Моделирование процессов аналитической биосепарации и биоконверсии на основе высокоэффективной мембранной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Аффинная хроматография как важнейший метод аналитической и препаративной биосепарации.

2 Современные стационарные фазы для динамических процессов, основанных на аффинных взаимодействиях.

2.2.1 Традиционные пористые носители (высокопроницаемые частицы)

2.2.2 Непористые сорбенты.

2.2.3 Перфузионные или гигапористые носители.

2.2.4 Непрерывные разделительные слои (сорбенты монолитного типа).

2.2.5 Тонкие мембраноподобные слои.

3 Макропористые полимерные сорбенты.

2.3.1 Особенности синтеза.

2.3.2 Морфология поровой структуры.

2.3.3 Функционализация поверхности посредством иммобилизации аффинных лигандов.

4 Особенности аффинного комплексообразования в растворе и с участием неподвижной фазы (сорбента).

2.4.1 Определение количественных характеристик специфического комплексообразования с использованием подхода аффинной хроматографии.

2.4.2 Аффинные лиганды: лиганды высокой специфичности и общеспецифические аффинные лиганды.

5 Проточные биореакторы на основе комплементарного связывания.

6 Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными ферментами.

7 Использование макропористых метакрилатных дисков монолитного типа в качестве носителей для твердофазного синтеза пептидов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1 Анализ поровой структуры монолитных сорбентов динамическим методом.

3.2 Ковалентная иммобилизация биологически активных лигандов на ГМА-ЭДМА дисках.

3.2.1 Влияние внешних параметров процесса, осуществляемого в статических условиях, на эффективную адсорбционную емкость сорбента.

3.2.2 Сравнение процессов иммобилизации белков и пептидов, осуществляемых в статических и динамических условиях.

3.2.3 Влияние промежуточного спейсера на количественные характеристики аффинных взаимодействий.

3.3 Влияние внешних условий на параметры аффинных взаимодействий, реализованных на монолитных носителях.

3.3.1 Зависимость эффективности аффинного связывания от скорости подвижной фазы (зональное элюирование).

3.3.2 Использование фронтального анализа для сравнения аффинного комплексообразования при различных скоростях подвижной фазы

3.3.3 Влияние поверхностной концентрации иммобилизованного лиганда на аффинные параметры исследуемых пар.

3.3.4 Влияние температуры на термодинамическую прочность аффинных комплексов.

3.4 Практические приложения исследованных процессов, основанных на межфазовом распределении вещества.

3.4.1 Аффинное фракционирование пулов поликлональных антител.

3.4.2 Создание проточного ферментативного биореактора на основе химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА монолитных дисках.

3.4.3 Прямой синтез адсорбционных лигандов на макропористых монолитных носителях (ГМА-ЭДМА дисках) с использованием подхода твердофазного пептидного синтеза (ТФПС).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 1 Материалы и приборы.

2 Методы.

4.2.1 Ковалентное связывание лигандов с монолитными стационарными фазами.

4.2.2 Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография (ВЭМДАХ).

4.2.3 Количественное определение параметров аффинного взаимодействия методом фронтального элюирования.

4.2.4 Мультифункциональная иммуноаффинная хроматография.

4.2.5 Приготовление сывороток антител.

4.2.6 Твердофазный пептидный синтез (ТФПС).

4.2.7 Синтез конъюгата БК-С-БСА.

4.2.8 Иммуноферментный анализ.

4.2.9 Ферментативный гидролиз М-бензоил-Ь-тирозин этилового эфира (БТЭЭ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА).

4.2.10Анализ продуктов ферментативного гидролиза БСА с использованием метода капиллярного электрофореза.

4.2.11 Ферментативный синтез дипептида ВосЬеиРЬеОМе с использованием химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА диске.

4.2.12Химический синтез аминокислотных производных ВосЬеиОМе,

РЬеОМе и дипептида ВосЬеиРЬеОМе.

4.2.13Твердофазный пептидный синтез на ГМА-ЭДМА дисках.

4.2.14Гель-электрофоретический анализ ВЭМДАХ элюатов, содержащих тканевый активатор плазминогена (ТАП).

ВЫВОДЫ.

