Неферментативная рекомбинация молекул РНК в реакциях расщепления/лигирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах

Лутай Алексей Валериевич

НЕФЕРМЕНТАТИВНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ МОЛЕКУЛ РНК В РЕАКЦИЯХ РАСЩЕПЛЕНИЯ /ЛИГИРОВАНИЯ

02 00 10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1111111111111111111

ООЗОТ1В22

I

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель

д х н , академик РАН Власов Валентин Викторович

Официальные оппоненты

д х н Салахутдинов Нариман Фаридович к х н Пышная Инна Алексеевна

Ведущая организация

Институт физико-химической биологии им А Н Белозерского

Защита состоится » М.С№ 2007

в 1Л- часов на

,МГУ

:аседании

диссертационного совета Д 003 45 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «¿У » & И 2007 1

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Федорова О С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ключевым этапом возникновения жизни является период, на котором из молекул РНК, возникших в ходе пребиотического синтеза, формировались пространственно обособленные надмолекулярные ансамбли, способные к самовоспроизведению и эволюции Это в итоге привело к формированию молекулярно-генетических и биохимических основ современной организации жизни Исследования последних лет показали, что первые молекулярные ансамбли такого типа состояли из молекул РНК небольшой длины, которые появились в результате абиотических процессов из относительно простых органических предшественников нуклеиновых кислот. Одним из вопросов, связанных с развитием мира РНК, является следующий в результате каких реакций в пребиотическом мире, в отсутствие белковых ферментов, происходило усложнение молекул РНК и увеличение их размера? Самовоспроизведение имеющихся молекул подразумевает существование процессов репликации (полимеризации), а эволюция — наличие процессов генерации изменчивости молекул РНК (рекомбинации)

Возможным вариантом процесса, который может приводить к увеличению разнообразия и удлинению молекул РНК, является неферментативная рекомбинация с участием 2',3'-циклофосфата На первом этапе расщепление РНК приводит к образованию фрагментов, несущих на З'-конце 2',3'-циклофосфат, которые далее могут взаимодействовать с 5'-ОН группой других фрагментов Для указанной реакции, во всех описанных случаях, наблюдались низкие выходы продуктов неферментативного лигирования, однако, можно ожидать, что простейшие вещества, присутствовавшие в «пребиотическом бульоне» и способные влиять на эффективность протекания реакций трансэтерификации, например ионы металлов, могут обеспечивать более высокую скорость образования новых молекул РНК (продуктов лигирования)

Целью настоящей работы является изучение реакции неферментативного лигирования фрагментов РНК, которая могла бы иметь место в пребиотических условиях

В ходе исследования решались следующие задачи

1) Изучение эффективности протекания реакции неферментативного лигирования между олигонуклеотидами, концевые 2',3'-циклофосфат и 5'-гидроксильная группа которых сближены в дуплексе за счет образования комплекса с комплементарной матрицей Исследование влияния рН, температуры и концентрации двухвалентных ионов металлов, как возможных катализаторов превращения

еакции и

ие

типа реакции

2) Изучение сопряженной реакции расщепления/лигирования в комплексе частично-комплементарных олигонуклеотидов Выяснение особенностей протекания реакции, а именно влияние двухвалентных ионов металлов, рН буфера и температуры на скорость эффективность образования продуктов лигирования

3) Выделение продуктов лигирования и определе* фосфодиэфирной связи, образующейся при протекании расщепления/лигирования

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе была показана возможность образования новых молекул РНК с измененной последовательностью в результате неферментативной | реакции расщепления/лигирования, протекающей в присутствии ионов магния Ионы Mn2+, Со2+, Zn2+ и РЬ2+ ускоряют реакцию неферментативного лигирования и также могут выступать в качестве катализаторов образования новых молекул РНК Результаты, полученные в работе, расширяют представления о свойствах молекулы РНК и неферментативных способах появления новых последовательностей РНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы Результаты работы представлены на международных конференциях "29th FEBS Congress" (Poland, 2004), "International Society for the Study of the Origin of Life" (China, 2005), "Origin of life and Evolution of Biosphere" (Novosibirsk, 2005), "International Conference on the Chemical Biology" (Novosibirsk, 2005)

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы Работа изложена на 104 страницах, содержит 34 рисунка и 4 таблицы Библиография включает 163 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование матрично-направленной реакции лигирования олигонуклеотидов, несущих 2',3'-циклофосфат

Реакцию неферментативного матрично-зависимого лигирования олигонуклеотидов изучали в комплементарном комплексе из трех олигонуклеотидов, в котором 2',3'-циклофосфат одного олигонуклеотида Ш-гОр и 5'-гидроксильная группа олигонуклеотидоа Ню сближены за счет образования комплементарного комплекса с олигонуклеотидом-матрицей I (Рис 1, А)

IM-rC>p

2\3>p

5'-0H

pAGGGATAGGAAACArC CAAAGATGAT TCCCTATCCTTTGT-GG-TTTCTACTATGCCG I

-0-P-0-

, "pAGGGATAGGAAACArCCAAAGATGAT

TCCCTATCCTTTGT-GG-TTTCTACTATGCCG

"pAGGGATAGGAAACAr(CpA)

"pAGGGATAGGAAACArCp ■

pAGGGATAGGAAACArC>p

Рис. 1. Неферментативное лигирование олигонуклеотидов в составе комплекса 1/(11 ю+III-rOp) А Схема реакции Б. Схема получения олигонуклеотида Ш-гОр 1 - 0 1 М NaOH, 90°С, 5 мин, 2 -50 мМ EDAC, 100 мМ MES-TEA рН 5.5, 37°С, 1 ч Рибонуклеотидные звенья выделены жирным

Для того, чтобы избежать деградации фосфодиэфирных связей внутри олигонуклеотидов, все олигонуклеотиды состояли полностью из дезоксирибозвеньев, за исключением олигонуклеотида Ш-гС>р, который содержал на З'-конце рибозвено, несущее 2',3'-циклофосфат В качестве 3'-фрагмента использовали как олигонуклеотид равной длины - II, так и более короткий олигонуклеотид - П10

Для получения Ш-гС>р олигонуклеотид Ш-г(СрА) обрабатывали 0.1 М №ОН, а затем получившийся олигонуклеотид Ш-гСр инкубировали с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (ЕВАС) (Рис. 1, Б) Выход реакции циклизации был не менее 99% Образование 2',3'-циклофосфата доказывали обработкой олигонуклеотида Ш-гС>р 0 01 М раствором НС1, что приводило к гидролизу циклофосфата и изменению подвижности олигонуклеотида в денатурирующем 20%-ном ПААГ Двухцепочечный комплекс 1/(11 ю+Ш-гОр) (далее комплекс АО получали стандартной процедурой отжига, содержание комплекса при 37°С составляло не менее 95%

Зависимость эффективности реакции лигирования от рН и присутствия ионов магния

Влияние рН на эффективность протекания реакции лигирования изучали, инкубируя комплекс А] в какодилатном (рН 6 0, 6 4, 6 8, 7.2) и Трис-НС1 (рН 7 2, 7 8, 8 4, 8 8) буферах, которые имеют перекрывающееся значение рН 7.2, что позволяет сравнивать реакции в двух буферах различной природы

Как видно из рис 2 эффективность реакции лигирования в отсутствие ионов металлов возрастает с ростом значений рН (светлые столбцы) Наблюдаемая зависимость объясняется ускорением реакции за счет увеличения нуклеофильности атакующей 5'-гидроксильной группы, что соответствует механизму основного катализа

Аналогичный вид рН-зависимости наблюдается и в присутствии ионов магния в этом случае катализирующий эффект ионов металла также увеличивается с ростом рН, однако выходы продуктов лигирования значительно выше, чем в отсутствии ионов металлов (Рис 2, темные столбцы) Присутствие 200 мМ №С1 не оказывает заметного влияния на эффективность магний-зависимой реакции при 37°С

Также оказалось, что добавление в реакционную смесь ЭДТА до равной и большей концентрации, чем концентрация ионов магния приводит к резкому снижению эффективности

реакции неферментативного лигирования, что подтверждает предположение о роли аквагидроксокомплексов ионов магния, как катализаторов реакции

По аналогии с реакцией

во в 4 6 8 7.2 78

» буфер без Мд*- ™ буфер с!

Рис. 2. рН-зависимость спонтанного (светлые столбцы) и металл-зависимого | (темные

столбцы) неферментативного лигирования олигонуклеотидов. 1 мкМ комплекс А[ инкубировали в течение 72 ч при 37°С в отсутствие или в присутствии 5 мМ| М§С12 в 50 мМ какодилатном или Трис-НС1 буфере, каждый из [которых содержал 200 мМ ЫаС1 Значения выходов реакции для буферов при рН 7.2 были усреднены, поскольку разница между ними была меньше 0 3%.

расщепления фосфодиэф ирных связей в РНК, ион металла координирует атакующую гидрбксильную

группу, облегчая ее депротонирование, депротонирования определяется значением

при этом эффективность рКа аквагидроксокомплекса иона металла Поэтому следует ожидать, что ионы металлов с более низким значением рКа, чем у иона магния, должны проявлял! большую каталитическую активность в реакции неферментативного лигирования

Кинетика реакции неферментативного лигирования

В исследуемой реакционной системе образующийся продукт лигирования может вступать в обратную реакцию — реакцию расщепления фосфодиэфирной связи с образованием 2',3'-циклофосфата] который способен как повторно вступать в реакцию неферментативного лигирования, так и подвергаться гидролизу с образованием концевой фосфатной группы, смещая равновесие в сторону расщепления Выход продукта лигирования в этом случае отражает равновесие существующее в

некоторый момент времени между реакциями лигирования, расщепления и гидролиза 2',3'-циклофосфата, каждая из которых катализируется ионами металлов Сравнение выходов реакции на стадии накопления продукта является наиболее объективным критерием сравнения каталитической активности ионов металла, если не в самой реакции неферментативного лигирования, то в процессе образования новых молекул РНК

Для определения продолжительности стадии накопления продуктов лигирования, кинетику неферментативного лигирования исследовали в присутствии ионов магния и кобальта, а также в присутствии спермидина Выбор ионов металлов определялся а) различием рКа их аквакомплексов (значения рКа отличаются не менее, чем на 3 единицы), б) различием в предпочтении лигандов (ион магния связывается преимущественно с атомами кислорода, тогда как ион кобальта взаимодействует и с атомами азота), в) сравнимыми размерами ионов Спермидин был выбран в качестве альтернативного катиона, так как он является полиамином, который за счет протонированных в водных растворах аминогрупп связывается с отрицательно-заряженными молекулами нуклеиновых кислот.

