р0В В ОНКОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

01.04.21 - лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1992

Работа вшолнепа в Институте общей физики Российской Академии наук.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук В.Б. Лощонов

Официальные оппонвнти:

доктор физико-математических наук

B.В.Смирнов

кандидат физико-математических наук

C.Д.Захаров

Ведущая организация

Центр технологических лазеров РАН

Защита состоится " - 1992 года в часов

-р

на заседании Специализированного совета К 003.49.02 Института общей физики РАН по адресу: 117942 Москва В-333, ул.Вавилова, 38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей физики РАН.

Автореферат разослан

1992 года

Ученый секретарь Совета кандидат физ.-мат. наук

^^^"^Т.Б.Воляк

Г\ о ,

Г1:Ч'1 '¡(Ц. г,Л.

»''¿¿УДА; ОТГ'ЕННЛ" " 1 "

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность работа. Среди современных лазерных медицинских технологий особое моста занимают методы диагностики н терапии злокачественных опухолей, основанные на применении фотосепсгсбилззаторов ('КЗ), избирательно накаплававднгся в тканях злокачественных новообразований. Эффект фотосенснбилизации биологических систем (индуцирование фотохимических реакций окисления светопоглощавдями химическими препаратами) бил открыт еще в начале века, однако наиболее активно возможности применения фотосенсибилизаторов в онкологии исследуются в последнее десятилетие, благодаря развитию лазерных источников излучения. Катализируемое светом разрушение фотосенсибнлизированных опухолей получило название фотодинамической терапии (ФДТ) рака. Избирательное накопление некоторых фотосенскбшшзаторов в тканях злокачественных новообразований и возможность их обнаружения по характерной флюоресценции позволяет локализовать фотодинашческое воздействие с минимальным повреждением окружающих нормальных тканей, и «оставляет основу флюоресцентной диагностики (ФД). Попытки диагностики рака по флюоресценции фотосенсибилизатора успешно проводятся за рубежом. При атом многие авторы особо отмечают исключительную перспективность данного метода для эбнаружешя опухолей малых размеров, поскольку чувствительность {ишоресцентных методов существенно выше других современных ютодов ранней диагностики.

Однако, флюоресцентная диагностика на основе опухолввд-:елективных фотосенсибилизаторов не является в настоящее время редмэтом широких клинических испытаний, как собственно отодинамическая терапия, и причина этого - недостатки

используемых до настоящего времени клинических: фотосенсибилизаторов на основе производных гематопорфарина (ПШ). В целом для данных препаратов характерно: слабое иоглощешо в красном и ближнем ИК диапазонах, т.е. там, где биологические ткани наиболее прозрачны; низкий квантовый выход образования синглетного кислорода - главного цитотоксического агента, генерируемого при фотодинамическом воздействии; низгсий квантовый выход флуоресценции ( ~ 2 %); неоднородный химический состав и, как следствие, отсутствие прямих корреляций дазду флюоресцентными и фотодинашческимл свойствами различных компонент препарата, аккумулированных в опухоли, что усложняет решение задач световой дозиметрии при ФДТ. Наиболее эффективно флюоресценция ПШ возбуждается в ближнем УФ и синем диапазонах спектра, что, по-существу, с ухает возможности флюоресцентной диагностики, т.к. возбуждающее излучение проникает в биологические ткани но Оолео, чем на глубину клеточного слоя и кроме того, одновремэнно возбуздается собственная флюоресценция тканей, сильно затрудняющая обнаружение опухолей малых размеров.

Несовершенство используемых препаратов стимулировало поиск новых, более аффективных фотосенсибилизаторов различных классов химических соединений. На различных модельных системах интенсивно исследуется их фотодпнамичеекая активность. Как отмечают многие авторы, для клинического применения необходим препарат, оптимально сочетающий свойства эффективного фотосенсибилизатора и флюоресцентного мзркера опухолей, поскольку флюоресценция фотосенсибилизатора и возможность ее аффективного обнаружения необходима не только для диагностических целей, но и для терапии, т.к. позволяет проводить контроль, за состоянием красителя при ФДТ и может бить использована для получения необходимой для решения

проблем световой дозиметрии информации о содержании препарата в тканях.

