Межмолекулярные взаимодействия в монослоях высокомолекулярных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Горелкин Петр Владимирович

МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МОНОСЛОЯХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

»

!

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, физико-математические науки

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 7 0КТ 2011

Москва-2011

4858038

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Яминский Игорь Владимирович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор

Василевская Валентина Владимировна

Защита состоится «16» ноября 2011 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 в Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, конференц-зал ЦКП Физического Факультета МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «11» октября 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.002.01,

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

кандидат физико-математических наук

Общая характеристика работы

Диссертационная работа посвящена исследованию особенностей формирования полимерных пленок полиэлектролитов и биополимеров на поверхностях золота и кремния. Известно, что эти материалы можно модифицировать тио- и кремнийорганическими соединениями, создавая при этом поверхности с заданными свойствами. В работе была изучена специфическая адсорбция полиэлектролитов на модифицированные подложки золота и кремния, были определены межмолекулярные взаимодействия, возникающие в адсорбированных полимерных слоях нанометровой толщины, и исследованы их структура и физико-химические свойства.

Актуальность работы.

Создание высокоселективных биосенсоров, способных проводить непрерывный качественный и количественный анализ веществ в жидкостях в режиме реального времени, важно для создания непрерывной прикроватной клинической диагностики. Наиболее перспективным направлением в разработке таких биосенсоров является создание нанометровых датчиков на базе кантилеверов атомно-силового микроскопа. Изгиб кантилеверной консоли, регистрируемый лазерооптической системой, происходит в результате формирования латеральных напряжений внутри сенсорного слоя, который нанесен на поверхность. Процессы, протекающие при взаимодействии сенсорного слоя с определяемым веществом, обуславливают чувствительность и селективность таких датчиков. Формирование латеральных напряжений в процессе адсорбции высоко и низкомолекулярных соединений зависит от структуры и физико-химических свойств адсорбированных полимерных слоев. В основу анализа жидкостей с помощью биосенсоров положено биоспецифическое распознавание, такое как взаимодействие антигена с антителом, гибридизация молекул ДНК и взаимодействие аптамер-белок. Вещества, обладающие способностью биоспецифического распознавания, являются, как правило, полиэлектролитами. Знание основных механизмов формирования тонких полимерных слоев полиэлектролитов и биополимеров необходимо для дальнейшего изучения процессов, проходящих на поверхности биологических мембран, создания высококачественных рецепторных слоев и разработки биокаталитических поверхностей.

Цель работы - определить механизмы формирования нанометровых полимерных слоев на поверхности золота и кремния при специфической адсорбции из растворов полиэлектролитов. Для этого были решены следующие задачи:

1. Выявлены влияния электростатического и структурного факторов на формирование латеральных напряжений на примере модельных систем мо-

нослоев металлокомплексов бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфида и 4'-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2/;6',2"]-терпиридина (Рис. 1а и 16, стр./).

2. Определены процессы появления и развития напряжений в полиэлектролитах при адсорбции на твердую заряженную подложку. В качестве полиэлектролита был выбран раствор бромида поли-М-этил-4-винилпиридиния (4-ВП).

3. Исследовано влияние первичной структуры макромолекул ДНК, привитых к поверхности золота и способных к формированию вторичной структуры, на процесс образования двойной спирали с комплементарными им поли-нуклеотидами из раствора.

4. Оценен вклад длины метиленовой цепи аптамера, интегрированного в рецепторный слой триэтиленгликольунодекантиола, на процесс адсорбции тромбина из раствора.

5. Определена взаимосвязь ориентации белковых макромолекул на поверхности и формирования латеральных напряжений в слое в процессе образования иммунного комплекса (антиген-антитело) при специфической адсорбции.

Научная новизна работы. Впервые изучены закономерности формирования латеральных напряжений в нанометровых слоях в процессе адсорбции полиэлектролитов. В диссертационной работе установлено:

1. Взаимосвязь латеральных напряжений и межмолекулярных взаимодействий в тонких полимерных пленках при адсорбции полиэлектролитов на заряженную поверхность.

2. Охарактеризовано влияние-заряда и структуры молекул на образование напряжений в поверхностном слое.

3. Для молекул ДНК, привитых к золотой поверхности и обладающих вторичной структурой, предложена тримолекулярная модель комплементарного связывания.

4. Обнаружено различие механизмов генерации поверхностных напряжений при взаимодействии тромбина с аптамерами, встроенными в монослой и отличающимися длиной метиленовой цепи.

5. Установлена взаимосвязь между структурой слоя антител и латеральными напряжениями, возникающими при биоспецифической адсорбции антигена пероксидазы хрена.

Практическая значимость работы. Разработан метод непрерывного определения'веществ в потоке жидкости с помощью новой наномеханической кан-тилеверной системы, позволяющей измерять интерпланарные межмолекулярные напряжения в тонких слоях. Создана методика контроля релаксации напряжений в адсорбированных полиэлектролитных пленках на заряженных

поверхностях золота и кремния. Предложен экспериментальный способ определения наличия вторичной структуры одноцепочечной ДНК, крайне важный для разработки датчиков на основе полинуклеиновых кислот. Разработан способ создания селективного рецепторного слоя на основе аптамеров и триэтиленгликольунодекантиола для определения тромбина в растворе. Предложена методика создания слоя антител на поверхности кантилевера, пригодного для многократного использования в качестве биосенсора.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 7-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Банф, Канада, 2010 год; на 6-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Джеджу, Южная Корея, 2009 год; 2-ой и 3-ей Международных конференциях «Современные достижения био-наноскопии», Москва, 2008, 2009 годы; Международной конференции «На-номедицина», Сант-Филио, Испания, 2008 год; 5-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Майнц, Германия, 2008 год; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008 год; Четвертой всероссийской Карги некой конференции «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007 год; Малом полимерном конгрессе, Москва 2005 год.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке задач диссертационной работы. Им лично выполнена подготовка образцов и их исследование методами атомно-силовой микроскопии и методом измерения отклонения наномеханического кантилеверного датчика (НКС).

Автором лично проведены анализ и интерпретация экспериментальных данных, полученных методами: сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), НКС и кварцевого микровзвешивания (КМВ). Обобщены результаты экспериментов, проведен анализ факторов, влияющих на формирование латеральных напряжений в рецепторных слоях, нанесенных на поверхность кантилевера.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 17 печатных работах, из которых 5 - статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 12 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная оабота состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы, включающего 186 наименований. Работа изложена на 137 страницах и содержит 52 рисунка, 5 таблиц.

Основное содержание работы Во введении обоснована актуальность темы диссертации, формулируется цель работы, обсуждается новизна и практическая значимость полученных результатов.

В главе 1 представлен сбзор литературы по теме диссертационной работы. Проанализированы работы зарубежных исследовательских групп, посвященные определению межмолекулярных латеральных напряжений в различных полимерных системах. В главе представлены теоретические результаты различных исследовательских групп, которые объясняют основы формирования латеральных напряжений в тонких слоях, нанесенных на твердую поверхность. Теоретические модели, описывающие формирование латеральных напряжений в тонких слоях, опираются на формулу, сформулированную Г. Стоуни при проведении исследований формирования поверхностного напряжения в металлических слоях, нанесенных на тонкие пластины:

где - Ла - изменение поверхностного натяжения (латеральных напряжений в слое); Е - модуль Юнга; t - толщина балки; V - коэффициент Пуассона; / -длина балки; Аг - отклонение балки

Изменение поверхностного натяжения кантилеверной балки, исходя из геометрического приближения малых отклонений, определяется суммой двух вкладов: первый появляется в результате протекания химической реакции на поверхности, второй возникает вследствие изменения упругости исследуемой системы. Латеральные напряжения, возникающие в слое в результате химической реакции, можно выразить через изменение поверхностной свободной энергии на единицу площади, используя уравнение Шатлворта:

где латеральные напряжения в слое, возникающие в результате хими-

ческой реакции, Р - изменение поверхностной свободной энергии, А - площадь.

Особый акцент сделан на анализ теоретических моделей формирования латеральных напряжений в процессе иммобилизации молекул ДНК на поверхность золота и образования двуспиральной ДНК при взаимодействии с комплементарной последовательностью полинукЛеотидов из раствора.

Глава 2. Влияние электростатического и структурного Факторов на формирование латеральных напряжений в мономолекулярных слоях.

Возникновение латеральных напряжений в адсорбированном слое связано с появлением интерпланарных межмолекулярных взаимодействий. Измере-

(2)

ние латеральных напряжений можно проводить с помощью наномеханиче-ской кантилеверной системы (ИКС). Измерительная консоль (кантилевер) представляет собой кремневую балку, одна сторона которой покрыта золотом. Закрепленные на поверхности золота или кремния молекулы за счет взаимодействия друг с другом формируют напряжения, вызывающие изгиб кантилевера. Расталкивание между двумя соседними молекулами в слое приводит к генерации расталкивающих (отрицательных изменений) латеральных напряжений, в то время как появление новых связей между молекулами ведет к появлению стягивающих (положительных изменений) латеральных напряжений.

Для изучения процессов создания наноразмерных пленок на поверхности в сложных полимерных системах необходимо установить ряд базовых закономерностей формирования латеральных межмолекулярных напряжений на примере упорядоченных монослоев.

На данный момент опубликован ряд работ, касающихся вопроса влияния электростатического фактора на формирование интерпланарных межмолекулярных взаимодействий в монослоях. Однако влияние пространственной структуры молекул на формирование латеральных напряжений ранее не было изучено. Влияние данного фактора на формирование межмолекулярных напряжений в полимерном слое крайне важно учитывать для правильной интерпретации результатов измерения. Для этих целей в работе в качестве модельных систем были выбраны следующие соединения: бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфид (лиганд I) и 4'-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,';б',2"]-терпиридин (лиганд II), способные хе-мосорбироваться на поверхности золота за счет дисульфидной группы и формировать плотную мономолекулярную пленку. Эти вещества, привитые к поверхности, могут образовывать хелатные комплексы различной формы за счет изменения комплексообразующего иона металла и природы заместителей в лигандной оболочке (рис.1).

Рис. 1. Схемы реакций: а) - лиганда I с комплексообразующим металлом; б) - замещение хлорг в оболочке лиганда II на гистидин.

■5—Аи

(а)

(б)

0,3 -1

100 150 1, мин

250

Рис. 2. Зависимость латеральных напряжений (а) в монослоях от времени (I) хе-мосорбции из 10"3 М растворов в метаноле ка поверхности золота: 1 - лиганда I ; 2 - лиганда II

В процессе ,:емосорбции лиганда I и лиганда II на поверхности золота в формирующихся монослоях наблюдается рост стягивающих напряжений, которые становятся постоянными по мере насыщения лигакдами адсорбционного елок (рис. 2).

Наблюдаемый рост латеральных напряжений в монослойной пленке связан, как следует из уравнения Шатлворта (2), с увеличением поверхностной свободной энергии системы, в результате чего энтропия системы уменьшается, и, следовательно, в ходе формирования монослоя образуется упорядоченная двумерная структура. Кроме того, при формировании монослоя расстояние между соседними молекулами становится достаточным для появления возможности взаимодействия между ароматическими группами лигандов. Для адсорбировавшихся молекул лиганда I п-п взаимодействие осуществляется между бензольными и пиридиновыми кольцами, а у молекул лиганда II -между пиридиновыми кольцами.

При адсорбции молекулам, содержащим сопряженные п-связи, энергетически выгоднее выстроиться таким образом, чтобы ароматические кольца каждой молекулы были параллельны друг другу. В слое, образованном лиган-дом I, значения латеральных напряжений в три раза меньше, чем у монослоя, сформированного лигандом II. Это в первую очередь связано с тем, что молекула лиганда II в отличие от лиганда I обладает большей подвижностью за счет длинной метиленовой цепи между тиольной группой, через которую осуществляется взаимодействие с поверхностью золота, и сопряженной ароматической системой трех пиридиновых колец. В случае же лиганда I, сульфидная группа связана непосредственно с бензольным кольцом сопряженной ароматической системы, что приводит к более структурированному монослою.