Продукт лигирования появляется уже в течение первых суток инкубации и затем его количество возрастает (Рис 3) Количественные данные были получены двумя методами — путем прямого определения радиоактивности в полосе, соответствующей продукту лигирования, по Черенкову и сканированием геля на Molecular Imager FX-PRO Plus (Вю-Rad, USA) (Рис 3,Б)

Mg»

M0(234S>7S9 0125<5S7«9 0t234567S9

Рис. 3. Кинетика реакции неферментативного лиги-рования А Анализ в 15%-ном денатурирующем

•• • ......... — ПААГ реакционных смесей, содержавших

НИШИ» МИНИН ||(||||)|| лг» 1 Мм комплекс А,, 50 мМ Трис-НС1 рН

7 2, 200 мМ ЫаС1, а также 5 мМ Г^С12, или 5 мМ СоСЬ, или 10 мМ спермидин, инкубированных при 37°С в течение 0, 17, 41, 65, 89, 100, 113, 124, 137, 149, 161 ч (дорожки 0 — 9, соответственно) Стрелками показаны положения продукта " лигирования и исходного

олигонуклеотида [32Р]-Ш-гС>р Маркеры длины (М) обозначены цифрами, соответствующими их длине Б Кинетика накопления продуктов лигирования в присутствии ионов М§2+(квадраты), Со2+(круги) и спермидина(ромбы).

«1 I» 137 14 1«

Для упрощения кинетической зависимости накопления лидирования, использовали значение тангенса угла наклона

продукта прямой,

проведенной через точки экспериментальных данных, который отражает наблюдаемую скорость накопления продуктов В течение первых ПО часов реакции продукты лигирования в реакционных смесях с ионами металлов накапливаются с эффективными константами (0.2 -»- 0 6 ( * Ю"1 ч'1. Как следует из полученных данных, в течение первых 3-4 суток реакция находится в стадии накопления продукта, поэтому в дальнейших экспериментах с указанным комплексом эффективность протекания реакции иефермеитативного лигирования оценивали, измеряя выход продукта лигирования через 3 или 4 суток.

Зависимость выхода продукта лигирования от температуры

Известно, что в некоторых случаях реакции, протекающие в комплексах нуклеиновых кислот, ускоряются при замораживании растворов, что объясняется образованием внутри льда полостей с перенасыщенным раствором, в которых скорость реакции определяется не температурой, а концентрирующим эффектом или взаимодействием с поверхностью льда Поэтому для определения температурного диапазона протекания реакции неферментатнвного литерования реакцию проводили как при положительных, так и при отрицательных температурах!- -70, -20, 5, 20, 37 °С Наиболее низкая температура соответствует полному замерзанию раствора; при -20вС, согласно Л1ггературным данным во льду

могут существовать полости

перенасыщенным раствором,

положительные значения температуры составляют диапазон условий, в которых двухцепочечный комплекс относительно стабилен и| скорость протекания реакции должна определяется температурой При более высоких температурах исследование не проводили, так как ¡при этом увеличивается степень диссоциации комплекса.

Исследования показали, что при низких температурах продукты лигирования не образуются При 37°С выходы продукта лигирования уменьшаются в ряду Со2*>М§2+>спермидии, что совпадает с результатами, полученными при исследовании кинетики реакции

Зависимость, эффективности реакции лигирования от концентрации ионов Mr1*, Mn1*, Со1*, Zn*\ Pb1* при рН 7.2 и 8.8.

Для изучения влияния различных ионов металлов на эффективность образования продукта лигирования в качестве катализаторов использовали следующие ионы - MgJ\ Мп*\ Со2*, Zn;\ Pb2\ для которых зяа» ения рКа оквакомплексов находятся в диапазоне значений от 7 до 12 Реакцию лигирования проводили при концентрации ионов металлов от 50 мкМ до 250 мМ при рН - 7.2 или 8.8. Несмотря на возможное образование малорастворимых гидроксидов металлов (а для ионов свинца также и

хлоридов), для всех ионов металлов использовали одинаковый диапазон концентраций, поскольку известно, что реакция трансэтерификации может протекать, и в осадках нуклеиновых кислот, и на поверхности нерастворимых гидроксидов

Выходы продуктов

лигирования, полученные в присутствии различных ионов металлов представлены на диаграмме (Рис 4) При рН 7 2 (темные квадраты) для всех ионов металлов, кроме магния, наблюдается

зависимость в виде колоколообразной зависимости Анализ

зависимостей показал, что значения максимумов при рН 7.2 совпадают со значениями равновесных концентраций ионов металлов,

рассчитанных из значений произведений растворимости соответствующих гидроксидов(Табл 1)

Таблица 1 Значения равновесных концентраций ионов металлов

Произведение растворимости гидроксидов, ПР

М8 Мп Со гп РЬ

ПР 5 6хЮ"12 4 5><10"14 1 бхЮ"15 ЗхЮ'16 5 5хЮ-'6

Равновесная концентрация иона металла для осаждения гидроксидов, М

рН7 2 - 07 0 025 0 005 0 008

рН 8 8 0 14 0 001 4*10'5 7 5ХЮ"6 1 4x10"5

Равновесная концент] рация иона металла для осаждения хлорида, М

- - - - 4Х10"4

Исключение составили ионы марганца для которых наибольший выход реакции лигирования наблюдался при концентрации 100 мМ (рН 7 2), которые при большей концентрации вызывают значительные изменения структуры двойной спирали, что и может быть причиной резкого падения выхода продукта лигирования

Рис. 4. Выходы продукта реакции неферментативного лигирования в присутствии ионов металлов при рН 7 2 (темные квадраты) и 8 8 (светлые ромбы) Цифрами 1-7 обозначена концентрация ионов металла 0, 0 05, 0 5, 5, 25,100, 250 мМ, соответственно

Таким образом, существование максимумов на приведенных зависимостях объясняется образованием гетерогенной ([^¿1 в виде нерастворимых гидроксидов, которое приводит к уменьшение концентрации свободного иона металла в растворе, а также, к соосаждению нуклеиновых кислот. При этом наблюдается снижение эффективности реакции

Эффективность образования продуктов лигирования при рН 7 2 для различных ионов металлов при концентрациях от 0 05 ¿о 5 мМ уменьшается в ряду. РЬ>2п>Со>Мп>М§ Данный порядок точно коррелирует со значениями констант кислотности аквакомплексов ионов 12 (Мё2>10 7(Мп2>8 8(Со2+)> 8 5(2п2+)> 7 5(РЬ2+) |

При рН 8 8 (Рис. 4, серые ромбы) только для ионов магния и марганца рассчитанные равновесные концентрации находятся в диапазоне используемых концентраций, что и отражается в виде максимумов на кривых Все остальные ионы при рН 8 8 имеют низкие значения равновесной концентрации и не оказывают значительного влияния на эффективность реакции лигирования.

Рассчитанное равновесное значение концентрации иона магния при рН 8 8 (Табл. 1) составляет 140 мМ, однако мы наблюдаем уменьшение выхода продукта лигирования уже при увеличении концентрации ионов магния от 25 мМ до 100 мМ. Известно, что увеличение концентрации ионов магния от 10 до 100 мМ при рН 9 0 приводит к ускорений реакции расщепления РНК, а не лигирования Таким образом, снижение выхода реакции лигирования, наблюдаемое в этих условиях, может быть вызвано увеличением скорости расщепления образованной фосфодиэфирной связи

Таким образом, в ходе исследований выяснено, что реакция неферментативного лигирования олигонуклеотидов, несущих 2',3'-циклофосфат, может протекать в составе дуплекса, где 2',3'-циклофосфат и 5'-гидроксильная группа соседних олигонуклеотидов сближены в результате комплементарных взаимодействий с олигонуклеотидом-матрицей Эффективность образования продукта лигирования увеличивается с ростом рН, а также в присутствии ионов металлов (Mg2+, Мп2+, Со2+, Ъс?*, РЬ24) Однако, в случае металл-катализируемоЬ реакции эффективность лигирования зависит от значения рКа иона металла и растворимости его гидроксида Ионы металлов проявляют максимальную эффективность катализа при рН близких значению рКа их аква^мплексов и при концентрациях ниже их равновесной концентрации, возможной в данных условиях

Наибольший выход продуктов лигирования 16% наблюдался при рН 8 8 и 25 мМ ионов магния, а наибольшие выходы продуков лигирования в присутствии для ионов кобальта и марганца составляли около 10%

Анализ природы образующейся фосфодиэфирной связи

Поскольку взаимодействие 2',3'-циклофосфата с 5'-гидроксильной группой может приводить к образованию как 3',5'-, так и 2',5'-фосфодиэфирной связи, то для определения типа образующейся связи мы использовали метод ферментативного гидролиза фосфодиэфирных связей Рибонуклеаза Т1 расщепляет только 3',5'- фосфодиэфирные rGpX связи, причем способна узнавать и процессировать даже единственную рибосвязь в составе химерных ДНК/РНК олигонуклеотидов

