Определение следовых концентраций аминокислот, различных органических кислот и сахаров при их совместном присутствии методом реакционной хромато-масс-спектрометрии в водных и органических растворах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
Соболевский, Тимофей Геннадьевич
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
2004
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
На правах рукописи
Соболевский Тимофей Геннадьевич
Определение следовых концентраций аминокислот, различных органических кислот и Сахаров при их совместном присутствии методом реакционной хромато-масс-спектрометрии в водных и органических растворах
02.00.02 -Аналитическая химия
Автореферат
Москва - 2004 С' ~ Я 3 ' ЬН
6Е-.;::;
Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 15.03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 280. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В .Ломоносова.
Общая характеристика работы
Актуальность темы. В настоящее время все чаще возникает необходимость высокоселективного и высокочувствительного определения состава таких биологически важных соединений, как аминокислоты, органические кислоты и сахара, в различных объектах. Подобные исследования проводятся при диагностике различных заболеваний, в том числе врожденных. Состав органических кислот и Сахаров — один из показателей качества пищевой продукции и различных напитков. Микробиологические исследования также требуют определения этих классов соединений на ультранизком уровне.
При определении таких соединений в ряде случаев используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ), поскольку эти методы позволяют проводить определение указанных соединений напрямую (после предварительной очистки пробы). Однако пределы обнаружения (за исключением ВЭЖХ с амперометрическим детектированием), достигаемые в этом случае, сравнительно высоки, а в качестве элюента необходимо использование органических растворителей высокой степени чистоты. Кроме этого, ВЭЖХ и КЭ не позволяет проводить определение соединений различных классов при их совместном присутствии в смеси.
Газовая хроматография (ГХ) находит более широкое применение в анализе указанных соединений, и, как правило, определение проводят с использованием пламенно-ионизационного детектора. Поскольку рассматриваемые соединения чаще всего не подлежат прямому газохроматографическому анализу, необходимо проведение предколоночной дериватизации для переведения таких соединений в соответствующие летучие производные. В существующих публикациях уровень рабочих концентраций составляет обычно 10"4- Ю'Ч, и в подавляющем большинстве случаев не проводится определение всех рассматриваемых соединений при их совместном присутствии в смеси (или же определяют лишь несколько представителей каждого из классов).
В литературе наблюдается значительная противоречивость данных по условиям получения различных производных рассматриваемых классов соединений. Применимость некоторых описанных в литературе методов получения летучих производных для ГХ показана только на модельных смесях соединений, а не на реальных объектах, хотя матрица может оказывать настолько сильное мешающее влияние, что ни о каком не только количественном, но и качественном установлении состава не может быть и речи. Также в литературе редко приводятся данные по пределам детектирования для соответствующих летучих производных, и совершенно не рассматривается примене-
1'ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА СП« 09
ние концентрирования для снижения предела обнаружения. Как правило, только малая часть реакционной смеси, полученной после дериватизации, подвергается анализу (1-2 мкл из 0.5-1 мл конечного экстракта), что приводит к значительному повышению пределов обнаружения.
Необходимо отметить немногочисленность работ по использованию реакционной хромато-масс-спекгрометрии для анализа отдельных групп соединений, относящихся к рассматриваемым классам, хотя она является более высокочувствительным и, в большинстве случаев, - более высокоселективным методом. Кроме того, масс-спектры летучих производных регистрируют для относительно больших количеств веществ, хотя известно, что общий вид масс-спектра зависит от концентрации, и чем ниже концентрация, тем больше масс-спектр может отличаться от библиотечного.
Таким образом, актуальной является разработка общей методологии получения и последующего анализа летучих производных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов на уровне следов при их совместном присутствии в водном либо органическом растворе.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка способа определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов в водных и органических растворах (экстрактах) при их совместном присутствии в смеси на уровне следовых концентраций методом реакционной хромато-масс-спектрометрии и снижения пределов обнаружения за счет использования сорбционного концентрирования из органического раствора (экстракта) с последующим анализом всего концентрата.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить закономерности силилирования различных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов в органических растворах с использованием гексамстилдисилазана (ГМДС), N.0-бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА), М-метил-М'-третбутил-диметилсилилтрифторацетамида (МТБСТФА) и различных растворителей, и выбрать условия ГХ-МС определения соответствующих триметилсилильных (ТМр и третбутилдиметилсилильных (ТБДМС) производных;
- изучить масс-спектры электронной (ЭИ) и химической (ХИ) ионизации для различных количеств этих производных и провести оценку пределов детектирования в режиме регистрации полного ионного тока и селективного ионного детектирования;
- разработать методологию определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов методом реакционной ГХ-МС;
- изучить условия дериватизации в водно-органическом растворе для аминокислот, жирных, дикарбоновых и других органических кислот с помощью реакции этерификации — ацилирования (реагент — изобутилхлорформиат, ИБХФ) и разработать условия ГХ-МС определения получающихся производных;
- изучить масс-спектры ЭИ и ХИ для различных количеств соответствующих изобутоксикарбонильных производных и алкиловых эфиров и оценить пределы детектирования;
- изучить состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией из лиофилизированной культуры Е. Coli (после дериватизации);
- изучить состав жирных, дикарбоновых и аминокислот, выделенных из клеточных культур аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов (после дерива-тизации), и возможность дифференциации этих типов клеток;
- разработать способ определения следовых количеств аминокислот в водном растворе, основанный на получении N-изобутоксикарбонил-О-гептафторбутиловых (ИБОК-ГФБ) производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата.
Научная новизна. В работе изучены условия дериватизации широкого круга веществ (всего 60 соединений), принадлежащим к классам аминокислот, жирных, дикарбоновых, гидрокси- и оксокислот, а также Сахаров и стеролов с использованием следующих реагентов: ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ. Показаны преимущества и недостатки каждого способа получения летучих производных и установлены оптимальные условия дериватизации и определения изученных веществ при их совместном присутствии.
Для всех производных изучены масс-спектры для различных количеств веществ. Получены масс-спектры ЭИ ТМС производных ряда органических кислот, Сахаров и стеролов, отсутствующие в библиотеке масс-спектральных данных NIST 98. Впервые представлены масс-спектры ЭИ N-изобутоксикарбонил-О-изобутиловых и N-изобу-токсикарбонил-0-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также гептафторбути-ловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот. Установлены пределы детектирования всех соответствующих производных в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые составили
2.5x10"' — 2.0xl0"1J г и 1.4x10"' — 1.0х10*12г в пробе (в зависимости от соединения и типа производных).
В режиме ХИ положительных ионов изучены масс-спектры ТМС производных гидрокси- и оксокислот, стеролов и Сахаров, ^юобутоксшсарбонил-0-изобутиловых и N-изобутоксикарбонил-О-гептафторбугаловых эфиров аминокислот, а также изобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот. Показано, что пределы детектирования всех изученных производных составляли 3.4x10"' - 5.0х10"12г в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и 1.0x10"'- 1.0хЮ",2г в случае селективного ионного детектирования (в зависимости от соединения и типа производных).
Предложена методология определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов, основанная на обработке одной части образца смесью БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесью ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе. При этом в первом случае в виде ТМС производных определяются все классы соединений, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоновые и короткоцепные гидрокси- и оксокислоты.
На основании проведенных исследований установлен состав свободных аминокислот, а также других органических кислот и Сахаров в лиофилизированной культуре клеток Е. Coli (штамм К-12 HfrHthi).
Проведено исследование состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в суспензии клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность дифференциации этих типов клеток на основании различия в составе аминокислот.
Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере на 2 порядка.
Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решать задачи определения следовых концентраций широкого круга веществ в водных и органических растворах при их совместном присутствии. Изученные закономерности дериватизации соединений различных классов позволяют выбрать наиболее подходящий реагент и условия проведения реакции в зависимости от цели и задач исследования, а также предполагаемого состава смеси.
Масс-спектры ЭИ и ХИ, полученные для различных производных всех изученных соединений, позволяют увеличить селективность определения и дополнительно снизить пределы детектирования при использовании селективного ионного детектирования.
Масс-спектры ЭИ соединений, отсутствующих в библиотеке масс-спектральных данных №8Т 98, позволяют увеличить достоверность идентификации, что особенно важно в анализе аминокислот в виде изобутоксикарбонильных производных.
Разработанная методология анализа микробиологических образцов позволяет проводить высокочувствительное и селективное определение широкого круга соединений в указанных объектах на следовом уровне.
Предложенный способ определения аминокислот в раковых клетках и фибробла-стах позволяет увеличить достоверность дифференциации раковых и здоровых клеток.
Разработанный способ сорбционного концентрирования из органических растворов обеспечивает возможность снижения пределов обнаружения по крайней мере на 2 порядка благодаря ГХ-МС анализу всего концентрата. На защиту выносятся:
- оптимизированные условия дериватизащщ соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов с использованием таких реагентов, как ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ;
- масс-спектры ЭИ ТМС производных различных органических кислот, Сахаров и стеролов, а также Л'-изобутоксикарбонил-О-изобутиловых, М-изобутоксикарбо-нил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, изобутиловых и гептафторбути-ловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот, и соответствующие пределы детектирования;
- масс-спектры ХИ положительных ионов ТМС производных гидрокси- и оксокис-лот, спиртов, Сахаров и стеролов, М-изобутоксикарбонил-О-изобутиловых и N изобутоксикарбонил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, изобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот, и соответствующие пределы детектирования;
- методология определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов, основанная на обработке одной части образца смесью БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесью ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе;
- результаты определения состава соединений изученных классов, выделенных экстракцией из лиофилизированной клеточной культуры Е. Coli;
- способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный на. определении различия в составе аминокислот методом реакционной ГХ-МС;
- способ определения аминокислот в водном растворе, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании производных и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере на 2 порядка.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Питтсбургской конференции по аналитической химии и прикладной спектроскопии (12-17 марта.2000 г., Новый Орлеан, Луизиана, США), 24-м Международном симпозиуме по хроматографии (15-20 сентября 2002 г., Лейпциг, Германия) и 8-м Международном симпозиуме по гибридным методам в хроматографии (4-6 февраля 2004 г., Брюгге, Бельгия).