В этой связи представляется актуальным исследование фотосенсибштааторов нового поколения с точка зрения пх применения для флюоресцентной диагностики рака.

Цель работы заключалась в:

1) поиске новых эффективных фотосенсибилизаторов для спектрально-флюоресцентной диагностики рака;

2) разработке метода спектрально-флюоресцентной диагностики с применением фотосенсийилизаторов нового поколения.

В.процессов выполнения работы решались следующие задачи:

3) методические:

- разработка методов измерений спектрально-флюоресцентных :арактеристик биологических тканей in vivo с использованием [азерных источников возбуждения флюоресценции, оптического ногоканального анализатора спектров, а также олоконно-оптической системы доставки возбуэдавдегося и сбора люоресцентгого и рэссеяного от ткани излучений;

создание тестовой методики скрининга потенциальных >тосенсибилизаторов по флюоресцентной контрастности опухоли ■носительно окружающих нормальных тканей;

- разработка метода оценки накопления фотосенсибилизатора в ухолевых и нормальных тканях;

исследовательские:

- исследование, на основе скршшнгового метода, возможностей тользования фотосенсибшшзаторов из классов азо- и 13сшорфинов как экзогенных опухолевых маркеров при

флюоресцентной диагностике злокачественных опухолей;

исследование селективности накопления сульфированных фталоцианинов алюминия и мвзозамеценншс твтрабензопорфннов в трансплантируемых опухолях лабораторных животных;

сравнительный анализ ФД-характеристик исследованных фотосенсибилизаторов и определение наиболее перспективных из них дня создания новых лекарственных препаратов для ФД и ФДГ рака.

Научная новизна работы заключается в следующем: I. На основе свотоволоконной, лазерной и спектроскопической техники разработана методика измерений спектрально флюоресцентных характеристик биологических тканей in vivo, позволяющая проводить нвинвазивный количественный анализ селективности накопления íG в опухолевых тканях при возбузденил флюоресценции излучением Не-Не лазера и одновременной регистрации спектров флюоресценции в диапазоне 650-800 -нм и обратного диффузно рассеянного от ткани сигнала лазерного возбуадения.

Z. Как флюоресцентные опухолевые маркеры впервые исследованы новые потенциальные 4С: мезо-замещенные тетрабензопорфины, моно-и дифталоцканины редкоземельных алементов (Nd, Eu. Fr, Gd) и металлов -1У группы (Hf, Zr).

3. Среда отечественных ФС нового поколения обнаружены i детально исследованы препараты, в том числе не имеющие зарубежны: аналогов, обладающие высокой фотодиагностической эффективностью ] перспективные с точки зрения создания новых лекарственных фор для таких современных лазерных медицинских технологий, как ФД ФД? рака.

Практическая значимость работы: I. Разработанная на основе лазерного волоконного спектроанализатора оригинальная методика измерений спектрально-флюоресцентных характеристик тканей in vivo является достаточно универсальной и может быть использован как для исследования ФД-характеристик препаратов на стадии доклинических испытаний, так и при ФД и ФДТ рака в клинической практике.

2. Проведенные на стадии доклинических испытаний исследования ФД-характеристик 27 отечественных потенциальных ФС позволили провести выбор фотосенсибилизатора (сульфофталоцианина элшиния) для разработки его лекарственной формы для ФД и ФДТ рака. В сравнении с препаратами» применяющимися в настоящее время в зарубежной клинической практике, сульфофталоцианины алшиния характеризуется простотой и доступностью их получения не только в лабораторных, но и в заводских условиях, отличаются постоянством и высокой вопроизводймосФыз химического состава, низкой токсичностью и устойчивость!) йря хранении.

3.. Сильное поглощение в красном диапазоне спектра, где биологические тканй относительно прозрачны, и возможность использования для возбуждения Их флюоресценции излучения Не-Не лазера, наиболее простого и широко распространенного из используемых в клинической практике лазерных источников, существенно повышает эффективность и глубину диагностики с таким экзогенным опухолевым маркером, как сульфофталоцаанан алюминия.

4. В целом, наличие препарата, сочетающего свойства эффективного ФС и эффективной* опухолевого маркера, наличие задеаяыХ. а простых в эксплуатации лазерных источников, шобходамых для использования сульфоталоцйанина алюминия в слинической практике, создает исключительную перспективу для

- б -

развития в нашей стране методов ФД и ФДТ рака и внедрения юс в широкую клиническую практику.

