Мультиплексная микрочиповая система с иммобилизованными реактивами для молекулярно-генетического анализа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский Государственный Университет Химический факультет

Наволоцкий Денис Васильевич

МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ МИКРОЧИПОВАЯ СИСТЕМА С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РЕАКТИВАМИ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Специальность 02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 5 НОЯ 2010

Санкт-Петербург - 2010

004614143

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Танеев Александр Ахатович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Карпова Людмила Алексеевна

кандидат химических наук Борзенко Андрей Геннадьевич

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта

РАМН

Защита состоится 25 ноября 2010 г., в 15.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. A.M. Горького по адресу: 199134, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.

Замечания и отзывы по данной работе в одном экземпляре, заверенные печатью организации, просим отправлять в адрес Диссертационного совета.

Автореферат разослан « » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

/ к.ф-м.н. Панчук В.В. /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Современные методы молекулярно-генетического анализа развиваются как в направлении увеличения производительности, снижения себестоимости анализа и времени анализа, так и в направлении увеличения селективности и информативности анализа. В настоящее время активно разрабатываются новые методы, основанные на применении микрочиповых аналитических систем, которые обладают принципиально новыми преимуществами и позволяют получить большее количество информации об анализируемом объекте.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из основных методов исследования нуклеиновых кислот в молекулярно-генетическом анализе. Необходимость расширения области применения ПЦР ставит задачи разработки высокочувствительных и селективных аналитических систем, удобных и надежных при эксплуатации, увеличивающих быстродействие и производительность анализа, а также позволяющих снизить трудозатраты при выполнении анализа.

Повышение аналитических характеристик коммерческого оборудования для проведения ПЦР в пластиковых пробирках и планшетах достигло предела в своем развитии, так как существующие анализаторы имеют ограничения по скоростями термоциклирования и равномерности распределения температур внутри реакторов. Микрочиповые аналитические системы в принципе лишены этих недостатков, благодаря низкой термической массе микрочипов, малым размерам микрореакторов. Однако разработанные к настоящему времени микрочиповые системы не обладают всей совокупностью таких аналитических характеристик как высокая чувствительность и широкий динамический диапазон, высокая скорость термоциклирования и стабильность температурных режимов, высокая производительность и быстродействие, низкая стоимость микрочипов и легкость работы с ними.

Актуальной задачей при разработке микрочиповых аналитических систем с высоким быстродействием является обеспечение возможности осуществления мультиплексной ПЦР-РВ, которая позволяет проводить количественное определение нескольких генетических элементов, что увеличивает информативность и надежность получаемых результатов.

Разработка ПЦР-микрочипов и выбор материалов, из которых они изготовлены, является важной задачей, так как это определяет основные аналитические характеристики системы, стоимость микрочипа, и в итоге возможность его одноразового использования. Кроме того, нерешенной задачей

является снижение трудозатрат при подготовке ПЦР смесей при анализе в подобных микрочиповых системах.

Цель настоящей работы. Разработка микрочиповой аналитической системы для проведения мультиплексной ПЦР в режиме реального времени с иммобилизованными в микрореакторах реактивами.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Разработка схемы анализа для определения содержания нуклеиновых кислот методом мультиплексной ПЦР-РВ, включающей узлы термоциклирования и флуоресцентного детектирования нескольких красителей. Оптимизация алгоритма управления термоциклированием и параметров детектора.

• Выбор материала микрочипа, который обеспечивает высокое быстродействие аналитической системы, высокую технологичность изготовления микрочипа и низкую стоимость. Разработка микрочипа и способа модификации поверхности, позволяющего предотвратить ингибирование ПЦР материалами микрочипа и проводить одновременный анализ нескольких образцов.

• Разработка методики иммобилизации реактивов внутри микрореакторов, выбор стабилизирующих веществ и оптимизация состава лиофилизируемых реактивов.

• Оптимизация методики проведения мультиплексной ПЦР-РВ для качественного и количественного определения содержания нуклеиновых кислот на примере определения содержания ГМО в пищевых продуктах. Оценка аналитических характеристик системы.

Научная новизна. Предложена и обоснована схема построения микрочиповой аналитической системы для проведения мультиплексной ПЦР-РВ. Предложены мультиреакторные микрочипы с микрореакгорами открытого типа, позволяющие проводить одновременно несколько десятков реакций, и обоснован выбор таких высокотеплопроводных материалов как кремний и алюминий для изготовления микрочипов. Предложены и разработаны способы модификации поверхности Б! и А1 микрочипов для создания двухмерного распределения гидрофильных и гидрофобных свойств. Разработана методика иммобилизации реактивов в микрореакторах кремниевого и алюминиевого чипа, что позволяет хранить микрочипы с готовыми тест-системами при комнатной температуре, значительно сокращает трудозатраты и вероятность ошибки оператора при проведении анализа. Предложен критерий выбора ПЦР тест-систем для достижения высокого быстродействия и специфичности ПЦР-РВ

анализа. Оптимизированы условия проведения мультиплексной ПЦР в микрочипах на примере разработки методик качественного скрининга и количественного определения содержания ГМО в продуктах питания.

Практическая значимость работы. На основе результатов настоящей работы разработан микрочиповый ПЦР анализатор, обеспечивающий проведение мультиплексной ПЦР-РВ. Разработаны технологии производства микрочипов, включающие изготовление конструкции и модификацию поверхности. Разработаны методики производства микрочипов с иммобилизованными реактивами, которые позволяют хранить тест-системы и микрочипы при комнатной температуре в течение одного года. Адаптированы существующие и разработаны новые методики проведения ПЦР анализа. Разработаны методики выделения и очистки ДНК из различных биологических объектов и проведения количественного определения содержания ГМО методом мультиплексной ПЦР-РВ.

Разработанная аналитическая система с соответствующими тест-системами позволяет проводить мультиплексную ПЦР-РВ за 23 минуты с максимально возможной эффективностью реакции и пределом обнаружения 0,05% при анализе ГМО в растительном сырье.

В результатах исследований проявили заинтересованность Министерство Чрезвычайных Ситуаций РФ, ЦНИИ Эпидемиологии, НИИ Акушерства и гинекологии им. Д.О.Отга, институт им. Р.Коха (Германия), организации аналитического приборостроения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Общая схема молекулярно-генетического анализа методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами. Схема термоциклирования и регистрации аналитического сигнала.

2. Критерии выбора материалов микрочипа. Условия проведения модификации поверхности микрочипа для создания гидрофильных и гидрофобных зон.

3. Условия проведения иммобилизации ПЦР-реактивов и состав иммобилизируемых реактивов.

4. Критерий выбора ПЦР тест-систем для достижения высокого быстродействия и специфичности ПЦР-РВ анализа.

5. Оптимальные условия проведения мультиплексной ПЦР-РВ в микрочиповой аналитической системе для достижения высокого быстродействия, чувствительности и достоверности анализа.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 5 тезисах докладов на конференциях. Основные результаты работы докладывались на следующих конференциях: П-Ш Всероссийской конференции «Аналитика России» (2007, 2009, г.Туапсе); Годичной сессии научного совета РАН по аналитической химии, (2008, .г.Клязьма).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, включая 36 рисунков, 28 таблицы и 149 наименований в списке цитируемой литературы.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении дано обоснование актуальности создания микрочиповых аналитических систем с иммобилизованными реактивами для экспрессного и селективного определения ДНК методом мультиплексной ПЦР-РВ. Здесь же сформулирована цель работы, указаны ее новизна и практическая значимость.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы состоит из семи частей. В первой и второй части рассмотрена полимеразная цепная реакция как метод генетического анализа и проведен краткий обзор области применения ПЦР. Обозначены основные факторы, которые влияют на процессы при протекании ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), и требования, которые выдвигаются к процессу проведения качественного и количественного анализа. Рассмотрена мультиплексная ПЦР-РВ, приведены варианты ее реализации и области применения, а также основные ограничения различных вариантов ее реализации и факторы, которые играют важную роль при оптимизации и разработке реактивов для проведения мультиплексной ПЦР-РВ. В третьей части рассмотрены существующие аналитические системы для проведения ПЦР, описаны принципы осуществления термоциклирования и детектирования продуктов реакции и указаны факторы, которые ограничивают улучшения аналитических характеристик существующих систем. В четвертой, пятой и шестой частях рассмотрены существующие конструкции микрочипа, материалы, применяемые для изготовления микрочипа, и приведены основные факторы, которые определяют область применения существующих микрочипов в ПЦР-анализе. Рассмотрены методы модификации поверхности для предотвращения ингибирования ПЦР материалами микрочипа. Рассмотрены примеры использования иммобилизованных реактивов при проведении ПЦР-анализа.