Публикации. По материалам работы опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.
Материал диссертации изложен на 178 страницах, содержит 28 таблиц и 83 рисунка. Список литературных источников состоит из 96 наименований.
Основное содержание работы Исходные вещества, аппаратура, техника эксперимента
Работу проводили на хромато-масс-спектрометре спектрометре "Automass Mult? (ThermoQuest, Франция) в сочетании с газовым хроматографом "Trace GC" (ThermoQuest, CE Instruments, Италия), оборудованном инжектором для ввода проб с делением/без деления потока. Для разделения силильных производных использовали капиллярную кварцевую колонку RTX-5K1S (Restek, США) 30 м х 0.32 мм х 0.25 мкм с привитой неподвижной фазой SE-54 (5% фенил 95% диметилполисилоксан), а в случае изобутоксикарбонильных производных и алкиловых эфиров - колонку СР Sil 24СВ (Varian, США) 30 м х 0.32 мм х 0.5 мкм с неподвижкой фазой средней полярности (50% фенил 50% диметилполисилоксан). Объем пробы -1 мкл.
В качестве модельных соединений использовали 17 аминокислот, 17 жирных кислот, 6 дикарбоновых кислот, 7 гидроксикислот, 2 оксокислоты, 5 Сахаров, 4 стерола, 2 спирта.
Разделение проводили в режиме программирования температуры, варьируя начальную температуру термостата, скорость нагрева и температуру конечной изотермы. В качестве газа-носителя использовали гелий марки «А» (99.99%).
Масс-спектрометрическую регистрацию соответствующих производных осуществляли в режиме полного ионного тока (ПИТ) и селективного ионного детектирования (СИД). Масс-спектры получали в условиях электронной и химической ионизации, используя в последнем случае изобутан (99.5%) в качестве газа-реагента.
Температура ионного источника составляла 100-250°С в зависимости от способа ионизации. Регистрацию спектров ЭИ проводили в диапазоне масс 90-750Д для силильных производных, и 80-400 Д- для изобутоксикарбонильных производных и изо-бутиловых / гептафторбутиловых эфиров. Энергия электронов - 70 оВ. Идентификацию продуктов дериватизации проводили путем библиотечного поиска в базе масс-спектральных данных N1ST 98, а также вручную. В случае ХИ масс-спектры регистрировали в диапазоне 200-800Д для силильных производных и 150-815 Д в случае изобутоксикарбонильных производных и изобутиловых / гептафторбутиловых эфиров. Энергия электронов в ХИ-160 эВ.
В качестве объекта исследования использовали лиофилизированную культуру Escherichia Coli (штамм К-12 HfrH thi, выращенный сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ В.В. Куц, И.Б. Котовой, Н.В. Угольковой и А.Д. Исмаиловым), а также суспензии физиологически активных и физиологически неактивных клеток аденокарциномы человека и фибробластов в изотоническом растворе, приготовленных сотрудниками Онкологического центра Н.Ю. Анисимовой и М.В. Киселевским.
Дериватизация и хромато-масс-спектрометрическая идентификация летучих производных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов
При проведении настоящего исследования нами были выбраны следующие реагенты: для получения силильных производных - гексаметилдисилазан, N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамид, и К-метил-К-третбутиддиметилсилилгрифтор-ацетамид, а для получения изобутоксикарбонильных производных и алкиловых эфиров - изобутилхлорформиат. Следует заметить, что любые силильные эфиры (а также сами реагенты) подвержены гидролизу, поэтому дериватизацию необходимо проводить в среде, не содержащей даже следов воды. Особенно это важно для ТМС производных, тогда как, по имеющимся данным, стабильность ТБДМС эфиров по отношению к гидролизу в 104 выше. Реакция же с ИБХФ протекает в водно-органической среде.
Дериватизация гексаметилдисилазаном. ГМДС - один из наиболее доступных реагентов для получения ТМС производных, широко используемый в настоящее время в практике реакционной газовой хроматографии. Дериватизация этим реагентом требует присутствия в качестве катализатора трифторуксусной кислоты (ТФУК).
Из литературы известно, что наиболее сложную задачу представляет собой получение ТМС производных аминокислот, поэтому нами прежде всего была изучена возможность дериватизации этого класса соединений. Поскольку аминокислоты очень плохо растворимы в органических растворителях, для дериватизации необходимо использовать упаренные досуха водные растворы. Аминокислоты в водном растворе при рН1 существуют в виде внутренних солей, и для разрушения этой структуры их стандартные растворы обычно готовят в 0.1MHCL
Проведение дериватизации модельного раствора 17 аминокислот в оптимальных условиях, выбранных в результате эксперимента (100°С в течение 1 ч.), показало, что были получены производные только для аланина, глицина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, серина, треонина, метионина, тирозина и триптофана, т.е. 11 из 17 соединений. Более того, масс-спектрометрическое исследование показало, что в ряде случаев происходило образование не N(O)-TMC ТМС эфиров аминокислот, а ЛГСС^-трифторацетил ТМС эфиров. Это означает, что ТФУК сама взаимодействовала с аминокислотами, ацилируя их по аминогруппе, а реакционной способности ГМДС не хватало для замещения трифторацетильной группы на ТМС группу. К недостаткам этой реакции следует отнести необходимость работы с агрессивной ТФУК, выделение аммиака (а значит, опасность проведения реакции в замкнутом объеме) и образование осадка на котором может происходить адсорбция обра-
зующихся производных. По этой причине в дальнейших исследованиях мы отказа-
лись от использования ГМДС в качестве дериватизирующего реагента и не использовали его для получения летучих производпых остальных соединений.
Дериватизация И,0-бис(триметилсилил)трифторацетамидом. БСТФА был применен для дериватизации всех изучаемых соединений. Обычно при проведении этой реакции требуется присутствие полярного растворителя - имеющиеся в литературе данные указывают на то, что выход ТМС производных в этом случае выше. Нами было установлено, что пиридин является лучшим растворителем для всех изучаемых соединений (кроме аминокислот), тогда как при использовании ацетонитрила или тетрагидрофурана полного растворения Сахаров и некоторых других веществ добиться не удавалось. Модельные соединения были разбиты на несколько групп, так как в противном случае наблюдали частичное либо полное перекрывание хроматографических пиков, отвечающих соответствующим производным. Поскольку было необходимо изучить масс-спектры всех производных, и в точности установить, какие ионы являются характеристичными для каждого соединения, перекрывание хроматографических пиков на данном этапе исследования было недопустимо.
Нами было установлено, что максимальный выход ТМС производных жирных, ди-карбоповых, гидрокси-, оксокислот, Сахаров, спиртов и стеролов наблюдался при соотношении объемов пиридина (содержащего дериватизируемые соединения) и БСТФА 1:2, температуре 100°С и времени проведения реакции 1 ч. Также было показано, что в этих условиях не происходило количественного образования ТМС производных аминокислот.
Имеющиеся в литературе данные по условиям получения ТМС производных аминокислот с этим реагентом крайне противоречивы. Можно только сказагь, что дериватизация аминокислот БСТФА происходит в гораздо более жестких условиях.
Нам удалось получить летучие производные только 14 из 17 модельных аминокислот (что находится в противоречии с литературными данными). Варьирование температурно-временного режима в сочетании с высушиванием, а также использование ацетонитрила вместо пиридина так и не позволило нам получить ТМС эфиры аспарагина, аргинина и гистидина. Возможно это было связано с присутствием следовых количеств воды в используемых растворителях.
Для производных всех исследуемых соединений, полученных в выбранных нами оптимальных условиях, были изучены масс-спектры ЭИ и ХИ. В первом случае большинство соединений претерпевало значительную фрагментацию, интенсивность пика молекулярного иона была незначительной, либо ион отсутствовал в масс-спектрах. У всех ТМС производных в масс-спектре присутствовал малоинтенсивный пик иона Показано, что в случае жирных кислот соотношение интенсивностей пиков ионов с может служить показателем
насыщенности / ненасыщенности: так, для насыщенных жирных кислот 1 {т/г 129) й 1(т/г 132), а при наличии двойных связей —1(т/г 129)»/(т/г 132).
В масс-спектрах ТМС производных изомерных Сахаров, фруктозы и галактозы, присутствовали одинаковые ионы, однако их интенсивности заметно отличались.
Использованная нами версия библиотеки масс-спектральных дашшх NIST 98 содержала сведения не для всех производных изученных соединений: в ней отсутствовали масс-спектры ТМС эфиров ундекановой кислоты, всех ненасыщенных жирных кислот (за исключением линоленовой), /5-гидроксипентадекановой, 22-гидроксидо-козановой, хинной, шикимовой (приведена неверная структура), хлорогеновой кислот, сахарозы, трегалозы, линалоола и всех
стеролов (за исключением катехола). Масс-спектр ТМС эфира а-кетопропионовой кислоты, полученный нами, не соответствует масс-спектру, приведенному в NIST 98, при этом есть все основания полагать (исходя из возможных направлений фрагментации), что в библиотеке представлены ошибочные данные.
Оценку пределов детектирования (ПД) для ТМС производных всех изученных соединений, полученных в выбранных нами условиях, проводили в режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД. В случае ЭИ ПД составили 1.2x10""-2.5x10"'г, а при использовании СИД- от 5.0хЮ"'2 до 1.4x10"' г в пробе в зависимости от соединения.
В режиме ХИ в выбранных нами оптимальных условиях были получены масс-спектры ТМС эфиров гидрокси-, оксокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов. Масс-спектры многих соединений содержали пик протонированного молекулярного иона относительная интенсивность которого была максимальной. В ряде слу-
чаев в масс-спектрах присутствовал пик иона [М-89]*, отвечающего элиминированию группы ТМС производные Сахаров, особенно дисахаридов, претерпевали
выражепную фрагментацию, и пик [МН^ присутствовал только у производного галактозы.
