"Мостиковые" олигонуклеотиды как перспективные инструменты в антисенс технологии и ДНК-диагностике тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПЫШНАЯ ИННА АЛЕКСЕЕВНА

«МОСТИКОВЫЕ» ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ В АНТИСЕНС ТЕХНОЛОГИИ И ДНК-ДИАГНОСТИКЕ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2006

Работа выполнена в

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель: _

к.х.н., доцент|"Йванова | Евгения Михайловна

Научный консультант

д.х.н., профессор Зарытова Валентина Филипповна

Официальные оппоненты:

д.б.н. Зенкова Марина Аркадьевна к.х.н. Ошевский Сергей Иванович

Ведущая организация: Химический Факультет

Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

на заседании диссертационного совета Д 1)03.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.Х.Н.

Фёдорова О.С.

¿оое>А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование олигонуклеотидных конструкций в качестве инструментов в различных молекулярно-биологических исследованиях основано на способности олигонуклеотидов эффективно образовывать комплексы с комплементарными им участками НК. Однако эффективное связывание олигонуклеотидов с мишенями не всегда является селективным. Так, высокоэффективное связывание протяженного олиго-нуклеотида может оказаться неселективным, поскольку наряду с образованием прочного совершенного комплекса не исключена возможность формирования частично комплементарных комплексов с мишенями, содержащими нуклеотидные несоответствия. Наиболее остро проблема обеспечения селективности комплексообразования встает для ОС-богатых олигонуклеотидных конструкций, когда стабильность ОС-богатых комплексов, содержащих мисматчи, оказывается близка или даже выше стабильности совершенных АТ-богатых комплексов одной и той же длины. Зависимость стабильности НК-комплексов от длины и нуклеотидного состава делает проблематичным использование наборов природных олигонуклеотидов, например, для ДНК-диагностики при использовании «чиповой» технологии.

В настоящее время существуют несколько подходов к повышению селективности комплексообразования олигонуклеотидов с НК: введение в состав буфера тетраалкиламмониевых солей; замена протяженных олигомеров тандемами на основе коротких олигонуклеотидов; применение модифицированных олигонуклеотидов с измененными гибридизационными свойствами, например РЫА и ЬИА. Однако, комплексы РИА и ЬИА олигомеров с НК не всегда могут выступать в качестве субстратов ферментов, часто используемых в различных молекулярно-биологических исследования.

Олигонуклеотиды, состоящие из нативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотидными вставками, и имеющие непрерывный сайт связывания с НК («мостиковые» олигонуклеотиды МО), могут быть компромиссным вариантом между протяженными и модифицированными олиго-нуклеотидами.

Целью настоящей работы являлось изучение возможности использования «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве олигонуклеотидных зондов для ДНК-диагностики, основанной на методе молекулярной гибридизации, и для направленного воздействия на ДНК-мишень в качестве адресной части алкилирующих производных.

В ходе исследования решались следующие задачи: систематическое изучение гибридизационных свойств МО, содержащих в сахарофосфатном остове различные ненуклеотидные вставки; исследование направленного воздействия на ДНК-мишень алкилирующего производного «мостикового» олигонуклеотида; изучение ферментативного превращения «мостиковых» олигонуклеотидов и их компле!

1илышм»-или содержащими нук-РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА С.Пете^рт 9 4

ОЭ

11 ■ 1 11 ■■

леотидные несоответствия матрицами в присутствии таких ферментов, как фосфодиэстераза змеиного яда, Год-гтолимераза и Т4 ДНК-лигаза; исследование возможности использования иммобилизованных «мостиковых» оли-гонуклеотидов в качестве зондов для анализа последовательности ДНК методом молекулярной гибридизации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были систематически исследованы гибридизационные свойства «мостиковых» олигонуклеотидов, содержащих в сахарофосфатном остове вставки на основе олигоэтиленгликолей, олигометилендиолов и аналога тетрагидрофу-рана. Показано, что наличие любой вставки в составе комплекса приводит к уменьшению его стабильности, причем дестабилизирующий эффект вставки зависит от ее длины, природы и положения в составе МО, а также от количества вставок. Продемонстрировано, что, введение вставок в различные по составу олигонуклеотиды позволяет получать олигонуклеотидные конструкции с заранее заданными гибридизационными свойствами. Установлено, что в условиях эффективного комплексообразования наличие вставки в МО не приводит к изменению направленности и степени модификации ДНК-мишени алкилирующим производным МО, по сравнению с теми же параметрами для алкилирующего производного природного олиго-нуклеотида. Изучены закономерности ферментативного превращения МО в комплексах с ДНК-матрицами под действием Т4 ДНК-лигазы и Taq-полимеразы. Впервые показано, что наличие даже однонуклеотидного несоответствия между МО и ДНК-матрицей приводит к уменьшению выхода продукта ферментативной реакции как при использовании Т4 ДНК-лигазы, так и 7я<7-полимеразы. Впервые иммобилизованые МО были предложены и использованы в качестве высокоселективных зондов при выявлении НК, содержащих однонуклеотидные несоответствия, методом молекулярной гибридизации, в том числе с ферментативным включением метки в состав МО.

В данной работе предложен подход для анализа последовательности ДНК, практическая значимость которого получила подтверждение в патенте на изобретение. Разработана тест-система для выявления и генотипиро-вания вируса гепатита С.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на международных и российских концеренциях: 'Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference", Novosibirsk, 2003; "Chemical & Biological Problems of Proteomics", Novosibirsk, 2004; III международная конференция "Высокие медицинские технологии в XXI веке", Бенидорм, Испания, 2004; International Conference in Chemical Biology, Novosibirsk, 2005; Российской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней", Новосибирск, 2005; "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск, 2005; на выставке высокотехнологичной продукции

СО РАН в рамках IX Петербургского международного экономического форума, Санкт-Петербург, 2005.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах, содержит 39 рисунков, 12 схем, 4 таблицы и 4 приложения. Библиография включает 266 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Гибридизационные свойства «мостиковых» олигонуклеотидов

Исследование гибридизационных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов (МО) проводили на трех модельных комплексах (Схема 1), каждый из которых состоял из матрицы M и контрольного или «мостикового» олиго-нуклеотида. Контрольные и «мостиковые» олигонуклеотиды различались по длине: окта-, дека- и додекануклеотиды.

Схема 1

148 М10 Ml 2

3'CGAGGTCC5' 3'TCGAGGTCCC5' 3' GTGAGGTÇCGT 5'

118 GCTCCAGG M10 AGCTCCAGGG N12 CAGCTCCAGGCA

* * *

N4<£)±H4 GCTCCAGG N5 (L) jN5 AGCTCCAGGC N6 (1)^6 CAGCTCCAGGCA

* положение ненуклеотидной вставки L

Вставки представляли собой содержащие фос- TF ГО ? DES TEG HEG о-

фатную группу остатки ?" >DD i Р" .

тетрагидрофурана - TF, L. " ,< ; J 0.¿ °Г ; С олигоэтиленгликолей (ди ¿-р- | 0_ ) _ и о t-0 0J t-0 о-^

- DEG, тетра - TEG и 5 o-g- ô-jj- ^

гекса - HEG) и олигоме- 0 0

тилендиолов (пента - PD и дека — DD). Исследуемые ненуклеотидные вставки отличались по гидрофобности и по длине и были расположены в центральной части олигонуклеотидов (Схема 1).

Исследование гибридизационных свойств МО проводили методом термической денатурации их комплексов с матрицами при помощи оптической регистрации сигнала. Термодинамические параметры образования комплексов определяли двумя способами [Petersheim et al., 1983]: 1) оптимизационным методом, используя приближение модели двух состояний и 2) концентрационным методом из зависимости обратной температуры плавления комплексов от суммарной концентрации олигонуклеотидных компонентов. Во всех случаях рассчитанные параметры с высокой точностью описывают экспериментальные значения оптической плотности во всем диапазоне температур (Рис. 1).

0.024 -, ДАх/ДТ

270 nm 280 nm

260 nm

0.012

Рис. 1. Типичные экспериментальные (черные) и рассчитанные (цветные) дифференциальные кривые плавления, полученные на разных длинах волн для контрольного и содержащих ненуклеотидную вставку декану клеотидных комплексов N12/M12 (1) и N6(D£G),N6/M12 (2). Кривые получены при общей концентрации цепей 2.6*10"5 М в буфере, содержащем 10 шМ фосфат натрия

юо (рН 7.3), 1 MNaCl, 0.1 mM EDTA. т, "с

Ниже (Рис. 2) представлены термодинамические данные для додеканук-леотидных комплексов. Введение любой ненуклеотидной вставки приводит к дестабилизации каждого из образуемых комплексов, т.е. наблюдается падение температуры плавления и абсолютных величин свободной энергии комплексообразования (Рис. 2).

ag°37 2 -15.0

-10.0

-5.0

Рис. 2. Температуры плавления (точки) и свободные энергии (столбцы) образования додекануклеотидных комплексов матрицы М12 с контрольным N12 и «мости-ковыми» N6(£)iN6 олигоцуклеотидами.

Вставка на основе TF (Рис. 2, комплекс N6(f.)iN6/M12") вызывает минимальную дестабилизацию модифицированных комплексов. При увеличении длины ненуклеотидной вставки ее дестабилизирующий эффект, рассчитанный как AAG°37(£) = AG°3t(N6(L)iN6/M12) - AG°37(N12/M12), увеличивается. Так, например, для всех комплексов, сформированных DEG-содержащими олигомерами (9 связей), величина AAG°37 на ~ 1.3 ккал/моль ниже, чем для //ЕС-содержащих олигомеров (21 связь). Ненуклеотидные вставки на основе DEG и PD, имеющие одинаковое количество вносимых связей (по 9), имеют сопоставимый дестабилизирующий эффект (3.33 и 3.83 ккал/моль, соответственно).

При увеличении числа вставок i от 1 до 5 наблюдается дальнейшее падение величин свободной энергии комплексообразования и температуры плавления модифицированных комплексов (Рис. 2, комплекс N6(Z>fG1iN6/M12). Для каждого типа вставок наибольший дестабилизирующий вклад вносит введение в состав олигонуклеотида именно первой мономерной ненуклеотидной вставки (i=l). Следует отметить, что дестабилизирующий эффект при введении каждой следующей вставки непропорционален числу вставок, т.е. не является аддитивным. Например, значение дестабилизирующего вклада в олигомерах N6(i)N6 и N6(L)3N составляет 3.3 (i=l) и 4.7 (1=3) ккал/моль, соответственно.

Исключение то описанных выше закономерностей составляют комплексы, содержащие вставки на основе декандиола DD, увеличение числа повторов которой вызывает рост стабильности модифицированного комплекса относительно дуплексов с одиночным остатком DD (Рис. 2, комплекс N6(POMN6/M 12). Вероятно, при увеличении числа Ш)-вставок до двух фосфатная группа «ломает» общую структуру вставки с формированием гидрофобных контактов между двумя декандиолами, обеспечивая стабилизацию дуплекса.

При изменении длины олигонуклеотидов (окта-, дека- и додека-) все приведенные закономерности влияния вставок на гибридизационные свойства МО сохранялись.

Влияние позиции ненуклеотидной вставки в составе олигонуклеотида на гибридизационные свойства полученных МО исследовали на модельных комплексах, каждый из которых состоял из матрицы М12 и контрольного N12 или •М'С-содержащего додекануклеотида Nv(£)Nw. Вставка располагалась на расстоянии от двух (v=2) до десяти нуклеотидов (w=10) от 5'-конца додекануклео- 4 с

тида (Рис. ЗА).

Введение одной и той -

же DEG-вставки в J~

разные положения pnv(£)nw додекануклеотида N12 приводит к изменению свободной энергии в интервале 1.6 3.7 ккал/моль (Рис. ЗБ). Наличие ненуклеотидной вставки в центральной ЧаСТИ ДОДе- где * - положение вставки £ швжв кануклеотида вносит Рис. 3. Модельные комплексы (А) и дестабилизирую-болыпий вклад в дес- щий эффект DEG-всггавки (Б), рассчитанный по фор-табилизацию форми- муле

руемого комплекса, по MG°37(i) = AG°37(Nv(L)Nw/M12) - ДО°37(М2/М12)

Г 5' GICSASGTCCGI CAGCTCCAGGCA Ml 2 N12 ддв°7 ккал/мол

CAGCTCCAGGCA N2(L)N10 1. 6

CAGCTCCAGGCA N3 (I) N9 2. 7

CAGCTCCAGGCA N4 (i)N8 3. .5

CAGCTCCAGGCA N5 (i)N7 2. 8

CAGCTCCAGGCA N6(£)N6 3. . 7

CAGCTCCAGGCA N7(X)N5 3. 5

CAGCTCCAGGCA N4 (i)N8 2 . 4

CAGCTCCAGGCA N9 (L) N3 2 .8

CAGCTCCAGGCA N10 (£)N2 2 .2

сравнению со случаем, когда вставка располагается ближе к концам «мос-тикового» олигомера, например A AG 037(N6(i.)N6) = 3.7 ккал/моль.

Увеличение числа мономерных вставок в составе додекануклеотида N12 до четырех приводит к дальнейшему понижению гибридизационных свойств «мостиковых» олигомеров в интервале 3.7 11.1 ккал/моль (Рис. 4). При этом эффект, связанный с наличием двух мономерных ненуклео-тидных вставок в разных положениях додекануклеотида N12, является практически аддитивным, т.е. соответствует сумме эффектов, наблюдаемых при использовании соответствующих олигомеров, имеющих по одной мономерной вставки в тех же положениях.

