Модифицированные полимерные наногели тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ



На правах рукописи

/¿¿¿¿¿с

НУКОЛОВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОГЕЛИ: СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 1 НОЯ 2010

МОСКВА-2010

004612144

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в фармацевтическом колледже Медицинского центра университета Небраски в соответствии с соглашением о научном сотрудничестве и обмене между Московским государственным университетом имени М.В. Ломоносова (Москва, Россия) и Медицинским центром университета Небраски (Омаха, Небраска, США).

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Кабанов Александр Викторович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Паписов Иван Михайлович

доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович

Ведущая организация: Институт биохимической физики

им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится 10 ноября 2010 года в 14 час. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр.3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 8 октября 2010 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета, к. х. н. ^— Долгова A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наногели представляют собой уникальный класс наноразмеркых гидрогелей, основанных на гидрофильной или амфифильной полимерной сетке, которая стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей. В настоящее время наногели интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека благодаря способности обратимо откликаться на небольшие внешние воздействия (температура, ионная сила, рН, электрическое поле и др.), а также включать в свой объем и контролируемо высвобождать различные биологически активные вещества (БАВ).

В последние годы гидрогели микро- и наноразмеров привлекают все большее внимание в качестве основы для создания систем доставки лекарств (СДЛ) в определенные органы. Наногели способны абсорбировать большое количество воды (до 95% в/в), тем самым, содействуя включению в свой объем различных молекул (РНК, ДНК, олигонуклеотиды, низкомолекулярные терапевтические и диагностические агенты), которые нестабильны, быстро выводятся из организма или характеризуются высокой системной токсичностью. Наногели позволяют конструировать СДЛ с контролируемым «спусковым механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, наногели могут быть модифицированы различными векторными группами, которые способствуют избирательной направленной доставке БАВ в определенные органы или клетки-мишени.

Наногели - это интенсивно развивающийся, относительно новый класс наноматериалов (первый обзор вышел в 2002). Поэтому многие физико-химические свойства наногелей еще практически не изучены, в литературе мало работ по введению направляющих векторных групп в наногели, до сих пор нет успешных попыток использования наногелей для адресной доставки лекарственных препаратов in vivo.

Цель работы заключалась в синтезе новых полимерных наногелей, способных включать биологически активные вещества; в создании новых подходов для модификации этих сложных полимерных систем различными векторными группами с сохранением их биологической активности; в изучении физико-химических особенностей поведения таких наногелей в водных средах и в установлении возможности практического применения разработанных наноматериалов в медицине.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что можно контролировать многие физико-химические характеристики наногелей, синтезируемых на основе блок-иономерных комплексов, создавая полимерные наноконтейнеры для молекул с заранее заданными свойствами (емкость загрузки и кинетика высвобождения БАВ, дисперсионная стабильность пустых и нагруженных наногелей, способность «откликаться» на изменения во внешней среде). Разработаны методы химической модификации наногелей низкомолекулярными соединениями (фолиевая кислота) и белками (моноклональные антитела) с сохранением их биологической активности. Изучены физико-химические характеристики модифицированных наногелей (гидродинамический размер, Ç-потенциал, дисперсионная стабильность) в широком диапазоне рН и ионной силы раствора. Также оптимизировано число модифицирующих групп с точки зрения их взаимодействия с модельными и клеточными рецепторами. Разработаны методы введения БАВ и флуоресцентных меток в модифицированные наногели, впервые показана принципиальная возможность их доставки с помощью наногелей в опухоль.

Практическая значимость работы. В ходе исследования физико-химических свойств наногелей и возможности их модификации векторными группами получены результаты, имеющие принципиальное значение для развития этого нового класса наноматериалов в качестве систем для направленной доставки терапевтических и диагностических молекул в раковые опухоли. В частности, в работе исследована способность наногелей, нагруженных противораковыми лекарствами и модифицированных фолиевой кислотой, селективно убивать раковые клетки, уменьшать скорость роста опухолей и увеличивать продолжительность жизни животных.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международном Симпозиуме по наномедицине и доставке лекарственных препаратов NanoDDS'08 (Торонто, Канада, 2008) и NanoDDS'09 (Индианаполис, США, 2009), на 40 и 41-ом ежегодном студенческом биомедицинском научном форуме (Небраска, США, 2009 и 2010), на 50-ом ежегодном национальном студенческом научном форуме (Техас, США, 2009), на 1-ой Международной летней школе - Нано2009. «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, Россия, 2009), на симпозиуме «Biomedical Polymers for Drug Delivery» (Юта, США, 2010), на 42-ой ежегодной фармацевтической научной конференции аспирантов (Огайо, США,

2010), а также Гордоновской научной конференции «Drug Carriers in Medicine and Biology» (США, 2008 и 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК, и 10 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (161 наименований) и приложения. Работа изложена на 141 странице, содержит 27 рисунков, 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре рассмотрены современное состояние исследований в области микро/наногелей, основные подходы к их получению, особенности их физико-химических характеристик, а также возможность практического применения данных систем для решения задач современной медицины.

В экспериментальной части описаны синтез наногелей и методы их модификации векторными группами, способы введения различных лекарственных препаратов, а также использованные в работе методы исследования.

В работе изучены наногели, полученные на основе блок-иономерных комплексов (БИК) с использованием полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты (ПЭГ-б-ПМАК) и двухвалентных ионов металла (Са2+, Ва2+). В частности, в работе использовали блок-сополимсры ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) и ПЭГ(114)-б-ПМАК(81) с концевыми метокси-группами, а также ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) с концевой гидроксильной группой.

Синтез полимерного наногеля, состоящего из ковалентно сшитых блок-сополимерных цепей ПЭГ-б-ПМАК, представляет собой двухстадийный процесс (Схема 1). Первая стадия заключается в самоорганизации блок-сополимера в БИК в присутствии ионов металла. Блок-иономерные комплексы ПЭГ-б-ПМАК и Ме"+ были приготовлены из водных растворов блок-сополимера и МеС12 при pH 8.0. Вторая стадия - это формирование ковалентных сшивок в ядре БИК между карбоксильными группами полиметакриловой кислоты и аминогруппами 1,2-этилендиамина в присутствии водорастворимого карбодиимида (КДИ). После введения сшивок в БИК ионы металла удаляли хелатированием с ЭДТА и последующим диализом. Формирование наноразмерных БИК и наногелей

подтверждали методами динамического рассеяния света (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Различные по природе векторные группы (фолиевая кислота (ФК), моноклональные антитела (rnAb) или их фрагменты (Fab)) были ковалентно связаны с наногелями через короткие связки или длинные гибкие ПЭГ мостики. Модифицированные наногели были охарактеризованы методами ДРС, АСМ, протонного ядерного магнитного резонанса ('Н-ЯМР), УФ-спектрофотометрии, электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Кроме того, метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР) был использован для демонстрации специфического связывания модифицированных наногелей с их мишенями и определения равновесных констант ассоциации и диссоциации.

В качестве противоопухолевых препаратов были выбраны доксорубицин (DOX) и цисплатин (CDDP), которые вводились в наногели простым смешением водных растворов компонентов при рН 7.0 и рН 9.0, соответственно. Контролируемое высвобождение данных веществ из наногелей изучали методом диализа в буферных растворах при рН 7.4 и 5.5 и температуре 37°С. Исследованы параметры (плотность сшивки, степень модификации), влияющие на введение и скорость высвобождения этих препаратов из наногелей.

Также в работе использовали наногели и их производные, содержащие флуоресцентные группы (флуоресцеин изотиоцианат или коммерчески доступные красители Alexa Fluor® 488 или 680), ковалентно связанные с полиметакриловыми сегментами. Данные материалы использовали для анализа эффективности связывания и эндоцитоза ФК-наногелей и нагруженных лекарствами наногелей в различных раковых клетках (А2780, А549 и NIH3T3).

Практическая значимость работы продемонстрирована с использованием модели аденокарциномы яичника А2780 человека, привитой к иммунодефицитным мышам. В частности, проведены исследования по биораспределению цисплатины в организме животного с использованием масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС).

ПЭГ-б-ПМАК Фолиевая кислота (ФК) Цисплатин (CDDP) Доксорубицин (DOX)

R = CH,0-, ОН-X = <70. 125, 114 у = 180, 81

СООН

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Синтез и физико-химические свойства полимерных наногелей. 1.1. Синтез полимерных наногелей на основе блок-иономерных комплексов. Синтез полимерных наногелей на основе блок-сополимера ПЭГ-б-ПМАК был впервые осуществлен в нашей научной группе с использованием блок-иономерного комплекса ПЭГ-о-ПМАК/Са2+ качестве матрицы (Схема 1).

ПМАК-сшитое ядро

{ к

вф самосборка [ -»/С % , '

ПЭГ-б-ПМАК

Са2*

1) CH3CHjN=C=N(CH2)3N(CH3)2-HCI

2) NHjCHJCH,NH,

полимерная матрица (БИК)

сшитая матрица с ионами металла

Схема 1. Схема синтеза наногеля на основе блок-сополимеров ПЭГ-б-ПМАК.

За формированием БИК ПЭГ-б-ПМАК/Ме2* следили по изменению мутности получаемых растворов (рис. 1) при варьировании состава реакционной смеси, Z. (Z = п*[Меп+]/[СОО"], где п - валентность ионов металла, [Ме"+] - их концентрация и [СОСУ] - концентрация карбоксильных групп при данном рН.) Из рис. 1 видно, что образование БИК ПЭГ-б-ПМАК/Ме2' происходит в узком диапазоне конденсирующих противоионов и зависит от природы этих противоионов, длины ионного блока и относительной весовой фракции гидрофильного ПЭГ блока (/эг) в блок-сополимере. Например, при одинаковых значениях Z мутность растворов комплексов, сформированных из ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) (/эг = 0.26), была значительно выше, чем комплексов, состоящих из ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) блок-сополимеров, где гидрофильный блок гораздо длиннее (/Эг ~ 0.33). Во всем диапазоне изученных концентраций более «гидрофильные» ПЭГ(114)-б-ПМАК(81) блок-сополимеры (/эг~ 0.42) не образовывали БИК с ионами Са21, однако

1 I Рисунок 1. Зависимости мутности

растворов различных ПЭГ-б-ПМАК/Ме2' комплексов при варьировании состава реакционной смеси, Z:

(А) ПЭГ(170)-б-ПМАК(180)/Са!\

0.151-

0.10

0.05

(Д) ПЭГ( 170)-б-ПМАК(180)/Ва , (■) ПЭГ(125)-б-ПМАК( 180)/Са2\ (□) ПЭГ( 125)-б-ПМАК( 18 0 )/В а2\ (•) ПЭГ(114)-б-ПМАК(81)/Са2\ (О) ПЭГ(114)-б-ПМАК(81)/Ва!".

наблюдалось формирование БИК при высоких концентрациях ионов Ва2+ (Z ~ 3) (рис. 1). Кроме того, во всех случаях комплексы с ионами Ва2+ начинали образовываться при более низких значениях Z по сравнению с ионами Са2+, возможно благодаря более сильному связыванию Ва2' с анионным сегментом блок-сополимера. На основании экспериментальных данных можно предположить, что самосборка ПЭГ-5-ПМАК/Ме2+ зависит от кооперативного связывания противоионов с ионным цепями ПМАК и инициируемой амфифильности получаемых комплексов.