При использовании ХИ ПД составили 2.0x10"" - 1.5x10"' г и 7.0хЮ'12 - 1.0х10"9 г в
режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД, соответственно.
Таким образом, нами были разработаны условия, позволяющие проводить определение жирных, дихарбоновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, Сахаров и стеролов при их совместном присутствии в органическом растворе на уровне следов в виде ТМС производных методом реакционной ГХ-МС (ЭИ/ХИ), когда определение аминокислот не требуется.
Дериватизация №метил-М-третбутилдиметилсилилтрифторацетамидом. МТБСТФА был применен только для исследования дериватизации аминокислот как наиболее трудно дериватизируемых соединений. Были изучепы условия получения ТБДМС эфиров аминокислот в различных температурно-временных режимах с использованием в качестве растворителя пиридина и ацетонитрила. Для разрушения
структуры внутренней соли аминокислоты предварительно растворяли в 0.1 Ми 0.01 МНС1. Установлено, что при температуре 70°С и времени дериватизации 30 мин (растворитель — ацетонитрил) происходит образование соответствующих производных всех 17 модельных аминокислот независимо от того, какой концентрации НС1 использовали для приготовления исходного раствора.
Нами была изучена стабильность ТБДМС эфиров аминокислот во времени и при разбавлении. Реакционные смеси при хранении в холодильнике при 4°С были стабильны в течение как минимум одной недели. Для изучения стабильности производных при разбавлении, реакционные смеси разбавляли в 10 и в 500 раз ацетонитрилом и МТБСТФА. Оказалось, что уже при 10-кратном разбавлении ацетонитрилом на соответствующих хроматограммах отсутствовали пики ТБДМС производных лизина, аргинина и гистидина. Этот факт можно объяснить их нестабильностью в отсутствие избытка реагента. Разбавление же реакционных смесей самим МТБСТФА приводило к пропорциональному уменьшению площадей пиков ТБДМС эфиров в соответствии с фактором разбавления.
Масс-спектры ТБДМС производных аминокислот изучали в условиях ЭИ. Было показано, что для ТБДМС эфиров аминокислот типичным являлся отрыв третбутиль-ной группы, что приводило к появлению интенсивных пиков [М-С4Н)]*. ПД этих производных в режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД составили 3.0x10""-
соответственно (в зависимости от соединения).
Таким образом, в результате проведенных пами исследований были разработаны условия определения аминокислот на уровне следов, основанные на получении ТБДМС производных и последующем ГХ-МС анализе. Поскольку целью работы являлось изучение возможности определения всех классов соединений при их одновременном присутствии в смеси, представлялось логичным использовать для их дерива-тизации МТБСТФА. Однако предварительное исследование состава лиофилизиро-ванной культуры E.Coli показало, что в присутствии значительного количества сахаров в образце одновременная регистрация всех классов соединений в виде ТБДМС производных невозможна.
Дериватизация изобутилхлорформиатам. По вышеуказанной причине нами была изучена дериватизация аминокислот, жирных, дикарбоновых и других органических кислот ИБХФ в сочетании с изобутанолом (ИБ) и гептафторбутанолом (ГФБ) и возможность их ГХ-МС определения на уровне следов. Оказалось, что среди изученных нами соединений летучие производные образовывали только жирные, дикарбоновые и аминокислоты (а также а-кетоглутаровая, а-кетопропионовая и яблочная кислоты). Вместе с тем, подобная селективность алкилхлорформиатов исключительно полезна при анализе реальных проб, содержащих значительные количества Сахаров. При использовании ИБХФ с ИБ для дериватизации смеси
жирных, дикарбоновых и аминокислот в выбранном нами соотношении реагентов НгО - ИБ - пиридин - ИБХФ 10:2:1:2 были получены К-изобутоксикарбонил-0-изобутиловые эфиры (ИБОК-ИБ) 15 из 17 аминокислот, а также изобутиловые и диизобутиловые эфиры всех жирных и дикарбоновых кислот.
В случае гидроксиаминокислот серина и треонина, площади соответствующих пиков на хроматограмме были существенно ниже остальных производных. Варьирование соотношений реагентов и длительное воздействие ультразвукового поля не привело к значимому увеличению выхода этих производных. Кроме этого, не были получены производные гистидина и аргинина.
Площади пиков производных аминокислот на соответствующих хроматограммах, полученных в случае использования для дериватизации раствора этих соединений в 0.1 М НС1 и дистиллированной воде,. значимо не отличались. Это является существенным преимуществом данного способа получения летучих производных аминокислот.
При дериватизации трех указанных классов соединений смесью ИБХФ и гептафторбутанола при экспериментально выбранном соотношении реагентов -ГФБ - пиридин - ИБХФ 10:2:1:1, были получены N-изобутохсикарбоиил-О гептафторбутиловые (ИБОК-ГФБ) эфиры всех аминокислот, кроме аргинина, и гептафторбутиловые и дигептафторбутиловые эфиры всех жирных и дикарбоновых кислот. Несмотря на существенно большую молекулярную массу, фторсодержащие производные элюировались при меньших температурах, что позволило сократить время анализа и получить более узкие пики.
Экспериментально было показано, что температура не оказывала заметного влияния на эффективность дериватизации ИБХФ, поэтому реакцию проводили при комнатной температуре. Вместе с тем, время реакции должно быть минимизировано, поскольку при продолжительном контакте с водной фазой наблюдали падение сигнала для некоторых производных.
Масс-спектры ИБОК-ИБ / ИБОК-ГФБ производных аминокислот, а также ИБ / ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот были изучены в режимах ЭИ и ХИ. В случае ЭИ, ион [М-]01]*, отвечающий отщеплению г р у п п"ДОДСи\ утствовал в масс-спектрах производных всех аминокислот, за исключением лизина, триптофана и цистина, причем его интенсивность во многих случаях была максимальной. Ион с характерен для производных ароматических аминокислот, фенила-ланина и тирозина, причем в последнем случае интенсивность этого иона очень низка из-за присутствия гидроксигруппы в кольце. Рассмотрение масс-спектра производного аспарагина позволило предположить, что его амидогруппа не только не дериватизировалась, по и элиминировала воду с образованием нитрила. По всей видимости, это происходило в инжекторе, поскольку пик производного аспарагина был
несимметричным. Кроме этого, было обнаружено, что в случае алифатических гидро-ксиаминокислот (серии, треонин) происходило образование -диизобутоксикарбо-нил-0-изобутиловых эфиров, хотя считается, что алкилхлорформиаты взаимодействуют только с Ой-группами, расположенными в а-положении к карбоксилу.
Масс-спектры ЭИ ИБОК-ИБ производных аминокислот в нашей работе были получены впервые. В табл. 1 приведены характеристичные ионы и их относительные интенсивности для этих производных.
Таблица 1. Характеристичные ионы и их относительные интенсивности для ИБОК-ИБ производных аминокислот в масс-спектрах электронной ионизации (жирным шрифтом выделены наиболее интенсивные ионы)
--Соединение.-. „ ..МН-б ч" от/гхарактерисгинных ^ - - ^ ^
Алании ИБОК-ИБ 245 116 (20), 144 (100)
Глицин ИБОК-ИБ 231 102 (35), 120 (25), 130 (100), 176 (35)
Валин ИБ0К-И5 273 116 (40), 172 (100)
Лейцин ИБОК-ИБ 287 130 (25), 186(100)
Изолейцин ИБОК-ИБ 287 130 (55), 186 (IX)
Пролин ИБ0К-И5 271 114 (20), 170(100)
Аспарагин ИБОК-ИБ 270 113 (10), 141 (15), 143 (10), 169 (100)
Метионин ИБОК ИБ 305 101 (35), 119 (80), 156 (20), 175 (100), 188 (20), 204 (45), 231 (70), 244 (20), 305 (30)
Треонин 2ИБОК-ИБ 375 100 (100), 119 (53), 156 (45), 162 (17), 175 (33), 202 (19), 218 (14), 231 (33), 257 (4), 274 (7)
Серии 2ИБОК-ИБ 361 104 (100), 142 (59), 176 (13), 187 (28), 204 (87), 243 (5), 260 (19)
Фенилаланин ИБОК-ИБ 321 91 (30), 120 (40), 130 (30), 148 (100), 164 (35), 204 (30), 220 (30)
Лизин 2ИБОК-ИБ 402 128 (40), 184 (100), 198 (15), 272 (10), 328 (10)
Тирозин 2ИБОК-ИБ 437 107 (45), 164 (100), 180 (10), 220 (55), 320 (25), 336 (10)
Триптофан ИБОК-ИБ 360 130 (100), 360 (15)
Цисгин 2ИБОК-2И5 552 176(30,188(100), 276(20)
ПД ИБОК-ИБ производных аминокислот и ИБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот в режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД составили -
соответственно (в зависимости от соединения).
Масс-спектры ЭИ ИБОК-ГФБ производных аминокислот, ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот также были получены впервые. В табл. 2 приведены характеристичные ионы и их относительные интенсивности для ИБОК-ГФБ производных аминокислот.
Таблица 2. Характеристичные ионы и их относительные интенсивности для ИБОК-ГФБ производных аминокислот в масс-спектрах электронной ионизации
--Г^ГТ: -г , к.. 'и и... : - Соединен!»;-, . MMif ) " .*» '*/п/гхарактериетичмыхионои..."
