Нетрадиционные пути получения ядер β-лактамных антибиотиков ферментативной трансформацией пенициллинов и цефалоспоринов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Список принятых сокращений и обозначений.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Ядра Р-лактамных антибиотиков.

1.1.1. Р-лактамные антибиотики - представители класса антиинфекционных препаратов.

1.1.2. Ядра р-лактамных антибиотиков.

1.1.3. Физикохимические свойства ядер Р-лактамных антибиотиков.

1.1.4. Основные методы получения ядер антибиотиков.

1.2. Пенициллинацилаза - основной фермент химии антибиотиков.

1.2.1. Первый биокаталитический промышленный процесс.

1.2.2. Пенициллинацилаза - представитель семейства Ntn-гидролаз.

1.2.3. Субстратная специфичность пенициллинацилаз.

1.3. Получение ядер антибиотиков трансформацией пенициллинов и цефалоспоринов

1.3.1. Термодинамика гидролиза пенициллинов и цефалоспоринов.

1.3.2. Кинетические закономерности ферментативного гидролиза Р-лактамных антибиотиков.

1.3.3. Биокаталитическая трансформация пенициллинов и цефалоспоринов в промышленности.

1.4. Современные подходы к повышению производительности стадии биотрансформации антибиотиков.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы.

2.2.2. Определение активности пенициллинацилазы по гидролизу NIPАВ.

2.2.3. Определение каталитических параметров гидролиза NTPAB в воде.

2.2.4. Определение каталитических параметров гидролиза NIP АВ в D2O.

2.2.5. Анализ компонентов реакции гидролиза антибиотиков в двухфазных системах 'вода-бутилацетат'.

2.2.6. Ферментативный гидролиз в двухфазных системах.

2.2.7. Проведение реакций гидролиза антибиотиков в двухфазных системах в условиях, близких к равновесию.

2.2.8. Очистка L,D-PGCN-HC1.

2.2.9. Синтез изопропилового эфира фенилглицина.

2.2.10. Синтез амида триптофана.

2.2.11. Синтез изопропиламида фенилглицина.

2.2.12. Анализ компонентов реакционной смеси при получении ядер антибиотиков ацильным переносом.

2.2.13. Получение 6-АРА ферментативным переносом с PenG или PenV на амиды аминокислот.

2.2.14. Получение 7-ADCA ферментативным переносом с CephG на амиды аминокислот.

2.2.15. Получение 6-АРА ферментативным переносом с PenG на эфиры аминокислот

2.2.16. Получение 6-АРА ферментативным переносом на с PenG на нитрилы аминокислот.

2.2.17. Определение рК аминогрупп производных аминокислот.

2.2.18. Определение растворимости ацилированных производных аминокислот.

2.2.19. Определение термодинамических констант синтеза фенилацетильных производных аминокислот.

2.2.20. Синтез PenG'-L-PGCNH+.

2.2.21. Синтез CephG'-L-PGCNH+.

2.2.22. Получение 6-АРА, исходя из PenG'-L-PGCNTT.

2.2.23. Получение 7-ADCA, исходя из CephG"-L-PGCNH+.

2.2.24. Анализ компонентов реакционной смеси при конденсации фенилуксусной кислоты с фенилглицинонитрилом.

2.2.25. Анализ оптической чистоты фенилглицинонитрила при его конденсации с фенилуксусной кислотой.

2.2.26. Ферментативная конденсация фенилуксусной кислоты с фенилглицинонитрилом.

2.2.27. Синтез ионных комплексов антибиотиков и производных аминокислот.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Ферментативный гидролиз р-лактамных антибиотиков в кислой среде в двухфазных системах «водный раствор - несмешивающийся с водой органический растворитель».

Введение.

3.1.1. Теоретический анализ модели гидролиза антибиотиков в кислой среде в двухфазных системах.

3.1.1.1. Термодинамика гидролиза в двухфазных системах.

3.1.1.2. Факторы, влияющие на выход гидролиза.

3.1.2. Экспериментальное исследование гидролиза антибиотиков в кислой среде в двухфазных системах.

3.1.2.1. Особенности гидролиза антибиотиков в кислой среде в двухфазных системах

3.1.2.2. Экспериментальная зависимость выхода ядра антибиотика от рН.

3.1.2.3. Зависимость выхода от начальной концентрации антибиотика.

3.1.2.4. Динамическое пересыщение раствора ядра антибиотика в ходе реакции.

3.1.2.5. Состояние равновесия при гидролизе антибиотиков в двухфазной системе.