Формирование БИК с гидродинамическим диаметром 90-110 нм было подтверждено методом ДРС. Важно отметить, что растворы комплексов ПЭГ-б-ПМАК/Меп+ были устойчивы даже при высоких концентрациях ионов металла в системе (Z = 2.5). Напротив, в тех же условиях комплексы ПМАК/Меп+ претерпевали фазовое разделение. Это указывает на стабилизацию образующихся блок-иономерных комплексов за счет наличия гидрофильных ПЭГ блоков во внешнем слое ПЭГ-б-ПМАК/Ме"+. Комплексы ПЭГ-б-ПМАК/Меп+, по всей вероятности, представляют собой наночастицы с морфологией «ядро-корона».

Полученные ПЭГ-б-ПМАК/Са2+ комплексы далее были использованы в качестве матриц для синтеза наногелей с различной плотностью сшивок (Схема 1). Основываясь на данных 'Н-ЯМР, найдено, что выход реакции был значительно ниже теоретического (не менее 3-5% введенных поперечных сшивок для теоретически возможного 20%). Это возможно благодаря формированию «петель» и/или прохождению реакции конденсации только по одной концевой группе 1,2-этилендиамина, а также гидролизу КДИ-активированных карбоксильных групп. Тем не менее, в результате синтеза было введено достаточное количество сшивок для создания полимерной сетки, которая оставалась стабильной даже при 200-кратном разбавлении. В то же время, несшитые БИК диссоциировали при удалении противоионов. Как и ожидалось, размеры набухших наногелей были значительно больше размеров их первоначальных БИК матриц (150-170 нм по сравнению с 90-110 нм). Мы предполагаем, что наногели частично сохраняют структуру исходных БИК и содержат формообразующее ядро сшитых полианионных цепей и внешнюю гидрофильную ПЭГ корону. Наногели имели отрицательный ^-потенциал, что свидетельствует о наличии некоторой доли ПМАК цепей в короне. Полученные полимерные наногели не агрегировали и оставались стабильными в широком диапазоне pH (4.5-11.0) и концентраций (до 5 % в/в). Для практического использования данных наногелей важно, что они

могут быть лиофилизированы и редиспергированы в водных средах практически без изменения их первоначальных параметров.

1.2. Физико-химические характеристики наногелей.

Наногели представляют собой сверхмягкие наноматериальг сферической формы (рис. 2). Размеры, заряд, степень набухания и дисперсионная стабильность материалов играют принципиальную роль для их применения в качестве СДЛ. Найдено, что размеры дегидратированных частиц (метод АСМ) значительно отличаются от размеров набухших наногелей в разбавленных растворах (метод ДРС). Так, средняя высота и диаметр дегидратированных ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) наногелей составили 3.45 ±0.1 нм и 111 .43 ± 0.4 нм, соответственно. Установлено, что увеличение числа сшивок в наногеле приводит к увеличению высоты дегидратированных частиц, что указывает на увеличение жесткости материала.

Рисунок 2. Двух- и трехмерные АСМ изображения ПЭГ(170)-£-ПМАК(180) наногеля в прерывисто-контактном режиме на воздухе. Ширина изображения - 2 мкм.

Набухание наногелей, как правило, зависит от многих параметров, например, природы полимера, качества растворителя, плотности сшивки, температуры, ионной силы раствора. Этот обратимый процесс происходит в результате комбинации эффектов ионизации ПМАК цепей, увеличения подвижности сегментов, уменьшения их межмолекулярных взаимодействий, а также проникновения противоионов в объем наногеля и повышения осмотического давления. При увеличении рН среды в отсутствии добавленной соли наблюдалось увеличение размеров наногеля, а в присутствии соли (0.15 М NaCl) размеры наногеля практически не изменялись (рис. 3). Степень набухания наногелей при постоянном рН также зависела от ионной силы раствора. В частности, при увеличении концентрации низкомолекулярного электролита в системе при рН 7.4 наблюдалось постепенное уменьшение размеров наногелей. В противоположность этому при рН 5.5, когда ПМАК сегменты были частично ионизированы, увеличение ионной силы раствора приводило к увеличению размеров. Возможно, что при низком рН увеличение ионной силы раствора приводит как к увеличению ионизации, так и к увеличению осмотического давления за счет проникновения противоионов. В то же время, при высоком рН цепи ПМАК практически

полностью ионизированы и добавление противоионов приводит к снижению электростатического отталкивания цепей за счет экранирования заряда.

Влияние рН и ионной силы раствора на изменения ^-потенциала наногелей, возможно, еще более сложно. Согласно теории Штерна частицы с хорошо выраженной поверхностью (мицеллы, липосомы) образуют двойной электрический слой на поверхности, состоящий из адсорбционного слоя (слой Гельмгольца), который непосредственно примыкает к межфазной поверхности, и диффузного слоя (слой Гуи), в котором находятся противоионы. Однако в отличие от данных частиц, изучаемые мягкие материалы, возможно, могут образовывать слой Гельмгольца, распространяющийся внутрь объема наногеля. Таким образом, размеры (возможно форма) наногеля и емкость его адсорбционного слоя в двойном электрическом слое могут изменяться в зависимости от степени набухания. Более того, в результате ионизации, несмотря на предполагаемую для изучаемых наногелей структуру «ядро-корона», несшитые цепи ПМАК могут перемещаться из ядра наногеля во внешние слои благодаря своей гибкости и способствовать понижению ^-потенциала системы. Любопытно, что ^-потенциал повышался и переставал зависеть от рН при высокой ионной силе раствора (0.15 М №С1). Насколько нам известно, теория ^-потенциала в наногелях пока недостаточно развита. Тем не менее, исходя из наших результатов, можно предположить, что проникновение противоионов в объем данных частиц может сильно влиять на их размеры (набухание) и ^-потенциал. Для полного понимания свойств наногелей необходимы дальнейший феноменологический анализ и теоретическое обоснование набухания и электрокинетических характеристик данного наноматериала.

Рисунок 5. Влияние степени сшивки наногелей на их гидродинамический диаметр (Д,фф) и ¡¡-потенциал. Результаты выражены, как среднее значение ± ЭР (п = 3).

Из рис. 3 видно, что на степень набухания наногелей влияет и плотность сшивок: например, водные растворы наногелей на основе ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) с низкой плотностью сшивок (теор.10%) набухали гораздо сильнее при повышении рН, чем наногели с большим числом сшивок (теор. от 40% до 80%), а при теоретической степени сшивки 5% невозможно синтезировать наногели с диаметром частиц менее 200 нм. С увеличением плотности сшивки уменьшался потенциал наногелей (рис. 3) благодаря 1) уменьшению подвижности сегментов ПМАК в результате введения дополнительных сшивок и 2) уменьшению числа свободных карбоксильных групп, способных к ионизации. Важно отметить, что сильно сшитые наногели (теор.80%) были неустойчивы и агрегировали в растворах, содержащих физиологическую концентрацию солей.

Гидрофильные наногели, синтезированные на основе БИК матрицы, представляют собой важный класс новых наноматериалов. Исчерпывающий анализ физико-химических характеристик наногелей необходим для создания новых эффективных СДЛ на их основе. Так, изменение только одного параметра, например, степени сшивки, приводит к изменению размера и заряда наногелей, их стабильности и способности к набуханию. Таким образом, разработанный нами метод синтеза наногелей позволяет контролировать многие физико-химические свойства этих систем (набухание, размер, заряд), влиять на их дисперсионную стабильность и способность «откликаться» на изменения внешней среды.

2. Фолат-модифицированные наногели с введенными БАВ.

Одна из задач современной медицины состоит в создании СДЛ направленного действия с использованием специфических векторных групп. Выбор фолиевой кислоты, в качестве векторной группы, был обусловлен её стабильностью и высокой аффинностью (Kj ~ 10"9-Ю"10 М ) к фолатному рецептору, который имеет высокий уровень экспрессии в раковых клетках.

2.1. Синтез ФК-наногелей.

ФК-наногели были синтезированы в три стадии (Схема 2): 1) синтез наногелей со свободными поверхностными гидроксильными группами, 2) синтез стабильных промежуточных продуктов (интермедиатов) с концевыми аминогруппами (NH2-наногель), 3) конъюгация интермедиата с активированной фолиевой кислотой (ФК-наногель). На каждой стадии образовывалось стабильное соединение, которое можно изолировать и хранить в течение нескольких месяцев.

Водные дисперсии наногелей, синтезированные на основе ОН-ПЭГ(125)-б-ПМАК(180), служили исходным материалом для синтеза конъюгатов ФК-наногель.

cl-PMA-b-PEO-OH

наногель

RT. 30 min fl

/» О

}—\ P00H

HjN

Фолиевая кислота (ФК) соон

d-РМА-Ь-РЕО-О-

ДВС-наногель

RT, 3h

ч / -NH+CI \

КДИ, H20

«,

%o

Cl-PMA-b-PEO ^ NH,

О

стабильный интермедиат, ЫН2-наногель

ФК-наногель

активный интермедиат ФК

. СООН

N—наногель

Схема 2. Схема синтеза ФК-модифицированного наногеля.

Гидроксильные группы наногеля реагировали с дивинилсульфоном (ДВС) по реакции Михаэля с образованием стабильного интермедиата (ДВС-наногель). В реакции использовали избыток ДВС, учитывая его гидролиз в водных растворах, а также возможность образования межмолекулярных сшивок. Далее ДВС-наногель смешивали с избытком 1,2-этилендиамина для получения стабильного производного (NHi-наногсль), характеристики которого были практически такими же, как и исходного наногеля (табл. 1). Конечный продукт, ФК-наногель, очищали методом гель-фильтрационной хроматографии. Количество связанной ФК, определяемое методом спектрофотометрии, варьировалось от 0.01 до 2.5 мкмоль ФК/мг полимера в зависимости от молярного соотношения ФК в реакционной смеси. Важно отметить, что в результате реакции фолиевой кислоты с наногелем возможно образование биологически неактивного а- и активного у-изомеров, хотя выход у-изомсра может быть выше в силу более высокой реакционной способности карбоксильной группы ФК в у- по сравнению с а-положением. Так как в результате синтеза несколько ФК ковалентно сшивались с одной молекулой наногеля, то их изомеры не могли быть разделены. Тем не менее, ФК-наногель содержал достаточное количество активного у-изомера, что подтверждено дальнейшими экспериментами по связыванию ФК-наногеля с его мишенью.

2.2. Морфология и набухание ФК-наногелей.

Методом АСМ показано, что морфология наногелей не изменяется после их модификации векторными группами. Например, средние высоты и диаметры

дегитратированных частиц составили 48.55 ± 2.9 нм и 103.18 ± 9.8 им, соответственно, для наногелей, и 45.37 ± 2.2 нм и 111.16 ± 3.5 нм, соответственно, для ФК-наногелей. Средние объемы составили 2.70 * 105 нм3 и 2.90 * 105 нм3, соответственно. Полученные наногели значительно набухали в водной среде (табл. 1). Степень их набухания и значения ^-потенциала зависели от рН среды, а также наличия низкомолекулярных электролитов в растворе (табл.1).

Таблица 1. Физико-химические характеристики1 пустых и нагруженных лекарством наногелей (А) в отсутствии низкомолекулярных электролитов в воде при рН 5.5 и 7.4, а также (Б) в фосфатном буфере (рН 7.4, 0.15 М ЫаС1) и ацетатно-солевом буфере (рН 5.5, 0.15 М ЫаС1). Результаты выражены, как среднее значение ± ЭЭ (п = 5). ФК-наногели содержали 0.2 мкмоль ФК/мг полимера.