Алании ИБОК-ГФБ 371 144 (100), 270 (31)
Глицин ИБОК-ГФ5 357 102 (26), ИЗ (21), 130 (100), 183 (10), 256 (69), 258 (34), 302 (10)
Валин ИБОК-ГФБ 399 98 (26), 101 (35), 116 (58), 172 (100), 256 (12), 283 (13), 298 (14), 301 (6)
Лейцин ИБОК-ГФБ 413 101 (9), 112 (2), 130 (29), 186 (100), 256 (9), 301 (4), 312 (8)
Изолейцин ИБОК-ГФБ 413 101 (76), 130 (74), 186 (100), 256 (17), 283 (12), 301 (23), 312 (12), 357(2)
Пролин ИБОК-ГФБ 397 114 (38), 170 (100), 296 (23)
Аспарагин ИБОК-ГФБ 396 95 (84), ИЗ (34), 119 (9), 141 (10), 154 (6), 169 (100), 183 (5), 223 (8), 256 (20), 295 (36)
Метионин ИБОК-ГФБ 431 101 (100), 114 (22), 116 (20), 119 (7), 127 (41), 156 (9), 175 (15), 204 (15), 256 (6), 270 (12), 284 (И), 301 (54), 311 (13), 327 (5), 357 (27), 431 (9)
Треонин 2ИБОК-ГФБ 501 101 (100), 156 (12), 162 (5), 254 (6), 284 (13), 301 (47), 328 (18), 357 (13)
Серии 2ИБОК-ГФБ 4В7 101 (52), 104 (100), ИЗ (55), 142 (49), 148 (56), 176 (И), 204 (71), 224 (10), 270 (28), 301 (16), 314 (99)
Фенилаланин ИБОК-ГФБ 447 91 (100), 120 (17), 131 (19), 146 (13), 164 (6), 220 (7), 256 (17), 330 (64)
Лизин 2ИБОК-ГФБ 528 100 (19), 110 (14), 116 (21), 128 (93), 143 (18), 153 (21), 172 (36), 184 (100), 198 (38). 256 (6), 272 (13), 310 (31), 355 (27). 454 (10)
Тирозин 2ИБОК-ГФ6 563 107 (100), 163 (4), 346 (8)
Триптофан ИБОК-ГФБ 486 130 (100), 486 (1)
Цисгин 2ИБОК-2ГФБ 804 96 (24), 102 (51), ИЗ (44), 118 (32), 144 (16), 146 (21), 223 (6), 256 (15), 269 (15). 295 (6). 301 (19), 314 (100). 346 (39), 370 (5). 402 (10)
ГИСТИДИН 2ИБОК-ГФБ 537 110 (31), 121 (23), 136 (50), 154 (И), 181 (100), 210 (24), 236 (22), 254 (9), 310 (35). 320 (74). 364 (23). 420 (45). 464 (8), 481 (5). 537 (31)
Как видно из данных табл. 2, ИБОК-ГФБ производные аминокислот претерпевали глубокую фрагментацию в условиях ЭИ, что, вообще говоря, типично для фторсо-держащих соединений. В масс-спектрах ИБОК-ГФБ производных многих аминокислот также присутствовали ионы [M-10lYt отвечающие отщеплению С4Н9ОСО. Кроме этого, например, ион с m/z = 144 характерен как для ИБОК-ИБ, так и для ИБОК-ГФБ эфира аланина, ион с m/z = 130 - для обоих производных глицина, m/z = 172 - для обоих производных валина и т.д. Несмотря на существенную фрагментацию, в масс-спектрах производных метионина, гистидина и триптофана присутствовали пики молекулярных ионов, причем интенсивность пика [М\* у производного гистидина достигала 30%.
Было установлено, что характер фрагментации ГФБ эфиров насыщенных жирных кислот уникален: независимо от длины углеродного скелета, в масс-спектрах всех гомологов присутствовали два наиболее интенсивных пика с m/z = 242 и 255.
ПД ИБОК-ГФБ производных аминокислот и ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот в режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД составили 2.0x1 ö"12 -8 0х10',оги l.OxIO"12- 1 ОхЮ",0г, соответственно (в зависимости от соединения).
В выбранных нами оптимальных условиях были изучены масс-спектры ХИ ИБОК-ИБ / ИБОК-ГФБ производных аминокислот, а также ИБ / ГФБ эфиров жирных и ди-
карбоновых кислот. В масс-спектрах производных всех соединений присутствовал интенсивный пик [Л/Н]+. Значение m/z для [МН^ изобутоксикарбопильного производного аспарагина подтверждает ранее сделанное предположение о том, что в действительности его амидогруппа превращается в нитрил до попадания в ионный источник масс-спектрометра. В случае же алифатических гидроксиамииокислот, серина и треонина, величины m/z наиболее интенсивных пиков указывают на образование смешанных .ЭДО-диизобутоксикарбонильных производных. В масс-спектрах производных лейцина, изолейцина, пролина, метионина и фенилаланина присутствовали малоинтенсивные пики ионов [М-101]*, отвечающих элиминированию изобутокси-карбонильной группы. В масс-спектрах производных серина, треонина и тирозина также присутствовали пики ионов отвечающие отрыву
Масс-спектры ХИ ИБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот, помимо интенсивных пиков содержали фрагменты образованные вследствие отщепления причем среди эфиров дикарбоновых кислот ион присутствовал только у малоновой кислоты. В масс-спектрах ИБ эфиров жирных кислот с длиной углеродного скелета до включительно присутствовал только ион [А/-55]+, а для старших гомологов - оба этих иона.
В случае ГФБ эфиров дикарбоновых кислот происходило отщепление группы что приводило к появлению пиков ионов причем их ин-
тенсивность увеличивалась по мере роста длины углеродного скелета, и у последних трех гомологов она превышала относительную интенсивность протонированных молекулярных ионов.
В условиях ХИ ПД для ИБОК-ИБ производных аминокислот и ИБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот в режимах ПИТ (по масс-хроматограмме) и СИД составляли 5.0х10"12- 2.0x10"'г и l.OxlO"12- 2.0x10"'°г, а для ИБОК-ГФБ/ГФБ производных -1.8x10""- 3.4x10"®г и б.ОхЮ"12— 5.7x10"'°г, соответственно (в зависимости от соединения).
Таким образом, на основании проведенных исследований по дериватизации и ГХ-МС определению различных классов соединений, нами предложена методология анализа жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и сте-ролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов. Она подразумевает обработку одной части образца смесью пиридина и БСТФА (после высушивания), а другой - смесью ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе (для определения аминокислот, жирных и дикарбоновых кислот) с последующим ГХ-МС анализом соответствующих продуктов дериватизации.
Изучение состава соединений, выделенных из клеточных культур
Определение состава соединений, выделенных из лиофилтированной
культуры Escherichia ColL В качестве объекта исследования нами был выбран лиофилизированный пламм кишечной палочки К-12 HfrH thi, выращенный на среде Гловера, которая содержала значительное количество глюкозы. Клеточные оболочки были предварительно разрушены замораживанием в жидком азоте. Для определения гидрофобных соединений проводили экстракцию пиридином (с последующей конверсией в ТМС производные), а для определения аминокислот - водную экстракцию и дериватизацию ИБХФ.
В выбранных оптимальных условиях в соответствии с предложенной методологией нами были приготовлены и продериватизированы образцы лиофилизатов. Исследование показало, что полученные экстракты представляли собой очень сложные смеси, в которых концентрации компонентов отличались на порядки. Основную массу выделенных соединений, как было установлено масс-спектрометрически, представляли собой производные различных Сахаров, причем из-за большого их количества занимаемый ими интервал времен удерживания был очень широк, что не позволяло провести достоверное качественное определение совместно элюирующихся микрокомпонентов. В табл. 3 приведен список веществ, идентифицированных в образце лиофилизата, и оценка их содержания (% в пробе).
Таблица 3. Соединения, идентифицированные в образце лиофилизата Е. Coli после экстракции пиридином и дериватизации БСТФА, и оценка их содержания (Sr ^ 0.20)
; Л' Соединение,- Оценка-'. . содержания? ЙЬ- ;* Соединение! ' J ,' ". Оценка -содержания,.%.
о-Кетопропионовая кислота, 2ТМС б.7х103 ß-Ma ни иг, 6ТМС 1.0x10"
Алании, Ы-ТМС О-ТМС 2 0x10'5 Ö-Фруктоза, 5ТМС 2.4х103
Янтарная кислота, 2ТМС 20x10"' Сорбопираноза, 5ТМС 1.2xlOJ
Яблочная кислота, ЗТМС 2.7x10 э ¿> Мальтоза, 8ТМС 2.0x10"
о-Кетоглутаровая кислота, ЗТМС 1.3x102 О-Тураноза, 7ГМС 6.0x10"
Гексадекановая кислота, ТМС 6.7x10* Лактоза, 8ТМС 1.0x10 2
Октадекановая кислота, ТМС 6.7x10" Мелибиоэа, 8ТМС 5.0x10"
/Малаютва, 5ТМС 1.3x10т1 Норвалин, N-TMC О-ТМС 2.7x10"
Трегалоза, 8ХМС 4.4x10" Фумаровая кислота, 2ТМС 2.7x10"
Ксилоза, 4ТМС 1.0x10" З-Кегоглутаровая кислота, ЗТМС 6.0x10"
Ксилит, 5ТМС 1.0x10" З-Гидроксиглутаровая кислота, ЗТМС 3.3x10"
Талаза, 5ТМС 4.0x10" 2-Гидроксиглутаровая кислота, ЗТМС 4.7X10"
¿-Альтроза, ЗТМС 1.1x10* D-Глюкоза, STMC 1.3x10'
Для оценки содержания использовали метод внешнего стандарта, анализируя смесь производных модельных соединений и сравнивая площади соответствующих пиков. В случае перегруженных пиков проводили дополнительное разбавление реакционной смеси. Идентификацию неизвестных проводили с использованием библиотеки масс-спектральных данных NIST 98. Из табл. 3 видно, что оценка содержания идентифицированных в образце лиофилизата E.Coli соединений составляла l.OxlO"4- 1.3x10"'%.
Для определения состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в образце лиофи-лизата навеску обрабатывали дистиллированной водой, при этом происходило практически полное его растворение. Для того, чтобы достичь максимальной степени извлечения соединений, образец помещали в ультразвуковое поле на 15 мин.
Соединения, идентифицированные в образце после водной экстракции и дериватизации смесью ИБХФ-ИБ, а также оценка их содержания приведены в табл. 4. Соответствующая хроматограмма представлена рис. 1.