Для создания GpX-содержащего продукта лигирования использовали химерный ДНК/РНК олигонуклеотид III-rGpA, содержащий на З'-конце последовательность rGprA вместо гСргА, и олигонуклеотид-матрицу Ig, содержащий замену G->C в соответствующем положении. Продукты лигирования получали, инкубируя комплекс Ai в следующих буферах 1) 25 мМ Mg2+, 50 мМ Трис 8 8, 200 мМ NaCl, 2) 1 мМ Мп2+, 50 мМ Трис 8 4, 200 мМ NaCl и 3) 10 мМ Со2\ 50 мМ Трис 8 8,200 мМ NaCl

В качестве позитивного контроля использовали олигонуклеотид Р', соответствующий продукту лигирования и содержащий только 3',5'-фосфодиэфирные связи, который получали лигированием с помощью ДНК-лигазы дефосфорилированного с З'-конца олигонуклеотида III-rG и фосфорилированного олигонуклеотида рПю, сближенных на комплементарной матрице Ig (Рис 5, схема вверху слева)

F» (3,5') Р (2',5' ог 3,5*)

Р' . PjMal__ЕШп)__Р[Со)

0123012301230123

25

Рис. 5. Определение типа фосфодиэфирной связи,

образующейся в реакции неферментативного лигирования Олигонуклеотиды обозначены жирными линиями, образующаяся связь показана волнистой линией, р

- фосфатная группа Анализ расщепления продуктов лигирования Р' и Р(Ме) Дорожки 0

- олигонуклеотид, 1 - рН 13, 90°С, 20 мин, 2 - какодилат рН 6 8,45°С, 4 ч, 3 - 50 ед акт РНКазы Т1, какодилат рН 6 8,45°С, 4 ч

Все олигонуклеотиды расщеплялись 0 1 М ЫаОН с образованием продуктов с одинаковой электрофоретической подвижностью (Рис 5, дорожка 1) В условиях инкубации с рибонуклеазой Т1 (дорожка 3) происходит количественное расщепления продукта ферментативного лигирования Р', тогда как продукты неферментативного лигирования

остались сохранными более чем на 98% Полученные данные свидетельствуют о том, что неферментативное дотирование происходит с образованием 2',5'-фосфодиэфирных связей

Известно, что в составе двойной спирали РНК 2',5'-фосфодиэфирная связь находится в т-1те конформации и является нестабильной Для определения стабильности образовавшейся 2',5-фосфодиэфирной связи (КЗрс1С) в составе используемого ДНК-комплекса, продукт лигирования подвергли М§2+-зависимому щелочному гидролизу, как в одноцепочечном состоянии, так и в составе дуплекса с комплементарной ДНК-патрицей (Рис 6)

без матрицы б с матрицей 123456 0123456 Р '

0123456 0123456

---Р(Мд)

(2'-5')

10 20 30 Время, ч

Рис. 6 Магний-зависимое расщепление фосфодиэфирной связи, образующейся в| реакции неферментативного лигирования А Анализ в 20%-ном денаутрирующем ПААГ продуктов реакции расщепления

олигонуклеотидов РиР' Трис-НС1 буфере содержащем 100 мМ присутствии (а, б) и в отсутствие (в, г) комплементарной матрицы 16 Цифры соответствуют (временам инкубации 0, 2, 4, 7 5, 24, 32, 48 ч, соответственно Б Кинетические профили реакции расщепления Буквенное обозначение профилей, как на А.

в 50 мМ рН 9 0, |М62+, в

Для сравнения использовали продукт ферментативного лигирования Р', содержащий 3',5'-фосфодиэфирную связь Как видно из рис 6, 3',5'-фосфодиэфирная связь проявляет большую стабильность в одноцепочечном состоянии (а), чем 2',5'-изомер (в) и гораздо более стабильна (б) в составе дуплекса Скорость расщепления в двуцепочечной спирали для 2',5'-изомера (г) в 103 раз выше, чем для 3',5-изомера (б), что совпадает с литературными данными |

Исходя из полученных данных, схема реакции выглядит следующим образом разрыву

высвобождению фосфодиэфирной

нуклеофильная атака 5'-гидроксильной группы приводит к находящейся напротив 3 О-Р связи в 2',3'-циклофосфате, З'-гидроксильной группы и образованию 2',5'-связи Образующаяся 3'-гидроксильная[ группа

находится в ш-Ьпе положении к 50-Р связи в 2',5'-фосфодиэфирной связи и, выступая в роли атакующего нуклеофила, приводит к исходной системе, в которой существуют 2',3'-циклофосфат и свободная 5'-гидроксильная группа, что и наблюдалось при высоких концентрациях М§2+ (Рис. 7)

3',5'-фосфодиэфирная связь, имеющая в двойной спирали значительно более высокую стабильность, если бы

образовывалась, то должна была бы сохраняться в дуплексе Таким образом, можно считать, что в исследованных условиях 3',5-связь не образуются в заметных количествах в реакции неферментативного лигирования с участием 2',3'-циклофосфата и 5'-гидроксильной группы Такая стереоселективность свидетельствует о существовании конформационных ограничений, которые затрудняют протекание нуклеофильной атаки 5'-гидроксильной группы в другом направлении, приводящем к образованию 3',5'-фосфодиэфирной связи

Исследование матрично-направленной комбинированной реакции раыцепления/лигирования химерного ДНК/РНК олигонуклеотида.

Выбор модели

Мы предположили, что 2',3'-циклофосфат, образующийся в результате расщепления РНК, может взаимодействовать не с высвободившейся 5'-гидроксильной группой, а с 5'-гидроксильной группой другого фрагмента В этом случае, в результате двух последовательных неферментативных реакций из нескольких молекул РНК может образоваться новая молекула РНК

Для исследования возможности протекания такой реакции мы использовали тройной комплекс А2, состоящий из олигонуклеотидов 1в, Пю и олигонуклеотида Ш-ЮрА, который содержал остаток аденина, не участвующий в образовании комплементарного комплекса Отщепление рибоаденилата приведет к образованию Ш-гО>р, содержащего 2',3'-циклофосфат, который может вступать в реакцию лигирования с 5'-гидроксигруппой близлежащего олигонуклеотида П10 Поскольку обе реакции - расщепления и лигирования, катализируются ионами металлов, мы использовали ион свинца, проявляющий среди металлов наибольшую каталитическую активность в реакции расщепления фосфодиэфирных

-И-М>р "ТС-N-

-¿Г-N-N-Н-

3' -5'

Рис. 7. Схема реакции неферментативного матрично-зависимого лигирования

связей и, как мы показали, значительную активность в реакции лигирования |

Инкубация тройного комплекса в присутствии различных концентраций ионов свинца РЬ2+ при рН 7.2 (37°С, 96 ч) приводит к образованию продукта лигирования, выходы которого представлены на диаграмме (Рис 8)

Наибольшая эффективность лигирования наблюдается при концентрации ионов свинца от 1 до 10 мМ, а максимальный выход продукта лигирования составляет около 6%

Выходы продукта

лигирования в реакциях лигирования и

расщепления/лигирования имеют сравнимые значения, что свидетельствовует о быстром протекания первой стадии — реакции расщепления и образования 2',3'-циклофосфата Полученные данные

демонстрируют возможность протекания сопряженной

реакции расщепления/

лигирования в присутствии ионов металлов в качестве одновременно двух реакций, а следовательно, и неферментативной рекомбинации молекул РНК

005 0 1 0.5 1 5 Концентрация ионов РЬг~, мМ

Рис. 8.

лигирования

Образование продуктов в РЬ2+-катализируемой реакции расщепления/лигирования Реакционные смеси, содержащие 1 мкМ комплекс А2, 50 мМ какодилат рН 7 2, а также ионы свинца в указанной концентрации, инкубировали в течение 96 ч при 37°С

катализаторов

воз

(ложность

Рекомбинация молекул РНК через сопряженные акты расщепления/лигирования в присутствии комплементарной матрицы

Выбор модели

Сопряженную реакцию расщепления/лигирования РНК исследовали с использованием двух частично комплементарных олигонуклеотидах Lig и Теш Последовательности олигонуклеотидов были выбран^ таким образом, что 3'-часть олигонуклеотида Tern комплементарна 5^-области олигонуклеотида Lig, а З'-часть Lig — 5'-области Теш Гибридизация этих олигонуклеотидов может приводить к образованию комплексов различной длины, при этом тетрааденилатные фрагменты олигонуклеотида Lig не

участвуют в комплексообразовании, а образуют свисающие концы (Рис 9, А)

А

fPJ-Lig üg х

•——У———---I

Тет

Lig 5 -CUCUCUUOCUGAAAA Тет 5 -GAGAGCAGGAA

5-

Б -с/с- Ли -С1"с- Л ЧЙС-

-СрС- -СрС- — -СрС-

к,

ч

-Ср с--СрС-

Рис. 9. Схема сопряженной реакции расщепления/лигирования, протекающего в комплексе олигонуклеотидов Ь^ и Теш А 32Р-радиоактивная метка обозначена звездочкой (*) Комплементарные участки олигонуклеотидов Ьщ и Тет выделены цветом Б ^ — расщепление фосфодиэфирных связей в одноцепочечном участке, не принимающем участия в образовании дуплекса, кг — образование новой фосфодиэфирной связи (выделена рамкой) с участием 2',3'-циклофосфата и 5-ОН группы второй молекулы олигонуклеотида, к_2 -расщепление образовавшейся фосфодиэфирной связи, к3 - гидролиз 2',3'-циклофосфата, приводящий к образованию 2' или З'-фосфата

Отщепление тетрааденилатного фрагмента, не принимающего участия в комплементарных взаимодействиях, приводит к образованию псевдодуплекса, содержащего в сайтах разрыва 2',3'-циклофосфат, , который может либо взаимодействовать с 5'-ОН группой расположенного рядом олигонуклеотида Ьщ, образуя новую молекулу РНК, или подвергаться гидролизу с образованием концевой фосфатной группы, которая уже не принимает участия в реакции лигирования (Рис 9, Б)

Для образования реакционного комплекса к 32Р-меченному олигонуклеотиду [32Р]-1л§, добавляли равное количество немеченных олигонуклеотидов и Тет Во всех экспериментах, кроме оговоренных особо, использовали реакционную смесь, содержащую олигонуклеотиды Ьщ, [32Р]-Ь^ и Тет в концентрации 3 мкМ

В виду отсутствия 5'-гидроксильной группы радиоактивно-меченый олигонуклеотид [32Р]-Ь^ (5'-фосфат) может вступать в реакцию лишь в случае, если он образует комплекс в паре с немеченым и только если

| расположен в 5* области комплекса (Рис. 9, А). Поскольку

комплексы ([32Р]-1^+[32Р]-П{»/Тет) и (Ьщ+[3 2Р]-П§/Тет) являются непродуктивными, а продукты легирования, образующиеся в комплексе (1лц+Ы{*/Тет), не детектируется и не учитывается из-за отсутствия в них радиоактивной метки, то в описанной экспериментальной системе выходы продукта лидирования будут несколько заниженными.

