Модели расчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов с ДНК тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛОМЗОВ АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

МОДЕЛИ РАСЧЕТА СТАБИЛЬНОСТИ КОМПЛЕКСОВ МОСТИКОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ДНК

01 04 17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 6 ОКТ 2008

Новосибирск - 2008

003448445

Работа выполнена в

Учреждении Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН), Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский Государственный Университет» (НГУ)

Научный руководитель

кандидат химических наук, доцент Пышный Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, доцент Воробьев Юрий Николаевич, кандидат физико-математических наук, Титов Игорь Иванович

Ведущая организация

Химический факультет Московского государственного университета имен Ломоносова М В

Защита диссертации состоится «15» октября 2008 г в 15— на заседани диссертационного совета Д 003 014 01 в Учреждении Российской академии нау Институт химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН (ИХКГ С РАН) по адресу 630090, Новосибирск, ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российски академии наук Институт химической кинетики и горения Сибирского отделени РАН (ИХКГ СО РАН)

Автореферат разослан «12» сентября 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук

А А Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание производных нуклеиновых кислот (НК), обладающих улучшенными функциональными характеристиками, имеет как фундаментальное, так и практическое значение Фундаментальный интерес, в первую очередь, связан с желанием расширить представления о физической природе взаимодействий, способствующих формированию двойной спирали ДНК Практическая значимость обусловлена широким спектром применения олигонуклеотидов (ОН) и их производных Возможность направленного изменения комплексообразующих свойств путем введения в регулярную структуру биополимера модификаций позволяет повысить эффективность и расширить сферу их использования Олигодезоксирибонуклеотиды, состоящие из двух или более фрагментов, которые соединены гибкими ненуклеотидными линкерами, - мостиковые олигонуклеотиды (МО), являются перспективными агентами, позволяющими создавать на их основе зонды, с направлено пониженными гибриди-зационными свойствами при сохранении сиквенс-специфичности взаимодействия с НК

Цель работы. Построение модели расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов мостиковых олигонуклеотидов (величин энтальпии (ДН°), энтропии (ДБ0), свободной энергии Гиббса (ДО°37) комплексообразования и температуры плавления (Тпл) дуплексов) в стандартных условиях (1М ИаС1, рН ~ 7) и расширение прогностической способности данной модели на случай использования буферных растворов с различной концентрацией противоионов, в том числе при конкурентном связывании нескольких типов катионов с ДНК

Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование комплексообразующих свойств мостиковых олигодезоксирибонуклеоти-дов, содержащих ненуклеотидные вставки на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3 -фосфата (ТР), олигоэтиленглико-лей бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (ОЕв, ТЕС, НЕв), или олигометилендиолов 5-гидрокси-пентил-1- и 10-гидроксидецил-1-фосфатов (РБ и ББ) и их регулярных повторов Исследование характеристик равновесного образования дуплексных структур проводили методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала Кинетические константы комплексообразования определяли, используя метод остановленной струи Полученные данные позволили впервые построить модели прогностического расчета стабильности комплексов МО с комплементарными последовательностями ДНК Модели основаны на приближении «ближайших соседей» (БС), которое с высокой точностью позволяет рассчитывать термодинамические параметры комплексообразования МО, несущих ненуклеотидные вставки на основе ди-

этиленгликоля, в стандартных условиях. Разработана модель, используя которую можно определять величину дестабилизирующего вклада ненук-леотидной вставки в энергию комплексообразования МО в зависимости от числа ковалентных связей, формирующих остов вставки

Впервые создана неэмпирическая модель, учитывающая нелинейность зависимости обратной температуры плавления комплексов олиго-нуклеотидов от логарифма концентрации катионов в растворе С ее помощью можно с высокой точностью рассчитывать стабильность комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов при различных концентрациях противоионов в растворе, в том числе в случае конкурентного взаимодействия одновалентных катионов и ионов магния с ДНК

Предложены новые способы учета вкладов внутримолекулярных комплексов ОН при определении термодинамических и кинетических характеристик формирования межмолекулярных НК-дуплексов, что позволяет определять «истинные» параметры перехода спираль-клубок в ДНК

Практическая значимость. Предложенные подходы позволяют проводить расчет величин термодинамических характеристик (АН0, Д8°, ДО°з7 и Тпл) формирования дуплексных структур ДНК С их использованием оказывается возможным проводить направленный выбор структуры олигонуклеотидов, например, при создании систем анализа генетического материала, основанных на методе молекулярной гибридизации Кроме того, используя разработанные модели, можно проводить оценку вкладов отдельных типов взаимодействий (электростатиче-

ских/неэлектростатических) в энергию формирования ДНК/ДНК комплексов

Основные положения, выносимые на защиту.

Модели расчета термодинамических параметров формирования комплексов МО в стандартных условиях (1 М №С1, нейтральные значения рН)

Модель пересчета стабильности комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов из стандартных условий в условия с другими концентрациями одновалентных катионов и ионов магния

Подходы для учета вклада вторичных структур олигонуклеотидов при определении термодинамических параметров и кинетических характеристик образования дуплексных структур НК

Личный вклад автора. Все результаты, приведенные в диссертации, получены либо самим автором, либо с его непосредственным участием Автор участвовал в постановке задач, решаемых в рамках диссертационной работы, в написании и подготовке публикации статей и тезисов кон-

ференций, самостоятельно проводил основные эксперименты и обрабатывал результаты, интерпретировал полученные данные

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 14 конференциях, в том числе International Conference «Targeting RNA Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA-mterference», 18-21 Июня 2003г, Новосибирск, Россия, «Десятая Всероссийская Научная Конференция Студентов-Физиков и Молодых Ученых», 1-7 апреля 2004 г, Москва, Россия, «1st International Conference on Chemical Biology», 2-7 Июля 2005г, Новосибирск, Россия, «Международная конференция «Физико-химическая биология»» 30 июля-3 августа 2006г, Новосибирск Россия, «Albany 2007 The 15th Conversation», 19-23 Июня 2007г, Олбани, США

Публикации. Основной материал диссертации опубликован в 5 статьях в рецензируемых научных журналах и в 2 статьях в сборниках трудов

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и 7 приложений Объем диссертации составляет 175 страниц, включая 45 рисунков и 38 таблиц Библиография содержит 167 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение содержит обоснование и актуальность проводимых исследований. В нем сформулирована цель работы, определена научная новизна, охарактеризована практическая значимость полученных результатов

Первая глава диссертационной работы является обзором литературы, состоящим из четырех частей, в которых объединены данные по стабильности ДНК/ДНК комплексов ОН В первой части рассмотрены общие вопросы, касающиеся стабильности комплексов НК Вторая часть содержит данные о модельных представлениях для расчета стабильности комплексов ОН. В третьей части описаны модельные представления, основанные на приближении «ближайших соседей» Приведены величины унифицированных термодинамических инкрементов, соответствующих различным структурным элементам дуплексов, позволяющие проводить расчет стабильности комплексов НК, имеющих различные нарушения регулярной структуры, как встречающиеся в природе, так и создаваемые искусственно В этой части рассмотрены только систематически описанные возмущения регулярной структуры ДНК/ДНК комплексов В четвертой части обобщены данные о влиянии буферных условий на способность ОН формировать комплексы Основное внимание уделено моделям расчета комплексообразующих свойств ОН с НК при различных концентрациях катионов в растворе, в том числе, в случае конкурентного свя-

TF

-NlN-

0

0 I

N) n=1'5

0"

0

I DEGn

Г0 P"

Lo o-p- !

^ a

О

< (Vo-P- )„ 0

0 -

0=P~ I I

/ О

( r-u tegn ^ j

о-" 1

0~ 0-p-0 ' n

O"

I

0=p-

( hegn <4 > i

о o—'

Рисунок 1. Структура динуклеотидного шага (NN), несущего ненуклеотидную вставку (L„).

зывания нескольких различных типов катионов с ДНК (например, ионов натрия и магния).

Вторая глава диссертации посвящена описанию экспериментов и состоит из четырех частей. В первой части охарактеризованы реактивы и описаны методики подготовки материалов для проведения исследований. Во второй, третьей и четвертой частях описаны методы исследования структуры НК (метод кругового дихроизма), получения термодинамических (метод термической денатурации с оптической регистрацией сигнала) и кинетических (метод остановленной струи) характеристик формирования комплексов ОН.

Третья глава («Результаты и их обсуждение») содержит три части. Первая часть состоит из четырех разделов, в которых представлены данные систематического исследования формирования комплексов МО, несущих вставки на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3-фосфата (TFJ, олигоэтиленгликолей: бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (DEGn, TEGn, HEGn); или олигомети-лендиолов: 5-гидроксипентил-1- и 10-гидроксидецил-1 -фосфатов (PDn и DDn) и их регулярных повторов (Рис. 1). Первый раздел посвящен исследованию структуры комплексов МО. Методом кругового дихроизма (КД) было показано, что спектры КД комплексов, образованных с участием модифицированных, содержащих различные вставки на основе олигоэтиленгликолей и олигометилендиолов, и немодифицированных ОН при низких температурах, характерны для двойной спирали ДНК В-формы (Рис. 2). В спектрах КД всех комплексов регистрируются сравнимые по интенсивности длинноволновая положительная полоса (максимум около 280 нм), коротковолновый отрицательный минимум (250 нм), а точка нулевой эллиптичности лежит вблизи максимума поглощения 260 нм (Ivanov V.l. и др., 1983). Незначительные различия в спектрах комплексов нативных и модифицированных олигонуклеотидов свидетельствуют о локальном возмущении структуры дуплекса при введении ненуклеотид-ной вставки.

О

6

X

S 4

M8/N4(LJ4

GCTC(Ln)CAGG3 CGAG—GTCC5

- -2 cd

'-' -4

M10/N5(Ln)5

AGCTC(Ln,CAGGC3' TCGAG—GTCCG5

-8

-6

>lg,>5 15°C M12/N6(l">6

O 95°C 5CAGCTC(L")CAGGCA3' ;<dec.>5 95oC 3GTCGAG—GTCCGT5'

Рисунок 2. Спектры КД нативного (M10/N10, где N10 = N5(Ln)5, Ln - нет) и модифицированного (M10/NS(Ln)5, Ln = (DEG,)) комплексов ОН при 15 °С и смеси олигонуклеотидов в одно цепочечном состоянии (М10 + N10, M10/N5(DEGl)5) при 95 °С (слева). [MIO] = [N5ÍLn)5] = 5-Ю"3 М. Комплексы ОН с одинаковой коровой последовательностью, исследованные в данной работе (справа).

Второй раздел посвящен исследованию термодинамических характеристик формирования комплексов МО с ДНК. Образование комплексов с их участием может быть описано равновесной схемой представленной на рисунке ЗА. В случае Ка ,Ка » 1/Кр формирование комплекса может

быть представлено в рамках приближения двух состояний (модель «все-или-ничего»), с эффективной константой ассоциации к .. = К -К -К,,

Эфф 12

(Рис. ЗБ). Правомерность использования приближения двух состояний при образовании комплексов МО подтверждается выполнением следующих критериев: 1) экспериментальные кривые термической денатурации и теоретические, рассчитанные в приближении модели двух состояний,

l ! ÍLAaj jJüu^J

Рисунок 3. Схемы формирования комплекса с участием мостикового (А) и нативного (Б) олигонуклеотидов.

Б

5 AAG°37,

4 ккал/моль

3 I 1

2 1 ;

1 1

0 _L

12

Ä

без учета вторичной учет учет методом

структуры концентрационным оптимизации методом

Рисунок 4. Дестабилизирующий эффект введения ненуклеотидной вставки (ОЕв,) в центральную часть комплексов олиго-нуклеотидов длиной 8, 10 и 12 пар оснований с одинаковой коровой частью последовательности (см. Рис. 2, справа).