'' 'А'1' '¿»
м
4МС7
ЛС Я 2ВЭ5-ОМ
NL
Рис. 1. Хроматограмма, полученная после дериватизации водного экстракта образца лиофилизата Е.СоИ смесью ИБХФ-ИБ
Таблица 4. Соединения, идентифицированные в образце лиофилизата Е. Coli после экстракции водой и дериватизации ИБХФ-ИБ, и оценка их содержания (s, £ 0.20)
'" j i'"'"'' ' с zv * . - .Соединение*; • .................. — „, Оценка« . - • содержания,^ t ,i Соединение.• Г ""Оцеиетг содержания^0/»»
Алании, ИБОК-ИБ 3.0x10"' Лизин, 2ИБОК-ИБ 2.2x10"
Глицин, ИБОК-ИБ 9.1xltTs Триптофан, ИБОК-ИБ 2.3x10т5
Валим, ИБОК-ИБ 5.0x10 J Тирозин, 2И60К-ИБ 5.0x10"
Лейцин, ИБОК-ИБ 4.7x10" ^•Аминоизомасляная кислота, ИБОК-ИБ 4.4x10"
Изолейцин, ИБОК-ИБ l.Oxltr» Иорвалин, ИБОК-ИБ 7-ОхЮ"5
Пролин, ИБОК-ИБ 1.0x1a4 Норлейцин, ИБОК-ИБ 3.1*10"
Аспарагин, ИБОК-ИБ Э.ОхЮ"5 Тетрадекановая кислота, ИБ 1.0x10"
Метионин, ИБОК-ИБ 5.0xl0"5 Гексадекановая кислота, И5 5.2x10"
Треонин, 2ИБОК-ИБ г.ысг1 Октадекановая кислота, ИБ 4.9x10"
Серии, 2ИБОК-ИБ 2.3x1er4 Unci |ра«у9-Октадеценовая кислота, ИБ 4.0xl0rs
Фенилаланин, ИБОК-ИБ 5.2x10"
Как видно из табл. 4, оценка содержания идентифицированных в образце соединений (преимущественно аминокислот) составляла 2.3x10'5 - З.0х10~3%. Следовательно, можно сделать однозначный вывод о целесообразности проведения экстракции водой с последующей дериватизацией экстракта при определении жирных и аминокислот.
Определение состава аминокислот в клетках аденокарциномы и
фибробластов человека. В настоящее время наиболее общепринятым способом диагностики опухолевых тканей является гистологический метод, базирующийся на морфологических различиях нормальных и раковых клеток. Метод является весьма субъективным и имеются литературные данные о невысокой его достоверности. В связи с этим, актуальным является поиск новых подходов к увеличению достоверности диагностики рака на основании изучения особенностей нормальных и раковых клеток. В литературе имеются отрывочные данные, указывающие на пониженное содержание аминокислот в раковых клетках по сравнению с нормальными.
Нами было решено изучить состав аминокислот (а также жирных и дикарбоновых кислот) в клетках аденокарциномы и фибробластах (нормальных клетках соединительной ткани) в соответствии с предложенной методологией. Образцы клеточных культур представляли собой взвеси клеток (вскрытых замораживанием в жидком азоте) в изотоническом растворе.
Аминокислоты, идентифицированные в виде ^изобутоксикарбонил-О-гептафтор-бутиловых эфиров в исследованных образцах физиологически активных клеток аде-нокарциномы {ас +) и фибробластов (/Ь +), а также данные по оценке их содержания
представлены в табл. 5. Кроме этого, в этой таблице приведены расчетные коэффициенты (К), численно равные отношепию абсолютных концентраций аминокислот, обнаруженных в образцах фибробластов и аденокарциномы, соответственно.
Как видно из данных табл. 5, в образцах физиологически активных клеток адено-карциномы и фибробластов было обнаружено 16 аминокислот, однако раковые клетки оказались существенно обеднены аминокислотами по сравнению с фибробла-стами, на что указывают высокие значения коэффициента К Особенно значимое отличие (К > 10) наблюдалось для таких аминокислот, как валин, лейцин, изолейцин, аспарагин, метионин, треонин, фенилаланин, лизин, гистидин, триптофан, тирозин и цистин. Дикарбоновые кислоты обнаружены не были, а количества жирных кислот в обеих пробах существенно не отличались.
Таблица 5. Результаты анализа физиологически активных клеток аденокарциномы и фибробластов на содержание аминокислот
;Ам~йн6кислота"%1 Г ^ ;- Оцек"касочержания,.%'.V _
Алании, ИБОК-ГФБ 3.2х1(Г3 1.бх10Т2 50
Глицин, ИБОК-ГФБ 7.6x10' 4.8x10' 0.7
Валин, ИБОК-ГФБ 7.2x10т4 1.2x102 16.9
Лейцин, ИБОК-ГФБ 1.2x10-' 2.7x102 23.2
Изолейцин, ИБОК-ГФБ 4 6Х104 1.5х10тг 31.9
Пролин, ИБОК-ГФБ 5.2x10"' 1,7х10"2 3.3
Аотарагин, ИБОК-ГФБ 3.2x10" 4.0x10' 12 7
Метионин, ИБОК-ГФБ 3.4x10* 1.1x102 31.В
Треонин, 2ИБОК-ГФБ 1-3x10-' 1.3х1(Г2 10.3
Фенилаланин, ИБОК-ГФБ 7.5x1с4 2.1x10-' 279
Серин, 2ИБОК ГФБ 1.8x10-' 1.3х1(Гг 7.5
Лизин, 2ИБОК-ГФБ 1.3x10т' 1.5x10' 11.8
Гистидин, 2ИБОК-ГФБ 1.6x1(1" 4.2x10т' 25.4
Триптофан, ИБОК-ГФБ 1.7x10т4 6.5x10' 381
Тирозин, 2ИБОК-ГФБ 8.2Х104 2.1х10'2 25.7
Цистин, 2ИБОК-2ГФБ 9 7x10' 1.2x10"' 12.8
На рис.2 представлены две хроматограммы, зарегистрированные для образца физиологически активных фибробластов (вверху) и физиологически активных клеток аденокарциномы (внизу) в режиме СИД после соответствующей пробоподготовки.
Рис 2. Хроматограммы, полученные для образца физиологически активных фибробластов (вверху) и клеток аденокарциномы (внизу) в режиме селективного ионного детектирования
Таким образом, полученные данные (см. табл. 5 и рис. 2) позволяют сделать вывод о значимом различии в составе аминокислот как внутри пробы, так и между пробами, что указывает на принципиальную возможность дифференцирования раковых и здоровых клеток. Эти результаты являются предварительными, и в настоящее время продолжаются работы по накоплению экспериментальных данных.
Определение следовых содержаний аминокислот в водных растворах с использованием сорбционного концентрирования
Снижение предела обнаружения аминокислот имеет важное значение, поскольку это может уменьшить как число клеток, поступающих на анализ, так и уровень определяемых в них концентраций. В связи с этим, нами была изучена возможность снижения пределов обнаружения аминокислот в водных растворах.
В качестве модельных соединений были выбраны ИБОК-ГФБ эфиры аминокислот, выделение которых включает стадию экстракции из воды летучим органическим растворителем - хлороформом. Существенное отличие температур кипения хлороформа и ИБОК-ГФБ производных аминокислот, которые являются среднелетучими соединениями позволило предположить, что возможно селективное сорбционное концентрирование из экстракта с последующим переносом всего концентрата производных в ГХ-МС путем термодесорбции.
Основным требованием при выборе сорбента было условие минимальной остаточной сорбции определяемых соединений, что необходимо для обеспечения переноса ультрамалых количеств изучаемых веществ, и химической инертности по отношению к компонентам реакционной смеси. Этим требованиям, как показали наши исследования, в наилучшей степени удовлетворяло сверхтонкое кварцевое волокно (СКВ), обладающее развитой поверхностью, обеспечивающей селективную сорбцию, и исключительной термостабильностью.
Для отработки условий термодесорбции ультранизких количеств ИБОК-ГФБ производных аминокислот 1 мкл раствора с минимальной концентрацией по веществу их Ю"10г наносили (при комнатной температуре) на слой СКВ, помещенного во вкладыш инжектора хроматографа, после чего растворитель удаляли в потоке гелия (вне хроматографа). После этого вкладыш помещали в инжектор хроматографа, находящийся при 50°С, и нагревали его. Варьируя условия термодесорбции (конечную температуру инжектора, скорость потока газа-носителя при термодесорбции и время термодесорбции), экспериментально были выбраны следующие условия, обеспечивающие количественный перенос следовых количеств ИБОК-ГФБ производных аминокислот с сорбента в колонку: температура инжектора- 300°С (время термодесорбции - 10 мин); скорость потока газа-носителя через колонку во время термодесорбции - 3 мл/мин. Для обеспечения фокусировки производных аминокислот на начальном участке колонки ее температуру при термодесорбции поддерживали равной 40°С. Для оценки степени переноса изучаемых соединений с сорбента площади пиков на хроматограмме сравнивали с соответствующими площадями, полученными при обычном вводе 1 мкл того же раствора в ГХ-МС.
С целью изучения возможности сорбционного концентрирования ИБОК-ГФБ-производных аминокислот на СКВ из больших по объему проб экстрактов исходный раствор соответствующих производных был разбавлен в 10 и 100 раз хлороформом. Далее, 10 либо 100 мкл раствора, разбавленного 1:10 (1:100), наносили на СКВ и затем удаляли растворитель в потоке гелия (50мл/мин) в течепие 5-10 мин (в зависимости от объема пробы) вне хроматографической системы. После этого проводили термодесорбцию, как описано выше. Для оценки степени переноса в этом случае площади пиков на хроматограмме сравнивали с соответствующими площадями, полученными при обычном вводе 1мкл исходного (неразбавленного) раствора в ГХ-МС.
В табл. 6 представлены сводные данные по степеням переноса ИБОК-ГФБ производных аминокислот, полученные при нанесении на сорбент 1, 10 и 100мкл соответствующих растворов, содержащих одни и те же количества определяемых веществ удалении растворителя и последующей термодесорбции в ГХ-МС.