(А) вода Д»м» нм рН 5.5 й/<1Ъ ^-потенциал, мК Дэфф, нм рН 7.4 8/<Я> ¡¿-потенциал, мВ

наногель 94 ±8 0.06 ± 0.02 -15 ±4 177 ±6 0.05 ±0.01 -29 ±2

1ЧН2-наногель 103 ±7 0.06 ± 0.02 -16± 1 175 ±5 0.07 ±0.01 -29 ±3

ФК-наногель 107 ±2 0.09 ±0.01 -13 ± 1 136 ±8 0.05 ±0.01 -21 ±3

наногельШОХ Н9±6 0.09 ± 0.04 -11±3 148 ±9 0.09 ± 0.04 -26 ± 1

ФК-наногельЛЮХ 113±3 0.09 ±0.02 -8 ± 3 120 ± 1 0.08 ± 0.02 -22 ± 1

наногель/СООР 109 ±5 0.04 ±0.01 -5 ± 1 137 ±5 0.04 ± 0.02 -20 ± 1

ФК-наногель/СО0Р 104 ±1 0.09 ±0.04 -9 ±2 126 ±7 0.03 ±0.02 -18 ±2

(Б) солевой буфер рН 5.5 (АВв) рН 7.4 (РВв)

наногель 143 ±7 0.06 ±0.01 -6± 1 152 ±8 0.05 ± 0.01 -9 ±1

МЬ-наногель 142 ±6 0.07 ±0.02 -6±1 158 ±8 0.09 ± 0.02 -8 ±1

ФК-наногель 113 ± 3 0.07 ±0.01 -5 ± 1 127 ±7 0.07 ±0.01 -9 ± 1

наногельШОХ 132 ±2 0.08 ± 0.03 -2 ± 1 140 ±6 0.09 ± 0.03 -5 ±1

ФК-наногельЛЮХ 117 ± 5 0.08 ± 0.02 -2 ± 1 121 ±4 0.08 ±0.01 -4 ± 1

наногель/СООР 122 ±9 0.07 ± 0.04 -3±1 127 ±7 0.05 ± 0.02 -4 ± 1

ФК-наиогель/СООР 118 ± 9 0.06 ± 0.02 -5 ±2 118 ± 5 0.09 ± 0.02 -6 ± 1

" Эффективный диаметр (Дафф), относительная ширина распределения частиц по размерам (8/<К>) и (-потенциал наногелей были получены методом динамического рассеяния света (ДРС).

Следует отметить, что модификация наногелей ФК-векторами приводила к некоторому уменьшению в размерах и увеличению ^-потенциала даже в отсутствии низкомолекулярных электролитов в системе (табл. 1). При увеличении количества пришитых ФК-векторов степень набухания наногелей понижалась.

Например, ФК-наногели с умеренной степенью модификации (0.05-0.1 мкмоль ФК/мг полимера) набухали подобно ^модифицированным наногелям. Напротив, сильно модифицированные ФК-наногели набухали гораздо меньше (1.0 мкмоль ФК/мг полимера) или совсем теряли способность к набуханию (2 мкмоль ФК/мг полимера). Такое поведение ФК-наногелей можно объяснить I) введением дополнительных сшивок в наногеле в результате побочной реакции между аминогруппами КН2-наногеля и карбоксильными группами бис-активированной ФК, а также 2) ассоциацией ФК-векторов в мультимерные комплексы, благодаря образованию водородных связей по типу хугстиновского взаимодействия.

2.3. Специфичность связывания ФК-наногелей с их мишенью.

Взаимодействие ФК-наногелей с фолат-связывающим белком (ФСБ), иммобилизованным на поверхность биосенсора, изучали методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР), который позволяет следить за протеканием реакций в реальном временном диапазоне. Изменение угла ППР в общем случае пропорционально количеству адсорбировавшегося/ десорбировавшегося с поверхности вещества (при известном фиксированном показателе преломления среды). ППР-отклик от немодифицированного наногеля оставался на уровне фонового сигнала в растворе, что говорит об отсутствии взаимодействий или минимальной адсорбции наногеля на субстрате (рис.4). Напротив, ФК-наногель вызывал сильный ППР-отклик, который понижался при добавлении свободной ФК (до или одновременно с ФК-наногелем), что свидетельствует о специфичном связывании ФК-наногеля с его мишенью. Хотя даже значительный избыток свободной фолиевой кислоты не блокировал полностью сигнал (200 мкМ свободной ФК по сравнению с 0.12 мкМ ФК в наногеле). Такое сильное связывание ФК-наногеля с субстратом частично можно объяснить его многоточечным взаимодействием с иммобилизованным ФСБ.

ФК-наногель

100 200 300 400 500 600 700 800 900 Время, сек

Рисунок 4. Специфическое взаимодействие наногелей, ФК-наногелей (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) и смеси ФК-наногелей со свободной ФК (100 мкМ) с ФСБ, иммобилизованным на

поверхности биосенсора.

2.4. Введение ЕАВ е наногели.

Противораковые препараты (СПОР и БОХ) были введены в наногели при различных молярных соотношениях лекарства и карбоксильных групп наногеля, [лекарство]/[СООН]. СООР эффективно связывался с ПМАК блоками наногеля посредством образования координационного комплекса с Р1 (II). В случае ООХ введение лекарства в наногели происходило за счет электростатических, а также гидрофобных взаимодействий. В обоих случаях размер «нагруженных» наногелей (наногелей с введенными БАВ в их объем) уменьшался, и ^-потенциал увеличивался, что свидетельствует о нейтрализации карбоксильных групп наногеля и включении лекарства в наногели (табл. 1, рис 5). Степень набухания наногелей с введенным лекарством сильно зависела от молярного соотношения [лекарство]/[СООН]. Размеры наногеля практически не менялись при повышении рН, если соотношение [СООР]/[СООН] было выше, чем 0.5 (рис 5).

Рисунок 5. Влияние введения лекарств на гидродинамический диаметр и ц-потешшал наногелей. Пустые наногели (■) и наногели с введенным CDDP при разных молярных соотношениях CDDP и карбоксильных групп ПМАК, [CDDP]/[COOH]: (*■) 0.25, (♦) 0.5, (X) 0.75, (О) 0.1 и (*) 1.5. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (п = 3).

Интересно отметить, что ёмкость наногелей (отношение массы введенного лекарства к массе нагруженного наногеля) уменьшалась на 10-15% при введении ФК-групп (рис.6). Более того, для сильно модифицированных ФК-наногелей, например 1.0 мкмоль ФК/мг полимера, ёмкость понижалась почти на 45% по сравнению с немодифицированными наногелями. Это может быть обусловлено стерическими препятствиями для проникновения и связывания лекарства с наногелями в результате сжатия ФК-наногеля, а также уменьшением числа свободных карбоксильных групп в наногеле вследствие побочных реакций при конъюгации ФК. Варьирование молярных соотношений [лекарство]/[СООН] от 0.25 до 1.5 не привело к резкому изменению ёмкости наногелей, но значительно

влияло на дисперсионную стабильность нагруженных наногелей. Так, при молярном соотношении больше чем 0.75, системы лекарство/наногель дестабилизировались и выпадали в осадок в течение нескольких дней (рис. 6). Тем не менее, мы получили стабильные нагруженные лекарством ФК-накогели с концентрацией ФК-вектора от 0.1 до 0.5 мкмоль ФК/мг полимера при массовом отношении лекарство/полимер равным, как минимум, 1:2. Данные наногели могут быть высушены и редиспергированы в водных средах практически без изменения первоначальных характеристик (Д3фф = 152 ± 8 нм, 5/<R> = 0.05 ± 0.01 против Д,фф = 165 ± 10 нм, 5/<R> = 0.10 ± 0.05 для исходных и редиспергированных наногелей, соответственно). Важно, что полученные наногели обладают исключительно высокой несущей способностью и остаются стабильными в физиологических условиях (ионная сила, pH) в течение нескольких недель.

0.25 0.5 0.75 1 1.5 0.25 0.5 0.75 1 1.5

[СйОРИСООН] рЭОХ]/[СООН]

Рисунок 6. Ёмкость наногелей (черные столбцы) и ФК-наногелей (белые столбцы) при различных молярных соотношениях (А) СПОР или (Б) ООХ и карбоксильных групп ПМАК при 37°С. Стрелками отмечены молярные соотношения [лекарство]/[СООН] при которых (1) ФК-наногели или (2) обе системы нестабильны и выпадают в осадок в течение нескольких дней. Степень модификации ФК-наногелей составила 0.2 ФК/мг полимера. Результаты выражены, как среднее значение ± БО (п = 3).

2.5. Высвобождение БАВ из наногелей.

Кинетику высвобождения лекарственных препаратов из наногелей изучали методом диализа в фосфатном (рН 7.4) и ацетатном (рН 5.5) буферных растворах. Из кинетических кривых высвобождения (зависимость количества высвободившегося лекарства от времени) СОЭР и ООХ из наногелей видно, что процесс высвобождения зависел от рН среды. Так, при рН 5.5 около 60% ООХ выделялось из наногелей в первые 6 ч., в то время как при рН 7.4 то же самое количество лекарства выделялось за 24 ч. (рис. 7Б). Ускоренное высвобождение ООХ из наногелей при кислых рН может быть объяснено протонированием карбоксильных групп ПМАК цепей, что приводит к ослаблению

электростатических взаимодействий между лекарством и наногелем. Стоит отметить, что высвобождение СОЭР характеризуется более пролонгированным действием (рис.7А). Кроме того, для двух типов лекарств наблюдалось замедление их скорости высвобождения из наногелей. Это может быть связано с различной подвижностью молекул лекарства во внутренних и внешних слоях наногеля, что влияет на скорость диффузии во внешнюю среду. Кроме того, по мере выделения лекарства отрицательный заряд наногеля увеличивается, и удерживание лекарств за счет образования новых связей усиливается. Отметим, что кинетические кривые высвобождения лекарств из наногеля и ФК-наногеля практически совпадали для всех изученных значений рН среды (рис.7), хотя для ФК-наногелей с высокой степенью модификации наблюдалось ускоренное выделение включенных лекарств, возможно, благодаря периферийной локализации лекарства. Эти данные наглядно демонстрируют, что природа взаимодействия лекарство/наногель и рН среды оказывают значительное влияние на кинетику высвобождения противораковых препаратов. Резюмируя, можно сказать, что нагруженные наногель и ФК-наногель могут выступать как модели лекарственных форм пролонгированного действия.

Рисунок 7. Кинетические кривые высвобождения (A) CDDP и (Б) DOX из наногелей и ФК-наногелей (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) в солевом буфере (PBS, рН 7.4 или ABS, рН 5.4) при 37°С: (А) наногель, рН 5.5, (М) ФК-наногель, рН 5.5, (Д)наногель, рН 7.4, и (□) ФК-наногель, рН 7.4. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (п = 3).

3. Наногели, модифицированные белками (моноклональные антитела).

Наша задача заключалась в том, чтобы разработать такой метод модификации наногелей, который бы позволял вводить любые векторные группы без потери их биологической активности, что актуально по отношению к специфическим моноклональные антителам (mAb) или их фрагментам (Fab). В работе были использованы специфические антитела СС49 (или их фрагменты), имеющие

высокую аффинность к опухолеспецифическому антигену гликопротеину TAG-72. Антитела СС49 уже используются в клинических исследованиях для диагностики и лечения различных онкологических заболеваний, благодаря высокому уровню экспрессии TAG-72 во многих аденокарциномах человека. В качестве диагностического агента мы использовали флуоресцентный зонд Alexa Fluor 680, который был ковалентно связан с наногелями.