Выделение и очистка белков, пептидов и полинуклеотидов, а также исследование их взаимодействий в растворе и в локализованном состоянии играет ключевую роль как в решении фундаментальных задач теоретической биологии, так и реализации практических планов, направленных, прежде всего, на создание лекарственных препаратов на их основе. В этой области современные генно-инженерные методы получения подобных лекарственных препаратов на настоящий момент являются наиболее перспективными как из-за отсутствия ограничений по источнику сырья, так и относительно низкой стоимости конечного продукта. Генно-инженерные технологии находят широкое применение в промышленном производстве ряда биологически активных белков и пептидов, как, например, инсулина, интерферонов, окситоцина, тканевого активатора плазминогена и др. Очевидно, что в дальнейшем спектр генно-инженерных лекарственых препаратов будет только расширяться. При этом важнейшей задачей является разработка методологических подходов для аналитического и препаративного обеспечения биотехнологических процессов, позволяющих достоверно оценить структуру, степень конверсии и чистоту целевых пептидов или белков на каждой производственной стадии, а также достичь высокой эффективности их выделения из сложных сред. Грамотно построенные методы позволяют сократить время и экономические затраты на разработку всего процесса в целом. Для решения указанных задач необходимо создание и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию, так и достоверную идентификацию продукта. Таким образом, все цели и задачи представленной работы, направленные именно на создание и детальное исследование новых сепарационных и биоконверсионных процессов для нужд современной биотехнологии, являются актуальными. 7

В качестве одного из наиболее популярных методов разделения веществ, основанного на их распределении между двумя фазами, можно назвать жидкостную хроматографию (ЖХ).

Межфазовое распределение вещества в жидкостной хроматографии является основным условием функционирования слоя как разделительной матрицы. Именно поэтому хроматографический процесс может служить логичным инструментом анализа пористых стационарных фаз, предназначенных для более тонких методов моделирования и практической реализации биокомплементарных взаимодействий. Очевидно, что для корректного построения и описания подобных взаимодействий необходимо свести к минимуму (или приблизить к естественному) влияние искусственной поддерживающей среды, используемой для локализации (иммобилизации) одного из активных компонентов. Идеальная стационарная фаза не должна провоцировать неспецифических взаимодействий между биологическим веществом и собственной поверхностью, обеспечивая при этом равную доступность активных поверхностных лигандов и осуществляя функцию незатрудненного транспорта как аффинанта, так и продукта.

Новыми и весьма перспективными сорбентами, удовлетворяющими всем требованиям, выдвигаемым к современным стационарным фазам, являются так называемые монолитные носители, занимающие в последние годы бесспорную лидерскую позицию в данной научной и практической области. Среди них, в первую очередь, могут быть названы макропористые сополимеры 2,3-эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата, ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА), выполненные в форме цельных тонких дисков. Успешно развиваемый несколькими мировыми исследовательскими группами новейший метод динамического разделения веществ с использованием данных оригинальных сорбентов получил название высокоэффективной мембранной (или, в настоящее время - монолитной дисковой) хроматографии (ВЭМХ или ВЭМДХ). 8

Осуществление эффективных разделительных процессов на ультракоротких непрерывных (монолитных) слоях сорбента оказалось революционным решением, внесшим серьезные коррективы в традиционные представления об основополагающих принципах хроматографии. Во-первых, привычные, так называемые проницаемые, материалы, используемые в данном сепарационном методе в качестве стационарных фаз и представляющие собой мелкодисперсные макропористые или сетчатые сорбенты, были заменены на полностью протекаемые (конвекционные) носители. Во-вторых, было доказано, что эффективный процесс разделения может осуществляться без участия стандартной длинной колонки, функцию которой успешно выполняют тонкие мембраноподобные слои. Малая толщина (длина) разделительного слоя ГМА-ЭДМА сорбентов, а также открытая структура проточных каналов, на поверхности которых происходит адсорбционное разделение, обеспечивают минимальное диффузионное сопротивление нормальному массопереносу вещества, а также, что весьма существенно, низкие рабочие давления. Таким образом, реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных материалов-носителей.