Таблица 6. Степени переноса* следовых количеств ИБОК-ГФБ производных аминокислот с сорбента в капиллярную колонку (.гг< 0.15, п = 5)
"*- 1 Г*—""Г"'" " ------^--' ' Ч Ч -* у, ч Аминокислота« ' - ...—Степень-переноса,"/о^"*__.1 ,,
1МЮГ* ' " ■ 1 10>1кя«;, : ш> мкл 1 • *;
Алании, ИБОК-ГФБ 102 105 100
Глицин, ИБОК-ГФБ 95 96 94
Валин, ИБОК-ГФБ 97 99 95
Лейцин, ИБОК-ГФБ 99 97 96
Изолейцин, ИБОК-ГФБ 98 94 96
Пролин, ИБОК-ГФБ 100 97 99
Асларагин, ИБОК-ГФБ 103 100 98
Метионин, ИБОК-ГФБ 93 95 92
Треонин, 2ИБОК-ГФБ 89 90 85
Фенилаланин, ИБОК-ГФБ 97 99 95
Серин, 2ИБОК-ГФБ 85 83 81
Лизин, 2ИБОК-ГФБ 82 81 80
Гистидин, 2ИБОК-ГФБ 80 82 80
Триптофан, ИБОК-ГФБ 95 97 , 94
Тирозин, 2ИБОК-ГФБ 98 95 96
Цистин, 2ИБОК-2ГФ6 90 87 91
степень переносаучитывает и степень извлечения из раствора
Как видно из табл. 6, степени переноса являлись количественными и независимо от объема раствора составляли 80-105%. Меньшие значения наблюдали для производных алифатических гидроксиаминокислот, а также труднодериватизируемых лизина, гистидина и цистина.
Таким образом, предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата. По сравнению с общепринятым подходом, этот способ позволяет снизить пределы обнаружения по меньшей мере на 2 порядка.
Выводы
1. Изучены условия силилирования следовых количеств 60 различных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов в органических растворах с использованием гексаметиддисилазана, N,0-6to-(триметилсилил)трифторацетамида и №метил^-третбутиддиметилсилилгриф-торацетамида и различных растворителей; показаны преимущества и ограничения каждого из способов дериватизации, установлены оптимальные условия дериватизации и определения изученных соединений при их совместном присутствии в смеси.
2. Изучены условия этерификации / ацилирования аминокислот, жирных, дикарбоно-вых и ряда других органических кислот в водно-органических растворах с использованием изобутилхлорформиата в сочетании с изобутанолом и гептафторбутано-лом, и выбраны оптимальные условия этерификации и ацилирования.
3. Изучены масс-спектры электронной и химической ионизации ТМС, ТБДМС, ИБОК-ИБ, ИБОК-ГФБ, ИБ и ГФБ производных, и оценены пределы детектирования в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые составили 2.0х10"12- 3.4* 10"9 г и
в пробе, соответственно (в зависимости от соединения и способа ионизации); впервые представлены масс-спектры электронной ионизации ИБОК-ИБ и ИБОК-ГФБ производных аминокислот, а также ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот.
4. Предложена методология определения следовых содержаний жирных, дикарбоно-вых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси, основанная на обработке одной части образца смесью БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесью ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующим ГХ-МС анализом соответствующих производных.
5. При использовании разработанной методологии определен состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией пиридином и водой из лиофилизированной культуры Е. Coli, и проведена оценка их содержания.
6. В экспериментально выбранных условиях определен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов, и показана возможность увеличения достоверности дифференциации этих клеток, основанной на установленном различии в составе аминокислот.
7. Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по меньшей мере на 2 порядка.
Список публикаций по теме диссертации
1. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, LA. Revelsky, В. Miller, V. Oriedo. Electron ionization mass spectra ofN(0, 5-isobutoxycarbonyl isobutyl esters of amino acids // Eur. J. Mass Spectrom. 2002.8. P. 447-449.
2. T.G. Sobolevsky, E.S. Chernetsova, A.I. Revelsky, IA. Revelsky, A.B. Starostin, B. Miller, V. Oriedo. Electron ionization mass spectra and their reproducibility for trialkylsilylated derivatives of organic acids, sugars and alcohols // Eur. J. Mass Spectxora. 2003.9. P. 487- 495.
3. IA. Revelsky, Yu.S. Yashin, T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo. Electron ionization and atmospheric pressure photochemical ionization in gas chromatography-mass spectrometry analysis of amino acids // Eur. J. Mass Spectrom. 2003. 9. P. 497- 507.
4. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo, E.S. Chernetsova, IA. Revelsky. Comparison of silylation and esterification / acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids // J. Sep. Sci. 2003.26. No. 17. P. 1474-1478.
5. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, IA. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo. Simultaneous determination of fatty, dicarboxylic and amino acids based on derivatization with isobutyl chloroformate followed by gas chromatography - positive ion chemical ionization mass spectrometry // J. Chromatogr. B. 2004.800. No. 1-2. P. 101-107.
6. A.I. Revelsky, T.G. Sobolevsky, LA. Revelsky, I.N. Glazkov, MA. Gruzdeva. Off-line large sample injection and its perspectives in GC and GC-MS analysis. // Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy, Новый Орлеан, Луизиана, США, март 2000.1826Р.
7. T.G. Sobolevsky, A.Yu. Gurianov, A.I. Revelsky. Sorption concentrating of impurities traces from organic solutions and their solventless analysis using GC and GC-MS // 24th International Symposium on Chromatography, Лейпциг, Германия, сентябрь 2002. SAMP-022.
8. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, N.Yu. Anisimova, T.S. Odaryuk, M.V. Kiselevsky, IA. Revelsky, B. Miller. Cancer vs. healthy human cells: the profiling of amino acids as isobutoxycarbonyl heptafluorobutyl esters by GC-MS El // 8th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography, Брюгге, Бельгия, февраль 2004. PI08.
Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ревельский Игорь Александрович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич
кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Бродский Ефим Соломонович
Ведущая организация: Институт физической химии РАН, г. Москва
Защита состоится 21 апреля 2004 года в 16 ч. 10 мин. в ауд. 344 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы д. 1 стр. 3, МГУ, Химический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан марта 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
Торочешникова И.И
Р1047 9
список сокращений. введение.
глава 1. методы полумения летучих производных аминокислот, различных органических кислот и сахаров (литературный обзор).
1.1. Газохроматографический анализ аминокислот.
1.2. Газохроматографический анализ жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, сахаров и родственных соединений.
глава 2. оборудование, исходные вещества и методика эксперимента.
2.1. Оборудование.
2.2. Исходные вещества и материалы.
2.3. Методика эксперимента.
2.3.1. Приготовление растворов модельных соединений.
2.3.2. Дериватизация аминокислот с использованием гексаметилдисилазана
2.3.3. Дериватизация модельных соединений с использованием N.O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и Ь/-метил-Ь/третбутилдиметилсилилтрифторацетамида.
2.3.4. Дериватизация аминокислот с использованием изобутилхлорформиата
2.3.5. Дериватизация жирных и дикарбоновых кислот с использованием изобутилхлорформиата.
2.3.6. Приготовление лиофилизированных препаратов культуральной жидкости с клетками бактерий Escherichia Coli.
2.3.7. Приготовление клеточных культур фибробластов и аденокарциномы прямой кишки человека.
2.3.8. Экстракция из лиофилизата Escherichia Coli.
2.3.9. Дериватизация экстрактов из реальных образцов.
2.3.10. Газохроматографическое определение продуктов дериватизации.
2.3.11. Масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации
глава 3. дериватизация модельных соединений и оптимизация условий гх-мс определения летучих производных.
3.1. Оптимизация условий газохроматографического определения.
3.2. Силилировлние жирных, дикарбоновых, гидрокси-, okco- и аминокислот. сахаров, спиртов и стеролов.
3.2.1. Дериватизация гексаметилдисилазаном.
3.2.2. Дериватизация МО-бис(триметилсилил)трифторацетамидом.
3.2.3. Дериватизация аминокислот М-метил-Nтретбув 1лдиметилсилилтрифторацетамидом.
3.3. э1ерификация и ацилирование жирных, дикарбоновых и аминокислот.
3.3.1. Дериватизация изобутилхлорформиатом.
глава 4. хромато-масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации изучаемых соединений.
4.1. Электронная ионизация.
4.1.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования.
4.1.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования.
4.2. Химическая ионизация.
4.2.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров гидрокси-, оксокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования.
4.2.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования.
глава 5. изучение состава соединений, выделенных из клеточных культур
5.1. Определение состава соединений, выделенных из аиофиаизированной культуры Escherichia Сои.
5.2. Определение состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в клетках аденокарциномы и фибробллстов человека.
глава 6. определение следовых содержаний аминокислот в водных растворах.
6.1. Изучение возможности сорбционного концентрирования следовых количеств изобутоксикарбонильных производных аминокислот из органического раствора и ГХмс анализа всего концентрата.
Актуальность темы. В настоящее время dcc чаще возникает необходимость высокоселектпвного и высокочувствительного определения состава таких биологически важных соединении, как ампиокислоты, органические кислоты и сахара, в различных объектах. Подобные исследования проводятся при диагностике различных заболеваний, в том числе врожденных. Состав органических кислот и Сахаров - один из показателен качества пищевой продукции и различных напитков. Микробиологические исследования также требуют определения состава этих классов соединении па ультрапизком уровне.
При определении таких соединении в ряде случаев используется жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез, поскольку эти методы позволяют проводить определение указанных соединений напрямую (после предварительной очистки пробы). Однако пределы обнаружения (за исключением ВЭЖХ с амперометричеекпм детектированием), достигаемые в этом случае, сравнительно высоки, а в качестве элюепта необходимо использование органических растворителей высокой степени чистоты. Следует отметить также, что сочетание этих методов с масс-спектрометрией до сих пор находит лишь ограниченное применение, при этом пределы обнаружения существенно выше, чем в случае использования реакционной хромато-масс-спсктрометрнн. Кроме этого, жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез не позволяют проводить определение соединений различных классов при их совместном присутствии в смеси.