6

Изучены варианты осуществления и условия иммобилизации реактивов. Описаны основные закономерности влияния стабилизирующих добавок при иммобилизации реактивов методом лиофилизации на сохранение активности ДНК-полимеразы и устойчивость реактивов при длительном хранении. В седьмой части рассмотрены методики определения содержания генно-модифицированных организмов (ГМО) в пищевых продуктах, изучены методики выделения ДНК, проведения качественного и количественного определения содержания ГМО методом ЛЦР.

На основании обзора литературы сформулирована цель настоящей работы, заключающаяся в разработке микрочиповой аналитической системы для проведения мультиплексной ПЦР в режиме реального времени с иммобилизованными реактивами.

2 АППАРАТУРА, МЕТОДИКИ И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА В главе описаны аппаратура, реактивы и техника проведения экспериментов. Схема разработанной экспериментальной установки приведена на рисунке 1. Система детектирования интенсивности флуоресценции растворов в двух спектральных диапазонах реализована с использованием эпифлуоресцентной оптической схемы, в которой разделение потоков флуоресцентного и возбуждающего излучения осуществляется системой двухполосных светофильтров (2,5) и дихроичным зеркалом (4), а раздельное детекти-рование осуществляется попеременным возбужде-нием флуоресценции излу-чением двух светодиодов (6). В качестве детектора использована камера с ПЗС-матрицей (1). Для осуществления термоциклирования используется

элемент Пельтье (7), которым

управление проводится

микроконтроллером по ПИД-алгоритму по температуре, рассчитываемой по АЛХ-модели из

показаний

Рисунок 1: Схема экспериментальной установки. 1 - камера термического датчика с ПЗС-матрицей, 2, 5 - светофильтры, 3 - объектив, 4 - ^ закрепленного на дихроичное зеркало, 6 - светодиод с двумя излучающими

элементами, 7 - элемент Пельтье, 8 - микрочип ,9 - поверхности элемента

температурный датчик. Пельтье.

Разработанная конструкция микрочипа представлена на Рис. 2А.

Микрочип представляет собой пластину из алюминия или кремния (2) с размерами (ДхЩхВ) 25x28x0.5 мм с небольшими углуб-лениями

микрореакто-рами (3) с приклеенной к ней пластиковой рамкой (1). Размеры микрореакторов находились в диапазоне (ДхЩхГ) от 1.6x1.6x0.3 мм до 2x2x0.4 мм. Ввод ПЦР-смесей (1) (см. Рис. 2Б) осуществляется механическим или автоматическим дозатором под слой герметизирующей

полиметилсилоксановой жидкости (3),

удерживаемой в зоне микрореакторов

герметизирующая жидкость, 2 - ПЦР- пластиковой рамкой. смесь, 3 - микрочиповая пластина.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава состоит из пяти частей. Первая часть посвящена обоснованию выбора конструкции микрочипа для проведения мультиплексной ПЦР-РВ, материалов для изготовления микрочипов, а также способов модификации поверхности, позволяющих предотвратить ингибирование ПЦР и проводить анализ нескольких образцов на одном микрочипе. В качестве основных критериев при разработке конструкции микрочипа нами выбраны:

1. снижение термической массы микрочипа с введенными в микрореакторы растворами, приводящее к увеличению скорости термоциклирования;

2. увеличение теплопередачи от нагревательного элемента к раствору, приводящее к снижению времени установления температурного равновесия в растворе;

3. надежность герметизации реакционного объема, возможность прямого ввода проб и использования иммобилизированных реактивов, приводящие к увеличению надежности анализа и упрощению работы с микрочипом;

4. возможность произвольного изменения топологии расположения и объемов микрореакгоров в зависимости от необходимого числа одновременно проводимых ПЦР и чувствительности анализа.

В соответствии с этими критериями нами разработан микрочип (см. Рис.

«■■»■» Гидрофобное покрытие «"■"■ Гидрофильное покрытие

Рисунок 2: Схематичное изображение микрочипа (А) и его сечения (Б). А: 1 -пластиковая рамка, 2 - микрочиповая пластина, 3 - микрореакторы. Б: 1 -

2А), который состоит из прямоугольной кремниевой или алюминиевой пластины, на поверхности которой изготовлены 16-48 углублений (микрореакторов), объемом 1-2 мкл, соответственно.

Передача тепла осуществляется через микрочиповую пластину, а флуоресцентное детектирование — через слой герметизирующей жидкости. Выбор материалов для изготовления микрочипа основывался на величине их удельной теплоемкости и теплопроводности. Для достижения высоких скоростей передачи тепла от нагревательного элемента к ПЦР-смеси микрочиповая пластина изготавливалась из высокотеплопроводных материалов, кремния и алюминия. В то время как для снижения теплообмена с окружающей средой рамка изготавливалась из пластика с низкой теплопроводностью. Герметизирующая жидкость также обладала низкой теплопроводностью. Такая комбинация материалов потенциально позволяет снизить передачу тепла от микрочиповой пластины и ПЦР-смесей в окружающую среду, и тем самым достигнуть низкой термической массы микрочипа и соответственно высоких скоростей термоциклирования.

Использование кремния и алюминия в качестве материала микрочипа привело к ингибированию ПЦР, что потребовало проведения модификации поверхности. Однако при модификации всей поверхности чипа однородным покрытием наблюдался либо неэффективный контакт раствора со стенками микрореакторов (гидрофобное покрытие), либо взаимное смешивание образцов между соседними микрореакторами (гидрофильное покрытие). Для решения этой задачи нами была проведена разработка способов модификации поверхности, приводящих к созданию на поверхности микрочипа гидрофильных и гидрофобных зон (Рис.2Б). При этом гидрофильные зоны должны определять положение ПЦР-смеси при проведении анализа и предотвращать ингибирование ПЦР, а гидрофобные зоны — предотвращать взаимное смешивание ПЦР-смесей при термоциклировании.

Особенностью поставленной задачи по модификации поверхности является необходимость достичь сочетания гидрофильных свойств поверхности с предотвращением ингибирования ПЦР. Разработанные на сегодняшний момент методики модификации поверхности основаны на создании поверхности, предотвращающей сорбцию компонентов ПЦР-смеси, и основывались на нанесении полимерного покрытия с ярко выраженными гидрофобными свойствами. Кроме того, разработанные методики модификации поверхности относились только к микрочипам из и кремнийсодержащих материалов. Для модификации кремниевой пластины нами предложено

использовать покрытие, которое обладает гидрофильными свойствами, но заряд поверхности остается минимальным и не вызывает сорбцию компонентов ПЦР-смеси. Такому критерию удовлетворяет покрытие, получаемое при обработке пластины [3-(2,3-эпоксипропокси)-пропил]-триметоксисиланом и

этиленгликоль-диметиловым эфиром (Рис.ЗА). Гидрофильность полученной поверхности была высокой (угол смачивания 60°), вводимая ПЦР-смесь эффективно смачивала всю внутреннюю поверхность микрореактора, а гидрофильные свойства сохранялась в течение 3 месяцев.