3.1.2.6. Соответствие между термодинамически равновесным и кинетически достижимым выходом в исследуемых системах.

3.2. Катализ пенициллинацилазой в кислых средах.

Введение.

3.2.1. рН-зависимость каталитических параметров гидролиза NIPAB.

3.3. Получение ядер антибиотиков ацильным переносом на внешний нуклеофил

Введение.

3.3.1. Идея метода.

3.3.2 Критерии эффективности получения ядер антибиотиков ацильным переносом

3.3.3. Реализация ацильного переноса: термодинамически и кинетически К контролируемые режимы.

3.3.4.1. Процессы, сопряженные с ацильным переносом.

3.3.4.2. Математическая модель термодинамики ацильного переноса.

3.3.4.3. Качественный анализ термодинамики образования амидной связи в рамках синтетических потенциалов.

3.3.4.4. Величины синтетических потенциалов.

3.3.4.5. Количественный анализ термодинамики получения ядер антибиотиков ацильным переносом.

3.5. Синтетические потенциалы N-фенилацетильных производных амидов, эфиров и нитрилов аминокислот.

3.3.6. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер антибиотиков ацильным переносом: эфиры аминокислот.

3.3.6.1. Бензиловыйэфир аланина.

3.3.6.2. Метиловый эфир гистидина.

3.3.6.3. Метиловый эфир фенилглицина.

3.3.6.4. Метиловый эфир триптофана.

3.3.6.5. Этиловый эфир фенилаланина.

3.3.6.6. Изопропиловый эфир L-фенилглицина.

3.3.7. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер антибиотиков ацильным переносом: амиды аминокислот.

3.3.7.1. Амид фенилглицина.

3.3.7.2. Амид триптофана.

3.3.7.3. N-изопропиламид фенилглицина.

3.3.8. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер антибиотиков ацильным переносом: нитрилы аминокислот.

3.3.8.1. Нитрил фенилглицина.

3.3.8.2. Нитрил фенилаланина.

3.4. Комплексообразование между Р-лактамными антибиотиками и производными аминокислот.

Введение.

3.4.1. Определение термодинамических параметров комплексообразования из экспериментальных данных.

3.4.2. Влияние комплексообразования между антибиотиком и нуклеофилом на термодинамику ацильного переноса.

3.4.3. Энантиоселективность комплексообразования.

3.4.4 Использование комплексообразования.

3.5. Разделение рацемата фенилглицинонитрила ферментативным ацилированием в водной среде.

Введение.

3.5.1. Эффективность ферментативного прямого ацилирования.

3.5.2. Перспективы использования разделения аминонитрилов прямым ацилированием.

Выводы.

Актуальность темы исследования. По всеобщим прогнозам антибиотики будут активно востребованы медициной по крайней мере еще несколько десятков лет, что ставит новые требования к эффективности и качеству их производства. Использование ферментов, пенициллинацилаз, для получения ядер Р-лактамных антибиотиков гидролизом пенициллинов и цефалоспоринов стало в свое время первым промышленным биокаталитическим процессом, открывшим новые перспективы развития фармацевтической промышленности. Благодаря этому, антибиотики стали самыми распространенными и доступными медикаментами; потребность в них возрастает и по сей день. В этой связи разработка новых подходов, позволяющих заменить химические стадии производства биотехнологическими, интегрировать процесс, сократить расход реагентов и т.д. являются весьма актуальными.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось исследование принципиально новых подходов, новых ферментативных процессов получения ядер Р-лактамных антибиотиков - 6-аминопенициллановой (6-АРА) и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой (7-ADCA) кислот, исходя из таких субстратов как бензилпенициллин (PenG), феноксиметилпенициллин (PenV), бензилдезацетоксицефалоспорин (CephG). В задачи входило изучение термодинамики соответствующих процессов а также кинетических закономерностей их протекания, оценка эффективности предложенных подходов в сравнении с традиционным процессом -ферментативным гидролизом.

Научная новизна. Впервые документирована и детально исследована активность пенициллинацилазы из E.coli в кислых средах (рН 3-4). Предложены и исследованы новые методы получения ядер Р-лактамных антибиотиков - 6-аминопенициллановой (6-АРА) и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой (7-ADCA) кислот. Один из них заключается в ферментативном гидролизе соответствующих антибиотиков в кислых средах в двухфазных системах «водный раствор - несмешивающийся с водой органический растворитель». Другой оригинальный подход состоит в получении ядер не гидролизом, как в традиционной схеме, а ферментативным ацильном переносом на внешний нуклеофил: эфиры, амиды и нитрилы аминокислот. Проведено детальное изучение термодинамических и кинетических закономерностей протекания предложенных процессов получения ядер антибиотиков. Попутно обнаружено и исследовано явление образования ионных комплексов между антибиотиками и производными аминокислот.