GTCGA6GTCCGT

Ml 2

CAGCTCCAGGCA CAGCTCCAGGCA CAGCTCCA*GGCA CAGCTCCAG*GCA CAGCTCCA*GGCA

N12 N6(£)N6 N4 (X)N4 (£)N4 N3<L>N3(£)N3<L)N3 N2 (i)N2 (L)N4 (L)N2 (I) N2

Рис. 4. Температуры плавления (столбцы) и свободные энергии (точки) комплексообра-зования матрицы М12 с нативным и «мостико-выми» олигонуклеоти-дами, содержащими от одной до четырех /)£С-вставок.

Таким образом, изменение термической стабильности комплексов, сформированных олигонуклеотидами, содержащими ненуклеотидные вставки, зависит от природы ненуклеотидной вставки, ее положения в олигонуклео-тидной цепи, а также от количества вставок и числа связей во вставке. Наличие вставки в составе комплекса приводит к изменению величин свободной энергии в интервале 1.6 11.1 ккал/моль; наибольший дестабилизирующий вклад вносит введение первой мономерной ненуклеотидной вставки, а увеличение числа вставок приводит к дальнейшему падению величин свободной энергии комплексообразования и температуры плавления модифицированных комплексов.

2. Ллтлирование ДНК-мишени реакционно-способным производным (ЯС1-)«мостикового» олигонуклеотида было исследовано на модельном комплексе (Рис. 5). В качестве мишени использовали 5'-[32Р]-меченый 20-звенный олигонуклеотид М. Алкилирующие ЛС/-содержащие реагенты получали на основе нативного рМ2 и «мостикового» р№(£)№ додекаме-ров. В качестве ненуклеотидной вставки использовали остаток гексамети-лендиола (НО). Алкилирование мишени М регистрировали гель-электрофорезом в денатурирующем 20% ПААГ по появлению продуктов деструкции полинуклеотидной цепи в местах модифицированных оснований после обработки реакционной смеси 10% водным пиперидином и пиперидин-стабильных аддуктов. Реакционную смесь, содержащую аддукты ковалентного присоединения реагента по основанию С13 мишени, устойчи-

вые к обработке пиперидином (адцукты * на рис. 5А), предварительно обрабатывали гидразин-гидратом для расщепления модифицированной мишени (данные рассщепления гидразин-гвдратом не представлены).

Нативный р!Ч12 образует стабильный комплекс с ДНК мишенью М (Тпл 55°С) и модифицирует ее на 60% в условиях эффективного комплексообра-зования (при 20°С). Введение в состав додекануклеотида вставки практически не влияет на степень модификации ДНК-мишени реагентом ЯС1-р№(£)№ (64%), несмотря на уменьшение гибридизационных свойств этого олигомера (Тпл 38°С) (Рис. 5Б).

Рис. 5. Модификация ДНК-мишени алкилирующими реагентами. (А) Радиоавтограф гель-электрофореза в 20% денатурирующем геле продуктов модификации мишени М алкилирующими реагентами на основе N12 (1) и N4(Z.)N8 (2) после пиперидиновой обработки. (Б) Модельные комплексы, степень модификации ДНК-мишени алкилирующими реагентами и температуры плавления соответствующих комплексов. Условия модификации: 10 шМ трис-HCl (рН 7.2), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, [М] = 5-10"7 М, [реагент] = 1*10"5 М при 20°С, 48 ч. Условия плавления: 10 шМ какодилат натрия (рН 7.4), 100 шМ NaCl, 1 mM EDTA при общей концентрации цепей 2.6*10"5 М

Сайты модификации как для 7?C/-pN12, так и для ffC7-pN4(L)N8 были одни и те же: G9, G12, С13, G16, G19, включая основной сайт алкилирования -С13 (70% - от общей степени модификации).

Суммируя представленные данные по модификации мишени алкилирующими производными нативных и «мостиковых» олигонуклеотидов, можно сделать вывод, что в условиях эффективного комплексообразования наличие в составе реакционноспособного производного олигонуклеотида не-нуклеотидной вставки не приводит к изменению эффективности и направленности алкилирования ДНК-мишени. Таким образом, «мостиковые» оли-гонуклеотиды, несущие реакционноспособную группу, могут быть использованы при физиологических условиях в качестве потенциальных инструментов в антисенс технологии.

А

(A+G) 1 2

Б

адцуктьГ

Тпл, °С

55 38

3. Субстратные свойства «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК в реакциях, катализируемых ферментами

Способность «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК участвовать в реакциях, катализируемых ферментами была исследована при использовании З'-экзонуклеазы на примере фосфодиэстеразы (Crotalus atrox), а также с помощью широко применяемых в молекулярной биологии Т4 ДНК-лигазы и Год-полимеразы.

3.1. Гидролиз «мостиковых» олигонуклеотидов фосфодиэстеразой змеиного яда

Сравнение устойчивости 5'-[32Р]-меченых нативного (32pN20 -32pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA) и «мостикового» (32pN8(L)N4(L)N8 -32pGCATCAAG*CAGC*TCCAGGCA) олигомеров в присутствии З'-экзонуклеазы было проведено на примере фосфодиэстеразы. В качестве ненуклеотидной вставки использовали остаток гексаметилендиола (HD). Время полупревращения контрольного 32pN20 и «мостикового» 32pN8(/,)N4(Z,)N8 олигонуклеотидов в присутствии фосфодиэстеразы змеиного яда составило 60 и 180 минут, т.е. гидролиз фосфодиэфирной связи перед ненуклеотидной вставкой замедляется в три раза, по сравнению с гидролизом связей в нативном олигонуклеотвде (Рис. 6А). Причем, если нативный 32pN20 практически полностью разрушается, то для модифицированного олигомера 32pN8(£)N4(L)N8 наблюдается накопление продукта, укороченного с З'-конца до первой ненуклеотидной вставки (Рис. 6Б).

о *—<—I—'—I—|—I—|—I О 100 200 300 400 Время, мин

Рис. 6. Кинетические кривые накопления 5'-меченых продуктов гидролиза 32р1Ч12 (1) и (2) в присутствии 0.09 ед. фосфодиэстеразы змеи-

ного яда (А) и радиоавтораф продуктов гидролиза (Б) через 15 и 340 минут реакции. Условия гидролиза: 20 гаМ Тлэ-НО (рН 8.0), 100 шМ №С1, 15 шМ МяС12,1 тМ БЭТА.

Таким образом, наличие ненуклеотидной вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида не только приостанавливает деградацию такого оли-

32Р, %

А

Б

5 340 Время, мин 12 12

100

50

гомера фосфодиэстеразой на уровне первой ненуклеотидной вставки со стороны З'-конца, но и замедляет сам процесс отщепления нуклеотидов с 3'-конца МО.

3.2. Субстратные свойства комплексов, содержащих «мостиковые» олигонуклеотиды, в реакциях, катализируемых Т4 ДНК-лигазой

Влияние ненуклеотидной вставки, введенной в олигонуклеотид, на эффективность лигирования МО в тандемном дуплексе с помощью Т4 ДНК-лигазы исследовали на модельных комплексах А и Б (Схема 2). В комплексе А 5'-[32Р]-меченый октануклеотид (32pN8) служил фосфат-содержащим компонентом лигируемого тандема, а контрольный N12 или «мостиковые» Nv(Z,)Nw додекануклеотиды - ОН-компонентом тандема. В комплексе Б 32pN8 выступал в роли ОН-компонента, а додекануклеотиды (pN12 или pNv(L)Nw) являлись фосфат-содержащими компонентами (Схема 2).

комплекс А

комплекс Б

Схема 2

GTCGAGGTCCGTCGTAGTTC Ml

32pGCATCAAG МрН8 CAGCTCCAGGCA N12 CAGCTCCAGGCA N2 (L)N10 "L CAGCTCCAGGCA N3 ( И H9 CAGCTCCAGGCA N4 ( L) N8 CAGCTCCAGGCA N5 (I) N7 CAGCTCCAGGCA N6(1) N6 CAGCTCCAGGCA 1,7 N5 CAGCTCCAGGCA »8(I)N4 CAGCTCCAGGCA 1,9'111,3 CAGCTCCAGGCA N10(i,N2

_ 3'

M2 CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT 32pH8 32pGCATCAAG

pN12 pCAGCTCCAGGCA

Nv(L)N* pNv (L) Nw Г" pH2(X)H10 pCAGCTCCAGGCA

S *

pK3 (L)N9 pCAGCTCCAGGCA *

pN4(L)K8 pCAGCTCCAGGCA *

pN5(L)N7 pCAGCTCCAGGCA pN6(X)H6 pCAGCTCCAGGCA

pN7(£)N5 pCAGCTCCAGGCA *

pN8(£)H4 pCAGCTCCAGGCA *

pN9(L)N3 pCAGCTCCAGGCA *

_ pNIO(i)N2 pCAGCTCCAGGCA

* - положение ненуклеотидной вставки L - DEG

Реакцию лигирования тандемных комплексов А и Б проводили при 37°С в присутствии Т4 ДНК-лигазы. Образование продуктов ферментативного лигирования тандемных комплексов А и Б регистрировали гель-электрофорезом в денатурирующем 20% ПААГ по появлению полосы с более низкой электрофоретической подвижностью. По мере приближения ненуклеотидной вставки к одноцепочечному разрыву как в комплексе А, так и в комплексе Б, эффективность лигирования уменьшается в 2 5 раз.

В комплексе А уменьшение степени образования продукта лигирования наблюдается, когда ненуклеотидная вставка отделяет от З'-ОН конца доде-кануклеотида пять и меньше нуклеотидных звеньев. При этом наблюдается накопление промежуточного продукта, который может соответствовать 5'-аденилированной форме (Ар32р№8) исходного фосфатсодержащего компонента 32рШ.

В комплексе Б подобное действие вставки на образование полноразмерного продукта лигирования начинает проявляться несколько раньше, когда ненуклеотидная вставка отделяет семь и меньше нуклеотидных звеньев от 5'-конца фосфат-содержащего додекануклеотидного компонента тандема.

вЯ^^вЛИЯШЙР20-мер

N

ApMpN8 MpN8

о и

г? s* 25 fc is !0 s idzzzzzzzzz^4 Z Z г z z z z z

taj О О taj bj bj faj hj fS

^SSSSS&SSSZZZZZZZZZZ zzzzzzzzzz 0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.

Рис. 7. Радиоавтограф электрофореграммы продуктов лигирования в комплексах А и Б после разделения их в 20% денатурирующем ПААГ. 3ipN8, Ap32pN8 и 32pN20- указывают положения исходного меченого октануклеотида и продуктов его лигирования. Условия лигирования: буфер 20 тМ трис-HCI (рН 7.5), 100 тМ NaCl, 10 тМ MgCl2, 10 тМ DTT, 1 тМ АТР, [матрица] = МО'5 М, [додскамер] = 1-10"5 М, [32pN8] = 5*10"6 М, в присутствии 40 е.а. Т4 ДНК-лигазы, 37°С, 30 мин.

При замене DEG-вставки в N6(Z.)N6 на какую-либо другую из исследуемых (TF, PD, TEG, DD или HEG) существенного изменения эффективности лигирования тандема (N6(i)N6 + 32pN8) на матрице М1 не происходит, т.е. не наблюдается влияние природы вставки, находящейся на расстоянии 6 нуклеотидов от одноцепочечного разрыва, на выход полноразмерного продукта лигирования.

Возможность дискриминации нуклеотидных несоответствий между матрицей М1 и «мостиковым» олигомером N6(L)N6 в присутствии Т4 ДНК-лигазы исследовали на модельном комплексе А (Рис. 8А). Выбор N6(Z,)N6 был обусловлен тем, что эффективность лигирования комплекса (N6(L)N6 + pN8)/Ml незначительно отличается от эффективности лигирования нативного комплекса (N12 + pN8)/Ml.

Однобуквенные замены в матрицах Ml-m находились в сайте связывания З'-ОН-гексамерного фрагмента «мостикового» олигонуклеотида N6(Z,)N6; значение m отражает удаленность нуклеотидного несоответствия от сайта лигирования.

Видно, что наличие однонуклеотидных замен в матрицах М1-1 и М1-2 вблизи сайта лигирования практически полностью ингибирует образование продукта лигирования как при использовании N12, так и N6(L)N6 (Рис. 8Б).

При удалении однонуклеотидной замены в матрице от сайта лигирования эффективность лигирования нативного тандема (N12 + pN8) возрастает и для матрицы М1-6 достигает 74% (Рис. 8Б).

KL-6 _ л

М1-5 -Г"Г~Г

KL-4 ________t___________

m-з ---------1----------

Ml-2 ----------a---------

Ml-1 -----------С--------

Ml 3 GTCGAGGTCCGT CGTAGTTC 5 pGCATCAAG N12 CAGCTCCAGGCA pN8

N6(X)N6 CAGCTCCAGGCA

Ml Ml-1 Ml-2 Ml-3 Ml-4 Ml-5 Ml-6

Рис. 8. Лигирование тандема + 32рШ) или (N12 + ирЯ8) в комплексе с

ДНК-матрицей с помощью Т4 ДНК-лигазы. (А) Модельные тандемные комплексы и (Б) степень лигирования тандема на правильной матрице М1 и матрицах М1-ш. Условия лигирования см. в подписи к рис. 7.

В то же время эффективность лигирования тандема + р№) на

всех матрицах М1-3 М1-6 не превышает 10% даже при использовании в качестве матрицы 20-звенного олигонуклеотида М1-6 с самым удаленным мисматчем (Рис. 7Б). Максимальный фактор дискриминации для олигомера рассчитанный как отношение выходов продуктов лигирования тандема + рШ) в совершенном и несовершенном комплексах,

составляет 23.