Апробация работы:

Основные положения диссертационной работы доложены на УШ Всесоюзной конференции "Измерения в медицине и их метрологическое обеспечение", (Менделеева, 1986); Международном симпозиуме "Применение лазеров в хирургии и медицине" (Самарканд, 1988); Международной конференции "Лазерц п медицина" (Ташкент, 1989); Республиканской школе-семинаро "Лазерная биология и лазерная медицина: практика" (Тарту, 1990); Республиканской школе-семинаре "Лазерная биология и медицина. Новые применения" (Таллинн, 1991); пленуме Научного Совета АМН СССР "Лазерная медицина, хирургия и лазерная медицинская техника" (Казань, 1991); Х1У Международной конференции по когерентной и пелинейной оптике (Ленинград, 1991); Международной конференции "Новое в лазерной медицине" (Брест, 1991).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Содержание диссертации изложено на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками и содержит .3 таблицы, из которых одна составлена по данным литературы. Список литературы включает 129 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении рассмотрены цель и задачи исследований, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы,кратко изложено содержание диссертация.

В первой главе рассматривается современное состояние проблемы использования в онкологии. Кратко излагаются молекулярные механизмы фотссепсибшшзацяи, приводятся данные о применении ФДГ и ФД в различных областях онкологии, подробно обсуждаются возможности и ограничения метода ФД, различию подхода я решению проблемы повышения эффективности ФД. Сформулированы основные требования к оптимальному ФС, среда которых: сильное поглощение в области 650-900 нм, высокая солектавяость накопления в опухолях и возможность их флврорэсцентпого обнаружения, устойчивость при лазерном воздействии.

Во Второй главе рассматриваются теоретические аспекты распространения излучения видимого диапазона в биотканях и полученЦ аналитические выражения, используемые при обработке спектральной информация. Подчеркивается, что основные трудности, возникавшие при решения задачи о распространении излучения в биотканях» поровдаится спецификой биологической ткани, оо отличней от сред» рассматриваемых в задачах физического т. да. Главная особенность бйолсгйчвских тканей состоит в сложности и изменчивости ах структуры* влиянием на' распространение излучения различна* неконтролируемых измене ш£й биологической среда, формирувдйхся как йа тканевой» Так и йа оргагтмзнном уровне. Тем не ыонев» диалогическая ткаяь моажт описываться как случайно-неоднородаая среда» содержащая поглощакцие и рассеиваодие излучение одйотшшыа чзстЛцц с заданными сечения;« поглощения <?а и рассеяшМ «в соответственно. Стоически такое

приближение справедливо, когда распространенна излучения в ткани обусловлено, главным образом, многократным рассеянием. Общепризнанно, что именно этот механизм распространения излучения доминирует в диапазоне х= 600-700 нм, где для большинства мягких тканей характерны высокое альбедо (Н^О.93), рассеяние вперед (»->0,6), а таюсз малая длина свободного пробега фбтонов (£ 100 т для х= 633 им).

Для получения нэобходашх аналитических выражений, описывающих распространение излучения видимого диапазона в ■ тканях была использована теория переноса. Рассмотрены две различные ситуации, реализованные при проведении экспериментов:

1. УФ-возбувдение и флюоресценция в видимой части спектра.

2. Возбуждение и флюоресценция в красной части спектра.

В • первом случае распределение возбуждающего излучения описывается уравнением Ламберта-Бэра, а флюоресцентное излучение распространяется согласно уравнению диффузии. В втором случае распределение возбуждающего и флюоресцирующего излучения было получено из уравнения- диффузии. При диффузном распространении излучения возникает также обратный диффузно-рассеянный в ткани поток возбуздащего излучения, который также как и поток флюоресцентного излучения направлен изнутри наружу ткани. Показано, что их отношение не зависит от мощности возбуждающей излучения 10 н определяется только молекулярными характеристикам: флюорохрома и оптическими свойствами ткани в красной част) спектра.

Полученные выражения используются в обработке результатов пр возбуждении флюоресценции ФС в УФ и красной части спектра.