Показана способность ПА из E.coli эффективно использовать фенилуксусную кислоту в качестве ацилирующего агента в кислых средах.

Практическая значимость работы. Благодаря установленной активности фермента (ПА из E.coli) в кислых средах расширен спектр его применений в биокатализе. В частности, показана его эффективность в получении ядер антибиотиков гидролизом в кислых средах в двухфазных системах, что позволяет интегрировать стадии биосинтеза антибиотика и его трансформации с получением соответствующего ядра. Показана возможность получения ядер антибиотиков ферментативным ацильным переносом с выходом, превышающим 99%. Производительность предложенного процесса в несколько раз превышает производительность традиционного ферментативного гидролиза. Показана эффективность получения ядер антибиотиков ацильным переносом в кислых средах на нуклеофилы с низким рК (нитрилы аминокислот). Высокая энантиоселективность ацильного переноса, демонстрируемая ПА из E.coli, позволила также сопрячь процессы получения ядра антибиотика с разделением рацемата нуклеофила. Было показано, что фенилуксусная кислота способна выступать в кислых средах ацилирующим агентом, не уступающим по эффективности активированным производным.

Основные результаты и выводы

1. Исследован ферментативный гидролиз Р-лактамных антибиотиков в кислой среде (рН 3-4) в двухфазных системах «водный раствор - несмешивающийся с водой органический растворитель». Термодинамически равновесный выход 6-АРА и 7-ADCA в рассмотренных условиях составляет 90% и 99% соответственно.

2. Отмечено образование стабильных пересыщенных растворов ядер антибиотиков в ходе гидролиза в двухфазной системе в кислой среде. Показано, что вследствие пересыщения кинетически достижимый выход 6-АРА и 7-ADCA снижается соответственно до 70% и 90%.

3. Впервые документирована и детально исследована активность пенициллинацилазы из Exoli в кислых средах. Показано, что протонирование группы с рК~5 лишь частично снижает активность фермента, в то время как ключевая в катализе группа имеет рК~3 и может быть соотнесена с аминогруппой SerlB, обладающей аномально низкой основностью.

4. Исследован метод получения ядер Р-лактамных антибиотиков ферментативным ацильным переносом на внешний нуклеофил: эфиры, амиды и нитрилы аминокислот. Продемонстрировано повышение выхода ядра до 99% и выше с использованием метилового эфира и амида триптофана, этилового эфира фенилаланина, изопропилового эфира фенилглицина, фенилаланинонитрила.

5. Показано, что при подходящем выборе нуклеофила (фенилаланинонитрил) вклад конкурирующей реакции гидролиза не превышает 1%.

6. Продемонстрировано увеличение производительности процесса в несколько раз в сравнении с традиционным гидролизом, как за счет ускорения реакции, так и за счет повышения концентраций реагентов.

7. Показана эффективность ацильного переноса в кислых средах на нитрилы аминокислот, сопровождаемого осаждением ядра антибиотика.

8. Исследована термодинамика и энантиоселективность образования ионных комплексов р-лактамных антибиотиков с эфирами, амидами, нитрилами аминокислот. Показан пример разделения рацемата фенилглицинонитрила с помощью энантиоселективной кристаллизации.

9. Обнаружена способность ПА из E.coli использовать фенилуксусную кислоту в качестве эффективного ацилирующего агента в кислой среде. Проведено разделение рацемата фенилглицинонитрила с помощью энантиоселективного ацилирования ФУК в водной среде.

1. A. Bruggink Short course of industrial chemistry, Moscow State University, 2003.

2. H.C. Егоров Основы учения об антибиотиках, изд-во МГУ, 1994.

3. Б.П Брунс, Е.М. Савицкая, Н.Н. Шелленберг, Г.С. Либинсон, Т.С. Колыгина, Е.Н. Дружинина, Физикохимические свойства 6-аминопенициллановой кислоты кривые титрования и растворимость, Антибиотики, 1962, 7, 440-442.

4. П.С. Ныс, Е.В. Кольцова, Н.Н. Шелленберг, Е.М. Савицкая, М.М. Левитов, Физикохимические свойства 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, Антибиотики, 1976, 5,391-394.