Влияние ионов магния па эффективность протекания реакции расщепления/лигирования при различных рН

Реакцию расщепления/лигирования олигонуклеотида в комплексе с Тещ изучали в бис-Трис-нропаповом буфере (ВТР) при различных рН, а также при различных концентрациях хлорида натрия и ионов магния (Рис, 10).

Рис. 10. рН-зависимость реакции расщепления/

лигирования. Анализ продуктов лигирования в 20%-ном денатурирующем ПААГ.

Реакцию проводили в присутствии 5 мМ М§С12 в 25 мМ ВТР буфере при рН от 7.0 до 9.5 (указаны сверху), при 37°С в течение 3 суток. Положения исходного олигонуклеотида [,2Р]-1А§ (дорожка К) и продуктов лигирования обозначены

стрелками Ьщ и Р, соответстве н н о.

Инкубация олигонуклсотидов в отсутствие ионов металлов не приводила к образованию детектируемых количеств продуктов лигирования, что объясняется низкой скоростью реакций трансэтерификашш в отсутствие катализаторов.

Оказалось, что с увеличением рН увеличивается как выход продуктов реакции расщепления/лигирования, так и деградация РНК, В присутствии N'¿01 степень деградации олигону клеотидов была ниже, однако, одновременно снижались и выходы продуктов лигирования (Рис. 10). Наибольший выходы продуктов лигирования - 0.2, 1.1 и 2.5% наблюдались в отсутствие ИаС1 при рН 8,5, 9.0 и 9.5, соответственно.

Важно отмстить, что хотя при рН выше 8 5 происходит значительная (более 85%) деградация свободного олигонуклеопща [КР]-Ь|§ по всем фосфодиэфирным связям, деградация продукта дотирования ограничена лишь свисающей тетрааденилатной последовательностью на его 3* конце и не затрагивает фосфодиэфнриые связи, расположенные внутри образовавшегося дуплекса (Рис 10, дорожки 8 5,9 0,9.5)

Влияние температуры на эффективность образования продуктов лигирования

Для определения влияния температуры на эффективность образования продуктов лнгирования реакцию проводили при температуре от -20"С до 42°С (Рис И) Как и ожидалось, повышение температуры приводит к увеличению степени деградации олигонуклеотида [,гР]-Ь|§. При температурах ниже 30°С расщепление связей происходит, только внутри тетрааденилатного остатка, а при более высоких температурах расщеплению подвергаются и фосфодиэфирные связи, расположенные в двуцепочечном участке (Рис 11, А)

Наибольший выход продукта лигировзния наблюдается при 25"С, при этом продукт реакции постепенно накапливается в течение 7 суток (Рис 11, В) Продукт реакции (Р) появляется уже при 15°С и представлен в виде одной полосы, которая соответствует по подвижности в геле олигомеру длиной 26 нуклеотндов (маркер длины 1т). При температуре до 25°С с повышением температуры наблюдается рост выхода продуктов лигирования, которые при 25°С представлены уже 5-ю полосами, одна из которых соответствует полноразмерному продукту лигирования (Р), а другие четыре - продуктам с отщепленными концевыми адешшамн. При дальнейшем увеличении температуры наблюдается снижение выхода продукта лигирования

При 37°С деградация олигонуклеотида [52Р]-1л§ превышает 88%, однако, в продукте лигирования расщеплению в этих условиях подвергся лишь тетраденилатный участок При 42°С выход продуктов лнгирования крайне мал (не более 0.1%), а деградация исходного олигонуклеотида превышает 95%.

При более длительном экспонировании геля, можно обнаружить, что при температурах от 20°С до 37°С происходит образование и более протяженных молекул РНК, длиной от 33 до 37 нуклеотидов, которые соответствуют продуктам реакции расшеиления/лигирования, протекающей с участием трех молекул олигонуклеотида (Рис. 11, Б).

А1т 12 3 4 5 6 7 Б

; ¥ . I 1 « 1

- -20 15 20 25 30 37 42 "С

Е'ис. 11. Влияние температуры на выход продуктов сопряженной реакции расщегшения/лигиро вания. А. Разделение в 20%-ном денатурирующем ПААГ реакционных смесей, содержащих 3 мкМ комплекс, 25 мМ ВТР рН 9.5, 5 мМ и инкубированных в течение 3

суток при температурах -20, +15, 20, 25, 30, 37 и 42 °С (дорожки \ - 7, соответственно). Положение исходного олигонуклеотида [32Р]-Ы)Д обозначено стрелкой продуктов реакции - стрелками Р,, -1, -2, -3, -4, соответственно. 1т - [ Р]-РНК IПУ1, инкубированная в 2 М имидазольном буфере, рН 7.0, 20 мин, при 96°С. Б. Более длительное экспонирование участка геля, приведенного на рис. А (показана область, выделенная скобкой на обоих частях рисунка). В. Суммарный выход продуктов реакции расщепления/лигирования (в % от исходного количества олигонуклеотида в реакционной смеси).

Полученный профиль зависимости выхода продуктов реакции расщенления/лигироваиия от температуры с максимумом при 25°С коррелирует с данными о стабильности комплекса Ь^/Тет и используемых условиях (Т11Л = 1Й°С), согласно которым при температурах выше Т„„ доля олигокукпеотядов, находящихся в составе комплекса, резко уменьшается (Рис. 11, В).

Скорость накопления продукта лидирования

Дня выяснения причины снижения выходов продукта лигирования при повышении температуры исследовали кинетику сопр^снной реакции при 25 °С и 37°С (Рис. 12). При 37°С выход продукта реакции

расщепления/лигирования увеличивается в течение первых 30 — 45 часов, а затем происходит его снижение. При этом не наблюдается появления продуктов равномерного расщепления фоефодиэфирных связей внутри продукта реакции Р1, о чем свидетельствует отсутствие полос в геле между исходным олигонуклеотидом [32Р]-Ь1(| и продуктами лигирования, (отмечено прерывистой линией на рис. 12, А), Это указывает на избирательное расщепление образованной фосфодиэфирной связи.

Рис. 12. Кинетика сопряженной реакции

расщепления/лигирования. (Л) Анализ в 20%-ном денатурирующем ПААГ реакционных смесей, содержащих 3 мкМ комплекс, 25 мМ ВТР рН 9.5, 5 мМ \lgCl2, инкубированных при 25 и 37 °С в течение 0, 6, 20, 30, 40, 45, 55, 70, 78, 90, 100, 115 ч. Положение исходного олигонуклеотида [32Р]-1^ обозначено стрелкой 1Л& а продуктов реакции — стрелками Р(, -!, -2, -3, -4 соответственно. (Б) Накопление продуктов лигирования при 25°С (квадраты) и 37°С (круги).

Деградация олигонуклеотида Ыц через 40-45 часов составляет не менее 50% и затрагивает все фосфодиэфирные связи внутри олигонуклеотида, что обусловлено его нахождение в растворе в свободном виде. Продукт сопряженной реакции расщепления/лигирования образует с Тет более прочный комплекс и, как следствие, не подвергается расщеплению (Рис. 12, А). При 25°С выход продуктов реакции линейно увеличивается в течение 7.5 суток (Рис. 12, Б), достигая наибольшего значения 6%.

Полученные данные отражают существующее равновесие между образованием и деградацией фосфодиэфирной связи в продукте лигирования, которое определяется не только температурой, но и стабильностью комплекса. Очевидно, что существуют условия, в которых выход продукта лигирования выше 6%, а время жизни превышает сотни часов.

Анализ природы фосфодиэфирной связи, образующейся в реакции расщепления/лигирования олигонуклеотидов Lig и Тет

Поскольку в продукте лигирования образуется связь врХ, то для определения природы образующейся связи (2',5'- или 3',5'-изомер), можно использовать способность рибонуклеазы Т1 селективно расщеплять только 3',5'- фосфодиэфирные связи

Продукт лигирования был получен в реакционной смеси, содержащей комплекс (2 Ьщ / Теш) и 5 мМ М§2+, при рН 9.5 и 25°С. Полноразмерный продукт лигирования содержит две врХ связи| - одна из которых, врА, расположенная ближе к 3 '-концу, является составной частью олигонуклеотида Ь^, тогда как другая, врС, образуется в исследуемой реакции Таким образом, при пробинге врС связи, образующейся в реакции расщепления/лигирования, 3',5'-фосфодиэфирную связь ОрА можно использовать для сравнения

Полученные 5'-[32Р]-радиоактивно-меченные олигонуклеотиды обрабатывали рибонуклеазой Т1 (Рис. 13)

1 0 5 10 15 20 30 40 60 120

«в.