Газовая хроматография находит более широкое применение в анализе указанных соединений, и, как правило, определение проводят с использованием пламеппо-ионизационного детектора. Поскольку рассматриваемые соединения, как правило, не подлежат прямому газохроматографическому анализу, необходимо проведение иредколопочиой дериватизации для переведения таких соединений в соответствующие летучие производные. В существующих публикациях, посвященных газохроматографическому определению соединений этих классов, уропепь рабочих концентраций составляет обычно 10"' - KTVo, и в подавляющем болыиннстис случаен не проводится определение всех рассматриваемых соединений при их совместном присутствии в смеси (или же определяют лишь несколько представителей каждого класса). Кроме того, наблюдается значительная противоречивость данных по условиям получения различных производных рассматриваемых классов соединений.
В настоящее время панболее часто используется два основных метода получения летучих производных вышеуказанных соединений: силилироваиие мреже - этернфикацпя (ацплироваинс) различными реагентами, в том числе ал-килхлорформиатами. Данные но условиям проведения реакции силилирования зачастую противоречивы - разные авторы предлагают различные температурные режимы проведения реакции, время дериватизацнп и используют разные растворители. Результаты, полученные разными авторами в эквивалентных условиях, также отличаются. Второй тип реагентов (различные алкилхлорфор-мнаты) сравнительно недавно получил применение для дериватизацни аминокислот и жирных кислот. Основным достоинством данного тина реагентов является то, что реакция протекает практически мгновенно в водно-оргаиичсской среде при комнатной температуре, хотя выход (степень конверсии) очень сильно зависит от выбранного алкнлхлорформната и вспомогательного реагента (спирта). Эта реакция все еще мало изучена в анализе жирных, дикарбо-иовых и гидроксикислот. Нет публикаций, и которых происходило бы одновременное определение амнио-, жирных, дикарбоповых и гидроксикислот и Сахаров в одной пробе.
Применимость некоторых описанных в литературе методов получения летучих производных показана только на модельных смесях соединений, а не на реальных объектах, хотя ясно, что матрица может оказывать настолько сильное мешающее влияние, что ни о каком не только количественном, но и качественном установлении состава не может быть и речи. Также в литературе совершенно не рассматривается применение концентрирования при определении изучаемых соединений. Как правило, только малая часть реакционной смеси, полученной после дериватизацни, подвергается анализу (1-2 мкл из 0.5-1 avi копечного экстракта), что приводит к значительному повышению пределов обнаружения, н не позволяет в полной мере раскрыть возможности, предоставляемые современным аналитическим оборудованием.
Необходимо отметить псмиогочпсленность работ но использованию реакционной хромато-масс-спектрометрии для анализа отдельных групп соединений, относящихся к рассматриваемым классам, хотя она является более высокочувствительным и, в большинстве случаев - высокоселективиым методом. Кроме того, масс-снектры летучих производных регистрируют для относительно больших количеств веществ, хотя известно, что общий вид масс-спектра зависит от концентрации, н чем ниже концентрация, тем больше масс-спектр может отличаться от библиотечного.
Цели и задачи исследования. Цслыо данной работы являлась разработка способа определения жирных, дикарбоповых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов в водных и органических растворах (экстрактах) при их совместном присутствии в смеси на уровне следовых концентраций методом реакционной хромато-масс-спсктрометрип и снижения пределов обнаружения за счет использования сорбциоиного концентрирования из органического раствора (экстракта) с последующим анализом всего концентрата.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить закономерности силнлнровапия различных жирных, дикарбоповых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов в органических растворах с использованием гексаметилдисилазапа (ГМДС), N,0-бнс(триметилсилил)грифторацетамида (БСТФА), УУ-метил-ТУ-третбутил-димстилсилилтрифторацетамнда (МТБСТФА) и различных растворителей, и выбрать условия ГХ-МС определения соответствующих тримс-тилсилильпых (ТМС) и третбугилдиметилсилильиых (ТБДМС) производных;
- изучить масс-спектры электронной (ЭИ) и химической (ХИ) ионизации для различных количеств этих производных и пронести оценку пределов детектирования в режиме регистрации полного ионного тока и селективного ионного детектирования;
- разработать методологию определения жирных, днкарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов п стеролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов методом реакционной ГХ-МС;
- изучить условия дериватизации в водпо-оргаппчсском растворе для аминокислот, жирных, дикарбоновых и других органических кислот с помощью реакции этерифпкации - ацилирования (реагент - нзобутилхлорформиат, ИБХФ) и разработать условия ГХ-МС определения получающихся производных;
- изучить масс-спектры ЭИ н ХИ для различных количеств соответствующих изобутоксикарбонильных производных и алкиловых эфиров и оценить пределы детектирования;
- изучить состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией из лиофнлизнрованпой культуры Е. Coli (после дериватизации);
- изучить состав жирных, дикарбоновых и аминокислот, выделенных из клеточных культур адснокарципомы прямой кишки человека и фиброб-ластов (после дериватизации), и возможность дифференциации этих типов клеток;
- разработать способ определения следовых количеств аминокислот в водном растворе, основанный на получении //-изобутоксикарбопил-О-гептаф-торбутиловых (ИБОК-ГФБ) производных, их экстракции хлороформом, сорбциоппом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата.
Научная иоптпа. В работе изучены условия дериватизации широкого круга веществ (всего 60 соединении), принадлежащим к классам аминокислот, жирных, дикарбоновых, гидрокси- и оксокпслот, а также Сахаров, спиртов и стеролов с использованием следующих реагентов: ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ. Показаны преимущества и недостатки каждого способа получения летучих производных п установлены оптимальные условия дериватизации и определения изученных веществ при их совместном присутствии.
Для всех производных изучены масс-спектры ЭИ для различных количеств веществ. Получены масс-спектры ЭИ ТМС производных ряда органических кислот, Сахаров и стеролов, отсутствующие в библиотеке масс-спектральных данных NIST98. Впервые представлены масс-спектры ЭИ TV-изобуток-сикарбоиил-О-нзобутиловых и Л^-нзобутокснкарбоиил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также гептафгорбутиловых эфнров жирных и дикарбоновых кислот. Установлены пределы детектирования всех соответствующих производных в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые
Q п о м составили 2.5x10" -2.0x10 г и 1.4x10 - 1.0x10 г в пробе (в зависимости от соединения и типа производных).
В режиме ХИ положительных ионов изучены масс-спектры ТМС производных гидрокси- и оксокислот, стеролов и Сахаров; TV-изобутоксикарбонил-О-нзобутнловых н //-изобутокснкарбоиил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также изобутиловых и гепгафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот. Показано, что пределы детектирования всех изученных производных составляли 3.4х10'9 - 5.0х10"12г в режиме регистрации полного
Q п ионного тока (по масс-хроматограмме) и 1.0x10 - 1.0x10 г в случае селективного ионного детектирования (в зависимости от соединения и типа производных).
Предложена методология определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси па уровне следов, основанная на обработке одной части образца смесыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесыо ИБХФ с гептафторбутаполом в водно-органическом растворе. При этом в первом случае в виде ТМС производных определяются все классы соединений, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоиовыс и короткоцеиные гидрокси- и оксокислоты.
Па основании проведенных исследовании установлен состав свободных аминокислот, а также других органических кислот и Сахаров в лиофилизи-рованпой культуре клеток Е. Coli (штамм К-12 HfrH thi).
Проведено исследование состава жирных, дпкарбоиовых и аминокислот в суспензии клеток адснокарципомы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность дифференциации этих типов клеток на основании различия в составе аминокислот.
Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбциониом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мерс на 2 порядка.
Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решать задачи определения следовых концентрации широкого круга веществ в водных н органических растворах при их совместном присутствии. Изученные закономерности дернватпзацпп соединений различных классов позволяют выбрать наиболее подходящий реагент и условия проведения реакции в зависимости от цели и задач исследования, а также предполагаемого состава смеси.
Масс-спектры ЭИ и ХИ, полученные для различных производных всех изученных соединений, позволяют увеличить селективность определения и дополнительно снизить пределы детектирования при использовании селективного ионного детектирования.
Масс-спектры ЭИ соединений, отсутствующих в библиотеке масс-спек-тральных данных NIST 98, позволяют увеличить достоверность идентификации, что особенно важно в анализе аминокислот в виде изобутоксикар-бопильпых производных.
Разработанная методология анализа микробиологических образцов позволяет проводить высокочувствительное и селективное определение широкого круга соединений в указанных объектах.
Предложенный способ определения аминокислот в раковых клетках и фнбробластах позволяет увеличить достоверность дифференциации раковых и здоровых клеток.
Разработанный способ сорбциониого концентрирования из органических растворов обеспечивает возможность снижения пределов обнаружения по крайней мере на 2 порядка благодаря ГХ-МС анализу всего концентрата. На защиту выносятся:
- оптимизированные условия дерпватпзацнн соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоиовых, гидроксн-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов с использованием таких реагентов, как ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ;
- масс-спектры ЭИ ТМС производных различных органических кислот, Сахаров, спиртов и стеролов, а также Л'-изобутоксикарбонил-О-изобутиловых, Л^изобутоксикарбоипл-О-гснтафторбутнловых эфиров аминокислот, пзобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования;
- масс-спектры ХИ положительных ионов ТМС производных гидрокси- и оксокислот, спиртов, Сахаров и стеролов, TV-изобутоксикарбопил-О-изо-бутиловых и TV-изобутоксикарбонил-О-гсптафторбутиловых эфиров аминокислот, изобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования;
- методология определения жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смссн, основанная на обработке одной части образца смссыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смссыо ИБХФ с геитафторбутанолом в водпо-оргаиичсском растворе;
- результаты определения состава соединении изученных классов, выделенных экстракцией из лиофилнзироваиной клеточной культуры Е. Coli;
- способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный па определении различия в составе аминокислот методом реакционной ГХ-МС;
- способ определения аминокислот в водном растворе, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании производных и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере па 2 порядка. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены па
Питтсбургскон копфереицмп по аналитической химии и прикладной спектроскопии (12-17 марта 2000 г., Новый Орлеан, Луизиана, США), 24-м Международном симпозиуме но хроматографии (15-20 сентября 2002 г., Лейпциг, Германия), и 8-м Международном симпозиуме по гибридным методам в хроматографии (4-6 февраля 2004 г., Брюгге, Бельгия).
