Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов

Виноградова, Ольга Александровна

Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Виноградова, Ольга Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Новосибирск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов»

Автореферат диссертации на тему "Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов"

На правах рукописи

ВИНОГРАДОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ НЕНУКЛЕОТИДНЫХ ВСТАВОК НА СУБСТРАТНЫЕ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ДНК-ДУПЛЕКСОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2011

4852277

Работа выполнена в Институте химической биологии

и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н., доцент Пышный Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

д.х.н. Долинная Нина Германовна к.х.н. Кузнецов Никита Александрович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 10 » июня_2011 г. в 10:00 часов на

заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru Автореферат разослан « 6 » мая___2011г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Производные природных нуклеиновых кислот (НК) и их аналоги уже давно стали незаменимыми инструментами во многих исследовательских и практических молекулярно-биологических приложениях. Введение модифицированных остатков в регулярную структуру НК позволяет направленно изменять функциональные характеристики формируемых на их основе комплексов, такие как стабильность, субстратные и структурные свойства. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН были предложены мостиковые олигонуклеотиды, состоящие из нативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотид-ными вставками, не затрагивающими комплементарные взаимодействия между основаниями и не имеющими выраженного сродства к НК-компонентам. Были определены термодинамические параметры комплексо-образования мостиковых олигонуклеотидов, описаны некоторые структурные характеристики комплексов на их основе, исследованы субстратные свойства в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами.

Представленная работа является продолжением серии работ по исследованию свойств мостиковых олигонуклеотидов и ДНК-комплексов на их основе и направлена на изучение структурных особенностей и субстратных свойств модифицированных ДНК-дуплексов в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами.

Целью настоящей работы было исследование характера возмущений, вносимых в структуру ДНК-дуплекса ненуклеотидной вставкой на. основе фосфодиэфиров олигометилендиолов и олигоэтиленгликолей, с точки зрения изучения субстратных и конформационных свойств комплексов мостиковых олигонуклеотидов для их последующего использования в гибридиза-ционном анализе и для направленного изменения формы ДНК-структур.

В ходе исследования решали следующие задачи:

- изучение влияния ненуклеотидных вставок на конформационные особенности модифицированных ДНК-дуплексов и исследование зависимости величины локального возмущения, вносимого модифицированным остатком, от размера и структуры выпетленных вставок в цепях ДНК-комплекса;

- исследование возможности направленного изменения формы многокомпонентных ДНК-ассоциатов на основе модифицированных ДНК-дуплексов в качестве строительных блоков;

- изучение субстратных свойств модифицированных дуплексов ДНК в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами; определение кинетических параметров лигирования совершенных и содержащих однонук-леотидное несоответствие модифицированных ДНК-субстратов под действием ДНК-лигазы фага Т4;

- разработка подхода повышения эффективности гибридизационного анализа при использовании олигонуклеотидных мостиковых зондов и структурированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Представленная работа является детальным и систематическим исследованием конформа-ционных и субстратных свойств ДНК-комплексов на основе мостиковых олигонуклеотидов. Впервые проведено исследование характера возмущений, вносимых в структуру ДНК-комплексов в результате введения ненук-леотидной вставки. Показано, что любое ненуклеотидное выпетливание в составе дцДНК приводит к изгибу основной оси модифицированного ДНК-фрагмента в месте введения вставки. Показано, что наличие изгибающих ненуклеотидных вставок в составе ДНК-дуплексов, организуемых по принципу конкатемерных структур, способствует самоограничению роста цепи ДНК-конкатемера в результате формирования циклических дцДНК.

Проведено детальное исследование влияния ненуклеотидных вставок в структуре ДНК-дуплексов на их субстратные свойства в реакциях ДНК-зависимых ферментов (ДНК-лигазы фага Т4 и Taq ДНК-полимеразы). С целью выявления стадий ферментативной реакции, определяющих изменение эффективности процессирования модифицированных ДНК-субстратов, определены кинетические параметры реакций лигирования Т4 ДНК-лигазой модифицированных совершенных и содержащих однонуклеотид-ные несоответствия ДНК-комплексов.

Показано использование мостиковых олигонуклеотидов как высокоселективных зондов в гибридизационном анализе. Предложено использование ограниченно фрагментированной дцДНК-матрицы в качестве анализируемого объекта с целью повышения чувствительности гибридизационного анализа.

Проведенные исследования свойств комплексов мостиковых олигонуклеотидов принципиальны для установления особенностей формирования модифицированных ДНК-дуплексов. Показанная возможность регулирования конформационных и субстратных свойств ДНК-комплексов необходима для расширения их практической значимости.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях, в том числе: Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященная 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006; 15th International symposium «Nanostructures: physics and technology», Novosibirsk, 2007; II Международный Молодежный Медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» к 110-летию СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2007; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; The sixth international conference on bioin-formatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, 2008; Первый и Второй международные форумы по нанотехнологиям, Москва, 2008, 2009; Международная конференция «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, 2009.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах, содержит 66 рисунков и 12 таблиц. Библиография включает 273 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конформационные особенности ДНК-дуплексов на основе мостико-вых олигонуклеотидов

При исследовании структуры комплексов мостиковых олигонуклеотидов методом кругового дихроизма было установлено, что КД-спектры модифицированных комплексов характерны для двойной спирали ДНК В-формы \Pyshnyi О.У. е1 аI 2006]. Детектируемые незначительные различия в спектрах комплексов нативных и модифицированных олигонуклеотидов свидетельствуют о локальном возмущении структуры дуплексов. Исследование конформационных особенностей модифицированных ДНК-дуплексов проводили на примере 32-звенных ДНК-дуплексов с одинаковой нуклео-тидной последовательностью, различающихся наличием в центральной части одной или обеих цепей дополнительных модифицирующих звеньев. В центральную часть матричного олигонуклеотида рМ32 вводили звенья на основе остатков фосфодиэфира З-гидрокси-2-

гидроксиметилтетрагидрофурана (АР^ или триаденилата (А3). В структуру олигонуклеотида N32 вводили звенья Х| на основе: моно- и олигоаденила-тов (АО и олиготимидилатов (Т|), или ненуклеотидные вставки: остатки фосфодиэфиров диэтиленгликоля (БЕС;), 1,10-декандиола (ОБ;) и 1,12-додекандиола (БОБО. В качестве контрольных были исследованы модифицированные ДНК-дуплексы рМ32ЛЧ32-Хь содержащие дополнительные звенья Х| на 5'-конце олигонуклеотидной цепи N32 (схема 1).

рМ32 3' ССССТААТТСААСССС*ТТССАвТСССАСААСОр Схема 1.

N32 5 * ССССАТТААСТТООСС^ААСвТСАСССТСТТСС

* 1 * - положения ненуклеотидных вставо!^ и Х! в рМ32 и N32 соответственно

рМ32/Ш6(Х,)Ш6

А АР

гттггггт , А п..

и^ухи ' р

Р О

V; РМ16(¥рМ16/Ш2 ¿ , (, А

лпгп тт , Р

иАМААЛАД X,: Ь О ^

У^рМЩУрМШШбОДШб А Т ВЕС > 00 > ООО

ГТТТ1 ГТТТ1 \ _п_. 1

илл^удд, ^

' рМЗг/Шг^ Г-' О Г"' о и0 0_р'_ I

ПГПГТТГТГПП г>. '_ _ 11 А-г

х, , уилдХиии ,Г1 ¡| о Ц

^ ООО

о \ о /

При исследовании электрофоретической подвижности комплексов рМ32/М6(Х01У16, рМ16(^)М16ЛЧ32, рМ16(У,)М16/1Ч16(Х0Ш6 было установлено, что введение любой вставки приводит к снижению электрофоретической подвижности в неденатурирующих условиях ДНК-дуплексов относительно ДНК-дуплекса без выпетливания рМ32ЛЧ32 или дуплексов рМ32ЛЧ32-Хь несущих соответствующую модификацию на конце дцДНК (рис. 1). Более протяженное выпетливание в случае большинства исследуемых дуплексов приводит к более выраженному снижению их электрофоретической подвижности.

i = ¡1 3 5 7 9[ 5 9 1 1 1 1 1 1 1 3 5 s 1 2 3 4 5 5

дуплексы 1 1 1 1 ! ф* Щ ¿¡к!, .„ Ж ШЩ • w * t ' It ' 1 1 1 1 Ш & ф A ♦ Ш щ rä 9 * *

рМ32 1 1 j. 1 1 $ р- 1 ; §; А

рМ32/ N321 ¡N32-Ai N32 Гф-DEGi N32 N$2-DD,

N16(Ai)N16 M6(DEG0N16 N16(DDi)N16

Рис. 1. Электрофоретический анализ ДНК-дуплексов pM32/N16(Xi)N16 в 18% ПА-АГ в неденатурирующих условиях при 10°С. Условия гибридизации-. 45 мМ трис-борат (pH 8.3), 5 мМ MgCl2, [32рМ32] = 7.5 мкМ, [N32], [N16(Xj)N16] = 5 мкМ, 25°С, 30 мин.

Наблюдаемое снижение электрофоретической подвижности ДНК-дуплексов с внутренними петлями обусловлено изгибом дцДНК в сайте модификации [Thompson J.F., handy A. 1988; Rice J.A., Crothers D.M. 1985]. Локальное нарушение структуры согласуется с данными КД-спектров. С помощью выражения: а = 2 arccos(nBHyTp/|iKOH4) [Thompson J.F., Landy A. 1988], где цвнутр и u.„.,„ - электрофоретические подвижности комплексов, несущих одинаковые модификации в центральной части дуплекса и на его конце соответственно, были определены величины углов изгиба дуплексных структур ДНК (табл. 1).

Установлено, что степень влияния различных нуклеотидных и ненук-леотидных выпетливаний на изменение конформации модифицированных дуплексов определяется не только протяженностью петли, но природой модифицированных звеньев. Так, при одинаковом числе остатков (i), нуклео-тидные вставки в большей степени изгибают остов дцДНК, чем любые не-нуклеотидные, несмотря на большую контурную длину последних. В случае олигоаденилатного фрагмента это связано с сохранением стэкинг-

Таблица 1. Величина изгиба основной оси спирали (угол а) ДНК-комплексов [|М32/М6(Х;)М16.. рМ 16(У|]Ч16/.М2. р.У116(У^У116/М6(.\).\1(>

Y¡ X\i 0 1 2 3 4 5 7 9

А - 21° - 50° - 74° 82° 83°

- Т - - - - - 70° - -

- DEG - 20° - 41° - 61° - -

- DD - 32° 35° 45° 53° 59° - -

- DOD - 27° 19° 39° 38° 44° - -

АР, А 16° 0° - 39° - 69° 83° 82°

Аз А 46° 31° - 0° - 16° 49° 63°

Примечание. Ошибку определения угла изгиба рассчитывали как стандартное отклонение величины при анализе данных, полученных в серии из не менее трех независимых экспериментов. Величина ошибки не превышает ± 5°.

взаимодействий в одноцепочечном участке [Rosen М.А. et al. 1992]. Напротив, каждый из ДНК-дуплексов pM32/N16(DOD¡)N16 (i = 2-5) характеризуется значительно меньшим изгибом спирали относительно любого из рассмотренных ДНК-дуплексов pM32/N16(X¡)N16 (i = 2-5) с соответствующим количеством последовательно введенных модифицированных остатков X¡, хотя контурная длина DODj-остатков наибольшая. Данный факт мы связываем с гидрофобной природой подобных ненуклеотидных вставок, стремящихся минимизировать площадь контакта их алифатических цепей с растворителем, что приводит к компактизации вставки и в результате к снижению степени изгиба модифицированного ДНК-дуплекса.

Кроме того, практически во всех рассмотренных случаях увеличение числа последовательно расположенных вставок одного типа вызывает повышение величины изгиба спирали ДНК. Исключение составляют ДНК-дуплексы с модификациями на основе гидрофобных фосфодиэфиров де-кандиола и додекандиола. Введение второго подобного остатка не влияет на структуру ДНК-дуплекса или приводит к уменьшению изгиба (табл. 1).

При исследовании серии комплексов с двумя внутренними выпетлива-ниями pM16(Yj)M16/N16(X¡)N16 в матричной и олигонуклеотидной цепях показано, что наличие невзаимодействующих нуклеотидных последовательностей способствует некоторой компенсации суммарного изгиба ДНК-дуплекса (табл. 1).

Влияние электростатических взаимодействий дополнительных фосфатных остатков, сводимых на стыке дуплексных фрагментов при введении ненуклеотидной вставки, исследовали на модельных тандемных дуплексах pM32/N16,+N162 и pM16(Yj)M16/N16,+N162 с одноцепочечным разрывом в центральной части олигонуклеотида N32, содержащим моноэфирные фосфатные остатки или нет. Наличие одноцепочечного разрыва в отсутствии фосфатного остатка на стыке дуплексных структур (pM32/N16i+N162) приводит к незначительному изгибу дцДНК (а = 5°) (рис. 2). Наличие в точке кооперативного контакта 5'- или 3'-концевого

фосфатного остатка или сближение пары фосфатов приводит к достоверно детектируемому возмущению дуплекса, а достигает 19° и 42° соответственно. Разнесение фосфатных остатков в брешь-содержащих комплексах рМЩАзЭЛИб/Мб^+рМбг вызывает релаксацию ДНК до а = 12° в случае упорядоченного за счет стэкинг-взаимодействий триаденилатного перехода. В случае рМЩАР^М^/Мб^+рМбг, напротив, детектируется увеличение изгиба до 54° (рис. 2).