практически совпадают; 2) термодинамические параметры, полученные методом оптимизации кривых плавления на разных длинах волн, близки между собой; 3) наблюдается линейная зависимость величин 1/Тпл от логарифма суммарной концентрации олигонуклеотидов (Ст) с коэффициентом корреляции R2 > 0.95; 4) термодинамические параметры, полученные оптимизационным и концентрационным методами, отличаются не более чем на 10% (SantaLucia J. Jr., 1998).

Исследование стабильности ДНК-комплексов показало, что введение вставки на основе фосфодиэфира диэтиленгликоля (DEG0 приводит к снижению стабильности комплексов (M/N), а величина дестабилизирующего эффекта, рассчитываемая как:

AAG°37=AG°37(M/N(DEGl)) - AG°37(M/N), (1)

при первичном рассмотрении оказалась зависящей от длины олигонукле-отидной последовательности (Рис. 4). Такой эффект, вероятно, может быть связан с возможностью формирования компонентами протяженных комплексов вторичных структур.

Наличие внутримолекулярных структур («шпилек») у компонентов комплексов длиной более 8 нуклеотидов было доказано методом термической денатурации, путем проведения концентрационных серий экспериментов для самих олигомеров.

В соответствии с этим, формирование комплексов должно описываться следующей равновесной схемой (2.1)-(2.3):

А+В —^АВ (2Л)

А^=>На (2-2)

В^±Нв (2-3)

Предложено два способа учета вторичных структур (оптимизационный и концентрационный) для определения термодинамических парамет-

ров комплексообразования из данных, полученных методом термической денатурации дуплексных структур с оптической регистрацией сигнала

В соответствии со схемой (2), связь доли двухцепочечного состояния (а=[АВ]/[А]0), доли олигонуклеотидов в шпилечной форме =[НД]/[А]0

и ¿¡и =[Нв]/[В]0) с равновесными константами формирования соответствующих структур, в случае эквимолярного соотношения взаимодействующих олигонуклеотидов, примет вид

К = К = 2а ± п П

зфф (1 + КД1 + кв) (1-а)2 Ст

СнА=«КА (3 2)

Сщ=ссКв, (3 3)

где Кэфф - эффективная константа формирования дуплекса

Для определения термодинамических параметров формирования ДНК-дуплексов (ДН°, ДБ0) из экспериментов по их термической денатурации с оптической регистрацией сигнала, необходимо найти взаимосвязь регистрируемой величины оптического поглощения с термодинамическими характеристиками формируемых структур и условиями комплексообразования (метод оптимизации) В соответствии со схемой (2), оптическое поглощение является суммой вкладов межмолекулярного комплекса (дц), одноцепочечных неструктурированного (оц) и структурированного состояния (НА, Нв)

А = аАд11(Т) + (£НААНА(Т) + СнАНв(Т)) + (1-а-(£Нл +£Нв))Ащ(Т), (4)

где оптическое поглощение линейно зависит от температуры А,(Т)=А,+В, Т, А„ В, =сот1,1= оц, НА, Нв, дц

Таким образом, из анализа профилей экспериментальных кривых термической денатурации методом оптимизации при использовании уравнений (3) и (4), можно определить термодинамические параметры образования комплекса, компоненты которого формируют внутримолекулярные структуры.

В соответствии с (3 1), формирование олигонуклеотидами шпилечных структур может быть описано как снижение концентрации одноцепочечных неструктурированных форм компонентов комплекса, что учитывается в виде поправки на начальную концентрацию олигонуклеотидов (Ст), образующих межмолекулярный комплекс В этом случае зависимость Тпл-температуры, при которой а=0 5, от Ст будет задаваться выражением.

1 Д8°

+

Ьп гДе У = 0 + КА(ТПЛ)Х1 + КВ(Т„,))

(5)

Тпл АН0 АН0 4у

Определив зависимость 1 /Тпл от /«(Ст) ОН, и затем, восстановив эффективную концентрацию с использованием термодинамических пара-

Рисунок 5. Концентрационный метод определения термодинамических параметров формирования межмолекулярного комплекса с учетом шпилечных структур Символ «*» означает восстановленную зависимость (Ст/4у)

-19 -17 -15 -13 -11

Ьп(Ст/4у), Ьп(Ст/4)

метров формирования вторичных структур (Рис. 5, уравнение (5)), можно определить «истинные» термодинамические параметры формирования дуплексной структуры (концентрационный метод)

С использованием данных подходов определены термодинамические параметры формирования комплексов мостиковых и нативных олигонук-леотидов, которые несколько отличаются от полученных без учета вторичных структур С их использованием показано, что величины ДДС°з7 для комплексов с одинаковой коровой частью последовательности, но разной длины (см Рис 2, справа) совпадают с точностью ±02 ккал/моль (Рис 4)

В то же время было доказано, что энергетический эффект введения вставки в значительной степени зависит от оснований, находящихся с 5'-и 3'-стороны от ненуклеотидной вставки (ближайшее окружение, Рис 6), и не зависит от фланкирующих модифицированный динуклеотидный шаг спирали нуклеотидов (данные не приведены) Кроме того, продемонстрирована аддитивность энергетических эффектов при одновременном введении нескольких ненуклеотидных вставок, между которыми находится не менее четырех нуклеотидов

Третий раздел посвящен исследованию влияния различных ненуклеотидных вставок (на основе производных тетрагидрофурана, олигоэти-

Рисунок 6. Зависимость дестабилизирующего эффекта ненуклеотидной вставки (БЕОО от ее ближайшего окружения

для комплексов 0ТТТХ(ШС|)утттс

вАЛАХ'—У'АААС ХУ =

5,_х(ОЕО,)у_3,/3,_х,у_5,

44 -40 • 3'-30 25 20 1 Ч 1 0 0 ^ 00

ЛЛСГ ккал/моль

аа лс о; <;.\ лт ас «; м к п с л сх тс ос ст ст

-80 ■

-70

-60

-50

-40

-30

ди",

ккал/чоль

у = 036х + 0 ^4 И2 =0 98

О <

<1

4 0

3 О

2 О

1 О

О О

ДБ , кдл/(моль К)

-1 О

-80

-130

-180

-230

-2 0-1

у = 1 18х -2 3 Б

II = 0 83

о

о /* <

аб о о

1п (ш)

АМ8/Ы4 г' 4 0М12/Ы6(1"'6

о М10/N5 14 5 ХМ10/Ы5

рад с

Рисунок 7. А) Компенсационный эффект корреляция энтропии и энтальпии комплексообразования мостиковых олигонуклеотидов М8ЛЧ4(Ьп)4,

Б) Логарифмическая зависимость дестабилизирующего вклада ненуклеотидной вставки от количества связей в ненук-леотидной вставке

ленгликолей и олигометилендиолов) на стабильность комплексов МО

Практически все (22 из 27) величины ДА0037(Ьп) ненуклеотидных вставок были получены из анализа двух или трех серий комплексов длиной 8, 10 и 12 нуклеотидов (Рис 2, справа) Вариация величин составляла, в среднем, 4% (максимум 10%) для вставок (ТЁП), (ОЕО„), (ТЕСП), (НЕОп), (РО„) (п=1-5) Более высокие значения коэффициента вариации (в среднем 8%, максимум 14%) были получены для вставки (БОп) Полученные результаты показывают, что дестабилизирующий эффект введения вставки имеет как энтропийную, так и энтальпийную составляющие Наличие последней связано, в первую очередь, с нарушением стэкинга оснований, величина энергии которого должна оставаться неизменной при одном и том же разрушаемом контакте Чтобы учесть данный эффект были определены величины энтальпии, энтропии и свободной энергии, связанные с изменением структуры ненуклеотидной вставки, которые рассчитывали следующим образом

ААО°;(Ьп)=АДО°7(Ьп)- ДДС°7(ОЕО,), (6)

где величины ДД0о*37(Ьп) определены в соответствии с уравнением (1) Аналогично могут быть записаны выражения для ДДН°*(ЬП) и ДД8°*(ЬП)

Было показано, что и после выделения термодинамического эффекта, связанного с длиной ненуклеотидной вставки, энтальпийный вклад в свободную энергию сохраняется. Данный факт может быть обусловлен наличием линейной корреляции энтропии и энтальпии формирования комплексов НК (Рис 7А)

Величина ДДОз7(Ьп) имеет логарифмическую зависимость от количества ковалентных связей, формирующих остов вставки (Рис 7Б) Такая

зависимость свободной энергии от длины ненуклеотидной вставки обусловлена количеством возможных конформаций, принимаемых гибким линкером (Mathews DH, 1999) В этом случае необходимо затратить энергию на сближение концов вставки при формировании комплекса Наиболее простой моделью для расчета этой энергии является модель свободно сочлененной цепи, которая предполагает, что энергия имеет только энтропийную составляющую, логарифмически зависящую от количества мономерных звеньев цепи В соответствии с этой моделью, определив величину наклона и отсечки в уравнении зависимости свободной энергии от количества ковалентных связей, формирующих остов ненуклеотидной вставки (ш), и, считая, что ллп°*(1.п) имеет только энтропийную составляющую, получим

AAS°*(Ln)= AAG°* (Ln)/310 15=(1184 ln(m)-2280)/310 15 кал/(моль К) (7)

Таким образом, термодинамические параметры формирования комплексов, содержащих любую вставку на основе (TFn), (DEGn), (TEGn), (HEGn) и (PDn), могут быть рассчитаны на основе соответствующих величин для (DEGj) и дополнительной энтропийной поправки:

AS0 (Ln)= AS0 (DEG, )+AAS°* (Ln) (8)

Исключение из общей зависимости (7) - вставка на основе (DDn), влияние которой на стабильность МО имеет более сложный характер Свойства этой вставки могут быть обусловлены ее способностью формировать межвставочные ассоциаты при ее мультиплицировании, в то время как предложенная нами модель не учитывает таких дополнительных взаимодействий

В четвертом разделе методом остановленной струи исследовано влияние введения ненуклеотидной вставки на кинетические характеристики формирования комплексов, формируемых с участием МО (M10/N10, M10/N5(Ln)5, где Ln=(TF0, (DEG,), (DEG3), (HEGO, (DD2) и (DD3), см Рис 1 и 2) Для количественного определения эффекта введения ненуклеотидной вставки разработана модель, описывающая формирование комплексов ОН и учитывающая возможность формирования ими внутримолекулярных структур, скорость формирования которых значительно выше, чем межмолекулярных ассоциатов Кинетическая схема может быть представлена следующим образом

А+вф>НА (9 1)

A(J^Ha (9 2)

В<=^=>Нв (9 3)

Для данной схемы зависимость доли двухцепочечного состояния от времени (в приближении кн = Кн = Кь) принимает вид

е -1 ,где ± 2 (1+кь)2

а = а _--^ м

. а_ у ч2\

1--е

КА0

Р о

При регистрации кинетических кривых формирования ДНК-дуплекса оптическим методом необходимо учитывать поглощение света как неструктурированными (Аот,), так и структурированными (Ан) одноцепочеч-ными и двухцепочечными (АЛ/) формами

А=аАЛ,+(1-а-9А0„+г;Аь (11)

где С, - доля олигонуклеотидов в шпилечном состоянии

Так как С,=( 1 -а) Кн, то выражение (11) можно представить в виде

А=а Ай,,+(1-а) А*0,,, (12)

где А оц = (1-Кн) Аш(+Кн Ан - эффективное оптическое поглощение одноцепо-

чечного состояния, которое не зависит от времени

При определении кинетических констант образования ДНК-комплексов использовали термодинамические характеристики шпилечных структур и дуплекса определенные нами ранее, а варьируемыми параметрами выступали константа скорости ассоциации и оптические характеристики комплекса и одноцепочечного состояния Константу скорости диссоциации рассчитывали, используя равновесную константу формирования комплекса и константу скорости ассоциации (10) Равновесные константы формирования межмолекулярных комплексов с учетом и без учета вторичных структур ОН получены из экспериментов по термической денатурации с помощью метода оптимизации кривых плавления

Характерные экспериментальные и рассчитанные без учета вторичных структур кривые релаксации (Рис 8А) хорошо совпадают между собой, т е формирование комплексов как нативных, так и модифицированных олигонуклеотидов хорошо описывается приближением двух состояний.