-6«

Время, мин

Р1

Р1-

Ми

Рис. 13. Расщепление [ Р]-меченного продукта

лигирования рибонуклеазой Т1. Ь — продукт расщепления рибонуклеазой Т1 [32Р]-меченного олигонуклеотида Стрелками Р1, и11^.4 обозначены положения в' геле полноразмерного проекта лигирования, его фрагмента с отщепленной последователь-I» ностью А4, а также положение

г: ~ {Г- * фрагмента олигонуклеотида

, Ь'щ с отщепленной

последовательностью | А4 Реакционную смесь содержавшую 0 1 мкг/мкл суммарной тРНК, 20 мМ какодилат натрия рН 6 8 и 3 ед акт. рибонуклеазы Т1 инкубировали при 37°С в течение времени, указанного над каждой дорожкой

В использованных условиях СрА-связи расщепились более чем на 98% (Рис 13) Количество олигонуклеотида Ьщ^, соответствующего расщеплению врС-связи, образующейся в реакции расщепления/лигирования, уже через 10 минут составило 2 - 3 % от

исходного количества олигонуклеотида Р1, и в дальнейшем не увеличивалось Из полученных результатов следует, что не более 2 — 3% продуктов лигирования содержат 3',5'-фосфодиэфирные связи, которые и расщепились рибонуклеазой Т1, а остальные ОрС-связи, образовавшиеся в реакции расщепления/лигирования, являются 2',5'-изомерами и остаются интактными в условиях расщепления рибонуклеазой Т1.

Преимущественное образование 2',5'-фосфодиэфирной связи не уменьшает значимости данной реакции в моделировании эволюции пребиоического мира РНК, поскольку содержащие их

олигонуклеотиды способны образовывать комплементарные комплексы и могут служить как матрицами, так и праймерами для синтеза новых молекул РНК Следует отметить, что в реакции образуются, хотя и в небольшой степени, 3',5'-фосфодиэфирные связи, более устойчивые к расщепляющему действию ионов металлов

Важно то, что в результате реакции появляются новые, более длинные молекулы РНК, способные образовывать устойчивые комплексы, что в конечном итоге приводит к повышению стабильности фосфодиэфирных связей Образование новой молекулы РНК, уже полностью комплементарной исходной матрице, происходит в результате сопряженной реакции расщепления/лигирования в комплексе матрицы с частично-комплементарными

олигонуклеотидами Этот процесс представляет собой вариант блочной репликации, которая могла протекать в пребиотическом мире РНК

Выводы

Изучена неферментативная реакция дотирования с участием концевых 2',3-циклофосфата и 5'-гидроксильной группы олигонуклеотидов, сближенных на комплементарной матрице

1 Показано, что реакция катализируется двухвалентными ионами Mg2+, Мп2+, Со2+, Zn2+, РЬ2+, при этом эффективность реакции в присутствии иона металла определяется значением рКа аквакомплекса и растворимостью его основания Наибольший выход продукта лигирования, 16%, был получен в присутствии ионов магния.

2 Впервые показана возможность образования молекул РНК с измененной

реакции частично-в магния, фрагмента

последовательностью в результате сопряженной расщепления/лигирования, протекающей в комплексе комплементарных олигорибонуклеотидов в присутствии ионе Обнаруженные продукты лигирования содержат 2-3 исходного олигорибонуклеотида, а их суммарный выход достигает 6%

3 Показано, что во всех продуктах лигирования, образующихся в результате как реакции неферментативного лигированм, так и сопряженной реакции расщепления/лигирования Не менее 95% образованных связей являются 2',5'-фосфодиэфирными связями

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах: 1 Лутай А В , Черноловская Е Л., Зенкова М А, Власов В В

Неферментативное матрично-зависимое лигирование 2',3'-циклО( олигонуклеотидов, катализируемое ионами металлов // Академии Наук 2005 Т 401 С 163-166.

2 Lutay, А V , Chernolovskaya, Е L, Zenkova, М A. and Vlassov, V.V.. The nonenzymatic template-directed ligation of oligonucleo ides // Biogeosciences 2006 V. 3 P. 243-249

3 Lutay, AV, Zenkova, MA and Vlassov, VV. Noneizymatic recombination of RNA - possible mechanism of novel sequences formation // Chemistry&Biodiversity 2007. V 4 P 762-767

фосфат-Доклады

Изд лиц ИД №04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 20 04 2007 Формат бумаги 60x84/16 Бумага №1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Печ л 1,1 Уч-изд л 1,0 Тираж 100 Заказ №37 Институт неорганической химии им Л В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ГЛАВА 1. НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ФОСФОДИЭФИРНОЙ СВЯЗИ МЕЖДУ ФРАГМЕНТАМИ РНК (РЕАКЦИЯ ЛИГИРОВАНИЯ) (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 ВВЕДЕНИЕ

1.2 КОНДЕНСИРУЮЩИЕ АГЕНТЫ - КАРБОДИИМИДЫ И БРОМЦИАН

1.3 АКТИВИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФОСФАТА

1.3.1 Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот

1.3.2 Лигирование 2',3'-цикпофосфат-содержащих нуклеиновых кислот

1.3.3 Лигирование 5'-трифосфат-содержащих нуклеиновых кислот

1.4 РИБОЗИМЫ

3.2 ГИДРОЛИЗ ФОСФОДИЭФИРНОЙ СВЯЗИ ГИДРОКСИДОМ НАТРИЯ 87

3.3 ПОЛУЧЕНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С 2',3'-ЦИКЛОФОСФАТОМ НА З'-КОНЦЕ 87

3.4 ГИДРОЛИЗ 2',3'-ЦИКЛОФОСФАТА 87

3.5 ПОЛУЧЕНИЕ ДВУЦЕПОЧЕЧНОГО КОМПЛЕКСА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ 88

3.6 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РН НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ 88

3.7 ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ

В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ 89

3.8 ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ 90

3.9 ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ РИБОНУКЛЕАЗОЙ Т1 91

3.10 РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРОДУКТА ЛИГИРОВАНИЯ ПРИ РН 9.0 В

ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Мд2+ 91

3.11 ДЕФОСФОРИЛИРИРОВАНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ 91

3.12 ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ЛИГИРОВАНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С

ПОМОЩЬЮ ДНК-ЛИГАЗЫ 92

ВЫВОДЫ 93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94

Список сокращений

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (IUBMB), а также следующие сокращения:

РНК Рибонуклеиновая кислота

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ПААГ Полиакриламидный гель дПААГ Денатурирующий ПААГ

Трис Трис-(оксиметил)-аминометан

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота

CDI Карбодиимид

EDAC 1М-этил-М'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

NTP Нуклеотидтрифосфат

ДЭАЭ Диэтиламиноэтилцеллюлоза

MES-TEA N-морфолинэтансульфокислота, оттитрованная триэтиламином

ВТР БисТрис-пропан

DISN Дииминосукцинонитрил

DAMN Дииминомалеонитрил

Введение

Ключевым этапом возникновения жизни является период, на котором молекулы РНК, возникшие в ходу пребиотического синтеза, существовали в формате пространственно обособленных молекулярных ансамблей, способных к самовоспроизведению и эволюции, что в итоге привело к формированию молекулярно-генетических и биохимических основ современной организации жизни [1]. Одним из вопросов, связанных с развитием мира РНК, является следующий: в результате каких реакций в пребиотическом мире, в отсутствие белковых ферментов, происходило усложнение молекул РНК и увеличение их размера? Самовоспроизведение имеющихся молекул подразумевает существование процессов репликации (полимеризации), а эволюция - наличие процессов генерации изменчивости молекул РНК (рекомбинации).

Возможным вариантом процесса, который может приводить к увеличению разнообразия и удлинению молекул РНК, является неферментативная рекомбинация, протекающая с участием 2',3'-циклофосфата [2]. Расщепление РНК приводит к образованию фрагментов, несущих на З'-конце 2',3'-циклофосфат, который может взаимодействовать с 5'-ОН группами других фрагментов РНК.

Принципиальная возможность реакции лигирования олигонуклеотидов с участием вышеупомянутых групп была показана в работах [3-5]. Хотя в использованных условиях лигирование олигонуклеотидов протекало с низкой эффективностью, можно предположить, что простейшие вещества, присутствовавшие в «пребиотическом бульоне» и способные ускорять реакции трансэтерификации (например, ионы металлов), могут также повышать и эффективность реакций лигирования РНК.

Целью настоящей работы является изучение реакции неферментативного лигирования фрагментов РНК, которая могла бы иметь место в пребиотических условиях.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1) изучение эффективности протекания реакции неферментативного лигирования между олигонуклеотидами, у которых концевые г'.З'-циклофосфат и 5'-гидроксильная группа сближены в дуплексе за счет образования комплекса с комплементарной матрицей. Исследование влияния рН буфера, температуры среды и различных концентраций двухвалентных ионов металлов, как возможных катализаторов превращения;

2) изучение комбинированной реакции расщепления/лигирования в комплексе частично-комплементарных олигонуклеотидов. Выяснение особенностей протекания реакции, а именно: влияния на эффективность образования продуктов лигирования двухвалентных ионов металлов, рН буфера и температуры среды, скорости реакции.

3) Выделение продуктов лигирования и определение типов изомеров фосфодиэфирной связи.

Выводы

Изучена неферментативная реакция лигирования с участием концевых 2',3'-циклофосфата и 5'-гидроксильной группы олигонуклеотидов, сближенных на комплементарной матрице.