*РР 'РУР

ггггтгггп

р р

рМ32/1Ч1б,+тб2

птгОгтп

\ =АР, кЛЛЛ^

р р

20 40

угол изгиба,

рМ16СУ).)М16/ —, 1Ч16,+1Ч16, 60

Рис. 2. Величины изгиба а тандемных комплексов рМ32/1Ч161+М162, рМЩАРОЛИб/Шб^Шбг, рМ16(А3)М16ЛЧ161+М62 в зависимости от наличия фосфатных остатков в сайте одноцепочечного разрыва.

Термическая стабильность комплексов с выпетливаниями. Методом термической денатурации с оптической регистрацией были определены температуры плавления комплексов серий рМ32/1Ч16(Х|)1Ч16 и рМ16(\^)М16ЛЧ16(Х|)1Ч16. Показано, что наличие внутренних петель во всех случаях дестабилизирует ДНК-дуплексы. Степень дестабилизации возрастает с увеличением длины выпетливания (рис. 3). Выявлена корреляция между стабильностью возмущенного комплекса и величиной отклонения формы его спирали от линейной (рис. 3).

пгпгггтп

'"М." ' ' 1

180 Т

° 150 В

2120 +

гтгггтт

Хг=А, ХрОЕС^ Х^ОО; ХрООО,

гтгОпт

Х=А,

Йа

Х,=А|

т 78 Д

•п в

+ 74 я

72 6

+ 70§

¡=13579 135 12345 12345 13579 13579 П Рис. 3. Корреляция между стабильностью комплексов с выпетливаниями рМ32/]\16(Х|)М6, рМ 16(\'|)М 16/М32. рМ16(У])М1б/М1б(Х()М16 и уровнем их изгибной деформации. Величина изгиба 180°-а (столбцы) и температуры плавления (точки) нативного и модифицированных ДНК-комплексов. Условия термической денатурации: 10 мМ какодилат натрия (рН 7.2), 35 мМ №С1, 5 мМ 1У^С12, концентрация олигонуклеотидов 1 мкМ.

Таким образом, наличие ненуклеотидных звеньев в составе комплексов мостиковых олигонуклеотидов приводит к изгибу дцДНК-спирали на участке нарушения регулярности структуры и обуславливает их дестабилизацию. Масштаб дестабилизации и величина изгиба модифицированной дцДНК определяется структурой вводимой вставки.

2. Многокомпонентные ассоциаты на основе модифицированных ДНК-дуплексов

ДНК-дуплексы на основе мостиковых олигонуклеотидов были рассмотрены в качестве строительных блоков для получения многокомпонентных ДНК-объектов нетривиальной формы. Были исследованы особенности строения конкатемерных структур на основе модифицированных ДНК-дуплексов. Рассмотрены две серии ДНК-конкатемеров (схема 2). ДНК-конкатемеры 29В-34В формировали на основе блоков, образованных 5'-32Р-меченной матрицей и модифицированным вставками на основе пяти остатков фосфодиэфиров диэтиленгликолей (ОЕС5) олигонуклеотидным компонентом. ДНК-конкатемер 40В был образован 40-звенной 5'-32Р-меченной матрицей и олигонуклеотидом, содержащим ненуклеотидную вставку из четырех остатков фосфодиэфиров декандиолов (004). В качестве контрольных исследовали ДНК-конкатемеры 32Ь и 40Ц сформированные на основе нативных ДНК-дуплексов.

Схема 2.

3' ТТСААСССв-ТТССАСТСССССбСТСАвАЭр 5 рСССйАСТСТСААСТТСССС+ААССТСА6Св

3'АТТСААСССС-ТТССАСГСССССССТСАСАСр 5 рвОСОАвТСТСТААОТТббОС^ААСОТСАббв

3'ААТТСААСССв-ТТССМЗТССССС6СТСА6А5р 5' рСбСбАВТСТСТТААСТТСССС* ААССТСАСОв

3'ААТТСААСССб -ТТбСАбТСАССССбСТСАСАбр 5' рСОССАОТСТСТТААСТТСССС,ААСОТСАОТСв

3'ААбТТСААСССе-ТТССАСТСАСССС6СТСА5Аер 5 рСССвАОТСТСТТСААСТТСССС ^ААССТСАСТОв

ЗААСТТСААСССб-ТТеСАСАТСАССССССТСАСАОр 5 рвбСбАОТСТСТТСААвТТСвОС *ААСОТСТАвТвв

3'ААТТСААСССвТТвСАвТСАССССССТСАСАбр '' р06ССАСТСТСТТАА6ТТ6ввСААССГСАЭТСЭ

40В э АССТАТвАССС в-ТТССАСАЭТТвАССССС ТАвАТ ТСТвАбр

5 рСССОАТСТААСАСТСТОСАТАСТввбС^ААСбТОТСААСТС

40Ь 3 АССТАТСАССССТТССАСАСТТбАСССССТАОАТТСТСАбр

5'рввССАТСТАА6АСТСТССАТАСТС66СААССТеТСААСТ6

* - положение ОЕС5 и |*и . в ДНК-дуплексах 29В-34В и 40В соответственно

Формирование конкатемерных структур проводили при медленном охлаждении эквимолярной смеси олигонуклеотидных компонентов мономерных дуплексов с 95°С до 25°С в буферных условиях, пригодных для дейст-

29 В ЗПВ 3111 32В 33В 34В 32Ь

вия Т4 ДНК-лигазы. При добавлении ДНК-лигазы происходило частичное лигирование мономерных дуплексов, образующих конкатемер. При анализе ДНК-конкатемеров методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях установлено, что в случае ДНК-конкатемера 32Ь формируется набор полимерных структур. В случае модифицированных ДНК-конкатемеров 29В-34В также образуется набор продуктов, однако в дорожках можно выделить несколько явно выраженных дискретных полос (рис. 4), что свидетельствует о предпочтительном образовании ДНК-структур определенной формы. Формирование ДНК-конкатемера 40В происходит по аналогичному принципу.

п.н

3000 2000

1000 500 300

100

^ а в я в е а

« О N Л ^ —) «-1 —) —, —, —, ГЪ

■ в::...............

■гУЩ [

||||

1|р1В;||11 ЩИИР

А к

160 128

96 64

Рис. 4. Результат электрофоретического разделения в 10% неденатурирующем ПААГ нативного 32Ь и модифицированных 29В-34В ДНК-конкатемеров. Т - модифицированный маркер длины, полученный тупоконечным лигированием ДНК-дуплекса рМ32/»16(1)ЕС5)1\16 (последовательность см. схема 1). Условия гибридизации ДНК-

конкатемеров: 10 мМ 1У^С12, 10 мМ ОТТ, 20 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 0.1 М ЫаС1, 1 мМ АТФ, 20 ед. акг. Т4 ДНК-лигазы, [каждой цепи] = 10 мкМ, 25°С, 30 мин. Условия тупоконечного лигирования: 10 мМ 10 мМ БТТ, 20 мМ трис-НС1

(рН 7.5), 0.1 М ЫаС1, 25% ПЭГ 6000, 1 мМ АТФ, 100 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы, [рМ32/М6(БЕС5)М6] = 10 мкМ, 15°С, 12 часов.

Эффективность образования детектируемых самоограниченных продуктов для ДНК-конкатемеров 29В-34В зависит от длины мономерного дуплекса. Выход подобных структур максимален в случае 32-33-мерных блоков (ДНК-конкатемеры 32В и 33В) (рис. 4). Это было соотнесено с тем, что удлинение дуплексного фрагмента между соседними ненуклеотидными звеньями, также как и детектируемый изгиб ДНК-дуплекса в месте введения вставки, приводит к изменению относительной ориентации фрагментов ДНК-конкатемера, соединенных модифицированными остатками. Очевидно, что наиболее эффективное формирование самоограниченных структур наблюдается в том случае, когда оси отдельных немодифицированных фрагментов ДНК-конкатемера будут расположены в одной плоскости.

Сопоставляя электрофоретические подвижности структур, детектируемых в конкатемере 32В, с модифицированным маркером длины,

содержащим аналогичную ненуклеотидную вставку DEG5 (рис. 4), установлено, что регистрируемые на электрофореграмме полосы с большей подвижностью соответствуют продуктам ассоциации 3 и 6 ДНК-блоков.

Устойчивость нашивного и модифицированного ДНК-конкатемеров по отношению к действию экзонуклеаз. Была исследована стабильность ДНК-конкатемеров 32L и 32В в присутствии экзонуклеаз III и X и фосфо-диэстеразы змеиного яда (ФДЗЯ). Линейный конкатемер 32L проявил стабильность только к действию ФДЗЯ. В случае обработки экзонуклеазами III и X наблюдали деградацию конкатемера. Полученные результаты согласуются со структурой линейного конкатемера, который, согласно схеме ассоциации мономерных ДНК-дуплексов, содержит З'-дуплексные фрагменты и 5'-одноцепочечные нависания. Стабильность образующихся в случае модифицированного конкатемера 32В самоограниченных структур проявляется по отношению к ФДЗЯ и экзонуклеазе X. Одной из причин устойчивости ДНК-конкатемера 32В в присутствии экзонуклеазы X может быть недоступность 5'-одноцепочечных концов, что реализуется в случае замыкания ДНК-конкатемера в цикл.

Эффективность гибридизации конкатемерных комплексов ДНК с олигонуклеотидом-стоппером, комплементарным одному из липких концов ДНК-блока, была исследована для нативного 32L и модифицированного 32В конкатемеров. Показана гибридизация олигонуклеотида-стоппера в случае линейного конкатемера 32L. Формирование комплексов между оли-гонуклеотидом и самоограниченными структурами модифицированного ДНК-конкатемера 32В зарегистрировать не удавалось.

Таким образом, самоограниченные структуры, регистрируемые в случае модифицированного ДНК-конкатемера при его исследовании с помощью гель-электрофореза, сформированы таким образом, что 5'-одноцепочечные участки недоступны для гибридизации с комплементарным олигонуклеотидом, что говорит в пользу того, что данные структуры являются замкнутыми.

Особенности строения нативных и модифицированных ДНК-конкатемеров были исследованы методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) . Из типичных топографических АСМ-изображений поверхности слюды с ДНК-конкатемерами видно, что во всех модельных системах преобладают полимерные молекулы с линейной формой (рис. 5). Формирование ДНК-объектов нетипичной формы (разветвленных и циклических) также детектируется во всех системах. По данным статистического анализа полученных АСМ-изображений можно выделить общую тенденцию увели-

* - АСМ-исследования проведены в ЦКП «Наноструктуры» (Институт физики полупроводников им. A.B. Ржанова СО РАН).

чения количества циклических структур, когда их сборка происходит на основе модифицированных блоков. Доля циклических объектов в случае конкатемеров 32В и 40В составляет 10%. Однако нами было отмечено, что данные о распределении конкатемерных структур по длине, определенные методом АСМ и с помощью гель-электрофореза, различаются. АСМ-данные свидетельствуют о высоком содержании коротких ассоциатов, что может быть объяснено частичной диссоциацией дцДНК в процессе про-боподготовки образцов для АСМ-исследований.

Рис. 5. Изображения атомно-силовой микроскопии поверхности слюды с нанесенными ДНК-конкатемерами.

Были подобраны условия нанесения образцов ДНК, оптимальные для анализа подобных объектов. Показано, что нанесение образцов ДНК-конкатемеров на поверхность слюды, предварительно обработанную раствором 10 мМ N¡(N03)2, приводит к повышению средней длины линейных структур в случае немодифицированных конкатемеров и увеличению доли циклических структур в случае модифицированных ДНК-конкатемеров (рис. 6). Согласно полученным АСМ-изображениям выход циклических ДНК-структур в случае модифицированных ДНК-блоков составляет 35% от общего числа детектируемых объектов. Длина окружности дцДНК-циклов для конкатемера 32В равна 23-121 нм (-3-12 мономерных ДНК-дуплексов),

для 40В - 30-200 нм (-2-14 мономерных ДНК-дуплексов). Полученные данные согласуются с АСМ-анализом образцов ДНК-конкатемеров, проведенными Д.В. Клиновым в ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова с использованием альтернативной подложки - пиролити-ческого графита.

Рис. 6. Изображения атомно-силовой микроскопии предварительно обработанной 10 мМ N¡(N03)2 поверхности слюды с нанесенными ДНК-конкатемерами.

Таким образом, наличие ненуклеотидной вставки в структуре мономерных ДНК-дуплексов изменяет характер их ассоциации. Получение ДНК-конкатемеров с использованием модифицированных ДНК-блоков приводит к самоограничению роста цепи формируемых структур, в том числе за счет образования циклических объектов. Полученные результаты не только подтверждают, что введение выпетленных ненуклеотидных вставок приводит к изгибу спирали ДНК-дуплексов, но и говорят в пользу перспективности использования мостиковых олигонуклеотидов для построения структур нетипичной формы.