3.1. Модификация наногелей антителами или их фрагментами.

Специфические направляющие вектора были присоединены к наногелям

ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) через гибкие ПЭГ связки в три стадии. На первой стадии антитела (или их фрагменты) тиолировали по общепринятой методике, используя реагент Траута. Вторая стадия заключалась в получении ПЭГилированных mAb (тАЬ-ПЭГ-№12) в результате реакции между тиольными группами антител и малеимидными группами ПЭГ связок. На заключительной стадии проводили ковалентное связывание карбоксильных групп наногеля, активированных N-гидроксисукцинимидом (NHS), с тАЬ-ПЭГ-NHj. Использование гибких ПЭГ связок, содержащих 170 мономерных звеньев, было обусловлено задачей сохранения доступности пришитых к наногелю антител для связывания с их специфическим антигеном.

3.2. Анализ mAb-наногелей и их физико-химические свойства.

mAb-наногели анализировали методом электрофореза в полиакриламидном

геле (SDS-PAGE) в присутствии и отсутствии восстанавливающего агента. Сравнение локализации свободных mAb и тАЬ-ПЭГ-МН2 в полиакриламидном геле подтверждает успешное ПЭГилирование как легких, так и тяжелых цепей антитела. Кроме того, данные электрофореза свидетельствуют об успешном синтезе mAb-наногелей, а также тщательной очистке конечного продукта методом гель-фильтрационной хроматографии. Количество антител, ковалентно связанных с наногелем, составило от 50 до 150 мкг белка/мг наногеля в зависимости от степени модификации.

Методом АСМ показано, что mAb-наногели сохраняли сферическую форму. Гидродинамический диаметр наногелей немного уменьшался после их модификации (160-170 нм против 140-150 нм, рН 7.4). Однако Ç-потенциал mAb-наногеля значительно увеличивался от -32.1 ± 2.1 мВ до -17.0 ± 3.2 мВ. Уменьшение отрицательного заряда наногеля можно объяснить его частичным экранированием благодаря антителам, ковалентно связанных с поверхностью наногеля, а также уменьшением подвижности ПМАК сегментов. Степень

набухания mAb-наногелей была практически такой же, как для немодифи-цированных наногелей. Дисперсия mAb-наногелей оставалась стабильной и не агрегировала в физиологическом растворе (0.15 M NaCl, рН 7.4) в течение, как минимум, 15 дней. В заключение стоит сказать, что разработанный нами метод позволяет эффективно модифицировать наногели различными антителами или их фрагментами без изменения морфологии и физико-химических свойств наногеля.

3.3. Специфичность связывания тАЬ-наногелей с их мишенью.

Специфическое взаимодействие между mAb-модифицированными наногелями и антигеном (бычий подчелюстной муцин, БПМ) было изучено методом ППР. Найдено, что наногели, модифицированные специфическим антителами СС49, имели высокую аффинность к антигену, в то время как наногели с неспецифическими векторами (IgG) ми немодифицированные наногели не обладали связывающей активностью по отношению к гликопротеину БПМ (рис. 8). Кроме того, добавление свободного СС49 (100-300 нМ) приводило к понижению ППР-отклика СС49-наногеля, что свидетельствует о специфичном связывании с БПМ-мишенью. Константы ассоциации (КА) были определены в режиме реального времени с помощью программного обеспечения BIAevaluation 3.0.2 и составили 1.21 х 108 М"1 для СС49 и 1.01 х 108 М"1 для СС49-наногель. Равновесные константы диссоциации (КГ); 1/КА) составили 8.3 нМ и 9.9 нМ, соответственно. Это свидетельствует о том, что СС49-наногели обладают практически такой же аффинностью к антигену, что и свободные антитела. Таким образом, разработанный нами метод позволяет векторизовать наногели различными антителами без нарушения их активности.

Рисунок 8. Специфическое

СС4Э-наногель

-------------- --------------------- . взаимодеиствие

СС49-наногелей, смеси СС49-наногелей со свободным СС49 (200 нМ), а также [еО-шшшелей

СС49-наногель + свободный СС49

—---———„л_______с_в «мобилизованным БПМ.

Концентрация образца - 100 нМ.

|дС-наногель

500 1000

Время, сек

4. Практическое применение разработанных наногелей в медицине.

В настоящей главе представлены данные о практическом применении полимерных наногелей, которые свидетельствуют о широких возможностях этих систем в медицинской практике. Была исследована способность ФК-наногелей, нагруженных противораковыми лекарствами, селективно убивать раковые клетки, а также уменьшать рост опухолей и увеличивать продолжительность жизни животных.

4.1. Применение ФК-наногелей с введенными противораковыми

лекарствами.

4.1.1. Исследования на клеточных культурах (in vitro эксперименты).

Уровень накопления ФК-наногелей в раковых клетках человека А2780, экспрессирующих фолатные рецепторы (ФР), был значительно выше, чем немодифицированных наногелей, и уменьшался в присутствии свободной фолиевой кислоты, что свидетельствует о специфическом взаимодействии с ФР. Найдено оптимальное количество ФК-векторов, связанных с наногелем (0.1-0.2 мкмоль ФК/мг полимера), выше которого захват ФК-наногелей клетками постепенно уменьшался. Такое поведение может быть объяснено 1) межмолекулярными взаимодействиями ФК-векторов, приводящими к их дезактивации, а также 2) пониженным поглощением клеткой сильно модифицированных ФК-наногелей через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Методом конфокальной микроскопии показано, что ФК-векторы не влияют на конечную локализацию наногелей в клетках.

Установлено, что порядок введения БАВ и модификации в системе ФК-наногель/CDDP сильно влияет на способность ФК-вектора связываться с ФР, хотя в случае ФК-наногель/DOX такой зависимости не наблюдалось. В частности, если вначале модифицировать наногели ФК-группами, а потом вводить лекарство, то транспорт таких систем в А2780 клетки будет практически на уровне наногель/CDDP, возможно, благодаря дезактивации a-карбоксильных групп фолата во время загрузки. Найдено, что система ФК-наногель/лекарство селективно захватывается ФР-положительной популяцией клеток даже в смеси различных клеточных линий. Введение ФК-векторов приводило к значительному усилению цитотоксического действия препаратов по сравнению с системой ФК-наногель/лекарство.

4.1.2. Исследования противоопухолевой активности "нагруженных" лекарством ФК-наногелей на мышах (in vivo эксперименты). Для подтвержде-

ния концепции адресной доставки лекарства in vivo с помощью ФК-наногелей использовали CDDP-нагруженные наногели. Всех животных с привитыми раковыми опухолями содержали на диете с недостатком фолата, что позволяло снизить концентрацию эндогенного фолата, а также влияло на количество ФР в раковой опухоли. Предварительные результаты по биораспределению лекарственных форм CDDP в мышах показали эффективность адресной доставки лекарства в опухоль. Так, концентрация Pt в опухолях мышей, получивших инъекции ФК-наногель/CDDP, была в 7 раз выше, чем для свободного лекарства. Противоопухолевую активность препаратов оценивали по изменению объема опухоли, потере массы и средней продолжительности жизни животных (рис. 9). Все лекарственные формы CDDP ингибировали рост опухоли по сравнению с контролем. Торможение роста опухоли и увеличение средней продолжительности жизни животных были более выражены в группе ФК-наногель/CDDP (рис. 9Б). Однако при его совместном введении со свободной фолиевой кислотой эти показатели ухудшались, что может быть объяснено насыщением ФР. Введение свободного лекарства не оказало такого выраженного тормозящего влияния на скорость роста опухоли, наблюдалась тенденция потери веса и сокращение средней продолжительности жизни животных (рис. 9А), что свидетельствует о токсичности препарата.

Рисунок 9. (А) Потеря в весе животных и (Б) рост опухоли после введения лекарственных форм CDDP в модели раковых клеток яичника А2780. Результаты выражены, как среднее ± SEM (п = 7-8), *р<0.05, **р< 0.01, NS-статистически незначимая величина.

Основываясь на наших in vitro и in vivo экспериментах, можно заключить, что разработанный нами ФК-наногель/CDDP представляет собой перспективную лекарственную форму, который в будущем, возможно, позволит понизить системную токсичность лекарства, улучшить противоопухолевый эффект и продлить жизнь пациента.

выводы

1. Впервые синтезированы и всесторонне изучены полимерные ковалентно сшитые наногели, которые способны включать молекулы БАВ и нести различные векторные группы. Показано влияние природы комплексообразующих ионов металла и относительного соотношения анионного и неионогенного блоков в блок-сополимере ПЭГ-б-ПМАК на формирование блок-иономерных комплексов, которые являются исходными материалами для синтеза таких наногелей.

2. Показана принципиальная возможность контроля дисперсионной стабильности, размера и ^-потенциала наногелей и их производных посредством изменения плотности сшивки, степени модификации векторными группами и количества введенного лекарства. Установлено влияние изменения рН и ионной силы раствора на набухание таких наногелей и их производных.

3. Разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей различными химическими группами (фолиевая кислота (ФК), антитела) с сохранением способности этих групп к специфическому связыванию с их мишенями (фолатный рецептор, антиген).

4. Впервые осуществлен синтез фолат-модифицированных наногелей с введенными молекулами БАВ (цисплатин, доксорубицин). Установлено, что количество ФК-векторов влияет на способность наногелей эффективно связывать и удерживать БАВ в своем объеме. Проведена оптимизация числа групп ФК (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) с целью увеличения введения БАВ в наногели и достижения их стабильности в физиологических средах.

5. Впервые показана возможность одновременного использования цисплатина и ФК-векторов в одной системе для адресной доставки лекарства в опухоли. С помощью экспериментов in vitro и in vivo установлено, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, улучшают активность и снижают токсичность цисплатина.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Jong Oh Kim, Nataliya V. Nukolova, Hardeep Oberoi, Alexander V. Kabanov, and Tatiana K. Bronich; Block ionomer complex micelles with cross-linked cores for drug delivery.//Bbic0K0M0neK. Соед. A. 2009. T. 51. № 6. c. 1-11.

2. Нуколова II.B., Кабанов A.B., Бронич Т.К. Адресная доставка полимерных наногелей. //Тезисы докладов 1-ой Международной летней школы - Нано2009. «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», Россия. 2009. с. 388.

3. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander B. Zezin, Tatiana K. Bronich and Alexander V. Kabanov. Cisplatia-loaded folate-conjugated nanogels for targeted cancer therapy. // The 42nd Annual Pharmaceutics Graduate Student Research Meeting. Columbus.USA. 2010. Book of abstracts, p. 65.

4. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander V. Kabanov and Tatiana K.. Bronich. Fo late-conjugated nanogels as a nanocarrier for targeted delivery for cancer treatment.//The 41st Annual Midwest Student Biomedical Research Forum. Omaha. USA. 2010. Book of abstracts, p.48

5. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander V. Kabanov and Tatiana K. Bronich. Folate-Conjugated Cross-Linked Polymer Nanogels as a Nanocarrier for Targeted Delivery.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS'09). Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts, p.72

6. Nataliya V. Nukolova, Surinder Batra, Alexander V. Kabanov, Tatiana K.. Bronich. Preparation of Antibody-Bound Cross-Linked Micelles for Targeted Drug Delivery.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS'09). Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts, p.73

7. Jong Oh K.im, Nataliya V. Nukolova, Zigang Yang, Alexander V. Kabanov, and Tatiana K. Bronich. Surface Functionalized Nanogels with Cross-Linked Ionic Core for Specific Tumor Targeting.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS'09). Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts, p.57

8. Hardeep S. Oberoi, Fredric C. Laquer, Nataliya V. Nukolova, Jiangeng Huang, Yazen Alnouti and Tatiana K. Bronich. Biodistribution and comparative pharmacokinetics of cisplatin loaded core cross-linked micelles in mice.// The 7th international Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS'09), Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts, p. 74

9. Nataliya V. Nukolova, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich. Design of folic acid-conjugated cross-linked polymer micelles for delivery of magnetic resonance imaging agents // The 50th annual National Student Research Forum. Galveston. Texas. USA. 2009. Book of abstracts, p.90

10. Nataliya V. Nukolova, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich. Polymer Micelles for Delivery of Imaging Agents.// The 40th Annual Midwest Student Biomedical Research Forum. Omaha. Nebraska. USA. 2009. Book of abstracts, p.66

11. Nataliya V. Nukolova, Michael D. Boska, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich. Polymer Micelles with Cross-linked Core for Delivery of Imaging Agents.// The 6th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS'08), Toronto. Canada. 2008. Book of abstracts, p.85

Список сокращений:

ACM атомно-силовая микроскопия

БАВ биологически активные вещества

БИК блок-иономерные комплексы

ДРС динамическое рассеяние света

КДИ карбодиимид

ППР поверхности о плазменный резонанс

ПЭГ-б-ПМАК блок-сополимер этиленгликоля и метакриловой кислоты

сдл система доставки лекарств

ФК фолиевая кислота

'Н-ЯМР протонный ядерный магнитный резонанс

CDDP цисплатин

DOX доксорубицин

mAb или Fab моноклональные антитела или их фрагменты

NHS И-гидроксисукцинимид

5/<R> относительная ширина распределения частиц по размерам

SD среднеквадратичное отклонение

Подписано в печать 07.10.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1026 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, дЛ Главное здание МГУ, к. 102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Синтез наногелей

1.1.1. Наногели с нековалентными сшивками

1.1.2. Наногели с ковалентными сшивками

1.2. Физико-химические свойства наногелей

1.3. Наногели как полимерные системы доставки лекарств

1.3.1. Введение БАВ в наногели

1.3.2. Контролируемое высвобождение БАВ из наногелей

1.4. Химическая модификация наногелей. Введение векторных 26 групп

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Реагенты и растворители

2.1.2. Блок-сополимеры этиленглиголя и метакриловой кислоты

2.1.3. Использованные клеточные культуры

2.1.4. Испытания на животных

2.2. Синтез полимерных наногелей и их модификация

2.2.1. Общая методика синтеза полимерных наногелей

2.2.2. Синтез флуоресцентно-меченых наногелей

2.2.3. Модификация наногелей векторными группами

2.2.3.1. Фолат-модифицированные наногели (ФК-наногель)

2.2.3.2. Наногели, модифицированные моноклональными 39 антителами или их фрагментами

2.2.4. Введение БАВ в наногели

2.2.4.1. Цисплатин-нагруженный наногель (наногель/CDDP)

2.2.4.2. Доксорубицин-нагруженный наногель (наногель/DOX)

2.2.5. Контролируемое высвобождение БАВ из наногелей

2.3. Физико-химические методы исследования

2.4. Исследования на клеточных культурах (in vitro эксперименты)

2.5. Исследования на животных (in vivo эксперименты)

2.5.1. Противораковая активность CDDP/наногелей

2.5.2. Визуализация раковых опухолей in vivo

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Синтез и физико-химические свойства полимерных наногелей

3.1.1. Синтез полимерных наногелей на основе 53 блок-иономерных комплексов

3.1.2. Физико-химические характеристики наногелей

3.2. Фолат-модифицированные наногели с введенными БАВ

3.2.1. Синтез ФК-наногелей

3.2.2. Морфология и набухание ФК-наногелей

3.2.3. Специфичность связывания ФК-наногелей с их мишенью

3.2.4. Введение БАВ в наногели

3.2.5. Высвобождение БАВ из наногелей

3.3. Наногели, модифицированные белками 82 (моноклональные антитела)

3.3.1. Модификация наногелей антителами или их фрагментами

3.3.2. Анализ mAb-наногелей и их физико-химические свойства

3.3.3. Специфичность связывания mAb-наногелей с их мишенью

3.4. Практическое применение разработанных наногелей в медицине

3.4.1. Применение ФК-наногелей с введенными противораковыми 93 препаратами

3.4.1.1. Исследования на клеточных культурах (ш vitro эксперименты)

3.4.1.2. Исследования противоопухолевой активности нагруженных 106 лекарством ФК-наногелей на мышах (in vivo эксперименты)

3.4.2. Флуоресцентно-меченые СС49-наногели для диагностики рака 110 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 115 БЛАГОДАРНОСТИ 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM атомно-силовая микроскопия

БАВ биологически активные вещества

БИК блок-иономерный комплекс

БПМ бычий подчелюстной муцин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДВС дивинилсульфон

Дэфф гидродинамический диаметр

ДРС динамическое рассеяние света

ИСП-МС масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой

КДИ карбодиимид

МАЛ малеимидная группа наногель/CDD цисплатин-нагруженный наногель наногель/DOX доксорубицин-нагруженный наногель

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПМАК полиметакриловая кислота

ППР поверхностно плазмонный резонанс

ПЭГ полиэтиленгликоль

ПЭГ-о-ПМАК блок-сополимер этиленгликоля и метакриловой кислоты

ПЭИ полиэтиленимин

РЭС ретикулоэндотелиальная система

СДЛ система доставки лекарств

ФИТЦ флуоресцеин изотиоцианат

ФК фолиевая кислота

ФК-наногель фолат-модифицированный наногель

ФР ф о латный рецептор

ФР-а фолатный рецептор а-изоформы

ФСБ фолат-связывающий белок

Н-ЯМР протонный ядерный магнитный резонанс

ABS ацетатно-солевой буферный раствор

CDDP цисплатин

DOX доксорубицин

Fab фрагменты моноклональных антител

РаЬ-наногель наногель, модифицированный фрагментами тАЬ иммуноглобулин О тАЬ моноклональные антитела тАЬ-наногель наногель, модифицированный моноклональными антителами тАЬ-ПЭГ-Ж12 ПЭГилированные антитела

N48 М-гидроксисукцинимид

РВ8 фосфатный буфер

5/<Я> относительная ширина распределения частиц по размерам

БОЭ-РАОЕ электрофорез в полиакриламидном геле

ББ среднеквадратичное отклонение

БЕМ стандартная ошибка среднего

Наногели представляют собой уникальный класс наноразмерных гидрогелей, основанных на гидрофильной или амфифильной полимерной сетке, которая стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей. В настоящее время наногели интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека благодаря способности обратимо откликаться на небольшие внешние воздействия« (температура, ионная сила, рН, электрическое поле и др.), а также включать в свой объем и контролируемо высвобождать различные биологически активные вещества (БАВ).

В последние годы гидрогели микро- и наноразмеров привлекают все большее внимаиие в качестве основы для создания систем доставки лекарств (СДЛ) в определенные органы. Наногели способны абсорбировать большое количество воды (до 95% в/в), тем самым, содействуя включению в свой объем различных молекул (РНК, ДНК, олигонуклеотиды, низкомолекулярные терапевтические и диагностические агенты), которые нестабильны, быстро выводятся из организма или характеризуются высокой системной токсичностью. Наногели позволяют конструировать СДЛ с контролируемым «спусковым- механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, наногели могут быть модифицированы различными векторными группами, которые способствуют избирательной направленной доставке БАВ в определенные органы или клетки-мишени.

Наногели - это интенсивно развивающийся, относительно новый класс наноматериалов (первый обзор вышел в 2002 [1]). Поэтому многие физико-химические свойства наногелей еще практически не изучены, в литературе мало работ по введению направляющих векторных групп в наногели, до сих пор нет успешных попыток использования наногелей для адресной доставки лекарственных препаратов in vivo.

Данная диссертационная работа посвящена синтезу сложных полимерных наногелей, которые способны включать и контролируемо высвобождать биологически активные вещества, созданию принципиально новых подходов для модификации этих сложных полимерных систем различными векторными группами (низкомолекулярные соединения или белки) с сохранением их биологической активности. Всесторонний анализ физико-химических особенностей таких наногелей в водных средах является важным этапом для создания новых систем доставки лекарств с контролируемым дозированием на их основе. Результаты этого исследования имеют принципиальное значение для развития этого нового класса наноматериалов и создают базис для разработки функциональных систем для направленной доставки терапевтических и диагностических молекул в раковые опухоли на основе наногелей.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Наногели представляют собой набухшую пространственную структурную сеть полимеров, которая способна сохранять форму и стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей (ковалентные сшивки). Дисперсионная стабильность наногелей зависит от комбинации многих факторов, например, химической природы полимеров, качества растворителя, степени сшивкши других. В настоящее время микро- и наногели интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека (оптоэлектроника, системы доставки лекарств (СДЛ) с контролируемым дозированием, диагностика заболеваний). Представленный обзор литературы посвящен основным подходам синтеза микро/наногелей, их физико-химическим характеристикам и возможности использования в качестве наноконтейнеров для адресной доставки лекарственных и диагностических препаратов.

1.1. Синтез наногелей

Методы синтеза наногелей можно разделить на два основных класса, а именно: 1) самоорганизация полимерных цепей и их стабилизация за счет физических нековалентных связей или 2) введение химических ковалентных сшивок. Первые работы по синтезу наногелей с нековалентными связями были выполнены в научной группе под руководством J. Sunamoto на основе холестерин-модифицированных полисахаридов [2]. Наногели, имеющие химические ковалентные сшивки, впервые были получены в группе A.B. Кабанова [3]. Эти наногели были синтезированы на основе блок-сополимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полиэтиленимина (ПЭИ) (ПЭГ-б-ПЭИ) для доставки олигонуклеотидов. Стоит отметить, что понятие «наногель» включает в себя широкий спектр наноразмерных частиц, основанных на полимерной сетке, которая способной набухать и изменять физико-химические характеристики в ответ на небольшие изменения в окружающей среде.

выводы

1. Впервые синтезированы и всесторонне изучены полимерные ковалентно сшитые наногели, которые способны включать молекулы БАВ и нести различные векторные группы. Показано влияние природы комплексообразующих ионов металла и относительного соотношения анионного и неионогенного блоков в блок-сополимере ПЭГ-б-ПМАК на формирование блок-иономерных комплексов, которые являются исходными материалами для синтеза таких наногелей.

2. Показана принципиальная возможность контроля дисперсионной стабильности, размера и ^-потенциала наногелей и их производных посредством изменения плотности сшивки, степени модификации векторными группами и количества введенного лекарства. Установлено влияние изменения рН и ионной силы раствора на набухание таких наногелей и их производных.

3. Разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей различными химическими группами (фолиевая кислота (ФК), антитела) с сохранением способности этих групп к специфическому связыванию с их мишенями (фолатный рецептор, антиген).

4. Впервые осуществлен синтез фолат-модифицированных наногелей с введенными молекулами БАВ (цисплатин, доксорубицин). Установлено, что количество ФК-векторов влияет на способность наногелей эффективно связывать и удерживать БАВ в своем объеме. Проведена оптимизация числа групп ФК (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) с целью увеличения введения БАВ в наногели и достижения их стабильности в физиологических средах.