С использованием модельного представления (9 1)-(9 3) определены температурные зависимости констант скоростей реакции формирования ДНК-дуплексов (Рис. 8Б), величины которых свидетельствуют о том, что введение ненуклеотидной вставки не приводит к значительным изменениям величин констант скоростей ассоциации комплексов, в то время как константы скорости диссоциации дуплексных структур значительно увеличиваются

Установлено, что дестабилизирующий эффект ненуклеотидной встав-

Рисунок 8. А) Характерные экспериментальные (тонкие) и рассчитанные (толстые) с использованием приближения двух состояний кривые формирования комплексов ОН. Б) Сравнение констант скоростей прямой и обратной реакции (к+, к.) формирования комплексов нативных и мостиковых ОН (М10Л^5(Ьп)5), после учета вторичных структур, ш - количество ковалентных связей, формирующих остов ненуклеотидной вставки. Т= 25°С.

ки вызван, главным образом, увеличением константы скорости диссоциации комплексов, величина которой пропорциональна длине вставки. Как и при исследовании термодинамических свойств МО, вставки на основе декандиола за счет своей гидрофобной природы являются исключением из общей тенденции.

Вторая часть третьей главы посвящена разработке моделей для расчета стабильности комплексов МО в стандартных условиях (величин АН0, АБ" и ДС°37 )• Собрана база данных, содержащая 375 (97 определены нами) наборов значений термодинамических параметров комплексо-образования, из которых 64 получены нами для модифицированных комплексов, несущих вставки на основе фосфодиэфира диэтиленгликоля (ОБвО. На основе ее анализа, предложены четыре типа моделей расчета термодинамических характеристик комплексообразования как МО, так и их нативных аналогов, основанных на приближении «ближайших соседей».

Модель №1 предполагает, что энергетический эффект вставки не зависит от ее ближайшего окружения, т.е. усреднен по всем типам БС. В этом случае характеристика дуплексной структуры (например, свободная энергия образования комплекса с одной вставкой (ОБСО) может быть вычислена согласно следующей схеме:

Х,Х°Е^Х,Х<...Х, Х^2 Х2Х3 Х3Х4 X, Х1

X ^ Х^ —Х^ X ^...Х J Х^Х 2 Х-^Х^ Х-^Х ^ X ^ X ^

4 6 Время, с

1-М10/ГЧ10

2-УП0/К5а>ЕС"5

3- М10ЛЧ5 5

4-.\Ш>«5(0Ш),5

Здесь 5'-х,хы-У - динуклеотидный шаг, термодинамические параметры У-Х.Х^-У

которого определены в соответствии с приближением БС, х1 - поправки

х,

связанные с концевыми эффектами, Симметр - энтропийный член, возникающий для самокомплементарных комплексов, равный 1.4 кал/(моль К), (БЕС])- энергетический эффект введения ненуклеотидной вставки, определенный в соответствии с (1) Количество инкрементов в этом случае равно 14. 13 факторов БС (12 динуклеотидных пар + фактор симметрии) и один, связанный с наличием ненуклеотидной вставки

Модель №2 предполагает зависимость термодинамического эффекта вставки от типа и ориентации пар оснований, фланкирующих вставку с 5'-и З'-стороны В этом случае стабильность комплексов МО будет описываться следующей схемой

ХУ^ХЛ, X, ХЛ УС -> УС-. УС-, Х-.Х. )(% УС,

2 ,3 ,4 1 = . .+ Г ,+ ;+ + + + Симметр + Х^Х2—Х3Х4 Х1 Х1Хг ХгХ} Х2Х4 Х1 Х1

^ фЮ,)

+ ,2 + ,г+Структ, Х2 Х3

где ХГ:С"] и фЕа^хг - термодинамические инкременты, описывающие за-а-;

висимость дестабилизирующего эффекта от типа оснований, фланкирующих вставку с 5'- и З'-сторон, соответственно, Структ - фактор, учитывающий структурные особенности комплексов, например, наличие олиго(с!А)п (п>3) участков в комплексе и наличие модификации в дуплексе как таковой Первая связана с особенностями пространственной организации специфических участков дг/ДНК, а вторая сопряжена с общими для всех комплексов мостиковых олигонуклеотидов изменениями, не зависящими от нуклеотидной последовательности Количество инкрементов в этом случае равно 13+(4+4-1)=20 13 факторов БС, по 4 инкремента для каждого типа оснований с 5'- и с З'-стороны от вставки (А, Т, в или С), один из которых линейно зависим (итого, 8-1=7 параметров) Зависимым параметром мы выбрали 5'-А(С1ЕС!1)-3'/5'-Т-3', для которого принимали ДДССГ) = 0.

Модель №3 предполагает использование в качестве унифицированных инкрементов модифицированных динуклеотидных пар В этом случае расчет стабильности модифицированного дуплекса производится по следующей схеме

ÄG

1500 i кал/моль 1000

■ SantaLucia, 1998

□ Модель №1

□ Модель №2

■ Модель №3 И Модель №4

Рисунок 9. Сравнение рассчитанных нами и представленных в литературе величин свободной энергии отдельных инкрементов для немодифицирован-ных ДНК/ДНК комплексов

у у (DEG,) у У У 12 3 4" L

XlX1 ~-X2X4...XL

. ^3^4

X.2 X2

- + ,* + Симметр. +

ХгФЩ)Хг

у Х2 у

+Структ.

Данная модель предусматривает введение к набору модели БС (13 инкрементов) дополнительно 16 факторов (5'-Х(ПЕО,'У-3'/5'-Х'У-3'), характеризующих возмущение каждого типа динуклеотидной пары. Таким образом, модель №3 включает 29 (13+16) параметров.

Модель №4 предполагает рассмотрение эффекта введения ненуклео-тидной вставки как новой динуклеотидной пары, характеризуемой собственными термодинамическими параметрами. Расчет стабильности модифицированного дуплекса в данной модели производится по следующей схеме:

-X2ÄA...XL

Х,Х2 Л; Л3 _ Л3Л4

2 vl3

+ Симметр. + Структ.

Эта модель статистически эквивалентна модели №3, но выражает другой физический смысл, характеризуя собственный вклад модифицированной динуклеотидной пары в общую стабильность дуплекса.

Анализ созданной базы данных термодинамических параметров формирования комплексов нативных и модифицированных ОН с использованием моделей №1-4 проводили методом множественной линейной регрессии с использованием пакета Statistica 5.5. Полученные наборы инкрементов (Рис. 10, Таблица 1) являются достоверными, о чем судили по факту выполнения ряда статистических критериев: вариация абсолютной величины инкремента менее 50% (по величине ААО°37),р-уровень < 0.05. Ус-

Таблица 1. Величины унифицированных термодинамических инкрементов, характеризующих эффект введения ненуклеотидной вставки (БЕС]) в дуплекс-

ную структуру ДНК при ( юрмировании комплексов МО

СФ1 Модель №1 СФ Модель №2 СФ Модель №3 Модель М>4

вставка ДС^2 1 48±0 07 ДН03 -1 70±0 63 5'Тл375'А3' о 70±0 17 2 59±1 85 3'АЛА3'/5'ТТ3' 1 58±0 38 -10 59±4 14 2 52±0 38 -3 13±4 15

0Л/С 0 33±0 17 2 39±1 85 А^/СТ 1 10±0 32 -2 44±3 49 2 57±0 32 6 36±3 48

СЛЛЗ 0 95±0 16 3 54±1 80 АЛв/СТ 1 39±0 28 0 72±3 09 2 62±0 28 6 50±3 04

ЛА/Т 2 70±0 28 3 80±3 02 АЛТ/АТ 2 49±0 38 -5 78±4 20 3 46±0 38 0 82±4 17

ЛТ/А 2 93±0 25 5 06±2 77 СЛА/ГО 2 09±0 25 -0 61±2 73 3 40±0 25 6 76±2 72

ЛСЛЗ 2 37±0 26 3 07±2 79 СлС/ОС 2 05±0 24 -1 63±2 59 3 72±0 24 6 13±2 63

лО/С 2 54±0 25 4 57±2 68 С^/Св 1 76±0 27 -0 53±3 00 3 84±0 27 7 37±3 02

СлТ/АО 2 67±0 23 5 52±2 56 3 89±0 23 11 30±2 50

СЛА/ТС 1 65±0 38 -5 11±4 15 2 91±0 38 3 32±4 15

ОлС/СС 0 98±0 26 -2 54±2 85 3 05±0 26 7 48±2 86

СЧЗ/СС 1 14±0 29 -2 86±3 14 2 81±0 29 4 90±3 16

ОлТ/АС 1 80±0 28 -1 76±3 12 3 28±0 28 7 04±3 10

ТЛА/ТА 3 32±0 28 2 84±3 04 3 84±0 27 8 75±2 97

ТЛС/СА 1 45±0 27 -7 00±3 02 2 71±0 27 1 42±3 03

РЧЗ/СА 1 96±0 38 -2 09±4 17 3 26±0 38 5 29±4 15

ТЛТ/АА 3 04±0 38 -2 03±4 14 3 98±0 38 5 43±4 15

олиго(ёА) 0 78±0 14 1 56±1 48 олиго(с!А) 0 83±0 13 2 22±1 48 0 83±0 13 2 22±1 48

вставка -0 70±0 24 -1 61±2 67 вставка -0 88±0 25 -1 80±2 72 -0 88±0 25 -1 80±2 72

СФ - структурный фактор, - [ккал/моль], - [ккал/моль] Символ «А» соответствует ненуклеотидной вставке (ОБО])

Таблица 2. Анализ точности расчета Тпл для комплексов модифицированных олигонуклеотидов стандартное (стТпл), среднее (ДТ^"), максимальное (ДТщ,"™) отклонение при расчете величин Тщ, и коэффициент корреляции Пирсона (Я)

Модель ДТ сроС 1 ПЛ I дтплмакс_°с И2

№1 3 6 29 92 0 97

№2 23 1 8 62 0 99

№3 1 7 1 3 43 0 99

№4 1 7 1 3 43 0 99

тановлено, что величины классических инкрементов модели БС, полученные нами, хорошо совпадают с опубликованными ранее {БаШаЬисга 3 Зг, 1998) (Рис 9) О надежности расчета термодинамических параметров с использованием полученных наборов инкрементов судили по уровню корреляции (И2) экспериментальных и расчетных величин энергий ком-плексообразования олигонуклеотидов, величина которой стремилась к единице

Сравнение точности расчета температур плавления комплексов МО, вошедших в анализируемую базу данных, при использовании различных моделей приведено в таблице 2 Видно, что модели №2-4 позволяют проводить расчет стабильности комплексов МО в стандартных условиях с точностью ДТплср ~1 5 °С Следует отметить, что модель №2 содержит всего 7 дополнительных к БС термодинамических инкрементов

В третьей и четвертой части результатов и обсуждения изучено влияние ионной силы раствора на стабильность комплементарных комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов

Создана база данных, содержащая величины температур плавления и термодинамических параметров образования комплексов (ДН°, Д8° и ДО°37) мостиковых и контрольных ОН с ДНК как экспериментально определенные, так и представленные в литературе В нее включены 2215 наборов данных, характеризующих стабильность комплексов ОН при различных концентрациях одновалентных катионов (0 01 М < М+< 1 022 М) и катионов магния (0 001 М < [М§С12] < 0 3 М)

На основе анализа базы данных предложена модель расчета стабильности комплексов НК при различных концентрациях катионов в растворе, которая предполагает различную эффективность связывания катионов с одноцепочечным (оц-) и двухцепочечным (дц-) состояниями ДНК

(13 1)

КЕЯ

)

сГв

(13 2) (13 3)

Формирование комплекса может быть описано следующей схемой

А + В + ^Ьп^т^АШК+ь ), (13 4)

/ ' где - количество дополнительно связывающихся с НК катионов С,г+ при

образовании дуплексных структур

В этом случае электростатическая составляющая энергии формирования дуплексов, связанная с влиянием катионов на стабильность комплексов ОН, может быть представлена в виде энтропийного вклада (Д5°_от ), величина которого зависит от концентрации катионов в растворе ([С,2+]), констант связывания катионов с оц- и ¿)г/-ДНК (К0ц(Дц)(С,2+)), количества сайтов связывания в составе ОН и их комплексов (ЬА В ЛВ(С12+)), а так же от числа катионов данного типа, взаимодействующих с одним участком связывания в оц- (^) и ¿^-состояниях (ап° .)