5. М.С. Булычева, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая, Физикохимические свойства 7-аминоацетоксицефалоспорановой кислоты, Антибиотики, 1977, 12, 1073-1076.

6. Г.С. Либинсон, Устойчивость 6-аминопенициллановой кислоты в водных растворах низкой и средней концентрации, Хим. Фарм. Ж., 1971, 9, 37-41.

7. Т. Yamana, A. Tsuji, Y. Muzakami, Kinetic approach to the development in p-Iactam antibiotics. I. Comparative stability of semisynthetic penicillins and 6-aminopenicillanic acid in aqueous solution, Chem. Pharm. Bull., 1974, 22, 1186-1197.

8. T. Yamana, A. Tsuji, Comparative stability of cephalosporins in aqueous solution. Kinetics and mechanism of degradation, J. Pharm. Sci., 1976, 65, 1566-1574.

9. Г.С. Либинсон, Проблемы стандартизации антибиотиков. Устойчивость пенициллинов и цефалоспоринов в растворах, Антибиотики, 1983, 2, 56-75.

10. F.R. Batchelor, F.P. Doyle, J.H.C. Nayer, G.N. Rolinson, Synthesis of penicillin: 6-APAin penicillin fermentation, Nature, 1959, 183, 257-258.

11. K. Kato, Further notes on penicillin nucleus, J. Antibiotics, 1953, 6, 184.

12. H.W.O. Weissenburger, M.G. Van der Hoeven, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 1970, 89, 1081-1084.

13. J.G. Shewale, H. Sivaraman, Penicillin acylase: enzyme production and its application in the manufacture of 6-APA, Proc. Biochem. 1989, 24, 146-154.

14. J.G. Shewale, B.S. Desphande, V.K. Sudhakaran, S.S. Ambedkar, Penicillin acylases: applications and potentials, Proc. Biochem. 1990, 25, 97-103.

15. G.N. Rolinson, F.R. Batchelor, D. Butterworth, J. Cameron-Wood, M. Cole, G.C. Eustace, M.V. Hart, M. Richards, E.B. Chain, Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin by enzymatic hydrolysis. Nature, 1960, 187, 236-237.

16. H.T. Huang, A.R. English, T.A. Seto, G.M. Shull, B.A. Sobin, Enzymatic hydrolysis of the side chain of penicillins, J. Am. Chem. Soc, 1960, 82, 3790-3791.

17. C.A. Claridge, A. Gourevitch, J. Lein, Bactarial penicillin amidase, Nature, 1960, 187, 237-238.

18. R.B. Morin, B.G. Jackson, R.A. Mueller, E.R. Lavagnino, W.B. Scanlon, S.L. Andrews, Chemistry of cephalosporin antibiotics. III. Chemical correlation of cephalosporin and penicillin antibiotics, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 1896-1897.

19. J. Velasco, J.L. Adrio, A.M. Moreno, B. Diez, G. Soler, J.L. Barredo, Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenum, Nature Biotechnol, 2000, 57, 328-332.

20. F. Alfani, M. Cantarella, N. Cutarella, A. Gallifuoco, P. Golini, D. Bianchi, Enzymatic conversion of cephalosporin С into glutaryl 7-aminocephalosporanic acid. A study in different reactor configurations, Biotechnol. Lett. 1997, 19, 175-178.

21. Sakaguchi K. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23,411-414.

22. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29, 404-407.

23. D.A. Self, G. Kay, M.D. Lilly The conversion of benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid using an insoluble derivative of penicillin amidase, Biotechnol. Bioeng. 1969, 11, 337-348.

24. Patent 1183260 (England) Insolubilized enzymes and their preparation and use / M.D. Lilly, G. Kay, R.J. Wilson, A.K. Sharp, 1970.

25. D. Warburton, P. Dunnil, M.D. Lilly Conversion of benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid in a batch reactor and continuous feed stirred tank reactor using immobilized penicillin amidase, Biotechnol. Bioeng. 1973, 15, 13-25.

26. A. Parmar, H. Kumar, S.S. Marawaha, J.F. Kennedy Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenicillanic acid, Biotechnology Advances, 2000, 18, 289-301.

27. A.L. Margolin, Novel crystalline catalysts, Trends in Biotechnology, 1996, 14, 223-230.

28. Y. Yao, J.J. Lalonde Unexpected enantioselectivity and activity of penicillin acylase in the resolution of methyl 2,2-dimethyl-l,3-dioxane-4-carboxylate, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2003, 22, 55-59.