5. Впервые показана возможность одновременного использования цисплатина и ФК-векторов в одной системе для адресной доставки лекарства в опухоли. С помощью экспериментов in vitro и in vivo установлено, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, улучшают активность и снижают токсичность цисплатина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Прежде всего я хотела бы выразить глубокую благодарность Татьяне Карповне Бронич и Александру Викторовичу Кабанову за постоянное внимание и поддержку в течение всего времени моей работы под их руководством, за их смелые идеи и удивительную работоспособность. За ценный урок: видеть картину в целом, но обращать внимание на детали. Также я хотела бы выразить благодарность Hardeep Oberoi за плодотворное сотрудничество в течение всего времени работы над проектом.

Работа была выполнена с использованием оборудования Центра «Наноматериалы» (отделение Center for Biomedical Research Excellence (CoBRE) в Небраске) при финансовой поддержке Национального Института Здоровья США грант RR021937. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства обороны США MRMC 06108004 (А.В.К.) и Национального Института Здоровья США CAI 16590 (Т.К.Б). Я благодарна Центру конфокальной микроскопии и проточной цитометрии (Dr. Charles A. Kuszynski), Центру по изучению межмолекулярного взаимодействия, Центру по получению АСМ-изображений (Медицинский центр университета Небраски).

В заключение, я хотела бы поблагодарить за оказанную помощь и поддержку весь состав Центра Доставки Лекарств и Наномедицины, под руководством Александра Викторовича Кабанова.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наногели - это уникальный класс гидрогелей, характеризующийся наноразмерами, дисперсионной стабильностью и способностью быстро откликаться на изменения в окружающей среде. Наногели, изученные в данной работе, представляют собой набухшую структурную трехмерную сетку, сшитых полимерных ПМАК цепей, покрытую гидрофильной ПЭГ короной. Сшитое формообразующее отрицательно заряженное ядро наногеля позволяет контролировать связывание и высвобождение низкомолекулярных заряженных молекул. В тоже время, благодаря гидрофильной ПЭГ короне увеличивается стабильность и время циркуляции таких наночастиц в кровотоке, предотвращается взаимодействие введенных лекарственных и/или диагностических молекул с белками сыворотки, обеспечивается био- и иммунногенная совместимость. В нашей работе продемонстрировано, что физико-химические свойства таких наноматериалов (набухание, размеры, заряд, дисперсионная стабильность и др.) зависят от многих параметров (состав блок-сополимера, степень сшивки, рН среды, ионная сила раствора и др.) и могут быть заранее заданы.

В настоящей работе впервые показана возможность адресной доставки наногелей, нагруженных терапевтическими лекарствами, в опухоль in vivo. Чтобы синтезировать активный и стабильный в физиологических условиях ФК-наногель, было решено несколько основных нетривиальных задач. Во-первых, разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей, которые обладают несколькими различными функциональными группами. Каждая частица, изучаемого в настоящей работе наногеля, несет, по крайней мере, сотни карбоксильных, амино- и концевых гидроксильных групп, которые могут одновременно вступать в реакцию и влиять на выход основного продукта. Заслуживает внимания, что разработана воспроизводимая методика синтеза ФК-наногелей и всех промежуточных продуктов, которые можно хранить без потери активности до нескольких месяцев. Кроме того, предложен метод модификации наногелей, который позволяет вводить любые векторные группы без потери их биологической активности, что актуально по отношению к специфическим антителам.

Другая задача состояла в оптимизации числа векторных групп, ковалентно связанных с поверхностью наногеля. Как показано, степень' модификации ФК-наногелей влияет на их физико-химические характеристики. Так, при увеличении числа ФК-векторов наногели теряют способность к набуханию, а также уменьшается, эффективность их загрузки лекарствами и стабильность нагруженных ФК-наногелей. Кроме того, эндоцитоз сильно модифицированных ФК-наногелей в ФР-положительные клетки менее эффективен, так как большая часть ФК-наногеля «застревает» в клеточной мембране и не транспортируется внутрь клетки. Несмотря на сложность модификации, было найдено оптимальное количество связанных с наногелем ФК-векторов, при котором нагруженные наногели (до 50% в/в лекарства) стабильны в течение нескольких месяцев и максимально захватываются1 клетками. Следует отметить, что разработан метод загрузки наногелей лекарствами (ФК-наногель/СББР), при котором ФК-вектора сохраняют способность связываться с рецептором. Впервые показана возможность одновременного использования СЭОР и направляющих ФК-векторов в одной терапевтической молекуле. Недостаточный интерес к комбинации СББР/ФК, возможно, заключается в реакции СББР с а-карбоксильной группой фолата, что приводит к дезактивации ФК-вектора. Нами был предложен метод загрузки наногеля лекарством, позволяющий сохранять активность ФК-наногеля/СББР.

Заслуживает внимание, что доставка лекарства в желаемую область-мишень животного и его противоопухолевый эффект посредством ФК-наногеля/СБОР были подавлены введением свободной фолиевой кислоты.

Это означает, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, действительно обладают специфичностью к ФР и улучшают активность новых лекарственных форм за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза, что подтверждено in vitro и in vivo экспериментами. Кроме того, данные полимерные наноматериалы обладают уникальной способностью различать раковые и здоровые клетки in vitro, что может быть дополнительным преимуществом этих систем. Также показана возможность использования флуоресцентно-меченых наногелей, модифицированных специфическими антителами или их фрагментами, для диагностики раковой опухоли.

Моноклональные антитела или фрагменты, а также ФК широко применяются в качестве векторов для адресной доставки различных терапевтических и диагностических агентов в области наномедицины. Мы считаем, что новые лекарственные формы, основанные на наногелях, это значительный шаг вперед в использовании нанотехнологий в медицине. В настоящей работе продемонстрирована возможность эффективной адресной доставки новых лекарственных форм, основанных на наногелях, что открывает широкие перспективы для дальнейшего развития этого особого класса полимерных материалов.

1. S.V. Vinogradov, Т.К. Bronich, A.V. Kabanov, Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 135-147.

2. K. Akiyoshi, S. Deguchi, N. Moriguchi, S. Yamaguchi, J. Sunamoto, Self-Aggregates of Hydrophobized Polysaccharides in Water. Formation and Charactenstics of Nanoparticles, Macromolecules 26 (1993) 30623068.

3. S. Vinogradov, E. Batrakova, A. Kabanov, Poly(ethylene glycol)-polyethyleneimine NanoGel (TM) particles: novel drug delivery systems for antisense oligonucleotides, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 161999) 291-304.

4. K. Akiyoshi, A. Ueminami, S. Kurumada, Y. Nomura, Self-association of cholesteryl-bearing poly(L-lysine) in water and control of its secondary structure by host-guest interaction with cyclodextrin, Macromolecules 332000) 6752-6756.

5. K.Y. Lee, W.H. Jo, I.C. Kwon, Y.H. Kim, S.Y. Jeong, Structural determination and interior polarity of self-aggregates prepared from deoxycholic acid-modified chitosan in water, Macromolecules 31 (1998) 378-383.

6. S.J. Shu, X.G. Zhang, D.Y. Teng, Z. Wang, C.X. Li, Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly (L-aspartic acid)-polyethylene glycol for controlled protein release, Carbohydrate Research 344 (2009) 1197-1204.

7. S. Daoud-Mahammed, P. Couvreur, K. Bouchemal, M. Cheron, G. Lebas, C. Amiel, R. Gref, Cyclodextrin and Polysaccharide-Based Nanogels: Entrapment of Two Hydrophobic Molecules, Benzophenone and Tamoxifen, Biomacromolecules 10 (2009) 547-554.

8. K. Akiyoshi, E.C. Kang, S. Kurumada, J. Sunamoto, T. Principi, F.M. Winnik, Controlled association of amphiphilic polymers in water:

9. Thermosensitive nanoparticles formed by self-assembly of hydrophobically modified pullulans and poly(N-isopropylacrylamides), Macromolecules 33 (2000) 3244-3249.

10. K. Akiyoshi, S. Kobayashi, S. Shichibe, D. Mix, M. Baudys, S.W. Kim, J.r

11. Sunamoto, Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin, J. Control. Release 54 (1998) 313-320.

12. J.K. Oh, R. Drumright, D.J. Siegwart, K. Matyjaszewski, The development of microgels/nanogels for drug'delivery applications, Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 448-477.

13. K. Raemdonck, J. Demeester, S. De Smedt, Advanced nanogel engineering for drug delivery, Soft Matter 5 (2009) 707-715.

14. V. Boyko, A. Pich, Y. Lu, S. Richter, K.F. Arndt, H.J.P. Adler, Thermosensitive poly(N-vinylcaprolactam-co-acetoacetoxyethyl methacrylate) microgels: 1 synthesis and characterization, Polymer 44 (2003) 78217827.

15. C.L. Lin, W.Y. Chiu, C.F. Lee, Preparation, morphology, and thermoresponsive properties of poly(N-isopropylacrylamide)-based copolymer microgels, J. Polym. Sci. Pol. Chem.-44 (2006) 356-370.

16. Ю.Д. Семчиков, Высокомолекулярные соединения, Издательский центр "Академия", Москва, 2006.

17. L. Liang, W. Funke, Cross-linking self-emulsifying copolymerization of an unsaturated polyester and styrene, Macromolecules 29 (1996) 86508655.

18. H. Nur, V.T. Pinkrah, J.C. Mitchell, L.S. Benee, M.J. Snowden, Synthesis and properties of polyelectrolyte microgel particles, Advances in Colloid and Interface Science 158 (2010) 15-20.

19. S. Mendrek, A. Mendrek, H.J. Adler, A. Dworak, D. Kuckling, Preparation of Temperature-Sensitive Core-Shell Poly(glycidol)/Poly(Nisopropylacrylamide) Nanohydrogels under Surfactant-Free Conditions, Macromolecules 42 (2009) 9161-9169.

20. S. Schachschal, A. Balaceanu, C. Melian, D.E. Demco, T. Eckert, W. Richtering, A. Pich, Polyampholyte Microgels with Anionic Core and Cationic Shell, Macromolecules 43 (2010) 4331-4339.

21. S.R. Marek, C.A. Conn, N.A. Peppas, Cationic nanogels based on diethylaminoethyl methacrylate, Polymer 51 (2010) 1237-1243.

22. E. Kohli, H.Y. Han, A.D. Zeman, S.V. Vinogradov, Formulations of biodegradable Nanogel carriers with 5'-triphosphates of nucleoside analogs that display a reduced cytotoxicity and enhanced drug activity, J. Control. Release 121 (2007) 19-27.

23. S.V. Vinogradov, A.D. Zeman, E.V. Batrakova, A.V. Kabanov, Polyplex Nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs, J. Control. Release 107 (2005) 143-157.

24. L.F. Yan, W. Tao, One-step synthesis of pegylated cationic nanogels of poly(N,N '-dimethyl amino ethyl methacrylate) in aqueous solution via self-stabilizing micelles using an amphiphilic macroRAFT agent, Polymer 51 (2010) 2161-2167.

25. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, S.A. Simon, D. Needham, pH and ion-triggered volume response of anionic hydrogel microspheres, Macromolecules 31 (1998) 5084-5093.

26. K. McAllister, P. Sazani, M. Adam, M.J. Cho, M. Rubinstein, R.J. Samulski, J.M. DeSimone, Polymeric nanogels produced via inverse microemulsion polymerization as potential gene and antisense delivery agents, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 15198-15207.

27. I. Kaneda, A. Sogabe, H. Nakajima, Water-swellable polyelectrolyte microgels polymerized in an inverse microemulsion using a nonionic surfactant, Journal of Colloid and Interface Science 275 (2004) 450-457.