3.3. Удлинение «мостикового» олигонуклеотида Тац-полимеразой

Удлинение 5'-[32Р]-меченых олигонуклеотидов р№(£)№0 * рМ0(£)ГО проводили на ДНК матрице М1 (Схема 3) в присутствии всех нуклеозид трифосфатов с помощью Т<щ-полимеразы. Видно (Рис 9), что олиго-нуклеотиды pN2(JL)N10 -5- в

которых вставка находится на расстоянии 6-10 нуклеотидов от 3'-конца удлиняемого олигомера, достраиваются с практически той же эффективностью (70-80%), что и нативный олиго-нуклеотид рМ2 (86%).

В случае олигонуклеотидов - рШ0(1)ГО, в которых вставка располагается на расстоянии 2-5 нуклеотидов от 3'-конца додека-

нуклеотида, выход полноразмерного продукта уменьшается в ~ 2 раза.

Схема 3

5

Ml GTCGAGGTCCGTCGTAGTTC

pN12 pCAGCTCCAGGCA pN2(X)N10 pCAGCTCCAGGCA pN3(X)N9 pCAGCTCCAGGCA pN4(X)N8 pCAGCTCCAGGCA pCAGCTCCAGGCA pCAGCTCCAGGCA pCAGCTCCAGGCA pCAGCTCCAGGCA

pN5 (X) N7 pN6(X)N6 pN7 (X) N5 pN4 (X) N8 pN9(X)N3 pNIO (X) N2

pCAGCTCCAGGCA pCAGCTCCAGGCA

pNv (X) Nw

100 степень удлинения, %

50

шо

I S

jdijeeddtje

- щ w - _ _

li A U % %

» I

Рис. 9. Степень удлинения Тад-полимеразой р1Ч12 и олигомеров на матрице М1. Условия элонгации: 100 шМ трис-НС1 (рН 8.85), 50 шМ М КС1, 1.8 шМ МяС12, 0.1% Tween-20, [М1] = 1-105 М, [додекамер] = 110'6 М, [сЮТР] = 2-10"4 М, 1.5 е.а. Тсщ-полимеразы, 50 °С, 30 мин.

Возможность дискриминации нуклеотидных несоответствий между матрицей и «мостиковым» олигомером в присутствии Гад-полимеразы исследовали, сравнивая эффективности элонгации нативного р!Ч12 и всех «мостиковых» (рШ(£)1Ч10 - р!Ч10(£)ГО) олигонуклеотидов

присутствии правильной матрицы М1 и на матрицах М1-1 ^ М1-6, содержащих однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания додеканукле-отида на расстоянии от одного до шести нуклеотидов от его 3'-конца. Для примера представлены

- У

электрофореграммы реакционных смесей после удлинения нативного р!Ч12 и «мостикового» рШ(Г)Ш олигонуклеотидов (Рис. 10).

Видно, что для р1Ч12 только в случае матрицы М1-1, содержащей несоответствие в 1-ой позиции от начала элонгации, наблюдается некоторое падение эффективности образования «неправильного» продукта элонгации, по сравнению с эффективностью в совершенном комплексе (Рис. 10).

В случае «мостиковых» олигонуклеотидов удлинение происходит только в присутствии правильной матрицы М1, а выход продукта в несовершенном комплексе во всех случаях составлял не более 5%.

5

+

2 я я

о. free £

8

Н N П Ч «1 V

Сайт связывания додекамеров

Рис 10. Радиоавтографы электрофореграмм после разделения в 20% ПААГ продуктов удлинения 7адг-полимеразой нативного N12 и «мостикового» N6(L)N6 олигомеров на правильной матрице Ml и матрицах М1-1 - М1-6, содержащах однонуклеотидные несответ-ствия. Условия см. в подписи к рис. 9.

Из всех «мостиковых» олигомеров особенно следует отметить олигонук-леотид pN6(L)N6 (Рис. 10), для которого высокая степень образования правильного продукта, сравнимая со степенью образования в контрольном комплексе pN12/Ml, сочетается с самым высоким фактором дискриминации, достигающим 60. Фактор дискриминации рассчитывали как отношение эффективностей удлинения олигонуклеотидов в совершенном и несовершенном комплексах.

Таким образом, показано, что комплексы, содержащие «мостиковые» олигонуклеотиды, могут выступать в качестве субстратов в ферментативных реакциях в присутствии Т4 ДНК-лигазы и 7о^-полимеразы. Наличие ненуклеотидной вставки в «мостиковом» олигонуклеотиде в составе несо-■. вершенного комплекса приводит к эффективной дискриминации замен в

матричной цепи, т.е. «мостиковые» олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов для определения последовательности ДНК методом * молекулярной гибридизации с ферментативным включением метки в состав

«мостикового» олигонуклеотида.

4. «Мостиковые» олигонуклеотиды как зонды в молекулярной гибридизации

Одной из проблем гибридизационного анализа является обеспечение селективности связывания набора олигонуклеотидных зондов с НК в одинаковых условиях. Известно, что максимальная дискриминация однобуквен-ных несоответствий между анализируемой матрицей и зондом достигается при температуре плавления их правильного комплекса [Hearst et al., 1987], что означает необходимость использования олигонуклеотидных зондов с близкими гибридизационными свойствами при гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.

Полученные нами данные о гибридизационных свойствах «мостиковых» олигонуклеотидов свидетельствуют о том, что, вводя в состав олигонуклеотидов ненуклеотидные вставки, можно конструировать олигомеры с задан' ными гибридизационными свойствами.

Поэтому были выбраны 15-мерные (Zl, Z2 и Z3) и 16-мерные (Z4, Z5, Z6) нативные олигонуклеотиды (Схема 4), различающиеся нуклеотидным составом (соотношением GC/AT) и обладающие, соответственно, разными гибридизационными свойствами. В качестве модельных матриц использовали соответствующие комплементарные олигонуклеотиды.

Учитывая выявленные в работе закономерности между наличием ненуклеотидной вставки и гибридизационными свойствами МО, на основе всех нативных олигонуклеотидов Zl-s- Z6 были сконструированы «мостиковые» олигомеры Zla, Zlb, Z2a,Z2b, Z3a, Z3b, Z4a, Z5a, Z6a (Схема 4).

GAGAC£aGAGTGATC

zia * --—; " t zib

GAGACCAGAGTGATC GAGACCAGAGTGATC

22

5CAGAGTGATCGAGGC

z2a . —------г— * "ь

CAGAGTGATCGAGGC CAGAGTGATCGAGGC

Z35'

23a * * * *

CGCGGCCAGGTGCCC

CGCGGCCAGGTGCCC

—____Z3b

* ^^ * *

CGCGGCCAGGTGCCC

Схема 4

"m CGCTCAATGCCTGGAG CGCTCAATGCCTGGAG

CACTCTATGCCCGGCC

Z5a

CACTCTATGCCCGGCC

CGCTCAATACCCAGAA

CGCTCAATACCCAGAA

Видно, что введение вставок в состав нативных олигонуклеотидов Ъ\ + Z6 приводит к сближению гибридизационных свойств соответствующих «мостиковых» олигомеров (пунктирная линия на рис. 11).

Рис. 11. Температуры плавления комплексов, образованных натив-ными Zl - Z6 и «мостиковыми» Ъ\л, Х1Ъ, Х2л, ггъ, гзя, гзь,

7Лл, г5а, Ъбя

олигомерами с комплементарными матрицами. Условия плавления: см. в подписи к рис. 1.

GC/AT= 8/9

4.1. Использование «мостиковых» олигонуклеотидных зондов при детекции ДНК-матриц

Выбранные нативные и полученные «мостиковые» олигонуклеотиды были иммобилизованы на мелкодисперсный полимер (ДМЭГ) и использованы в качестве зондов в методе молекулярной гибридизации.

Введение биотиновой метки (Bio) для визуализации гибридизационного комплекса проводили тремя способами:

- сэндвич-гибридизацией с содержащим метку дополнительным олигонук-леотидом (Рис. 12 А);

- ферментативным лигированием с помощью Т4 ДНК-лигазы иммобилизованного зонда с дополнительным олигонуклеотидом, содержащим метку, после образования гибридизационного комплекса с матрицей (Рис. 12Б);

- ферментативным удлинением иммобилизованного зонда после образования гибридизационного комплекса с матрицей с помощью Гад-полимеразы в присутствии ограниченного набора нуклеозид трифосфатов (Рис. 12В).

После образования гибридизационного комплекса и его мечения полимер отмывали от избытка исходного биотинилированного компонента и инкубировали с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза. Далее полимер переносили в лунку (ячейку) микробиологического планшета и «проявляли» с помощью хромогенных субстратов (ВС1Р и ЫВТ) взаимодействие которых, инициируемое фосфатазой, приводило к образованию водонераство-римых окрашенных продуктов. На рис. 12 представлены результаты гибридизационного анализа в виде сканированного изображения планшетов, содержащих в ячейках полимер в иммобилизованными зондами, после проведения соответствующих реакций и всех обработок полимера.

А Б

ГПТУГГГГГПП гТПГУГУУГГГГ»

лхиии ^Л-^^ВЮ) 1

Нативные зонды ТА

«Мостиковые» зонды

74 а 75 а 76 а

74 а 7.5а иья

I мгб

В

1^ГПГУГГГГП

74 75 76

Щг. Ж V;

75а гба

Рис. 12 Использование полимеров с иммобилизованными нативными ТА, Z5, ТЛ> (а, б, в) и «мостиковыми» ТАъ, Т&я, гба (г, д, е) олигонуклеотидами в присутствии матриц М2А, MZ5, МТ6 после проведения сэндвич-гибридизации (А), лигирова-ния с помощью Т4 ДНК лигазы (Б) и удлинения - Гац-полимеразы (В). Условия проведения сэндвич-гибридизации: 100 шМ фосфат натрия (рН 7.2), 1 М ЫаС1, 5 шМ БОТА, [матрица]=110"8 М, \pATTTGGGCGT-Bio] = 5-Ю"6 М, 50°С, 30 мин; лигирования: 20 шМ трис-НС1 (рН 7.5), 1 М КаС1, 10 шМ MgCl2, 10 шМ ЭТТ, 1 тМ АТР, [матрица]=110"5 М, \pATTTGGGCGT-Bio] = 5-Ю"6 М, 40 е.а Т4 ДНК-лигазы, 37°С, 30 мин; удлинения: 10 шМ трис-НС1 (рН 8.8), 50 шМ КС1, 1.8 шМ М М§С12, [матрица]=1105 М, \dUTP-Bio] = 10"5 М, [¿АТР] = 510'5 М, 1.5 е.а. Тад-полимеразы, 52°С, 30 мин.

Последовательности зондов ТА, Т5,16 и 24а, Ъ5а, ЪЬл представлены на схеме 4. ШТА - 'АСССССАААТСТССАСССАТТСАСССССТТ. мг5-'АСССССАААТССССАСССАТАСАСССССТТ.

мгб - ' АСССССАААТТТСТСССТАТТСАСССССТТ.

Видно, что в присутствии правильных матриц интенсивность окрашивания полимеров, содержащих «мостиковые» зонды Z4a гба (Рис. 12г-е), практически не отличается от полимеров с контрольными зондами ТА - Z6 (Рис. 12а-в).

Что касается выявления нуклеотидных несоответствий в составе исследуемых матриц, то контрольные зонды Ъ6 не способны в полной мере выполнить эту задачу при использовании всех трех методов введения метки (Рис. 12Аа, Бб, Вв). Так, правильный сигнал гибридизационного анализа наблюдается только в случае зонда Z6 в комплексе с матрицей МХ6 (Рис. 12Аа, Бб). Для зондов ТА и Х5 интенсивности сигналов гибридизации в совершенных и несовершенных комплексах если различаются, то совсем слабо.

В то же время, для «мостиковых» олигонуклеотидных зондов гибридизация во всех случаях происходит селективно (Рис. 12г-е). Интенсивное окрашивание полимеров с иммобилизованными зондами Т4я, Z5a и Тбя наблюдается только при использовании полностью комплементарных матриц правильных Мг4,1УК5 и МТ6, соответственно.

Таким образом, на модельных системах было показано, что использование набора иммобилизованных «мостиковых» зондов позволяет в одинаковых условиях эффективно дискриминировать матрицы, содержащие нук-леотидные несоответствия, т.е. иммобилизованные на носителе «мостиковые» олигонуклеотиды, могут быть использованы в качестве высокоселективных зондов для гетерофазного гибридизационного анализа ДНК.

4.2. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов в ДНК диагностике

Возможность применения «мостиковых» олигонуклеотидов, иммобилизованных на носителе, в качестве зондов при параллельном гетерофазном гибридизационном анализе была продемонстрирована при использовании в качестве матриц ОТ ПЦР-продуктов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и и

вируса гепатита С (ВГС).

4.2.1. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов для анализа ОТ ПЦР-продукта вируса клещевого энцефалита (ВКЭ)

Для детекции предварительно денатурированного ОТ ПЦР-продукта ВКЭ, длиной 414 п.о. и содержащего на обеих цепях 5'-концевую биотино-вую метку, в качестве олигонуклеотидных зондов использовали обладающие близкими гибридизациионными свойствами «мостиковые» олигонуклеотиды: г1а, г1Ь, г2а, Ъ2Ь, ТЗя и гЗЬ (Схема 4).