29. L. Cao, L. F. van Rantwijk, R. A. Sheldon Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase, Org. Lett. 2000, 2, 1361-1364.

30. L. Cao, L. M. van Langen, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon Cross-linked aggregates of penicillin acylase: robust catalysts for the synthesis of p-lactam antibiotics, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11,665-670.

31. J.A. Brannigan, G. Dodson, H.J. Duggleby, P.C. Moody,J.L. Smith, D.R. Tomchick, A.G. Murzin A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation, Nature, 1995, 378,416-419.

32. H.J. Duggleby, S.P. Tolley, C.P. Hill, E.J. Dodson, G. Dodson, P.C. Moody, Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995,373,264-268.

33. C. Oinonen, J. Rouvinen, Structural comparison of Ntn-hydrolases, Protein. Sci. 2000. 9, 2329-2337.

34. C.G. Suresh, A.V. Pundle, K.N. Rao, H. SivaRaman, J.A. Brannigan, C.E. McVey, C.S. Vcnna, Z. Dauter, E.J. Dodson, C.G. Dodson Penicillin V acylasc crystal structure reveals new Ntn-hydrolasc family members, Nature Struct. Biol. 1999 6,414-416.

35. J. Pci, N.V. Grishin Peptidase family U34 belongs to the superfamily of N-terminal nucleophile hydrolases, Protein Sci. 2003, 12, 1131-1135.

36. G. Schumacher., D. Sizmann, H. Haug, P. Buckel. A. Bock Penicillin acylase from E.coli: unique gene-protein relation, Nucleic Acid. Res. 1986, 14, 5713-5727.

37. M. Cole Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli, Nature. 1964. 203, 519-520.

38. M. Cole Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylasc of Escherichia coli, Biochem. J. 1969, 115, 741-745.

39. H.C. Бондарева, M.M. Левитов, M.C. Рабинович Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы из Exoli, Биохимия, 1969, 34, 478-783.

40. М. Van der Mey. Е. De Vroom Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 345-348.

41. M. Robak, A. Szewczuk Penicillin amidase from Proteus rettgeri, Acta Biochimica. Polonica. 1981, 28 275-284.

42. D. Chiang, RE. Bennet Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 1967, 93, 302-308.

43. Г.Г. Чилов, Д.Т. Гуранда, B.K. Швядас Роль гидрофобности в связывании спиртов активным центром пенициллинацилаз, Биохимия, 2000, 65, 1135-1139.

44. A. Plaskie, Е. Roets, Н. Vanderhaeghe Substrate specificity of penicillin acylase of E.coli. J. Antibiotics. 1978, 31,783-788.

45. И.А. Ямсков, M.B. Буданов, В.А. Даванков, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая Энантиоселективный гидролиз N-фенилацетал-0,Ь-С-фснилглицина пенициллинамидогидролазой из E.coli и ее иммобилизированными препаратами. Биоорг. химия. 1979, 5, 604-610.

46. Д. Т. Гуранда Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis, диссертация на соискание кандидата хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

47. V.K. Svedas, M.V. Savchenko, A.I. Bcltser, D.F. Guranda Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme, Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1996,799, 659-669.

48. W.B. Alkema, A.K. Prins, E. de Vries, D.B. Janssen Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem J. 2002, 365, 303-9.

49. A.S. Soloshonok, A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, E.V. Kozlova Biokatalytic resolution of p-fluoroalkyl-p-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry. 1994, 5, 1119-1126.

50. Svedas V., Guranda D„ Van Langen L., Van Rantwijk F. and Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 1997, 417, 414-418.

51. D.T. Guranda, L. M. van Langen, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon, V. K. Svedas Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium, Tetrahedron: Asymmetry, 2001, 12, 1645-1650.

52. J. G. Shewale, V. K. Sudhakaran Penicillin V acylase: Its potential in the production of 6-aminopcnicillanic acid. Enzyme Microb. Technol. 1997, 20, 402-410.

53. Y.B. Tewari, R.N. Goldberg Thermodynamics of the conversion of penicillin G to phenylacetic acid and 6-aminopenicillanic acid, Biophys. Chem. 1988,29,245-252,.

54. П.С. Ныс, Д.Э. Сатарова, JI.B. Подшибякина, В.Б. Корчагин, Е.М. Савицкая Псницилиинамидаза из E.coli. Кинетические и равновесные параметры ферментативного гидролиза 8-фенилацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты. Антибиотики, 1980, 11,808-815.