28. K. Ogawa, A. Nakayama, E. Kokufuta, Electrophoretic behavior of ampholytic polymers and nanogels, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 82238227.

29. K. Ogawa, A. Nakayama, E. Kokufuta, Preparation and characterization of thermosensitive polyampholyte nanogels, Langmuir 19 (2003) 31783184.

30. A.V. Kabanov, S.V. Vinogradov, Nanogels as Pharmaceutical Carriers: Finite Networks of Infinite Capabilities, Angew Chem Int Ed Engl 48 (2009) 5418-5429.

31. T.K. Bronich, Keifer, P. A., Shlyakhtenko, L. S., Kabanov, A. V., Polymer micelle with cross-linked ionic core, J Am Chem Soc 127 (2005) 8236-8237.

32. J.O. Kim, N.V. Nukolova, H.S. Oberoi, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Block ionomer complex micelles with cross-linked cores for drug delivery, Polym. Sci. Ser. A 51 (2009) 708-718.

33. J.Y. Zhang, Y.M. Zhou, Z.Y. Zhu, Z.S. Ge, S.Y. Liu, Polyion complex micelles possessing thermoresponsive coronas and their covalent core stabilization via "click" chemistry, Macromolecules 41 (2008) 1444-1454.

34. R.K. O'Reilly, M.J. Joralemon, K.L. Wooley, C.J. Hawker, Functionalization of micelles and shell cross-linked nanoparticles using click chemistry, Chemistry of Materials 17 (2005) 5976-5988.

35. S. Yusa, M. Sugahara, T. Endo, Y. Morishima, Preparation and Characterization of a pH-Responsive Nanogel Based on a Photo-Cross1.nked Micelle Formed From Block Copolymers with Controlled Structure, Langmuir 25 (2009) 5258-5265.

36. R.K. O'Reilly, C.J. Hawker, K.L. Wooley, Cross-linked block copolymer micelles: functional nanostructures of great potential and versatility, Chemical Society Reviews 35 (2006) 1068-1083.

37. R.K. O'Reilly, M.J. Joralemon, C.J. Hawker, K.L. Wooley, Facile syntheses of surface-functionalized micelles and shell cross-linked nanoparticles, J. Polym. Sci. Pol. Chem. 44 (2006) 5203-5217.

38. K.B. Thurmond, T. Kowalewski, K.L. Wooley, Shell cross-linked knedels: A synthetic study of the factors affecting the dimensions and properties of amphiphilic core-shell nanospheres, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 6656-6665.

39. S. Bontha, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymer micelles with cross-linked ionic cores for delivery of anticancer drugs, J. Control. Release 114(2006) 163-174.

40. T.K. Bronich, S. Bontha, L.S. Shlyakhtenko, L. Bromberg, T.A. Hatton, A.V. Kabanov, Template-assisted synthesis of nanogels from Pluronic-modified poly(acrylic acid), Journal of Drug Targeting 14 (2006) 357366.

41. S.E.A. Gratton, P.A. Ropp, P.D. Pohlhaus, J.C. Luft, V.J. Madden, M.E. Napier, J.M. DeSimone, The effect of particle design on cellular internalization pathways, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (2008) 11613-11618.

42. L.E. Euliss, J.A. DuPont, S. Gratton, J.M. DeSimone, Imparting size, shape, and composition control of materials for nanomedicine, Chemical Society Reviews 35 (2006) 1095-1104.

43. J.P. Rolland, B.W. Maynor, L.E. Euliss, A.E. Exner, G.M. Denison, J.M. DeSimone, Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 10096-10100.

44. S.E.A. Gratton, P.D. PohhauS, J. Lee, I. Guo, M.J. Cho, J.M. DeSimone,

45. Nanofabricated particles for engineered drug therapies: A preliminary

46. Biodistribution study of PRINT (TM) nanoparticles, J. Control. Release 121 (2007) 10-18.

47. L.C. Glangchai, M. Caldorera-Moore, L. Shi, K. Roy, Nanoimprint lithography based fabrication of shape-specific, enzymatically-triggered smart nanoparticles, J. Control. Release 125 (2008) 263-272.

48. M. Oishi, Y. Nagasaki, Stimuli-responsive smart nanogels for cancer diagnostics and therapy, Nanomedicine 5 (2010) 451-468.

49. Y. Qiu, K. Park, Environment-sensitive hydrogels for drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (2001) 321-339.

50. S.V. Vinogradov, Colloidal microgels in drug delivery applications, Current Pharmaceutical Design 12 (2006) 4703-4712.

51. J. He, X. Tong, Y. Zhao, Photoresponsive Nanogels Based on Photocontrollable Cross-Links, Macromolecules 42 (2009) 4845-4852.

52. A. Suzuki, T. Tanaka, Phase transition in polymer gels induced by visible light, Nature 346 (1990) 345-347.

53. R. Pelton, Temperature-sensitive aqueous microgels, Advances in Colloid and Interface Science 85 (2000) 1-33.

54. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, D. Shah, S.A. Simon, D. Needham, Investigation of the swelling response and drug loading of ionic microgels: The dependence on functional group composition, Macromolecules 32 (1999) 8996-9006.

55. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, A.V. Dobrynin, S.A. Simon, D. Needham, Investigation of the swelling response and loading of ionic microgels with drugs and proteins: The dependence on cross-link density, Macromolecules 32 (1999) 4867-4878.

56. F. Ilmain, T. Tanaka, E. Kokufuta, Volume transition in a gel driven by hydrogen-bonding, Nature 349 (1991) 400-401.

57. N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (2000) 27-46.

58. N.A. Peppas, J.Z. Hilt, A. Khademhosseini, R. Langer, Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology, Adv. Mater. 18 (2006) 1345-1360.

59. J. Ricka, T. Tanaka, Swelling of ionic gels: quantitative performance of the Donnan theory, Macromolecules 17 (1984) 2916-2921.

60. S.A. Dubrovskii, V.V. Vasil'ev, Swelling pressure and elastic behavior of polymacromonomer networks with different functionalities of junctions, Polym. Sci. Ser. A 48 (2006) 924-933.

61. S.K. De, N.R. Aluru, B. Johnson, W.C. Crone, D.J. Beebe, J. Moore, Equilibrium swelling and kinetics of pH-responsive hydrogels: Models, experiments, and simulations, Journal of Microelectromechanical Systems 11 (2002) 544-555.

62. S.V. Vinogradov, T.K. Bronich, A.V. Kabanov, Self-assembly of polyamine-poly(ethylene glycol) copolymers with phosphorothioate oligonucleotides, Bioconjugate Chemistry 9 (1998) 805-812.

63. S. Kazakov, M. Kaholek, I. Gazaryan, B. Krasnikov, K. Miller, K. Levon, Ion concentration of external solution as a characteristic of micro- and nanogel ionic reservoirs, J. Phys. Chem. B 110 (2006) 15107-15116.

64. T.K. Bronich, S.V. Vinogradov, A.V. Kabanov, Interaction of nanosized copolymer networks with oppositely charged amphiphilic molecules, Nano Letters 1 (2001) 535-540.

65. P. Colombo, R. Bettini, P. Santi, A. DeAscentiis, N.A. Peppas, Analysis of the swelling and release mechanisms from drug delivery systems with emphasis on drug solubility and water transport, J. Control. Release 39 (1996) 231-237.

66. J.O. Kim, G. Sahay, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymeric Micelles with Ionic Cores Containing Biodegradable Cross-Links for Delivery of Chemotherapeutic Agents, Biomacromolecules 11 (2010) 919-926.

67. A.V. Dobrynin, R.H. Colby, M. Rubinstein, Polyampholytes, J. Polym. Sci. Pt. B-Polym. Phys. 42 (2004) 3513-3538.

68. Y. Ogawa, K. Ogawa, B.L. Wang, E. Kokufuta, A biochemo-mechanical system consisting of polyampholyte gels with coimmobilized glucose oxidase and urease, Langmuir 17 (2001) 2670-2674.

69. S.H. Choi, J.H. Lee, S.M. Choi, T.G. Park, Thermally reversible pluronic/heparin nanocapsules exhibiting 1000-fold volume transition, Langmuir 22 (2006) 1758-1762.

70. S. Zschoche, J. Rueda, V. Boyko, F. Krahl, K.F. Amdt, B. Voit, Thermo-Responsive Nanogels Based on PolyNIPAAm-graft-(2-alkyl-2-oxazoline)]s Crosslinked in the Micellar State, Macromol. Chem. Phys. 211 (2010) 1035-1042.

71. Y. Ogawa, K. Ogawa, E. Kokufuta, Swelling-shrinking behavior of a polyampholyte gel composed of positively charged networks with immobilized polyanions, Langmuir 20 (2004) 2546-2552.

72. T. Sawai, H. Shinohara, Y. Ikariyama, M. Aizawa, Electrical control of the volume of pH-sensitive microgels, Journal of Electroanalytical Chemistry 297 (1991) 399-407.

73. J.K. Oh, D.I. Lee, J.M. Park, Biopolymer-based microgels/nanogels for drug delivery applications, Prog. Polym. Sci. 34 (2009) 1261-1282.

74. K.N. Minh, D.S. Lee, Injectable Biodegradable Hydrogels, Macromol. Biosci. 10(2001) 563-579.

75. T. Tanaka, I. Nishio, S.-T. Sun, S. Ueno-Nishio, Collapse of Gels in an Electric Field, Science 218 (1982) 467-469.

76. N. Sahiner, A.M. Alb, R. Graves, T. Mandal, G.L. McPherson, W.F. Reed, V.T. John, Core-shell nanohydrogel structures as tunable delivery systems, Polymer 48 (2007) 704-711.

77. H. Kobayashi, O. Katakura, N. Morimoto, K. Akiyoshi, S. Kasugai, Effects of Cholesterol-Bearing Pullulan (CHP)-Nanogels in Combination with Prostaglandin El on Wound Healing, J. Biomed. Mater. Res. Part B 9IB (2009) 55-60.

78. N.A. Peppas, P. Colombo, Analysis of drug release behavior from swellable polymer carriers using the dimensionality index, J. Control. Release 45 (1997)35-40.

79. A.V. Kabanov, V.Y. Alakhov, Pluronic (R) block copolymers in drug delivery: From micellar nanocontainers to biological response modifiers, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 19 (2002) 1-72.

80. H.B. Zhang, C. Zhao, H. Cao, G.J. Wang, L. Song, G.G. Niu, H.A. Yang, J. Ma, S.Q. Zhu, Hyperbranched poly(amine-ester) based hydrogels for controlled multi-drug release in combination chemotherapy, Biomaterials 31 (2010) 5445-5454.

81. K. Nagahama, M. Hashizume, H. Yamamoto, T. Ouchi, Y. Ohya, Hydrophobically Modified Biodegradable Polyethylene glycol) Copolymers that Form Temperature-Responsive Nanogels, Langmuir 252009) 9734-9740.

82. K. Nagahama, Y. Mori, Y. Ohya, T. Ouchi, Biodegradable nanogel formation of polylactide-grafted dextran copolymer in dilute aqueous solution and enhancement of its stability by stereocomplexation, Biomacromolecules 8 (2007) 2135-2141.

83. G. Sahay, J.O. Kim, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, The exploitation of differential endocytic pathways in normal and tumor cells in the selective targeting of nanoparticulate chemotherapeutic agents, Biomaterials 312010) 923-933.

84. K. Ulbrich, V. Subr, P. Podperova, M. Buresova, Synthesis of novel hydrolytically degrasable hydrogels for controlled drug-release, J. Control. Release 34 (1995) 155-165.