Видно, что интенсивность окрашивания полимеров с иммобилизованными «мостиковыми» олигонуклеотидами Ъ\я ТЗЬ (Рис. 13Б, дорожки 1 и

I

[

2) близка и практически не отличается от интенсивности окрашивания контрольных нативных полимеров Zl ^ ЪЪ (Рис. 13Б, дорожка 3), т.е. «мости-ковые» олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов в ДНК-диагностике при проведении гибридизационного анализа с использованием наборов олигонуклеотидов, различающихся ОС/АТ-составом.

Рис. 13. Карта зондов на планшете (А) и сканированное изображение планшета (Б) с полимерами, содержащими иммобилизованные «мостиковые» ТЛ а +• Т2Л> (1 и 2) и нативные Zl 1Л (3) олигонуклеотиды, после проведения гибридизации с денатурированным ОТ ПЦР-продуктом ВКЭ. К+ -положительный контроль. Условия гибридизации см. в подписи к рис. 12.

4.2.2. Использование «мастиковых» олигонуклеотидов для анализа ОТ ПЦР-продукта вируса гепатита С (ВГС)

В качестве анализируемого ДНК-материала был использован ОТ ПЦР-образец 5'-нетранслируемой области генома (5'-иТЯ) вируса гепатита С (ВГС) длиной 230 п.о. Все используемые ПЦР-продукты ВГС были предварительно секвенированы. С целью выбора последовательности зондов предварительно проведен анализ последовательностей 5'- нетранслируемой области геномов различных субтипов вируса гепатита С, опубликованных в международной базе данных [http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/index]. Выявление и генотипирование денатурированного ОТ ПЦР-образца ВГС проводили в присутствии ограниченного набора трифосфатов, используя Тац-полимеразу для включения биотиновой метки в состав иммобилизованных ' олигонуклеотидных зондов. Ненуклеотидная вставка располагалась на рас-

Г стоянии 6 нуклеотидов от З'-конца всех зондов (Схема 5).

Схема 5

субтип генотип I/ субтип субтип нативные 5- 2-1аЪ аасссостсаатссстсоао 2-Ха свссстссссссосаа 2-1Ъ ссссстссссссссса "мостиковые" 5' * 2-1аЪ* аассссстсаатссстссас г-1а* ссосотосссссссаа г-1ь* озесстсссс?ссасса

субтип генотип II - \ субтип 1-Па ассссааттссссвоаасас 2-11ь ассосааттассосааасас * 2-11* ассссааттвсссссаасас Я-ИЬ* ассссааттассвзаалоас

субтип генотип III—- "^ч^ субтип 2-Х11а атасассосаатссстсвсо !-ШЬ стасасссоаатсссбссса 2-Ша* стасассссаатссстсоос 2-111* отасассс<заатс<?с«;®за

А 2_3

К+

гзь 73а 73

ъп 21а ъ\

ггь 7Ля 11

щгфф

Поскольку на территории России для клинической практики достаточно выявить и различить генотипы (I, II и III) и субтипы (la, Ib, IIa, IIb, Illa и Illb), то на основе нативных олигонуклеотидов (Z-Iab - Z-ШЬ) были синтезированы «мостиковые» олигонуклеотиды (Z-Iab* — Z-IIIb*) (Схема 5). Все синтезированные олигомеры были иммобилизованы на носитель. Последовательности данных зондов соответствовали определенным участкам субтипов ВГС. Последовательность олигонуклеотидного зонда const (TGGTCTGCGGAACCGGTGAG) соответствовала высококонсервативному участку 5-UTR генома ВГС всех анализируемых субтипов.

Иммобилизованные «мостиковые» олигонуклеотиды были предварительно проверены на возможность детекции соответствующей синтетической 70-звенной матрицы (данные не представлены). Интенсивность сигнала гибридизационного анализа для всех «мостиковых» зондов в присутствии соответствующих правильных матриц была близка и намного превосходила <,

интенсивность сигнала «мостиковых» зондов в присутствии «неправильных» матриц.

Для отнесения генотипов ВГС II и III к соответствующим субтипам ВГС (IIa, ПЬ и Ша, ШЬ) были выбрали по одному олигонуклеотидному зонду (Z-IIa, Z-ПЬ, Z-IIIa и Z-IIIb), для генотипа ВГС I - три зонда (Z-Iab и Z-Ia, Z-Ib) (Схема 4), поскольку регистрация положительного сигнала зонда Z-Ib свидетельствует о наличии в генетическом материале как субтипа Ib, так и субтипа Ша. Таким образом, предложенный набор для выявления и гено-типирования ВГС содержит восемь олигонуклеотидных зондов, при этом регистрация положительного сигнала при использовании зондов Z-Iab и Z-Ib свидетельствует о наличии в генетическом материале ВГС субтипа Ib, в то время как регистрация сигналов зондов Z-Ib и Z- Illa свидетельствует о наличии в генетическом материале ВГС субтипа Ша.

Апробация предложенной тест-системы была проведена на 70 клинических образцах ВГС. ПЦР-продукты были предварительно секвенированы. На рис. 14 для примера представлены данные анализа ПЦР-продукта, отнесенного по данным секвенирования к субтипу Ib, с помощью нативных зондов (А) и данные анализа ПЦР-продуктов субтипов: Ib, IIa и Illa при использовании «мостиковых» зондов (Б).

Видно, что в случае ^модифицированных нативных зондов, кроме правильных сигналов в лунках с зондами Z-Iab и Z-Ib, наблюдаются ложнопо-ложительные сигналы в ячейках с зондами Z-Ia (одна ошибка А/с в соответствующем гибридизационном комплексе) и Z-IIa (две ошибки G/t в соответствующем гибридизационном комплексе) (Рис. 14А).

В то же время, используя «мостиковые» зонды (Z-Iab*, Z-Ia*, Z-Ib*, Z-IIa*, Z-IIb*, Z-IIIa*, Z-IIIb*), сигнал наблюдается только в случае правильных олигонуклеотидов, последовательность которых полностью комплементарна определенному участку в последовательности анализируемого ПЦР-продукта (Рис. 14Б).

о

ео и

é и

6

х

GGGCGTGCCCCCGCAA ' CCCGCACGGGGGCGcT

_ACCGGAATTGCCGGGAAGAC TGGCCTTAAtGGCCtTTCTG

U

я а о и: S

В

о я

Б

субтипы Ib Ha Illa

L1

Рис. 14. Сканированное изображение планшета с нативными (А) и «мости-ковыми» (Б) зондами после проведения реакции удлинения цепи в присутствии ПЦР-фрагментов, отнесенных по данным секвенировангия к субтипам Ib, На, Illa. Условия удлинения см. в подписи к рис. 12.

Таким образом, видно, что разработанная тест-система, основанная на использовании «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов, позволяет надежно выявить и отнести к соответствующему субтипу генетический материал ВСГ. Данная тест система не требует дорогостоящих реактивов и оборудования, необходимых для прямого секвенирования ДНК. Для проведения генотипирования ВГС в качестве анализируемого материала можно использовать один стандартный ОТ-ПЦР образец фрагмента 5'-иТЯ ВГС, получаемый с помощью ПЦР, а также с помощью тест-систем для выявления ВГС, таких как АмплиСенс НСУ.

ВЫВОДЫ

I. Впервые проведено исследование гибридизационных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов 5'1Чу(£)^\у3 , в которых короткие нативные оли-гонуклеотидные фрагменты (IV) с различным числом звеньев (V и №) связаны разным количеством (¡) фосфатсодержащих ненуклеотидных вставок (¿) на основе олигоэтиленгликолей (ди-, тетра- и гекса-), олигометилендиолов (пента- и дека) и аналога тетрагидрофурана. Установлено, что:

• значение свободной энергии комплексообразования «мостиковых» олигонуклеотидов с ДНК-матрицей уменьшается на 1.6 -г- 11.1 ккал/моль в зависимости от природы и длины вставки, ее положения в олигонук-леотидной цепи, количества вставок;

• изменяя параметры ¡, V и IV, можно создавать наборы «мостиковых» олигонуклеотидов с заранее заданными гибридизационными свойствами независимо от нуклеотидной последовательности.

II. Продемонстрировано, что степень и направленность модификации ДНК-мишени алкилирующими (ЯСГ) производными «мостиковых» олиго-

нуклеотидов 5 ÄC/-N4(i)N83 (L= гексаметилендиол) в условиях эффективного комплексообразования не отличаются от таковых при использовании ^модифицированного олигонуклеотидного реагента RCI- N12.

III. Исследована способность «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК-матрицей участвовать в реакциях, катализируемых ферментами. Показано, что:

• «мостиковые» олигонуклеотиды более устойчивы по сравнению с нативными олигонуклеотидами к гидролизу 3' -экзонуклеазой, на примере фосфодиэстеразы змеиного яда. Гидролиз фосфодиэфирной связи перед ненуклеотидной вставкой замедляется в три раза, по сравнению с гидролизом связей в нативном олигонуклеотиде;

• наличие ненуклеотидной вставки в «мостиковом» олигомере в составе совершенного комплекса на расстоянии 7 и менее нуклеотидов от позиции комплекса, подвергающейся ферментативному превращению Т4 ДНК-лигазой или Год-полимеразой, приводит к уменьшению выхода продукта ферментативной реакции в 2-5 раз;

• наличие ненуклеотидной вставки в «мостиковом» олигомере в составе несовершенного комплекса либо значительно уменьшает выход продукта реакции, либо полностью блокирует ферментативные реакции, катализируемые Т4 ДНК-лигазой или Га^-полимеразой;

• максимальный фактор дискриминации (отношение выхода продуктов реакции в совершенном и несовершенном комплексах), рассчитанный для олигонуклеотида 5 pN6(£)N6-OH в реакциях, катализируемых Год-полимеразой или Т4 ДНК-лигазой, составляет 60 и 23, соответственно.

IV. Иммобилизованные на носителе «мостиковые» олигонуклеотиды впервые предложены в качестве олигонуклеотидных зондов для проведения гетерофазного параллельного анализа ДНК методом молекулярной гибридизации, в том числе с использованием ферментативного мечения гибриди-зационного комплекса с помощью Т4 ДНК-лигазы и Год-полимеразы. Показано, что:

• использование в качестве зондов «мостиковых» олигонуклеотидов с близкими гибридизационными свойствами обеспечивает равные сигналы при параллельном гибридизационном анализе ДНК;

• применение зондов на основе «мостиковых» олигонуклеотидов приводит к эффективной дискриминации однонуклеотидных несоответствий в составе анализируемых матриц и обеспечивает высокую достоверность выявляемого правильного сигнала гибридизации.

V. Создана тест-система для генотипирования вируса гепатита С, основанная на использовании в качестве зондов набора иммобилизованных «мостиковых» олигонуклеотидов с заданными гибридизационными свойствами и на применении ферментативного мечения гибридизационного комплекса с помощью Гад-полимеразы.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Pvshnava I.A.. Pyshnyi D.V., Ivanova Е.М., Zarytova V.F., Bonora G.M., Scalfi Happ C., Seliger H.. Oligonucleotide conjugates with non-nucleotidic spacers designed for discriminative hybridization at physiological temperature // Nucleoside Nucleotide. 1998. V. 17. P. 1289-1297.

2. Vorobjev P.E., Pvshnava I.A.. Pyshnyi D.V., Venyaminova A.G., Ivanova E.M., Zarytova V.F., Bonora G.M., Scalfi-Happ C., Seliger H. Nuclease resistance and RNase H sensitivity of oligonucleotides bridged by oligomethylenediol and oligoethylene glycol linkers // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001. V. 11. P. 77-85.

3. Pvshnava I.A.. Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 1065-1071.

4. Пышный Д.В., Иванова E.M., Пышная И.А.. Зарытова В.Ф. Способ выявления анализируемой последовательности ДНК // Патент на изобретение №2259402 от 27.08.2005.

5. Пышная И.А.. Виноградова О.А., Кабилов М.Р., Зарытова В.Ф., Пышный Д.В., Иванова Е.М. Модифицированные олигонуклеотиды как инструменты для футпринтинга сайтов связывания ДНК-зависимых ферментов // Труды 1-го Международного форума "Актуальные проблемы современной науки". Ч. 29: Биология. Из-во СГТУ. 2005. С. 19-21.

6. Виноградова О.А., Пышная И.А.. Дмитриенко Е.В., Хомякова Е.А., Зарытова В.Ф., Пышный Д.В., Иванова Е.М. Модифицированные олигонуклеотиды как зонды с повышенной селективностью удлинения на матрице ДНК с помощью Taq-полимеразы // Труды 1-го Международного форума "Актуальные проблемы современной науки". Ч. 29: Биология. Из-во СГТУ. 2005. С. 78-80.

Подписано к печати 21.12.2005 Формат бумаги 60x84,1/20 пен. л

Тираж 100 экз

¿<?csA -685

ф Список сокращений.

1. Введение.

2. Теоретические и практические аспекты метода молекулярной гибридизации (обзор литературы).

2.1 Типы гибридизационного анализа.

2.1.1. Гомофазная гибридизация в растворе.

2.1.2. Гетерофазная гибридизация.

2.1.2.1. Гибридизация на частицах и иммунологических планшетах.

2.1.2.1.1. Гибридизация на мелкодисперсных частицах.

Ф 2.1.2.1.2. Гибридизация на наночастицах.

2.1.2.1.3. Гибридизация на иммунологических планшетах.

2.1.2.2. Гибридизация в слое геля.

2.1.2.3. Гибридизация на плоских поверхностях.

2.2. Эффективность и кинетика гибридизации (теоретические аспекты).