1) Показано, что реакция катализируется двухвалентными ионами Мд2+, Мп2+, Со2+, Zn2+, Pb2+, при этом эффективность реакции в присутствии иона металла определяется значением рКа аквакомплекса и растворимостью его основания. Наибольший выход продукта лигирования, 16%, был получен в присутствии ионов магния.

2) Впервые показано образование молекул РНК с измененной последовательностью в результате протекания в комплексе частично-комплементарных олигорибонуклеотидов сопряженной реакции расщепления/лигирования, катализируемой ионами магния. Обнаруженные продукты лигирования содержат от 2 до 3 фрагментов исходного олигорибонуклеотида.

3) Показано, что во всех продуктах лигирования, образующихся в результате протекания как реакции неферментативного лигирования, так и сопряженной реакции расщепления/лигирования, не менее 95%-образованных связей являются 2',5'-фосфодиэфирными связями.

1. Gilbert W. The RNA World. // Nature. 1986. V. 319. P. 618.

2. Chetverin A. B. The puzzle of RNA recombination. // FEBS Lett. 1999. V. 460. P. 15.

3. Verlander M. S., Lohrmann R., Orgel L E. Catalysts for the self-polymerization of adenosine cyclic 2', З'-phosphate. //J. Mol. Evol. 1973. V. 2. P. 303-316.

4. Uesugi S., Ikehara M. Synthesis and template-directed polymerization of adenylyl(3'-5')adenosine cyclic 2', 3-phosphate. // Biochemistry. 1977. V. 16. P. 493498.

5. Usher D. A., McHale A. H. Nonenzymic joining of oligoadenylates on a polyuridylic acid template. // Science. 1976. V. 192. P. 53-54.

6. Orgel L E. Prebiotic chemistry and the origin of the RNA world. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 39. P. 99-123.

7. Naylor R, Gilham P. T. Studies on some interactions and reactions of oligonucleotides in aqueous solution. // Biochemistry. 1966. V. 5. P. 2722-2728.

8. Schneider-Bernloehr H., Lohrmann R., Sulston J., Weimann B. J., Orgel L E., Miles H. T. Non-enzymic synthesis of deoxyadenylate oligonucleotides on a polyuridylate template. // J. Mol. Biol. 1968. V. 37. P. 151-155.

9. Robberson D. L., Davidson N. Covalent coupling of ribonucleic acid to agarose. // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 533-537.

10. Пурмаль А. А., Друца В. Л, Шабарова 3. А. Новый тип модифицированных ДНК. Специфическое введение 3'-5'-пирофосфатных межнуклеотидных связей. // Биоорганическая химия. 1984. Т. 10. С. 394-400.

11. Kanaya Е., Yanagawa Н. Template-directed synthesis of oligoadenylates using cyanogen bromide and diiminosuccinonitrile. // Nucleic Acids Symp. Ser. 1985. V. P. 181-184.

12. Kanaya E., Yanagawa H. Template-directed polymerization of oligoadenylates using cyanogen bromide. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7423-7430.

13. Ng К. E., Orgel L E. The action of a water-soluble carbodiimide on adenosine-5'-polyphosphates. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 3573-3580.

14. Пурмаль А. А., Друца В. Л., Шабарова 3. А. Введение три- и тетрафосфатных межнуклеотидных вставок в олигодезоксирибонуклеотиды. // Биоорганическая химия. 1988. V. 14. Р. 1183-1187.

15. Ferris J. P., Ertem G., Agarwal V. Mineral catalysis of the formation of dimers of 5-AMP in aqueous solution: the possible role of montmorillonite clays in the prebiotic synthesis of RNA. // Orig. Life Evol. Biosph. 1989. V. 19. P. 165-178.

16. Shabarova Z. A., Dolinnaya N. G., Drutsa V. L, Melnikova N. P., Purmal A. A. DNA-like duplexes with repetitions. III. Efficient template-guided chemical polymerization of d(TGGCCAAGCTp). // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 57475761.

17. Королева О. H., Друца В. Л., Долинная Н. Г., Цытович А. В., Шабарова 3. А. ДНК-подобные дуплексы, содержащие повторы. VII. Химико-ферментативныйсинтез полимеров с фрагментами промоторов. // Молекулярная биология. 1984. Т. 18. С. 146-160.

18. Кузнецова С. А., Ивановская M. Г., Шабарова 3. А. Химические реакции в двухспиральных нуклеиновых кислотах. Природа связи, образующейся при химческом лигировании с участием цис-диольной группировки. // Биоорганическая химия. 1987. Т. 13. С. 1139-1141.

19. Dolinnaya N. G., Sokolova N. I., Gryaznova О. I., Shabarova Z. A. Site-directed modification of DNA duplexes by chemical ligation. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 3721-3738.

20. Dolinnaya N. G., Sokolova N. /., Ashirbekova D. Т., Shabarova Z. A. The use of BrCN for assembling modified DNA duplexes and DNA-RNA hybrids; comparison with water-soluble carbodiimide. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 3067-3072.

21. Ого J. Mechanism of synthesis of adenine from hydrogen cyanide under possible primitive earth conditions. // Nature. 1961. V. 191. P. 1193-1194.

22. Lowe C. U., Rees M. W., Markham R. Synthesis of Complex Organic Compounds from Simple Precursors: Formation of Amino-Acids, Amino-Acid Polymers, Fatty Acids and Purines from Ammonium Cyanide. // Nature. 1963. V. 199. P. 219-222.

23. Ferris J. P., Orgel L. E. Aminomalononitrile and 4-amino-5-cyanoimidazole in hydrogen cyanide polymerization and adenine synthesis. // J. Am. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 4976-4977.

24. Sanchez R., Ferris J., Orgel L. E. Conditions for purine synthesis: did prebiotic synthesis occur at low temperatures?. // Science. 1966. V. 153. P. 72-73.

25. Sanchez R. A., Ferris J. P., Orgel L. E. Cyanoacetylene in prebiotic synthesis. // Science. 1966. V. 154. P. 784-785.

26. Ho N. W., Gilham P. T. The reversible chemical modification of uracil, thymine, and guanine nucleotides and the modification of the action of ribonuclease on ribonucleic acid. // Biochemistry. 1967. V. 6. P. 3632-3639.

27. Shabarova Z. A., Prokofiev M. A. A model of enzymatic synthesis of the internucleotide bond between oligodeoxynucleotides. // FEBS Lett. 1970. V. 11. P. 237-240.

28. Uesugi S., Ts'o P. 0. Chemical polymerization of oligonucleotides directed by a complementary polynucleotide. Preparation and polymerization of oligo(2'-0-methylinosine З'-phosphate). // Biochemistry. 1974. V. 13. P. 3142-3152.

29. Ibanez J. D., Kimball A. P., Oro J. Possible Prebiotic Condensation of Mononucleotides by Cyanamide. // Science. 1971. V. 173. P. 444-446.

30. Arndt-Jovin D. J., Jovin Т. M., Bahr W., Frischauf A. M., Marquardt M. Covalent attachment of DNA to agarose. Improved synthesis and use in affinity chromatography. // Eur. J. Biochem. 1975. V. 54. P. 411-418.

31. Potuzak H., Dean D. G. Affinity chromatography on columns containing nucleic acids. // FEBS Lett. 1978. V. 88. P. 161-166.

32. Ferris J. P., Yanagawa H., Hagan W. J., Jr. Prebiotic synthesis and reactions of nucleosides and nucleotides. // Adv. Space Res. 1983. V. 3. P. 61-68.

33. Ferris J. P., Huang С. H., Hagan W. J., Jr. Montmorillonite: a multifunctional mineral catalyst for the prebiological formation of phosphate esters. // Orig. Life Evol. Biosph. 1988. V. 18. P. 121-133.

34. Зарытова В. Ф., Райт В. К, С. Ч. Т. Действие активирующих реагентов на межнуклеотидные связи в полирибонуклеотиде. // Биоорганическая химия. 1977. Т. 3. С. 1626-1631.

35. Герцюк М. И., Сергеев В. И., Цытович А. В., Долинная Н. Г., Кухарь В. П. Синтез и реакционная способность новых водорастворимых карбодиимидов. // Биоорганическая химия. 1990. Т. 16. С. 1268-1276.

36. Долинная Н. Г., Гоязнова О. И., Соколова Н. И., Шабарова 3. А. Химические реакции в двухспиральных нуклеиновых кислотах II.Введение точечных модификаций в сахаро-фосфатный остов ДНК. // Биоорганическая химия. 1986. Т. 12. С. 921-928.

37. Calladine С. R. Mechanics of sequence-dependent stacking of bases in B-DNA. // J. Mol. Biol. 1982. V. 161. P. 343-352.

38. Dickerson R. E. Base sequence and helix structure variation in В and A DNA. // J. Mol. Biol. 1983. V. 166. P. 419-441.

39. Dolinnaya N. G., Blumenfeld M., Merenkova I. N., Oretskaya T. S., Krynetskaya N. F., Ivanovskaya M. G., VasseurM., Shabarova Z. A. Oligonucleotide circularization by template-directed chemical ligation. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 54035407.

40. Antsypovich S. I., Oretskaya T. S., Romanova E. A., Volkov E. M., Tashlitsky V. N., Vasser M., Shabarova Z. A. Synthesis and properties of cross-linked DNA duplexes. // FEBS Lett. 1996. V. 378. P. 224-226.

41. Shabarova Z. A., Fedorova 0. A., Dolinnaya N. G., Gottikh M. B. Derivatization and template-guided ligation of oligodeoxyribonucleotides using cyanogen bromide and N-substituted morpholines. // Orig. Life Evol. Biosph. 1997. V. 27. P. 555-566.

42. Wang S., Kool E. T. Circular RNA oligonucleotides. Synthesis, nucleic acid binding properties, and a comparison with circular DNAs. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2326-2333.