Разработка способа модификации микрочипа из А1 была направлена на создание покрытия, предотвращающего взаимодействие компонентов ПЦР раствора с поверхностью А1, в результате которого и наблюдается ингибирование ПЦР. Одним из осуществленных нами вариантов модификации является покрытие алюминиевой пластины слоем ЗЮ2 через газовую фазу при помощи 81С14 (Рис.ЗБ). Толщина наносимого покрытия контролировалась по цвету интерференционному покрытия. Такая обработка позволила создать поверхность, аналогичную поверхности микрочипа из 81, поэтому дальнейшая модификация велась по способу, показанному на Рис.ЗА. Однако, такой способ модификации привел к большой степени брака при изготовлении микрочипов. За основу альтернативного метода были взяты методики создания защитного слоя оксида алюминия, широко используемые в промышленности. Подобный слой обладает максимальной устойчивостью при рН=7,5^8,5, который совпадает с рН ПЦР-смеси. В соответствии с предложенным способом модификации пластина из А1 выдерживалась в смеси концентрированной Н3РО4 и НЖ>3 (1:2) (Рис.ЗВ). В результате такой обработки поверхность А1 пластины приобретала матовый оттенок. Однако такая обработка не позволила достигнуть долговременной стабильности гидрофильных свойств, и поэтому нами было предложено стабилизировать гидрофильные свойства за счет сорбции гидрофильного полимера в порах оксидного слоя, для чего проводилась ультразвуковая обработка в 1% растворе поливинилового спирта (ЛВС) в фосфатном буферном растворе с рН=7,5. В результате достигнута стабильность гидрофильных свойств поверхности, необходимая для эффективного смачивания ПЦР-смесью (контактный угол 40°), при хранении при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Для предотвращения смешения проб в процессе анализа на поверхность между микрореакгорами мы предложили наносить гидрофобный слой полиметил-метоксисилоксана (ПММС) (контактный угол смачивания равен 106°). Так как микрореакторы представляют собой углубления на пластине, то

нанесение гидрофобного слоя осуществлялось методом контактной печати.

Таким образом, в результате работы разработана технологичная и простая в изготовлении конструкция микрочипа. Себестоимость такого микрочипа, особенно, в случае использования А1, позволяет одноразовое использование такого микрочипа, что является несомненным преимуществом при выполнении

Рисунок 3: Схема способов модификации поверхности кремния (А) и алюминия (Б, В). рутинных анализов. Разработанная методика модификации 81 и А1 поверхности

не приводит к значительному увеличению стоимости микрочипа, позволяет

предотвратить ингибирование ПЦР материалом микрочипа, обеспечить

воспроизводимый термический контакт ПЦР-смеси с поверхностью

микрореактора, значительно упростить ввод проб в микрореакторы и

предотвратить их смешение при выполнении анализа.

Вторая часть посвящена разработке экспериментальной установки для проведения мультиплексной ПЦР-РВ. Экспериментальная установка состоит из двух систем: системы термоциклирования и системы детектирования. В качестве основною критерия при разработке системы термоциклирования нами была принята возможность осуществления как управляемого нагрева, так и охлаждения микрочипа, чему оптимально удовлетворяет система с элементом Пельтье в качестве нагревательного элемента. Основной задачей была реализация управления термоциклированием по температуре в микрореакторе, которая позволяет достигнуть максимальных скоростей термоциклирования. Обычно для решения таких задач используется термический датчик,

51

А!

-о—( ¡м-о-н

Ч Я

интегрированный в микрочип, однако, это значительно увеличивает себестоимость микрочипа и не обеспечивает его одноразовое использование. Для решения данной задачи нами использовался термический датчик, закрепленный на поверхности элемента Пельтье, а расчет температуры в микрореакторе при термоциклировании проводился с использованием авторегрессионной модели с внешним воздействием (АЮС-модели). Определение параметров АЯХ-модели проводилось при помощи микрочипа с интегрированным термическим датчиком (термочипом). Полученные параметры использовались при управлении термоциклированием, которое осуществлялось при помощи пропорционально-интегрально-дифференциального (ПИД) алгоритма, позволяющего достичь максимальных скоростей нагрева и охлаждения микрочипа. Достигнутые скорости нагрева и охлаждения микрочипов превышают таковые для приборов, использующих пластиковые пробирки, в 3-5 раз, и приведены в таблице 1.

Таблица 1: Скорости нагрева и охлаждения микрочипов, изготовленных из 81 и А1.

Материал микрочипа Максимальная скорость нагрева, °С/с Максимальная скорость охлаждения, °С/с Средняя скорость нагрева, "С/с Средняя скорость охлаждения, °С/с

Алюминий 9,7±0.1 10,3±2 7,9±1 8,2±1

Кремний 9,5±0.1 9,9±1 7,9±1 8,0±1

Основной задачей при разработке системы детектирования являлось обеспечение сопоставимого со скоростями термоциклирования быстродействия при детектировании интенсивности флуоресценции двух красителей. Для снижения времени детектирования нами использовалась камера с ПЗС-матрицей, позволяющая получить двумерное распределение интенсивности флуоресценции по поверхности микрочипа и провести одновременное измерение интенсивности флуоресценции всех растворов. К преимуществам такого способа детектирования можно отнести и независимость системы детектирования от количества и расположения микрореакторов в микрочипе, что позволяет легко изменять топологию микрочипа. Кроме того, для снижения времени детектирования нами разработана эпифлуоресцентная оптическая схема, включающая в себя два двухполосных светофильтра и дихроичное зеркало (см.Рис.1). Раздельное детектирование флуоресценции в каждом из каналов обеспечивалось переключением двух светодиодов. Причем спектральные характеристики светофильтров и дихроичного зеркала были выбраны такими, чтобы при включении светодиода 1 регистрировалась интенсивность флуоресценции в диапазоне 510+530 нм при возбуждении в диапазоне 480+495 нм (первый канал детектирования), а при включении

12

светодиода 2 диапазон регистрации составил 58СН640 нм при возбуждении в диапазоне 54СН-560 нм (второй канал детектирования). Выбранные спектральные характеристики оптимальны для детектирования двух наиболее распространенных флуоресцентных красителей 5(6)-карбоксифлуоресцеина (БАМ) и 5(6)-карбокси-Х-родамина (1ЮХ). Измерение интенсивности флуоресценции двух красителей в двух спектральных диапазонах позволяет определить интенсивность флуоресценции каждого красителя. В общем случае, для этого требуется решение системы двух линейных уравнений с четырьмя коэффициентами, зависящими от молярных коэффициентов поглощения красителей и квантового выхода флуоресценции в соответствующих спектральных диапазонах. Спектральные характеристики разработанной системы были таковы, что определение коэффициентов этой системы уравнений дало в результате только один значимый коэффициент, определяющий вклад красителя ЯОХ в интенсивность флуоресценции, детектируемую на первом канале, при этом на втором канале детектируется флуоресценция только красителя 110 X.

Отсутствие перемещающихся деталей позволило определить распределение интенсивности возбуждающего излучения по поверхности микрочипа и провести корректировку значений флуоресценции растворов. Таким образом, алгоритм получения сигнала интенсивности флуоресценции состоит из обработки кадров, получаемых на первом и втором канале детектирования, проведения корректировки изображений по кадру выравнивания и определении интенсивности флуоресценции каждого красителя, путем решения системы двух линейных уравнений с одним коэффициентом. Предел обнаружения системы детектирования при определении флуоресцеина составил 1,4-10"9М, а родамина — 3,9-10"9М, что сравнимо с характеристиками ПЦР-анализаторов и достаточно для проведения ПЦР-РВ.

В результате нами была разработана экспериментальная установка для проведения мультиплексной ПЦР-РВ, которая характеризуется высоким быстродействием и позволяет проводить детектирование флуоресценции двух красителей. В результате экспериментов по определению эффективности амплификации при проведении ПЦР в разработанных микрочипах с предложенными способами модификации поверхности получено, что эффективность амплификации при проведении ПЦР в кремниевом микрочипе составила 94±6%, а алюминиевом — 94±5%. Полученные эффективности амплификации близки к теоретическому максимуму, что доказывает отсутствие ингибирования ПЦР материалом микрочипа.

Оценка предела обнаружения выполнялась при помощи построения градуировочной зависимости при анализе стандартных образцов состава с содержанием ДНК 10, 102, 103 и 104 копий/мкл. В результате построена градуировочная зависимость (Рис.4), а предел обнаружения, определенный как наименьшая концентрация, определяемая с погрешностью 50%, равен копиям ДНК в микрореакторе.

Увеличение скоростей термоциклирования позволяет сократить время проведения анализа за счет снижения времени перехода между стадиями

температурно-

временного Было

сокращение

анализа

сокращения

проведения

сравнению

режима, проведено времени за счет времени стадий по с

г 25 з

¡од(СдНК)

Рисунок 4: Градуировочная зависимость порогового цикла от десятичного логарифма концентрации ДНК.