2.2.1. Гибридизация в растворе.

2.2.2. Гетерофазная гибридизация. ф 2.2.2.1. Носитель - микрочастица.

2.2.2.2. Носитель - слой геля. щ 2.2.2.3. Носитель - плоская поверхность.

2-3. Структура пробы и зонда как фактор, влияющий на эффективность процесса гибри-^ дизации.

2.3.1. Структура пробы в гетерофазной гибридизации.;.

2.3.2. Дизайн и структура зонда в гетерофазной гибридизации.

2.3.2.1. Зонды, содержащие модифицированные основания.

2.3.2.2. Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов.

2.3.2.3. Зонды, содержащие вставки в рибозофосфатном остове.

2.4. Проблемы селективности параллельной гибридизации с набором олигонуклеотидных а зондов.

2.4.1. Буфер.

2.4.2. Модифицированные основания.

2.4.3. Фермент-зависимые реакции, используемые в гибридизационном анализе.

Использование олигонуклеотидных конструкций в качестве инструментов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты (НК), например, в антисенс технологии или в медицинской ДНК-диагностике, основано на способности олигонуклеотидов образовывать прочные комплексы с комплементарными им участками НК. Основные требования к олигонуклеотидным конструкциям состоят в обеспечении высокой эффективности, сайт-специфичности и селективности их связывания с комплементарными им участками НК.

Сайт-специфичность, как и эффективность связывания олигонуклеотида с комплементарной НК, определяется его длиной и нуклеотидной последовательностью и зависит от комплексообразующей способности этого олигонуклеотида, т.е. от стабильности формируемых им комплексов. Селективность олигонуклеотидных конструкций отражает их способность различать на уровне связывания ДНК-мишени, содержащие несоответствия в последовательности. Так, высокоэффективное связывание протяженного антисмыслового олигонуклеотида может оказаться неселективным, поскольку наряду с образованием прочного совершенного комплекса при физиологических условиях не исключена возможность формирования частично комплементарных комплексов с мишенями, содержащими нуклеотидные несоответствия в последовательности [1]. Наиболее остро проблема обеспечения селективности комплексообразования встает для GC-богатых олигонуклеотидных конструкций, когда стабильность GC-богатых комплексов, содержащих мисматчи, оказывается близка или даже выше стабильности совершенных АТ-богатых комплексов сопоставимой длины. Зависимость стабильности НК-комплексов от нуклео-тидного состава делает проблематичным использование при гибридизационном анализе НК наборов олигонуклеотидов равных по длине. В этом случае, при одинаковых условиях гибридизации, задаваемых форматом параллельного анализа, возможно появление ложноположительных или ложноотрицательных сигналов [2]. Таким образом, создание олигонуклеотидных конструкций, способных высокоселективно связываться с НК, является важной и пока не решенной задачей как при разработке ген-направленных соединений, так и олигонуклеотидных зондов.

В настоящее время существуют несколько подходов к повышению селективности комплексообразования олигонуклеотидов: введение в состав буфера тетраалкиламмо-ниевых солей [3], которые способны частично нивелировать различия в связывании олигонуклеотидов разного нуклеотидного состава; замена протяженных олигомеров тандемами на основе коротких олигонуклеотидов [4]; применение модифицированных олиго-нуклеотидов с измененными гибридизационными свойствами [5]. В качестве последних широко представлены олигонуклеотидные аналоги с замещенным рибозофосфатным остовом, например, на основе пептидил- (PNA) [6] или замкнутых (locked) (LNA) [7] нуклеиновых кислот, обладающие повышенными гибридизационными свойствами. Однако использование таких олигонуклеотидов ограничивается отсутствием строгого алгоритма для предварительного расчета стабильности образуемых ими комплексов как совершенных, так и содержащих мисматчи. Кроме того, комплексы таких олигонуклеотидов с НК-мишенями не всегда могут выступать в качестве субстратов ферментов, часто используемых в различных молекулярно-биологических исследования.

Олигонуклеотиды, состоящие из нативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотидными вставками, и имеющие непрерывный сайт связывания с НК («мости-ковые» олигонуклеотиды), могут быть компромиссным вариантом между протяженными и модифицированными олигонуклеотидами. Гибридизационные свойства таких «мости-ковых» олигонуклеотидов могут поддаваться расчету, т.к. вставки не затрагивают способности оснований образовывать комплементарные пары, не нарушают геометрию спирали комплексов НК, а лишь локально возмущают структуру рибозофосфатного остова. Кроме того, «выпетленная» из двуцепочечной спирали ненуклеотидная вставка не должна существенно влиять на способность модифицированных комплексов выступать в качестве субстратов в ферментативных реакциях. Описаны олигонуклеотиды с различными ненуклеотидными вставками (циклические [8] и шпилечные [9]); известны дуплексы [10], триплексы [11] и более сложные комплексы, олигонуклеотидные компоненты которых соединены вставками. Вставки являются инструментом, с помощью которого би- или трикомпонентные процессы сводятся к монокомпонентным, упрощая исследования нук-леиново-нуклеиновых взаимодействий [10, 11].

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности использования «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве инструментов для ДНК-диагностики, основанной на методе молекулярной гибридизации (в качестве олиго-нуклеотидных зондов), и для направленного воздействия на НК мишень (в качестве адресной части алкилирующих производных).

В ходе исследования впервые решались следующие задачи:

- систематическое изучение гибридизационных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов, содержащих в сахарофосфатном остове различные ненуклеотидные вставки на основе олигометилендиолов и олигоэтиленгликолей;

- исследование направленного воздействия на ДНК-мишень алкилирующими производными «мостиковых» олигонуклеотидов;

- изучение способности «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК участвовать в реакциях катализируемых ферментами, таким как, фосфодиэстераза змеиного яда и 7ж/-полимераза, Т4 ДНК-лигаза;

- исследование возможности использования иммобилизованных «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов для ДНК-диагностики.

5. ВЫВОДЫ

I. Впервые проведено исследование гибридизационных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов 5 Nv(X)jNw3, в которых короткие нативные олигонуклеотидные фрагменты (N) с различным числом звеньев (v и w) связаны разным числом (i) фосфатсодержащих не-нуклеотидных вставок (L) на основе олигоэтиленгликолей (ди-, тетра- и гекса-), олигоме-тилендиолов (пента- и дека) и аналога тетрагидрофурана. Установлено, что:

• значение свободной энергии комплексообразования «мостиковых» олигонуклеотидов с ДНК-матрицей уменьшается на 1.6 + 11.1 ккал/моль в зависимости от природы и длины ненуклеотидной вставки, ее положения в олигонуклеотидной цепи, количества вставок;

• изменяя параметры i, v и w, можно создавать наборы «мостиковых» олигонуклеотидов с заранее заданными гибридизационными свойствами независимо от нуклео-тидной последовательности.

II. Продемонстрировано, что степень и направленность модификации ДНК-мишени ал-килирующими {RCI) производными «мостиковых» олигонуклеотидов 5 7?C/-N4(X)N83 (L= гексаметилендиол) в условиях эффективного комплексообразования не отличаются от таковых при использовании немодифицированного олигонуклеотидного реагента RCI-N12.

III. Исследована способность «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК-матрицей участвовать в реакциях, катализируемых ферментами. Показано, что:

• «мостиковые» олигонуклеотиды более устойчивы по сравнению с нативными олигонуклеотидами к гидролизу З'-экзонуклеазой, на примере фосфодиэстеразы змеиного яда. Гидролиз фосфодиэфирной связи перед ненуклеотидной вставкой замедляется в три раза, по сравнению с гидролизом связей в нативном олигонуклеотиде;

• наличие ненуклеотидной вставки в «мостиковом» олигомере в составе совершенного комплекса на расстоянии 7 и менее нуклеотидов от позиции комплекса, подвергающейся ферментативному превращению в присутствии Т4 ДНК-лигазы или Taq-полимеразы, приводит к уменьшению выхода продукта ферментативной реакции в 2-5 раз;

• наличие ненуклеотидной вставки в «мостиковом» олигомере в составе несовершенного комплекса либо значительно уменьшает выход продукта реакции, либо полностью блокирует ферментативные реакции, катализируемые Т4 ДНК-лигазой или Тад-полимеразой;

• максимальный фактор дискриминации (отношение выходов продуктов реакции в совершенном и несовершенном комплексах), рассчитанный для олигонуклеотида

5 pN6(£)N6 в реакциях, катализируемых Тя^-полимера-зой или Т4 ДНК-лигазой, составляет 60 и 23, соответственно.

IV. Иммобилизованные на носителе «мостиковые» олигонуклеотиды впервые предложены в качестве олигонуклеотидных зондов для проведения гетерофазного параллельного анализа ДНК методом молекулярной гибридизации, в том числе с использованием ферментативного мечения гибридизационного комплекса с помощью Т4 ДНК-лигазы и Taq-полимеразы. Показано, что:

• использование в качестве зондов «мостиковых» олигонуклеотидов с близкими гибридизационными свойствами обеспечивает равные сигналы при параллельном гибридизационном анализе ДНК;

• применение зондов на основе «мостиковых» олигонуклеотидов приводит к эффективной дискриминации однонуклеотидных несоответствий в составе анализируемых матриц и обеспечивает высокую достоверность выявляемого правильного сигнала гибридизации.

V. Создана тест-система для генотипирования вируса гепатита С, основанная на использовании в качестве зондов набора иммобилизованных «мостиковых» олигонуклеотидов с заданными гибридизационными свойствами с применением ферментативного мечения гибридизационного комплекса с помощью Га^-полимеразы.

3.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, представленные в данной работе, позволяют заключить, что на основе исследованных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов стало возможным конструирование олигонуклеотидов с заданными гибридизационными свойствами.

Изученная способность комплексов, образованных с участием «мостиковых» олигонуклеотидов, в реакциях, катализирумых Т4 ДНК-лигазой и Гад-полимеразой, наряду с исследованными гибридизациоными свойствами «мостиковых» олигонуклеотидов, позволила предложить подход для анализа ДНК; практическая значимость которого получила подтверждение в патенте на изобретение, а также позволила разработать тест-систему для генотипирования вируса гепатита С, основанную на введении биотиновой метки с помощью Год-полимеразы в состав гибридизационного комплекса при использовании в качестве зондов набора иммобилизованных «мостиковых» олигонуклеотидов.

Экспериментальная часть 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Исходные материалы

4.1.1. Реактивы и препараты

В работе были использованы следующие реактивы и растворители: фосфорами-дитные мономерные синтоны (Glen Reseach, США); диэтиленгликоль, тетраэтиленгли-коль, гексаэтиленгликоль, дитиотрейтол, трифенилфосфин, 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран, 2,2'-дипиридилдисульфид, 4-N,Nдиметиламинопиридин, DMSO, DMFA, цетавлон, Triton х-100 (Fluka, Швейцария); диме-токситретил (ChemGenes, Англия); Stains'all (Aldrich, США); 1,5-пентандиол, 1,6-гександиол, 1,10-декандиол, мочевина (Merck, Германия); акриламид, яичный альбумин, (ДиаМ, Москва); И^'-метиленбисакриламид (Acros, США); трис-ОН, Tween-20, конъю-гат стрептавидин щелочная фосфатаза, ксиленцианол, бромфеноловый синий, фосфодиэ-стераза змеиного яда (Crotalus atrox) (Sigma, США); гексаметилендиаминтриэтиламин, полинуклеотидкиназа бактериофага Т4, 7ж/-полимераза, dNTP, dUTP-Bio (ИХБФМ СО РАН), мелкодисперсный полимер ДМЭГ-7 (ИОЧП, Санкт-Петербург); хромогенные субстраты BSIP и NBT (Molekular Probes, США); 1Ч,1Ч-диизопропиламмоний тетразолида, 2-цианоэтил-бис(]Ч,Н-диизопропиламинофосфит) и 4(ТЧ-2-хлорэтил-М-метиламино)~ бензилметиламин синтезированы Т.М. Ивановой (ИХБФМ СО РАН); реактивы и растворители квалификации х.ч. и о.с.ч. отечественного производства.

Все использованные органические растворители предварительно были перегнаны над Р2О5 и хранились над молекулярными ситами или гидридом кальция.

4.1.2. ОТ ПЦР-продукт вируса клещевого энцефалита, содержащий на обеих цепях 5'-концевые остатки биотина, был любезно предоставлен Морозовой О.В. (Лаборатория инфекционных заболеваний человека ИХБФМ СО РАН). ОТ ПЦР-продукты ВГС любезно предоставлены Филлипенко М.А. (Группа фармакогенетики ИХБФМ СО РАН), Пичко Н.П. (Лаборатория генной диагностики ИХБФМ СО РАН) и Караваевой Ю. В. (Муниципальная инфекционная клиническая больница № 1 г. Новосибирск).

Стандартная ПЦР-смесь, которую использовали при проведении гибридизационного анализа на твердой фазе, содержала: конечный ПЦР-продукт, и остаточные количества исходных праймеров, 7д#-полимеразы, dNTP, кДНК.

4.1.3. Буферы и растворы

1. Monia, В.P., Johnston, J.F., Eckers, D.J., Zounesn, М.А., Lima, W.F., Freier, S.M. Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense // J. Biological Chemistry. 1992. V. 267. P. 19954-19962.

2. Marcotte, E.R., Srivastava, L.K., Quirion, R. DNA microarrays in neuropsychopharma-cology // Trends Pharmacol. Sci. 2001. V. 22. P. 426-436.