43. Rubin E., Rumney S. t., Wang S., Kool E. T. Convergent DNA synthesis: a non-enzymatic dimerization approach to circular oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3547-3553.

44. Selvasekaran J., Turnbull K. D. Chemical ligation of oligodeoxyribonucleotides on circular DNA templates. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 624-627.

45. Selvasekaran J., Turnbull K. D. Control of reaction chemoselectivity with a circular DNA template in the ligation of short oligodeoxyribonucleotides. // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. P. 2493-2500.

46. Sawai H., Wada M. Nonenzymatic template-directed condensation of short-chained oligouridylates on a poly(A) template. // Orig. Life Evol. Biosph. 2000. V. 30. P. 503-511.

47. Kawamura K., Okamoto F. Cyclization and dimerization of hexanucleotides containing guanine and cytosine with water-soluble carbodiimide. // Viva Origino. 2001. V. 29. P. 162-167.

48. Joyce G. F., Orgel L E. Non-enzymatic template-directed synthesis on RNA random copolymers. Poly(C,A) templates. II J. Mol. Biol. 1988. V. 202. P. 677-681.

49. Orgel L. E. Unnatural selection in chemical systems. // Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 109-118.

50. Weimann B. J., Lohrmann R., Orgel L E., Schneider-Bernloehr H., Sulston J. E. Template-directed synthesis with adenosine-5-phosphorimidazolide. // Science. 1968. V. 161. P. 387.

51. Sulston J., Lohrmann R., Orgel L E., Schneider-Bernloehr H., Weimann B. J., Miles H. T. Non-enzymic oligonucleotide synthesis on a polycytidylate template. // J. Mol. Biol. 1969. V. 40. P. 227-234.

52. Sawai H. Catalysis of internucleotide bond formation by divalent metal ions. // J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. P. 7037-7039.

53. Ninio J., Orgel L E. Heteropolynucleotides as templates for non-enzymatic polymerizations. II J. Mol. Evol. 1978. V. 12. P. 91-99.

54. Lohrmann R., Orgel L E. Studies of oligoadenylate formation on a poly (U) template. // J. Mol. Evol. 1979. V. 12. P. 237-257.

55. Lohrmann R., Orgel L E. Self-condensation of activated dinucleotides on polynucleotide templates with alternating sequences. // J. Mol. Evol. 1979. V. 14. P. 243-250.

56. Sleeper H. L, Lohrmann R., Orgel L. E. Template-directed synthesis of oligoadenylates catalyzed by Pb2+ ions. II J. Mol. Evol. 1979. V. 13. P. 203-214.

57. Sawai H. Template-directed synthesis of oligoadenylate. Template effect of oligouridylates and catalytic activity of Pb2+ ion. // Nucleic Acids Symp Ser. 1980. V. P. 77-79.

58. Lohrmann R., Orgel L E. Efficient catalysis of polycytidylic acid-directed oligoguanylate formation by Pb2+. // J. Mol. Biol. 1980. V. 142. P. 555-567.

59. Lohrmann R., Bridson P. K., Orgel L. E. Condensation of activated diguanylates on a poly(C) template. II J. Mol. Evol. 1981. V. 17. P. 303-306.

60. Shabarova Z. A., Ivanovskaya M. G., Isaguliants M. G. DNA-like duplexes with repetitions: efficient template-guided polycondensation of decadeoxyribonucleotide imidazolide. // FEBS Lett. 1983. V. 154. P. 288-292.

61. Sleeper H. L, Lohrmann R., Orgel L. E. Formation of the imidazoles of dinucleotides under potentially prebiotic conditions. // J. Mol. Evol. 1978. V. 11. P. 8793.

62. Joyce G. F., Inoue Т., Orgel L. E. Non-enzymatic template-directed synthesis on RNA random copolymers. Poly(C, U) templates. // J. Mol. Biol. 1984. V. 176. P. 279306.

63. Joyce G. F., Orgel L E. Non-enzymic template-directed synthesis on RNA random copolymers. Poly(C, G) templates. //J. Mol. Biol. 1986. V. 188. P. 433-441.

64. Inoue Т., Joyce G. F., Grzeskowiak K., Orgel L. E., Brown J. M., Reese С. B. Template-directed synthesis on the pentanucleotide CpCpGpCpC. // J. Mol. Biol. 1984. V. 178. P. 669-676.

65. Haertle Т., Orgel L E. The template properties of some oligodeoxynucleotides containing cytidine and guanosine. //J. Mol. Evol. 1986. V. 23. P. 108-112.

66. Acevedo O. L, Orgel L E. Non-enzymatic transcription of an oligodeoxynucleotide 14 residues long. //J. Mol. Biol. 1987. V. 197. P. 187-193.

67. Sawai H., Kuroda K., Hojo T. Efficient oligoadenylate synthesis catalyzed by uranyl ion complex in aqueous solution. // Nucleic Acids Symp. Ser. 1988. V. P. 5-7.

68. Wu Т., Orgel L. E. Nonenzymatic template-directed synthesis on hairpin oligonucleotides. 2. Templates containing cytidine and guanosine residues. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 5496-5501.

69. Wu Т., Orgel L. E. Nonenzymatic template-directed synthesis on hairpin oligonucleotides. 3. Incorporation of adenosine and uridine residues. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7963-7969.

70. Wu Т., Orgel L E. Nonenzymatic template-directed synthesis on oligodeoxycytidylate sequences in hairpin oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 317-322.

71. Hill A. R., Jr., Orgel L. E., Wu T. The limits of template-directed synthesis with nucleoside-5'-phosphoro(2-methyl)imidazolides. // Orig. Life Evol. Biosph. 1993. V. 23. P. 285-290.

72. Sawai H., Totsuka S., Yamamoto К., Оzaki H. Non-enzymatic, template-directed ligation of 2-5' oligoribonucleotides. Joining of a template and a ligator strand. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2995-3000.

73. Sawai H., Wada M., Kouda Т., Nakamura Ozaki A. Nonenzymatic Ligation of Short-Chained 2'-5'- or 3'-5'-Linked Oligoribonucleotides on 2'-5'- or 3'-5'-Linked Complementary Templates. // Chembiochem. 2006. V. 7. P. 605-611.

74. Gibbs D., Lohrmann R., Orgel L E. Template-directed synthesis and selective adsorption of oligoadenylates on hydroxyapatite. II J. Mol. Evol. 1980. V. 15. P. 347354.

75. Acevedo O. L, Orgel L E. Template-directed oligonucleotide ligation on hydroxylapatite. // Nature. 1986. V. 321. P. 790-792.

76. Orgel L. E. Did template-directed nucleation precede molecular replication?. II Orig. Life Evol. Biosph. 1986. V. 17. P. 27-34.

77. Ferris J. P., Ertem G. Oligomerization of ribonucleotides on montmorillonite: reaction of the 5'-phosphorimidazolide of adenosine. II Science. 1992. V. 257. P. 1387-1389.

78. Ferris J. P., Ertem G. Montmorillonite catalysis of RNA oligomer formation in aqueous solution. A model for the prebiotic formation of RNA. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 12270-12275.

79. Ding P. Z., Kawamura K., Ferris J. P. Oligomerization of uridine phosphorimidazolides on montmorillonite: a model for the prebiotic synthesis of RNA on minerals. //Orig. Life Evol. Biosph. 1996. V. 26. P. 151-171.

80. Ertem G., Ferris J. P. Template-directed synthesis using the heterogeneous templates produced by montmorillonite catalysis. A possible bridge between the prebiotic and RNA worlds. //J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 7197-7201.

81. Ferris J. P., Hill A. R., Jr., Liu R., Orgel L. E. Synthesis of long prebiotic oligomers on mineral surfaces. II Nature. 1996. V. 381. P. 59-61.

82. Kawamura K., Ferris J. P. Clay catalysis of oligonucleotide formation: kinetics of the reaction of the 5-phosphorimidazolides of nucleotides with the non-basic heterocycles uracil and hypoxanthine. II Orig. Life Evol. Biosph. 1999. V. 29. P. 563591.

83. Ertem G., Ferris J. P. Sequence- and regio-selectivity in the montmorillonite-catalyzed synthesis of RNA. II Orig. Life Evol. Biosph. 2000. V. 30. P. 411-422.

84. Miyakawa S., Ferris J. P. Sequence- and regioselectivity in the montmorillonite-catalyzed synthesis of RNA. II J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 8202-8208.

85. Kanavan'oti A., Chang S., Alberas D. J. Limiting concentrations of activated mononucleotides necessary for poly(C)-directed elongation of oligoguanylates. II J. Mol. Evol. 1990. V. 31. P. 462-469.

86. Kanavarioti A., Rosenbach M. T. Catalysis of hydrolysis and nucleophilic substitution at the P-N bond of phosphoimidazolide-activated nucleotides in phosphate buffers. //J Org Chem. 1991. V. 56. P. 1513-1521.

87. Kanavarioti A. Dimerization in highly concentrated solutions of phosphoimidazolide activated mononucleotides. // Orig. Life Evol. Biosph. 1997. V. 27. P. 357-376.

88. Kanavarioti A. Preference for internucleotide linkages as a function of the number of constituents in a mixture. II J. Mol. Evol. 1998. V. 46. P. 622-632.

89. Kanavarioti A., Lee L F., Gangopadhyay S. Relative reactivity of ribosyl 2-OH vs. З'-OH in concentrated aqueous solutions of phosphoimidazolide activated nucleotides. //Orig. Life Evol. Biosph. 1999. V. 29. P. 473-487.

90. Kanavarioti A., Monnard P. A., Deamer D. W. Eutectic phases in ice facilitate nonenzymatic nucleic acid synthesis. //Astrobiology. 2001. V. 1. P. 271-281.