55. R.D. Godoy, L.F. Sanabria, A. Gomez Aguiree, L. Giraldo, A. Gomez Ordonez, G. Buitrago Reaction heat measurements in the enzymatic hydrolysis reaction of penicillin GK to obtain 6-APA, Enzyme Microb. Technol. 1996, 19, 585-589.

56. CO Roclie Diagnostics Corporation, http://www.roche-applied-science.com/indbio/ind/framesetbiocatalysts.htm

57. Y.B. Tewari, R.N. Goldberg Thermodynamics of the conversion of penicillin G to phenylacctic acid and 6-aminopenicillanic acid, Biophys. Chem. 1988,29,245-252,.

58. П.С. Ныс,, Диссертация на соискание звания доктора химических наук, Москва, 1983.

59. И.В. Березин, А.А. Клесов, A.J1. Марголин, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая, В.К. Швядас Изучение пенициллинамидазы из E.coli. рН-зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина, Антибиотики, 1976, 21, 411-415.

60. В.К. Швядас, А.А. Клесов, A.JI. Марголин, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая, И.В. Березин Изучение пенициллинамидазы из E.coli. Кинетика ферментативного гидролиза 7-фенилацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты, Антибиотики, 1976, 21, 698-704.

61. П.С. Ныс, Д.Э. Сатарова, JI.B. Подшибякина, В.Б. Корчагин, Е.М. Савицкая Пеницилиинамидаза из E.coli. Кинетические и равновесные параметры ферментативного гидролиза 8-фенилацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты, Антибиотики, 1980, 11, 808-815.

62. V.K. Sudhakaran, B.S. Deshpande, S.S. Ambedkar, G.C. Shewale Enzymatic hydrolysis of 7-phenylacetamidodesacetoxycephalosporanic acid by immobilized penicillin G acylase, Hindustan Antibiot Bull, 1989,31,79-82.

63. C.K. Lee, Performance of a cyclic operated multicolumns recirculated packed bed batch reactor for 6-APA production, Bioprocess Eng. 1997, 16, 237-242.

64. A.M.A. Nabais, J.P. Cardoso Enzymatic conversion of benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid in concentrated ultrafiltrated broths, Bioprocess Eng. 2000,23, 191-197.

65. A.M.A. Nabais, J.P. Cardoso Purification of benzylpenicillin filtered broths by ultrafiltration and effect on solvent extraction,, Bioprocess Eng. 1999, 21, 157-163.

66. A.M.A. Nabais, J.P. Cardoso Ultrafiltration of fermented broths and solvent extraction of antibiotics, Bioprocess Eng. 1995, 13,215-221.

67. A.M.A. Nabais, J.P. Cardoso Concentration of ultrafiltrated benzylpenicillin broths by reversed osmosis, Bioprocess Eng. 2000, 22,215-221.

68. K. Shugerl Integrated processing of biotechnology products, Biotechnology Advances, 2000, 18, 581-599.

69. T. Barenschee, T. Sheper, K. Shugerl An integrated process for production and biotransformation of penicillin, J. Biotechnol. 1992, 26, 143-154.

70. D. Rindfleisch, B. Syska, Z. Lazarova, K. Shugerl Integrated membrane extraction, enzyinic conversion and electrodialysis for the synthesis of ampicillin from pcnicillin G, Process Biochem. 1997, 32, 605-616.

71. H.K. Gaidhani, K.L. Wasewar, V.G. Pangarkar Intensification of enzymatic hydrolysis of penicillin G: Part 1. Equilibria and kinetics of extraction of phenylacctic acid by Alamine 336, Chem. Eng. Sci. 2002, 57, 1979-1984.

72. H.K. Gaidhani, V.L. Tolani, K.V. Pangarkar, V.G. Pangarkar Intensification of enzymatic hydrolysis of penicillin G: Part 2. Model of enzymatic reaction with reactive extraction, Chem. Eng. Sci. 2002, 57, 1985-1992.

73. J. Danzig, W. Tischer, C. Wandrey Continuous enzyme-catalyzed production of 6-aminopenicillanic acid and product concentration by reversed osmosis, Chem. Eng. Technol. 1995, 18, 256-259.

74. X. Cao, X.Y. Wu, T. Wu, K. Jin, B.K. Hur Concentration of 6-aminopenicillanic acid from penicillin bioconversion solution and its mother liquor by nanofiltration membrane, Biotechnol. Bioprocess Eng. 2001,6,200204.

75. В. Дженкс Катализ в химии и энзимологии, Москва, 'Мир', 1972.