В третьей главе описаны установка для измерений спектрально флюоресцентных характеристик биотканей in vivo и MaTepnaJ

исследований.

В 3.1. описана экспериментальная установка, состоящая, из следующих фушщашгальннх блоков: лазерных источников излучения для возбуждения флюоресценции, волоконно-оптической системы доставки излучения, систзггы регистрации и обработки получаемой спектральной информации.

В работе бЫЛИ ИСПОЛЬЗОВаШ: Н2-Л330р (*-гш1 = 337 ПМ), Ka-Ne лазер = 632,8 нм), Кг+-лазер (\rQH =407, 415 mí).

Мпоговолокояный катетер, состоящий из центрального кварцевого волокна для передача лазерного излучения к Ticaim и равномерно расположенных вокруг него кварцевых волокон для приема флюоресцентного и рассеянного излучения, позволяет проводить сканирование биоткани с пространственным разрешением по менее 1,5мм.

Система регистрации базируется на оптическом многоканальном анализаторе спектров OSHA, иигочаюшим в себя многоканальный фотодетектор, контроллер, светосильный решеточный полихроматор, принтер и графопостроитель, и позволяет проводить сканирование объекта в режиме реального времени. Описывается общая методика проведения измерений спектров флюоресценции биотканей in vivo. Поскольку время измерения одного спектра флюоресценции в одной точке составляет 100 мсек.то при плотности мощности возбуждающего лазерного излучения 100-150 мВт/см2 доза облучения биотканей при измерении одного спектра флюоресценции не превышает Ю-2 Дж/см^', что существенно ниже Дозы облучения, необходимой для индуцирования фотодинамического аффекта.

В 3.3. представлены исследованные ФС, их спектры поглощения,и флюоресценции в 0,9 % растворе NaCl.

В 3.3. и 3.4. описаны биологически объекты:' зкгаерякеятэльдаз шухолевые модели и лабораторные животные.

В четвертой главе представлена разработанная методика скрининга и обсуждаются полученные по а той методике результаты предварительного отбора потенциальных ®5, перспак'гашш: с точки зрения ФД.

В 4.1. с целью апробации акспзриметальной установки, выбора адекватной опухолэвой модели п лазерного источника всзОуждошхя флюоресценции были проведены предварительные исследования распределения известных ФС ( ПГП и Зотосан -П) у мыаей со спонтанными адэишарцшюмами молочной аолазы . Дяя возбуждения флюоресценции тканой применялся традиционно используемый при ФД с данными препаратами Кг+-лазер. Показано, что аксдариманталшая установка обеспечивает точность, спектральное разрешение и чувствительность, достаточные дош проведения систематических исследований флюоресценции биотканей в Вадимом' диапазоне спектра, но в то ей время модель спонтанных новообразований затрудняет сравнительные флюоресцентные исследования ФС, т.к. характеризуется значительной неоднородностью оптико-физических свойств тканей на длинах волн возбуждения (407,415 нм) и регистрации флюоресценции (550-800 нм)

В 4.2. описана методика проведения скрининга. В качества опухолевой модели биле выбрана перевивная опухоль - карцинома Зрлиха в солидной форме, которая моаат рассматриваться как однородная оптико-физическая среда, близкая по своим оптическим свойствам к окруааодзй нормальной ткани (мышце). Скрининг ФС проводили чэроз 24 часа после внутривенного введения препаратов в дозах 10 иг/кг в.т. при возбуждении флюоресценции тканей излучение» УФ-днапазона (Н^-лазвр, хех = 337 ш), • аффективно возбуждающего каи собственную флюоресценцию тканей, так в флюоресценцию ФС во всем рабочем диапазоне озма (350-900 пм). Ир

выборе лазерного источника учитывалось также и то, что в отличие of излучения Кг+-лазера, излучение с длиной волны 337 пм не лошздает в максимум поглощения гемоглобина, поэтому содержание крови в различных участках тааая в меньшей степени влияет на эффективность возбуадения флюоресценции.

В 4.3. обсуждается круг потенциальных -1С, выбрашшх для право допил стсршшпга: оульфопроизводаце фталоцнащша алшнппя и цинка, активно изучаемые за рубежом, а такая но исследовавшиеся ранее мезозамэщвшзш бепвоаналоги порфнршюв - тетрабвнзопорфшш (ТБП).