температурно-временным режимом, оптимизированным для проведения ПЦР в пластиковых пробирках в объеме 25 мкл, предполагая, что скорость установления температурного равновесия в растворе в разработанной микрочиповой системе будет высокой. В результате оптимизации нами было сокращено время проведения стадии денатурации ДНК с 10 до 1 с, а стадии элонгации — с 25 до 15 с, что позволило сократить общее время анализа на 44% до 23 мин без снижения эффективности амплификации. Экспериментальные ПЦР кривые, полученные в этих условиях, приведены на Рис.5а, а для оценки эффективности использовалась калибровочная зависимость из графика на Рис.5б. Из представленных данных видно, что воспроизводимость результатов высока, а эффективность ПЦР составила (97±3%).

Третья часть посвящена изучению процессов, происходящих при проведении мультиплексной ПЦР-РВ в микрочиповых системах, и определению параметров, которые ограничивают быстродействие и чувствительность анализа в микрочиповых аналитических системах. В существующих ПЦР тест-системах для проведения мультиплексной ПЦР-РВ амплифицируемые участки ДНК часто имеют различные длины для обеспечения возможности анализа продуктов ПЦР

- К1

------ К2 ------ КЗ

......... К4 Jtf!

0

J-......'■' /-'У

Номер цикла

-1Я ИЛ Л* I -0* -Э« OJ

Рисунок 5: Результаты ПЦР-РВ при ускоренном температурно-временном реокиме. А - ПЦР-привые при анализе "положительного образца" (К1) и его разбавления в 4 (К2), 16 (КЗ) и 64 (К4) раза и отрицательного контрольного образца. Б -калибровочная зависимость порогового цикла от десятичного логарифма концентрации ДНК.

методом гель-электрофореза. Нами была изучена одна из таких систем и в результате сокращения времени проведения стадии элонгации обнаружено, что чем длиннее амплифицируемый участок, тем дольше оптимальное время проведения стадии элонгации, т.е. возможности снижения времени проведения анализа ограничены размером самого длинного амплифицируемого участка (ампликона). Для достижения минимального времени анализа требуется сокращать длину ампликонов, однако для сохранения специфичности и селективности ПЦР длина ампликонов не может быть значительно короче 70 п.о. Оптимальной с нашей точки зрения длиной, обеспечивающей необходимую селективность и быстродействия анализа, является длина амплифицируемого участка ДНК от 80 до 150 п.о.

Четвертая часть посвящена разработке

Таблица 2: ОПЦ при различных временах хранения микрочипа с иммобилизованной смесью при 50°С.

способа проведения иммобилизации реактивов внутри микрореакгоров, позволяющего достигнуть долговременной стабильности иммобилизованных реактивов при хранении при комнатной

температуре. Одним из способов проведения

иммобилизации является высушивание части реактивов в микрореакторе. Особой практической значимостью на наш взгляд является высушивание в

15

Стабилизатор, С=100тМ ОПЦ (%) при различных временах хранения микрочипа с иммобилизованной смесью при 50°С

0 ч. 24 ч. 170 ч.

Сахароза 100±4 - -

Манит 101±3 94±3 92±5

Трегалоза 101±3 97±4 96±3

Сорбит 101±3 96±8 89±3

микрореакгорах микрочипа праймеров, определяющих амплифицируемый участок ДНК, и ДНК-полимеразы, наиболее термолабильного компонента ПЦР-смеси. Такой подход, кроме увеличения чувствительности анализа, позволяет сократить количество операций при проведении анализа одной пробы на наличие нескольких участков ДНК. Однако в процессе высушивания и хранения ПЦР-смеси активность ДНК-полимеразы снижается. Как правило, для сохранения активности ДНК-полимеразы в высушиваемую смесь добавляются специальные вещества — стабилизаторы. В качестве стабилизаторов нами были выбраны полисахариды из ряда глюкоза, трегалоза, манит, сорбит; среди которых наилучшие характеристики получены при использовании трегалозы. Как показано в таблице 2, отношение пороговых циклов (ОПЦ) при проведении анализа с использованием высушенных реактивов с различными стабилизаторами к пороговому циклу с использованием жидкой смеси реактивов без стабилизатора остается неизменным при хранении в случае использования трегалозы.

При дальнейшей оптимизации было обнаружено, что эффективность ПЦР с сокращенным температурно-временным режимом снижается при хранении

смесей, содержащих только один стабилизатор (трегалозу), и было предложено добавить

дополнительные стабилизаторы. В качестве таких стабилизаторов были выбраны поливинилпироллидон (ПВП) и Т\уееп 20. Результаты оптимизации состава

иммобилизируемой ПЦР смеси и условий проведения иммобилизации приведены в Таблице 4, из которых следует, что смесь, содержащая трегалозу (ЮОшМ), Т\уееп 20 (1%), ПВП (2%) позволила добиться необходимого сохранения активности ДНК-полимеразы (Таблица 3). Время ПЦР анализа с использованием таких микрочипов составило 23 мин, что равно времени ПЦР с использованием невысушенных реактивов без стабилизаторов. Экспериментально показано, что время хранения микрочипов с подобными иммобилизированными ПЦР реактивами составило 4 месяца, что достаточно для большинства практических задач. ОПЦ, полученные при анализе с

Таблица 3: ОПЦ, полученные при анализе с использованием микрочипов, хранившихся в течение 170 ч при 50°С.

Стабилизатор ОПЦ при хранении 170 ч при 50°С, (%)

Трегалоза (ЮОтМ) 65±4

Трегалоза (ЮОтМ), Т\\'ееп 20 (1%), 81±3

Трегалоза (ЮОтМ), ПВП (2%) 89±3

Трегалоза (ЮОтМ), Т\уееп 20 (1%), ПВП (2%) 97±4

Контроль 99±2

использованием микрочипов, хранившихся в течении 170 ч при 50°С .

Пятая часть посвящена разработке методики проведения качественного и количественного определения ГМО в продуктах растительного происхождения. Основной задачей ставилось применение полученных в данной работе результатов по повышению быстродействия анализа к разработке методик анализа методом мультиплексной ПЦР-РВ. Для скрининга ГМО были выбраны гены 35 S, tNOS и nptll, присутствие которых характерно для ГМ растений, и ген 18S, присутствующий во всех растениях. Количественный анализ проводился по отношению содержания генов генетической модификации к гену лектина (Lectin) и зеина (Zein), присутствующих во всех сортах сои и кукурузы, соответственно. В результате выбора последовательностей праймеров и зондов нами были разработаны ПЦР тест-системы для проведения скрининга продуктов растительного происхождения и количественного анализа (Таблица 4), в которых длины амплифицируемых участков удовлетворяют сформулированному выше критерию и попадают в диапазон длин от 80 до 150 п.о. Различия в температурах гибридизации праймеров находятся в пределах погрешности метода расчета, и это позволило проводить анализ всех генов на одном микрочипе в едином температурно-временном режиме.

Дополнительной задачей, возникшей в результате проведения экспериментов, оказалось обеспечение необходимой чистоты выделяемой из пробы ДНК из-за высокого отношения объема пробы к общему объему ПЦР-смеси (80%) при использовании иммобилизованных реактивов. Проведенная оптимизация методики выделения и очистки ДНК позволила устранить ингибирование ПЦР. С использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами нами был проведен скрининг проб и количественный анализ Таблица 4: Результаты анализа содержания ГМО. Результаты качественного

анализа стандартных образцов состава приведены в таблице 4, из которой видно, что ген 35S, характерный для ГМ сои, присутствует только в образцах, содержащих ГМО. В результате, нами предложены микрочипы, содержащие иммобилизованные реактивы, позволяющие проводить одновременный скрининг ГМО от 8 до 24 образцов в зависимости от топологии чипа.

Для выполнения количественного анализа была построена градуировочная зависимость (Рисунок 5), по которой

образцов стандартного состава ГМ сои (СО).

СО Содержание ДНК Содержание

35S 18S ГМО

1.00% + + +

0,5% + + +

0,1% + + +

0.00% - + -

выполняли анализ образца с известным содержанием ГМО (0,75±0,07)%. Найденная

концентрация ГМО составила (0,64±0,09)%. Доверительные

•I -М -«4 -04 «л о

Рисунок 6: Градуировочная зависимость порогового цикла от содержания ГМО в пробе.