Процессы синтеза и химической модификации поверхности ГМА-ЭДМА сорбентов, а также ионообменный и гидрофобный варианты ВЭМДХ различных классов веществ представляют собой достаточно изученную научно-практическую область. Однако, закономерности подхода биоаффинного разделения с использованием ультракоротких монолитных стационарных фаз до сих пор не исследовались. Таким образом, научная новизна представляемой работы не подлежит сомнению.

Генеральной целью настоящего исследования являлось моделирование и изучение динамических процессов, основанных на распределении веществ между двумя фазами, происходящих с участием адсорбционных биологически-комплементарных взаимодействий. При этом в качестве стационарной фазы использовались макропористые ГМА-ЭДМА монолитные слои. 9

Для достижения стратегической цели решались следующие тактические задачи:

1. Разработка и оптимизация методов функционализации монолитных сорбентов, заключающейся в ковалентной иммобилизации различных белков и пептидов (биоспецифических лигандов) на поверхности ГМА-ЭДМА носителей; определение влияния способа ковалентного связывания лиганда на параметры последующего аффинного комплексообразования.

2. Исследование влияния внешних параметров (скорости потока подвижной фазы, температуры, поверхностной концентрации лиганда) на процесс образования биокомплементарных пар.

3. Разработка метода скоростного фракционирования сложных смесей, основанного на комбинации сорбентов различной адсорбционной функциональности.

4. Разработка метода твердофазного синтеза модельных пептидных последовательностей с использованием ГМА-ЭДМА монолитов; количественное сравнение аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности сорбента.

5. Исследование возможности создания скоростных проточных биореакторов на основе иммобилизованного на ГМА-ЭДМА монолитах фермента (химотрипсина), катализирующего реакции как расщепления (прямой катализ), так и образования (обратный катализ) пептидной связи.

Научная значимость работы заключается в формулировании новых принципов динамического образования высокоспецифических пар, которые открывают новые горизонты в исследовании биокомплементарных взаимодействий, имеющих место в живой природе. С практической точки зрения, результаты работы также представляют безусловную ценность. В качестве лишь одного примера можно назвать использование

11

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5 ВЫВОДЫ

1. При разработке методов ковалентной иммобилизации биологических лигандов на поверхности ГМА-ЭДМА макропористых монолитных носителей с сохранением способности этих лигандов связывать соответствующие биокомплементы установлено, что количество вводимых аффинных сайтов может регулироваться условиями иммобилизации, а максимальная емкость сорбента достигается при гидравлической подаче раствора лиганда в поры сорбента. Показано, что в случае использования ГМА-ЭДМА монолитов введение обычных в аффинной хроматографии промежуточных спейсеров не является необходимым.

2. При исследовании влияния внешних параметров на количественные характеристики аффинного связывания с участием биоспецифических лигандов, иммобилизованных на поверхности монолитных сорбентов, показано, что изменения скорости потока подвижной фазы (0.5 - 10.0 мл/мин), температуры (0 - 40°С) и поверхностной концентрации сайтов связывания не влияют на прочность образования аффинных комплексов.

3. Сравнение результатов фракционирования пулов поликлональных антител, полученных с помощью разработанного и оптимизированного нового аффинного метода (ИА ВЭЖХ), с данными, полученными методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), позволяет рекомендовать скоростную аффинную хроматографию на монолитах в качестве альтернативного аналитического решения.

4. Показано, что монолитные стационарные ГМА-ЭДМА фазы с непосредственно синтезированными пептидами могут выполнять роль эффективного сорбента для аффинных разделений; при этом исключаются длительные и дорогостоящие стадии выделения и очистки пептидного продукта. Впервые проведено сравнение аффинных свойств носителей с иммобилизованными и непосредственно синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов лигандами (пептидными

140

1. Nomenclature for chromatography. IUPAC recommendations (1993) J. Pure

2. Appl. Chem. 65(4) (1993) 819.

3. S. M. A. Bueno, K. Haupt, M. A. Vijayalakshmi, Separation ofimmunoglobulin G from human serum by pseudobioaffinity chromatography using immobilized histidine in hollow fibre membranes, J. Chromatogr. B, 691 (1997)33-41.

4. Я. Туркова, Аффинная хроматография, пер. с англ., М., Мир, 1980.