В 4.4. анализируется собственная флшрэсцевцпя биотканей в видимом диапазоне спектра, на основания литературных данных обсуздсатся роль собственной флюоресценции в диагностике рака. Подчеркивается, что интенсивность и форма спектра собственной' флюоресценции тканой чувствительны к их функциональному п физиологическому состоянии, однако однозначных корреляций мэжду патологией ткани и форжй спектра ее флюоросцещип не выявлено.

В 4.5.приведены результат измерений флюоресценции опухолевых п нормальных тканой через 24 часа поело вводения различных <ГС. Обнаружено, что большинство из взег избирательно накашивается в опухолевых тканях, о чем свидетельствует появление в спектрах флизоросцонцпи \ полос излучения IG = 672-685 нм),

интенсивность которых в опухоли существенно вике, чем в мшще.

В 4.6. представлены результаты сравнительной оценки уровной флюоресценции различных ЗС в опухолевых и нормальных тканях. В

данном разделе подробно обсуздается. клановая для сравнительного

/

флюоресцентного анализа проблема норняровка спектров, которая обусловлена тем, что при регистрации флшресценции тканей in vivo с помощью волоконно-оптической техники невозможно точно

фиксировать взаимное расположение волоконно-оптической систеьш н исследуемой ткани и таким образом обеспечить одинаковые для всех экспериментов условия возбуждения. Крош того, интенсивности измеряемых сигналов зависят от нестабильности в работе лазерного источника, от эффективности перо дачи излучения по световодам, юстировки всей оптической схем! и т.п. условий, которые могут различаться от вксперимонта к эксперименту.

При возбужденна в УФ диапазоне сигналы флюоросцэнцни ФС

нормировали на одновременно регистрируемый в том жа спектралыюк

диапазона сигнал собственной флюоресценции тканей ,

который зависит от всех перечисленных параметров так жа, как и

ФС (ЬО

сигнал экзогенной флшресцзнцш ). Сравнения были

шах

проведены по I) опухолевым тканям и 2) опухолевым тканям относительно нормальных (флюоресцентной контрастности, Кф). Обсуждается, при выполнении каких условий нормировка сигналов флюоресценции ФС по величине сигнала собственной флюоресценции может быть использована для количественного сравнения спектров флюоресценции. Показано,что при возбуждении в УФ диапазоне, когда оптические ■ свойства тканей на длине еолны возбуждения и флюоресценции сильно различаются, величина Кф отражает диагностическую эффективность ФС, т.е. возможность обнаружения опухоли на фоне окружающих нормальных тканей после его избирательного накопления, однако, не отражает истинного соотношения концентраций ФС в опухоли и нормальной ткани, являясь тем не менее, аффективным диагностическим параметром, определение •которого может бить использовано для увеличения чувствительности при регистрации границы парохода опухоль-Еорма в процессе диагностики поверхностных злокачественных опухолей.

Обнаружено, что для 10 новых потенциальных ФС наибольшие

значения экзогенной флюоресценции и флюоресцентной контрастности опухоли наблюдаются посла введения фталоцизнинов алюминия и тотрабензопорфанов высокой степени сульфирования, причем для. некоторых ФС (с1а1рсс1х р-ркп-ТВП з2^3) данные параметры

были вше, чем для клишпоских ФС: Фотофрпн-П, Фотосан-П.

Пятая глава посвящена исследованиям селективности накопления в опухолях фталоцианинов и тетрябензопорфшгов. Характерное для отих соединений поглощение в красной части спектра позволяет исследовать возможности ФД при возбуждении флюоресценции ФС излучением Не-Не лазера (х0х = 633 нм). Подробно обсуздаются преимущества возбуздения флюоресценции в красной части спектра, среди которых необходимо выделить основные: большая глубина проникновения возбузздавдего излучения и, следовательно, большая глубина диагностики, а также отсутствие собственной флюоресценция исследуемых тканей.

В 5.1.описана разработанная методика измерений и обработки спектров флюоресценции при ^ех=533 нм.