(14)

где Ап = Апм (С;*) -(ДА,(СГ) + ДА,(СГ)) (15 О

АкМВ) (СГ) - Ьмв)(СГ).Ак''г ^<СГ"СГ1 (15 2)

Ля" +

ЬпАВ (СГ) = ЬАВ (СГ).Д^ ^(СГМСП (15 3)

(О-Ю сГ

Кроме того, для повышения точности описания экспериментальных данных, описывающих зависимость стабильности комплексов от концентрации ионов натрия, оказалось необходимым введение дополнительных поправок Показано, что наблюдается значимое улучшение предсказательной способности предложенной модели (более чем на 10%) при использовании поправок, характеризующих изменение эффективного числа сайтов связывания, описывающих различную эффективность влияния катионов на стабильность комплексов олигонуклеотидов различного ОС-состава, наличие концевых эффектов, а так же появление дополнительных фосфатных остатков при введении ненуклеотидных вставок в структуру ОН. Указанные поправки введены следующим образом

А«5> =1^1 + <с-/(СС)) + СГ +С№|) (15 4)

кш + <"-/(СС)) + С' + »<Г;,)' (15 5)

где/вС) - ОС-состав НК-компонентов, ¿сс = ¿Г(/(СС) = 1)-£;'(/(СС) = 0) ?

Ц(ДОС) = 0)

Таблица 3 Величины параметров, характеризующих взаимодействие одновалентных катионов и ионов магния с ДНК в одно- и двухцепочечном состояниях в зависимости от ОС-состава НК-компонентов и наличия в них ненуклео-тидной вставки_

Состояние ДНК Коц(дц), М 1 м* Дп°, Дк° М* Коц(дц), М'1 Мё2+ Дп°,Дк° мё2+ тконц Ьоц(дц) .ас гРЕ01 Ьоц(дц)

оц 24 4±4 2 0 92±0 04 49 7±0 2 0 26±0 01 2 94±0 44 -0 35±0 04 0 50±0 33

ДЦ 40 9±6 6 0 98±0 05 84 2±0 4 0 29±0 01 5 00±0 77 -0 37±0 04 0 49±0 33

/=А, В или АВ и Ц - эффективное число сайтов связывания катионов на один фосфодиэфирный остаток в НК-компоненте, принято, что Ц (ДОС) = 0) = 1

Используя модель (14)-(15), были определены количественные характеристики взаимодействия одновалентных катионов и ионов магния с ДНК (Таблица 3) На рисунке 10 приведены корреляции расчетных и экспериментальных температур плавления комплексов ОН, вошедших в базу данных Видно, что предложенная модель позволяет описывать зависимость стабильности ДНК/ДНК комплексов от концентрации одновалентных катионов, в случае конкурентного связывания моновалентных катионов (М+ К+, Ыа+, Трис+) и ионов с ДНК Средняя ошибка расчета температур плавления комплексов в случае связывания только ионов натрия и конкурентного взаимодействия одновалентных катионов и ионов магния с ДНК составила 1 и 2 3 °С, соответственно

Таким образом, предложенные модели позволяют проводить расчет стабильности МО, несущих вставки на основе фосфодиэфиров производных тетрагидрофурана, олигоэтиленгликолей и олигометилендиолов при различных концентрациях катионов в растворе, в том числе, в случае кон-

Рисунок 10. Корреляция расчетных и экспериментальных температур плавления нативных и модифицированных комплексов при различных концентрациях ионов натрия (А) и при конкурентном связывании одновалентных катионов и ионов магния с ДНК (Б)

курентного связывания нескольких типов катионов с ДНК

На основе разработанных модельных представлений и установленных количественных характеристик создан прототип программного обеспечения (Visual Basic for Excel, Microsoft Co), позволяющий, исходя из первичной структуры нативных и мостиковых олигонуклеотидов, рассчитывать стабильность формируемых ими комплементарных ДНК/ДНК комплексов при различных концентрациях нуклеотидных компонентов и в широком диапазоне буферных условий ([NaCl] 0 01-1 022 М; [MgCl2]. 0 001-0 3 М) при нейтральных значениях рН.

Основные результаты и выводы

Разработаны подходы для расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов, образованных с участием производных олигонуклеотидов, несущих в структуре углеводо-фосфатного остова ненуклеотидные вставки на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3-фосфата (TF), олиго-этиленгликолей бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (DEG, TEG, HEG), или олигометилендиолов 5-гидрокси-пентил-1- и 10-гидроксидецил-1 -фосфатов (PD и DD) и их повторов (мостиковых олигонуклеотидов, МО)

1. Проведены физико-химические исследования комплексообразования МО с ДНК в стандартных буферных условиях (1 М NaCl, нейтральные значения рН) Методом кругового дихроизма продемонстрировано, что дуплексы, образованные как нативными, так и мостиковыми олигонукле-отидами с ДНК имеют В-форму двойной спирали Методом термической денатурации определены величины термодинамических эффектов, вызванных введением ненуклеотидной вставки, в зависимости от природы вставки, ее длины, числа вставок, типа модифицированного динуклеотид-ного шага спирали ДНК Методом остановленной струи выявлено, что дестабилизирующий эффект вставки, симбатно связанный с контурной длиной ненуклеотидного фрагмента, обусловлен возрастанием константы скорости диссоциации дуплекса

2. Созданы две базы данных, содержащие величины температур плавления и термодинамические параметры образования комплексов (АН°, AS° и AG°37) мостиковых и немодифицированных, контрольных олигонуклеотидов с ДНК как экспериментально определенных, так и представленных в литературе В базу I включены наборы данных, характеризующих стабильность нативных (311 наборов) и содержащих вставку на основе фос-фодиэфира диэтиленгликоля (DEG0 (64 набора) комплексов олигонуклеотидов в стандартных буферных условиях В базу II включены 2215 наборов данных, характеризующих стабильность комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов с ДНК при различных концентрациях NaCl

(0 01 - 1 022 М), а так же при конкурентном связывании с ДНК катионов натрия и магния (0 001 М < [ MgCl2] < 0 3 М)

3. Созданы модели, описывающие зависимость стабильности комплементарных комплексов МО от их нуклеотидного состава, природы, числа вводимых ненуклеотидных вставок и типа модифицированного динуклео-тидного фрагмента, а так же способности олигонуклеотидов формировать внутримолекулярные комплексы Определены унифицированные термодинамические параметры, характеризующие эффективность формирования элементов структуры комплексов МО Показано, что с их использованием средняя величина ошибки расчета температуры плавления комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов в стандартных условиях составляет 1 0 и 1 3 °С, соответственно

4. Предложено новое модельное представление, описывающее зависимость стабильности ДНК/ДНК комплексов от ионной силы раствора, не только в случае связывания одного типа противоионов с ДНК (например, Na4), но и при конкурентном связывании катионов (например, Na+ и Mg2+) Установлены характеристические параметры модели, определены их величины Показано, что в исследованном диапазоне буферных условий с использованием полученных параметров средняя величина ошибки расчета температуры плавления комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов, вне зависимости от ионной силы раствора, составляет менее 2 3 °С

5. На основе разработанных модельных представлений и установленных количественных характеристик создан прототип программного обеспечения (Visual Basic for MS Excel), позволяющий, исходя из первичной структуры нативных и мостиковых олигонуклеотидов, рассчитывать стабильность формируемых ДНК/ДНК комплексов при различных концентрациях нуклеотидных компонентов в широком диапазоне буферных условий ([NaCl] 0 01-1 022 М, [MgCl2] 0 001-0 3 М) при нейтральных значениях pH

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1 Pyshnaya I А , Pyshnyi D V, Lomzov А А , Zarytova V F , and Ivanova Е М. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucl, Nucl & Nucleic Acids — 2004 — V 23, № 6&7 — P 1065-1071

2. Pyshnyi D V , Lomzov A A , Pyshnaya I A , Ivanova E M Hybridization of the bridged oligonucleotides with DNA thermodynamic and kinetic studies // J. Biomol Struct. Dyn — 2006 — V 23, № 5 — P. 567-580 3 Ломзов A A, Пышная И A , Иванова E M , Пышный Д В. Термодинамические параметры для расчета стабильности комплексов мостиковых

олигонуклеотидов // Док Акад Наук — 2006 — Т 409, вып 2 — С 266-270

4 Lomzov А А, Pyshnyi D V Influence of Na+ and Mg2+ ions on thermal stability of oligonucleotide duplexes // J Biomol Struct Dyn — 2007 — V 24, № 6 — P 679-680

5 Ломзов A A, Пышный Д В Расчет температуры плавления нативных и модифицированных комплексов ДНК при различных концентрациях катионов металлов с помощью расширенной модели конденсации противоионов // Вестник НГУ Сер физическая —2008 — Т 3, вып 2 — С 61-75

6 Ломзов А А, Пышная И А, Пышный Д В, Иванова Е М Термодинамическое описание комплексообразования мостиковых олигонуклеотидов с ДНК // Труды 1-го Международного форума "Актуальные проблемы современной науки" Ч 29 Биология Самара Из-во СГТУ — 2005 —С 58-60

7 Ломзов А А, Пышная И А, Пышный Д В , Иванова Е М Модель для расчета стабильности комплексов олигонуклеотидов в присутствии двух типов противоионов // Труды 2-го Международного форума "Актуальные проблемы современной науки" Ч 29 Биология Самара Из-во СГТУ —

2006 —С 113-118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 Модельные представления для предварительного расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов олигонуклеотидов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Термодинамическое описание формирования ДНК/ДНК комплексов олигонуклеотидов. Модельные представления.

1.1.1 Термическая стабильность комплексов олигонуклеотидов.

1.1.2 Зависимость термодинамических параметров формирования комплексов олигонуклеотидов (АН" и AS") от температуры.

1.1.3 Компенсационный эффект энтальпии и энтропии.

1.2 Модели расчета стабильности комплексов олигонуклеотидов.

1.2.1 «Физическая» модель.

1.2.2 Модель ближайших соседей.

1.2.3 Составление баз данных и параметризация комплексов олигонуклеотидов в приближении модели ближайших соседей.

1.3 Термодинамические параметры формирования комплексов с нарушениями.