За счет п-п взаимодействий сопряженных ароматических колец монослои, сформированные лигандом I и лигандом II на поверхности кантилевера, имеют повышенную электронную'плотность и могут образовывать хелатные комплексы в результате сорбции ионов двухвалентных переходных металлов из раствора. На примере комплексов лиганда I и лиганда II с кобальтом, никелем и медью было изучено влияние пространственной структуры на формирование латеральных напряжений в могюслое. По данным электронной

спектроскопии было показано, что хелатирующая часть комплекса лиганда I с никелем имеет форму квадрата, комплекса с кобальтом - форму тетраэдра, а форма для комплекса с медью не может быть определена однозначно на основе электронного спектра1 (рис. 3).

Рис. 3. Трехмерные модели металлокомплексов лиганда I с ионами: (а) кобальта, (б) меди и (в) никеля

Объем, который занимают адсорбированные молекулы в монослое, называется исключенным. В процессе комплексообразования лигандов, иммобилизованных на поверхности, с ионами металлов происходит изменение исключенного объема адсорбированных молекул, что приводит к росту расталкивающих латеральных напряжений.

Наибольший рост расталкивающих напряжений наблюдается в ходе образования комплексов лиганда I с кобальтом и лиганда II с медью. Эти комплексы имеют одинаковую форму2, обусловленную тетраэдриче-ским лигандным окружением. Наименьший уровень латеральных напряжений наблюдается для комплекса лиганда I с никелем. В этом случае лигандная оболочка имеет форму квадрата (Рис. 4).

' Beloglazkina Е.К., Majouga A.G.,ZykN,V„ Rakhimov R.D., Yaminsky I.V., Gorelkin P.V., Kiselev G.A., Kutateladze A.G. Thin solid films, 2007, 51'S. 4649-4661.

2 W Henke, S. Kremer, D. Reinen, Inorg. Chair. 1983, 22, 2858 -2863

t, мин.

Рис. 4. Зависимости o(t) при образовании хе-латных комплексов в процессе адсорбции монослоем лиганда I из водных растворов перхлоратов: 1 - Со, 2 - Си, 3 - Ni и 4 - при взаимодействии лиганда II с раствором CuCI2«2H20 в метаноле.

Ь мин.

Рис. 5. Зависимость о(1) для монослоя лиганда II при его взаимодействии с раствором гистидина.

Зависимость латеральных напряжений в адсорбированном слое медного комплекса лиганда II от времени его взаимодействия с раствором гистидина в метаноле носит экстремальный характер (рис. 5). В течение первых минут наблюдается рост стягивающих напряжений, а затем превалируют растягивающие напряжения. Такой ход кривой свидетельствует о прохождении реакции замещения хлора на гистидин в два

этапа. Сначала происходит координация гистидина с медным комплексом лиганда II, в результате чего заряд поверхности частично экранируется, и электростатическое отталкивание между молекулами в слое уменьшается. Затем гистидин встраивается в структуру комплекса, вызывая тем самым увеличение исключенного объема молекулы (Рис. б), что в свою очередь, приводит к росту расталкивающих напряжений в слое. Таким образом, на примере двух модельных систем лигандов была показана взаимосвязь между структурой молекул, формирующих адсорбированный слой, и природой возникающих в нем латеральных напряжений. Было установлено, что наличие системы сопряженных связей у молекул лиганда I и лиганда II вызывает в монослое возникновение стягивающих латеральных напряжений, уровень которых зависит от удаленности данной системы от поверхности золота. При формировании слоя из молекул хелатных металлоком-плексов возникают расталкивающие напряжения, величина которых зависит от пространственной структуры молекулы. Изменение структуры лигандной оболочки металлокомплекса приводит к возникновению сначала стягивающих напряжений, а затем расталкивающих. Данные особенности возникновения латеральных напряжений в ходе образования адсорбционных пленок необходимо учитывать при исследовании более сложных полимерных систем.

(а)

(6)

Рис. 6. Модели медного комплекса лиганда II с хлором(а) и гистидином (б) ..„•••

Глава 3. Изучение адсорбции полиэлектролита на отрицательно заряженной поверхности.

Глава посвящена изучению особенности формирования слоя поли-1\1-этил-4-винилпиридиния (поликатиона 4-ВП) на поверхностях золота и кремния, содержащих анионные функциональные группы.

Рассмотрено два способа формирования отрицательно заряженной поверхности: окисление поверхности кремния и создание на поверхности золота упорядоченного монослоя, молекулы которого содержат концевые карбоксильные группы.

Окисление поверхности кремния проводили с помощью пираньей смеси (H2SO4 конц. И Н202 зо%-ый водн. р-р В соотношении 1:1). Отрицательный заряд на золотой поверхности формировался с помощью 3-меркаптопропионовой кислоты. Использование буфера с pH = 9,2 способствовало образованию отрицательно заряженной поверхности: ОН'

Si

-он

—О'

Au

—S-CH2-CH2-COOH

ОН'

Au

— S-CH2-CH2-COO"

0.04 0.03 0.02 0.01 О

-0.01 у

г*

/V

10

15

ч

Кинетика адсорбции поликатиона 4-ВП на отрицательно заряженную кремневую поверхность и, как следствие этого, формирование латеральных напряжений в слое имеет сложный характер (Рис.7).

В первый временной отрезок наблюдается резкий рост в адсорбированном слое стягивающих напряжений, обусловленный непосредственно адсорбцией поликатиона. Далее скорость роста стягивающих напряжений уменьшается, что, вероятно, вызвано упорядочиванием макромолекул в слое. После четырех часов адсорбции величина латеральных напряжений в полимерном слое достигает максимального значения, после чего наблюдается их некоторое снижение, вызванное, по-видимому, релаксационными процессами в полимере. Анализ топографии поверхности слоя, полученного в результате адсорбции поликатиона на" слюду, обработанную пираньей смесью, проводили с помощью силовой зондовой микроскопии (СЗМ). Слюда является стандартной отрицательно заряженной подложкой, используемои в зондовой микроскопии, и по своим свойствам она аналогична окисленной поверхности крем-

Рис. 7. Зависимость o(t) для слоя поликатиона 4-ВП в ходе его адсорбции на отрицательно заряженную кремниевую поверхность.

ния. Отрицательно заряженную слюду выдерживали в растворе поликатиона 4-ВП разное время: 30 минут и б часов. Данные СЗМ, показали, что рельеф поверхности не зависит от длительности процесса сорбции. Кинетика адсорбции поли-4-ВП на золотую поверхность, модифицированную упорядоченным слоем З-меркаптопропионовой кислоты, носит несколько иной характер по сравнению с отрицательно заряженной кремниевой поверхностью (Рис. 8).

0.02 -

0.01 3 0

X

О -0.01 -0.02

Xf-

J

t, ч

Рис. 8. Зависимость a(t) для слоя 4-ВП при его адсорбции на золотую поверхность кантилевера, модифицированную З-меркаптопропионовой кислотой.

В течение первых нескольких минут адсорбции поликатиона в слое наблюдается резкий рост расталкивающих напряжений, связанный, по-видимому, с нарушением упорядоченной структуры карбоксилсодержа-щего монослоя. Затем в ходе дальнейшей адсорбции и перераспределения макромолекул внутренние напряжения в слое начинают расти, из расталкивающих превращаясь в стяги-

вающие. Спустя четыре часа полимерный слой начинает релаксировать аналогично слою, сформированному на заряженной кремниевой поверхности (рис. 7). Скорость протекания процесса адсорбции поликатиона при использовании золотой подложки, модифицированной З-меркаптопропионовой кислотой, больше, чем в случае использования отрицательно заряженной кремниевой поверхности. Органические соединения, содержащие тиольную группу способны формировать на поверхности упорядоченные монослои подобные пленкам Лэнгмюра-Блоджет3. Кроме того, в боратном буфере группы -СООН на поверхности диссоциируют в большей степени, чем группы -Би ОН. В результате этого образование связей в точках зацепления макромолекул с поверхностью при взаимодействии поли-4-ВП с карбоксилсодержащим монослоем более вероятно, чем с окисленной поверхностью кремния. Для подтверждения факта быстрой адсорбции поли-4-ВП золотой поверхностью, модифицированной З-меркаптопропионовой кислотой, был проведен анализ изменения массы адсорбированного слоя методом кварцевого микровзвешивания (КМВ). Резкое понижение резонансной частоты в первые минуты, связанное с приростом массы, свидетельствует о том, что ь основном, процесс адсорбции макромолекул протекает именно зг/это время. После этого резонансная частота колебаний кварцевого кристалла практически не меняется (рис.9).

3 Nuzio, ft. G.; Allara, D. l„ Adsorption of Afunctional organic disulfides on gold surfp js. I. Am. Chem. Soc. 1983,105.4481-4483.

t мин.

Рис. 9. Зависимость изменения резонансной частоты колебаний кварцевого кристалла (йш) от времени (1) адсорбции 4-ВП на золотую поверхность, модифицированную 3-мерка-птопропионовой кислотой.

Таким образом, результаты, полученные в ходе экспериментов на НКС, КМВ и СЗМ, свидетельствуют о том, что непосредственно адсорбция полиэлектролита заряженной поверхностью происходит достаточно быстро, за несколько минут, в то время как процессы формирования структуры полимерного слоя и релаксации внутренних напряжений в нем занимают несколько часов. Полученные в данном разделе результаты по формированию латеральных напряжений в адсорбированном слое полиэлектролита 4-ВП

позволяют перейти к изучению специфической адсорбции более сложных биомолекул, таких как ДНК и белки.

Глава 4. Первичная структура полинуклеотидов и механизм адсорбции комплементарных ДНК на модифицированную поверхность. Глава посвящена изучению взаимосвязи формирования на золотой поверхности слоев из одноцепочечных молекул ДНК различного строения и возникновения латеральных напряжений при их биоспецифическом взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами. Одна из молекул ДНК была химически привита к золотой поверхности кантилевера, вторая молекула из комплементарной пары служила в качестве вещества, способного к биоспецифическому связыванию (все измерения проведены в буферном растворе Трис-ЭДТА с рН=7,4). Для экспериментов были взяты две пары комплементарных молекул ДНК с различной последовательностью нуклеотидов (табл.1).

Последовательность

Пара 1 HS-Б'-ТТ ТТТ ТТТ TTC ТТТ ССТ ТСТ ATT CG A G AT СТС СТС GA-3'

5'-TCG AGG AGA ТСТ CGA ATA GAA GGA AAG-3'

Пара 2 HS-5'-TTT ТТТ TTT TTC AGG CTG CTG TTC GAT CCA TTC ACT ACT-3'

5'-AGT AGT GAA TGG АТС GGA CAG CAG CCT GA-3'

В каждой паре одна из молекул ДНК содержала БН — группу, необходимую для закрепления на золотей поверхности кантилевера. Последовательность нуклеотидов в тиомодифицироьаиных молекулах ДНК пары 1 была подобрана таким образом, чтобы эти молекулы могли образовывать связи не только с комплементарными им полинуклеотидами, но и между собой, формируя тем самым вторичную структуру в адсорбированном слое. В тиомодифици-

рованных молекулах ДНК из пары 2 последовательность нуклеотидов была такова, что количестве комплементарных связей, возникающих между соседними молекулами, было не достаточно для формирования вторичной структуры на золотой поверхности кантилевера (Рис. 10). Иммобилизация на золотую поверхность тиомодифицированных молекул ДНК из обеих пар привела к возникновению стягивающих латеральных напряжений (рис.11).

В адсорбированном слое ДНК пары 1 латеральные напряжения выше, чем у пары 2. Это связано с тем, что молекулы ДНК пары 1, способны образовывать подряд восемь комплементарных связей между азотистыми основаниями, входящими в их состав, в отличие от тио-молекул пары 2, где подобного взаимодействия нет. Разница в уровне конечных значений латеральных напряжений составила 0,017 Н/м. Зная эту величину и плотность упаковки иммобилизованных молекул ДНК в слое (2.5 х1012 молекул/см2, по данным флуоресцентной микроскопии), используя уравнение Шатлворта (2), была найдена энергия межмолекулярных комплементарных связей, которая составляет 620 ± 10 кДж/моль. В данном случае вклад поверхностной деформации (второе слагаемое уравнения) не учитывали.