Для нормировки спектров флюоресценции был использован обратный даффузно-рассеянний в ткана сигнал возбуждающего лазерного излучения (ОДР сигнал). Поскольку спектральная интенсивность ОДР сигнала на 2-3 Порядка выше максимальной интенсивности измеряемых сигналов флюоресценции» для их одновременной регистрации в одном масштабе был использован пшрокополостный фильтр КС-15 с отношением коэффициентов ослабления на длйне волны возбуждения и флюоресценщш 6 = 1330.

Для экспериментального обоснования метода норлировки были исследованы:

- зависимости величины регйстйрувмого отраженного сигнала от расположения волоконно-оптического катетора относительно

поверхности ткапп при изменении угла падения о возбужденного излучения. Показано, что при о >10° измеряемый сигнал обусловлен только ОДР компонентой и практически не зависит от п. Поэтому основные измерения проводили с помощью катетера со специальной скошенной насадкой, ориентируицей волоконно - оптический катетер под углом а % 15-20° к поверхности ткани. Использование насадил фиксировало такжэ расстояние между торцом катетера и поверхностью ткави Г 2 ш).

- зависимости ОДР сигнала 1р и сигнала флюоресценции 1ф от мощности падающего излучения 10. Показано, что данные зависимости имеют линейный характер, т.е. отношение 1ф/1р по зависит от 10.

- зависимости ОДР сигналов от дозы вводимого препарата для тканей с заведомо различными оптическими свойствами (мышца и печень). Показано, что оптические свойства тканей существенно не меняются при используемых в экспериментах дозах вводимых ФС.

- сравнение ОДР сигналов от опухоли и нормальной мышцы показало, что при фиксированном 10 полученные значения находятся в пределах среднестатистического разброса. Это подтверждает данные о близости оптических свойств данных тканей и позволяет

. количественно анализировать сигналы флюоресценции опухолей и мышцы, нормируя их на величину регистрируемого ОДР сигнала.

Таким , образом, по разработанной методике измерений и нормировки спектров флюоресценции в данной главе были исследованы слэдупцдэ информативные параметры, описывающие эффективность ФС с точки зрения флюоресцентной диагностики:

I. Нормированная флюоресценция тканей (Фн) после введения ФС, которая .определяется интегральной интенсивностью флюоресценции в диапазоне 650-850 нм, нормированной на интегральную интенсивность

ОДР сигнала:

1ф(б50 -85QHM) 2(kq ®Н " уьаЗШП = '

где C,*,q - концентрация, молярная экстинкция и квантовый выход флюоресценции ФС соответственно, D - коэффициент диффузии ткани в красной части спектра, а а - эффективный коэффициент ослабления ткани в красной части спектра.

2. Флюоресцентная контрастность опухоль-норма (Кф), рассчитываемая как отношение нормированной флюоресценции опухолевых тканей Фн(оп) к нормированной флюоресценции мышцы Фн(норма):

Фп(опухоль) C^íotl) afI(1-4D| сф Кф = Фн(норма) = -^у- • „*,)

Если оптические свойства сопоставляемых тканей близки ("оп^ц-Don ü DH), папр;шер, в ситуации, реализуемой в наших экспериментах, величина Кф отражает отноиеше концентраций ФС в сопоставляемых тканях: Кф = С^(опух)/С^с(норма).

3. Относительный фактор накопления Кс, который определяется

как максимальное значение Кф, полученное при сканировании

поверхности опухоли после введения препарата: шах

Фд (опухоль) c'^t опухоль) Лс " -Ш^порма) (норма)

Определение парамэтрй Кс через максимальные значения Кф связано с неравномерным расйредэлейН8М ФС в объеме опухоли.

В 5.2. по разработанной методике регистрации нормированных спектров флюоресценцай биотканей 1л vivo исследованы ФД-характеристики 17 сульфопроизводных фталоцианинов алюминия, . моно- и дифталоцианинов РЗЭ а металлов 1У группы.

Показано, что наибольшей эффективностью среда исследованных потенциальных ФС обладают фталоцвднйпы алюминия, для которых

характерно сочетание высокой селективности накопления в тканях опухоли (Кс достигает 20) с высоким уровнем флюоресценции опухолей после их введения (Фц ~ 15-50) в высокой флюоресцентной контрастности опухоль-норма (Кф " 10-15)( рис.1).