76. М. Reschke, К. Schugerl Reactive extraction of penicillin I: Stability of penicillin G in the presence of carriers and relationships for distribution coefficients and degrees, Chem. Eng. J. 1984. 28, B1-B9.

77. V.K. Svedas, A.L. Margolin, I.V. Berezin Enzymatic synthesis of b -lactam antibiotics: a thermodynamic background, Enzyme Microb. Technol. 1980,2, 138-144.

78. И.В. Березин, А.А. Клесов, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая, В.К. Швядас Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинамидазой, Антибиотики. 1974, 19, 880-887.

79. J.B. Jones Enzymes in organic synthesis, Tetrahedron, 1986, 42, 3351-3403.

80. Y.L. Khmelnitsky, I.N. Zharinova, I.V. Berezin, A.V. Levashov, K. Martinek Detergentless inicroemulsions. A new microheterogeneous medium for enzymatic reaction, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1987, 501, 161-164.

81. M.B. Diender, A.J.J. Straathof, J.J. Heijnen Predicting enzyme catalyzed reaction equilibria in cosolvent-water mixtures as a function of pH and solvent composition, Biocatal. Biotransform. 1998, 16, 275-289.

82. M. Reschke, K. Schugerl Reactive extraction of penicillin II: Distribution coefficients and degrees of extraction Chem. Eng. J. 1984, 28, В11-B20.

83. G. Alvaro, R. Fernandez-Lafuente, R.M. Blanco, J.M. Guisan Immobilization-stabilization of penicillin Gacylase from Escherichia coli, Appl. Biochem. Biotechnol. 1990, 26, 181-195.

84. J. Masarova, D. Mislovicova, P. Gemeincr, E. Michalkova. Stability enhancement of Escherichia coli penicillin G acylase by glycosylation with yeast mannan, Biotechnol. Appl. Biochem. 2001, 34, 127-133.

85. L.A.M. van der Wielen, K.Ch.A.M. Luyben Integrated product formation and recovery in fermentation, Curr. Opin. Biotechnol. 1992, 3, 130-138.

86. G.G. Chilov, V.K. Svedas Enzymatic hydrolysis of beta-lactam antibiotics at low pH in a two-phase "aqueous solution water-immiscible organic solvent" system" Can. J. Chem. 2002, 80,699-707.

87. J. L. den Hollander, M. Zomerdijk, A. J. J. Straathof, L. A. M. van der Wielen Continuous enzymatic penicillin G hydrolysis in countercurrent water-butyl acetate biphasic systems, Chem. Eng. Sci. 2002, 57, 1591-1598.

88. G. Chilov, A. Sidorova, V.K. Svedas How does Ntn-hydrolase act: a quantum mechanical insight, 6th World Congress of Theoretically Oriented Chemists, Lugano, Switzerland, 2002, Abstract PC 441.

89. G. Chilov, A. Sidorova, V.K. Svedas Quantum chemistry of penicillin acylase action, 6th session of the V. A. Fock School on Quantum and Computational Chemistry, V. Novgorod, 2003, Abstract 782, p. 120.

90. W.B. Alkema, A.K. Prins, E. de Vries, D.B. Janssen Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the activc site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J. 2002, 365, 303-309.

91. W.B. Alkema, A.J. Dijkhuis, E. De Vries, D.B. Janssen, The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase, Eur. J. Biochem. 2002, 269, 2093-2100.

92. M. Morillas, C.E. McVey, J. A. Brannigan, A.G. Ladurner, L.J. Forney, R. Virdcn Mutations of penicillin acylase residue B71 extend substrate specificity by decreasing steric constraints for substrate binding, Biochem. J. 2003, 371, 143-150.

93. C.E. McVey, M.A. Walsh, G.G. Dodson, K.S. Wilson, J.A. Brannigan Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism, J. Mol. Biol. 2001, 313,139-50.

94. АЛ Марголин, B.K. Швядасб П.С. Ныс, E.B. Кольцова, E.M. Савицкая, И.В. Березин Пенициллинамидаза из E.coli. Изучение рН-зависимости равновесной константы гидролиза ампициллина, Антибиотики, 1978, 2, 114-117.

95. N. Kishore, Y.B. Tewari, W.T. Yap, R.N. Goldberg Thermodynamics of the hydrolysis of penicillin G and ampicillin, Biophys. Chem. 1994,49, 163-174.

96. M.B. Diender, A.J.J. Straathof, J.J. Heijnen Predicting enzyme catalyzed reaction equilibria in cosolvent-water mixtures as a function of pH and solvent composition Biocatal. Biotransform. 1998, 16, 275-289.