интервалы определенного и известного содержания ДНК перекрываются, что позволяет сделать вывод об отсутствии систематической погрешности при проведении анализа. Предел

обнаружения составил 0,05% от ГМ растения, что соответствует нормативным документам. Время проведения анализа составило 23 мин, что в 2-3 раза быстрее существующих анализаторов.

1. Разработана схема анализа методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами. Разработана аналитическая система, обеспечивающая детектирование флуоресценции двух красителей, в которой для термоциклирования используется элемент Пельтье с управлением по ПИД-алгоритму и корректировкой температуры по АЮС-модели. Разработанная схема легла в основу серийного ПЦР-анализатора.

2. В качестве материалов для изготовления микрочипов выбраны кремний и алюминий, обладающие высокой теплопроводностью. Из этих материалов разработаны микрочипы с микрореакторами открытого типа, позволяющие проводить одновременно 16-48 мультиплексных ПЦР-РВ. Стоимость разработанного микрочипа по сравнению с микрофлюидным чипом снижена в 12 раз в случае применения кремния, и в 80 раз — в случае алюминия, что позволяет их одноразовое использование

3. Разработаны способы модификации поверхности кремния и алюминия, заключающиеся в создании двумерного распределения гидрофильных и гидрофобных зон путем последовательной обработки поверхности пластины [3-(2,3-эпоксипропокси)-пропил]-триметоксисиланом и этиленгликоль-диметиловым эфиром, и путем обработки А1 пластины в смеси Н3РО4 и ЮГОз и в растворе ПВС для создания гидрофильного покрытия, с нанесением слоя ПММС для создания гидрофобного покрытия. Такая обработка обеспечила высокую эффективность ПЦР

ВЫВОДЫ

(94±6% - для Si, 94±5% - для AI), позволила предотвратить ингибирование ГГЦР, исключить взаимное смешение образцов.

4. Разработан способ иммобилизации ПЦР-реактивов путем высушивания растворов в микрореакторах и оптимизирован состав стабилизирующих добавок (ЮОтМтрегалоза, l%Tween20, 2%ПВП), что позволило достигнуть ста-бильности при хранении микрочипов при комнатной температуре в течение 4 мес.

5. Показано, что для достижения высокого быстродействия и селективности ПЦР-РВ анализа оптимальная длина амплифицируемого участка ДНК должна находиться в диапазоне от 80 до 150 п.о.

6. Разработаны условия качественного и количественного анализа суспензий микроорганизмов в диапазоне концентраций ЮМ О7 КОЕ/мл методом мультиплексной ПЦР-РВ. Достигнута близкая к максимальной эффективность ПЦР (94-И00%). Разработана методика скрининга и количественного определения ГМО с использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами. Время анализа составило 23 мин, а предел обнаружения — 0,05% от ГМ растения.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Наволоцкий Д.В. Мультиплексная аналитическая система для

определения днк методом ПЦР в реальном времени / A.B. Крисько, В.А. Арнаутов, Д.С. Гейбо, A.A. Танеев, М.Н. Сляднев. // Научное приборостроение 2010, т. 20, №1, с. 10-20

2. Наволоцкий Д.В. Разработка двухканальной системы флуоресцентною детектирования и системы термоциклирования для микрочипового ПЦР-анализатора / А.В.Крисько, В.А.Арнаутов, Д.С.Гейбо, A.A. Танеев, М.Н.Сляднев // Тезисы докладов III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, г.Туапсе.- 28 сентября-02 октября.-2009-С.408

3. Наволоцкий Д.В. Разработка микрочиповой аналитической системы для мультиплексного ПЦР-анализа с иммобилизованными в микрореакторах реактивами / А.В.Перчик, И.А.Маркьянов, A.A. Танеев, М.Н.Сляднев // Тезисы докладов III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, г.Туапсе.- 28 сентября-02 октября.-2009-C. 145

4. Наволоцкий Д.В. Разработка микрофлюидной системы экспрессного ПЦР анализа / М.В. Лаврова, A.A. Танеев // Тезисы докладов Годичной сессии

научного совета РАН по аналитической химии, г.Клязьма,- 21-25 апреля.-2008.-С.78

5. Наволоцкий Д.В. Разработка системы детектирования для гибридизационнных биочипов / М.В. Лаврова, A.A. Танеев // Тезисы докладов Годичной сессии научного совета РАН по аналитической химии, г.Клязьма,- 21-25 апреля.-2008.-С.79

6. Наволоцкий Д.В. Экспрессное определение ДНК в микрофлюидной аналитической системе методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени / М.В. Лаврова, М.А. Еркин // Тезисы докладов П Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, г.Туапсе.- 08-12 окгября.-2007-С.443

7. Наволоцкий Д.В. Экспрессное определение ДНК методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / М.В. Лаврова, М.А. Еркин, A.B. Крисько, A.A. Танеев // Научное приборостроение 2007,- т.17,- №3,-С.25-30

8. Наволоцкий Д.В. Модифицирование поверхности микрореакгоров микрофлюидного чипа для проведения полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени / М.В. Лаврова, М.А. Еркин, A.B. Крисько, A.A. Танеев // Научное приборостроение 2007,- т.17,- №3.-С. 16-24

Подписано в печать 15.10.2010 г. Формат 60x84/16. Печ.л. 1 Тираж 100 экз. Отпечатано в издательстве "Русская коллекция" 199178, Санкт-Петербург, 13 линия В.О., д.30, оф.4 Тел. (812) 327-49-46,327-73-00 www.ruscol.spb.ru

выводы

1. Разработана схема анализа методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами. Разработана аналитическая система, обеспечивающая детектирование флуоресценции двух красителей, в которой для термоциклирования используется элемент Пельтье с управлением по ПИД-алгоритму и корректировкой температуры по АЮС-модели. Разработанная система легла в основу серийного ПЦР-анализатора.

2. В качестве материалов для изготовления микрочипов выбраны кремний и алюминий, обладающие высокой теплопроводностью. Из этих материалов разработаны микрочипы с микрореакторами открытого типа, позволяющие проводить одновременно 16—48 мультиплексных ПЦР-РВ. Стоимость разработанного микрочипа по сравнению с микрофлюидным чипом снижена в 12 раз в случае применения кремния, и в 80 раз — в случае алюминия.

3. Разработаны способы модификации поверхности кремния и алюминия, заключающиеся в создании двумерного распределения гидрофильных и гидрофобных зон путем последовательной обработки поверхности 81 пластины [3-(2,3-эпоксипропокси)-пропил]-триметоксисиланом и этиленгликоль-диметиловым эфиром, и путем обработки А1 пластины в смеси Н3РО4 и ЬШОз и в растворе ПВС для создания гидрофильного покрытия, с нанесением слоя ПММС для создания гидрофобного покрытия. Такая обработка обеспечила высокую эффективность ПНР (94±6% - для 81, 94±5% - для А1), позволила предотвратить ингибирование ПЦР, исключить взаимное смешение образцов.

4. Разработан способ иммобилизации ПЦР-реактивов путем высушивания растворов в микрореакторах и оптимизирован состав стабилизирующих добавок (ЮОтМ трегалоза, 1% Т\уееп20, 2% ПВП), что позволило достигнуть стабильности при хранении микрочипов при комнатной температуре в течение 4 мес.

5. Показано, что для достижения высокого быстродействия и селективности ПЦР-РВ анализа оптимальная длина амплифицируемого участка ДНК должна находиться в диапазоне от 80 до 150 п.о.

6. Разработаны условия качественного и количественного анализа суспензий микроорганизмов в диапазоне концентраций 102-Ч07 КОЕ/мл методом мультиплексной ПЦР-РВ. Достигнута близкая к максимальной эффективность ПЦР (94+100%). Разработана методика скрининга и количественного определения ГМО с использованием микрочипов с иммобилизованными реактивами. Время анализа составило 23 мин, а предел обнаружения — 0,05% от ГМ растения.