На серии препаратов, синтезированных в процессе создания субстанции лекарственной формы ФО для ФД и ФДТ, исследована зависимость флюоресцентной контрастности Кф опухоль-норма от дозы вводимого <ХС и времени после его введения. Показано, что Кф сохраняется в течение 96 часов после введения ФС, а при сшивши дозы вводимого ФС в 10 раз для ее измерения не требуется повышения чувствительности системы регистрации и мощности возбуждающего излучения.

Показано, что при введении фталоцианинов РЗЭ флюоресцентным маркером тканей остается фггалоцианин, а ионы РЗЭ не проявляют своих флюоресцентных свойств, поатому возможного повышения Кф за счет перехода в ближний ИК-диапазон не происходит. При атом величина Кф для данных препаратов в 4-5 раз ниже, а уровень флюоресценции опухоли, в 25-10 раз меньше, чем при введении фталоцианинов алюминия.

В 5.3; исследована селективность накопления в опухолях пяти ТБП. Показано, что наибольшей селективностью накопления в опухолевых тквнях обладают безметальные ТБП (Кс = 5-9). При этом флюоресценция опухолей при введении данных препаратов сравнима с Фн опухолей после введения фталоцианинов алюминия. Флюоресцентная контрастность Кф опухоль-норма через 24 часа составляет ~ 4-6, сохраняется в течение 48 и снижается через 72 часа после введения ТЕП.

В заключении сформулированы основные результата и выводи работы:

1. Экспериментальная установка, созданная на базе оптического многоканального анализатора спектров и волоконно-оптической системы доставка лазерного излучения к биологическим тканям и сбора флюоресцентного и рассеянного излучения обеспечивает чувствительность, спектральное разрешение и точность, достаточные для систематических исследований спектров экзогенной флюоресценции биологических тканей в гадимом диапазоне.

2. Разработана методика скрининга и проведены сравнительные исследования экзогенной флюоресценции и флюоресцентной контрастности для 10 препаратов из классов фталоцианинов и тетрабензопорфинов - потенциальных фотосенсибилизаторов нового поколения - и известных фотосенсибилизаторов на основе производных гематопорфарипа при возбуждении флюоресценции биологических тканей излучением УФ диапазона . Показано, что при использовании в качестве опухолевых маркеров сульфированных фталоцианинов алюминия и тетрабензопорфинов экзогенная флюоресценция и флюоресцентная контрастность опухолей выше, чем при использовании клинических ФС на основе ПГП.

3. Разрзботан экспериментальный метод флюоресцентной диагностики злокачественных опухолей, основанный на использовании лазерной спектроскопии, волоконно-оптической техники и исследованных в данной работе фотосенсибилизаторов пового поколения. Повышение фотодиагностической эффективности достигнуто 38 счет большей глубины проникновения возбуждающего излучения в красной части спектра, высокой флюоресцентной контрастности опухолей после введения .новых перспективных препаратов, сочетающих свойства эффективных фотосенсибилизаторов и экзогенных опухолевых маркеров, а тагске возможности, в отсутствии

собственной флюоресценции биотканей при возбуждении излучением He-Ne лазера, проведения количественного анализа селективности накопления фотосенсибилизаторов в опухолевых тканях ln vivo.

4. Теоретически обосновано и экспериментально показано, что при диффузном характере распространения излучения, реализующемся в биотканях в красном диапазоне спектра, нормировка спектров флюоресценции на величину мощности обратного даффузно-рассеянного в ткани возбуждающего лазерного излучения позволяет проводить неинвазивные и воспроизводимые измерения селективности накопления фотосепсибилизаторов в биотканях. Разработана методика регистрации нормированных спектров флюоресценции биотканей 1п vivo при возбуждении излучением He-Ne лазера.

5. При возбуждении флюоресценции излучением He-Ne лазера исследована селективность накопления в опухолевых тканях и флюоресцентная контрастность опухолей даш 17 новых перспективных фотосенсибилизаторов: сульфофталоциаыинов алюминия, мою- и дифталоцианинов редкоземельных элементов и металлов 1У группы, а также 5 сульфированных мззо-замещенных тетрабензопорфинов.