3. Мостиковые олигонуклеотиды в качестве компонентов субстратных комплексов в реакциях с участием ДНК-зависимых ферментов (7а</ ДНК-полимеразы и Т4 ДНК-лигазы)

Ранее было показано использование мостиковых олигонуклеотидов в качестве превращаемых компонентов субстратных комплексов в реакциях ДНК-зависимых ферментов [Пышный Д.В. и др. Патент РФ №2259402 от 27.08.2005]. В представленной работе проведен дополнительный анализ субстратных свойств комплексов мостиковых олигонуклеотидов в реакциях с участием Тац ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы фага Т4.

Точность включения с1\ТР в состав нативных и мостиковых олигонуклеотидов при их ограниченном удлинении Тац ДНК-полимеразой оценивали по эффективности удлинения 12-звенных 32Р-меченных нативно-го р!М12 и мостиковых р^(ОЕС^5, рКбфЕв^б олигонуклеотидов на

матрицах М20(ш) в присутствии каждого из четырех дезоксирибонуклео-зид-5'-трифосфатов (сШТР), взятых по отдельности (схема 3).

M20W ------------1--------------Схема 3.

М20(я) ------------а-------

M20fe) ------------д-------

М20(с) 3' GTCGAGGTCCGTcGTAGTTC5'

pN12 pCAGCTCCAGGCA ^ пол1шсраза 5 'pCAGCTCCAGGCAdNMP pN7(DEGt)N5 5'pCAGCTCCVAGGCA dNTP 5'pCAGCTCC*AGGCAdMMP

pN6(DEGt)N6 5'pCAGCТС^ CAGGCA 5' pCAGCTC ^CAGGCAdNMP

dNTP - один из дезоксирибонуклшзид-5'-трифосфатов: dATP, dTTP, dCTP или dGTP * - положение DEG,

Эффективное удлинение нативного зонда pN12 наблюдали практически во всех случаях, вне зависимости от комплементарного соответствия между добавляемым и соответствующим матричным нуклеотидами (рис. 7). Эффективность встраивания некомплементарного нуклеотида в некоторых системах достигала 70-80%. В тех же условиях эффективное удлинение каждого из рассмотренных мостиковых зондов наблюдалось только при реализации полного соответствия между включаемым нуклеотидом и соответствующим звеном в ДНК-матрице (рис. 7).

1-ПП1

А Т С G

Рис. 7. Степень удлинения нативного рМ2 и модифицированных рШфЕС^б и р^(ОЕС,)К5 олигонуклеотидов на матрицах М20(ш) в присутствии отдельно взятых сМГР. Условия удлинения. 67 мМ трис-НС1 (рН 8.85), 16 мМ (Ш^О,,, 1.5 мМ МяС12, 0.085 мг/мл БСА, 0.01% Т\уееп-20, 5 мМ ДТТ, 1 ед. акт. Тещ полимеразы, [32рМ2], [32рЩОЕС,)№], [32Рт(ОЕС,^51 = 1 мкМ, [М20(ш)] = 10 мкМ, [сШТР] = 0.2 мМ, 50°С, 30 мин.

Для количественной оценки точности удлинения зондов на матрице М20(^ были рассчитаны соотношения скоростей встраивания нуклеотидов: комплементарного (с1АТР) и некомплементарного (сГГТР) первому нуклео-тиду матричной цепи. Рассчитанная подобным образом точность ограниченного удлинения мостиковых олигонуклеотидов в 1.6 раз выше относительно точности превращения нативного зонда.

Дискриминация однонуклеотидных несоответствий в составе субстратных комплексов, содержащих ненуклеотидную вставку в структуре Р-компонента, в реакциях лигирования Т4 ДНК-лигазой была исследована на модельных дуплексах, образованных 20-звенной матрицей Т20±т, нативным рШ2 или модифицированным р^фЕв])^ 12-звенными Р-компонентами и 8-звенным 32Р-меченным ОН-компонентом рМ (рис. 8а). Однонуклеотидные замены (мисматчи) в матрицах находились в участках, взаимодействующих с Р- или ОН-компонентами (матрицы Т20+Ш или Т20-Ш соответственно).

^ 100 п

с*

з 80 -

сз

О С. 60 -

U 40 -

D 20 -

и f- о 0 -

В pN12 □ pN8(DEGl)N4

_ Tf ir, с

т +

S S 2 н н н н

модифицированного

а б

Т20+9 ----------------1---

Т20+5 ------------1-------

Т20+4 -----------1--------

Т20-4 ----1---------------

T20-1 -------1------------

T20 3 'CGTAGTTCGTCGAGGTCCGT5'

5 'pCAGCTCCAGGCA pN12

5' pCAGCTCCA* GGCA pN8 pGCATCAAG3' pN8(DEG,)N4

* - положение DEG, ^

Рис. 8. Лигирование нативного T20±m/pN12+pN8 T20±m/pN8(DEGi)N4+pN8 ДНК-комплексов T4 ДНК-лигазой. Модельные тандем-ные комплексы (а) и степень лигирования (б). Условия лигирования: 20 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 0.1 М NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 40 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы, [Т20±ш] = 10 мкМ, [32pN8] = 5 мкМ, [pN12], [pN8(DEG,)N4] = 10 мкМ, 25°С, 30 мин.

Было показано снижение степени лигирования комплексов T20+m/pN8(DEGI)N4+pN8 (m= 4, 5). При лигировании тандема нативных олигонуклеотидов эти точечные замены дискриминируются менее эффективно. Кроме того, детектировали повышение эффективности дискриминации одиночных мисматчей в дуплексной части ОН-составляющей (матрицы Т20-1, Т20-4) (рис. 86).

Определение кинетических параметров реакций лигирования нативных и модифицированных ДНК-субстратов, проводимых с помощью Т4 ДНК-лигазы в стационарном и предстационарном режимах. Для установления влияния ненуклеотидной вставки на стадии ферментативной реакции были определены кинетические параметры превращения нативных и модифицированных ДНК-субстратов на примере реакции лигирования с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Модельные дуплексы формировали с помощью 20-звенных матриц М20, 5'-32Р-меченного октамера pN8 в качестве фосфат-содержащего компонента и нативного N12 или мостикового N6(DEG¡)N6 додекануклеотидов в роли ОН-составляющей субстратного

комплекса. Влияние мисматчей на протекание реакции лигирования исследовали на примере матриц, содержащих однонуклеотидные несоответствия в -6 положении связывания ОН-компонента (М20-6), а также в +1 позиции связывания Р-компонента (М20+1) (схема 4).

Изначально в стационарном режиме в рамках стандартной схемы Миха-элиса-Ментен были определены константа Михаэлиса К„ и каталитическая константа кса, (табл. 2).

Таблица. 2. Кинетические параметры лигирования совершенных и несовершенных комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов Т4 ДНК-лигазой.

ДНК-субстрат K„„ мкМ kcah мин'1 kcaJKm, mkM''mhh"' ^fecaJ^m ^комплемент

( ^cat^m ^мисматч

M20/N12 0.65 ± 0.02 78.3 ±11.7 120 ±22 -

M20-6/N12 0.34 ± 0.03 18.1 ±0.4 53 ±6 2.3 ±0.7

M20+1/N12 1.47 ±0.14 1.7 ±0.1 1.2 ±0.2 100 ± 34

M20/N6(DEG,)N6 0.15 ±0.02 14.4 ±0.1 96 ±14 -

M20-6/N6(DEG i)N6 6.15 ±0.01 14.9 ± 0.1 2.40 ± 0.02 40 ±6

M20+1/N6(DEG,)N6 2.0 ± 0.3 2.8 ±0.3 1.4 ±0.4 69 ±27

Условия лигирования: 66 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 1 мМ ДТТ, 5 мМ М§С12, 0.1 М №С1, 50 мкМ АТФ, 6 мкг/мл БСА, 0.02-0.1 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы, [рМ2], [рЩОЕС,)Щ = 5 мкМ, [32рЩ = 0.2-1 мкМ, [М20±ш] = 5 мкМ, 25°С, 1-35 мин.

При сравнении параметра Кт видно, что мисматч в первом положении участка связывания Р-компонента приводит к повышению в 2-3 раза значения константы для нативного и модифицированного субстратов. Мисматч или ненуклеотидная вставка в структуре ОН-компонента (комплексы М20-6/М2+рШ и МгОЛЧбфЕС^б+р^), приводят к снижению величины Кт в 1.8 и 4 раза соответственно. Наличие одновременно на расстоянии 6 нук-леотидов от одноцепочечного разрыва мисматча и модифицированного остатка (М20-6ЛЧ6(ВЕС])Ш+рШ) приводит к более значительному относительно других ДНК-субстратов изменению Кт, которая увеличивается в 9.5 раза. Мисматч вблизи одноцепочечного разрыва М20-1/1Ч12+рШ, М20-ХЛЧбфЕвОМ+рМ приводит к снижению параметра кса, в 28-46 раз. Любое нарушение регулярности структуры в -6 положении ДНК-комплексов М20-6/М2+рЩ М20ЛЧ6(БЕС,^6+рШ, также как и двойное возмущение М20-6ЛЧ6(ВЕС[)М+рШ, приводят к снижению кса, в 4-5 раз.

Таким образом, мисматч или модифицированный остаток приводят к изменению кинетических параметров реакции лигирования подобных субстратов относительно совершенного.

Схема 4.

М20+1 ------------1-------

М20-6 ------а-------------

М20-1 -----------о........

М20 3'GTCGAGGTCCGTCGTAGTTC5'

pGCATCAAG3' PN8

5 'CAGCTCCAGGCA N12

-'CAGCTCjCAGGCA N6(DEG,)N6

* - положение DEG,

С помощью выражения (кса,/Кт)ыыплшеЛкса,/Кт)„„сы!,1Ч был рассчитан параметр селективности фермента по отношению к паре совершенный/несовершенный олигонуклеотидный комплекс (табл. 2). Показано, что использование мостиковых олигонуклеотидов в качестве превращаемых компонентов субстратных комплексов приводит к повышению селективности дискриминации удаленных мисматчей. В рассмотренной системе эффективности дискриминации мисматча, удаленного на 6 нуклеотидов от сайта лигирования, увеличивается в 17.4±7.6 раза.

С использованием метода остановленной струи с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков триптофанов в молекуле фермента были определены кинетические параметры ферментативного превращения модифицированных субстратов под действием Т4 ДНК-лигазы в предстационарном режиме. Характер полученных кинетических кривых, характеризующих конформационные перестройки ДНК-лигазы при взаимодействии с ДНК-субстратами, демонстрирует, что реакция протекает, по крайней мере, в четыре регистрируемые по изменению интенсивности флуоресценции стадии (рис. 9).

М20+Ш6(ОЕС,)М Рис.

М20+Ш12

М20-6/ЩПЕС,)№ М20-6/1Ч12 М20ЛЧ6(ОЕС,)М М20ЛУ12

0.01

0.1 1

время, с

100

9. Экспериментальные и теоретические (гладкие) кинетические кривые, полученные при взаимодействии Т4 ДНК-лигазы (1 мкМ) с разными ДНК-

субстратами (2 мкМ). Теоретические кривые получены с использованием данных табл. 3.

Падение интенсивности флуоресценции на первом участке мы связываем с конформационными изменениями в молекуле фермента на стадии узнавания и специфического связывания с одноцепочечным разрывом в структуре ДНК-дуплекса. Второй стадией является аденилирование ДНК-субстрата. На третьей стадии происходит непосредственно образование фосфодиэфирной связи. Завершает процесс лигирования диссоциация фермента от ДНК-продукта, что сопровождается ростом интенсивности флуоресценции. Исходя из предполагаемой четырехстадийной схемы реакции, был произведен расчет констант элементарных стадий ферментативного лигирования (табл. 3).

Таблица 3. Константы скоростей элементарных стадий лигирования Т4 ДНК-лигазой нативных и модифицированных ДНК-субстратов.

Е- АМР+5+=±Е- АМР-5—^Е-АМР-Б—АМР-Р<=Ь±Е-АМР+Р

константы М20/ N12 М20/ МДОЕСОГО М20-6/ N12 М20-6/ ОТфЕС,)^ М20+1/ N12 М20+1/

А;,М"1-с"'-10б 225 ±9 225 ±2 114 ± 2 141 ±3 270 ±4 46.8 ± 1.3

А./, с 1 1.1 ±0.4 46.5 ±0.3 15.2 ±0.3 314± 30 24.6 ±0.2 29.8 ±0.3

кг, с1 0.80 ±0.01 2.03 ±0.02 1.16±0.03 1.37 ±0.09 0.56 ±0.05 0.21 ± 0.02

к3, с1 6.20 ±0.01 3.99 ±0.03 3.93 ±0.01 0.92 ±0.03 2.02 ±0.12 0.63 ± 0.03

к4, с-1 5.6 ±0.2 2.04 ±0.01 3.53 ±0.03 5.64 ±0.05 1.20 ±0.08 3.12 ±0.06

1.9 ±0.2 4.04 ±0.01 1.01 ±0.01 0.44 ±0.05 4.61 ±0.02 1.94 ±0.03

Ка, М'' -106 203 ± 26 4.84 ±0.07 7.5 ±0.3 0.45 ± 0.05 10.9 ±0.2 1.57 ±0.06

к*»,, М-10* 3.0 ±0.04 0.50 ±0.03 3.50 ±0.06 12.8 ± 1.6 0.26 ± 0.02 1.6 ± 0.1

Условия лигирования: 66 мМ трис-НС1 (рН 7.6), 1 мМ ДТТ, 5 мМ Р^С12, 50 мкМ АТФ, [Т4 ДНК-лигаза] = 1 мкМ, [ДНК-субстрат] = 0.5-4 мкМ, 20°С.