1.3.1 Внутридуплекспые нуклеотидные несоответствия (внутренние мисматчи)

1.3.2 Нуклеотидные несоответствия на конце дуплексной структуры (концевые мисматчи).

1.3.3 Последовательно идущие нуклеотидные несоответствия (тандемные мисматчи).

1.3.4 Однонуклеотидные нависания.

1.3.5 Нуклеотидные выпетливания.

1.3.6 Одноцепочечные разрывы в структуре двойной спирали ДНК.

1.3.7 Синтетические модификации.

1.4 Влияние факторов внешней среды на комплексообразующие свойства олигонуклеотидов.

1.4.1 Влияние ионной силы раствора на комплексообразующие свойства нуклеиновых кислот.

1.4.2 Модель малых лигапдов.

1.4.3 Модель малых лигандов в применении к олигонуклеотидам.

1.4.4 Модели полиэлектролитов.

1.4.5 Модель конденсации противоионов.

1.4.6Модель Пуассона-Больцмана.

1.4.7Модель сильно связанных ионов.

1.4.8 Методы молекулярной динамики и Монте-Карло для определения эффектов связанных с влиянием катионов па стабильность комплексов НК.

1.4.9 Полу эмпирические модели расчета влияния катионов на стабильность комплексов НК.

1.4.10 Сравнение моделей, описывающих влияние ионной силы раствора на стабильность комплексов олигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды — короткие, синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (НК) - в настоящее время широко используют в качестве молекулярных инструментов для изучения различных биохимических процессов, протекающих с участием НК; специфических зондов в системах ДНК-диагностики; при создании ген-направленных биологически активных препаратов [1]. Относительно недавно продемонстрирована возможность использования олигонуклеотидов как строительных блоков при формировании разнообразных наноструктур, обладающих заранее заданными геометрическими характеристиками [2, 3]. Столь обширная область применения обусловлена способностью олигонуклеотидов образовывать прочные двухцепочечные комплексы при реализации комплементарного взаимодействия между двумя олигомерами.

Для эффективного использования олигонуклеотидов необходимо проводить направленный выбор их структуры, обеспечивающий заранее заданные гибридизацион-ные свойства, т.е. необходимо располагать моделями по предварительному расчету стабильности комплексов олигонуклеотидов с НК. В литературе представлены модели, позволяющие производить такой расчет для нативных НК в различных буферных условиях [4 - 10].

Однако не всегда удается подобрать нативные олигонуклеотиды, удовлетворяющие требованиям экспериментов. Так, например, для более эффективного проведения гибридизацонного анализа необходимо увеличить стабильность дуплексных структур, не изменяя их нуклеотидную последовательность, задаваемую целевой НК. Существует возможность проводить такое изменение за счет увеличения длины олигонуклеотидных зондов, однако это приводит, как правило, к нежелательному появлению дополнительных вторичных структур и снижению специфичности их взаимодействия с выявляемой последовательностью. Поэтому для улучшения их свойств, в том числе гибридизаци-онных, в структуру олигомеров вводят различные модификации (см. например, [11 -14]). Так появились «скованные», пептидил-НК и ряд других производных. Кроме того, модифицированные производные могут проявлять устойчивость к ДНК-процессирующим ферментам, что повышает их устойчивость, как в живых системах, так и в условиях лабораторных системах анализа [14]. Однако данный аспект имеет и отрицательный характер - невозможность использования таких модификаций в системах, работающих с участием ферментативных реакций.

Дополнительным положительным эффектом введения модификаций в структуру олигомера может являться специфический выбор комбинации нативных и модифицированных нуклеотидов в олигонуклеотидных зондах, что позволяет сделать эффективность гибридизации близкой друг к другу у достаточно большого набора проб с исходно различной стабильностью. Данная возможность позволяет использовать набор различных зондов одновременно в устройствах параллельного анализа НК, например, при работе с биочипами [15].

Олигонуклеотиды, содержащие ненуклеотидные вставки, которые дестабилизируют дуплексные структуры, в некотором смысле являются наиболее оптимальными с точки зрения регуляции стабильности и взаимодействия с ферментами. Введение не-нуклеотидной вставки в центральную часть последовательности позволяет регулировать стабильность таких дуплексных структур, в то время как концевые участки остаются незатронутыми, что обеспечивает сохранение эффективности взаимодействия модифицированных олигомеров с ферментативными системами [16 - 17].

Ранее было предложено вводить ненуклеотидные вставки на основе этиленглико-лей и декандиолов в углеводофосфатный остов для регуляции гибридизационных свойств олигонуклеотидов [12, 16, 17]. Было показано, что при их использовании в диагностических тест-системах повышается специфичность сигнала при гибридизацион-ном анализе ДНК с использованием ферментативных систем [12]. Для оптимального выбора таких олигонуклеотидных зондов необходимо проводить предварительный расчет стабильности их комплексов.

Целью данной работы является построение модели расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов олигонуклеотидов (величин энтальпии (АН°), энтропии (AS°), свободной энергии Гиббса (AG°37) комплексообразования и температуры плавления (Тпл) дуплексов), содержащих различные ненуклеотидные вставки в стандартных условиях (1М NaCI, рН ~ 7) и расширение прогностической способности данной модели на случай использования буферных растворов с различной концентрацией противоионов, в том числе при конкурентном связывании нескольких типов катионов с ДНК.

Для этого необходимо решить следующие задачи:

1) провести систематическое исследование физико-химических свойств (структуры, кинетических и термодинамических параметров комплексообразования) олигонуклеотидных производных, содержащих ненуклеотидные вставки на основе на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3-фосфата (TF), олигоэтиленгликолей: бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (DEG, TEG, HEG); или олигомеги-лендиолов: 5-гидрокси-пентил-1- и 10-гидроксидецил-1-фосфатов (PD и DD) и их повторов;

2) разработать модели, которые позволят проводить предварительный расчет стабильности модифицированных комплексов в стандартных условиях;

3) исследовать влияние ионной силы раствора на комплексообразующие свойства модифицированных олигомеров и построить модель, которая даст возможность проводить предварительный расчет стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов, в том числе, в случае присутствия нескольких типов противоионов в растворе (например, катионов натрия и магния).

выводы

Разработаны подходы для расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов, образованных с участием производных олигонуклеотидов, несущих в структуре углеводофосфатного остова ненуклеотидные вставки на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3-фосфата (TF), олигоэтиленгликолей: бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (DEG, TEG, HEG); или олигометилендиолов: 5-гидрокси-пентил-1- и 10-гидроксидецил-1-фосфатов (PD и DD) и их повторов (мостиковых олигонуклеотидов, МО).

1. Проведены физико-химические исследования комплексообразования МО с ДНК в стандартных буферных условиях (1 М NaCl, нейтральные значения рН). Методом кругового дихроизма продемонстрировано, что дуплексы, образованные как нативными, так и мостиковыми олигонуклеотидами с ДНК имеют В-форму двойной спирали. Методом термической денатурации определены величины термодинамических эффектов, вызванных введением ненуклеотидной вставки, в зависимости от природы вставки, её длины, числа вставок, типа модифицированного динуклеотидного шага спирали ДНК. Методом остановленной струи выявлено, что дестабилизирующий эффект вставки, симбатно связанный с контурной длиной ненуклеотидного фрагмента, обусловлен возрастанием константы скорости диссоциации дуплекса.

2. Созданы две базы данных, содержащие величины температур плавления и термодинамические параметры образования комплексов (ДН°, AS° и AG°37) мостиковых и не-модифицированных, контрольных олигонуклеотидов с ДНК как экспериментально определенных, так и представленных в литературе. В базу I включены наборы данных, характеризующих стабильность нативных (311 наборов) и содержащих вставку на основе фос-фодиэфира диэтиленгликоля (DEGi) (64 набора) комплексов олигонуклеотидов в стандартных буферных условиях. В базу II включены 2215 наборов данных, характеризующих стабильность комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов с ДНК при различных концентрациях NaCl (0.01 — 1.022 М), а так же при конкурентном связывании с ДНК катионов натрия и магния (0.001 М < [ MgCb] < 0.3 М).

3. Созданы модели, описывающие зависимость стабильности комплементарных комплексов МО от их нуклеотидного состава, природы, числа вводимых ненуклеотидных вставок и типа модифицированного динуклеотидного фрагмента, а так же способности олигонуклеотидов формировать внутримолекулярные комплексы. Определены унифицированные термодинамические параметры, характеризующие эффективность формирования элементов структуры комплексов МО. Показано, что с их использованием средняя величина ошибки расчета температуры плавления комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов в стандартных условиях составляет 1.0 и 1.3 °С, соответственно.

4. Предложено новое модельное представление, описывающее зависимость стабильности ДНК/ДНК комплексов от ионной силы раствора, не только в случае связывания одного типа противоионов с ДНК (например, Na+), но и при конкурентном связывании ка

4" л-К тионов (например, Na и Mg ). Установлены характеристические параметры модели, определены их величины. Показано, что в исследованном диапазоне буферных условий с использованием полученных параметров средняя величина ошибки расчета температуры плавления комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов, вне зависимости от ионной силы раствора, составляет менее 2.3 °С.

5. На основе разработанных модельных представлений и установленных количественных характеристик создан прототип программного обеспечения (Visual Basic for MS Excel), позволяющий, исходя из первичной структуры нативных и мостиковых олигонуклеотидов, рассчитывать стабильность формируемых ДНК/ДНК комплексов при различных концентрациях нуклеотидных компонентов в широком диапазоне буферных условий ([NaCl]: 0.01-1.022 М; [MgCl2]: 0.001-0.3 М) при нейтральных значениях рН.

3.4 Заключение

В данной работе проведено детальное исследование свойств мостиковых олигонуклеотидов. Получены данные, которые позволяют проводить предварительный расчет стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов, несущих вставки на основе олиго-этиленгликолей в различных буферных условиях, что в дальнейшем позволит направлено конструировать олигомерные производные с заранее заданными свойствами.

Разработаны методы учета внутримолекулярных структур олигонуклеотидов при определении термодинамических и кинетических характеристик формирования межмолекулярные комплексов.

На основании проделанной работы создан прототип программного обеспечения, с помощью которого можно проводить расчет стабильности комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов (с использованием приближения БС и унифицированных термодинамических инкрементов, характеризующих дестабилизирующий эффект введения ненуклеотидной вставки (DEGj)) в различных буферных условиях (с использованием расширенной модели конденсации противоионов).

Приведем пример расчета стабильности комплекса олигонуклеотидов, один из которых содержит ненуклеотидные вставки. Рассчитаем термодинамические параметры формирования данного комплекса 5'-АССААА^ ^AGCTG*DEGl^CAG-37 5'-CTGCAGCTTTTGGT3' при концентрации катионов Na+ 100 шМ и Mg2+ 10тМ. В этом случае, энергию комплексообразования можно представить как сумму унифицированных инкрементов и ряда поправок, характеризующих структурные факторы и наличие ненуклеотидных вставок, одна их которых на основе гексаэтиленгликоля:

ACCAAA(HEGl)AGCTG(DEG')CAG^C СС СА АА АА АА AG GC СТ

TGGTTT—TCGAC—GTC ~ TG GG GT ТТ ТТ ТТ ТС CG GA

TG GC СА AG A G А(ВЩ) A G(degi)c + + + + + + + (HEG) + + po/y(c/A)+(DEG)

AC CG GT ТС T С T—T С—G

Используя величины унифицированных инкрементов в стандартных условиях (таблица 31), рассчитаем энтальпию и энтропию комплексообразования:

-АН" = 8.80 + 7.76 + 7.38 + 7.46 + 7.46 + 7.46 + 5.78 +10.02 + 5.78 + 7.38 +10.02 + 7.38 + +5.78 + 0.84 + 2.73 +10.59 + 0 + 2.54-2.22 +1.80= 114.74

-AS" =23.63 + 19.63 + 19.57 + 21.03 + 21.03 + 21.03 + 14.68 + 25.65 + 14.68 + 19.57 + 25.65 + 19.57 +

14.68 + 5.5 + 11.17 + 39.26 -(1184*ln(21)-2280)/310.15 +11.35-4.47 + 2.97=321.91

При вычислении величины энтропии комплексообразования использовали формулу (138), для рсчета дестабилизирующего эффекта вставки на основе (HEGi) (выражение, записанное в скобках).