Перед изучением специфического связывания комплементарных молекул ДНК, адсорбированных на золотой поверхности, с молекулами, находящимися в растворе, на незанятые участки поверхности наносили блокатор (три-этиленгликольунодекантиол) (рис.10, б).

Для комплементарных полинуклеотидов пары 1 в первые несколько минут протекания процесса биос'пецифического связывания между иммобилизованными на поверхности и находящимися в растворе молекулами ДНК привели к резкому росту стягивающих напряжений в адсорбированном слое. После пяти минут сорбции латеральные напряжения начинзю! медленно уменьшаться. Для второй пары нуклеотидов наблюдается плавный рост стягивающих напряжений в слое во всем временном интервале. Спустя 50 минут латеральные напряжения в полимерном слое обеих пар молекул ДНК имеют близкие значения (Рис. 12).

Рис. 11. Зависимость o(t) для иммобилизованных на золотую поверхность слоев тиомодифицированных молекул ДНК, способных (1) и неспособных (2) формировать вторичную структуру.

Пара 1

Пара 2

Ч||\\\\\\Ж\

\

Триэтиленгликопьунодекантиоп « Тимин »Аденин Цитозин ¡»Гуанин

Рис. 10. Постадийная схема процессов гибридизации молекул ДНК пары 1 и пары 2. а) - тиомодифицированные ДНК, привитые к золотой поверхности, б) - присоединение комплементарной ДНК из раствора, в) двуспиральные молекулы ДНК на поверхности.

t, мин.

Рис. 12. Зависимости oft) для процесса специфического связывания с образованием двойной спирали молекул ДНК из раствора с комплементарными тио-молекулами ДНК на поверхности, которые способны (1) и не способны (2) формировать вторичную структуру .

Отличие в формировании латеральных напряжений в адсорбированном слое молекул ДНК заключается в следующем: для первой пары нуклеотидов сначала происходит формирование некой вторичной структуры на поверхности за счет образования связей между близко расположенными соседними тиомодифицирован-ными молекулами ДНК. Затем на образовавшийся двухмолекуляр-ный комплекс из раствора сорбируются комплементарные молекулы. Быстро формируется некая трехмолекулярная переходная

структура (Рис. 10, б), которая затем разрушается и происходит медленный процесс гибридизации. В случае тиомодифицированной молекулы ДНК из второй пары вторичная структура не образуется, на поверхности находятся свободные одноцепочечные молекулы. Для этой пары комплементарных полинуклеотидов происходит обычный процесс образования двойной спирали: молекулы ДНК из раствора образуют точки зацепления с молекулами на поверхности, и затем медленно происходит процесс гибридизации, в результате чего наблюдается слабый рост стягивающих напряжений в слое. Близкие значения латеральных напряжений в конце процесса гибридизации свидетельствуют о формировании схожих структур двуспиральных молекул ДНК.

В результате исследования латеральных напряжений, формирующихся в адсорбированном слое тио-модифицированных полинуклеотидов, было определено значение энергии водородных связей, возникающих между молекулами ДНК, способными к образованию вторичной структуры, которое составляет 620 ± 10 кДж/моль. Данное значение согласуется с величиной энергии водородных связей, рассчитанных для аналогичной системы на основе теории молекулярных орбиталей4, которое составляет 606 кДж/моль. Для пары комплементарных полинуклеотидов, один из которых обладает вторичной структурой, предложен механизм образования двойной спирали.

Глава 5. Влияние структуры монослоя молекул тиолов и полинуклеотидов на специфическую адсорбцию белков в потоке. В главе представлены результаты изучения связывания молекул тромбина с монослоем, состоящим

4 Amparo Asensio, Nadya Kobko, and J. J. Dannenberg, J, Phys. Chem. A, 107,6441-6443 (2003)

из молекул триэтиленгликольунодекантиола и аптамеров (молекул ДНК, способных специфически взаимодействовать с определенным белком). Для экспериментов были взяты два аптамера, оканчивающиеся тиольными группами и содержащими метиленовые цепи, разной длины (рис.14): БН- ЗЧСНгк-вет Тбв тет бет ТвС-Б' (длина метиленовой цепи ~1,1 нм), БН- 3'-(СН2)24-2СТТ66 ТйТ 66ТТ66-5' (длина метиленовой цепи ~3.9 нм). В качестве контрольного вещества, не обладающего способностью к специфическому связыванию с тромбином, использовали полиаденин. Все исследования проводили в буферных растворах Трис-ЭДТА (рН = 7.4).

Формирование сенсорных мо. нослоев из аптамеров с различ-

Тромоин

' ной длиной метиленовой цепи

проходило в два этапа. Сначала Аптамер //// Т* на золотую поверхность сорби-

4 ровался аптамер, затем свобод-

ные адсорбционные центры поверхности занимали молекулы триэтиленгликольунодекантио-ла' Длина которых превышает размер молекулы аптамера с а) б) в) короткой метиленовой цепью

Рис. 13. Схема сравнения длины аптаме- С3ис-

ров (а, б) и триэтиленгликольунодекан- Процесс связывания аптамера с тм™-, /о\ тромбином проводили в потоке

ТИОЛа \ В] ■

буферного раствора (ЮОтМ Трис, 140мМ Г\1аС1, 20мМ М§С12, 20мМ КС1 (рН = 7.4)). Контроль связывания аптамера и тромбина фиксировали методами КМВ и НКС. Измерительные датчики НКС помещали в специально сконструированную ячейку, через которую прокачивался буферный раствор со скоростью 20 мкл/мин. Раствор тромбина объемом 250 мкл впрыскивали в прибор, и его концентрация в измерительной ячейке постепенно возрастала, достигая максимального значения через ~ 10 минут, затем буферный раствор снова плавно вытеснял раствор тромбина из ячейки. Аналогичную схему проведения эксперимента применяли и в КМВ.

Измерения на кварцевых микровесах показали, что при адсорбции тромбина на поверхность кантилевера, модифицированного аптамером с 6 метилено-выми группами, уменьшение резонансной частоты составляет 2 Гц. В то же время при адсорбции тромбина на поверхность, содержащую аптамер с 24 метиленовыми группами, уменьшение резонансной частоты было в два раза больше и составило 4 Гц (Рис. 14). Зависимость резонансной частоты и массы

адсорбированного вещества имеет вид: (»= (—, где к - жесткость кварцево-

го кристалла, т - масса вещества, присоединившегося к поверхности кристалла. Из этой формулы следует, что масса тромбина, адсорбированного слоем с молекулами аптамера с короткой метиленовой цепью меньше массы тромбина, сорбированного аптамером с длинной цепью. На рис. 15 приведены данные зависимости латеральных напряжений от времени сорбции тромбина этими же слоями, а также слоем, сформированным полиадени-ном. При взаимодействии тромбина с монослоем, содержащим аптамер с 6 метиленовыми группами, наблюдается рост стягивающих напряжений. В то время как связывание белка с аптамером с 24 метиленовыми группами вызывает рост рассталкивающих напряжений. Взаимодействие тромбина со слоем, содержащим полиаденин, не приводит к значительному изменению латеральных напряжений.

3" -4' \

4 -6" \ / ч^/

-1 о ...................т„.....................

О 1 20Т ~40^~~6(Г 80 1, мин

Рис. 14. Зависимости Дш(1:) для слоев триэтиленгликольунодекантиола, модифицированного: 1-аптамерами с 6 метиленовыми группами; 2 - ап-тамерами с 24 метиленовыми группами при взаимодействии с тромбином.

В случае аптамера, привитого к поверхности через короткую метиленовую цепь, последовательность нуклеотидов, способных связываться с белком, скрыта внутри слоя триэтиленгликольунодекантиола. Связывание тромбина с такой поверхностью, по-видимому, затруднено, что объясняет низкое значение массы адсорбированного вещества. Чтобы связывающий активный центр полинуклеотида был доступен для молекулы тромбина, аптамеру необходимо изменить свою конформацию. В результате этого в слое образуются пустоты, которые стремятся схлопнуться (Рис 17 а), что должно привести к росту стягивающих напряжений.

Сенсорный слой, сформированный из аптамеров с длинной метиленовой цепью, имеет активные центры, связывающие белок, над поверхностью слоя триэтиленгликольунодекантиола (рис.17 б). Это приводит к тому, что молекулы тромбина, связываясь с аптамером, отталкиваются друг от друга, и в

Рис. 15. Зависимости oft) для слоев триэтиленгликольунодекантиола, модифицированного! - аптамерами с б метиленовыми группами; 2 - аптамерами с 24 метиленовыми группами; 3 -полиаденином при взаимодействии с тромбином.

Рис. 18. Модели иллюстрирующие возникновения стягивающих (а) и расталкивающих (6) напряжений между адсорбированными молекулами тромбина.

слое возникают расталкивающие латеральные напряжения, кинетика нарастания которых носит индукционный характер. Доступность нуклеотидов к связыванию молекулами тромбина приводит к большей массе адсорбированного белка, по сравнению с поверхностью, образованной аптамером, который находится внутри слоя триэтиленгликольунодекантиола, что и следует из данных КМВ.

Слой, содержащий молекулы полиаденина, не связывает молекулы тромбина. Этот факт подтвердили и данные КМВ, и измерение латеральных напряжений на НКС.

Таким образом, механизм адсорбции тромбина из потока раствора зависит от структуры сенсорного слоя: молекулы аптамера находятся внутри монослоя триэтиленгликольунодекантиола или располсженны над его поверхностью.

Глава 6. Влияние ориентации белковых макромолекул на формирование латеральных напряжений в слое при образовании иммунного комплекса (антиген-антитело). В главе приведены результаты изучения формирования иммунного комплекса в процессе адсорбции антигена пероксидазы хрена (ПХ) на монослойную пленку антитела иммуноглобулина козы (^б), сформированную на золотой и кремниевой поверхностях. Рассмотрены два способа создания на этих поверхностях монослоев из ^б: физический и химический. Физический метод заключался в следующем: сначала на золотую поверхность адсорбировался белок А, который широко известен и применяется в иммуноферментном анализе, затем к поверхности, покрытой белком А, за счет аффинного взаимодействия прививался белок таким образом, чтобы активный центр антитела ^ оставался доступен для последующего взаимодействия с антигеном ПХ. При химическом способе слой антител создавался на кремниевой поверхности, которую предварительно модифицировали 3-аминопропилсилатраном и глутаровым альдегидом, реакция

проходила между аминогруппами иммуноглобулина и альдегидными группами поверхности (Рис. 18).

Адсорбция антигена ПХ антителом физически привитым к золотой поверхности кантилевера, вызывает формирование расталкивающих латеральных напряжений (рис. 19), за счет увеличения исключенного объема иммунного комплекса. После десорбции пероксидазы хрена в глициновом буфере (рН = 3,0) и повторной ее адсорбции иммуноглобулином в фосфатном буфере (рН = 7,4), значение латеральных напряжений, во вновь сформированном слое, были в несколько раз меньше. Это связано с тем, что в ходе удаления антигена ПХ молекулы антитела также частично десорбировались с поверхности.