Введение любого из рассмотренных возмущений структуры ДНК-субстрата (мисматча и/или ненуклеотидной вставки) приводит к изменению эффективности протекания каждой стадии ферментативного процесса. Согласно полученным результатам значительное влияние нерегулярности структуры ДНК-дуплекса сказывается на этапе образования комплекса ДНК-субстрат/Т4 ДНК-лигаза. Равновесная константа связывания Ксе для любого из подобных ДНК-субстратов уменьшается относительно нативного комплекса в 18-451 раз. При этом наибольшее уменьшение Ксв детектируется в случае ДНК-субстрата с двойным возмущением М20-б/ЩЭЕС^б+рШ и М20+Ш6(ОЕС,)М+р^. Уменьшение константы скорости стадии образования фосфодиэфирной связи к3 также наблюдается для каждого из ДНК-субстратов с возмущениями, изменение данной величины происходит в 1.6-9.8 раз. Наиболее значительно падение скорости реакции третьей стадии также в случае ДНК-субстратов с двойным возмущением.

Полученные данные дополнили модель взаимодействия Т4 ДНК-лигазы с модифицированными совершенными и мисматч-содержащими ДНК-субстратами. Ненуклеотидная вставка на основе фосфодиэфира ди-этиленгликоля оказывает влияние на все регистрируемые стадии реакции лигирования. Введение модифицированного остатка в структуру ДНК-субстрата с некомплементарной парой приводит к наиболее значительному снижению равновесной константы связывания с ДНК-субстратом и константы скорости реакции образования фосфодиэфирной связи.

4. Мостиковые олигонуклеотиды в качестве зондов при выявлении комплементарной последовательности в дцПЦР-фрагменте

Ранее был создан подход по выявлению определенных последовательностей НК на основе метода молекулярной гибридизации с использованием в качестве зондов набора иммобилизованных мостиковых олигонуклеоти-дов [Пышная И.А. 2006]. Одна из проблем использования мостиковых оли-гонуклеотидов в подобных практических приложениях связана с их пониженными гибридизационными свойствами, что может уменьшать чувствительность анализа, особенно в случае структурированного фрагмента ДНК. В представленной работе разработаны методики снижения вероятности структурирования анализируемой НК за счет ее ограниченной фрагментации. Подобраны простые и воспроизводимые протоколы фрагментации ДНК, основанные на формировании в ДНК апуриновых/апиримидиновых сайтов с их последующей деградацией при термической обработке (см. подписи к рис. 10). Исследования проводили, используя в качестве матрицы продукт ПЦР, соответствующий участку 5'-нетранслируемой области РНК вируса гепатита С (5'-НТО РНК ВГС) подтипа 2а.

Кислотно-зависимую фрагментацию осуществляли в кислых условиях с образованием сайтов апуринизации с дальнейшей деградацией ДНК при термической обработке. Из радиоавтографа видно (рис. 10), что в выбранных условиях 32Р-меченный ДНК-фрагмент достаточно быстро деградирует. При увеличении времени инкубации ДНК в кислых условиях наблюдается образование более коротких фрагментов.

Рис. 10. Результаты электрофоретиче-ского анализа в 10% денатурирующем ПААГ продуктов фрагментации 5'-32Р-меченной дцДНК после кислотного и ферментативного гидролиза. Условия кислотного гидролиза: к ПЦР-образцу добавляли 1/5 объема 0.4 М НС1 до рН 2, 37°С, 5-60 минут. Затем рН доводили до значения 7, добавляя 1/10 объема 1 М трис-ОН, 95°С, 10 мин.

Условия ферментативной фрагментации: 60 мМ трис-НС1 (рН 7.6). 1 мМ ЭДТА, 2 ед. акт. ШО, 5 мкл ПЦР-смеси, полученной после реамплифи-кации ДНК-фрагмента в присутствии сШТР, 37°С, 30 мин; 95°С, 15 мин. сШТРМТТР - соотношение соответствующих сПМТР при проведении ПЦР.

рН 2.0, мин сШТР/сЛТР

_ _ N ^ « N

1/1 о О

НТ О "Л Г- Оооо^-сччо

¿•.г? ш %

30* 9

ш - тфё

21 <« ••Вчйя.» мнвр

Ферментативная фрагментация основана на использовании дезок-сиуридин-содержащей ДНК и фермента урацил-ДНК-гликозилазы (UDG), обеспечивающего формирование апиримидиновых сайтов в структуре НК. Степень фрагментации ДНК после обработки UDG определяется содержанием в ней dUMP-остатков и контролируется изменением соотношения dTTP и dUTP при проведении ПЦР (рис. 10).

Эффективность превращения мостиковых олигонуклеотидов на фрагментированных ДНК-матрицах с помощью Taq ДНК-полимеразы. Полученные химической и ферментативной фрагментацией ДНК-образцы без дополнительной очистки использовали в качестве анализируемого материала (рис. II). Гибридизационный анализ проводили путем ограниченного удлинения Taq полимеразой иммобилизованных зондов со встраиванием биотиновой метки в составе дезоксиуридин-трифосфата. Полимер, содержащий биотинилированный продукт, проявляли с помощью конъюга-та стрептавидин-щелочная фосфатаза и хромогенных субстратов.

При гибридизационном анализе в присутствии нефрагментированного ПЦР-продукта наблюдали слабое окрашивание полимера. Использование фрагментированных матриц приводило к увеличению интенсивности сигнала гибридизации. При UDG-зависимой фрагментации эффективность анализа возрастала в 8 раз, а при кислотной в 4 раза по сравнению с использованием необработанного фрагмента ДНК (рис. 11).

s s

и О 5 30 60 u 0 0.2 0.6 1.2

время кислотной обработки, мин соотношение сШТР/с1ТТР

Рис. 11. Эффективность гибридизационного анализа в присутствии нативной анализируемой дцДНК или фрагментированной в результате кислотной (а) или ферментативной обработки (б). Условия гибридизации: 10 мМ трис-НС1 (рН 8.9), 50 мМ КС1, 0.1% Т\уееп-20, 1.8 мМ ]У^С12, 1.5 ед. акт. Taq полимеразы, 10 мкМ dUTP-Blo, 50 мкМ dATP, полимер с иммобилизованным зондом Р*2а (0.5 мг), в качестве матрицы использовали разбавленную в 20 раз ПЦР-смесь, содержащую нативный или фрагментированный ДНК-ампликон (не менее 0.04 мкМ). 20 циклов: 80СС, 30 с; 40°С, 3 мин; 50°С, 1 мин. Зонд Р*2а САСТС.ТАТОС.ССООСС, * - ОЕв,.

Была исследована специфичность сигнала гибридизации при параллельном выявлении фрагментированной ДНК с использованием набора зондов на основе мостиковых олигонуклеотидов, последовательности которых соответствует разным генотип-специфичным вариантам анализируемого участка 5'-НТО РНК ВГС (Р*1, Р*2а, Р*2Ь, Р*3а, Р*ЗЬ) [Викк J. е/ а!. 1992]. Показано, что удлинение модифицированных зондов происходит высокоселективно: в присутствии матрицы, соответствующей генотипу 2а, происходит удлинение только комплементарного зонда Р*2а (рис. 12)

Р*1 Р*2а Р*2Ь Р*3а Р*ЗЬ

11+

<штр

(1ТТР

-р I

р , ! §111 Щ • ■«;.' 1

5 мин }.:! :,ВВ| I • !1 |

30 мин * АШ(

60 мин V ¡.: >!-й>? Р

0.2 14. Л;:«

0.6 тт 1 # ■:! •-

1.2 . л-Ф | 1 Г

Рис. 12. Сканированное изображение полимеров с иммобилизованными зондами: Р*1, Р*2а, Р*2Ь, Р*3а, Р*ЗЬ - после проведения гибридизационного анализа в присутствии нативной Р и фрагментированной ДНК-пробы (генотип ВГС 2а). Условия гибридизации см. в подписи к рис. 11. Зонды:

Р*1 СОСТС.ААТОС.СТСОАО Р*2а САСТС.ТАТОС.ССйОСС Р*2Ь САСТС.ТАТОТ.ССООТС Р*3а СОСТС-ААТАС.ССАОАА р*зь с с С ТС * А А т о с. С С О О А А * — БЕС,.

Таким образом, фрагментация ДНК повышает чувствительность гете-рофазного гибридизационного анализа, и позволяет привлекать конструкции на основе мостиковых олигонуклеотидов, обладающих пониженными комплексообразующими свойствами, в качестве высокоселективных зондов, а следовательно, повышать точность анализа.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы конформационные свойства ДНК-дуплексов, содержащих выпетливания.

• Показано, что выпетливания на основе ненуклеотидных вставок (фос-фодиэфиров диэтиленгликоля, 1,10-декандиола, 1,12-додекандиола, 3-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана), как и на основе нуклеотид-ных звеньев (аденилатов и тимидилатов), приводят к изгибу линейной структуры дуплекса. Величина изгиба в случае ненуклеотидных выпетли-ваний варьирует в пределах 20°-61°.

• Установлено, что величину изгиба и степень термической дестабилизации дцДНК можно задавать, варьируя размер и тип ненуклеотидных вставок в составе цепей ДНК-дуплекса.

2. Продемонстрировано формирование ДНК-объектов нетривиальной формы с использованием ДНК-дуплексов с ненуклеотидными вставками на основе фосфодиэфиров диэтиленгликоля и 1,10-декандиола.

• Выявлено, что наличие ненуклеотидных вставок в составе мономерных ДНК-дуплексов, формирующих конкатемерные структуры, способствует самоограничению роста цепи ДНК-конкатемера и образованию циклических дцДНК.

• Подобраны условия для анализа ДНК-конкатемеров методом атомно-силовой микроскопии. На основе анализа АСМ-изображений установлено, что доля циклических ДНК-конкатемеров на основе модифицированных ДНК-дуплексов составляет 35%.

3. Исследованы субстратные свойства ДНК-комплексов, сформированных на основе мостиковых олигонуклеотидов, содержащих ненуклеотид-ные вставки, в реакциях ДНК-зависимых ферментов (ДНК-лигазы фага Т4 и Taq ДНК-полимеразы).

• Показано, что в условиях минисеквенирования точность удлинения Taq полимеразой мостикового олигомера, рассчитанная как соотношение скоростей включения соответствующего и некомплементарного нуклеоти-дов, в 1.6 раза выше относительно точности элонгации нативного зонда.

• Установлено, что ненуклеотидная вставка в структуре Р-компонента лигируемого тандемного комплекса ДНК приводит к повышению эффективности дискриминации однонуклеотидных несоответствий в дуплексной части Р- и ОН-компонентов.

• Определены кинетические параметры ферментативного превращения под действием Т4 ДНК-лигазы совершенных и несовершенных ДНК-субстратов, сформированных на основе мостиковых олигонуклеотидов, в стационарном и предстационарном режимах. Показано, что:

- введение ненуклеотидной вставки в структуру совершенного ДНК-субстрата приводит к замедлению всех регистрируемых этапов ферментативного лигирования относительно нативного субстрата;

- дискриминация мисматчей при лигирования модифицированных несовершенных ДНК-субстратов происходит как на стадии формирования комплекса фермент/ДНК-субстрат, так и на стадии лигирования.

4. Предложены способы повышения эффективности гибридизационно-го анализа ДНК, проводимого с участием мостиковых олигонуклеотидов в качестве зондов.

• Разработаны способы снижения вероятности структурирования дцДНК путем ее ограниченной фрагментации с помощью кислотной (выдерживание при рН 2) и ферментативной (обработка урацил-ДНК-гликозилазой) деградации ДНК.

• Показано, что использование фрагментированной ДНК повышает интенсивность сигнала гибридизационного анализа в случае ферментативной фрагментации в 8 раз, а при кислотной в 4 раза по сравнению с использованием нативного фрагмента ДНК, использование мостиковых зондов обеспечивает селективное распознавание анализируемой фрагментированной ДНК.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Виноградова O.A., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Пышный Д.В. Повышение эффективности гибридизационного анализа путём ограниченной фрагментации ДНК-пробы // Молекуляр. биология. -2007. - Т. 41. - С. 163-172.

2. Виноградова O.A., Еремеева Е.В., Ломзов A.A., Пышная И.А., Пышный Д.В. Конструирование изогнутых дцДНК с заданными геометрическими характеристиками на основе комплексов мостиковых олигонуклеотидов // Биоорган, химия. - 2009. - Т. 35. - С. 384-396.

3. Пышная И.А., Виноградова O.A.. Кабилов М.Р., Иванова Е.М., Пышный Д.В. Мостиковые олигонуклеотиды - молекулярные зонды для исследования фермент-субстратного взаимодействия и аллельспецифичного анализа ДНК // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - С. 1238-1251.