5. Y. D. Clonis, Matrix evaluation for preparative high-performance affinitychromatography, J. Chromatogr., 407 (1987) 179-187.

6. Т. Б. Тенникова, докт. дисс., СПб, 1997.

7. G. Т. Hermanson, А. К. Mallia, Р. К. Smith, Immobilized Affinity Ligand

8. Techniques, Academic Press, 1992.

9. К. K. Unger (Ed.), Packings and Stationary Phases in Chromatographic

10. Techniques, New York, Marcel Dekker, 1990, p. 75-98.

11. S. Hjerten, A. Vegvari, A. Resin, A. Takatsy, F. Kilar, A. Maruska, M.

12. Schmid, G. Gubitz, Gleanings from recent advances in microscale separations, Book of Abstracts, SBS 2001, p. 13.

13. J. L. Coffman, D. K. Roper and E. N. Lightfoot, High-resolutionchromatography of proteins in short columns and adsorptive membranes, Bioseparations, 4 (1994) 183-200.

14. G. Jilge, R. Janzen, H. Giesche, К. K. Unger, J. N. Kinkel, M. T. W. Hearn,

15. H. Iwata, K. Saito, S. Furusaki, T. Sugo, J. Okamoto, Adsorption characteristics of an immobilized metal affinity membrane, Biotechnol. Prog., 7(1991)412-418.

16. J. Hradil, D. Horak, M. Benes, in: M. Potschka, P. Dubin (Eds.), Strategies in Size Exclusion Chromatography, ACS Symposium Series 635, Washington, D.C., 1996, 212-245.

17. V. Saxena, A. E. Weil, Radial flow column: a new approach to scaling-up biopurifications, BioChromatography, 2 (1987) 90-97.

18. W- C. Lee, Protein separation using non-porous sorbents, J. Chromatogr. B, 699 (1997) 29.

19. Y. F. Maa, C. Horvath, Rapid analysis of proteins and peptides by reversed-phase chromatography with polymeric micropellicular sorbents, J. Chromatogr., 445 (1988) 71-86.

20. A. E. Rodrigues, Permeable packings and perfusion chromatography in protein separation, J. Chromatogr. B, 699 (1997) 47-61.

21. A. E. Rodrigues, J. C. Lopes, Z. P. Lu, J. M. Loureiro, M. M. Dias, Importance of intraparticle convection in the performance of chromatographic processes, J. Chromatogr., 590 (1992) 93-100.

22. A. I. Liapis, Y. Xu, O. K. Grosser, A. Tongta, "Perfusion chromatography". The effects of intra-particle convective velocity and microsphere size on column performance, J. Chromatogr., 702 (1995) 45-57.

23. G. A. Heeter, A. I. Liapis, Estimation of pore diameter for intraparticle fluid flow in bidisperse porous chromatographic particles, J. Chromatogr., 761 (1997) 35-40.

24. J. J. Van Deemter, F. J. Zuiderweg, A. Klinkenberg, Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography, Chem. EngngSci., 50 (1995) 3869-3882.

25. G. A. Heeter, A. I. Liapis, Effects of structural and kinetic parameters on the performance of chromatographic columns packed with perfusive and purely diffusive adsorbent particles, J. Chromatogr., 743 (1996) 3-14.

26. Cz. Horvath, Preparative HPLC, NATO ASI Chromatographic and Membrane Processes in Biotechnology, Azore, 1990.

27. F. Svec, J. M. J. Frechet, Modified poly(glycidyl methacrilate-co-ethylene dimethacrylate) continuous rod columns for preparative-scale ion exchange chromatography of proteins, J. Chromatogr., 702 (1995) 89.

28. S. Hjerten, J. L. Liao, R. Zhang, High-performance liquid chromatography on continuous polymer beds, J. Chromatogr473 (1989)273-275.

29. J. Mohhammad, S. Hjerten, Continuous beds. Their applicability for immobilization of proteins, Biomed. Chromatogr., 8(4) (1994) 165-169.

30. T. B. Tennikova, M. Bleha, F. Svec, T. V. Almazova, B. G. Belenkii, High performance membrane chromatography of proteins: a novel method of protein separation, J. Chromatogr., 555 (1991) 97-107.