Таким образом, величина свободной энергии в соответствии с (4) при 37 °С составляет -14.88 ккал/моль, а температура плавления, в соответствии с (7), в стандартных условиях (1М Na+) составляет 56.9 °С при концентрации олигонуклеотидов 10 мкМ.

Теперь пересчитаем стабильность комплекса в новых буферных условиях: 100 шМ Na+ и ЮшМ Mg2+. Рассчитаем электростатическую энергию в стандартных и в новых условиях комплексообразования, и вычтя из второго первое, найдем поправку необходимую для расчета стабильности комплекса в новых условиях.

Количество участков связывания задается формулами (155) - (156)

ЬА =13.(1 + <С -0.5) +С + 2-L0™ =14.7 LB = 13(1 + -0.5) + =13.7

Lab = 26 • (1 + • 0.5) + Z,*7 + 2 • Llf1 = 27.4 (163)

Здесь принято, что две вставки ((DEGi) и (HEGi)) вносят в эффективное число сайтов связывания одинаковый вклад, так как имеют по одному фосфатному остатку в своем составе.

Количество катионов, связывающихся с одноцепочечным и двухцепочечным состояниями, будет равняться: it" +

AkAW (Na+) . LA(B){Na+).Ak°-W-^i --- = 4 72 (164)

Na*)-[Na+] +КЩ )-[M82*} ^

A kA(B) (Mg2+). LAW{Mg»yisk°-^W] - . 5.62 (165)

AnAB (Na+ ) = Lab (А^).Д^-*-= 4J7 (166)

A nAB WgH = Lab (Mg2+>An^-^-^ = 6.08 (167)

Таким образом, число дополнительно связывающихся катионов натрия и магния при ком-плексообразовании будет: Ап^ = АпАВ СNa+) - (AkA{Na+) + AkB{Na+)) = 0.04

AnMglt = АпАВ (Mg2+) - (AkA{Mg1+) + AkB{Mg2+)) = 0.46 (168)

AS", =R-ln{ [Na*]"™' [Mg2+f^ ) = -4.44 кал (170)

J моль • К

В стандартных условиях (1М Na+) AS", - 0 .

В соответствии с уравнением (154), пересчитывая температуру плавления, получаем величину 52.7 °С.

Таким образом, общий алгоритм расчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов может быть представлен в виде схемы приведенной на рисунке 44.

Рисунок 44. Блок-схема для расчета стабильности комплексов олигонуклеотидов в различных буферных условиях.

Данный алгоритм был использован при создании прототипа программного обеспечения для расчета стабильности комплексов, содержащих ненуклеотидные вставки на основе фосфодиэфира диэтиленгликоля, в различных буферных условиях. На рисунке 45 представлено изображение интерфейса прототипа программы для рсчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов в различных буферных условиях, а ее программный код приведен в приложении 7.

Решая обратную задачу: поиска олигонуклеотидной последовательности с предварительно заданной стабильностью, например, методом перебора последовательностей, мож

Файл Правка £ид Всгевка Фориат Сервис Данные Окно £правка Adobe PDF w - *> - £-}i ;i 7°°- - ^ c - " - * ч с — = % .ч л л • о» - д •

R2C14 - fx иеткомплемен врнси псс1едсвэ кгьноии г 1 1 J » 5 « 1 ? и . ii и j.» и 11 17 gLg 5 53 Cujtqjl BCtJ 5 - -»3 |li«4«) И tT»r-}«] M 'За) М (Ч^ L 4S а .1 Us 3«oS*lt. ТмШ "U г» Be» Li«<r in

CTC*jC 5t it" I £ ? $DC ts 0 ( шее it» « ilj It» la i t. {^^^^^^пхтарзкм поса<до>атсп»хост

Рисунок 45. Изображение интерфейса прототипа программы для рсчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов в различных буферных условиях. но выбирать олигонуклеотиды с заранее заданными комплексообразующими свойствами.

Примером такой задачи может служить подбор олигонуклеотидного зонда для системы детекции специфической НК. Исходными данными являются известная последовательность анализируемого участка ДНК и условия, при которых будет проводиться гиб-ридизационный анализ. Необходимо найти последовательность олигонуклеотида, который максимально эффективно связывается с ДНК-матрицей, т.е. обеспечить заданную Тпл комплекса.

Для реализации подхода к решению данной задачи в полном объеме необходимо проводить дополнительные исследования по эффективности образования комплексов с нуклеотидными несоответствиями мостиковых олигонуклеотидов. Кроме того, нужно определить параметры эффективности/неэффективности взаимодействия олигомеров. Исследования на данную тему сейчас проводятся в нашей лаборатории.

Таким образом, данная задача является многопараметрической. Для ее решения необходимо создать теоретические основы направленного выбора нуклеогидной последовательности, так как метод прямого перебора олигонуклеотидных зондов с большим объемом варьируемых параметров, таких как, длина, последовательность олигонуклеотидов, использование тандемных комплексов, введение ненуклеотидных вставок в различные положения, характеристики ненуклеотидных вставок и т.д., требует большого количества машинного времени даже на современных компьютерах. Тем не менее, данный подход может быть осуществлен за счет распараллеливания процессов и использования кластерных компьютерных систем для вычислений.

Исследования по оптимизации и созданию алгоритмов выбора олигонуклеотидных зондов также проводятся в нашей лаборатории Бионанотехнологии ИХБФМ СО РАН. Объединение этой работы с представленными здесь результатами, позволит эффективно создавать олигонуклеотидные зонды с заранее заданными свойствами.

1. Heidenreich О., Sczakiel G. Oligonucleotides. In: Encyclopedia of molecular cell biology and molecular medicine, 2nd edition. /Ed. By Meyers R. A. //Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim. 2005. V. 9. P. 413-433.

2. Brucale M., Zuccheri G., Samori B. Mastering the complexity of DNA nanostructures. // Trends Biotechnol. 2006. V. 24. № 5. p. 235-243.

3. Rothemund P.W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. //Nature. 2006. V. 440. № 7082. P. 297-302.

4. Gray D.M., Tinoco I. Jr. A new approach to the study of sequence-dependent properties of polynucleotides. //Biopolymers. 1970. V. 9. P. 223-244.

5. Breslauer K.J., Frank R., Dlocker H., Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. № 11. P. 3746-3750

6. Ponnuswamy P.K., Gromiha M.M. On the conformational stability of oligonucleotide duplexes and tRNA molecules. // J. Theor. Biol. 1994. V. 169. P. 419-432.

7. Sundaralingam M., Ponnuswamy P.K. Stability of DNA duplexes with Watson-Crick base pairs: a predicted model. // Biochemistry. 2004. V. 43. № 51. P. 16467-16476.

8. Owczarzy R., You Y., Moreira B.G., Manthey J.A., Huang L., Behlke M.A., Walder J.A. Effects of sodium ions on DNA duplex oligomers: improved predictions of melting temperatures. // Biochemistry. 2004. V. 43. № 12. P. 3537-3554.

9. Owczarzy R, Moreira B. G., You Y., Behlke M. A., Walder J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. // Biochemistry. 2008. V. 47. № 19. P. 5336-5353.

10. Tan Z.J., Chen S.J. Nucleic acid helix stability: effects of salt concentration, cation valence and size, and chain length. // Biophys. J. 2006. V. 90. № 4. P. 1175-1190.

11. McTigue P.M., Peterson R.J., Kahn J.D. Sequence-dependent thermodynamic parameters for locked nucleic acid (LNA)-DNA duplex formation. // Biochemistry. 2004. V. 43. № 18. P. 5388-405.

12. Пышный Д.В., Иванова E.M., Пышная И.А., Зарытова В.Ф. Способ выявления ана-ли-зируемой последовательности ДНК. // Заявка на патент № 2003125398, приоритет от 27 августа 2003.

13. Shabih S., Sajjad К., Arif A. Peptide nucleic acid (PNA) — a review. // J. Chem. Tech. & Biotech. V. 81. № 6. P. 892-899.

14. Ahlborn C., Siegmund K., Richert C. Isostable DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. №49. P. 15218-15232.

15. Marcotte E.R., Srivastava L.K., Quirion R. DNA microarrays in neuropsychopharmacol-ogy. // Trends Pharmacol. Sci. 2001. V. 22. № 8. P. 426-436.

16. Rumney S. IV, Kool E.T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. № 21. P. 5635-5646.

17. Gao H., Chidambaram N., Chen B.C., Pelham D.E., Patel R., Yang M., Zhou L., Cook A., Cohen J.S. Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide bridges. // Bio-con-jug. Chem. 1994. V. 5. № 5. P. 445-453.

18. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. // М.: Мир, 1987.

19. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. // М.: Мир, 1984. Т. 1,2,3.

20. Luo R., Gilson H.S., Potter M.J., Gilson M.K. The physical basis of nucleic acid base stack-ing in water. // Biophys. J. 2001. V. 80. №1.P. 140-148.

21. Crothers D.M., Zimm B.H. Theory of the melting transition of synthetic polynucleotides: evaluation of the stacking free energy. // J. Mol. Biol. 1964. V. 9. P. 1-9.

22. Calladine C.R. Mechanics of sequence-dependent stacking of bases in B-DNA. // J. Mol. Biol. 1982. V. 161. № 2. P. 343-352.

23. SantaLucia J. Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. V. 33. P. 415-440.

24. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Thermodynamics and NMR of internal GT mismatches in DNA. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 34. p. 10581-10594.

25. Breslauer K.J. Metods for obtaining thermodynamic data on oligonucleotide transition. In: Thermodynamic data for bio-chemistry and biotechnology, Chapter 15. /Ed. Hinz H.-J. // Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag. 1986. P. 402-427.

26. Privalov P.L., Ptitsyn O.B., Birshtein T.M. Determination of stability of the DNA double he-lix in an aqueous medium. // Biopolymers. 1969. V. 8. P. 559 -571.

27. Rouzina I., Bloomfleld V.A. Heat capacity effects on the melting of DNA. 1. General aspects. //Biophys. J. 1999. V. 77. № 6. P. 3242-3251.

28. Jelesarov I., Bosshard H.R. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calo-rimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition. //J. Mol. Recognit. 1999.V. 12. № 1. P. 3-18.

29. Marky L.A., Blumenfeld K.S., Kozlowski S., Breslauer K.J. Salt-dependent conformational transitions in the self-complementary deoxydodecanucleotide d(CGCAATTCGCG): evi-dence for hairpin formation. // Biopolymers. 1983. V. 22. № 4. P. 1247-1257.

30. Owczarzy R. Melting temperatures of nucleic acids: Discrepancies in analysis. // Biophys Chem. 2005. V. 117. № 3. P. 207-215.

31. Tikhomirova A., Taulier N., Chalikian T.V. Energetics of nucleic acid stability: the effect of DeltaCP. // J Am Chem Soc. 2004. V. 126. № 50. P. 16387-16394.

32. Rouzina I., Bloomfield V.A. Heat capacity effects on the melting of DNA. 2. Analysis of nearest-neighbor base pair effects. // Biophys. J. 1999. V. 77. № 6. P. 3252-3255.