1. Meitzer J.S. PCR in Bioanalysis //Humana Press.-1998.- pp. 274

2. Lo Y. M. Clinical applications of PCR. //Humana Press.-1998.- pp. 353

3. Heller, K.J. Genetically Engineered Food. Methods and Detection. //Wiley-VCH.-2003.- pp. 304

4. Mauer J. PCR Methods in food. //Springer Science.-2006.- pp. 1485. van Pelt-Verkuil E. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. / A. van Belkum, J.P. Hays //Springer Science.-2008.- pp. 332

5. Abu Al-Soud "W. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting sample / P. Rädström // Applied and Environment Microbiology.-1998.-V.64.- P. 3748-3753

6. Chien A. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus / D.B. Edgar, J.M. Trela // Journal of Bacteriology.-1976.-V. 127.- P. 1550-1557

7. Cline J. PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases / J.C Braman, H.H. Hogrefe // Nucleic Acids Research.-1996.-V.24.- P. 34563451

8. Belgrader P. Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument / W. Benett, D. Hadley, G. Long, Jr. R. Mariella, F. Milanovich // Clinical Chemistry.-1998.-V.44.-P. 2191-2194

9. Rychlik W. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro / W. J. Spencer, R. E. Rhoads // Nucleic Acid Research.-1990.-V.l 8.- P. 6409-6412

10. Altshuler M.L. PCR troubleshooting: the essential guide //Horizon Scientific Press.-2006.- pp. 80

11. Robertson M.J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions / J. Walsh-Weiler // Methods in Molecular Biology.-1998.-V.98.- P. 121-154

12. Kubista M. The real-time polymerase chain reaction // Molecular Aspects of

13. Medicine.-2006.-V.27.-P. 95-125

14. Mackay J. Real-Time PCR Fluorescent Chemistries / O. Landt // Methods in Molecular Biology.-2007.-V.353,- P. 237-261

15. Jothikumar P. Design of FRET-TaqMan probes for multiplex real-time PCR using an internal positive control / V. Hill, J. Narayanan // BioTechniques.-2009.-V.46.- P. 519— 524

16. Ahmad A.I. New FRET primers for quantitative real-time PCR / J.B. Ghasemi // Analytical and Bioanalytical Chemistry.-2007.-V.3 87.- P. 2737-2743

17. Logan J. Real-time PCR: current technology and applications / K. Edwards, N. Saunders //Horizon Scientific Press.-2009.- pp. 284

18. Duarte С. O. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus / H. de Lencastre //Antimicrobial Agents and Chemotherapy.-2002.-V.46.- P. 2155-2161

19. Rutledge R. G. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves / C. Cote //Nucleic Acids Research.-2003.-V.31.- P. e93

20. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени / Г.А. Саматов, Д. Трофимов //Бином.-2009.- pp. 224

21. Svenstrup H.F. Development of a Quantitative Real-Time PCR Assay for Detection of Mycoplasma genitalium / J.S. Jensen, E. Bjornelius, P. Lidbrink, S. Birkelund, G. Christiansen // Journal of Clinical Microbiology.-2005.-V.43.- P. 3121-3128

22. James D. Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean and canola by multiplex PCR analysis / A.M. Schmidt, E. Wall, M. Green, S. Masri //Journal of agricultural and food chemistry.-2003.-V.51.- P. 5829-5834

23. Mafra I. Food authentication by PCR-based methods / I. Ferreira, B. Oliveira // European Food Research and Technology.-2008.-V.227.- P. 649-665

24. Tianfu H. Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR / B. Jian, B. Liu, Y. Bi, W. Hou, C. Wu // BMC Molecular Biology.-2008.-V.59.- P.

25. Hoorfar J. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays / B. Malorny, A. Abdulmawjood, N. Cook, M. Wagner, P. Fach // Journal of Clinical Microbiology.-2004.-V.42.- P. 1863-1868

26. Jarosova J. Validation of reference genes as internal control for studying viral infections in cereals by quantitative real-time RT-PCR / J.K. Kundu // BMC Plant Biology. -2010.-V.10.-P. 146

27. Meng S. A novel duplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for the detection of hepatitis C viral RNA with armored RNA as internal control / J. Li // Virology Journal.-2010.-V.7.- P. 117

28. Shen Y. Identification of suitable reference genes for measurement of gene expression in human cervical tissues / Y. Li, F. Ye, F. Wang, W. Lu, X. Xie // Analytical Biochemistry.-2010.-V.405.- P. 224-229

29. Vandesompele J. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes / K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, Anne De Paepe, F. Speleman // Genome Biology.-2002.-V.18,- P. 3

30. Wu L.C. Primer design for multiplex PCR using a genetic algorithm / J.T. Horng // Soft Computing.-2007.-V.ll.- P. 855-863

31. Henegariu O. Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol / N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance, P.H. Vogt//BioTechniques.-1997.-V.23.- P. 504-511

32. Yuryev A. PCR Primer Design //Humana Press.-2001pp. 431

33. Everett J.K. Primer Prim'er: A web based server for automated primer design / T.B. Acton, G.T. Montelione // ournal of Structural and Functional Genomics.-2004.-V.5.- P. 13-21

34. Grody W. W. Molecular Diagnostics: Techniques and Applications for the Clinical Laboratory / R.M. Nakamura, F.L. Kiechle //Academic Press.-2009.- pp. 484

35. O'Connell J. RT-PCR Protolols //Humana Press.-2003.- pp. 400

36. Zhang C. PCR microfluidic devices for DNA amplification / J. Xu, W. Ma, W. Zheng // Biotechnology Advances.-2006.-V.24.- P. 243-28441. lightCycler. Carousel-Based System / http://www.roche-applied-science.com

37. Mathies R.A. Lab-on-a-Chip: miniaturized systems for (bio)chemical analysis and synthesis //Elsevier.-2003.- pp. 394

38. Herold K. Lab on a Chip Technology:Biomolecular Separation and Analysis / A. Rasooly //Horizon Scientific Press.-2009.- pp. 300

39. Fukuba T. Microfabricated flow-through device for DNA amplification / T. Yamamoto, T. Naganuma, T. Fujii // Chemical Engineering Journal.-2004.-V.101.- P. 151156

40. Park N. Cylindrical Compact Thermal-Cycling Device for Continuous-Flow polymerase chain reaction / S. Kim, J.H. Hahn // Analytical Chemistry.-2003.-V.75.- P. 6029-6033

41. Schneega I. Flow-through polymerase chain reactions in chip thermocyclers / J.M.151

42. Kohler // Reviews in Molecular Biotechnology.-2001.-V.82.- P. 101-121

43. Giordano B.C. Polymerase chain reaction in polymeric microchips: DNA amplification in less than 240 seconds / J. Ferrance, S. Swedberg, F.R. Huhmer, J.P. Landers // Analytical Biochemistry.-2001 .-V.291.- P. 124-132

44. Neuzil P. Ultra fast miniaturized real-time PCR: 40 cycles in less than six minutes / C. Zhang, J. Pipper, S. Oh , L. Zhuo //Nucleic Acids Research.-2006.-V.34.- P. e77

45. Lodhi M.A. A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and vitis species. / G.N. Ye, N.F. Weeden, B.I. Reisch // Plant Molecular Biology Reporter.-1994.-V. 12.-P. 6-13

46. Tian W.C. Microfluidics for Biological Applications / E. Finehout //Springer.-2008.-pp. 416

47. Bilitewski U. Microchip Methods in Diagnostics //Humana press.-2009.- pp. 183

48. Shoffner M.A. Chip PCR II. Investigation of different PCR amplification systems in microbabricated silicon-glass chips / J. Cheng, J.E. Hvichia, L.J. Kricka, P. Wilding // Nucleic Acids Research.-1996.-V.24.- P. 380-385

49. Liu R.J. Self-contained, fully integrated biochip for sample preparation, polymerase chain reaction amplification, and DNA microarray detection / J. Yang, R. Lenigk, J. Bonanno, P. Grodzinski //Analytical Chemistry.-2004.-V.76.- P. 1824-1831

50. Northrup M.A. A miniature analytical instrument for nucleic acids based on micromachined silicon reaction chambers // Analytical Chemistry.-1998.-V.70.- P. 918-922

51. Chen J.H. A novel micro-well array chip for liquid phase biomaterial processing and detection / T.F. Chen, S.R. Huang, J. Gong, J.C. Li, W.C. Chen, T.H. Hseu, I.C. Hsu // Sensors and Actuators.-2003.-V.108.- P. 193-200

52. Matsubara Y. Application of a microchamber array for DNA amplification using a152novel dispensing method / M. Kobayasni, Y. Morita, E. Tamiya // Archives of Histology and Cytology.-2002.-V.65.- P. 481-488