97. J. Tramper, H.H. Beeftink, A.E.M. Janssen, C.G.P.H. Schroen, V.A. Nierstrasz, P.J. Kroon, R. Bosma Thermodynamically controlled synthesis of b-lactam antibiotics. Equilibrium concentrations and side-chain properties, 1999, 24, 498-506.

98. R.V. Ulijn, L. De Marin, P.J. Hailing, B.D. Moore, A.E. Janssen Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics via direct condensation, J. Biotechnol, 2002, 99,215-222.

99. R. Didziapetris, B. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D. Jakubke, V. Svedas, Penicillin acylase catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis, FEBS Lett. 1991, 287, 31-33.

100. R.J. Didziapetris, V.K.§vedas, Penycillin acylase catalyzed acyl group transfer to aminoacids, their esters and peptides: a kinetic study, Biomed. Biochim. Acta. 1991, 50, 237-242.

101. F.H. Carpenter The free energy change in hydrolytic reactions: the non-ionized compound convention, J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 1111-1122.

102. Е.Д. Дьяченко, JIB. Козлов, B.K. Антонов Свободная энергия гидролиза различных амидных связей, образованных а-карбоксильными группами ациламинокислот, Биоорг. Хим. 1977, 3, 99-104.

103. Е.Д. Дьяченко, Л.В. Козлов, В.К. Антонов Свободная энергия гидролиза п-нитроанилидов N-ацетиламинокислот. Биохимия 1971, 36, 981-984.

104. А.П. Кондратьева, Е.Н. Дружинина, Б.П. Брунс, Т. А. Николаева Устойчивость 6-АРА в водных растворах. Антибиотики, 1962, 2, 442-446.

105. Д.М. Уголева Изучение ферментативного синтеза N-фенилацетильных поизводных аминокислот и их эфиров, катализируемого пенициллинацилазой, в системах "водный раствор-осадок". Дипл. работа. Хим. ф-т МГУ, кафедра хим. энзимологии. М. 1998.

106. A. Bruggink, Е.С. Roos, E.de Vroom Penicillin acylase in the industrial production of beta-lactam antibiotics. Org. Process Res. Dev. 1998, 2, 128-133.

107. A.M. Blinkovsky, A.N. Markaryan Synthesis of beta-lactam antibiotics containing alpha-ami nophcnylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-beta-lactamide amidohydrolase.Enzyme Microb Technol 1993, 15, 965-73.

108. M.I. Youshko, G.G. Chilov, T.A. Shcherbakova, V.K. Svedas, 'Quantitative characterization of the nucleophile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions' Biochim. Biophys. Acta: Proteins & Proteomics, 2002, 1599, 134-140.

109. W.H.J. Boesten, Eur. Pat. Appl. EP 442585, 1991

110. T. Sugai,; T. Yamazaki,; M. Yokoyama, H. Ohta, Biocatalysis in organic synthesis: the use of nitrile- and amide-hydrolyzing microorganisms, Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997, 61, 1419-1427.

111. I. Ospiran, C. Jarret, U. Strauss, W. Kroutil, R.V.A. Orru, U. Felfer, A.J. Willetts, K. Faber, Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R 312 (CBS 717.73), J. Mol. Catal. B: Enzym 1999,6, 555-560.

112. A. Stolz, S. Trott, M. Binder, R. Bauer, B. Hirrlinger,; N. Layh, H.-J. Knackmuss, Enantioselectivc nirile hydratases and amidases from different bacterial isolates, J. Mol. Catal. B: Enzym. 1998, 5, 137-141.

113. M.A. Wegman, U. Heinemann, F. Van Rantwijk, A.Stolz, R.A. Sheldon, Stereoselective nitrile hydratase-catalysed hydration of D-phenylglycine nitrile, Org. Proc. Res. Dev. 2000, 4, 318-322.

114. C.M. Hjort, S.E. Godtfredsen, C. Emborg, Isolation and characterization of a nitrile hydratase ofrom a Rhodococcus sp., J. Chem. Tech. Biotechnol. 1990, 48, 217-226

115. N. Layh, B. Hirrlinger, A. Stolz, H.-J. Knackmuss Enrichment strategies for nitrile-hydrolysing bacteria, Appl Microbiol Biotechnol 1997,47,668-674.

116. M.A. Wegman, U. Heinemann, F. Van Rantwijk, A. Stolz, R.A. Sheldon, Hydrolysis of D,L-phenylglycine nitrile by new bacterial isolates J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001, 11,249-253.