В случае химической иммобилизации иммуноглобулина на кремниевую поверхность и последующим его взаимодействием с молекулами антигена ПХ в адсорбированном слое также формируются расталкивающие напряжения (Рис. 19). После десорбции ПХ в глициновом буфере и повторной его адсорбции иммуноглобулином значения латеральных напряжений во вновь образовавшемся слое практически не изменились по сравнению со значениями, полученными в ходе предыдущей иммунной реакции (отклонение воспроизводимости не превышало 3 %). Значения латеральных напряжений в слое, сформированном в процессе адсорбции антигенов ПХ антителами физически иммобилизованными на поверхности золота, в полтора раза больше, чем латеральные напряжения в слое, образованным в результате взаимодействия ПХ с поверхностью, на которую прививка иммуноглобулина осуществлялась химическим способом. Аффинное связывание иммуноглобулина с белком А, находящимся на поверхности золота, обеспечивает такую пришивку антител,

Рис. 19. Зависимость a(t) при адсорбции антителами IgG, физически привитыми на поверхность золота, антигенов ПХ: 1 - первоначальная; 2 - повторная после десорбции ПХ в глициновом буфере

Рис. 20. Зависимость a(t) при адсорбции антителами IgG, химически привитыми на поверхность кремния, антигенов ПХ: 1 - первоначальная; 2 - повторная после десорбции ПХ в глициновом буфере

при которой активные центры молекул да, способные связывать антигены ПХ, остаются открытыми. При химической прививке иммуноглобулина, часть связывающих центров антитела конформационно затруднена для иммунной реакции с ПХ из-за взаимодействия с поверхностью кремния. В результате, при образовании иммунного комплекса увеличение исключенного объема слоя в этом случае меньше, чем при физической иммобилизации поверхности. Тем не менее, химическая прививка иммуноглобулина позволяет проводить анализ связывания антигена с антителом после разрушения иммунного комплекса, в то время как использование слоя, полученного физической прививкой да, не позволяет проводить повторный анализ. Таким образом, поверхностный слой, полученный химической прививкой антител да, в отличие от поверхности с физически иммобилизованным слоем иммуноглобулина, обладает уникальным свойством: он может быть многократно использован для сорбции и десорбции антигенов ПХ, что позволяет применять его как регенерируемое сенсорное покрытие.

Выводы

1. На примере двух модельных систем лигандов: бис-4-(2-пиридил-метиленаминофенил)-дисульфида и 4'-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,';6',2"]-терпиридина была установлена взаимосвязь между структурой молекул, формирующих адсорбированный слой, и природой возникающих в нем латеральных напряжений.

2. Установлено, что адсорбция поликатиона 4-ВП отрицательно заряженной поверхностью происходит за несколько минут, в то время как формирование структуры полимерного слоя и релаксация внутренних напряжений в нем занимает часы. Создана методика контроля релаксации напряжений в адсорбированных полиэлектролитных пленках на заряженных поверхностях золота'и кремния.

3. Впервые, основываясь на значениях латеральных напряжений, была рассчитана энергия взаимодействия (водородных связей) между комплементарными звеньями молекулы ДНК, которая коррелирует со значением, полученным исходя из теории молекулярных орбиталей. Для полинуклеоти-дов, способных формировать вторичную структуру на поверхности золота, впервые предложен тримолекулярный механизм образования двойной спирали ДНК.

4. Впервые сенсорным слоем, состоящим из аптамера и триэтиленгли-кольунодекантиола, была проведена адсорбция тромбина, находящегося в движущемся буферном растворе. Установлено, что механизм адсорбции тромбина из потока зависит от структуры'сенсорного слоя: молекулы апта-мера находятся внутри монослоя или расположены над его поверхностью. Разработан способ создания селективного рецепторного слоя на основе ап-

тамеров и триэтиленгликольунодекантиола для определения тромбина в растворе.

5. Установлено, что поверхностный слой, полученный химической прививкой антител, в отличие от поверхности с физически иммобилизованным слоем антител, обладает уникальным свойством: он может быть многократно использован для сорбции и десорбции антигенов ПХ. Предложена методика создания слоя антител на поверхности кантилевера, пригодного для многократного использования в качестве биосенсора.

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:

1. Gorelkin P.V., Mukhin D.S., Majouga A.G., Romashkina R.B., Beloglazkina E.K., Yaminsky I.V., Zyk N.V. New self assembled coated cantilever for histidine protein immobilization // Mendeleev commun., 2010, Vol. 20, P. 329 - 331.

2. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Мухин Д.С., Kim T.S., Kim S.K., Lee S.M., Яминский И.В. Использование биоспецифических реакций для создания высокочувствительных биосенсоров на основе наномеханических кантилеверных систем // Высокомолек. соед. Сер. А, 2010, Т. 52, № 10, С. 1768-1779.

3. Beloglazkina Е.К., Majouga A.G., Zyk N.V., Rakhimov R.D., Yaminsky I.V., Gorelkin P.V., Kiselev G.A., Kutateladze A.G. Bis-(4-(2-pyridylmethyleneiminophenyl))disulfide — A chelating ligand capable of self assembly on gold surface and its complexes with M(BF4)2 and M(CI04)2; M -Co, Cu and Ni. Experimental and theoretical study // Thin solid films, 2007, Vol.515, No.11, P.4649-4661.

4. Yaminsky I.V, Gorelkin P.V., Kiselev G.A. Concurrence of Intermolecular Forces in Monolayers // Japanese Journal of Applied Physics, 2006, Vol. 45, No. 3B, P. 2316-2318.

5. E.B. Украинцев, Г.А. Киселев, Д.В. Багров, П.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул //Датчики и системы, 2007, N1, С. 1821.

6. Kiselev G.A., Gorelkin P.V., Mukhin D.S., Yaminsky I.V. Education laboratory kit for studying kinetics of sorption DNA using BioScan nanomechanical cantilever system // Book of abstracts of the 7th International Workshop on Nanomechanical Cantilever Sensors. Canada. Banff. May 26 - 28. 2010. P. WA10.

7. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Мухин Д.С., Колесов Д.В., Ерофеев А.С., Яминский И.В. Наномеханическая кантилеверная система - новый инструмент для изучения поверхностных явлений // Тезисы докладов Четвертая международной конференции «Современные достижения Бионаноскопии». Москва. 15 - 18 июня. 2010. С. 88.

8. Киселев Г.А., Горелкин П.В., Яминский И.В. Микромеханические био-сенсорь: на основе атомно-силовой микроскопии // Тезисы докладов Второй международной конференции «Современные достижения Бионаноско-пии». Москва. 17 -19 июня. 2008. С. 29.

9. П.В. Горелкин, Д.А. Давыдов, И.В. Яминский, А.А. Ярославов Изучение формирования трехкомпонентиых липидных бислоев на слюде методом атомно-силовой микроскопии // Тезисы докладов Второй международной конференции «Современные достижения Бионаноскопии». Москва. 17 - 19 июня. 2008. С.21.

10. Gorelkin P.V., Kiselev G.A., Filonov A.S., Yaminsky I.V. Sensors with Remote Operation for Chemical and Biological Protection // Book of abstracts of 5th International Workshop on Nanomechanical Cantilever Sensors. Germany. Meinz. May 19-21. 2008. P. 94-95.

11. Gorelkin P.V., Kiselev G.A., Filonov A.S., Yaminsky I.V. Advantages of microcantilever systems in medical applications // Book of abstracts of 5th International Workshop on Nanomechanical Cantilever Sensors. Germany. Meinz. May 19-21. 2008. P. 174-175.

12. Gorelkin P.V., Kiselev G.A., Magouga A.G., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Yaminsky I.V. High precision system for research of monolayer properties // Book of abstracts of 5th International Workshop on Nanomechanical Cantilever Sensors. Germany. Meinz. May 19 - 21. 2008. P. 171-172.

13. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Яминский И.В. Высокоточная микроканти-леверная биоаналитическая система Атомные Весы // Тезисы докладов Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». Москва. 11 - 13 марта. 2008. С. 383-384.

14. Киселев Г.А., Горелкин П.В., Яминский И.В. Прецизионный анализ процессов развития латеральных напряжений в тонких полимерных пленках на твердых поверхностях //Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Кар-гинской Конференции. Москва. 29 января - 2 февраля. 2007. Т. 2. С. 391.

15. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Яминский И.В. Универсальный прецизионный прибор для изучения физико-химических свойств тонких пленок // Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Каргинской Конференции. Москва. 29 января - 2 февраля. 2007. Т. 2. С. 108.

16. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Мажуга А.Г., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Яминский И.В. Исследование формирования заряженных пленок на твердых поверхностях //Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Каргинской Конференции. Москва. 29 января - 2"февраля. 2007. Т. 2. С. 107.

17. Киселев Г.А., Горелкин П.В., Кудринский А.А., Лисичкин Г.В., Яминский И.В. Универсальный сенсор на основе атомно-силового микроскопа //Тезисы докладов Малого Полимерного Конгресса. Москва. 29 ноября - 1 декабря. 2005. С. 94. '

Подписано в печать:

07.10.2011

Заказ № 6018 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы.

1.1 Способы модифицирования поверхности кантилевера и факторы, влияющие на формирование латеральных напряжений в адсорбированном слое.

1.2 Теоретическое обоснование возникновения латеральных напряжений в слое, нанесенном на поверхность золота или кремния, при протекании химических процессов.

1.2.1 Влияние биохимических реакций на формирование латеральных напряжений в биополимерном слое.

1.2.2 Модель формирования латеральных напряжений в вязкоупругом слое, закрепленном на твердой поверхности.

1.3 Модели формирования латеральных напряжений в слое олигонуклеоти-дов, иммобилизованных на поверхности, в процессе их гибридизации.

2 Влияние электростатического и структурного факторов на формирование латеральных напряжений в мономолекулярных слоях.

3 Изучение адсорбции поликатиона на отрицательно заряженную поверхность.

4 Первичная структура полинуклеотидов и механизм адсорбции комплементарных ДНК на модифицированную поверхность.

5. Влияние структуры слоя на природу межмолекулярных взаимодействий при связывании аптамера с белком.

6 Влияние ориентации белковых макромолекул на формирование латеральных напряжений в слое при образовании иммунного комплекса антиген-антитело).

Выводы.

Направление изучения химических процессов, свойств и структуры нанометровых полимерных покрытий на твердых поверхностях является одним из приоритетных в развитие современной науки о полимерах. Не смотря на то, что к настоящему времени полученод большое количество экспериментальных данных, подтверждающих факт возникновения поверхностных напряжений в тонких полимерных пленках, процесс формирования латеральных напряжений в слоях высокомолекулярных соединений, иммобилизованных на поверхности в результате химических реакций или адсорбции, изучен недостаточно глубоко. Очень важно понимание основных механизмов развития латеральных напряжений в слоях таких полимеров, как^полиэлектролиты и биополимеры. Это необходимо для дальнейшего > изучения процессов, происходящих на биологических мембранах, в рецепторных слоях биосенсорных датчиков и на биокаталитических поверхностях. Создание высокоселективных биосенсоров, способных проводить непрерывный качественный и количественный анализ веществ в жидкостях в режиме реального времени, важно, например, для создания непрерывной прикроватной клинической диагностики.

Наиболее перспективным направлением в разработке таких биосенсоров является создание нанометровых датчиков на базе кантилеверов атомно-силового микроскопа. Изгиб кантилеверной консоли, регистрируемый лазерооптической системой, происходит в результате формирования латеральных напряжений внутри сенсорного слоя, который нанесен на поверхность. Причины возникновения латеральных напряжений связаны с возникновением взаимодействия между соседними молекулами в слое. На рисунке 1 представлена схема, показывающая как закрепленные на поверхности молекулы, взаимодействуя друг с другом, формируют напряжение в слое, которое, в свою очередь, взаимодействуя с поверхностью кантилевера, заставляет его изгибаться. Направление сил межмолекулярных взаимодействий Направление результирующей силы

Рисунок 1 — Иллюстрация формирования стягивающих латеральных напряжений в слое, нанесенном на поверхность кантилевера

Например, появление отталкивания между двумя соседними молекулами в слое приводит к генерации расталкивающих (отрицательных изменений) латеральных напряжений, в то время как появление новых связей между молекулами ведет к появлению стягивающих (положительных изменений) латеральных напряжений. Процессы, протекающие при взаимодействии сенсорного слоя с определяемым веществом, обуславливают чувствительность и селективность таких датчиков.

Формирование латеральных напряжений в процессе адсорбции высоко и низкомолекулярных соединений зависит от структуры и физико-химических свойств адсорбированных полимерных слоев. В основу анализа жидкостей с помощью биосенсоров положено биоспецифическое распознавание, такое как взаимодействие антигена с антителом, гибридизация молекул ДНК и взаимодействие аптамер-белок. Вещества, обладающие способностью биоспецифического распознавания, являются, как правило, полиэлектролитами. Знание основных механизмов формирования тонких полимерных слоев полиэлектролитов и биополимеров необходимо для дальнейшего изучения процессов, проходящих на поверхности биологических мембран, создания высококачественных рецепторных слоев и разработки биокаталитических поверхностей.