4. Виноградова O.A.. Пышный Д.В. Селективность ферментативного превращения олигонуклеотидных зондов при анализе нуклеотидных полиморфизмов ДНК // Acta Naturae. - 2010. - Т. 2. - С. 40-58.

5. Виноградова O.A.. Щеглов Д.В., Латышев A.B., Пышный Д.В. Изучение структурной организации конкатемерных комплексов на основе на-тивных и модифицированных дцДНК-блоков // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицины. - 2011. - Т. 9. - С. 109-117.

6. Виноградова O.A.. Пышная И.А., Пышный Д.В. Точность действия ДНК-полимеразы на субстратных комплексах ДНК с возмущенной структурой // Труды 3-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки». Ч. 29: Биология. Из-во СГТУ. - 2007. - С. 15-19.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Виноградова, Ольга Александровна

Список сокращений

1. Введение

2. Принципы регулирования структуры и функций олигонуклеотидных ДНК- 9 дуплексов в структурной ДНК-нанотехнологии и гибридизационном анализе обзор литературы)

2.1. Структурная ДНК-нанотехнология. Принципы конструирования 9 нанообъектов на основе нативных и модифицированных молекул ДНК

2.1.1. Принципы формирования ДНК-блоков

2.1.1.1. Разветвленные ДНК-блоки на основе нативных олигонуклеотидов

2.1.1.2. ДНК-блоки с использованием дополнительных конструктивных 13 элементов

2.1.2. Статические ДНК-наноструктуры

2.1.2.1. Дискретные ДНК-объекты

2.1.2.1.1. Двухмерные замкнутые ДНК-структуры

2.1.2.1.2. Трехмерные ДНК-многогранники

2.1.2.2. Периодические ДНК-матрицы

2.1.2.2.1. ДНК-решетки

2.1.2.2.2. ДНК-нанотрубки

2.1.2.3. ДНК-оригами

2.1.3. Перспективы практического применения ДНК-наноконструкций

2.2. Гибридизационный анализ. Структура олигонуклеотидных зондов как 55 фактор, влияющий на селективность выявления нуклеотидных полиморфизмов в ДНК

2.2.1. Проблемы селективности ДНК-зависимых ферментов по отношению к 56 некомплементарным парам в структуре нативного ДНК-субстрата

2.2.2. Возмущение структуры ДНК-субстрата как способ повышения 62 селективности ферментативной реакции

2.2.2.1. Влияние структуры олигонуклеотидных зондов на селективность 62 ферментативной реакции

2.2.2.2. Введение дополнительного олигонуклеотидного несоответствия в 63 структуру ДНК-субстрата как способ повышения селективности

2.2.2.3. Модификации олигонуклеотидов, повышающие селективность 64 превращения ДНК-субстратов под действием ДНК-зависимых ферментов

2.2.2.3.1. Модификации гетероциклических оснований

2.2.2.3.2. Модификации углеводного остатка

2.2.2.3.3. Модификации межнуклеотидного фосфодиэфирного остатка

Введение диссертация по химии, на тему "Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов"

Модифицированные аналоги природных нуклеиновых кислот (НК) уже давно стали незаменимыми инструментами во многих исследовательских и практических молекулярно-биологических приложениях [1, 2]. Основная причина повышенного интереса к модифицированным НК заключается в том, что введение остатков органических молекул в регулярную структуру нуклеиновых кислот позволяет направленно изменять их функциональные характеристики (физико-химические и структурные свойства), сохраняя при этом способность к комплементарным взаимодействиям [3-6].

Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН были предложены мостиковые олигонуклеотиды, представляющие собой олигонуклеотидные конструкции, состоящие из нативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотидными вставками. Данные модифицированные остатки не затрагивают комплементарные взаимодействия между основаниями и не имеют выраженной сиквенс-специфичности. Были определены термодинамические параметры комплексообразования мостиковых олигонуклеотидов, описаны некоторые структурные характеристики комплексов на их основе, начато исследование субстратных свойств в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами. Была показана возможность получения производных олигонуклеотидов с заданными гибридизационными свойствами, определяемыми за счет введения ненуклеотидных вставок. Установлено влияние позиции неприродного остатка в структуре олигонуклеотида на эффективность процессирования модифицированных субстратов ДНК-лигазами и ДНК-полимеразами. Показана повышенная селективность ферментативных реакций в случае использования мостиковых олигонуклеотидов в качестве превращаемых компонентов субстратных комплексов ДНК [7-11].

Представленная работа является продолжением серии работ по исследованию свойств мостиковых олигонуклеотидов и ДНК-комплексов на их основе и направлена на изучение причин наблюдаемых изменений гибридизационных и субстратных свойств олигонуклеотидных производных. Исследования будут полезны как для установления принципиальных особенностей формирования комплексов на основе мостиковых олигонуклеотидов, так и могут обеспечить расширение практической значимости подобных олигонуклеотидных конструкций.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлось исследование характера возмущений, вносимых в структуру ДНК-дуплекса ненуклеотидной вставкой на основе фосфодиэфиров олигометилендиолов и олигоэтиленгликолей, с точки зрения изучения субстратных и конформационных свойств комплексов мостиковых олигонуклеотидов для их последующего использования в гибридизационном анализе и для направленного изменения формы ДНК-структур.

В ходе исследования решали следующие задачи:

- изучение субстратных свойств модифицированных дуплексов ДНК в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами, определение кинетических параметров лигирования совершенных и содержащих однонуклеотидное несоответствие модифицированных ДНК-субстратов под действием ДНК-лигазы фага Т4;

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

5. ВЫВОДЫ

1. Исследованы конформационные свойства ДНК-дуплексов, содержащих выпетливания.

• Показано, что выпетливания на основе ненуклеотидных вставок (фосфодиэфиров диэтиленглико ля, 1,10-декандиола, 1,12-до декан дио ла, 3 -гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана), как и на основе нуклеотидных звеньев (аденилатов и тимидилатов), приводят к изгибу линейной структуры дуплекса. Величина изгиба в случае ненуклеотидных выпетливаний варьирует в пределах 20°-61°.

3. Исследованы субстратные свойства ДНК-комплексов, сформированных на основе мостиковых олигонуклеотидов, содержащих ненуклеотидные вставки, в реакциях ДНК-зависимых ферментов (ДНК-лигазы фага Т4 и Taq ДНК-полимеразы).

• Показано, что в условиях минисеквенирования точность удлинения Taq полимеразой мостикового олигомера, рассчитанная как соотношение скоростей включения соответствующего и некомплементарного нуклеотидов, в 1.6 раза выше относительно точности элонгации нативного зонда.

Показано, что:

4. Предложены способы повышения эффективности гибридизационного анализа ДНК, проводимого с участием мостиковых олигонуклеотидов в качестве зондов.

4.5. Заключение

В представленной работе проведено исследование характера возмущений, вносимых в структуру ДНК-комплексов в результате введения ненуклеотидной вставки и приводящих к изменению субстратных и конформационных свойств модифицированных дуплексов ДНК. Показано, что ненуклеотидное выпетливание в составе ДНК-дуплекса приводит к изгибу основной оси модифицированного ДНК-фрагмента в месте введения остатка. Наличие изгиба, в свою очередь, сказывается на изменении субстратных свойств комплексов мостиковых олигонуклеотидов в реакциях с участием ДНК-процессирующих ферментов, приводя, с одной стороны, к снижению эффективности их превращения относительно нативных, и, с другой, к повышению способности дискриминирования однонуклеотидных несоответствий в последовательности матричной цепи. При исследовании кинетических параметров ферментативного превращения модифицированных совершенных и содержащих нуклеотидные несоответствия комплексов ДНК было установлено, что влияние ненуклеотидного звена на эффективность процессирования ДНК-субстратов происходит как на стадии узнавания ферментом субстратов, так и на стадии катализа. При этом влияние выпётленного изгибающего остатка особенно выражено проявляется на этапе формирования фермент/субстратного комплекса. Наличие двойного возмущения в виде мисматча и ненуклеотидной вставки приводит к более значительному снижению эффективности процессирования подобных субстратов.

Полученные данные в значительной степени расширяют понимание функциональных особенностей мостиковых олигонуклеотидов. На основе исследованных особенностей была продемонстрирована возможность использования мостиковых олигонуклеотидов для конструирования ДНК-объектов с особой формой, отличающейся от формы структур, полученных с помощью нативных ДНК-дуплексов, а также в качестве высокоселективных зондов в гибридизационном анализе, в том числе, проводимом в присутствии высокоструктурированного дцДНК-фрагмента. Для повышения чувствительности гетерофазного гибридизационного анализа с участием мостиковых олигонуклеотидных зондов были предложены способы статистической фрагментации дцДНК-пробы.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Виноградова, Ольга Александровна, Новосибирск

1. Gallo М., Montserrat J.M., Iribarre A.M. Design and applications of modified oligonucleotides//Braz. J. Med. Biol. Res. 2003. V. 36. P. 143-151.

2. Valoczi A., Hornyik C., Varga N., Burgyan J., Kauppinen S., Havelda Z. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. el75.

3. Freier S.M., Altmann K.-H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4429-4443.

4. Nguyen H.-K., Auffray P., Asseline U., Dupret D., Thuong N.T. Modification of DNA duplexes to smooth their thermal stability independently of their base content for DNA sequencing by hybridization //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3059-3065.

5. Wengel J. Nucleic acid nanotechnology towards Angstrom-scale engineering // Org. Biomol. Chem. 2004. V. 2. P. 277-280.

6. Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucl. Nucl. Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 1065-1071.

7. Пышный Д.В., Иванова E.M., Пышная И.А., Зарытова В.Ф. Способ выявления анализируемой последовательности ДНК // Патент на изобретение №2259402 от 27.08.2005.

8. Ломзов А.А., Пышная И.А., Иванова Е.М., Пышный Д.В. Термодинамические параметры для расчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклеотидов // Док. Акад. Наук. 2006. Т. 409. С. 266-270.

9. Pyshnyi D.V., Lomzov А.А., Pyshnaya I.A., Ivanova E.M. Hybridization of the bridged oligonucleotides with DNA: thermodynamic and kinetic studies // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23. P. 567-580.

10. Пышная И.А. «Мостиковые» олигонуклеотиды как перспективные инструменты в антисенс технологии и ДНК-диагностике // Диссертация кандидата химических наук. Новосибирск. ИХБФМ СО РАН. 2006.

11. Baumann C.G., Smith S.B., Bloomfield V.A., Bustamante С. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 6185-6190.

12. SeemanN.C. Nucleic acid junctions and lattices // J. Theor. Biol. 1982. V. 99. P. 237-247.

13. Kallenbach N.R., Ma R.-I., Seeman N.C. An immobile nucleic acid junction constructed from oligonucleotides //Nature. 1983. V. 305. P. 829-831.

14. Ma R.-I., Kallenbach N.R., Sheardy R.D., Petrillo M.L., Seeman N.C. Three-arm nucleic acid junctions are flexible //Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 9745-9753.

15. Tosch P., Walti C., Middelberg A.P.J., Davies A.G. Generic technique to generate large branched DNA complexes // Biomacromolecules. 2006. V. 7. P. 677-681.

16. Petrillo M.L., Newton C.J., Cunningham R.P. The ligation and flexibility of four-arm DNA junctions//Biopolymers. 1988. V. 27. P. 1337-1352.

17. Eis P.S., Millar D.P. Conformational distributions of a four-way DNA junction revealed by time-resolved fluorescence resonance energy transfer // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 13852-13860.

18. Wang Y., Mueller J.E., Kemper В., Seeman N.C. Assembly and characterization of five-arm and six-arm DNA branched junctions // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 5667-5674.

19. Wang X., Seeman N.C. Assembly and characterization of 8-arm and 12-arm DNA branched junctions // J. Am. Chem. Soc. 2007. Y. 129. P. 8169-8176.

20. Fu T.-J., Seeman N.C. DNA double-crossover molecules // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 3211-3220.

21. Li X., Yang X., Qi J., Seeman N.C. Antiparallel DNA double crossover molecules as components for nanoconstruction // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 6131-6140.

22. Seeman N.C. DNA nicks and nodes and nanotechnology // Nano Lett. 2001. V. l.P. 2226.

23. Zhang X., Yan H., Shen Z., Seeman N.C. Paranemic cohesion of topologically-closed DNA molecules // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 12940-12941.

24. Shen Z., Yan H., Wang T., Seeman N.C. Paranemic crossover DNA: a generalized Holliday structure with applications in nanotechnology // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 1666-1674.

25. Liu Y., Ke Y., Yan H. Self-assembly of symmetric finite-size DNA nanoarrays // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 17140-17141.

26. Ke Y., Liu Y., Zhang J., Yan H. A study of DNA tube formation mechanisms using 4-, 8-, and 12-helix DNA nanostructures // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 4414-4421.

27. Wei B., Mi Y. A new triple crossover triangle (TXT) motif for DNA self-assembly // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2528-2532.

28. Yan II., Park S.H., Finkelstein G., Reif J.H., LaBean T.H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires // Science. 2003. V. 301. P. 1882-1884.

29. He Y., Tian Y., Chen Y., Deng Z., Ribbe A.E., Mao C. Sequence symmetry as a tool for designing DNA nanostructures // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005. V. 44. P. 6694-6696.