6. Показано, что наибольшей эффективность!) с точки зрения флюоресцентной диагностики обладают фталоцианины алюминия высокой степени сульфирования, для которых характерно сочетание высокой селективности накопления в злокачественных опухолях (относительный фактор накопления достигает 20) с высоким уровнем флюоресценции опухолей в течение длительного периода (до 96 часов) после введения препарата. Особенно важным для флюоресцентной диагностики является тот факт, что высокая флюоресцентная контрастность (Кф ~ 10-15) опухолей после введения сульфированных фталоцианинов алюминия сохраняется при минимальных вводимых дозах.

7. Показано, что шрспоктявниш для' целей ФД являются бозматальянэ сульфированные тотрабеязопорфшы, селективно накапливавшиеся в здокачостшиншс опухолях и обеспечивающие значительную фяюорзсцэнтнуп контрастность (Кф 5-9) и высокий уровень флюоросцонцап опухолзй, который сохраняется до 48 часов посла введения. *

Материалы диссертации изложены в слздупких публикациях:

1. Лощенов В.В., Жаркова H.H. Метода и аппаратура для фоторадиационной дазгностики я терапии новообразований. // "Измерения в медицине и их метрологическое обоснечоппо". Сборник трудов УШ Всесоюзной конференции , М., 1986, с.137.

2. Жаркова H.H., Бабин A.B., Лощэнов В.Б. Применение фотосепсибштзирущих препаратов в лечении злокачественных новообразований ЛОР-Органов (обзор).// ВОРЛ, 1988, N 5, с.30-93.

3. Маркова H.H., Норманский В.Е., Лощенов В.Б., Барабан Р.Д. Спектра льно-фшэресцэнтпий анализ распределения двух фотосенсибшшзаторов в органах животных.//"Лазеры и медицина1.' Сборник тезисов международной конференции. М., 1989, т.2, с.41.

4. Zharkova H.H., ЗТогшапзку V.E., Lostchenov V.B., Barabasb R.D. Spectral fluorescence analysis of HpD and Photosun-П distribution in mice with spontaneons adenocarcinoma of the breast.// Proc. SPIE, 1989, vol.1353, p.108-113.

5. IIonnansKy V.E., Zliarkova N.N., Baryshev M.V., Lukinetc B.A., Kaliya O.L., Lostcbenov V.B. Pilot study: Spectral fluorescence analysis and pliotodynamic activity of some tfithalocyanines in experiments in vivo.// Proc. SPIE, 1989, '01.1353, p. 103-107.

6. Жаркова H.H., Лощенов В.Б Флюоресцентная контрастность и

диагностическая эффективность опухолевых фотосенсибилизаторов на основе фгалоцианинов.// Тезисы докладов ИУ Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике. Ленинград, 1991, т.2, с.76-77.

7. Харков.а H.H., Лощэнов В.Б., Волкова А.Н., Випская Н.П., Гальперн М.Г. Исследования распределения фгалоцианинов в оргааах животных In vivo.// "Новое в лазерной медицине".Тезисы докладов международной конференции Брест, 1991, с.95.

8. Жаркова H.H., Лощенов В.Б. Метода исследования фотосенсибилизаторов в онкологической диагностике.// "Лазерная биология и медицина. Новые применения". Материалы докладов 1У Республиканской школы-семинара, Тарту-Лохусалу, 1991, с.81-93.

9. Жаркова H.H., Лощенов В.Б., Дашкевич С.Н., Лукьянэц Е.А. Тетрабензопорфины - новые препараты для ФДТ. Селективность накопления в опухолях.// "Лазерная биология и медицина. Новые применения". Материалы докладов 1У . Республиканской школы-семинара, Тарту-Лохусалу, 1991, с.94-98.

10. loschenov V.B., Baryshev U.V., Zharkova N.N. . et al. Multichannel fiber system for 1иш1пезсепзв diagnostics oí tumors. // Pros. SPIE, 1992, v.1649, p.186-190.

Рис.-I. Спектры флюоресценции опухоли (I), периферической зоны (2) и интактной мышцы (3), измеренные in vivo через 24 часа после введения ClAlPcCl^Sg^g в дозе 10 иг/кг в.т. Флюоресценция возбуждается излучением H'e-Ne лазера (Хех = 633 нм). Спектры нормированы на величину ОДР сигнала (*).