31. T. B. Tennikova, F. Svec, High-performance membrane chromatography: highly efficient separation method for proteins in ion-exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase modes, J. Chromatogr., 646 (1993) 279-288.

32. H. Abou-Rebyeh, F. Korber, K. Schubert-Rehberg, J. Reusch, Dj. Josic, Carrier membrane as a stationary phase for affinity chromatography and kinetic studies of membrane-bound proteins, J. ChromatogrB 566 (1991) 341-350.

33. Dj. Josic, J. Reusch, K. Loster, O. Baum, W. Reutter, High performance membrane chromatography of serum and plasma membrane proteins, J. Chromatogr., 590 (1992) 59-76.

34. F. Svec, J. M. J. Frechet, Kinetic control of pore formation in macroporous polymers. Formation of "molded" porous materials with flow characteristics for separation and catalysis, Chem. Mater., 7 (1995) 707-715.

35. J. J. Meyers, A. I. Liapis, Network modeling of the convective flow and diffusion of molecules adsorbing in monoliths and in porous particles packed in a chromatographic column, J. Chromatogr. A, 852 (1999) 3-23.

36. C. Tanford, The Hydrophobic Effect, 2nd Ed., New York, Wiley, 1980.

37. R. Snyder, in: HPLC of Biological Molecules, Methods and Applications (K. M. Goodings, F. E. Regnier Eds.), Dekker, New York, 1990, p. 231.

38. F. E. Regnier, R. M. Chiez, in: HPLC of Biological Molecules, Methods and Applications (K. M. Goodings, F. E. Regnier Eds.), Dekker, New York, 1990, p. 89.

39. R. M. Moore, R. R. Walters, Protein separations on reversed-phase highperformance liquid chromatography minicolumns, J. Chromatogr., 317 (1984) 119-128.

40. R. S. Blanquet, K. H. Bui, D. W. Armstrong, Mechanistic considerations on the reversed phase liquid chromatographic separation of proteins, J. Liq. Chromatogr., 9(9) (1986) 1933-1949.

41. E. Klein, Affinity membranes: a 10-year review, J. Membr. Sci., 179 (2000) 127.

42. N. I. Dubinina, O. I. Kurenbin, T. B. Tennikova, Peculiarities of gradient ionexchange high-performance liquid chromatography of proteins, J. Chromatogr. A, 753 (1996) 217-225.

43. T. B. Tennikova, R. Freitag, An introduction to monolithic disks as stationary phases for high performance biochromatography, High Resol. Chromatogr., 23 (2000) 27-47.

44. J. Thommes, M.-R. Kula, Membrane chromatography an integrative concept in the down-stream processing of proteins, Biotechnol. Prog., 11 (1995) 357367.

45. M. Nachman, A. R. M. Azad, P. Bailon, Kinetic aspects of membrane-based immuno-affinity chromatography, J. Chromatogr., 591 (1992) 167-172.

46. J. A. Gerstner, R. Hamilton, S. M. Cramer, Membrane chromatographic systems for high-throughput protein separations, J. Chromatogr., 596 (1992) 173-180.

47. O.-W. Reif, R. Freitag, Characterisation and application of strong ionexchange membrane adsorbers as stationary phases in high performance liquid chromatography of proteins, J. Chromatogr654 (1993) 29-41.

48. A. Jungbauer, F. Unterluggauer, K. Uhl, A. Buchacher, F. Steindl, D. Pettauer, E. Wenisch, Scale-up of monoclonal antibody purification using radial streaming ion-exchange chromatography, Biotechnol. Bioeng., 32 (1988) 326333.

49. T. B. Tennikova, B. G. Belenkii, F. Svec, High-performance membrane chromatography. A novel method of protein separation, J. Liq. Chromatogr., 13 (1990) 63-71.

50. F. Svec, T. Tennikova, Polymeric separation media for chromatography of biopolymers in a novel shape: macroporous membranes, Bioact.Compat. Polym., 6 (1991) 394-406.

51. C. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, T. Tennikova, Fast isolation of protein receptors from streptococci G by means of macroporous affinity disks, J. Chromatogr., 65 (1998) 65-72.