30. He Y., Ye T., Su M., Zhang C., Ribbe A.E., Jiang W., Mao C. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra // Nature. 2008. V. 452. P. 198-202.

31. Zhang C., Su M., He Y., Zhao X., Fang P., Ribbe A.E., Jiang W., Mao C. Conformational flexibility facilitates self-assembly of complex DNA nanostructures // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105. P. 10665-10669.

32. Kahn J.D., Crothers D.M. Protein-induced bending and DNA cyclization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89. P. 6343-6347.

33. Lyubchenko Y., Shlyakhtenko L., Chernov B., Harrington R.E. DNA bending induced by Cro protein binding as demonstrated by gel electrophoresis // Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 5331-5334.

34. Muller B., Burdett I., West S.C. Unusual stability of recombination intermediates made by Escherichia coli RecA protein // EMBO J. 1992. V. 11. P. 2685-2693.

35. Tian Y., He Y., Ribbe A.E., Mao C. Preparation of branched structures with long DNA duplex arms // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 3404-3405.

36. Hansma H.G., Oroudjev E., Baudrey S., Jaeger L. TectoRNA and 'kissing-loop' RNA: atomic force microscopy of self-assembling RNA structures // J. Microsc. 2003. V. 212. P. 273-279.

37. Nasalean L., Baudrey S., Leontis N.B., Jaeger L. Controlling RNA self-assembly to form filaments //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 1381-1392.

38. Horiya S., Li X., Kawai G., Saito R., Katoh A., Kobayashi K., Harada K. RNA LEGO: magnesium-dependent formation of specific RNA assemblies through kissing interactions // Chem. Biol. 2003. V. 10. P. 645-654.

39. Aldaye F.A., Sleiman H.F. Sequential self-assembly of a DNA hexagon as a template for the organization of gold nanoparticles //Angew. Chem. Int. Ed. 2006. V. 45. 2204-2209.

40. Shi J., Bergstrom D.E. Assembly of novel DNA cycles with rigid tetrahedral linkers // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 1997. V. 36. P. 111-113.

41. Scheffler M., Dorenbeck A., Jordan S., Wustefeld M., von Kiedrowski G. Self-assembly of trisoligonucleotidyls: the case for nano-acetylene and nano-cyclobutadiene // Angew. Chem. Int. Ed. 1999. V. 38. P. 3311-3315.

42. Shchepinov M.S., Mir K.U., Elder J.K., Frank-Kamenetskii M.D., Southern E.M. Oligonucleotide dendrimers: stable nano-structures // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3035-3041.

43. Ivanov S.A., Volkov E.M., Oretskaya T.S., Muller S. Chemical synthesis of an artificially branched hairpin ribozyme variant with RNA cleavage activity // Tetrahedron. 2004. V. 60. P. 9273-9281.

44. Dolinnaya N., Gryaznov S., Ahle D., Chang C.-A., Shabarova Z.A., Urdea M.S., Horn T. Construction of branched DNA (bDNA) molecules by chemical ligation // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. V. 4. P. 1011-1018.

45. Horn T., Chang C.-A., Urdea M.S. Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4842-4849.

46. Braich R.S., Damha M.J. Regiospecific solid-phase synthesis of branched oligonucleotides. Effect oLvicinal2',5'r(or 2',3'-) and 3',5'-phosphodiesterJinkagesorL the formation ofhairpin DNA // Bioconjugate Chem. 1997. V. 8. P. 370-377.

47. Shchepinov M.S., Udalova I.A., Bridgman A.J., Southern E.M. Oligonucleotide dendrimers: synthesis and use as polylabelled DNA probes // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4447-4454.

48. Zimmermann J., Cebulla M.P.J., Monninghoff S., von Kiedrowski G. Self-assembly of a DNA dodecahedron from 20 trisoligonucleotides with C3h linkers // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 3626-3630.

49. Eckardt L.H., Naumann K., Pankau W.M., Rein M., Schweitzer M., Windhab N., von Kiedrowski G. Chemical copying of connectivity //Nature. 2002. V. 420. P. 286.

50. Gothelf K.V., Thomsen A., Nielsen M., Clo E., Brown R.S. Modular DNA-programmed assembly of linear and branched conjugated nanostructures // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 1044-1046.

51. Gothelf K.V., Brown R.S. A modular approach to DNA-programmed self-assembly of macromolecular nanostructures // Chem. Eur. J. 2005. V. 11. P. 1062-1069.

52. Endo M., Majima T. Parallel, double-helix DNA nanostructures using interstrand cross-linked oligonucleotides with bismaleimide linkers // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 5744-5747.

53. Endo M., Majima T. Control of a double helix DNA assembly by use of cross-linked oligonucleotides //J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 13654-13655.

54. Endo M., Majima T. Structural arrangement of DNA constrained by a cross-linker // Org. Biomol. Chem. 2005. V. 3. P. 3476-3478.

55. Endo M., Seeman N.C., Majima T. DNA tube structures controlled by a four-way-branched DNA connector// Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 6074-6077.

56. Endo M., Shiroyama T., Fujitsuka M., Majima T. Four-way-branched DNA-porphyrin conjugates for construction of four double-helix-DNA assembled structures // J. Org. Chem. 2005. V. 70. P. 7468-7472.

57. Dervan P.B. Molecular recognition of DNA by small molecules // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. P. 2215-2235.

58. Schmidt T.L., Nandi C.K., Rasched G., Parui P.P., Brutschy B., Famulok M., Heckel A. Polyamide struts for DNA architectures // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. V. 46. P. 43824384.

59. Rasched G., Ackermann D., Schmidt T.L., Broekmann P., Heckel A., Famulok M. DNA minicircles with gaps for versatile functionalization // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 967-970.

60. Vargas-Baca I., Mitra D., Zulyniak HJ., Banerjee J., Sleiman H.F. Solid-phase synthesis of transition metal linked, branched oligonucleotides // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V. 40. P. 4629-4632.

61. Mitra D., Cesare N.D., Sleiman H.F. Self-assembly of cyclic metal-DNA nanostructures using ruthenium tris(bipyridine)-branched oligonucleotides // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 5804-5808.

62. Choi J.S., Kang C.W., Jung K., Yang J.W., Kim Y.-G., Han H. Synthesis of DNA triangles with Vertexes of bis(terpyridine)iron(II) complexes // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 8606-8607.

63. Stewart K.M., McLaughlin L.W. Four-arm oligonucleotide Ni(II)-cyclam-centered complexes as precursors for the generation of supramolecular periodic assemblies // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 2050-2057.

64. Stewart K.M., Rojo J., McLaughlin L.W. Ru(II) tris(bipyridyl) complexes with six oligonucleotide arms as precursors for the generation of supramolecular assemblies // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 5808-5811.

65. Waybright S.M., Singleton C.P., Wächter K., Murphy C.J., Bunz U.H.F. Oligonucleotidedirected assembly of materials: defined oligomers^// J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. — 1828-1833.

66. Yang H., Sleiman H.F. Templated synthesis of highly stable, electroactive, and dynamic metal-DNA branched junctions // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 2443-2446.

67. Bhattacharryya A., Lilley D.M.J. The contrasting structures of mismatched DNA sequences containing looped-out bases (bulges) and multiple mismatches (bubbles) // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 6821-6840.

68. Rice J.A., Crothers D.M. DNA bending by the bulge defect // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4512-4516.

69. Joshua-Tor L., Frolow F., Appella E., Hope H., Rabinovich D., Sussman J.L. Three-dimensional structures of bulge-containing DNA fragments // J. Mol. Biol. 1992. V. 225. P. 397-431.

70. Kahn J.D., Yun E., Crothers D.M. Detection of localized DNA flexibility // Nature. 1994. V. 368. P. 163-166.

71. Rasched G., Ackermann D., Schmidt T.L., Broekmann P., Heckel A., Famulok M. DNA minicircles with gaps for versatile functionalization // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 967-970.

72. Ulanovsky L., Bodner M., Trifonov E.N., Choder M. Curved DNA: design, synthesis, and circularization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1986. V. 83. P. 862-866.

73. Han W., Dlakic M., Zhu Y.J., Lindsay S.M., Harrington R.E. Strained DNA is kinked by low concentrations of Zn2+ // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 10565-10570.

74. Hodges-Garcia Y., Hagerman P.J., Pettijohn D.E. DNA ring closure mediated by protein HU // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 14621-14632.

75. Amzallag A., Vaillant C., Jacob M., Unser M., Bednar J., Kahn J.D., Dubochet J., Stasiak A., Maddocks J.H. 3D reconstruction and comparison of shapes of DNA minicircles observed by cryo-electron microscopy // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. el25.

76. Niemeyer C.M., Adler M.A., Gao S., Chi L. Supramolecular nanocircles consisting of streptavidin and DNA // Angew. Chem. Int. Ed. 2000. V. 39. P. 3055-3059.

77. Lundberg E.P., El-Sagheer A.H., Kocalka P., Wilhelmsson L.M., Brown T., Norden B. A new fixation strategy for addressable nano-network building blocks // Chem. Commun. 2010. V. 46. P. 3714-3716.

78. Yang X., Wenzler L.A., Qi J., Li X., Seeman N.C. Ligation of DNA triangles containing double crossover molecules // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 9779-9786.

79. Chelyapov N., Brun Y., Gopalkrishnan M., Reishus D., Shaw B., Adleman L. DNA triangles and self-assembled hexagonal tilings // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 13924-13925.

80. Chen J.-H., Kallenbach N.R., Seeman N.C. A specific quadrilateral synthesized from DNA branched junctions // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 6402-6407.

81. Mao C., Sun W., Seeman N.C. Designed two-dimensional DNA Holliday junction arrays visualized by atomic force microscopy // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 5437-5443.

82. Brucale M., Zuccheri G., Rossi L., Bazzani A., Castellani G., Samori B. Characterization and modulation of the hierarchical self-assembly of nanostructured DNA tiles into supramolecular polymers // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 3427-3434.

83. Park S.H., Finkelstein G., LaBean T.H. Stepwise self-assembly of DNA tile lattices using dsDNA bridges//J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 40-41.

84. Aldaye F.A., Sleiman H.F. Dynamic DNA templates for discrete gold nanoparticle assemblies: control of geometry, modularity, write/erase and structural switching // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 4130-4131.

85. Goodman R.P., Berry R.M., Turberfield AJ. The single-step synthesis of a DNA tetrahedron// Chem. Commun. 2004. V. 12. P. 1372-1373.

86. Goodman R.P., Schaap I.A.T., Tardin C.F., Erben C.M., Berry R.M., Schmidt C.F., Turberfield A.J. Rapid chiral assembly of rigid DNA building blocks for molecular nanofabrication// Science. 2005. Y. 310. P. 1661-1665.

87. Li Z., Wei' B., Nangreave J., Lin C., Liu Y., Mi Y., Yan H. A replicable tetrahedral nanostructure self-assembled from a single DNA strand // J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 13093-13098.

88. Chen J., Seeman N.C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube // Nature. 1991. V. 350. P. 631-633.

89. Zhang C., Ko S.H., Su M., Leng Y., Ribbe A.E., Jiang W., Mao C. Symmetry controls the face geometry of DNA polyhedra// J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 1413-1415.

90. Shih W.M., Quispe J.D., Joyce G.F. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron //Nature. 2004. V. 427. P. 618-621.

91. He Y., Su M., Fang P., Zhang C., Ribbe A.E., Jiang W., Mao C. On the chirality of self-assembled DNA octahedral // Angew. Chem. Int. Ed. 2010. V. 49. P. 748-751.

92. Erben C.M., Goodman R.P., Turberfield A.J. A self-assembled DNA bipyramid // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 6992-6993.

93. Bhatia D., Mehtab S., Krishnan R., Indi S.S., Basu A., Krishnan Y. Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly // Angew. Chem. Int. Ed. 2009. V. 48. P. 4134^1137.

94. Matsuura K., Yamashita T., Igami Y., Kimizuka N. Nucleo-nanocages: designed ternary oligodeoxyribonucleotides spontaneously form nanosized DNA cages // ChemComm. 2003. V. 3. P. 376-377.

95. Aldaye F.A., Sleiman H.F. Modular access to structurally switchable 3D discrete DNA assemblies // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 13376-13377.

96. Zhang Y., Seeman N.C. Construction of a DNA-truncated octahedron // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 1661-1669.

97. Winfree E., Liu F., Wenzler L.A., Seeman N.C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals //Nature. 1998. V. 394. P. 539-544.

98. Yan H., LaBean T.H., Feng L., Reif J.H. Directed nucleation assembly of DNA tile complexes for barcode-patterned lattices // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. V. 100. P. 8103-8108.

99. Rothemund P.W.K., Papadakis N., Winfree E. Algorithmic self-assembly of DNA sierpinski triangles // PLoS Biol. 2004. V. 2. P. e424.

100. Liu H., He Y., Ribbe A.E., Mao C. Two-dimensional (2D) DNA crystals assembled from two DNA strands // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2943-2945.

101. Fujibayashi K., Hariadi R., Park S.H., Winfree E., Murata S. Toward reliable algorithmic self-assembly of DNA tiles: a fixed-width cellular automaton pattern //Nano Lett. 2007. V. 8. P. 1791-1797.