Биосенсоры являются основным элементом наномеханической кантилеверной системы (НКС), зарекомендовавшей себя в качестве полноценного экспериментального метода, который применяется в исследованиях межмолекулярных взаимодействий в монослойных пленках низкомолекулярных веществ, биополимерных объектов, а также в области химии поверхностных реакций и молекулярной биологии. До появления таких систем не существовало возможности напрямую экспериментально охарактеризовать силы кооперативных взаимодействий биополимеров вблизи поверхности. Особенно актуально использование метода НКС в таких исследованиях, как формирования латеральных напряжений при адсорбции полиэлектролитов и биополимеров, формирования наноструктур на поверхности, гибридизации молекул ДНК, образования поверхностных иммунных комплексов антиген-антитело и создания заданной структуры рецепторного слоя для биосенсорных датчиков. Цель и задачи исследования

Цель работы — определить механизмы формирования нанометровых полимерных слоев на поверхности золота и кремния при специфической адсорбции из растворов полиэлектролитов. Для этого были решены следующие задачи:

1. Выявление влияния электростатического и структурного факторов на формирование латеральных напряжений на примере модельных систем монослоев металлокомплексов бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфида и 4'-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,';6',2' ']-терпиридина.

2. Определение процессов появления и развития напряжений в полиэлектролитах при адсорбции на твердую заряженную подложку. В качестве полиэлектролита был выбран раствор бромида поли-Ы-этил-4-винилпиридиния (4-ВП).

3. Исследование влияния первичной структуры макромолекул ДНК, привитых к поверхности золота и способных к формированию вторичной структуры, на процесс образования двойной спирали с комплементарными им полинуклеотидами из раствора.

4. Оценка вклада длины метиленовой цепи аптамера, интегрированного в рецепторный слой триэтиленгликольунодекантиола, на процесс адсорбции тр9мбина из раствора.

5. Определение взаимосвязи ориентации белковых макромолекул на поверхности и формирования латеральных напряжений в слое в процессе образования иммунного комплекса (антиген-антитело) при специфической адсорбции.

Научная новизна работы.

Впервые изучены закономерности формирования латеральных напряжений в нанометровых слоях в процессе адсорбции полиэлектролитов: В диссертационной работе установлено:

1. Взаимосвязь латеральных напряжений и межмолекулярных взаимодействий- в тонких полимерных пленках при* адсорбции полиэлектролитов на заряженную /поверхность.

2. Охарактеризовано влияние заряда и структуры молекул на образование напряжений в поверхностном слое.

3. Для молекул ДНК, привитых к золотой поверхности и обладающих вторичной структурой, предложена тримолекулярная. модель комплементарного связывания.

4. Обнаружено различие механизмов генерации поверхностных напряжений при взаимодействии тромбина с аптамерами, встроенными в монослой и отличающимися длиной метиленовой цепи.

5. Установлена взаимосвязь между структурой слоя антител иммуноглобулина и латеральными напряжениями, возникающими при биоспецифической адсорбции антигена пероксидазы хрена.

Практическая значимость работы.

Разработан метод непрерывного определения веществ в потоке жидкости с помощью новой наномеханической кантилеверной системы, позволяющей измерять интерпланарные межмолекулярные напряжения в тонких слоях. Создана методика контроля релаксации напряжений в адсорбированных полиэлектролитных пленках на заряженных поверхностях золота и кремния. Предложен экспериментальный способ определения наличия вторичной структуры одноцепочечной ДНК, крайне важный для разработки датчиков на основе полинуклеиновых кислот. Разработан способ создания селективного рецепторного слоя на основе аптамеров и триэтиленгликольунодекантиола для определения тромбина в растворе. Предложена методика создания слоя антител на поверхности кантилевера, пригодного для многократного использования в качестве биосенсора. Апробация; работы.

Основные результаты работы были представлены на 7-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Банф, Канада, 2010 год; на 6-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Джеджу, Южная Корея, 2009' год; 2-ой и 3-ей Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии», Москва, 2008, 2009 годы; Международной конференции «Наномедицина», Сант-Филио, Испания, 2008 год; 5-ой международной конференции по наномеханическим кантилеверным системам, Майнц, Германия, 2008 год; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008 год; Четвертой всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007 год; международном симпозиуме «Электронный нос, электронный язык», Санкт-Петербург, 2007 год; 13-ом коллоквиуме по сканирующей зондовой микроскопии, Саппоро, Япония, 2005 год; Малом полимерном конгрессе, Москва 2005 год.

Личный вклад автора.

Автор принимал непосредственное участие в постановке задач диссертационной работы. Им лично разработана методика по модификации кремневой и золотой поверхностей и выполнена подготовка образцов для исследований методами сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), измерением отклонения датчика наномеханической кантилеверной системы (НКС) и кварцевого микровзвешивания (КМВ). Автором лично проведены анализ и интерпретация экспериментальных данных, обобщены результаты и выявлены факторы, влияющие на формирование латеральных напряжений в рецепторных слоях, нанесенных на поверхность кантилевера. Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 21 печатной работе, из которых 5 - статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 3 -статьи в рецензируемых научных журналах и 14 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

1 Обзор литературы

В данной главе рассмотрены имеющиеся экспериментальные данные, касающиеся исследования латеральных напряжений в адсорбированных слоях веществ различной природы, влияния на них химических процессов, структурных и фазовых изменений. Проанализированы различные способы измерения интерпланарных межмолекулярных взаимодействий с помощью наномеханических кантилеверных систем (НКС). Проведен обзор существующих теоретических работ, в которых приведены различные модели формирования напряжений в тонких полимерных слоях, иммобилизованных на поверхности золота и кремния.

Выводы

1. На примере двух модельных систем лигандов: бис-4-(2-пиридил-метиленаминофенил)-дисульфида и 4'-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,';6',2"]-терпиридина была установлена взаимосвязь между структурой молекул, формирующих адсорбированный слой, и природой возникающих в нем латеральных напряжений.

2. Установлено, что адсорбция поликатиона 4-ВП отрицательно заряженной поверхностью происходит за несколько минут, в то время как формирование структуры полимерного слоя и релаксация внутренних напряжений в нем занимает несколько часов. Создана методика контроля релаксации напряжений в адсорбированных полиэлектролитных пленках на заряженных поверхностях золота и кремния.

3. Основываясь на значениях латеральных напряжений, впервые была рассчитана энергия взаимодействия (водородных связей) между комплементарными звеньями молекулы ДНК, которая коррелирует со значением, полученным исходя из теории молекулярных орбиталей. Для полинуклеотидов, способных формировать вторичную структуру на поверхности золота, впервые предложен тримолекулярный механизм образования двойной спирали ДНК.

4. Впервые сенсорным слоем, состоящим из аптамера и триэтиленгликольунодекантиола, была проведена адсорбция тромбина, находящегося в движущемся буферном растворе. Установлено, что механизм адсорбции тромбина из потока зависит от структуры сенсорного слоя: молекулы аптамера находятся внутри монослоя или расположены над его поверхностью. Разработан способ создания селективного рецепторного слоя на основе аптамеров и триэтиленгликольунодекантиола для определения тромбина в растворе.

5. Установлено, что поверхностный слой, полученный химической прививкой антител IgG, в отличие от поверхности с физически иммобилизованным слоем иммуноглобулина, обладает уникальным свойством: он может быть многократно использован для сорбции и десорбции антигенов ПХ. Предложена методика создания слоя антител на поверхности кантилевера, пригодного для многократного использования в качестве биосенсора.

Благодарность

В заключение хочу выразить глубокую благодарность научному руководителю И.В. Яминскому, сотрудникам лаборатории Г.А. Киселеву, Д.В. Колесову за помощь в создании' эксперементальных установок и A.C. Филонову за помощь в освоении программного обеспечения. За предоставление специально синтезированных соединений для эксперимента А .Г. Мажугу (кафедра органической химии, лаборатория Биологически активных органических соединений Химического ф-та МГУ им. М. В. Ломоносова) и группу Т.С. Кима (Корейский институт науки и технологии). Хочу также выразить признательность A.A. Ярославову за консультации в ходе выполнения работы и Л.Д. Ужиновой за помощь и консультации на последнем этапе работы. Отдельно хочу поблагодарить Г.Б. Мешкова, A.A. Кудринского, и всех студентов, аспирантов и сотрудников группы зондовой микроскопии за дружеское участие и поддержку.

1. Vo-Dinh Т., Cullum В., Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics // Fresenius J. Anal. Chem., — 2000, — Vol. 366, — P. 540-551.

2. Kasemo В., Biological surface science // Surf. Sci., 2002, - Vol.500, - P. 656-677.

3. Lavrik N.V., Sepaniak M.J., Datskos P.G., Cantilever transducers as a platform for chemical and biological sensors // Rev. Sci. Instrum., — 2004, — Vol. 75,-P. 2229-2253.

4. Ziegler C., Cantilever-based biosensors // Anal. Bioanal. Chem., 2004, -Vol. 379,-P. 946-959.

5. Carrascosa L.G., Moreno M., Alvarez M., Lechuga L.M., Nanomechanical biosensors: a new sensing tool // TrAC, Trends Anal. Chem., 2006, — Vol. 25,-P. 196-206.

6. Fritz J., Cantilever biosensors // Analyst, 2008, - Vol. 133, pp. 855-863.

7. Nomura, Т.; Okuhura, M., Frequency shifts of piezoelectric quartz crystals immersed in organic liquids // Anal. Chim. Acta, — 1982, Vol. — P. 281284.

8. Wu G.H., Datar R., Hansen K., Thundat Т., Cote R., Majumdar A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers // Nat. Biotechnol. -2001,-Vol. 19,-P. 856-860.

9. Gimzewski J.K., Gerber C., Meyer E., Schlittler R.R. Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor // Chem. Phys. Lett. — 1994, Vol. 217, - P. 589-594.

10. Chen G.Y., Warmack R.J., Thundat Т., Allison D.P., Huang A. Resonance response of scanning force microscopy cantilevers. Rev. Sci. Instrum. — 1994, Vol. 65, - P. 2532-2537.

11. Thundat Т., Warmack R.J., Chen G.Y., Allison D.P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl. Phys. Lett. 1994, - Vol. 64, - P. 2894-2896.

12. Kolesar E.S., Allen P.B., Howard J.T., Wilken J.M., Boydston N. Thermally-actuated cantilever beam for achieving large in-plane mechanical deflections // Thin Solid Films 1999, - Vol. 355-356, - P. 295-302.

13. Thundat T., Sharp S.L., Fisher W.G., Warmack R.J., Wachter E.A. Micromechanical radiation dosimeter // Appl. Phys. Lett. 1995, - Vol. 66, -P. 1563-1565.

14. Pan C.S., Hsu W. Microstructure for in situ determination of residual strain. II J. Microelectromech. Systems 1999, Vol. 8, Is. 2, - P. 200-207.

15. Finot E., Thundat T., Lesniewska E., Goudonnet J.P. Measuring magnetic susceptibilities of nanogram quantities of materials using microcantilevers // TJltramicroscopy 2001, - Vol. 86, - P. 175-180.

16. Raiteri R., Butt H.-J. Measuring electrochem- ically induced surface stress with an atomic force microscope // J. Phys. Chem. 1995, - Vol. 99, - P. 15728-15732.

17. Davis Z.J., Abadal G., Kuhn O., Hansen O., Grey F., Biosen A. Fabrication and characterization of nano-resonating devices for mass detection // J. Vac. Set Technol., B 2000, - Vol. 18, - P. 612-616.

18. Boskovic S., Chon J.W., Mulvaney P., Sader J.E. Rheological measurements using microcantilevers // J. Rheol. 2002, - Vol. 46, - P. 891-899.

19. Bachels T., Schafer R. Microfabricated cantilever-based detector for molecular beam experiments // Rev. Sci. Instrum. — 1998, — Vol. 69, — P. 3794-3797.