52. Berruex, R. Freitag, T. B. Tennikova, Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal., 24 (2000) 95-104.

53. A. Podgornik, M. Barut, J. Jancar, A. Strancar, T. Tennikova, Highperformance membrane chromatography of small molecules, Anal. Chem., 71 (1999) 2986-2991.

54. R. Freitag, J. Breier, Displacement chromatography in biotechnological downstream processing, J. Chromatogr., 691 (1995) 101.

55. R. Freitag, S. Vogt, Comparison of particulate and continuous-bed columns for protein displacement chromatography, J. Biotechnol., 78(1) (2000) 69-82.

56. Okay, Macroporous copolymer networks, Prog. Polym. Sci., 25 (2000) 711779.

57. S. Xie, R. Alington, J. M. J. Frechet, F. Svec, in: Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Th. Scheper, R. Freitag, Eds), vol. 76, BerlinHeidelberg, Springer-Verlag, 2002, p. 88.

58. M. Abrams, J. R. Millar, A history of the origin and development of macroporous ion-exchange resins, React. Polym. 35 (1997) 7-22.

59. J.-L. Luna-Xavier, E. Bourgeat-Lami, A. Guyot, The role of initiation in the synthesis of silica/poly(methyl methacrylate) nanocomposite latex particles through emulsion polymerization, Coll. Pol. Sci., 279 (2001) 0947-0958.

60. E.T.W.M. Schipper, О. Sindt, Т. Hamaide, P. Lacroix-Desmazes, B. Muller et al., Reactive surfactants in heterophase polymerization for high performance polymers, Coll. Pol. ScL, 276 (1998) 402-411.

61. K. Dusek, in: Polymer networks: structure and mechanical properties (A. J. Chompff, S. Newman Eds), New York, Plenum Press, 1971, p. 245.

62. D. C. Sherrington, P. Hodge, Syntheses and separations using functional polymers, New York, Wiley, 1989.

63. Q. Wang, F. Svec, J. M. J. Frechet, Macroporous polymeric stationary-phase rod as continuous separation medium for reversed phase chromatography, Anal Chem., 65 (1993) 2243-2248.

64. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet, Rigid macroporous polymer monoliths, Adv. Mater., 11 (1999) 1169-1181.

65. A. Podgornik, M. Barut, A. Strancar, D. Josic, T. Koloini, Construction of large volume monolithic columns, Anal. Chem., 72 (2000) 5693-5699.

66. R. L. Albright, React. Polym., 4 (1986) 155.

67. K. A. Kun, R. Kunin, The pore structure of macroreticular ion exchange resins, J. Polym. Sci., C16 (1967) 1457-1469.

68. С. Т. Хванг, К. Каммермейер, Мембранные процессы разделения, М., Химия, 1981, с. 71.

69. F. Т. Sarfert, М. R. Etzel, Mass transfer limitations in protein separations using ion-exchange membranes, J. Chromatogr., 764 (1997) 3-20.

70. M. B. Tennikov, N. V. Gazdina, Т. B. Tennikova, F. Svec, Effect of porous structure of macroporous polymer supports on resolution in high-performance membrane chromatography of proteins, J. Chromatogr., 798 (1998) 55-64.

71. A. Podgornik, Т. B. Tennikova, Chromatographic reactors based on biomolecular activity, in: Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Th. Scheper, R. Freitag, Eds), vol. 76, BerlinHeidelberg, Springer-Verlag, 2002, p. 165.

72. R. F. Taylor, Protein immobilization: fundamentals and application, New York, Marcel Dekker, 1991.

73. S. S. Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, Boca Raton, CRC Press, 1993.

74. K. Hoffman, D. J. O'Shannessy, Site-specific immobilization by their oligosaccharide moieties to new hydrazide derivatized solid supports, J. Immunol. Met., 112 (1988) 113-120.

75. J. Turkova, in: Analitical and preparative separation methods of biomolecules (H. Y. Aboul-Enein, Ed), New York Basel, Marcel Dekker, 1999, p. 99.

76. T. H. Sisson, C. W. Castor, An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose, Immunol. Methods, 217 (1990) 215-220

77. P. L. Domen, J. R. Nevens, A. K. Mallia, G. T. Hermanson, D. C. Klenk, Site-directed immobilization of proteins, Chromatogr., 510 (1990) 293-302.