3. Nguyen, Н.-К., Fournier, О., Asseline, U., Dupret, D., Thuong, N.T. Smoothing of the thermal stability of DNA duplex by using modified nucleosides and chaotropic agents // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1492-1498.

4. Nielsen, P.E. Applications of peptide nucleic acids // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. V. 10. P. 71-75.

5. Jacobsen, N., Fenger, M., Bentzen, J. Rasmussen, S.L., Jakobsen, M.H., Fensthol, J.t, Skouv, J. Genotyping of the apolipoprotein В R3500Q mutation using immobilized locked nucleic acid capture probes // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 657-660.

6. Gao, K, Chidambaram, N., Chen, B.C., Pelham, D.E., Patel, R., Yang, M., Zhou, L., Cook, A., Cohen, J.S. Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide bridges //Biocojugate Chem. 1994. V. 5. P. 445-453.

7. Rumney, S. IV, Kool, E. T. Syructural Optimization of non-nucleotide replacements for duplex and triplex DNAs // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 5635-5646.

8. Vo, Т., Wang, S., Kool, E.T. Targeting pyrimidine single strands by triplex formation: structural optimization of binding //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2937-2944.

9. Drmanac, R., Labat, I., Brukner, I., Crkvenjakov, R. Sequencing of megabase plus DNA by hybridization: theory of the method // Genomics. 1989. V. 4. P. 114-128.

10. Khrapko, K.R., Lysov, Yu.P., Khorlyn, A.A., Shick, V.V., Florentiev, V.L., Mirzabekov, A.D. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Lett. 1989. V. 256. P. 118-22.

11. Southern, Е.М. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

12. Горбунова, B.H., Баранов, B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотера-пию наследственных заболеваний // Санкт-Петербург. Специальная литература. 1997.

13. Стент, Г., Кэлиндар, Р. Молекулярная генетика // М. Мир, ред. Алиханян С.И. 1981.

14. Whitcombe. D., Newton. C.R., Little. S. Advances in approaches to DNA-based diagnostics // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 602-608.

15. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R„ Horn, G.T., Mullis, KB., Erlich, H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. V. 239. P. 487-491.

16. Williams, A.P., Longfellow, C.E., Freier, S.M., Kierzek, R., Turner, D.H. Laser temperature-jump, spectroscopic, and thermodynamic study of salt effects on duplex formation by dGCATGC // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4283-4291.

17. Бадашкеева, А.Г., Кнорре, Д.Г.Олшо- и полинуклеотидные зоды. Метод молекулярной гибридизации // Молекулярн. биол. 1991. Т. 25. Р. 309-324.

18. Котова, Е.Ю., Крейдлин, Э.Я., Барский, В.Е., Мирзабеков, А.Д. Взаимное влияние олигонуклеотидов и флуоресцентной метки на эффективность гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологических чипах // Молекулярн. биол. Т. 34. С. 237-245.

19. Horn, Т., Chang, С.-A., TJrdea, M.S. An improved divergent synthesis of combtype branched oligodeoxyribonucleotide (bDNA) containing multiple secondary sequences // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4835-4841.

20. Daniel, M.-C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantumsize-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology // Chem. Rev. 2004. V. 104. P. 293-346.

21. Schultz, S., Smith, D.R., Mock, J.J., Schultz, D.A. Single-target molecule detection with nonbleaching multicolor optical immunolabels // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. V. 97. P. 996-1001.

22. Langer, P.R. Waldrop, A.A., Ward, D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probs // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981. V. 78. P.6633-6637.

23. Биосенсоры: основы и приложения. //М. Мир, ред. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. 1992.

24. SantaLucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 1460-1465.

25. Gamper, H.B., Gimino, G.D., Isaacs, S.T., Ferguson, M., Haerst, I.E. Reverse southern hybridization //Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 9943-9954.

26. Cardullo, R.A., Agrawal, S., Flores, C., Zamecnik, P.C., Wolf, D.E. Detection of nucleic acid hyridizaion by nonradiactive fluorescence resonanse energe transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988. V. 85. P. 8790-8794.

27. Tyagi, S., Marra, S.A.E., Kramer, F.R. Wavelength-shifting molecular beacon// Nat. Biotechnol. 2000. V. 18 P. 1191-1197.

28. Marras, S.A.E., Kramer, F.R., Tyagi, S. Genotyping with molecular mo-lecular beacons // In Kwok P.Y. (ed) Single nucleotide polymorphisms: methods and protocols. The Humana Press Inc., Totowa, NJ, V. 212. P. 111-128.

29. Johansson, M.K., Fidder, H, Dick, D., Cook, R.M. Intramolecular dimers: a new strategy to fluorescence quenching in duallabeled oligonucleotide probes // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 6950-6956.

30. Nelson, N.C., Hammond, P.W., Matsuda, E., Goud, A.A., Becker, M.M. Detection of all single-base mismatches in solution by chemiluminescence // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4998-5003.

31. Elghanian, R., Storhoff, J.J., Mucic, R.C., Letsinger, R.L., Mirkin, C.A. Selective colori-metric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles // Science. 1997. V. 277. P. 1078-1081.

32. Storhoff, J.J., Elghanian, R„ Mucic, R.C., Mirkin, C.A., Letsinger, R.L. One-pot colori-metric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 1959-1964.

33. Stevens, P.W., Henry, M.R., Kelso, D.M. DNA hybridization on microparticles: determining capture-probe density and equilibrium dissiciation constants // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1719-1727.

34. Hakala, H, Lonnberg, H. Time-resolved Fluorescence detection of oli-gonucleotie hybridization on a single microparticle: covalent immobilization of oligonucleotides and quantitation of a model system // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 232-237.

35. Penchovsky, R., Birch-Hirschfeld, E., McCaskill, J.S. End-specific covalent photode-pendent immobilisation of synthetic DNA to paramagnetic beads // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. e98.

36. Zammatteo, N., Alexandre, I., Ernest, I, Le, L., Brancart, F.,Remacle, J. Comparison between microwell and bead supports for the detection of human cytomegalovirus ampli-cons by sandwich hybridization // Anal. Biochem. 1997. V. 253. P. 180-189.

37. Henry, M.R., Stevens, P.W., Sun, J., Kelso, DM. Real-time measurements of DNA hy-brydyzation on microparticles with fluorescence resonance energy transfer // Anal. Biochem. 1999. V. 276. P. 204-214.

38. Samiotaki, M., Kwiatkowski, M., Ylitalo, N., Landegren, U. Seven-color time-resolved fluorescence hybridization analysis of human papilloma virus types // Anal. Biochem. 1997. V. 253. P. 156-161.

39. Ivanov, I.G., AbouHaidar, M.G. Thermal stability of oligonucleotide duplexes bound to nitrocellulose filters // Anal. Biochem. 1995. V. 232. P. 249-251.

40. Gingeras, T.R., Kwon, D. Y., Davis, G.R. Hybridization properties of immobilized nucleic acids //Nucleic Acid Res. 1987. V. 15. P. 5373-5390.

41. Weiler, J., Gausepohl, H., Hauser, N., Jensen, O.N., Hoheisel, J.D. Hybridisation based DNA screening on peptide nucleic acid (PNA) oligomer arrays // Nucleic Acid Res. 1997. V. 25. P. 2792-2799.

42. Beier, M., Hoheisel, J.D. Versatile derivatisation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1970-1977.

43. Weiler, J., Hoheisel, J.D. Combining the preparation of oligonucleotide arrays and synthesis of highquality primers // Anal. Biochem. 1996. V. 243. P. 218-227.

44. Shchepinov, M.S., Case-Green, S.C., Fell, T.S., Southern, E.M. Hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays //Nucleic Acids Symp. Ser. 1996. P. 27-28.

45. Shchepinov, M.S., Case-Green, S.C., Southern, E. M. Steric factors influencing hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 1155-1161.

46. Case-Green, S.C., Mir, K.U., Pritchard, C.E., Southern, E.M. Analysing genetic information with DNA arrays // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 2. P. 404-410.

47. Case-Green, S.C., Southern, E. M. Studies on the base pairing properties of deoxyi-nosine by solid phase hybridisation to oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 131-136.

48. Southern, E.M., Case-Green, S.C., Elder, J.K., Johnson, M., Mir, K.U., Wang, L., Williams, J.C. Array of complementary oligonucleotides for analysing the hybridization behaiour of nucleic acids //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1368-1373.

49. Maskos, U., Southern, E.M. A study of oligonucleotide reassociation using large arrays of oligonucleotides synthesised on a glass support // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 4663-4669.

50. Kane, M.D., Jatkoe, T.A., Stumpf, C.R., Lu, J., Thomas, J.D., Madore, S.J. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50-mer) microarrays // Nucleic Acids Rec. 2000. V. 28. P. 4552-4557.

51. Umek, R.M., Lin, S.W., Vielmetter, J., Terbrueggen, R.H., Irvine, В., Yu, C.J., Kayyem, J.F., Yowanto, H, Blackburn, G.F., Farkas, D.H., Chen, Y.-P. Electronic detection of nucleic acids //J. Mol. Diagn. 2001. V. 3. P. 74-84.

52. Der, S.D., Zhou, A., Williams, B.R.G., Silverman, R.H. Identification of genes differentially regulated by interferon a, b, or g using oligonucleotide arrays // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 15623-15628.

53. Williams, J.C., Case-Green, S.C., Mir, K.U., Southern, E.M. Studies of oligonucleotide interactions by hybridisation to arrays: the influence of dangling ends on duplex yield // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1365-1367.

54. Mir, K. U., Southern, E.M. Determining the influence of structure on hybridization using oligonucleotide array //Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 788-792.

55. Sabanayagam, C.R., Smith, C.L., Cantor, C.R. Oligonucleotide immobilization on mi-cropatterned streptavidin surfaces //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. e33.

56. Guo, Z., Guifoyle, R.A., Thiel, A.J., Wang, R., Smith, L.M. Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 5456-5465.

57. McGall, G., Labadie, J., Brock, P., Wallraff, G., Nguyen, Т., Hinsberg, W. Light-directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 13555-13560.

58. Maskos, U., Southern, E.M. A novel method for the analysis of multiple sequence variants by hybridisation to oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 22672268.

59. Heme, T.M., Tarlov, M.J. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 8916-8920.

60. Beier, M., Hoheisel, J.D. Production by quantitative photolithographic synthesis of individually quality checked DNA microarrays // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. el 1.

61. Kelley, S.O., Boon, E.M., Barton, J.K., Jackson, N.M., Hill, M.G. Single-base mismatch detection based on charge transduction through DNA // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4830-4837.

62. Adessi, C., Matton, G., Ayala, G., Turcatti, G., Mermod, J.-J., Mayer, P., Kawashima, E. Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. e87.

63. Zammatteo, N., Jeanmart, L., Hamels, S., Courtois, S., Louette, P., Hevesi, L., Remacle, J. Comparison between different strategies of covalent attachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays // Anal. Biochem. 2000. V. 280. P. 143-150.

64. Gentalen, Е., Chee, М. A novel method for determining linkage between DNA sequences: hybridization to paired probe arrays // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1485-1491.

65. Shoffner, M.A., Cheng, J., Hvichia, G., Kricka, L.L., Wilding, P. Chip PCR. I. Surface passivation of microfabricated silicon-glass chips for PCR // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 375-379.

66. Maskos, U., Southern, E.M. Parallel analysis of oligodeoxyribonucleotide (oligonucleotide) interaction. I. Analysis of factors influencing oligonucleotide duplex formation // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 1675-1678.

67. Southern, E.M., Maskos, U., Elder J.K. Analysing and comparing nucleic acid sequences by hybridisation to arrays of oligonucleotides: evaluation using experimental models // Genomics. 1992. V. 13. P. 1008-1017.

68. Maskos, U., Southern, E.M. Oligonucleotide hybridisations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridisation properties of oligonucleotide syn-thesised in situ//Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 1679-1684.

69. Maldonado-Rodriguez, R., Espinosa-Lara, M., Loyola-Abitia, R., Beattie, W.G., Beattie, K.L. Mutation detection by stacking hybridization on genosensor arrays // Mol. Biotechnol. 1999. V. 11. P. 13-25.

70. Belosludtsev, Y., Iverson, В., Lemeshko, S., Eggers, R., Wiese, R., Lee, S., Powdrill, Т., Hogan M. DNA microarrays based on noncovalent oligonucleotide attachment and hybridization in two dimensions // Anal. Biochem. 2001. V. 292. P. 250-256.

71. Zhao, X., Nampalli, S., Serino, A.J., Kumar, S. Immobilization of oligodeoxyribonucleo-tides with multiple anchors to microchips //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 955-959.

72. Stillman, B.A., Tonkinson, J.L. Expression microarray hybridization kinetics depend on length of the immobilized DNA but are independent of immobilization substrate // Anal. Biochem. 2001. V. 295. P. 149-157.

73. Chan, V., McKenzie, S.E., Surrey, S., Fortina, P., Graves, D.J. Effect of hydrophobicity and electrostatic on adsorbtion and surface diffusion of DNA oligonucleotide at liquid/solid interfaces // J. Colloid. Interface Sci. 1998. V. 203. P. 197-207.

74. Steel, А.В., Levicky, R.L., Heme, T.M., Tarlov M.J. Immobilization of nucleic acids at solid surface: effect of oligonucleotide length on layer assembly // Biophys. J. 2000. V. 79. P. 975-981.

75. Peterson, A.W., Heaton, R.J., Georgiadis, R. Kinetic control of hybridization in surface immobilized DNA monolayer films// J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 7837-7838.