20. Yamada H., Itoh H., Watanabe S., Kobayashi K., Matsushige K. Scanning near-field optical microscopy using piezoelectric cantilevers // Surf. Interface Anal. 1999, - Vol. 27, - P. 503-506.

21. Wu, G. H.; Ji, H. F., Hansen K., Thundat T., Datar R., Cote R, Hagan M. F., Chakraborty A. K., Majumdar A. Origin of nanomechanical cantilever motion generated from biomolecular interactions // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. -2001,-Vol. 98,-P. 1560-1564.

22. Thundat, T., Oden, P. I., Warmack R. J. Microcantilever sensors // Microscale Thermophys. Eng. ,- 1997,-Vol. 1,-P. 185-199.

23. Park K., Daniel JJ., Sturgis I .J., Leeyy J., Robinsonzz J.P., Rashid M.T., Living cantilever arrays' for characterization of mass of single live cells in fluids //Lab Chip, — 2008, — Vol. 8,-P. 1034-1041.

24. Fritz J., Bailer M. K., Lang H. P., Rothuizen H., Vettiger P., Meyer E., Guntherodt H. J., Gimzewski J. K. Translating Biomolecular Recognition into Nanomechanics// Science 2000, - Vol. 288, - P. 316-318.

25. Hansen K., Ji H., Wu G. H., Datar R., Cote R., Majumdar A. Effect of single nucleotide polymorphisms (SNPs) on Nanomechanical Motion // Anal. Chem.- 2001, -Vol. 73,-P. 1567-1571.

26. Jensenius, H.; Thaysen, J.; Rasmussen, A. A.; Veje, L. H.; Hansen, O.; Boisen, A. A microcantilever-based alcohol vapor sensor-application and response model // App. Phys. Lett. 2000, - Vol. 76, - P. 2615-2617.

27. Thundat T., Wachter E.A., Sharp S.L., Warmack R.J. Detection of mercury vapor using resonant microcantilevers // Appl. Phys. Lett. — 1995, — Vol. 66, -P. 1695-1697.

28. Su, M.; Dravid, V. Surface Combustion Microengines Based on Photocatalytic Oxidations of Hydrocarbons at Room Temperature // Nano Lett. 2005, - Vol. 5, - P. 2023-2028.

29. Liu G.L., Long Y.-T., Choi Y., Kang T., Lee L.P., Quantized plasmon quenching dips nanospectroscopy via plasmon resonance energy transfer // Nature Methods, 2007, - Vol. 4, - P. 1015 - 1017.

30. Fang W., Tsai H.-C., Lo C.-Y. Determining thermal expansion coefficients of thin films using micromachined cantilevers // Sens. Actuators, A — 1999, — Vol. 77,-P. 21-27.

31. Lin Y.-H., McConney M. E., LeMieux M.C., Peleshanko S., Jiang C., Singamaneni S., Tsukruk V.V. Trilayered Ceramic-Metal—Polymer Microcantilevers wit Dramatically Enhanced Thermal Sensitivity // Adv. Mater. — 2006, — Vol. 18,-P. 1157-1161.

32. Thundat T., Finot E., Hu Z., Ritchie R.H., Wu G., Majumdar A. Chemical Sensing in Fourier Space // Appl. Phys. Lett. 2000, - Vol. 77, 4061-4063.

33. Kadam A. R., Nordin G. P., George M. A. Use of thermally induced higher order modes of a microcantilever for mercury vapor detection // J. Appl. Phys. 2006, - Vol. 99, - P. 904- 905.

34. Xu X., Thundat T., Brown G. M., Ji H.-F. Detection of Hg2+ Using Microcantilever Sensors // Anal. Chem. 2002, - Vol. 74, - P. 3611- 3615.

35. Cherian, S.; Mehta, A.; Thundat, T. Investigating the Mechanical Effects of Adsorption of Ca2+ Ions on a Silicon Nitride Microcantilever Surface // Langmuir 2002, - Vol. 18, - P. 6935-6939.

36. Cherian S., Thundat T. Determination of adsorption-induced variation in the spring constant of a microcantilever // Appl. Phys. Lett. — 2002, — Vol. 80, — P. 2219-2221.

37. Butt H.-J. A Sensitive Method to Measure Changes in the Surface Stress of Solids II J. Colloid Interface Set 1996, - Vol. 180, - P. 251-260.

38. Raiteri R., Butt H.-J., Grattarola M. Changes in surface stress at the liquid:solid interface measured with a microcantilever // Electrochem Acta. — 2000,-Vol. 46,- P. 157- 163.

39. Pinnaduwage L. A., Hawk J. E., Boiadjiev V., Yi D., Thundat, T. Use of Microcantilevers for the Monitoring of Molecular Binding to Self-Assembled Monolayers // Langmuir 2003, - Vol. 19, - P. 7841-7844.

40. Tabard-Cossa V., Godin M., Grutter P. Redox-Induced Surface Stress of Polypyrrole-Based Actuators // J. Phys. Chem. B 2005, - Vol. 109, - P. 17531-17537.

41. Lemieux M.C., McConney M.E., Lin Y.-H., Singamaneni S., Jiang H., Bunning T. J., Tsukruk V. V. Polymeric Nanolayers as Actuators for UltraSensitive Thermal Bimorphs // Nano Lett. 2006, - Vol. 6, - P. 730-734.

42. Bashir R., Hilt J.Z., Elibol O., Gupta A., Peppas N.A. Micromechanical cantilever as an ultrasensitive pH microsensor // Appl. Phys. Lett. 2002, — Vol. 81,-P. 3091-3093.

43. Ji, H.-F.; Yan, X.; Mcshane, M. J. Experimental and Theoretical Aspects of Glucose Measurement Using a Microcantilever Modified by Enzyme-Containing Polyacrylamide // Diabetes Technol. Ther. — 2005, Vol. 7, — P. 986-995.

44. Zhang Y., Ji H.-F., Brown G., Thundat T. Detection of Cr042" Using a Hydrogel Swelling Microcantilever Sensor // Anal. Chem. 2003, - Vol. 75, -P. 4773-4777.

45. Liu K., Ji H.-F. Detection of Pb Using a hydrogel swelling Microcantilever sensor // Anal. Sci. 2004, - Vol. 20, - P. 9-11.

46. Mao J. S., Kondu S., Ji H. F., McShane M.J. Study of the pH-sensitivity of chitosan/gelatin hydrogel in neutral pH range by microcantilever method // Biotechnol. Bioeng. 2006, - Vol. 95, - P. 333-341.

47. Valiaev A., Abu-Lail N.I., Lim D.W., Chilkoti A., Zauscher S. Microcantilever sensing and actuation with end-grafted stimulus-responsive elastin-like polypeptides // Langmuir 2007, - Vol. 23, - P. 339-344.

48. Arora W. J., Tenhaeff W. E., Gleason K. K., Barbastathis G. Integration of Reactive Polymeric Nanofilms Into a Low-Power Electromechanical Switchfor Selective Chemical Sensing // J. Microelectromech. Syst. 2009, - Vol. 18, - P. 97-102.

49. Lang H. P., Bailer M. K., Berger R., Gerber Ch., Gimzewski J. K., Battiston F.M., Fornaro P., Ramseyer J. P., Meyer E., Guntherodt H.- J. An artificial nose based on a micromechanical cantilever array // Anal. Chim. Acta -1999, Vol. 393, - P. 59-65.

50. Jensenius H., Thaysen J., Rasmussen A. A., Veje L. H., Hansen O., Boisen A. Gas sensor based on micromachined cantilevers with integrated read-out Appl. Phys. Lett 2000, - Vol. 76, - P. 2615-2617.

51. Wright Y. J., Kar A. K., Kim Y. W., Scholz C., George M. A. Study of microcapillary pipette-assisted method to prepare polyethylene glycol-coated microcantilever sensors // Sens. Actuators, В — 2005, Vol. 107, — P. 242-251.

52. Украинцев E.B., Киселев Г.А., Кудринский A.A., Лисичкин Г.В., Яминский И.В., Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе // Высокомолек. соед. Б, 2007, - Т. 49, № 1, - С. 125-129.

53. Betts Т. A., Tipple С. Т., Sepaniak М. J., Datskos P. G. Selectivity of chemical sensors based on micro-cantilevers coated with thin polymer films И Anal. Chim. Acta 2000, - Vol. 422, - P. 89-99.

54. Thundat Т., Chen G.Y., Warmack R. J., Allison D.P., Wachter E.A. Vapor detection using resonating microcantilevers // Anal. Chem. — 1995, Vol. 67,-P. 519-521.

55. Cherian S., Gupta R.K., Mullin B.C., Thundat T. Detection of heavy metal ions using protein-functionalized microcantilever sensors // Biosen. Bioelectron. 2003, - Vol. 19, - P. 411-416.

56. Yan X., Xu X. K., Ji H.-F. Glucose Oxidase Multilayer Modified Microcantilever for Glucose Measurement // Anal. Chem. 2005, Vol. 77, — P. 6197-6204.

57. Subramanian, A.; Oden, P. I.; Kennel, S. J.; Jacobson, K. B. Glucose biosensing using an enzyme-coated microcantilever // Appl. Phys. Lett. — 2002, Vol. 81, - P. 385-387.

58. Yan, X.; Shi, X.; Hill, K.; Ji, H.-F. Microcantilevers Modified by Horseradish Intercalated Nano-Assembly for Hydrogen Peroxide Detection II Anal. Sci. 2006, - Vol. 22,- P. 205-208.

59. Karnati, C.; Du, H.; Ji, H.-F.; Xu, X.; Lvov, Y.; Chen, W.; Mulchandani, A. Organophosphorus hydrolase multilayer modified microcantilevers for organophosphorus detection // Biosens. Bioelectron. — 2007, Vol. 22, — P. 2636-2642.

60. Zhou, F.; Shu, W.; Welland, M. E.; Huck, W. T. S. Highly Reversible and Multi-Stage Manipulation of Microcantilever Motion Driven by Polyelectrolyte Brush // J. Am. Chem. Soc. 2006, - Vol. 128, - P. 53265327.

61. Zhou, F.; Biesheuvel, M.; Choi, E.-Y.; Shu, W.; Poetes, R.; Steiner, U.; Huck, W. T. S. Polyelectrolyte Brush Amplified Electroactuation of Microcantilevers // Nano Lett. 2008, - Vol. 8, - P 725-730.

62. Lang, H. P.; Berger, R.; Andreoli, C.; Brugger, J.; Despont, M.; Vettiger, P.; Gerber, Ch.; Gimzewski, J. K. Sequential position readout from array of micromechanical cantilever sensors // Appl. Phys. Lett. 1998, - Vol. 72, -P. 383-385.

63. Hu, Z.; Thundat, T.; Warmack, R. J. Investigations of adsorption and absorption-induced stresses using microcantilever sensors // J. Appl. Phys. -2001, Vol. 90,- P. 427-431.

64. Chou, Y.-I.; Chiang, H.-C.; Wang, C.-C. Study on Pd fimctionalization of microcantilever for hydrogen detection promotion // Sens. Actuators — 2008, -Vol. 129, P. 72-78.

65. Кара, P.; Liu, P.; Chen, Q.; Morishetti, D.; Mutyala, M. S.; Fang, J.; Varahramyan, K.; Ji, H.-F. Moisture measurement using porous aluminum oxide coated microcantilevers // Sen. Actuators B: Chem. — 2008, — Vol. /34, -P.390-395.

66. Lee, D.; Shin, N.; Lee, K.-H.; Jeon, S. Microcantilevers with nanowells as moisture sensors Sens. Actuators, B: Chem. — 2009, — Vol. 137, P. 561— 565.

67. Guo, Q.; Li, M.; Li, Y.; Shi, L.; Chong, T.C.; Kalb, J. A.; Thompson, С. V. Crystallization-induced stress in thin phase change films of different thicknesses // Appl. Phys. Lett. 2008, - Vol. 93, - P. 221907-1-221907-3.