85. B. Sun, B. Ranganathan, S.S. Feng, Multifunctional poly(D,L-lactide-co-glycolide)/montmorillonite (PLGA/MMT) nanoparticles decorated by Trastuzumab for targeted chemotherapy of breast cancer, Biomaterials 29 (2008) 475-486.

86. R.A. Gatenby, R.J. Gillies, Why do cancers have high aerobic glycolysis?, Nature Reviews Cancer 4 (2004) 891-899.

87. C. He, S.W. Kim, D.S. Lee, In situ gelling stimuli-sensitive block copolymer hydrogels for drug delivery, J. Control. Release 127 (2008) 189-207.

88. V.P. Torchilin, Multifunctional nanocarriers, Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (2006) 1532-1555.

89. E.S. Gil, S.M. Hudson, Stimuli-reponsive polymers and their bioconjugates, Prog. Polym. Sci. 29 (2004) 1173-1222.

90. H. Maeda, The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: The key role of tumor-selective macromolecular drug targeting, in: G. Weber (Ed.), Advances in Enzyme Regulation, Vol 41, vol. 41, 2001, pp. 189-207.

91. H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hori, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review, J. Control. Release 65 (2000) 271-284.

92. D.E. Owens, N.A. Peppas, Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles, International Journal of Pharmaceutics 307 (2006) 93-102.

93. F. Alexis, E. Pridgen, L.K. Molnar, O.C. Farokhzad, Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles, Molecular Pharmaceutics 5 (2008) 505-515.

94. S.D. Conner, S.L. Schmid, Regulated portals of entry into the cell, Nature 422 (2003) 37-44.

95. D.C. Drummond, O. Meyer, K.L. Hong, D.B. Kirpotin, D. Papahadjopoulos, Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors, Pharmacological Reviews 51 (1999) 691-743.

96. R.A. Petros, J.M. DeSimone, Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications, Nature Reviews Drug Discovery 9 (2010) 615627.

97. V.P. Torchilin, PEG-based micelles as carriers of contrast agents for different imaging modalities, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 235-252.

98. G.S. Kwon, K. Kataoka, Block copolymer micelles as long-circulating drug vehicles, Adv. Drug Deliv. Rev. 16 (1995) 295-309.

99. T.R. Daniels, T. Delgado, G. Helguera, M.L. Penichet, The transferrin receptor part II: Targeted delivery of therapeutic agents into cancer cells, Clinical Immunology 121 (2006) 159-176.

100. P.S. Low, W.A. Henne, D.D. Doorneweerd, Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for Imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases, Accounts of Chemical Research 41 (2008) 120-129.

101. Y.J. Lu, P.S. Low, Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 675-693.

102. C.P. Leamon, P.S. Low, Folate-mediated targeting: from diagnostics to drug and gene delivery, Drug Discovery Today 6 (2001) 44-51.

103. J. Sudimack, R.J. Lee, Targeted drug delivery via the folate receptor, Adv. Drug Deliv. Rev. 41 (2000) 147-162.

104. A.C. Antony, The biological chemistry of folate receptors, Blood 79 (1992) 2807-2820.

105. J.A. Reddy, V.M. Allagadda, C.P. Leamon, Targeting therapeutic and imaging agents to folate receptor positive tumors, Current Pharmaceutical Biotechnology 6 (2005) 131-150.

106. H.Z. Zhao, L.Y.L. Yung, Selectivity of folate conjugated polymer micelles against different tumor cells, International Journal of Pharmaceutics 349 (2008) 256-268.

107. S.H. Kim, J.H. Jeong, K.W. Chun, T.G. Park, Target-specific ccllular uptake of PLGA nanoparticles coated with poly(L-lysine)-poly(ethylene glycol)-folate conjugate, Langmuir 21 (2005) 8852-8857.

108. D. Kim, Z.G. Gao, E.S. Lee, Y.H. Bae, In Vivo Evaluation of Doxorubicin-Loaded Polymeric Micelles Targeting Folate Receptors and Early Endosomal pH in Drug-Resistant Ovarian Cancer, Molecular Pharmaceutics 6 (2009) 1353-1362.

109. R.J. Lee, P.S. Low, Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor mediated endocytosis, Journal of Biological Chemistry 269(1994)3198-3204.

110. P.S. Low, S.A. Kularatne, Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer, Current Opinion in Chemical Biology 13 (2009) 256-262.

111. N. Dinauer, S. Balthasar, C. Weber, J. Kreuter, K. Langer, H. von Briesen, Selective targeting of antibody-conjugated nanoparticles to leukemic cells and primary T-lymphocytes, Biomaterials 26 (2005) 58985906.

112. J.C. Olivier, R. Huertas, H.J. Lee, F. Calon, W.M. Pardridge, Synthesis of pegylated immunonanoparticles, Pharm. Res. 19 (2002) 1137-1143.

113. C.J. Sunderland, M. Steiert, J.E. Talmadge, A.M. Derfus, S.E. Barry, Targeted nanoparticles for detecting and treating cancer. Drug Dev. Res. 67 (2006) 70-93.

114. C.B. Hansen, G.Y. Kao, E.H. Moase, S. Zalipsky, T.M. Allen, Attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes- evaluetion,comparison and optimization of coupling procedures, Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1239 (1995) 133-144.

115. P. Kocbek, N. Obermajer, M. Cegnar, J. Kos, J. Kristl, Targeting cancer cells using PLGA nanoparticles surface modified with monoclonal antibody, J. Control. Release 120 (2007) 18-26.

116. S. Dhar, F.X. Gu, R. Langer, O.C. Farokhzad, S.j. Lippard, Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt(IV) prodrug-PLGA-PEG nanoparticles, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (2008) 17356-17361.

117. A.L.Z. Lee, Y. Wang, H.Y. Cheng, S. Pervaiz, Y.Y. Yang, The co-delivery of paclitaxel and Herceptin using cationic micellar nanoparticles, Biomaterials 30 (2009) 919-927.

118. A. I to, Y. Kuga, H. Honda, H. Kikkawa, A. Horiuchi, Y. Watanabe, T. Kobayashi, Magnetite nanoparticle-loaded anti-HER2 immunoliposomes for combination of antibody therapy with hyperthermia, Cancer Lett. 212 (2004) 167-175.

119. P. Debbage, W. Jaschke, Molecular imaging with nanoparticles: giant roles for dwarf actors, Histochem. Cell Biol. 130 (2008) 845-875.

120. W.W.K. Cheng, T.M. Allen, Targeted delivery of anti-CD19 liposomal doxorubicin in B-cell lymphoma: A comparison of whole monoclonal antibody, Fab' fragments and single chain Fv, J. Control. Release 126 (2008) 50-58.

121. A.P. Chapman, PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 531-545.

122. J.S. Wang, S.K. Varshney, R. Jerome, P. Teyssie, Synthesis of AB (BA), ABA and BAB block copolymers of tert-butyl methacrylate (A) and ethylene oxide (B), J. Polym. Sci. Pol. Chem. 30 (1992) 2251-2261.

123. M. Pourfarzaneh, G.W. White, J. Landon, D.S. Smith, Cortisol directly determined in serum by fluoroimmunoassay with magnetizable solid phase, Clin Chem 26 (1980) 730-733.

124. K.L. Holmes, L.M. Lantz, H.A.C.J.P.R. Zbigniew Darzynkiewicz, Chapter 9 Protein labeling with fluorescent probes, Methods in Cell Biology, vol. Volume 63, Part 1, Academic Press, 2001, pp. 185-204.

125. S.W. Sun, Y.C. Lin, Y.M. Weng, M.J. Chen, Efficiency improvements on ninhydrin method for amino acid quantification, Journal of Food Composition and Analysis 19 (2006) 112-117.

126. R.R. Traut, A. Bollen, T.-T. Sun, J.W.B. Hershey, J. Sundberg, L.R. Pierce, Methyl 4-mercaptobutyrimidate as a cleavable crosslinking reagent and its application to the Escherichia coli 30S ribosome, Biochemistry 12 (1973) 3266-3273.

127. B. Johnsson, S. Lofas, G. Lindquist, Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface-plasmon resonance sensors, Analytical Biochemistry 198(1991)268-277.

128. R. Karlsson, A. Michaelsson, L. Mattsson, Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system, Journal of Immunological Methods 145 (1991) 229240.

129. U.K. Laemmli, Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

130. T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods 65 (1983) 55-63.

131. F. Horkay, I. Tasaki, P.J. Basser, Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions, Biomacromolecules 1 (2000) 84-90.

132. K. Ogawara, S. Kawazoe, T. Tamura, S. Kawauchi, M. Satoh, J. Komiyama, Divalent counterion binding of Na poly(alpha:hydroxy acrylate), Polymer 39 (1998) 437-440.

133. G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition ed., Academic Press, San Diego, CA, 1996.

134. S.Y. Liu, J.V.M. Weaver, M. Save, S.P. Armes, Synthesis of pH-responsive shell cross-linked micelles and their use as nanoreactors for the preparation of gold nanoparticles, Langmuir 18 (2002) 8350-83571

135. M.L. Teyssot, M. Fayolle, C. Philouze, C. Dupuy, Bis-heteronucleophilic Michael addition to divinyl sulfone: A new efficient access to macrocycles, European Journal of Organic Chemistry (2003) 54-62.

136. M.P. Lutolf, J.A. Hubbell, Synthesis and Physicochemical Characterization of End-Linked Poly(ethylene glycol)-co-peptide Hydrogels Formed by Michael-Type Addition, Biomacromolecules 4 (2003) 713-722.

137. Y.-F. Lam, G. Kotowycz, Self Association of Folic Acid in Aqueous Solution by Proton Magnetic Resonance, Canadian journal of chemistry 50(1972) 2357-2363

138. J.O. Kim, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymer micelles with cross-linked polyanion core for delivery of a cationic drug doxorubicin, J. Control. Release 138 (2009) 197-204.

139. B.C. Nelson, K.E. Sharpless, L.C. Sander, Quantitative determination of folic acid in multivitamin/multielement tablets using liquidchromatography/tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A 1135 (2006) 203-211.

140. A.C. Alagon, T.P. King, Activation of polysaccharides with 2-iminothiolane and its uses, Biochemistry 19 (1980) 4341-4345.

141. A.L. Tarentino, A.W. Phelan, T.H. Plummer, 2-Iminothiolane: a reagent for the introduction of sulphydryl groups into oligosaccharides derived from asparagine-linked glycans, Glycobiology 3 (1993) 279-285.

142. D. Kim, E.S. Lee, K. Park, I.C. Kwon, Y.H. Bae, Doxorubicin Loaded pH-sensitive Micelle: Antitumoral Efficacy against Ovarian A2780/DOXR Tumor, Pharm. Res. 25 (2008) 2074-2082.

143. B.A. Kamen, M.T. Wang, A.J. Streckfuss, X. Peryea, R.G. Anderson, Delivery of folates to the cytoplasm of MA 104 cells is mediated by a surface membrane receptor that recycles, Journal of Biological Chemistry 263 (1988) 13602-13609.

144. J.A. Reddy, C. Abburi, H. Hofland, S.J. Howard, I. Vlahov, P. Wils, C. Leamon, Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors. Gene Therapy 9 (2002) 1542-1550.

145. C.P. Leamon, P.S. Low, Delivery of macromolecules into living cells: A method that exploits folate receptor endocytosis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (1991) 5572-5576.

146. R.G.W. Anderson, B.A. Kamen, K.G. Rothberg, S.W. Lacey, Potocytosis: Sequestraton and transport of small molecules by caveolae, Science 255 (1992)410-411.