102. LaBean T.H., Yan H., Kopatsch J., Liu F., Winfree E., Reif J.H., Seeman N.C. Construction, analysis, ligation, and self-assembly of DNA triple crossover complexes // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 1848-1860.

103. He Y., Tian Y., Ribbe A.E., Mao C. Highly connected two-dimensional crystals of DNA six-point-stars//J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 15978-15979.

104. Park S.H., Yin P., Liu Y., Reif J.H., LaBean T.H., Yan H. Programmable DNA self-assemblies for nanoscale organization of ligands and proteins // Nano Lett. 2005. V. 5. P. 729-733.

105. He Y., Chen Y., Liu H., Ribbe A.E., Mao C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays //J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 12202-12203.

106. He Y., Mao C. Balancing flexibility and stress in DNA nanostructures // Chem. Commun. 2006. V. 9. P. 968-969.

107. He Y., Ko S.H., Tian Y., Ribbe A.E., Mao C. Complexity emerges from lattice overlapping: implications for nanopatterning// Small. 2008. V. 4. P. 1329-1331.

108. Liu D., Wang M., Deng Z., Walulu R., Mao C. Tensegrity: construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 2324-2325.

109. Zhang C., He Y., Chen Y., Ribbe A.E., Mao C. Aligning one-dimensional DNA duplexes into two-dimensional crystals //J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 14134-14135.

110. Liu H., Chen Y., He Y., Ribbe A.E., Mao C. Approaching the limit: can one DNA oligonucleotide assemble into large nanostructures? // Angew. Chem. Int. Ed. 2006. V. 45. P. 1942-1945.

111. Stewart K.M., McLaughlin L.W. Four-arm oligonucleotide Ni(II)-cyclam-centered complexes as precursors for the generation of supramolecular periodic assemblies // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 2050-2057.

112. Vails N., Uson I., Gouyette C., Subirana J.A. A cubic arrangement of DNA double helices based on nickel-guanine interactions // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 7812-7816.

113. Paukstelis P.J. Three-dimensional DNA crystals as molecular sieves // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 6794-6795.

114. Zheng J., Birktoft J.J., Chen Y., Wang T., Sha R., Constantinou P.E., Gineil S.L., Mao C., Seeman N.C. From molecular to macroscopic via the rational design of a self-assembled 3D DNA crystal // Nature. 2009. V. 461. P. 74-77.

115. Park S.-J., Lazarides A.A., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Directed assembly of periodic materials from protein and oligonucleotide-modified nanoparticle building blocks // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V. 40. P. 2909-2912.

116. Mitchell J.C., Harris J.R., Malo J., Bath J., Turberfield A.J. Self-assembly of chiral DNA nanotubes // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 16342-16343.

117. Rothemund P.W.K., Ekani-Nkodo A., Papadakis N., Kumar A., Fygenson D.K., Winfree E. Design and characterization of programmable DNA nanotubes // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 16344-16352.

118. Mathieu F., Liao S., Kopatsch J., Wang T., Mao C., Seeman N.C. Six-helix bundles designed from DNA //Nano Lett. 2005. V. 5. P. 661-665.

119. O'Neill P., Rothemund P.W.K., Kumar A., Fygenson D.K. Sturdier DNA nanotubes via ligation//Nano Lett. 2006. V. 6. P. 1379-1383.

120. Liu D., Park S.H., Reif J.H., LaBean T.FI. DNA nanotubes self-assembled from triple-crossover tiles as templates for conductive nanowires // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Y. 101. P. 717-722.

121. Kuzuya A., Wang R., Sha R., Seeman N.C. Six-helix and eight-helix DNA nanotubes assembled from half-tubes //Nano Lett. 2007. V. 7. P. 1757-1763.

122. Yin P., Hariadi R.F., Sahu S., Choi H.M.T., Park S.FI., LaBean T.H., Reif J.H. Programming DNA tube circumferences // Science. 2008. V. 321. P. 824-826.

123. Rothemund P.W.K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns // Nature. 2006. V. 440. P. 297-302.

124. Andersen E.S., Dong M., Nielsen M.M., Jahn K., Lind-Thomsen A., Mamdouh W., Gothelf K.V., Besenbacher F., Kjems J. DNA origami design of dolphin-shaped structures with flexible tails // ACS Nano. 2008. V. 2. P. 1213-1218.

125. Douglas S.M., Dietz H., Liedl T., Hogberg B., Graf F., Shih W.M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes //Nature. 2009. V. 459. P. 414-418.

126. Ke Y., Douglas S.M., Liu M., Sharma J., Cheng A., Leung A., Liu Y., Shih W.M., Yan H. Multilayer DNA origami packed on a square lattice // J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 15903-15908.

127. Douglas S.M., Chou J.J., Shih W.M. DNA-nanotube-induced alignment of membrane proteins for NMR structure determination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 6644-6648.

128. Hogberg B., Liedl T., Shih W.M. Folding DNA origami from a double-stranded source of scaffold//J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 9154-9155.

129. McConaughy B.L., Laird C.D., McCarthy B.J. Nucleic acid reassociation in formamide // Biochemistry. 1969. V. 8. P. 3289-3295.

130. Jungmann R., Liedl T., Sobey T.L., Shih W., Simmel F.C. Isothermal assembly of DNA origami structures using denaturing agents // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 1006210063.

131. Ke Y., Sharma J., Liu M., Jahn K., Liu Y., Yan H. Scaffolded DNA origami of a DNA tetrahedron molecular container // Nano Lett. 2009. V. 9. P. 2445-2447.

132. Kuzuya A., Komiyama M. Design and construction of a box-shaped 3D-DNA origami // Chem. Commun. 2009. V. 28. P. 4182-4184.

133. Keren K., Krueger M., Gilad R., Ben-Yoseph G., Sivan U., Braun E. Sequence-specific molecular lithography on single DNA molecules // Science. 2002. V. 297. P. 72-75.

134. Tanaka K., Tengeiji A., Kato T., Toyama N., Shionoya M. A discrete self-assembled metal array in artificial DNA // Science. 2003. V. 299. P. 1212-1213.

135. Tanaka K., Clever G.H., Takezawa Y., Yamado Y., Kaul C., Shionoya M., Carell T. Programmable self-assembly of metal ions inside artificial DNA duplexes // Nature. 2006. V. l.P. 190-194.

136. Clever G.H., Carell T. Controlled stacking of 10 transition-metal ions inside a DNA duplex // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. V. 46. P. 250-253.

137. Braun E., Eichen Y., Sivan U., Ben-Yoseph G. DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire //Nature. 1998. V. 391. P. 775-778.

138. Fischler M., Simon U., Nir H., Eichen Y., Burley G.A., Gierlich J., Grämlich P.M.E., Carell T. Formation of bimetallic Ag-Au nanowires by metallization of artificial DNA duplexes // Small. 2007. V. 3. P. 1049-1055.

139. Burley G.A., Gierlich J., Mofid M.R., Nir H„ Tal S., Eichen Y., Carell T. Directed DNA metallization//J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 1398-1399.

140. Becerril H.A., Stoltenberg R.M., Wheeler D.R., Davis R.C., Harb J.N., Woolley A.T. DNA-templated three-branched nanostructures for nanoelectronic devices // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 2828-2829.

141. Nishinaka T., Takano A., Doi Y., Hashimoto M., Nakamura A., Matsushita Y., Kumaki J., Yashima E. Conductive metal nanowires templated by the nucleoprotein filaments, complex of DNA and RecA protein // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 8120-8125.

142. Mirkin C.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic material //Nature. 1996. V. 382. P. 607-609.

143. Alivisator A.P., Johnsson K.P., Peng X., Wilson T.E., Loweth C.J., Bruchez M.P., Schultz P.G. Organization of nanocrystal molecules using DNA // Nature. 1996. V. 382. P. 609611.

144. Taton T.A., Mucic R.C., Mirkin C.A., Letsinger R.L. The DNA-mediated formation of supramolecular mono- and multilayered nanoparticle structures // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 6305-6306.

145. Sharma J., Chhabra R., Liu Y., Ke Y., Yan H. DNA-templated self-assembly of two-dimensional and periodical gold nanoparticle arrays // Angew. Chem. Int. Ed. 2006. V. 45. P. 730-735.

146. Zheng J., Constantinou P.E., Micheel C., Alivisatos A.P., Kiehl R.A., Seeman N.C. Two-dimensional nanoparticle arrays show the organizational power of robust DNA motifs // Nano Lett. 2006. V. 6. P. 1502-1504.

147. Pinto Y.Y., Le J.D., Seeman N.C., Musier-Forsyth K., Taton T.A., Kiehl R.A. Sequence-encoded self-assembly of multiple-nanocomponent arrays by 2D DNA scaffolding // Nano Lett. 2005. V. 5. P. 2399-2402A

148. Sharma J., Chhabra R., Cheng A., Brownell J., Liu Y., Yan H. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles // Science. 2009. V. 323. P. 112116.

149. Sharma J., Ke Y., Lin C., Chhabra R., Wang Q., Nangreave J., Liu Y., Yan H. DNA-tile-directed self-assembly of quantum dots into two-dimensional nanopatterns // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 5157-5159.

150. Cheglakov Z., Weizmann Y., Braunschweig A.B., Wilner O.I., Willner I. Increasing the complexity of periodic protein nanostructures by the rolling-circle-amplilied synthesis of aptamers // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 126-130.

151. Liu Y., Lin C., Li H., Yan H. Aptamer-directed self-assembly of protein arrays on a DNA nanostructure //Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 4333^1338.

152. Chhabra R., Sharma J., Ke Y., Liu Y., Rinker S., Lindsay S., Yan H. Spatially addressable multiprotein nanoarrays templated by aptamer-tagged DNA nanoarchitectures // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 10304-10305.

153. Rinker S., Ke Y., Liu Y., Chhabra R., Yan H. Self-assembled DNA nanostructures for distance dependent multivalent ligand-protein binding // Nat Nanotechnol. 2008. V. 3. P. 418^122.

154. Williams B.A.R., Lund K., Liu Y., Yan H., Chaput J.C. Self-assembled peptide nanoarrays: an approach to studying protein-protein interactions // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. V. 46. P. 3051-3054.

155. Malo J., Mitchell J.C., Venien-Bryan C., Harris J.R., Wille H., Sherratt D.J., Turberfield A.J. Engineering a 2D protein-DNA crystal // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 3057-3061.

156. Ke Y., Lindsay S., Chang Y., Liu Y., Yan H. Self-assembled water-soluble nucleic acid probe tiles for label-free RNA hybridization assays // Science. 2008. V. 319. P. 180-183.

157. Lin C., Liu Y., Yan H. Self-assembled combinatorial encoding nanoarrays for multiplexed biosensing //Nano Lett. 2007. V. 7. P. 507-512.

158. Niemeyer C.M., Koehler J., Wuerdemann C. DNA-directed assembly of bienzymic complexes from in vivo biotinylated NAD(P)H:FMN oxidoreductase and luciferase // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 242-245.

159. Erben C.M., Goodman R.P., Turberfield A.J. Single-molecule protein encapsulation in a rigid DNA cage // Angew. Chem. Int. Ed. 2006. V. 45. P. 7414-7417.

160. Feng L., Park S.H., Reif J.H., Yan H. A two-state DNA lattice switched by DNA nanoactuator//Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 4342^1346.

161. Goodman R.P., Heilemann M., Doose R., Erben C.M., Kapanidis N., Turberfield A.J. Reconfigurable, braced, threedimensional DNA nanostructures // Nature. 2008. V. 3. P. 93-96.

162. Deng Z., Mao C. Molecular lithography with DNA nanostructures // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 4068-4070.

163. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J. C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 2503-2516.

164. Huang M.M., Arnheim N., Goodman M.F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 4567-4573.

165. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)—amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. V. 4. P. 560-569.

166. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 189-193.

167. Kwok S., Kellogg D.E., McKinney N., Spasic D., Godal L., Levenson C., Sninsky J.J. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 9991005.

168. Ayyadevara S., Thaden A.A., Shmookler Reis R.J.S. Discrimination of primer 3'-nucleotide mismatch by Taq DNA polymerase during polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 2000. V. 284. P. 11-18.

169. Thweatt R., Goldstein S., Shmookler Reis R.J. A universal primer mixture for sequence determination at the 3' ends ofcDNAs//Anal. Biochem. 1990. V. 190. P. 314-316.

170. Suss B., Flekna G., Wagner M., Hein I. Studying the effect of single mismatches in primer and probe binding regions on amplification curves and quantification in real-time PCR // J. Microbiol. Methods. 2009. V. 76. P. 316-319.

171. Liang P., Pardee B.A. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction // Science. 1992. V. 257. P. 967-971.

172. Christopherson C., Sninsky J., Kwok S. The effects of internal primer-template mismatches on RT-PCR: HIV-1 model studies // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 654-658.

173. Bra D., Martin-Laurent F., Philippot L. Quantification of the detrimental effect of a single primer-template mismatch by real-time PCR using the 16S rRNA gene as an example // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 1660-1663.

174. Petruska J., Goodman M.F., Boosalis M.S., Sowers L.C., Cheong C., Tinoco I. Comparison between DNA melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6252-6256.

175. Mendelman L.V., Petruska J., Goodman M.F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase alpha and reverse transcriptase // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 2338-2346.