68. Berger, R.; Delamarche, E.; Lang, H. P.; Gerber, C.; Gimzewski, J. K.; Meyer, E.; Guntherodt, H.-J. Surface Stress in the Self-Assembly of Alkanethiols on Gold // Science 1997, - Vol. 276, - P. 2021-2024.

69. Mertens, J.; Alvarez, M.; Tamayo, J. Real-time profile of microcantilevers for sensing applications // Appl Phys. Lett. 2005, - Vol. 87, - P. 2341021-234102-3.

70. Datskos, P. G.; Sauers, I. Detection of 2-mercaptoethanol using gold-coated micromachined cantilevers // Sens. Actuators 1999, - Vol. 61, — P. 75-82.

71. Marie, R.; Jensenius, H.; Thaysen, J.; Christensen, С. В.; Biosen, A. Adsorption kinetics and mechanical properties of thiol-modified DNA-oligos on gold investigated by microcantilever sensors // Ultramicroscopy -2002,-Vol. 91,- P. 29-36.

72. Moulin, A. M.; O'Shea, S. J.; Badley, R. A.; Doyle, P.; Welland, M. E. Measuring Surface-Induced Conformational Changes in Proteins // Langmuir 1999, - Vol. 15, - P. 8776-8779.

73. Украинцев E.B., Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкин П.В., Кудринский А.А., Лисичкин Г.В., Яминский И.В. Атомные весы: новыевозможности исследования взаимодействия молекул // Датчики и системы — 2007,— Т. 1, — С. 18—21.

74. Knowles, Т. P.; Shu, W.; Huber, F.; Lang, H. P.; Gerber, С.; Dobson, С. M.; Welland, M. E. Label-free detection of amyloid growth with microcantilever sensors // Nanotechnology — 2008, Vol. 19, - P. 3840071-384007-5.

75. Shu, W.; Laurenson, S.; Knowles, T. P. J.; Ferrigno, P. K.; Seshia, A. A. Highly specific label-free protein detection from lysed cells using internally referenced microcantilever sensors // Biosens. Bioelectron. — 2008, Vol. 24,- P. 233-237.

76. Pera, I.; Fritz, J. Sensing Lipid Bilayer Formation and Expansion with a Microfabricated Cantilever Array // Langmuir 2007, — Vol. 23, — P. 15431547.

77. Backmann, N.; Zahnd, C.; Huber, F.; Bietsch, A.; Pluckthun, A.; Lang, H.-P.; Guntherodt, H.-J.; Hegner, M.; Gerber, C. A label-free immunosensor array using single-chain antibody fragments // PNAS. — 2005,-Vol. 102, -P. 14587- 14592.

78. Velanki, S.; Ji, H.-F. Meas, Detection of Feline Coronavirus Using Microcantilever Sensors // Sci. Technol. 2006, - Vol. 17, - P. 29642968.

79. Yan, X.; Zhang, J.; Ji, H.-F.; Thundat, T. Molecular Recognition ofBiowarfare Agents Using Micromechanical Sensors I/ Expert Rev. Mol. Diagn. 2004, - Vol. 4 (6), - P. 859-866.

80. Zhang, J.; Ji, H.-F. An Anti E. Coli 0157:H7 Antibody-Immobilized Microcantilever for the Detection of Escherichia Coli (E. Coli) // Anal. Sci. 2004, - Vol. 20, - P. 585-587.

81. Kim, В. H.; Mader, O.; Weimar, U.; Brock, R.; Kern, D. P. Detection of antibody peptide interaction using microcantilevers as surface stress sensors II J. Vac. Sci. Technol., В 2003, - Vol. 21, - P. 1472-1475.

82. Alvarez, M.; Calle, A.; Tamayo, J.; Lechuga, L. M.; Abad, A.; Montoya, A. Detection of nanomechanical biosensors for detection of the pesticide DD // Biosens. Bioelectron. 2003, - Vol. 18, - P. 649-653.

83. Yan, X.; Ji, H.-F.; Thundat, T. Microcantilever Biosensing // Curr. Anal Chem. 2006, - Vol. 2, - P. 297-307.

84. Liu, F.; Zhang, Y.; Ou-Yang, Z. Flexoelectric origin of nanomechanic deflection in DNA- microcantilever system // Biosens. Bioelectron. — 2003, -Vol. 18, P. 655-660.

85. Ji, H.-F.; Thundat, T.; Dabestani, R.; Brown, G. M.; Britt, P. F.; Bonnesson, P. Ultrasensitive Detection of CrC>4 " Using a Microcantilever sensor // Anal. Chem. -2001, -Vol. 73,-P. 1572-1576.

86. Kim, D. J.; Weeks, B. L.; Hope-Weeks, L. J. Effect of Surface Conjugation Chemistry on the Sensitivity of Microcantilever .Sensors // Scanning- 2007, Vol. 29, - P. 245-248.

87. Shu, W.; Laue, E. D.; Seshia, A. A. Investigation of biotin-streptavidin binding interactions using microcantilever sensors // Biosens. Bioelectron. 2007, - Vol. 22, - P. 2003- 2009.

88. Tabard-Cossa, V.; Godin, M.; Burgess, I. J.; Monga, T.; Lennox, R. B.; Grutter, P. Microcantilever-Based Sensors: Effect of Morphology, Adhesion, and Cleanliness of the Sensing Surface on Surface Stress // Anal. Chem. -2007,-Vol. 79,-P. 8136-8143.

89. Gao, H.; Buchapudi, K. R.; Harms-Smyth, A.; Schulte, M. K.; Xu, X.; Ji, H.-F. Improved surface modification approach for micromechanical biosensors // Langmuir 2008, - Vol. 24, - P. 345-349.

90. Lavrik, N. V.; Tipple, C. A.; Sepaniak, M. J.; Datskos, P. G. Gold nano-structures for transduction of biomolecular interactions into micrometer scale movements // Biomed. Microdevices — 2001, — Vol. 3, — P. 35-44.

91. Lavrik, N. V.; Tipple, C. A.; Sepaniak, M. J.; Datskos, P. G. Enhanced chemi-mechanical transduction at nanostructured interfaces // Chem. Phys. Lett. — 2001, — Vol. 336, P. 371-376.

92. Headrick, J. J.; Sepaniak, M. Ji; Lavrik, N. V.; Datskos, P. G. Enhancing chemi-mechanical transduction in microcantilever chemical sensing by surface modification // Ultramicroscopy — 2003, Vol. 97, — P. 417-424.

93. Stolyarova, S.; Cherian, S.; Raiteri, R.; Zeravik, J.; Skladal, P.; Nemirovsky, Y. Composite Porous Silicon- Crystalline Silicon Cantilevers for Enhanced Biosensing // Sens. Actuators, B 2008, - Vol. 131, - P. 509-515.

94. Lee, D.; Kim, E.-H.; Yoo, M.; Jung, N.; Lee, K.-H.; Jeon, S. Enhanced mass sensitivity of stress-free, silicon nanowire-grown microcantilever sensors II Appl. Phys. Lett. 2007, - Vol. 90,- P. 113107-1-113107-3.

95. Desikan, R.; Lee, I.; Thundat, T. Effect of nanometer surface morphology on surface stress & adsorption kinetics of alkanethiol self-assembled monolayers // Ultramicroscopy — 2006, Vol. 106, 795-799.

96. Godin, M.; Williams, P. J.; Cossa, V. T., Olivier Laroche, L. Y. Beaulieu, R. B. Lennox, Peter Grutter Surface Stress, Kinetics, and Structure of Alkanethiol Self-Assembled Monolayers // Langmuir 2004, 20, 70907096.

97. Haiss, W. Surface stress of clean and adsorbate-covered solids // Rep. Prog. Phys 2001, - Vol. 64, 591-648.

98. Hagan, M.F., Majumdar, A., Chakraborty, A.K., Nanomechanical forces generated by surface grafted DNA. // J. Phys. Chem. B 2002. - Vol. 106, -P. 10163-10173.

99. Strey, H.H., Parsegian, V.A., Podgornik, R.,. Equation of state for DNA liquid crystals: fluctuation enhanced electrostatic double layer repulsion. // Phys. Rev. Lett. 1997 - Vol. 78, - P. 895-898.

100. Strey, H.H., Parsegian, V.A., Podgornik, R.,. Equation of state for polymer liquid crystals: theory and experiment. // Phys. Rev. E — 1999 — Vol. 59, — P. 999-1008.

101. Prashant, K.P., Jane, K., Rob, P.,. Force steps during viral DNA packaging // J. Mech. Phys. Solids 2003, - Vol. 52, - P. 2239-2257.

102. Klug, W.S., Ortiz, M.,. A director-field model of DNA packaging in viral capsids. //J. Mech. Phys. Solids-2003,-Vol. 51,-P. 1815-1847.

103. Hansen, K.M., Thundat, T.,. Microcantilever biosensors. // Methods 2005 -Vol. 37,-P. 57-64.

104. Stachowiak, J.C., Yue, M., Castelino, K., Chakraborty, A., Majumdar, A.,. Chemomechanics of surface stresses induced by DNA hybridization. // Langmuir 2006, - Vol. 22, - P. 263-268.

105. Meyer, R.B.,. Piezoelectric effects in liquid crystals. // Phys. Rev. Lett. — 1969,-Vol. 22,-P. 918-921.

106. Liu, F., Zhang, Y., Ou-Yang, Z.C. Flexoelectric origin of nanomechanic deflection in DNA-microcantilever system. // Bios ens. Bioelectron. — 2003, -Vol. 18,-P. 655-660.

107. Stoney, G. G. The Tension of Metallic Films Deposited by Electrolysis // Proc. R. Soc. (London) 1909, - Vol. 82, - P. 172-175.

108. Maria L. Sushko, John H. Harding, Alexander L. Shluger, Rachel A. McKendry, and Moyu Watari, Physics of Nanomechanical Biosensing on Cantilever Arrays II Adv. Mater. 2008, - Vol. 20, - P. 3848-3853

109. R. Shuttleworth, The surface tension of solids // Proc. Phys. Soc. London A 1950, - Vol. 63, - P. 444-457.

110. M. Watari, J. Galbraith, H.-P. Lang, M. Sousa, M. Hegner, C. Gerber, M. A. Horton, R. A. McKendry, Investigating the molecular mechanisms of in-plane mechanochemistry on cantilever arrays // J. Am. Chem. Soc. — 2007, Vol. 129, - P. 601-609.

111. Дж. Ферри, Вязкоупругие свойства полимеров, Пер. с англ. М.: ИЛ, 1963. 536с

112. Timoshenko S. Analysis of Bi-metal Thermostats, // J. Opt. Soc. Am. -1925, Vol. 11, - P. 233-255.

113. Clyne T. W. In Interfacial Effects in Particulate, Fibrous and Layered Composite // Materials Key Engineering Materials — 1996, — Vols. 116-117,-P. 307-330.

114. Martin S. J., Frye G. C., Senturia S. D. Dynamics and response of polymer-coated surface acoustic wave devices: effect of viscoelastic properties and film resonance // Anal. Chem. 1994 - Vol. 66, - P. 22012219.

115. Sader J. E. Surface stress induced deflections of cantilever plates with applications to the atomic force microscope: Rectangular plates. // J. Appl. Phys. -2001,- Vol. 89,-P. 2911-2921.

116. McCrum N. G., Read В. E., Williams G. Anelastic and Dielectric Effects in Polymeric Solids II Wiley, New York, 1967, - P. 617.

117. Wenzel M. J., Josse F., Heinrich S. M., Yaz E., Datskos P. G. Sorption-induced static bending of microcantilevers coated with viscoelastic material // J. Appl. Phys. 2008, - Vol. 103,-P. 064913-1-064913-11.

118. Zhang N.H., Xing J.J., Shan J.Y. Multiscale simulation for nanomechanical behavior of gene chips in label-free biodetection. // Fifth International Conference on Nonlinear Mechanics, Shanghai, Shanghai University Press, 2007, - P. 562-565.

119. Zhang, N.H., Shan, J.Y., Xing, J J. Piezoelectric properties of single-strand DNA molecular brush biolayers. // Acta Mech. Sol. Sin. 2007, - Vol. 20 (3),-P. 206-210.