33. Wu P., Nakano S., Sugimoto N. Temperature dependence of thermodynamic properties for DNA/DNA and RNA/DNA duplex fonnation. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. № 12. P. 2821-2830.

34. Petersheim M., Turner D.H. Base-Stacking and Base-Pairing Contributions to Helix Sta-bil-ity: Thermodynamics of Double-Helix Formation with CCGG, CCGGp,CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp. // Biochemistry. 1983. V. 22. № 2. P. 256-263.

35. Patel D.J., Hilbers C.W. Proton nuclear magnetic resonance investigations of fraying in dou-ble-stranded d-ApTpGpCpApT in H20 solution. // Biochemistry. 1975. V. 14. № 12. P. 2651-2656.

36. Petruska J., Goodman M.F., Boosalis M.S., Sowers L.C., Cheong C., Tinoco I. Jr. Com-pari-son between DNA melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 17. P. 6252-6256.

37. Liu L., Guo Q.X. Isokinetic Relationship, Isoequilibrium Relationship, and Enthalpy-Entropy Compensation. // Chem. Rev. 2001. V. 101. № 3. P. 673-695.

38. Lumry R. Uses of enthalpy-entropy compensation in protein research. // Biophys. Chem. 2003. V. 105. № 2-3. P. 545-557.

39. Breslauer K.J., Remeta D.P., Chou W.Y., Ferrante R., Curry J., Zaunczkowski D., Snyder J.G., Marky L.A. Enthalpy-entropy compensations in drug-DNA binding studies. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 24. P. 8922-8926.

40. Comish-Bowden A. Enthalpy-entropy compensation: a phantom phenomenon. // J. Bio-sci. 2002. V. 27. № 2. P. 121-126.

41. Petruska J., Goodman M.F. Enthalpy-entropy compensation in DNA melting thermodynamics. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 2. P. 746-750.

42. Sharp K. Entropy-enthalpy compensation: fact or artifact? // Protein Sci. 2001. V. 10. 3. P. 661-667.

43. Starikov E.B., Norden B. Enthalpy-entropy compensation: a phantom or something useful?//Phys. Chem. B. 2007. V. 111. №51. P. 14431-14435.

44. Freier S.M., Kierzek R., Jaeger J.A., Sugimoto N., Caruthers M.H., Neilson Т., Turner D.H. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. № 24. P. 9373-9377.

45. Gromiha M.M. Structure based sequence dependent stiffness scale for trinucleotides: a direct method. // J. Biol. Phys. 2000. V. 26. № 1. P. 43-50.

46. Halgren T.A. Representation of van der Waals (vdW) interactions in molecular mechanics force fields: potential form, combination rules, and vdW parameters. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. P. 7827-7843.

47. Cieplak, P., Cornell, W. D., Bayly, C., and Kollman, P. A. Application of the multi-molecule and multiconformational RESP methodology to biopolymers: charge derivation for DNA, RNA and proteins.//J. Comput. Chem. 1995. V. 16. № 11. P. 1357-1377.

48. Sugimoto N., Nakano S., Yoneyama M., Honda K. Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of DNA duplexes. //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. №22. P. 4501-4505.

49. Gray D.M. Derivation of nearest-neighbor properties from data on nucleic acid oligomers. I. Simple sets of independent sequences and the influence of absent nearest neighbors. // Bio-polymers. 1997. V. 42. № 7. P. 783-793.

50. Gray D.M. Derivation of nearest-neighbor properties from data on nucleic acid oligomers. II. Thermodynamic parameters of DNA:RNA hybrids and DNA duplexes. // Biopolymers. 1997. V. 42. № 7. P. 795-810.

51. Gray D.M., Hamilton F.D., Vaughan M.R. The analysis of circular dichroism spectra of natu-ral DNAs using spectral components from synthetic DNAs. // Biopolymers. 1978. V. 17. № 1. P. 85-106.

52. Goldstein R.F., Benight A.S. How many numbers are required to specify sequence-dependent properties of polynucleotides. // Biopolymers 1992. V. 32. № 12. P. 1679-1693.

53. Owczarzy R., Vallone P.M., Gallo F.J., Paner T.M., Lane M.J., Benight A.S. Predicting se-quence-dependent melting stability of short duplex DNA oligomers. // Biopolymers. 1997. V. 44. № 3. P. 217-239.

54. Nakano S., Kanzaki Т., Sugimoto N. Influences of Ribonucleotide on a Duplex Con-forma-tion and Its Thermal Stability: Study with the Chimeric RNA-DNA Strands. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. № 4. P. 1088-1095.

55. Doktycz M.J., Morris M.D., Dormady S.J., Beattie K.L., Jacobson K.B. Optical melting of 128 octamer DNA duplexes. Effects of base pair location and nearest neighbors on thermal stability. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 15. P. 8439-8445.

56. SantaLucia J. Jr. A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 4. P. 1460-1465.

57. Hud N.V., Plavec J. A unified model for the origin of DNA sequence-directed curvature. // Biopolymers. 2003. V. 69. № 1. P. 144-158.

58. Mathews D.IL, Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermo-dynamic parameters improves pre-diction of RNA secondary structure. // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. №5. P. 911-940.

59. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of internal AC mismatches in DNA sequence dependence and pH effects. // Biochemistry 1998. V. 37. № 26, P. 9435-9444.

60. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Nearest neighbor thermodynamic parameters for internal GA mismatches in DNA. // Biochemistry. 1998. V. 37. № 8. P. 2170-2179.

61. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Thermodynamics of internal CT mismatches in DNA. // Nu-cleic Acids Res. 1998. V. 26. № 11. P. 2694-2701.

62. Peyret N., Seneviratne P.A., Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermody-nam-ics and NMR of DNA sequences with internal АА, CC, GG, and TT mismatches. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 12. P. 3468-3477.

63. Bommarito S., Peyret N., SantaLucia J. Jr. Thermodynamic parameters for DNA sequences with dangling ends. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № 9. P. 1929-1934.

64. Ke S.H., Wartell R.M. Influence of neighboring base pairs on the stability of single base bulges and base pairs in a DNA fragment. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 14. P. 4593-4600.

65. Santa-Lucia J. Jr., Peyret N. Method and system for predicting nucleic acid hybridization thermodynamics ans computer-readeble storage medium for use therein. // US Patent application publication. № US 2003/0224357 AI. Pub. Date: Dec. 4. 2003.

66. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23. № 6-7. P. 1057-1064.

67. Peyret N. Prediction of Nucleic Acid Hybridization: Parameters and Algorithms. // Ph.D. Thesis. Wayne State University, Detroit, MI. 2000.

68. Bourde'lat-Parks B.N., Wartell R.M. Thermodynamic Stability of DNA Tandem Mismatches. // Biochemistry. 2004. V. 43. № 30. P. 9918-9925.

69. Ke S.-H., Wartell R.M. The thermal stability of DNA fragments with tandem mismatches at a d(CXYG)• d(CY4X4G) site. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 4. P. 707-712.

70. Ebel S., Lane A.N., Brown T. Very stable mismatch duplexes: structural and thermodynamic studies on tandem G.A mismatches in DNA. // Biochemistry. 1992. V. 31. № 48. P. 12083-12086.

71. Chou S.-H., Chin K.-H., Wang A. H.-J. Unusual DNA duplex and hairpin motifs. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. № 10. P. 2461-2474.

72. Tanaka F., Kameda A., Yamamoto M., Ohuchi A. Thermodynamic parameters based on a nearest-neighbor model for DNA sequences with a single-bulge loop. // Biochemistry. 2004. V. 43. №22. P. 7143-7150.

73. Wang Y.H., Griffith J. Effects of bulge composition and flanking sequence on the kinking of DNA by bulged bases. // Biochemistry. 1991. V. 30. № 5. P. 1358-1363.

74. Feig M., Zacharias M., Pettitt B.M. Conformations of an adenine bulge in a DNA oc-tamer and its influence on DNA structure from molecular dynamics simulations. // Biophys. J.2001. V. 81. № 1. P. 352-370.

75. Пышный Д.В., Иванова E.M. Термодинамические параметры коаксиального стэ-кинга при гибридизации олигодезоксирибонуклеотидов встык. // Изв. АН. Сер. хим.2002. №7. С. 1057-1066.

76. Protozanova Е., Yakovchuk P., Frank-Kamenetskii M.D. Stacked-unstacked equilibrium at the nick site of DNA. // J. Mol. Biol. 2004. V. 342. № 3. p. 775-785.

77. Yakovchuk P., Protozanova E., Frank-Kamenetskii M.D. Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. № 2. P. 564-574.

78. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova E.M. Efficiency of coaxial stacking depends on the DNA duplex structure. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. V. 21. № 3. P. 459-468.

79. Vasiliskov V.A., Prokopenko D.V., Mirzabekov A.D. Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № Ц. p. 2303-2313.

80. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., Mirzabekov A.D. Parallel ther-modynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 6. P. 1515-1521.

81. Watkins N.E. Jr, SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 19. P. 6258-6267.

82. Geci I., Filichev V.V., Pedersen E.B. Synthesis of twisted intercalating nucleic acids possessing acridine derivatives. Thermal stability studies. // Bioconjug. Chem. 2006. V. 17. № 4. P. 950-957.

83. Boczkowska M., Guga P., Stec W.J. Stereodefined phosphorothioate analogues of DNA: relative thermodynamic stability of the model PS-DNA/DNA and PS-DNA/RNA complexes. //Biochemistry. 2002. V. 41. №41. P. 12483-12487.

84. Xu Y., Kino K., Sugiyama H. The conformational study of two carbocyclic nucleosides: why carbocyclic nucleic acids (CarNAs) form more stable duplexes with RNA than DNA does. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2002. V. 20. № 3. P. 437-446.

85. Schlegel M.K., Peritz A.E., Kittigowittana K., Zhang L., Meggers E. Duplex formation of the simplified nucleic acid GNA. // Chembiochem. 2007. V. 8. № 8. P. 927-932.

86. Martin F.H., Castro M.M., Aboul-ela F., and Tinoco I. Jr. Base pairing involving deoxyi-nosinc: implications for probe design. // Nucleic Acids Res. 1985.V. 13. № 24. P. 8927-8938.

87. Petersen M., Nielsen C.B., Nielsen K.E., Jensen G.A., Bondensgaard K., Singh S.K., Ra-jwanshi V.K., Koshkin A.A., Dahl B.M., Wengel J., Jacobsen J.P. The conformations of locked nucleic acids (LNA). // J. Mol. Recognit. 2000. V. 13. № 1. P. 44-53.

88. Jensen G.A., Singh S.K., Kumar R., Wengel J., Jacobsen J.P. A comparison of the solution structures of an LNA:DNA duplex and the unmodified DNA:DNA duplex. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 2001. P. 1224-1232.

89. Takiya Т., Seto Y., Yasuda H., Suzuki Т., Kawai K. An empirical approach for thermal sta-bility (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes. //Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxl). 2004. №48. P. 131-132.

90. Giesen U., Kleider W., Berding C., Geiger A., Orum H., Nielsen P.E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 1998.V. 26. №21. P. 5004-5006.

91. Almarsson O., Bruice T.C. Peptide nucleic acid (PNA) conformation and polymorphism in PNA-DNA and PNA-RNA hybrids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 20. P. 9542-9546.

92. Amrane S., Mergny J.L. Length and pH-dependent energetics of (CCG)n and (CGG)n trinu-cleotide repeats. // Biochimie. 2006.V. 88. № 9. P. 1125-1134.

93. Williams M.C., Wenner J.R., Rouzina I., Bloomfield V.A. Effect of pH on the overstretching transition of double-stranded DNA: evidence of force-induced DNA melting. // Biophys. J. 2001. V. 80. № 2. P. 874-881.