176. Day J.P., Bergstrom D., Hammer R.P., Barany F. Nucleotide analogs facilitate base conversion with 3' mismatch primers // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 18101-818.

177. Tong J., Cao W., Barany F. Biochemical properties of a high fidelity DNA ligase from Thermus species AK16D //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 788-794.

178. Pritchard C.E., Southern E.M. Effects of base mismatches on joining of short oligodeoxynucleotides by DNA ligases //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3403-3407.

179. Housby J.N., Southern E.M. Fidelity of DNA ligation: a novel experimental approach based on the polymerisation of libraries of oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 4259-4266.

180. James K.D., Boles A.R., Henckel D., Ellington A.D. The fidelity of template-directed oligonucleotide ligation and its relevance to DNA computation //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5203-5211.

181. Harada K., Orgel L. Unexpected substrate specificity of T4 DNA ligase revealed by in vitro selection //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2287-2291.

182. Sriskanda V., Shuman S. Specificity and fidelity of strand joining by Chlorella virus DNA ligase //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3536-3541.

183. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3071-3078.

184. Nakatani M., Ezaki S., Atomi H., Imanaka T. Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 650-656.

185. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. V. 76. P. 245-254.

186. Bhagwat A.S., Sanderson R.J., Lindahl T.S. Delayed DNA joining at 3' mismatches by human DNA ligases //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4028^1033.

187. Shuman S. Vaccinia virus DNA ligase: specificity, fidelity, and inhibition // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 16138-16147.

188. Lamarche B.J., Showalter A.K., Tsai M.D. An error-prone viral DNA ligase // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 8408-8417.

189. Alexander R.C., Johnson A.K., Thorpe J.A., Gevedon Т., Testa S.M. Canonical nucleosides can be utilized by T4 DNA ligase as universal template bases at ligation junctions //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3208-3216.

190. Aoi Y., Yoshinobu Т., Tanizawa K., Kinoshita K., Iwasaki II. Ligation errors in DNA computing//BioSystems. 1999. V. 52. P. 181-187.

191. Broude N.E, Sano Т., Smith C.L., Cantor C.R. Enhanced DNA sequencing by hybridization //Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3072-3076.

192. Dubiley S., Kirillov E., Lysov Yu., Mirzabekov A. Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2259-2265.

193. Cha R.S., Zarbl Н., Keohavong P., Thilly W.G. Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the c-H-ras gene // PCR Methods Appl. 1992. V. 2. P. 14-20.

194. Rust S., Funke H., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 36233629.

195. Nielsen P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics and molecular biology // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 16-20.

196. Orum H., Jakobsen M.H., Koch Т., Vuust J., Borre M.B. Detection of the factor Y Leiden mutation by direct allele-specific hybridization of PCR amplicons to photoimmobilized locked nucleic acids // Clin. Chem. 1999. V. 45. P. 1898-1905.

197. Nguyen H.K., Fournier O., Asseline U., Dupret D., Thuong N.T. Smoothing of the thermal stability of DNA duplexes by using modified nucleosides and chaotropic agents // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1492-1498.

198. Hacia J.G., Woski S.A., Fidanza J., Edgemon K., Hunt N., McGall G., Fodor S.P.A., Collins F.S. Enhanced high density oligonucleotide array-based sequence analysis using modified nucleoside triphosphates // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 4975^1982.

199. Guo Z., Liu Q., Smith L.M Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphisms by artificial mismatch hybridization // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 331-335.

200. Zirvi M., Bergstrom D.E., Saurage A.S., Hammer R.P., Barany F. Improved fidelity of thermostable ligases for detection of microsatellite repeat sequences using nucleoside analogs //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. e41.

201. Latorra D., Campbell K., Wolter A., Hurley J.M. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers // Hum. Mutat. 2003. Y. 22. P. 79-85.

202. Giusto D.A.D., King G.C. Strong positional preference in the interaction of LNA oligonucleotides with DNA polymerase and proofreading exonuclease activities: implications for genotyping assays // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. e32.

203. Kennedy В., Arar K., Reja V., Henry R.J. Locked nucleic acids for optimizing displacement probes for quantitative real-time PCR // Anal. Biochem. 2006. V. 348. P. 294-299.

204. Ballantyne K.N., van Oorschot R.A.H., Mitchell R.J. Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance // Genomics. 2008. V. 91. P. 301-305.

205. Strand H., Ingebretsen O.C., Nilssen O. Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid // Clin. Chim. Acta. 2008. V. 390. P. 126-133.

206. Koizumi M., Morita K., Takagi M., Yasumo H., Kasuya A. Improvement of single nucleotide polymorphism genotyping by allele-specific PCR using primers modified with an ENA residue // Anal. Biochem. 2005. V. 340. P. 287-294.

207. Petersen M., Nielsen C.B., Nielsen K.E., Jensen G.A., Bondensgaard K., Singh S.K., Rajwanshi V.K., Koshkin A.A., Dahl B.M., Wengel J., Jacobsen J.P. The conformations of locked nucleic acids (LNA) // J. Mol. Recognit. 2000. V. 13. P. 44-53.

208. Summerer D., Marx A. Differential minor groove interactions between DNA polymerase and sugar backbone of primer and template strands // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 910-911.

209. Strerath M., Gaster J., Marx A. Recognition of remote mismatches by DNA polymerases // Chembiochem. 2004. V. 5. P. 1585-1588.

210. Strerath M., Gaster J., Summerer D., Marx A. Increased single-nucleotide discrimination of PCR by primer probes bearing hydrophobic 4'C modifications // Chembiochem. 2004. V. 5. P. 333-339.

211. Kranaster R., Marx A. Increased single-nucleotide discrimination in allele-specific polymerase chain reactions through primer probes bearing nucleobase and 2'-deoxyribose modifications // Chemistry. 2007. V. 13. P. 6115-6122.

212. Subramanya H.S., Doherty A.J., AshfordS.R., Wigley D.B. Crystal structure of an ATP-dependent DNA ligase from bacteriophage T7 // Cell. 1996. V. 85. P. 607-615.

213. Summerer D., Rudinger N.Z., Detmer I., Marx A. Enhanced fidelity in mismatch extension by DNA polymerase through directed combinatorial enzyme design // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005. V. 44. P. 4712-4715.

214. Zhang J., Li K. Single-base discrimination mediated by proofreading 3' phosphorothioate-modified primers // Mol. Biotechnol. 2003. V. 25. P. 223-227.

215. Hu Y.J., Li Z.F., Diamond A.M. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphism in genotyping by phosphorothioate proofreading allele-specific amplification // Anal. Biochem. 2007. V. 369. P. 54-59.

216. Richards E.G. 1975. In: Handbook of Biochemistry and Molecular Biology: Nucleic Acids. Ed. Fasman G.D. Clevland: CRC Press. V. 1. P. 589.

217. Berkner K.L., Folk W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction: quantitave assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphoroyl termini in DNA // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 3176-3184.

218. Kuzmic P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase // Anal. Biochem. 1996. V. 237. P. 260-273.

219. Дегтярев C.X., Белавин П.А, Шишкина И.Г., Зарытова В.Ф., Гаврюченкова Л.П., Морозов С.Н. Иммобилизованные олигонуклеотиды как афинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции // Биоорган. Химия. 1989. Т. 15. С. 358-362.

220. Lumpkin O.J., Zimm В.Н. Theory of gel electrophoresis of DNA // Biopolymers. 1982. V. 21. P. 2315-2316.

221. Lane D., Prentki P., Chandler M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 509-528.

222. Thompson J.F., Landy A. Empirical estimation of protein-induced DNA bending angles: applications to lambda site-specific recombination complexes // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P.9687-9705.

223. Lilley D.M.J. Kinking of DNA and RNA by base bulges // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.1995. V. 92. P. 7140-7142.

224. Dornberger U., Hillisch A., Gollmick F.A., Fritzsche H., Diekmann S. Solution structure of a five-adenine bulge loop within a DNA duplex // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1286012868.

225. Luebke K.J., Tinoco I. Sequence effects on RNA bulge-induced helix bending and a conserved five-nucleotide bulge from the group I introns // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 11677-11684.

226. Rosen M.A., Live D., Patel D.J. Comparative NMR study of A(n)-bulge loops in DNA duplexes: intrahelical stacking of A, A-A, and A-A-A bulge loops // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 4004-4014.

227. Roll C., Ketterle С., Faibis V., Fazakerley G.V., Boulard Y. Conformations of nicked and gapped DNA structures by NMR and molecular dynamic simulations in water // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 4059^1070.

228. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Türkin S.I., Gromova E.S. DNA-like duplexes with repetitions. I. Properties of concatemer duplexes formed by d(T-G-C-A-C-A-T-G) // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 2413-2429.

229. Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Химическое лигирование как метод сборки двутяжевых нуклеиновых кислот, модификация и исследование локальной структуры // Изв. Акад. Наук. Сер. Химическая. 1996. № 8. С. 1889-1911.

230. Филиппов Н.С., Ломзов A.A., Пышный Д.В. Термодинамическое описание самоассоциации олигонуклеотидов в конкатамерные структуры ДНК // Биофизика. 2009. Т. 54. С. 402-417.

231. Hansma H.G., Revenko I., Kim К., Laney D.E. Atomic force microscopy of long and short double-stranded, single-stranded and triple-stranded nucleic acids // Nucleic Acids Res.1996. V. 24. P. 713-720.

232. Kasumov A., Klinov D., Roche P.-E., Gueron S. Bouchiat H. Thickness and low-temperature conductivity of DNA molecules // Appl. Phys. Lett. 2004. Y. 84. P. 10071009.

233. Rivetti C., Guthold M., Bustamante C. Scanning force microscopy of DNA deposited onto mica: equilibration versus kinetic trapping studied by statistical polymer chain analysis // J. Mol. Biol. 1996. V. 264. P. 919-932.

234. Hansma H. G., Laney D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy // Biophys. J. 1996. V. 70. P. 1933-1939.

235. Pastre D., Pietrement O., Fusil S., Landousy F., Jeusset J., David M.-O., Hamon L., Le Cam E., Zozime A. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 2507-2518.

236. Adamcik J., Klinov D.V., Witz G., Sekatskii S.K., Dietler G. Observation of single-stranded DNA on mica and highly oriented pyrolytic graphite by atomic force microscopy //FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 5671-5675.

237. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. Москва: Фаир Пресс. 1999.

238. Zhao X., Muller J.G., Halasyam М., David S.S., Burrows C.J. In vitro ligation of oligodeoxynucleotides containing C8-oxidized purine lesions using bacteriophage T4 DNA ligase // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 3734-3744.

239. Doherty A.J., Suh S.W. Structural and mechanistic conservation in DNA ligases // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 4051^1058.

240. Pascal J.M., O'Brien P.J., Tomkinson A.E., Ellenberger T. Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA // Nature. 2004. V. 432. P. 473478.

241. Cherepanov A.V., de Yries S. Binding of nucleotides by T4 DNA ligase and T4 RNA ligase: Optical absorbance and fluorescence studies // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 35453559.• • 94

242. Cherepanov A.V., de Vries S. Kinetic mechanism of the Mg -dependent nucleotidyltransfer catalyzed by T4 DNA and RNA ligases // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 16951704.

243. Cherepanov A.V., Yildirim E., de Vries S. Joining of short DNA oligonucleotides with base pair mismatches by T4 DNA ligase // J. Biochem. 2001. V. 129. P. 61-68.

244. Nair P.A., Nandakumar J., Smith P., Odell M., Lima C.D., Shuman S. Structural basis for nick recognition by a minimal pluripotent DNA ligase // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 770-778.

245. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4535^1542.

246. Meijler M.M., Zelenko O., Sigman D.S. Chemical mechanism of DNA scission by (1,10-phenanthroline)copper. Carbonyl oxygen of 5-methylenefuranone is derived from water // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 1135-1136.

247. Sigman D.S. Chemical nucleases // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-9105.

248. Zhang Y., Price B.D., Tetradis S., Chakrabarti S., Maulik G., Makrigiorgos G.M. Reproducible and inexpensive probe preparation for oligonucleotide arrays // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. e66.

249. Muller K.M., Stebel S.C., Knall S., Zipf G., Bernauer H.S., Arndt K.M. Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. el 17.

250. Cho R.J., Fromont-Racine M., Wodicka L., Feierbach В., Stearns Т., Legrain P., Lockhart D.J., Davis R.W. Parallel analysis of genetic selections using whole genome oligonucleotide arrays// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 95. P. 3752-3757.

251. Timofeev E., Mirzabekov A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2626-2634.

252. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis С virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 4942^946.

253. Ильина E.H., Артемов E.K., Говорун B.M., Иванова JI.M., Иваников И.О. Генотипирование РНК вируса гепатита С аллельспецифичной амплификацией // Кремлевская медицина. Клинический вестник. 2002. Т. 1. С. 38—41.

254. Гущин А.Е., Носкова О.М., Шипулин Г.А. Разработка набора реагентов «Амплисенс HCV-генотип» для определения субтипов la, lb, 2а, За вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. 2003. Т. 3. С. 45-48.

255. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 911-940.

256. Mathews D.H., Burkard M.E., Freier S.M., Wyatt J.R., Turner D.H. Predicting oligonucleotide affinity to nucleic acid targets // RNA. 1999. V. 5. P. 1458-1469. //