120. Yue, M., Lin, H., Dedrick, D.E., Satyanarayana, S., Majumdar, A., Bedekar, A.S., Jenkins, J.W., Sundaram, S. A 2-D microcantilever array for multiplexed biomolecular analysis // J. Microelectromech. Syst. — 2004, -Vol. 13,-P. 290-299

121. Zhang, N.H. Thermoelastic stresses in multilayered beams // Thin Solid Films 2007, - Vol. 515 (23), - P. 8402-8406.

122. Zhang, N.H., Chen, J.Z. An alternative two-variable model for bending problems of multilayered beams // J. Appl. Mech. 2008 - Vol. 75, Is. 4, -P. 044503-044505

123. Zhang, N.H., Xing, J.J.,. An alternative model for elastic bending deformation of multilayered beams. // J. Appl. Phys. — 2006, Vol. 100, -P. 103519-1-103519-3.

124. Podgornik, R., Parsegian, V.A.,. Molecular fluctuations in the packing of polymeric liquid crystals. // Macromolecules 1990, - Vol. 23, - P. 22652269.

125. Podgornik, R., Rau, D.C., Parsegian, V.A. Parametrization of direct and soft steric-undulatory forces between DNA double helical polyelectrolytes in solutions of several different anions and cations. // Biophys. J., 1994, -Vol. 66,-P. 962-971.

126. Rau, D.C., Lee, B., Parsegian, V.A.,. Measurement of the repulsive force between polyelectrolyte molecules in ionic solution: hydration forces between parallel DNA double helices. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, -1984, Vol. 81, - P. 2621-2625.

127. Leiken, S., Parsegian, V.A., Rau, D.C., Rand, R.P.,. Hydration forces. // Annu. Rev. Phys. Chem. 1993 - Vol. 44, - P. 369-395.

128. Freund, L.B.,. Some elementary connections between curvature and mismatch strain in compositionally graded thin films // J. Mech. Phys. Solids 1996, - Vol. 44, - P. 723-736.

129. Heme, T.M., Tarlov, M.J.,. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.// J. Am. Chem. Soc. 1997, - Vol. 119, - P. 8916-8920.

130. Klug, W.S., Ortiz, M.,. A director-field model of DNA packaging in viral capsids. II J. Mech. Phys. Solids 2003, - Vol. 51, - P. 1815-1847.

131. Z. Jerzy, H. Yuan, Thiol-derivatized metalloporphyrins: monomolecular films for the electrocatalytic reduction of dioxygen at gold electrodes // Langmuir, 1993, - Vol. 9, - P. 2772-2774.

132. K.V. Gobi, T. Ohsaka, Enhanced Electrostatic Interactions for Selective and Controllable Permeation of Ionic Species at a Monolayer of Self-Assembled Dicationic Nickel Complex // J. Electroanal. Chem. 1999, — Vol. 465,-P. 177-186.

133. C.G.F. Cooper, J.C. MacDonald, E. Soto,W.G. McGimpsey, Non-Covalent Assembly of a Photoswitchable Surface II J. Am. Chem. Soc. 2004 - Vol. 126-P. 1032-1033.

134. E. Coronado, A. Forment-Aliaga, F.M. Romero, Copper(I) pseudorotaxane monolayers assembled on gold electrodes // Inorg. Chem. — 2004, — Vol. 42,-P. 6959-6961.

135. Nuzzo, D.L. Allara, Adsorption of Bifunctional Organic Disulfides on Gold Surfaces II J. Am. Chem. Soc. 1983, - Vol. 105, - P. 4481-4483.

136. D. Swalen, D.L. Allara, J.D. Andrade, Molecular monolayers and films // Langmuir- 1987, Vol. 3, - P. 932-950.

137. D. Lee, R.L. Donkers, G. Wang, A.S. Harper, R.W. Murray, Electrochemistry and Optical Absorbance and Luminescence of Moleculelike Au38 Nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 2004, - Vol. 126, - P. 6193-6199.

138. O. Lioubashevsky, V.I. Chegel, F. Patolsky, E. Katz, I. Willner, Enzyme-catalyzed bio-pumping of electrons into Au-nanoparticles: A surface plasmon resonance and electrochemical study // J. Am. Chem. Soc. — 2004, -Vol. 126,-P. 7133-7143.

139. B. C. Fagan, C.A. Tipple, Z. Xue, MJ. Sepaniak, P.G. Datskos. Modification of micro-cantilever sensors with sol-gels to enhance performance and immobilize chemically selective phases IITalanta, — 2000, Vol.3, No.3, - P.599-608.

140. C.A. Savran, S.M. Knudsen, A.D. Ellington, S.R. Manalis. Micromechanical detection of proteins using aptamer-based receptor molecules // Anal Chem., 2004, - Vol.76, No. 11, - P.3194-3198.

141. E.C. Constable, M.D. Ward Synthesis and co-ordination behaviour of 6,,6M-bis(2-pyridyl)-2,2,:4,4":2",2",-quaterpyridine; 'back-to-back' 2,2':6',2"-terpyridine // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1990. - P. 14051409.

142. W. Henke, S. Kremer, D. Reinen, Cu2+ in five-coordination: a case of a second-order Jahn-Teller effect. I: Structure and spectroscopy of the compounds Cu(terpy)X2-nH20 // Inorg. Chem. 1983, - Vol. 22, - P. 2858-2863

143. Caruso, F.; Trau, D.; Mo"hwald, H.; Renneberg, R. Enzyme Encapsulation in Layer-by-Layer Engineered Polymer Multilayer Capsules // Langmuir — 2000,-Vol. 16,- P. 1485-1490

144. Heuberger, R.; Sukhorukov, G.; Vo"ro"s, J.; Textor, M.; Mohwald, H. B Afunctional polyelectrolyte multilayers and microcapsules: Control ofnon-specific and bio-specific protein adsorption // AdV. Fund. Mater. — 2005, Vol. 15, - P. 357-360.

145. Smitha, B.; Sridhar, S.; Khan, A. A. Tuning the Transport Properties of Poly(oxyethylene)bisamine-Nafion Polyelectrolyte Complexes by Dielectric Manipulation // Macromolecules — 2004, Vol. 37,- P. 22332239.

146. Yamaguchi, T.; Miyata, F.; Nakao, S. Polymer electrolyte membranes with pore-filling structure for a direct methanol fuel cell // AdV. Mater. — 2003, -Vol. 15, -P. 1198-1203.

147. Wâgberg, L.; Forsberg, S.; Johansson, A.; Juntti, P. Engineering of fibre surface properties by application of the polyelectrolyte multilayer concept. Part I. Modification of paper strength. // J. Pulp Pap. Sci. — 2002, — Vol. 28,- P. 222-225.

148. Yan, X.; Hill, K.; Gao, H. Y.; Ji, H.-F. Surface Stress Changes Induced by the Conformational Change of Proteins // Langmuir 2006, - Vol. 22, - P. 11241-11247.

149. Yan, X. D.; Ji, H. F.; Lvov, Y. Modification of microcantilevers using Layer-by-Layer nanoassembly film for glucose measurement Chem. Phys. Lett. 2004, - Vol. 34, - P. 396 - 400.

150. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites // Science 1997, - Vol. 277, - P. 1232 - 1237.

151. Jiang, C. Y.; Markutsya, S.; Pikus, Y.; Tsukruk, V. V. Freely suspended nanocomposite membranes as highly sensitive sensors // Nat. Mater. -2004, Vol. 3, - P. 721 - 725.

152. Ono, S. S.; Decher, G. Preparation of ultrathin self-standing polyelectrolyte multilayer membranes at physiological conditions using pH-responsive film segments as sacrificial layers // Nano Lett. — 2006, -Vol. 6,- P. 592-594.

153. Nolte, A. J.; Rubner, M. F.; Cohen, R. E. Determining the Young's Modulus of Polyelectrolyte Multilayer Films via Stress-Induced

154. Mechanical Buckling Instabilities // Macromolecules — 2005, Vol. 38, — P. 5367-5369.

155. Burke, S. E.; Barrett, C. J. Swelling Behavior of Hyaluronic Acid/Polyallylamine Hydrochloride Multilayer Films // Biomacromolecules 2005, - Vol. 6, - P. 1419-1428.

156. Nuzzo, R. G.; Allara, D. L., Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surfaces // J. Am. Chem. Soc. 1983, - Vol. 105, - P. 4481-4483

157. Nolte, A. J.; Takane, N.; Hindman, E.; Gaynor, W.; Rubner, M. F.; Cohen, R. E. Thin Film Thickness Gradients and Spatial Patterning via Salt Etching of Polyelectrolyte Multilayers // Macromolecules — 2007, — Vol. 40,- P. 5479

158. J. Mertens, C. Rogero, M. Calleja, D. Ramos, J. A. Martin-Gago, C. Briones, J. Tamayo, Label-free detection of DNA hybridization based on hydrationinduced tension in nucleic acid films // Nature Nanotechnology, — 2008, VOL 3, - P. 301-307,.

159. Michael F. Hagan, Arup K. Chakraborty, Hybridization dynamics of surface immobilized DNA //J. Chem. Phys., 2004, - Vol. 120, - No. 10, 4958-4968.

160. Patel A.R., Frank C.W. Quantitative Analysis of Tethered Vesicle Assemblies by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring: Binding Dynamics and Bound Water Content // Langmuir — 2006, Vol. 22,-P. 7587-7599

161. Famulok, M., Mayer, G., Blind, M., Nucleic Acid AptamersFrom Selection in Vitro to Applications in Vivo // Acc. Chem. Res. — 2000, -Vol. 33,-P. 591-599.

162. Wilson, D.S., Szostak, J.W. In Vitro Selection of Functional Nucleic Acids // Annu. Rev. Biochem 1999, - Vol. 68, - P. 611-647.

163. Kirby, R, Cho, E.J., Gehrke, B., Bayer, T., Park, Y.S., Neikirk, D.P., McDevitt, J.T., Ellington, A.D. Aptamer-Based Sensor Arrays for the Detection and Quantitation of Proteins // Anal. Chem. — 2004 — Vol. 76, -P. 4066-4075.

164. Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E., An Aptamer-Based Quartz Crystal Protein Biosensor // Anal. Chem. 2002 - Vol. 74, - P. 44884495.

165. Drolet, D.W., MoonMcDermott, L., Romig, T.S., An enzyme-linked oligonucleotide assay.// Nat. Biotechnol. 1996 - Vol. 14, - P. 10211025.

166. Blank, M., Weinschenk, T., Priemer, M., Schluesener, H.,. Systematic Evolution of a DNA Aptamer Binding to Rat Brain Tumor Microvessels // J. Biol. Chem. -2001 Vol. 276, - P. 16464-16468.

167. N. Nugaeva, K.Y. Gfeller, N. Backmann, H.P. Lang, M. Duggelin, M. Hegner. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection // Biosensors and Bioelectronics, 2005, - Vol.21, - P. - P. 849-856.

168. H. Wang, Y. Liu, Y. Yang, T. Deng, G. Shen, R. Yu. A protein A-based orientation-controlled immobilization strategy for antibodies using nanometer-sized gold particles and plasma-polymerized film // Anal Biochem., 2004, - Vol.324, No.2, - P. 219-226.

169. Samour C.M. //Pat. 3118921 USA. 1964

170. Sakai G., Ogata K., Uda T., Miura N., Yamazoe N. A surface plasmon resonance-based immunosensor for highly sensitive detection of morphine //Sens, actuators B. 1998. - Vol. 45. № 1. - P. 5-12.

171. Sakai G., Nakata S., Uda T., Miura N., Yamazoe N. Highly selective and sensitive SPR immunosensor for detection of methamphetamine // Electrochim. Acta. 1999. - Vol. 44. № 21. - P. 3849-3854.

172. Pellequer J.L., Chen S., Roberts V.A., Tainer J.A., Getzoff E.D. Unraveling the effect of changes in conformation and compactness at V(L)-V(H) interface upon antigen binding // J. Mol. Recognit. 1999. — Vol. 12. №4.-P. 267-275.