53. Nagai H. Development of a microchamber array for picoliter PCR / Y. Murakami, Y. Morita, K. Yokoyama, E. Tamiya //Analytical Chemistry.-2001.-V.73.- P. 1043-1047

54. Nagai H. High-throughput PCR in silicon based microchamber array / Y. Murakami, K. Yokoyama, E. Tamiya // Biosensors & Bioelectronics.-2001.-V.16.- P. 1015- 1019

55. Akagi Y. Optimization of fluorescent cell-based assays for high-throughput analysis / S. Ramachandra, Y. Morita, E. Tamiya // Science and Technology of Advanced Materials.-2004.-V.5.-P. 343-349

56. Tamiya E. On-chip nanoliter-volume multiplex TaqMan polymerase chain reaction from a single copy based on counting fluorescence released // Anal. Chem.-2004.-V.76.- P. 6434-6439

57. Brenan C. High throughput, nanoliterquantitative PCR / T. Morrison // Drug Discovery Today: Technologies.-2005.-V.2.- P. 247-253

58. Liu J. Solving the "World-to-Chip" interface problem witha microfluidic matrix / C. Hansen, S.R. Quake //Analytical Chemistry.-2003.-V.75.- P. 4718-4723

59. Seeb J.E. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high-throughput genotyping with nonmodel organisms / C.E. Pascal, R. Ramakrishnan, L.W. Seeb // Methods in Molecular Biology.-2009.-V.583.- P. 277-292

60. Сляднев M.H. Разработка мультиреакторной микрофлюидной системы для ПЦР анализа в режиме реального времени / А.А. Танеев, В.А. Казаков, М.В. Лаврова, М.А. Еркин // Журнал аналитической химии.-2008.Л/.63.- Р. 210-217

61. Shoffner М.А. Chip PCR I. Surface passivation of microfabricated silicon-glasschips for PCR / J. Cheng, J.E. Hvichia, L.J. Kricka, P. Wilding // Nucleic Acids Research.1531996.-V.24.-P. 375-379

62. Erill I. Bacteriophage surface display of an immunoglobulin-binding domain of Staphylococcus aureus protein A / S. Campoy, N. Erill, J. Barbé, J. Aguiló // Sensors and Actuators.-2003.-V.96.-P. 685-692

63. Fukuba T. Microfabricated flow-through device for DNA amplification / T. Yamamoto, T. Naganuma, T. Fujii // Chemical Engineering Journal.-2004.-V.101.- P. 151— 156

64. Krishnan M. Polymerase chain reaction in high surface-to-volume ratio Si02 microstructures / D.T. Burke, M.A. Burns // Analytical Chemistry.-2004.-V.76.- P. 65886593

65. Koh C.J. Integrating polymerase chain reaction, valving, and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection / W. Tan, M. Zhao, A.J. Ricco, Z.H. Fan // Analytical Chemistry.-2003.-V.75.- P. 4591-4598

66. Grodzinski P. High sensitivity PCR assay in plastic micro reactors // Lab Chip.-2002.-V.2.- P. 179-187

67. Felbel J. Chemical surface management for micro PCR in silicon chip thermocyclers /1. Bieber, J.M. Kóhler // Proceedings of SPIE.-2002.-V.49.- P. 34-40

68. Schmidt U. Low-volume amplification on chemically structured chips using the PowerPlexl6 DNA amplification kit // International Journal of Legal Medicine.-2006.-V.l20.-P. 42—48

69. Brenan J.H. Nanoliter high throughput quantitative PCR // Nucleic Acids Research.-2006.-V.34.- P. el23

70. Kim J. A disposable, self-contained PCR chip / D. Byun, M.J. Mauka, H.H. Bau // Lab Chip.-2009.-V.9.- P. 606-612

71. Drobyshev A.L. The role of DNA diffusion in solid phase polymerase chain reaction with gel-immobilized primers in planar and capillary microarray format / TV. Nasedkina, N.V. Zakharova // Biomicrofluidics.-2009.-V.3.- P. 044112

72. Mikhailovich V.M. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV and HCV / D.A. Khodakov, N.V. Zakharova, D.A. Gryadunov, F.P. Filatov, A.S. Zasedatelev // BioTechniques.-2008.-V.44,- P. 241-248

73. Rey L. Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products / J.C. May //Marcel Dekker.-1999.- pp. 501

74. Klatser P.R. Stabilized, freeze-dried PCR mix for detection of mycobacteria. / S. Kuijper, C.W. van Ingen, J.H. Kolk // Journal of Clinical Microbiology.-1998.-V.36.- P. 1798-1800

75. Carpenter J.F. Liophilization of protein pharmaceuticals / B.S. Chang // Biotechnology and biopharmaceutical manufacturing.-1996.-V.- P. 199-264

76. Aracawa T. Factors affecting short-term and long-term stabilities of protein / J. Prestrelsky, W. Kinney, J.F. Carpenter //Advanced Drug Delivery.-1993.-V. 10.- P. 1-28

77. Prestrelsky J. Dehydration-induced conformational transitions in proteins and their inhibition by stabilizers / N. Tedeschi, T. Aracawa, J.F. Carpenter // Biophysics.-1993.-V.65.-P. 661-671

78. Levine H. Principles of "criostabilization" technology from structure/propertiey relations / L. Slade // Cryo Letters.-1988.-V.9.- P. 21-63

79. Chilson O.P. Effect of freezing on enzymes / L.A. Costello, N.O. Kaplan // Fed Proc.-.-V.24.- P. 55-65

80. Chen B.-L. Strategies to suppress aggregation of recombinant keratinocyte growth factor during liquid formulation development /T. Arakawa, E. Hsu, L. Narhu, TJ. Tressel, S.L. Chen // Journal of Pharmaceutical Sciences.-.-V.83.~ P. 1657-1661

81. Carpenter J.F. Stabilization of phosphofructorokinase with sugars during freeze-drying / L.M. Crowe, J.H. Crowe // Biochem Biophys Acta.-1987.-V.923.- P. 109-115

82. Izutsu K. Decreased protein-stabilizing effects of cryoprotectants due to crystallization / S. Yoshioka, T. Teora // Pharmaceutical Research.-.-V.1993.- P. 1232-1237

83. Carpenter J.F. An infrared spectroscopic study of the interactions of carbohydrates with dried proteins / J.H. Crowe // Biochemistry.-1989.-V.28.- P. 3916-3922

84. Izutsu K. Effect of mannitol crystallinity on the stabilization of enzymes / S. Yoshioka, T. Teora // Chemical & Pharmaceutical Bulletin.-1994.-V.42.- P. 5-8

85. Izutsu K. The effects of additives on the stability of freeze-dried (3-galactosidase. stored at elevated temperature / S. Yoshioka, Y. Takeda // International Journal of Pharmaceutics.-1991.-V.71.- P. 137-146

86. Chang B.S. Surface-induced denaturation of proteins during freezing and its inhibition by surfactants / B.S. Kendrick, J.F. Carpenter // Pharmaceutical Research.-1996.-V.85.-P. 1325-1333

87. Патент. Dry amplification reagent mixure for PCR and the technique of PCR analysis // G.O. Shaikhaev.-2005.- W02005/103217

88. DIANE Publishing Company. Biotechnology in a Global Economy //DIANE Publishing.-1992.-pp. 283

89. Nelson G.C. Genetically modified organisms in agriculture: economics and politics //Academic Press.-2001.- pp. 344

90. Marmiroli N. Methods for detection of GMOs in food and feed / E. Maestri, M, Gulli, A, Malcevschi, C, Peano, R, Bordoni, G, De Bellis // Analytical and Bioanalytical Chemistry.-2008.-V.392.- P. 369-384

91. О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Постановление №80 от 30.11.2007.

92. Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени / . МУК 4.2.2305-07.