78. J. Turkova, Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and functions, J. Chromatogr., 722 (1999) 1131.

79. P. C. Gunaranta, G. S. Wilson, Optimization of multienzyme flow reactors for determination of acetylcholine, Anal. Chem., 62 (1990) 402-407.

80. C. M. Niemeyer, L. Boldt, B. Ceyhan, D. Blohm, Evaluation of single-stranded nucleic acids as carriers in the DNA-directed assembly of macromolecules, J. Biomol. Struct. Dyn., 17(3) (1999) 527-538.

81. F. Salto, E. Cortes, J.L. Barredo, R. Fernandez-Lafuente, B. Diez, P. Armisen, C. Mateo, J.L. Garca, J.M. Guisan, L. Rodes, Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate support, J. Chromatogr. A, 848(1999)61-70.

82. N. Labrou, Y. D. Clonis, The affinity technology in downstream processing, J.

83. Biothech., 36 (1994)95-119.

84. H. Ehle, A. Horn, Immunoaffinity chromatography, Bioseparations, 3 (1990)47.53.

85. M. Berry, J. Davies, S. Smith, I. Smith, Immobilized of Fv antibody fragmentson porous silica and their utility in affinity chromatography, J. Chromatogr., 587(1991) 161-169.

86. G. Welling, T. Geurts, J. V. Gorkum, R. Damhof, J. Wouter-Drijfhout, W.

87. Bloemhoff, S. Welling-Wester, Synthetic antibody fragment as ligand in immunoaffinity chromatography, J. Chromatogr., 512 (1990)337-343.

88. D. Weber, P. Bailon, Application of receptor-affinity chromatography tobioaffinity purification, J. Chromatogr., 510 (1990) 59-69.

89. E. Bayer, E. Wilchek, Applications of a avidin-biotin technology to affinitybased separations, J. Chromatogr., 510 (1990) 3-11.

90. I. Chaiken, Analysis of macromolecular interaction using immobilized ligands,

91. Anal Biochem., 201 (1992) 197-210.

92. K. Kasai, Trypsin and affinity chromatography, J. Chromatogr., 597 (1992) 318.

93. A. Petel, M. O'Hara, J. Callaway, D. Greene, J. Martin, A. Nishikawa, Affinitypurification of tissue plasminogen activator using transition-state analogues, J. Chromatogr510 (1990) 83-93.150

94. S. H. Langer, J. E. Patton, In: H. Purnell (Ed) New developments in gaschromatography. Vol 11, Advances in Analytical Chemistry and Instrumentatio, New York, John Wiley&Sons, Inc, 1973.

95. E. M. Magee, Can. Pat. 631882 (1961).

96. J. A. Dinwiddie, US Patent, 2976132 (1961).

97. L. Giorno, E. Drioli, Biocatalytic membrane reactors: applications andperspectives, Tibtech, 18 (2000) 339-349.

98. Dj. Josic, H. Schwinn, A. Strancar, A. Podgornik, M. Barut, Y.-P. Lim, M.

99. Vodopivec, Use of compact, porous units with immobilized ligands with high molecular masses in affinity chromatography and enzymatic conversion of substrates with high and low molecular masses, J. Chromatogr. 803 (1998) 61-71.

100. H.-D. Jakubke, P. Kuhl, A. Konnencke, Basic principles of protease-catalyzedpeptide bond formation, Angew. Chem., 24 (1985) 85-93.

101. P. Clapes, P. Adlercreutz, B. Mattiasson, Enzymatic peptide synthesis inorganic media: comparative study of water-miscible and water-immiscible solvent systems, J. Biotechnol., 15 (1990) 323-338.

102. И. В. Гетун, И. Ю. Филиппова, Е. Н. Лысогорская, А. В. Бачева, Е. С.

103. Оксенойт, Пептидный синтез, катализируемый субтилизином-72 в органических растворителях, Биоорг. химия, 25 (1999) 591-596.

104. G. A. Homandberg, J. A. Mattis, М. Laskowski, Synthesis of peptide bonds byproteinases. Addition of organic cosolvents shifts peptide bond equilibria toward synthesis, Biochemistry, 17 (1978) 5220-5227.