94. Piskur J., Rupprecht A. Aggregated DNA in ethanol solution. // FEBS Lett. 1995. V. 375. №3. P. 174-178.

95. Tarahovsky Y.S., Rakhmanova V.A., Epand R.M., MacDonald R.C. High temperature sta-bilization of DNA in complexes with cationic lipids. // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 264273.

96. Evstigneev M.P., Mykhina Y.V., Davies D.B. Complexation of daunomycin with a DNA oligomer in the presence of an aromatic vitamin (B2) determined by NMR spectroscopy. // Biophys. Chem. 2005. V. 118. №2-3. P. 118-127.

97. Nakano S., Karimata H., Ohmichi Т., Kawakami J., Sugimoto N. The effect of molecular crowding with nucleotide length and cosolute structure on DNA duplex stability. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. № 44. P. 14330-14331.

98. Gu X.B., Nakano S., Sugimoto N. The effect of the structure of cosolutes on the DNA du-plex formation. //Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2006. V. 50. P. 205-206.

99. De Xammar Oro J.R., Grigera J.R. On the thermal stability of DNA in solution of mixed solvents. //Journal of Biological Phys. 1995. V. 21. P. 151-154.

100. Франк-Каменецкий М.Д. Рассмотрение перехода спираль-клубок в гомополимерах методом наиболее вероятного распределения. // Мол. Биол. 1968. Т. 2. Вып. 3. С. 408419.

101. Ландо Д.Ю., Иванова М.А., Ахрем А.А. Влияние изменения стехиометрии комплекса ДНК-лиганд при тепловой денатурации ДНК на параметры перехода спираль-клубок. // Мол. Биол. 1980. Т. 14. Вып. 6. С. 1281-1288.

102. Сорокин В.А., Гладченко Т.О., Галкин В.Л., Волчок И.В., Благой Ю.П. Теории «кон-денсации» и «скрепок» при описании перехода спираль-клубок ДНК: сравнительный анализ. // Биофизика. 1996. Т. 41. Вып. 6. С. 1214-1220.

103. Ахрем А.А., Ландо Д.Ю., Крот В.И. Исследование плавления нуклеопротеидов 1. Теория перехода спираль-клубок ДНК в присутствии белков с кооперативным характером взаимодействия при обратимом связывании. // Мол. Биол. 1976. Т. 10. Вып. 6. С. 1332-1340.

104. Ахрем А.А., Ландо Д.Ю. Влияние лигапдов с избирательным характером взаимо-дей-ствия на переход спираль-клубок ДНК. // Мол. Биол. 1979. Т. 13. Вып 5. С. 10981108.

105. Anastassopoulou J. Metal-DNA interactions. // J. Mol. Structure. 2003. V. 651-653. P. 19-26.

106. Nakano S., Fujimoto M., Нага H., Sugimoto N. Nucleic acid duplex stability: influence of base composition on cation effects. //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 14. P. 2957-2965.

107. Korolev N., Lyubartsev A.P., Nordenskiold L. Application of polyelectrolyte theories for analysis of DNA melting in the presence of Na+ and Mg2+ ions. // Biophys. J. 1998. V. 75. №6. P. 3041-3056.

108. Owczarzy R., Dunietz I., Behlkc M.A., Klotz I.M., Waldcr J.A. Thermodynamic treatment of oligonucleotide duplex-simplex equilibria. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. №25. P. 14840-14845.

109. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides. // Q. Rev. Biophys. 1978. V. 11. № 2. P. 179-246.

110. Франк-Каменецкий М.Д., Аншелевич В.В., Лукашин А.В. Полиэлектролитная модель ДНК. // УФН. 1987. Т. 151. Вып. 4. С. 595-618.

111. Frank-Kamenetskii M.D., Lukashin A.V., Anshelevich V.V. Application of polyelectrolyte theory to the study of the B-Z transition in DNA. // J. Biomol. Struct. Dyn. 1985. V. 3. № 1. P. 35-42.

112. Korolev N., Lyubartsev A. P., Nordenskiold L. Application of polyelectrolyte theories for analysis of DNA melting in the presence of Na+ and Mg2+ ions. // Biophys. J. 1998. V. 75. №. 6. P. 3041-3056.

113. Wilson R.W., Rau D.C., Bloomfield V.A. Comparison of polyelectrolyte theories of the binding of cations to DNA. //Biophys. J. 1980. V. 30. №. 2. P. 317-325.

114. Stigter D. Evaluation of the counterion condensation theory of polyelectrolytes. // Biophys. J. 1995. V. 69. № 2. P. 380-388.

115. Lyubartsev A.P. Molecular Simulations of DNA Counterion Distributions. // in Dekker En-cyclopedia ofNanoscience and Nanotechnology. 2004. by Marcel Dekker, Inc. P. 21312143.

116. Korolev N., Lyubartsev A.P., Rupprecht A., Nordenskiold L. Competitive binding of Mg(2+), Ca(2+), Na(+), and K(+) ions to DNA in oriented DNA fibers: experimental and Monte Carlo -simulation results. // Biophys. J. 1999. V. 77. № 5. P. 2736-2749.

117. Feig M., Pettitt B.M. Sodium and chlorine ions as part of the DNA solvation shell. // Biophys. J. 1999. V. 77. № 4. P. 1769-1781.

118. Хеерман Д.В. Методы компьютерного эксперимента в теоретической физике. // М.: Наука, 1990.

119. Quesada-Perez М., Martin-Molina A., Hidalgo-Alvarez R. Simulation of electric double layers undergoing charge inversion: mixtures of mono- and multivalent ions. // Langmuir. 2005. V. 21. № 20. P. 9231-9237.

120. Schildkraut C., Lifson S.'Dependence of the melting temperature of DNA on salt concen-tra-tion. // Biopolymers. 1965. V. 3. № 2. P. 195-208.

121. Wetmur J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991. V. 26. № 3-4. P. 227-259.

122. Frank-Kamenetskii M.D. Simplification of the empirical relationship between melting tem-perature of DNA, its GC content and concentration of sodium ions in solution. // Bio-poly-mers. 1971. V. 10. № 12. P. 2623-2624.

123. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. // J. Mol. Biol. 1962. V. 5. P. 109-118.

124. SantaLucia J. Jr., Allawi H.T., Seneviratne P.A. Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. // Biochemistry. 1996. V. 35. № 11. P. 3555-3562.

125. Mitsuhashi M. Technical Report: Part 1. Basic requirements for designing optimal oligonucleotide probe sequences. // J. Clin. Lab. Anal. 1996. V. 10. № 5. P. 277-284.

126. Tan Z.J., Chen S.J. RNA helix stability in mixed Na+/Mg2+ solution. // Biophys. J. 2007. V. 92. № 10. P. 3615-3632.

127. Stein V.M., Bond J.P., Capp M.W., Anderson C.F., Record M.T. Jr. Importance of cou-lom-bic end effects on cation accumulation near oligoelectrolyte B-DNA: a demonstration using 23NaNMR. //Biophys J. 1995. V. 68. № 3. P. 1063-1072.

128. Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids. / Ed. Fasman, G.D. // CRC Press. 1975. V. l.P. 589.

129. Wagner W., Pruss A. The IAPWS Formulation 1995 for the Thermodynamic Properties of Ordinary Water Substance for General and Scientific Use. // J. Phys. Chem. Ref. Data. 2002. V. 31. P. 387-535.

130. Джерасси К. Дисперсия оптического вращения // М: Издательство иностранной ли-те-ратуры, 1962.

131. Иванов В.И. Круговой дихроизм и структура комплементарных нуклеиновых кислот. //Молек. биол. 1973. Т. 7. С. 104-140.

132. Johnson W.C. Jr. Circular dichroism and its empirical application to biopolymers. // Meth-ods Biochem. Anal. 1985. V. 31. P. 61-163.

133. Cantor C.R., Warshaw M.M., Shapiro H. Oligonucleotide interactions. III. Circular di-chro-ism studies of the conforma-tion of deoxyoligonucleotides. // Biopolymers. 1970. V. 9. №9. P. 1059-1077.

134. Warshaw M.M., Cantor C.R. Oligonucleotide interactions. IV. Conformational differences between deoxy- and ribonucleoside phosphates. // Biopolymers. 1970. V. 9. № 9. P. 1079-1103.

135. Mergny J.L., Lacroix L. Analysis of thermal melting curves. // Oligonucleotides. 2003. V. 13. №6. P. 515-537.

136. Tsourkas A., Behlke M.A., Rose S.D., Bao G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. № 4. P. 1319-1330.

137. Duguid J.G., Bloomfield V.A., Benevides J.M., Thomas G.J. Jr. DNA melting investigated by differential scanning calorimetry and Raman spectroscopy. // Biophys J. 1996. V. 71. №6. P. 3350-3360.

138. Wemmer D.E., Chou S.H., Hare D.R., Reid B.R. Duplex-hairpin transitions in DNA: NMR studies on CGCGTATACGCG. // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. № 10. P. 37553772.

139. Lokhov S.G., Pyshnyi D.V. Thermodynamic and spectral proper-ties of DNA minidu-plexes with the terminal G-A mispair and 3' or 5' dangling bases. // FEBS Lett. 1997. V. 420. №2-3. P. 134-138.

140. Marky L.A., Breslauer K.J. Calculating thermodynamic data for transition of any molecu-larity from equilibrium melting curves. // Biopolymers. 1987. V. 26. № 9. P. 1601-1620.

141. Vesnaver G., Breslauer К .J. The contribution of DNA single-stranded order to the thermo-dynamics of duplex formation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 9. P. 3569-3573.

142. Wu P., Sugimoto N. Transition characteristics and thermodynamic analysis of DNA duplex formation: a quantitative consideration for the extent of duplex association. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № 23. P. 4762-4768.

143. Tataurov A.V., You Y., Owczarzy R. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids. // Biophys Chem. 2008. V. 133. № 1-3. P. 66-70.

144. Пышная И.А. «Мостиковые» олигонуклеотиды как перспектиыные инструменты в онтисенс технологии и ДНК-диагностике // Дис. канд. хим. наук: 02.00.10. Защищена 03.02.06. Утв. 12.05.06. Новосибирск. 2006. 150 е.

145. Goobes R., Minsky A. Contextual equilibrium effects in DNA molecules. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 19. P. 16155-16160.

146. Gryaznov S.M., Lloyd D.H. Modulation of oligonucleotide duplex and triplex stability via hydrophobic interactions. //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. № 25. P. 5909-5915.

147. Letsinger R.L., Chaturvedi S.K., Farooqui F., Salunkhe M. Use of hydrophobic substitu-ents in controlling self-assembly of oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. № 16. P. 7535-7536.

148. Ohmichi Т., Nakamuta H., Yasuda K., Sugimoto N. Kinetic Property of Bulged Helix For-mation: Analysis of Kinetic Behavior Using Nearest-Neighbor Parameters. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. № 46. P. 11286-11294.

149. Ying L., Wallace M.I., Klenerman D. Two-state model of conformational fuctuational a DNA hairpin-loop. // Chemical Physics Letters. 2001. V. 334. № 10. P. 145-150.

150. Williams A.P., Longfellow C.E., Freier S.M., Kierzek R., Turner D.H. Laser Temperature-Jump, Spectroscopic, and Thermodynamic Study of Salt Effects on Duplex Formation by dGCATGCt. // Biochemistry. 1989. V. 28. № Ю. P. 4283-4291.

151. Reuben J., Shporer M., Gabbay E.J. The Alkali Ion-DNA Interaction as Reflected in the Nuclear Relaxation Rates of Na+ and Rb+. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. № 1. P. 245-247.