91. Monnard P. A., Kanavarioti A., Deamer D. W. Eutectic phase polymerization of activated ribonucleotide mixtures yields quasi-equimolar incorporation of purine and pyrimidine nucleobases. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 13734-13740.

92. Trinks H., Schroder W., Biebricher С. K. Ice and the origin of life. // Orig. Life Evol. Biosph. 2005. V. 35. P. 429-445.

93. Ger/t J. A., Westheimer F. H., Sturtevant J. M. The enthalpies of hydrolysis of acyclic, monocyclic, and glycoside cyclic phosphate diesters. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 5059-5067.

94. Tapiero С. M., NagyvaryJ. Prebiotic formation of cytidine nucleotides. // Nature. 1971. V. 231. P. 42-43.

95. Osterberg R., Orgel L E., Lohrmann R. Further studies of urea-catalyzed phosphorylation reactions. // J. Mol. Evol. 1973. V. 2. P. 231-234.

96. Bernfield M. R. Ribonuclease and oligoribonucleotide synthesis. I. Synthetic activity of bovine pancreatic ribonuclease derivatives. // J Biol Chem. 1965. V. 240. P. 4753-4762.

97. Bernfield M. R. Ribonuclease and oigoribonucleotide synthesis. II. Synthesis of oligonucleotides of specific sequence. IIJ Biol Chem. 1966. V. 241. P. 2014-2023.

98. Bernfield M. R., Rottman F. M. Ribonuclease and oligoribonucleotide synthesis. 3. Oligonucleotide synthesis with 5'-cyclic phosphates. // J Biol Chem. 1967. V. 242. P. 4134-4143.

99. Renz M., Lohrmann R., Orgel L E. Catalysts for the polymerization of adenosine cyclic 2',3'-phosphate on a poly (U) template. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 240. P. 463-471.

100. VerlanderM. S., Orgel L. E. Analysis of high molecular weight material from the polymerization of adenosine cyclic 2', 3-phosphate. // J. Mol. Evol. 1974. V. 3. P. 115120.

101. Cote F., Perreault J. P. Peach latent mosaic viroid is locked by a 2',5'-phosphodiester bond produced by in vitro self-ligation. // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 533-543.

102. Cote F., Levesque D., Perreault J. P. Natural 2',5-phosphodiester bonds found at the ligation sites of peach latent mosaic viroid. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 19-25.

103. Ricca B. L, Wolf A. C., Silverman S. K. Optimization and generality of a small deoxyribozyme that ligates RNA. // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 1015-1025.

104. Orgel L E., Lohrmann R. Prebiotic chemistry and nucleic acid replication. II Accounts of Chemical Research. 1974. V. 7. P. 368-377.

105. Bartel D. P., Szostak J. W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences.//Science. 1993. V. 261. P. 1411-1418.

106. Rohatgi R., Bartel D. P., Szostak J. W. Kinetic and mechanistic analysis of nonenzymatic, template-directed oligoribonucleotide ligation. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 3332-3339.

107. Rohatgi R, Bartel D. P., Szostak J. W. Nonenzymatic, template-directed ligation of oligoribonucleotides is highly regioselective for the formation of 3-5' phosphodiester bonds. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 3340-3344.

108. Jaeger L, Wright M. C., Joyce G. F. A complex ligase ribozyme evolved in vitro from a group I ribozyme domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1471214717.

109. McGinness К. E, Wright M. C., Joyce G. F. Continuous in vitro evolution of a ribozyme that catalyzes three successive nucleotidyl addition reactions. // Chem. Biol. 2002. V. 9. P. 585-596.

110. Ellington A. D., Szostak J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. // Nature. 1990. V. 346. P. 818-822.

111. Robertson M. P., Ellington A. D. Design and optimization of effector-activated ribozyme ligases. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 1751-1759.

112. Robertson M. P., Ellington A. D. In vitro selection of nucleoprotein enzymes. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 650-655.

113. Rogers J., Joyce G. F. The effect of cytidine on the structure and function of an RNA ligase ribozyme. // RNA. 2001. V. 7. P. 395-404.

114. Paul N., Joyce G. F. Inaugural Article: a self-replicating ligase ribozyme. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. P. 12733-12740.

115. Breaker R. R., Joyce G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. // Chem Biol. 1994. V. 1. P. 223-229.

116. McGinness К. E., Joyce G. F. RNA-catalyzed RNA ligation on an external RNA template. // Chem Biol. 2002. V. 9. P. 297-307.

117. Vlassov A. V., Johnston В. H., LandweberL. F., Kazakov S. A. Ligation activity of fragmented ribozymes in frozen solution: implications for the RNA world. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 2966-2974.

118. Vorobjeva M., Gusseva E., Repkova M., Kovalev N., Zenkova M., Venyaminova A., Vlassov V. Modified binary hammerhead ribozymes with high catalytic activity. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V. 24. P. 1105-1109.

119. Vorobjeva M. A., Zenkova M. A., Venyaminova A. G., Vlassov V. V. Binary hammerhead ribozymes with improved catalytic activity. // Oligonucleotides. 2006. V. 16. P. 241-254.

120. Pyle A. M. Metal ions in the structure and function of RNA. // J. Biol. Inorg. Chem. 2002. V. 7. P. 679-690.

121. Tock M. R., FraryE., Sayers J. R., GrasbyJ. A. Dynamic evidence for metal ion catalysis in the reaction mediated by a flap endonuclease. // EMBO J. 2003. V. 22. P. 995-1004.

122. Kikovska E., Mikkelsen N. E., Kirsebom L A. The naturally trans-acting ribozyme RNase P RNA has leadzyme properties. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 69206930.

123. Breslow R., Huang D. L. Effects of metal ions, including Mg2+ and lanthanides, on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 4080-4083.

124. Flynn-Charlebois A., Wang Y., Prior Т. K„ Rashid I., Hoadley K. A., Coppins R. L, Wolf A. C., Silverman S. K. Deoxyribozymes with 2-5' RNA ligase activity. I I J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 2444-2454.

125. Vajda Т. Cryo-bioorganic chemistry: molecular interactions at low temperature. // Cell. Mol. Life Sci. 1999. V. 56. P. 398-414.

126. Seyhan A. A., Burke J. M. Mg2+-independent hairpin ribozyme catalysis in hydrated RNA films. // RNA. 2000. V. 6. P. 189-198.

127. Franchi M., Ferris J. P., Gallori E. Cations as mediators of the adsorption of nucleic acids on clay surfaces in prebiotic environments. // Orig. Life Evol. Biosph. 2003. V. 33. P. 1-16.

128. Franchi M., Gallori E. A surface-mediated origin of the RNA world: biogenic activities of clay-adsorbed RNA molecules. // Gene. 2005. V. 346. P. 205-214.

129. Благой Ю. П., Галкин В. Л., Гладченко Г. О., Корнилова С. В., Сорокин В. А., Г. Ш. А. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. // Киев, Наукова думка. 1991. С. 272.

130. Зенгер В. //Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. // Ред. Вайнштейн Б. К. М.: Мир. 1987. С. 570

131. Kazakov S. A., Balatskaya S. V., Johnston В. Н. Ligation of the hairpin ribozyme in cis induced by freezing and dehydration. // RNA. 2006. V. 12. P. 446-456.

132. Hoadley К A., Purtha W. E, Wolf A. C., Flynn-Charlebois A., Silverman S. К Zn2+-dependent deoxyribozymes that form natural and unnatural RNA linkages. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 9217-9231.

133. Husken D., Goodall G., Blommers M. J., Jahnke W., Hall J., HanerR., MoserH. E. Creating RNA bulges: cleavage of RNA in RNA/DNA duplexes by metal ion catalysis. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 16591-16600.

134. Otzen D. E, Barciszewski J., Clark B. F. Dual hydrolytic role for Pb(ll) ions. // Biochimie. 1994. V. 76. P. 15-21.

135. Kazakov S. A., Hecht S. M. Encyclopedia of Inorganic Chemistry. // Ред. King R. B. NY, Wiley, 1994. C. 2697-2720

136. Walter A. E., Turner D. H. Sequence dependence of stability for coaxial stacking of RNA helixes with Watson-Crick base paired interfaces. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 12715-12719.

137. Walter A. E., Turner D. H„ Kim J., Lyttle M. H., MullerP., Mathews D. H„ Zuker M. Coaxial stacking of helixes enhances binding of oligoribonucleotides and improves predictions of RNA folding. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 9218-9222.

138. Kim J., Walter A. E., Turner D. H. Thermodynamics of coaxially stacked helixes with GA and CC mismatches. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13753-13761.

139. Joyce G. F. RNA evolution and the origins of life. // Nature. 1989. V. 338. P. 217224.

140. Joyce G. F. The rise and fall of the RNA world. // New. Biol. 1991. V. 3. P. 399407.

141. Joyce G. F., Orgel L. E. The RNA World. II Ред. Gesteland R. F. and Atkins J. F. Cold Spring Harbor Press, NY, Cold Spring Harbor, 1993. C.1-25

142. Joyce G. F. The antiquity of RNA-based evolution. // Nature. 2002. V. 418. P. 214-221.

143. Orgel L. E. Some consequences of the RNA world hypothesis. // Orig. Life Evol. Biosph. 2003. V. 33. P. 211-218.

144. Lohrmann R., Orgel L. E. Prebiotic activation processes. // Nature. 1973. V. 244. P. 418-420.

145. Lohrmann R., Bridson P. K., Orgel L. E. Efficient metal-ion catalyzed template-directed oligonucleotide synthesis. // Science. 1980. V. 208. P. 1464-1465.

146. Player M. R., Torrence P. F. The 2-5A system: modulation of viral and cellular processes through acceleration of RNA degradation. // Pharmacol. Ther. 1998. V. 78. P. 55-113.

147. Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A. L, Rajbhandary U. L Studies on the sequence of the З'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 72. P. 465-478.