76. Zhong, X., Reynolds, R., Kidd, J.R. Single-nucleotide polymorphism genotyping on optical thin-film biosensor chip // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. V. 100. P. 1155911564.

77. Шишкина, И.Г., Левина, А.С., Зарытова, В.Ф. Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их сорбенты // Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 581-607.

78. Balladur, V., Theretz, A., Mandrand, В. Determination of the main forces driving DNA oligonucleotide adsorption onto aminated silica wafers // J. Colloid. Interface Sci. 1997. V. 194. P.408-418.

79. Fotin, A.V., Drobyshev, A.L., Proudnikov, D.Y., Perov, A.N., Mirzabekov, A.D. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1515-1521.

80. Belotserkovskii, B.P., Johnston, B.H. Polypropylene tube surfaces may induce denatura-tion and multimerization of DNA // Science. 1996. V. 271. P. 222-223.

81. Diehl, F., Grahlmann, S., Beier, M., Hoheisel, J. Manufactoring DNA microarrays of high spot homogeneity and reduced background signal // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. e38.

82. Blohm, D.H., Guiseppi-Elie, A. New developments in microarray technology // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12.P. 41-47.

83. Patolosky, F., Ranjit, K.T., Lichtenstein, A, Willner, I. Dentritic amplification of DNA analysis by oligonucleotide-fimctionalized Au-nanoparticles // Chem. Commun. 2000. V. 10. P. 1025-1026.

84. Letsinger, R.L., Elghanian, R., Viswanadham, G., Mirkin, C.A. Use of a steroid cyclic disulfide anchor in constructing gold nanoparticle-oligonucleotide conjugates // Biocon-jug. Chem. 2000. V. 11. P. 289-291.

85. OMeara, D., Yun, Z., Sonnerborg, A., Lundeberg, J. Cooperative oligonucleotides mediating direct capture of hepatitis С virus RNA from serum I I J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P.2454-2459.

86. Nanthakumar, A., Pon, R.T., Mazumber, A., Yu, S., Watson, A. Solid-phase oligonucleotide synthesis and flow cytometric analysis with microspheres encoded with covalently attached fluorophores // Bioconjug. Chem. 2000. V. 11. P. 282-288.

87. Watson, K.J., Zhu, J., Nguyen, S.T., Mirkin, C.A. Redox-active polymernanoparticle hybrid materials // Pure Appl. Chem. 2000. V. 72. P. 67-72.

88. Hussain, I., Brust, M., Papworth, A.J., Cooper, A.I. Preparation of acrylate-stabilized gold and silver hydrosols and gold-polymer composite films // Langmuir. 2003. V. 19. P. 4831.-4835.

89. Liu, F.-K., Hsieh, S.-Y., Ко, F.-H., Chu, T.-C., Dai, B.-T: Synthesis of nanometersized poly(methyl methacrylate) polymer network by gold nanoparticle template // Jpn. J. Appl. Phys. 2003. V. 42. P. 4147-4151.

90. Sato, К, Hosokawa, К, Maeda, М. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation as a detection method for single-base substitutions // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. e4.

91. Maxwell, D.J., Taylor, J.R., Nie, S. Self-assembled nanoparticle probes for recognition and detection of biomolecules // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 9606-9612.

92. Kiang, C.-H. Phase transition of DNA-linked gold nanoparticles // Physica A. 2003. V. 321. P. 164-169.

93. Murphy, D., Eritja, R., Redmond, G. Monitoring denaturation behaviour and comparative stability of DNA triple helices using oligonucleotide gold nanoparticle conjugates // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. e65.

94. Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P., Mirzabekov, A. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA and protein microchips // Anal. Biochem. 1997. V. 250. P. 203-211.

95. Proudnikov, D., Timofeev, E., Mirzabekov, A. Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips // Anal. Biochem. 1998. V. 259. P. 34-41.

96. Лившиц, M.A., Мирзабеков, А.Д. Расчет кинетики гибридизации ДНК с олигонук-леотидами, фиксированными в слое геля // Молекулярн. биол. 1996. Т. 30. С. 11581166.

97. Dubiley, S., Kirillov, Е., Lysov, Y., Mirzabekov, A. Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2259-2265.

98. Drobyshev, A.L., Zasedatelev, A.S., Yershov, G.M., Mirzabekov, A.D. Massive parallel analysis of DNA-Hoechst 33258 binding specificity with a generic oligodeoxyribonu-cleotide microchip // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4100-4105.

99. Timofeev, Е., Mirabekov, A. Binding specificity and stability of du-plexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2626-2634.

100. Komoea, Е.Ю., Крейдлин, Э.Я., Барский, B.E., Мирзабеков, А.Д. Изучение оптических свойств флуорохромов, перспективных для использования в биологических чипах // Молекулярн. биол. 2000. Т. 34. С. 304-309.

101. Vasiliskov, V.A., Prokopenko, D.V., Mirzabekov, A.D. Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2300-2313.

102. Kolchinsky, A., Mirzabekov, A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips // Hum. Mutat. 2002. V. 19. P. 343-360.

103. Nguyen, H.-IC, Southern, E.M. Minimising the secondary structure of DNA targets by incorporation of a modified deoxynucleotide: implications for nucleic acid analysis by hybridisation //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3904-3909.

104. Maertens, G., Stuyver, S., Rossau, R., van Heuverswyn, H. Process for typing HCV isolates // United States Patent. 2003. No 6,548,244 B2.

105. Graber, J.H., O'Donnell, M.J., Smith, C.L., Cantor, C.R. Advances in DNA diagnostic // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 14-18.

106. Marshall, E. Getting the noise out of gene arrays // Science. 2004. V. 306. P. 603-631.

107. Yuen, Т., Wurmbach, E., Pfeffer, R.L., Ebersole, B.J., Sealfon, S.C. Accuracy and calibration of commercial oligonucleotide and custom cDNA microarrays // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. e. 48.

108. Эмануэль, H.M., Кнорре, Д.Г. Курс химической кинетики // Москва. Высш. шк. 1984.

109. Келлети, Т. Основы ферментативной кинетики // Москва. Мир. ред. Курганов Б.И. 1990.

110. Пышный, Д.В. Новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с нуклеотивыми кислотами // Диссертация. К. X. Н. Новосибирск. НИБХ СО РАН. 1998.

111. Кантор, Ч., Шиммел, П. Биофизическая химия // Москва. Мир. 1985. Т. 3.

112. Craig, М.Е., Crothers, D.M., Doty, P. Relaxation kinetics of dimer formation by self complementary oligonucleotides // J. Mol. Biol. 1971. V. 62. P. 383-401.

113. Chan, V., Graves, D.J., McKenzie, S.E. The biophysics of DNA hybridization with oligonucleotide probes // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 2243-2255.

114. Porschke, D. Model calculation on the kinetics of oligonucleotide double helix coil transitions. Evidence for a fast chain sliding reaction // Biophys. J. 1994. V. 2. P. 83-96.

115. Варфоломеев, С.Д., Гуревич, КГ. Биокинетика//Москва, Фаир-Пресс, 1998.

116. Erickson, D., Li, D., Krull, U.J. Modeling of DNA hybridization kinetics for spatially resolved biochips // Anal. Biochem. 2003. V. 317. P. 186-200.

117. Hendolin, P.H., Paulin, L., Ylikoski, J. Clinically applicable multiplex PCR for middle ear pathogens // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. P. 125-132.

118. Sanchez, J.A., Pierce, K.E., Rice, J.E., Wangh, L.J. Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: an advanced method of asymmetric PCR and its uses in quantitative realtime analysis //Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2004. V. 101. P. 1933-1938.

119. Tong, A.K., Ju, J. Single nucleotide polymorphism detection by combinatorial fluorescence energy transfer tags and biotinylated dideoxynucleotides // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. el9.

120. Demidov, D.D., Yavnilovich, M.V., Belotsrkovskii, B.P., Frank-Kamenetskii, M.D., Nielson, P.E. Kinetics and mechanism of polyamide ("peptide") nucleic acid binding to duplex DNA //Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 1995. V. 92. P. 2637-2641.

121. Leijon, M., Sehlstedt, I J., Nielsen, P.E., Graslund, A. Unique base-pair reathing dynamics in PNA-DNA hybrids //J. Mol. Biol. 1997. V. 271. P. 438-455.

122. Kushon, S.A., Jordan, J.P., Seifert, J.L., Nielsen, H., Nielsen, P.E., Armitage, B.A. Effect of secondary structure on the thermodynamics and kinetics of PNA hybridization to DNA hairpins//J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 10805-10813.

123. Петюк, B.A. Взаимодействие олигонуклеотидов со структурированными участками РНК // Диссертация. К. X. Н. Новосибирск. НИБХ СО РАН. 2000.

124. Reynaldo, L.P., Vologodskii, А. К, Neri, В.P., Lyamichev, V.I The kinetic of oligonucleotide replacements // J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 511-520.

125. Sigman, D.S Chemical nucleases // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-9105.

126. Proudnikov, D., Mirzabekov, A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling//Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4535-4542.

127. Sigman, D.S. Chemical nucleases // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-9105.

128. Pogozelski, W.K., Tullius, T.D. Oxidative strand scission of nucleic acids: routes initiated by hydrogen abstraction from the sugar moiety // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 10891107.

129. Barone, A.D., McGall, G.H., Chen, C. Methods for fragmenting DNA // United States Patent. 2005. No US 2005/0191682 Al.

130. Blume, J.E., Cao, Y., McGall, G.H., Cole, K.B., Christians, F.C., Wu, K., Hsie, L„ Mi-yada, C.G., Barone, A.D., Truong, V. Methods for modifying DNA for microarray analysis //United States Patent. 2005. No 2005/0123956 Al.

131. Okahata, Y., Kawase, M., Niikura, K., Ohtake, F., Furusawa, II., Ebara, Y. Kinetic measurements of DNA hybridization on an oligonucleotide-immobilized 27-MHz quartz crystal microbalance //Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 1288-1296.

132. Levinsky, R., Ilerne, T.M., Tarlov, M.J., Satija, S.K. Using self-assembly to control the structure of DNA monolayers on gold: a neutron reflectivity study // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 9787-9792.

133. Lucas, S.W., Harding, M.M. Detection of DNA via an ion channel switch biosensor // Anal. Biochem. 2000. V. 282. P. 70-79.

134. Rouillard, J.M., Zuker, M., Gulari, E. OligoArray 2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3057-3062.

135. Herwig, R., Schmitt, A.O., Steinfath, M., O'Brien, J., Seidel, H., Meier-Ewert, S., Le-hrach, H., Radelof, U. Information theoretical probe selection for hybridization experiments // Bioinformatics. 2000. V. 16. P. 890-898.

136. Broude, N.E., Woodward, K., Cavallo, R, Cantor, C.R., Englert, D. DNA microarrays with stem-loop DNA probes: preparation and applications // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. e92.

137. Nguyen, Н.-К., Auffray, P., Asseline, U., Dupret, D., Thuong,N.T. Modification of DNA duplexes to smooth theirthermal stability independently of their base content for DNA sequencing by hybridization // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3059-3065.

138. Gutierrez, A.J., Matteucci, M.D., Grant, D., Matsumura, S., Wagner, R.W., Froehler, B.C. Antisense gene inhibition by С-5-substituted deoxyuridine-containing oligode-oxynucleotides//Biochemistry. 1997. V. 36. P. 743-8.

139. Seela, F., Becher, G. PyrazoIo3,4-d.pyrimidine nucleic acids: adjustment of dA-dT to dG-dC base pair stability //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2069-2078.

140. Berger, M., Wu, Y., Ogawa, A.K., McMinn, D.L., Schultz, P.G. Romesberg F.E. Universal base for hybridization, replication and chain termination // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2911-2914.

141. Berger, M., Luzzi, S.D., Henry, A.A., Romesberg, F.E. Stability and selectivity of unnatural DNA with five-memberedring nucleobase analogues // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 1222-1226.

142. Nielsen, P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics and molecular biology// Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 16-20.

143. Kurakin, A., Larsen, H.J., Nielsen, P.E. Cooperative strand displace-ment by peptide nucleic acid (PNA) I I Chem. Biol. 1998. V. 5. P. 81-89.

144. Lomakin, A., Frank-Kamenetskii, M.D. A theoretical analysis of speci-ficity of nucleic acid interaction with oligonucleotides and Peptide Nucleic Acids (PNAs) // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 57-70.

145. Giesen, U., Kleider, W., Berding, C., Geiger, A., Orum, H, Nielsen, P.E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5004-5006.

146. Armitage, B.A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization // Drug Discov. Today. 2003. V. 8. P. 222-228.

147. Wang, J., Palecek, E., Nielsen, P.E., Rivas, G., Cai, X., Shiraishi, H, Dontha, N., Luo, D., Farias, P.A.M. Peptide nucleic acid probes for sequence-specific DNA biosensors // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 7667-7670.

148. Perry-O 'Keefe, Н., Yao, X.-W., Coull, J.M., Fuchs, M., Egholm, M. Peptide nucleic acid pregel hybridization: An alternative to Southern hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 14670-14675.

149. Gaylord, B.S., Heeger, A.J., Bazan, G.S. DNA detection using water-soluble conjugated polymers and peptide nucleic acid probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. V. 99. P. 10954-10957.

150. Jacobsen, N. Bentzen, J., Meldgaard, M., Jakobsen, M.H., Fenger, M., Kauppinen, S., Skouv, J. LNA-enhanced detection of single nucleotide polymorphisms in the apolipo-protein E //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. elOO.

151. Finn, P.J., Gibson, N.J., Fallon, R., Hamilton, A., Brown, T. Synthesis and properties of DNA-PNA chimeric oligomers //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3357-3363.

152. Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. el75.

153. Pompizi, I., Haberli, A., Leumann, C.J. Oligodeoxynucleotides containing conforma-tionally constrained abasic sites: a UV and fluorescence spectroscopic investigation on duplex stability and structure //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2702-2708.

154. Борисова, О.Ф., Щелкина, A.K., Тимофеев, Э.Н., Флорентьев, B.JI. Димеры трип-лексов ДНК // Молекулярн. биол. 1995. Т. 29. С. 1076-1085.

155. Ma, M.Y.-X., McCallum, К, Climie, S.C., Kuperman, R., Lin, W.C., Sumner-Smith M., Barnet R. W. Design and synthesis of RNA miniduplexes via a synthetic linker approach.

156. Generation of covalently closed, double-stranded cyclic HIV-1 TAR RNA analogs with high Tat-binding affinity // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2585-2589.

157. Козлов, И.А., Ивановская, М.Г., Кубарева, E.A., Волков, Е.М., Шабарова, З.А. Синтез и свойства ковалентносвязанного ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания фактора транскрипции NF-kB //Молекулярн. биол. 1996. Т. 30. С. 854-863.

158. Amaratunga, М., Lohman, Т. М. Escherichia coli Rep helicase unwinds DNA by an active mechanism // Biochemistry. 1993. V 32. P. 6815-6820.

159. Pasman, Z., Garcia-Blanco, M. The 5' and 3' splice sites come together via a three dimensional diffusion mechanism // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 1638-1645.

160. Tian, L., Sayer, J.M., Jerina, D.M., Shuman, S. Individual nucleotide bases? Not base pairs, are critical for triggering site-specific DNA cleavage by vaccinia topoisomarase // J. of Biologycal Chemistry. 2004. V. 279. P. 3718-39726.

161. Thomson, J.В., Tuschl, Т., Eckstein, F. Activity of hammerhead ri-bozymes containing nonnucleotidic linkers //Nucleic Acids Research. 1993. V. 21. P. 5600-5603.

162. Benser, F., Fu, D.-J., Liidwig, J., McLaughlin, L.W. Hammerhead-lilce molecoles containing non-nucleoside linkers are active RNA catalysts // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 8483-8484.

163. Okamoto, A., Ichiba, Т., Saito, I. Pyrene-labeled oligodeoxynucleotide orobe for detecting base insertion by excimer fluorescence emission // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 8364-8365.

164. Hawkins, M.E., Balis, F.M. Use of pteridine nucleoside analogs as hy-bridization probes //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. e62.

165. Vo, Т., Wang, S., Kool, E.T. Targeting pyrimidine single strands by triplex formation: structural optimization of binding //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2937-2944.

166. Kool, E.T., Rochester, N.V. Stem-loop and circular oligonucleotide and method of using // United States Parent. 1997. № 5,674,683.

167. Giancola, C., Petraccone, L., Pieri, M. Barone, G, Thermodynamic and computational studies of DNA triple helices containing a nucleotide or a non-nucleotide linker in the third strand//Biophys. Chem. 2001. V. 94. P. 23-31.

168. Hearst, J.E. Background hybridization associate with the use of photo-crosslinkable oligonucleotide hybridization probes of identification of unique sequences in human genome // Photobiochem. Photobiophys. (suppl). 1987. P. 23-32.

169. Persson, В., Stenhag, K, Nilsson, P., Larsson, A., JJhlen, M., Nygren, P.-A. Analysis of oligonucleotide probe affinities using surface plasmon resonance: a means for mutational scanning // Anal. Biochem. 1997. V. 246. P. 34-44.

170. Li, С., Wong, Н. Model-based analysis of oligonucleotide arrays: ex-pression index computation and outlier detection// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. V. 98. 1. P. 3136.

171. Zang, L., Miles, M.F., Aldape, K.D. A model of molecular interactions on short oligonucleotide microarrays //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 818-821.

172. Melchior, W.B., Jr. Von Hippel ,P.H. Alteration of the relative stability of dA/dT and dG/dC base pairs in DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S A. 1973. V. 70. P. 298-302.

173. Riccelli, P. V, Benight, A.S. Tetramethylammonium does not universally neutralize sequence dependent DNA stability // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3785-3788.

174. Woo, J., Meyer, R.B., Gamper, KB. G/C-modified oligodeoxynucleotides with selective complementarity: synthesis and hybridization properties // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 2470-2475.

175. Loakes, D., Hill, F., Brown, D.M., Salisbury, S.A. Stability and structure of DNA oligonucleotides containing non-specific base analogues // J. Mol. Biol. 1997. V. 270. P. 426-435.

176. Carlson, C.S., Newman, T.L., Nickerson, D.A. SNPing in the human genome // Current Opinion in Chemical Biology. 2001. V. 5. P. 78-85.

177. Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L. A ligase-mediated gene detection technique // Science. 1988. V. 241. P. 1077-1080.

178. James, K.D., Boles, A.R., Henckel, D., Ellington, A.D. The fidelity of template-directed oligonucleotide ligation and its relevance to DNA computation // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5203-5211.

179. Deng, J.-Y., Zhang, X.-E., Mang, Y., Zhang, Z.-P., Zhou, Y.-F., Liu, O., Lu, H.-B., Fu, Z-J. Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism //Biosens. Bioelectron. 2004. V. 19. P. 1277-1283.

180. Gunderson, K.L., Huang, X.C., Morris, M.S., Lipshutz, R.J., Lockhart, D.J., Chee, M.S. Mutation detection by ligation to complete n-mer DNA arrays // Genome Res. 1998. V. 8. P. 1142-1153.

181. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

182. Щелкунов, C.H. Генетическая инженерия // Новосибирск. Сибирское Университетское Издательство. 2004. С. 42.

183. Nyren, P., Lundin, A. Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphatase synthesis // Anal. Biochem. 1985. V. 151. P. 504-509.

184. Ronaghi, M., Uhlen, M., Nyren, P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science. 1998. V. 281. P. 363-365.

185. Ayyadevara, S., Thaden, A.A., Reis, R.J.S. Discrimination of primer З'-nucleotide mismatch by Taq DNA polymerase during polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 2000. V. 284. P. 11-18.

186. Патрушев, Л.И., Зыкова, Е.С., Каюшин, А.Л., Коростелева, М.Д., Мирошников, А.И. Новая система ДНК-диагностики, позволяющая обнаруживать и идентифицировать гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 194-200.

187. Nordstrom, Т., Ronaghi, M., Forsberg, L., de Faire, U., Morgenstern, R., Nyren, P. Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by pyrose-quencing // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V. 31. P. 107-112.

188. Pastinen, Т., Kurg, A., Metspalu, A., Peltonen, L., Syvanen, A.-C. Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays // Genome Res. 1997. V. 7. P. 606-614.

189. Gemignani, F., Perra, C., Landi, S., Canzian, F., Kurg, A., To~nisson, N., Galanello, R., Cao, A., Metspalu, A., Romeo, G. Reliable detection of p-thalassemia and G6PD mutations by a DNA microarray // Clinical Chemistry. 2002. V. 48. P. 2051-2054.

190. Lindroos, K., Liljedahl, U., Raitio, M., Syvanen, A.-C. Minisequencing on oligonucleotide microarrays: comparison of immobilisation chemistries // Nucleic Acida Res. 2001. V. 29. e69.

191. Giusto, D.A.D., King, G.C. Strong positional preference in the interaction of LNA oligonucleotides with DNA polymerase and proofreading exonuclease activities: implications for genotyping assays //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. e32.

192. Strerath, М„ Gaster, J., Summerer, D., Marx, A. Increased single-nucleotide discrimination of PCR by primer probes bearing hydrophobic 4'C modifications // Chem. Bio. Chem. 2004. V. 5. P. 333-339.

193. Gallo, M., Montserrat, J.M., Iribarre, A.M. Design and applications of modified oligonucleotides//Braz. J. Med. Biol. Res. 2003. V. 36. P. 143-151.

194. Freier, S M., Altmann, K.-H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4429-4443.

195. Breslauer, K.J. Extracting thermodynamic data from equilibrium melting curves for oligonucleotide order-disorder transition // In: Methods in molecular Biology. V. 26. Ed. Agrawal, S. Totowa, New Jersey: Humana Press. 1994. P. 347-372.

196. Petersheim, M., Turner, D.H. Base-stacking and base-pairing contribu-tions to helix stability: thermodynamics of double-helix formation with CCGG, CCGGp, CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp //Biochemistry. 1983. V. 22. P. 256-263.

197. Lokhov, S.G., Pyshnyi, D.V. Thermodynamic and spectral properties of DNA minidu-plexes with the G*A mispairs and 3'- or 5'-dangling bases // FEBS Lett. 1997. V. 420. P. 134-138.

198. Breslauer, K.J. Methods for obtaining thermodynamic data on oligonu-cleotide transitions. In: Thermodymamic data for biochemistry and biotechnology // Ed. Hinz H-J. Berlin. Heidelberg. New York. Tokyo: Springer-Verlag. 1986. P. 402-427.

199. Tanaka, F., Kameda, A., Yamamoto, M., Ohuchi, A. Thermodynamic parameters based on a nearest-neighbor model for DNA sequences with single-buldge loop // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 7143-7150.

200. Gryaznov, S.M., Lloyd, D.H Modulation of oligonucleotide duplex and triplex stability via hydrophobic interactions //Nucleic Acids Res.1993. V. 21. P. 5909-5915.

201. Kaumop, Ч., Шиммел, П. Биофизическая химия II Москва. Мир. 1985. Т. 3. С. 329.

202. Махат, A.M., Gilbert, W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavage // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

203. Toulmd, J.-J. Artificial regulation of gene expression by complemen-tary oligonucleotides // An overview. In: Antisense RNA and DNA. J.A.H. Murray. Ed. Wiley-Liss. New York P. 175-194.

204. Wu, D.Y., Wallace, R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. V. 76. P. 245-254.

205. Doherty, A.J., Dafforn, T.R. Nick recognition by DNA ligases // J. Mol. Biol. 2000. V. 296. P. 43-56.

206. Odell, M., Shuman, S. Footprinting of chlorella virus DNA ligase bound at a nick in duplex DNA // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 14032-14039.

207. Друца, В.Л., Беднарек, П.З., Королева, O.H. Особенности репликации синтетических олигонуклеотидов с неприродными звеньями // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 1206-1217.

208. Королева, О.П., Друца, В.Л. Исследование транскрипции ДНК-матриц с пирофос-фатными межнуклеотидными связями // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2003. Т. 44. С. 203-207.

209. Liu, J., Doetsch, P.W. Escherichia coli RNA and DNA polymerase bypass of dihy-drouracil: mutagenic potential via transcription and replication // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1707-1712.

210. Viswanathan, A., Doetsch, P. W. Effects of nonbulky DNA base damages on Escherichia coli RNA polymerase-mediated elongation and promoter clearance // J. Biol. Chem. 998. V. 273. P. 21276-21281.

211. Eom, S.H., Wang, J., Steitz, T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site // Nature. 1996. V. 382. P. 278-281.

212. Clark, J.M. Novel non-template nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eulcaryotic DNA polymerases // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 9677-9686.251252253254255256257258,259.260,261.262.

213. Takeshita, М., Chang, C.-N., Johnson, F„ Will, S., Grollmann, A.P. Oligodeoxynucleo-tides containing synthetic abasic sites model substrates for DNA polymerases and apurinic/apyrimidinic endonucleases // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 10171-10179.

214. Takeshita, M., Eisenberg, W. Mechanism of mutation on DNA templates containing synthetic abasic sites: study with a double strand vector // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1897-1902.

215. Nazarkina,Zh.K., Pyshnyi, D.V., Pyshnaya, I.A., Lavrik, O.I., Khodyreva, S.N. Use of modified flap structures for study of excision repair proteins // Biochemistry (Moscow). In press.

216. Дегтярев, C.X., Белавин, П.А., Шишкина, И.Г., Зарытова, В.Ф., Гаврю-ченкова, Л.П., Морозов, С.Н. Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестриции // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 358-362.

217. Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids // Ed. G.D. Fasman. -Cleveland.: CRC Pressio 1975. V. 1. P. 589.

218. Berkner, K.L., Folk, W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction. Quantative assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphoryl ter-mini in DNAs // Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 3176-3184.

219. Гороо/санкин, A.B., Иванова, E.M., Кобец, Н.Д. Синтез олигодезоксириботимидила-та, содержащего алкилирующую группу и остаток биотина, для направленной модификации хроматина//Биоорган. химия. 1993. Т. 19. С. 81-85.

220. Барам, Г.И., Бунева, B.H., Добрикова, Е.Ю., Петров, В.Н. Множествен-ность аф-финой модификации РНКазы при алкилировании ее реакционноспособным аналогом 5'дезоксирибонуклеотида//Биоорган. Химия. 1986. Т. 12. С. 613-620.

221. Коробко, В.Г., Грачев, С.А. Определение нуклеотидной последовательности в ДНК модифицированным химическим методом // Биоорган. Химия. 1977. Т. 3. С. 14201422.

222. Xu, Y., Kool, Е.Т. Chemical and enzymatic properties of bridging 54- S-phosphorothioester linkages in DNA //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3159-3164.

223. Dafforn, A., Kirakossian, H., Lao, К Miniaturization of the lumines-cent oxygen channeling immunoassay (LOCITM) for use in multiplex array formats and other biochips // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 1495-1497.

224. New England Biolabs. 1990-1991. Catalog. P. 51.