93. Kempken F. Genetic Modification of Plants: Agriculture, Horticulture and Forestry / C. Jung //Springer Berlin Heidelberg.-2010.- pp. 667

94. Grohmann L. Detection of genetically modified plantsin seeds, food and feed // Biotechnology in Agriculture and Forestry.-2010.-V.64.- P. 117-136

95. Vollenhofer S. Genetically modified organisms in foods screening and specific detection by polymerase chain reaction / K. Burg, J. Schmidt, H. Kroath // Journal of agricultural and food chemistiy.-1999.-V.47.- P. 5038-5043

96. Kricka L.J. Microchip PCR / P. Wilding // Anal Bioanal Chem.-2003.-V.377.- P. 820-825

97. Reyes D.R. Micro Total Analysis Systems. 1. Introduction,Theory and Technology / D. Iossifidis, P. Auroux, A. Manz // Analytical Chemistry.-2002.-V.74.- P. 2623-2636

98. Oda R.P. Infrared-mediated thermocycling for ultrafast poly-merase chain reaction / M.A. Strausbauch, A.F.R. Huhmer, N. Borson, S.R. Jurrens, J. Craig //Analytical Chemistiy.-1998.-V- P. 4361 4368

99. Huhmer A.F.R. Noncontact infrared-mediated thermo-"cycling for effective polymerase / J.P. Landers //Analytical Chemistry.-2000.-V.72.- P. 5507 5512

100. Orrling K. An efficient method to perform milliliter-scale PCR utilizing highly controlled microwave thermocycling / P. Nilsson, M. Gullberg, M. Larhed // Chemical Communications.-2004.-V.7.- P. 790-791

101. Fermer C. Microwave-assisted high-speed PCR / P. Nilsson, M. Larhed //157

102. European Journal of Pharmaceutical Sciences.-2003.-V.18.- P. 129-32

103. Arumuganathan K. Nuclear DNA content of some important plant species / E.D. Earle // Plant Molecular Biology Reporter.-1991.-V.9.- P. 208-218

104. Shenhar R. Self-assembly and self-organization / T. Norsten, V. Rotello // Nanostructure Science and Technology.-2004.-V.2.- P. 41-74

105. ИЗ. Патент. Surface coating for microfluidic devices that incorporate a biopolymer resistant moiety // H. Yang, S. Sundberg.-2005.-US6841193

106. Кнунянц И.JI. Химическая энциклопедия //Советская энциклопедия.-1988.-рр.

107. Richards J.У. Aluminium: its history, occurrence, properties, metallurgy and applications //BiblioBazaar.-2009.- pp. 346

108. Патент. Reaction system for performing in the amplification of nucleic acids // M. Lee, H. Bird, D. Leslie, D. Squirrel, J. Shaw, D. Ween, D. Diacon -2007.-W0/2001/023093

109. Takahashi H. Anodic oxide films on aluminum: their significance for corrosion protectio / S. Masatoshi, T. Kikuchi // Modern Aspects of Electrochemistry.-2009.-V.46.- P. 59-174

110. Vargel C. Corrosion of aluminium //Elsevier.-2004.- pp. 626

111. Davis J.R. Corrosion of aluminum and aluminum alloys //ASM International.-1999.- pp. 313

112. Roper M.G. Advances in polymerase chain reaction on microfluidic chips / C.J. Easley, J.P. Landers //Analytical Chemystry.-2005.-V.77.- P. 3887-3894

113. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии //Высшая школа.-2000.- pp. 351

114. Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа / И.П. Калинкин //Химия.-1986.- pp. 432

115. Ljung L. Modeling of dynamic systems / T. Glad //PTR Prentice Hall.-1994.- pp. 361

116. Chaudhari A.M. Transientliquid crystal thermometry of microfabricated PCRvessel arrays / T.M. Woudenberg, M. Albin, K.E. Goodson // Microelectromechanical158systems.-1998.-V.7.- P. 345 55

117. Curcio M. Continuous segmented-flow polymerase chainreaction for high-throughput miniaturized DNA amplification / J. Roeraade // Analytical Chemystry.-2003.-V.75.- P. 1-7

118. Wang Q. An integrated software solution for real-time PCR analysis based on microfluidic biochip / Gong H. // Bioengineered and Bioinspired Systems.-2003.-.-77 — 86

119. Wang Q. An integrated system for real-time PCR analysis based on microfluidic biochip / Y. Tan, H. Gong // International Journal of Computational Engineering Science.-2003.-V.4.- P. 285-288

120. Кельнер P. Аналитическая химия. Проблемы и подходы. //Мир.-2004.- pp. 608

121. Lee Т. A miniaturized DNA amplifier: its application in traditional Chinese medicine / I.-M.Hsing,A. Lao, M.C. Carles //Analytical Chemistry.-2000.-V.72.- P. 42424247

122. Mackay I.M. Real-time PCR in virology / E.A. Katherine, A. Nitsche // Nucleic Acids Research.-2002.-V.30.- P. 1292-1305

123. Spadoro J.P. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance // Journal of Clinical Microbiology.-1998.-V.36.- P. 191197

124. Siegmund V. Dry-reagent-based PCR as a novel tool for laboratory confirmation // Journal of Clinical Microbiology.-2005.-V.43.- P. 271-276

125. Skrabanja A.T. Lyophilization of biotechnology products / A.L. de Meere, R.A. de Ruiter, P.J. van den Oetelaar // Journal of Pharmaceutical Science and Technology.-1994.-V.48.-P. 311-317

126. Marmiroli N. Methods for detection of GMOs in food and feed / E. Maestri, M. Gulli, A. Malcevschi, C. Peano, R. Bordoni, G. De Bellis // Analytical and Bioanalytical Chemistry.-2008.-V.392.- P. 369-384

127. Yeates C. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification /

128. M.R.Gillings, A.D.Davison, N.Altavilla, D.A.Veal // Biological Procedures Online.-1998.1591. V.l.-P.

129. Moller E.M. A simple and efficient protocol for isolation of highmolecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies,and infected plant tissues. / G. Bahnweg, H. Sandermann, H.H. Geiger//Nucleic Acids Research.-1992.-V.20.- P. 6115-6116

130. Lodhi M. A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine sultivars and vitis species / G.-N. Ye, N. Weeden, B. Reisch // Plant Molecular Biology Reporter.-1994.-V. 12.-P. 6-13

131. Pitcher D.G. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiumthiocyanate / N.A. Saunders, R.J. Owen // Letters in Applied Microbiology.-1989.-V.8.-P. 151-156

132. Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purificationof nucleic acids //Applied Microbiology and Biotechnology.-2006.-V.73.- P. 495-504

133. Choudary P.V. Adsorption of endogenous polyphenols relieves the inhibition byfruit juices and fresh produce of immuno-PCR detection of Escherichia coli 0157:H7 / A.A. Ogunjimi // FEMS Immunology and Medical Microbiology.-1999.-V.23.- P. 213-220

134. Koonjul P. Inclusion of polyvinylpyrrolidone in the polymerasechain reaction reverses the inhibitory effects ofpolyphenolic contamination of RNA / W. Brandt, J. Farrant, G. Lindsey // Nucleic Acids Research.-1999.-V.27.- P. 915-916

135. Tulpan D. Thermodynamically based DNA strand design / M. Andronescu, S.B. Chang, M.R. Shortreed, A. Condon, H. H. Hoos, L.M. Smith // Nucleic Acids Research.2005.-V.33.-P. 4951-4964

136. Ho S. Thermogenomics: Thermodynamic-based approaches to genomicanalyses of DNA structure // Methods.-2009.-V.47.- P. 159-167

137. Tanaka E Specificity of Hybridization Between DNA Sequences Based on Free Energy. / A. Kameda ,M. Yamamoto, A. Ohuchi // Lecture Notes in Computer Science.2006.-V.3892.-P. 371-379

138. SantaLucia J.Jr. The thermodynamics of DNA structural motifs. / D. Hicks // Annu Rev Biophys Biomol Struct.-2004.-V.33.- P. 415-440

139. Hardegger M. Quantitative detection of the 35S promoter and the NOS terminatorusing quantitative competitive PCR / P. Brodmann, A. Herrmann // European Food Research and Technology.-1999.-V.209.- P. 83-87

140. Ishii K. Optimization of annealing temperature to reduce bias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR / M. Fukui // Applied and Environmental Microbiology. -2001.-V.67.-P. 3753-3755

141. Moreira B.G. Effects of fluorescent dyes, quenchers, and dangling endson DNA duplex stability. / Y. You, M.A. Behlke, R. Owczarzy // Biochemical and Biophysical Research Communications.-2005.-V.327.- P. 473^84