105. А. К. Гладилин, А. В. Левашов, Ферментативная стабильность в системахс органическими растворителями, Биохимия, 63 (1998) 408-421,151

106. К. Nilsson, К. Mochbach, Immobilization of enzymes and affinity ligands tovarious hydroxyl group carrying supports using highly reactive sulfonyl chlorides, Biochem. and Biophysic. Research Communications, 102 (1981) 449-457.

107. H. Gaertner, T. Watanabe, J. V. Sinisterra, A. Puigserver, Peptide synthesiscatalyzed by modified a-chymotrypsin in low-water organic media, J. Org. Chem., 56 (1991) 3149-3153.

108. M. Reslow, P. Adlercreutz, B. Mattiasson, The influence of water on proteasecatalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixture, Eur. J. Biochem., 177(1988)313-318.

109. A. Konnecke, R. Bullerjahn, H.-D. Jakubke, Peptide synthesis by means ofimmobilized enzymes, Monatschefte fur Chemie, 112 (1981) 469.

110. P. Clapes, P. Adlercreutz, B. Mattiasson, Enzymatic peptide synthesis inorganic media. Nucleophile specifity and medium engineering in a-chymotrypsin catalyzed reactions, Biothechnol. Appl. Biochem., 12 (1990) 376-386.

111. Т. Дэвени, Я. Гергей, Аминокислоты. Пептиды. Белки, М., Мир, 1976,166.169.

112. Дж. Стюард, Дж. Янг, Твердофазный синтез пептидов, М., Мир, 1971.

113. V. I. Korol'kov, G. A. Platonova, V. V. Azanova, Т. В. Tennikova, G. Р.

114. Vlasov, In situ preparation of peptidylated polymers as ready-to-use adsorbents for rapid immunoaffmity chromatography, Lett. Pept. Sci. (LIPS), 7(2000) 53-61.

115. B. Chao, M. Brickelmaier, P.S. Hochman, R. Baciu, J.H. Cuervo, A. Whitty,

116. ELISA methods for the analysis of antibody responses induced in multiple sclerosis patients treated with recombinant interferon-^, J. Immunol. Meth. 227 (1999) 121-135.152

117. N. Heine, L. Germeroth, J. Schneider-Mergener, H. Wenschuh, A modularapproach to the SPOT synthesis of 1,3,5-trisubstituted hydantoins on cellulose membranes, Tetrahedron Lett., 42 (2001) 227-230.

118. R. Frank, An easy technique for the positionnaly addressable, parallel chemicalsynthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48 (1992) 9217-9231.

119. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Schallaun, A. Jungbauer, Direct synthesis ofpeptides on CIM® monolithic columns for affinity chromatography, ISPPP'2000, Ljubljana, Slovenia.

120. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Berger, A. Jungbauer, Direct Synthesis ofpeptides on conventive interaction media monolithic columns for affinity chromatography, J. Comb. Chem., 4 (2002) 33-37.

121. G. A. Platonova, G. A. Pankova, I. Ye. Il'ina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova,

122. Quantitative fast fractionation of a pool of polyclonal antibodies by immunoaffinity membrane chromatography, J. Chromatogr., 852 (1998) 129140.

123. О. H. Lowry, N. I. Posebrough, A. L. Farr, P. I. Randall, Protein measurmentwith the folin phenol reagent, I. Biol. Chem. 193 (1951)265-275.

124. L. Berruex, R. Freitag, T. Tennikova, High flowthrough enzymaticreactor/separator for conjoint hydrolysis of proteins and peptide mapping, HPLC'99, Granada, Spain.

125. J. P. Briand, S. Muller, M. H. V. Van Regenmortel, Synthetic peptides asantigens: pitfalls of conjugation methods, J. Immunol. Methods, 78 (1985) 5969.

126. Ю. А. Овчинников, Биоорганическая химия, M., Просвещение, 1987.

127. К. R. Williams, К. L. Stone, Enzymatic cleavage and HPLC peptide mappingof proteins, Molec. Biotechnol., 8 (1997) 155-167.

128. E. Kaezmarek, M. H. Lee, J. McDonagh, Initial interaction between fibrin andtissue plasminogen activator, J. Biolog. Chem., 268 (1993) 2474-2479.153