Публикации. По материалам работы опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.
Выводы
1. Изучены условия силилнрования следовых количеств 60 различных жирных, дикарбоновых, гндрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов в органических растворах с использованием гсксаметилдисилазана, N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамида и уУ-метил-уУ-третбутилдиметилси-лилтрифторацетамида и различных растворителей; показаны преимущества и ограничения каждого из способов дериватизацни, установлены оптимальные условия дериватизацни и определения изученных соединений при их совместном присутствии в смеси.
2. Изучены условия этерификации / ацилирования аминокислот, жирных, дикарбоновых и ряда других органических кислот в водно-органических растворах с использованием изобутнлхлорформната в сочетании с изобута-полом и гептафторбутаполом, и выбраны оптимальные условия проведения этой реакции.
3. Изучены масс-спектры электронной и химической ионизации ТМС, ТБДМС, ИБОК-ИБ, ИБОК-ГФБ, ИБ и ГФБ производных, и оценены пределы детектирования в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые составили 2.0x10'12- 3.4x10'9г и 1.0x10'12- 1.4x10"9г в пробе, соответственно (в зависимости от соединения и способа ионизации); впервые представлены Macc-cneicipbi электронной ионизации ИБОК-ИБ и ИБОК-ГФБ производных аминокислот, а также ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот.
4. Предложена методология определения следовых содержаний жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси, основанная на обработке одной части образца смесыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесыо ИБХФ с гептафторбутаполом в водио-органическом растворе.
5. При использовании разработанной методологии определен состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией ннрндпном н водой нз лнофнлизнропанной культуры Е. Coli, и проведена оценка их содержания.
6. В экспериментально выбранных условиях определен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток адепокарциномы прямой кишки человека и фибробластов, и показана возможность увеличения достоверности дифференциации этих клеток, основанной на установленном различии в составе аминокислот.
7. Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбцнопном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по меньшей мере на 2 порядка.
Заключение
В результате проведенного исследования изучены условия получения летучих производных широкого круга соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, стеролов и спиртов (всего 60 веществ) с использованием таких реагентов как гексаметилднсилазаи, //,0-бис(триметилсилнл)трифторацетамид, //-метнл-//-третбутилднметиленлилтрифторацетамид и изобутилхлорформиат (в сочетании с изобутанолом и гептафторбутанолом). Показаны достоинства и недостатки каждого реагента, области их применения в газохроматографическом анализе, и приведены рекомендации по выбору того или иного реагента в зависимости от поставленной задачи.
В работе получены масс-спектры различных летучих производных изученных соединений в режиме электронной и химической ионизации, причем для многих производных масс-спсктры были зарегистрированы и описаны впервые. Очевидно, что без знания характеристичных ионов и их интенсив-постей невозможна достоверная идентификация, а также высокочувствительное и высокоселектпвное определение того или иного соединения. Оценка пределов детектирования для производных соединений указанных классов была проведена в режиме регистрации полного ионного тока (но масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования. Показано, что пределы детектирования для изученных классов соединений составляют
19 q примерно от 1.0x10" до 1.0x10" г в зависимости от вещества, способа ионизации н детектирования. Эта информация является полезной при выборе реагента для дериватизации и способа ионизации, поскольку от этого во многом зависит чувствительность и селективность определения.
На основании проведенных исследований предложена комплексная методология анализа жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси иа уровне следов. Она подразумевает обработку одной части образца смесью пиридина и БСТФА (после высушивания), а другой — смесыо ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующим ГХ-МС анализом соответствующих продуктов дериватизации. При этом в нервом случае в виде ТМС производных определяются все классы соединений, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоновые и короткоцениые гидрокси- и оксокислоты.
При использовании предложенной методологии был определен состав жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров в лиофилизированпой культуре Escherichia Coli. Кроме этого, был изучен состав жирных, дикарбоиовых и аминокислот в клетках аденокарципомы прямой кишки человека и фибробластах. Показано, что физиологически активные клетки аденокарципомы существенно отличаются по аминокислотному составу от здоровых клеток. Это открывает перспективы более достоверного дифференцирования раковых и здоровых клеток в дополнение к существующим традиционным гистологическим методам исследования и определению высокомолекулярных веществ-признаков онкологических заболеваний.
Разработан способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбцноппом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата. Этот способ позволяет снизить концентрационные пределы обнаружения соответствующих производных аминокислот (а также - потенциально - алкиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот) по меньшей мере на 2 порядка. Кроме этого, было показано, что ввод пробы без растворителя существенно снижает фон от неподвижной фазы капиллярной колонки и обеспечивает в ряде случаев получение более узких и симметричных пиков.
1. Т.М. Larson, М. Gawlitzek, II. Evans, U. Albcrs, J. Cacia. Chemometric Evaluation of On-Line High-Pressure Liquid Chromatography in Mammalian Cell Cultures: Analysis of Amino Acids and Glucose // Biotechnol. Bioeng. 2002. 77. 5. P. 553-563.
2. K. Blau, G. King. Handbook of Derivatives for Chromatography / Heyden: London, 1978.
3. R.W. Zumwalt, D. Roach, C.W. Gchrke. Gas-Liquid Chromatography of Amino Acids In Biological Substances//J. Chromatogr. 1970. 53. P. 171-193.
4. R.W. Zumwalt, K. Kuo, C.W. Gehrke. A Nanogram and Picogram Method for Amino Acid Analysis by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1971. 57. P. 193-208.
5. C. Deng, C. Shang, Y. Ни, X. Zhang. Rapid Diagnosis of Phenylketonuria and Other Aminoacidemias by Quantitative Analysis of Amino Acids in Neonatal Blood Spots by Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 2002. 775. P. 115-120.
6. P. Dallakian, II. Budzikievvicz. Gas Chromatography Chemical Ionization Mass Spectrometry in Amino Acid Analysis of Pyoverdins // J. Chromatogr. A. 1997. 787. P. 195-203.
7. C.W. Gehrke, II. Nakamoto, R.W. Zumwalt. Gas-Liquid Chromatography of Protein Amino Acid Trimethylsilyl Derivatives // J. Chromatogr. 1969. 45. P. 24-51.
8. C.W. Gehrke, K. Leimer. Trimethylsilylation of Amino Acids. Derivatization and Chromatography //J. Chromatogr. 1971. 57. P. 219-238.
9. C.W. Gehrkc, К. Lcimcr. Trimcthylsilylation of Amino Acids. Effect of Solvents on Derivatization Using Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide // J. Chromatogr. 1970. 53. P. 201-208.
10. I. Matsumoto, T. Kuhara. A New Chemical Diagnostic Method for Inborn Errors of Metabolism by Mass Spectrometry Rapid, Practical, and Simultaneous Urinary Metabolites Analysis // Mass. Spectrom. Rev. 1996. 15. P. 43-57.
11. S.L. MacKenzic, D. Tenaschuk, G. Fortier. Analysis of Amino Acids by Gas-Liquid Chromatography as /er/.-Butyldimcthylsilyl Derivatives. Preparation of Derivatives in a Single Reaction//J. Chromatogr. 1987. 387. P. 241-253.
12. I. Starke, E. Kleinpeter, B. Kamm. Separation, Identification, and Quantification of Amino Acids in L-Lysine Fermentation Potato Juices by Gas Chromatography Mass Spectrometry // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. 371. P. 380-384.
13. P. Simek, A. Hcydova, A. Jegorov. High Resolution Capillary Gas Chromatography Mass Spectrometry of Protein and Non-Protein Amino Acids, Amino Alcohols, and Hydroxycarboxylic Acids as their tert.
14. Butyldimethylsilyl Derivatives//J. High Resolut. Chromatogr. 1994. 17. P. 145152.
15. Zs.F. Katona, P. Sass, I. Molnar-Perl. Simultaneous Determination of Sugars, Acids and Amino Acids in Apricots by Gas Chromatography Mass Spectrometry//:. Chromatogr. A. 1999. 847. P. 91-102.
16. P. Ilusck. Simultaneous Profile Analysis of Plasma Amino and Organic Acids by Capillary Gas Chromatography //J. Chromatogr. B. 1995. 669. P. 352-357.
17. P. Ilusck. Chloroformates in Gas Chromatography as General Purpose Derivatizing Agents//J. Chromatogr. B. 1998. 717. P. 57-91.
18. P. Ilusck, P. Matucha, A. Vrankova, P. Simek. Simple Plasma Work-up for a Fast Chromatographic Analysis of Homocysteine, Cysteine, Methionine and Aromatic Amino Acids // J. Chromatogr. B. 2003. 789. P. 311-322.
19. P. Musek. Rapid Derivatization and Gas Chromatographic Determination of Amino Acids//J. Chromatogr. 1991. 552. P. 289-299.
20. S. Matsumura, II. Kataoka, M. Makita. Determination of Amino Acids in Human Scrum by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1996. 681. P. 375-380.
21. II. Kataoka, S. Matsumura, II. Koizumi, M. Makita. Rapid and Simultaneous Analysis of Protein and Non-Protein Amino Acids as N(0,S)-Isobutoxycarbonyl Methyl Ester Derivatives by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 167-173.
22. A.P. Vonderheide, M. Montcs-Bayon, J.A. Caruso. Solid-Phase Microextraction as a Sample Preparation Strategy for the Analysis of Seleno Amino Acids by Gas Chromatography Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry // Analyst. 2002. 127. P. 49-53.
23. S. Casal, M.B. Olivcira, М.Л. Fcrreira. Gas Chromatographic Quantification of Amino Acid Enantiomcrs in Food Matrices by their A^O.Sj-Ethoxycarbonyl Ileptafluorobutyl Ester Derivatives // J. Chromatogr. A. 2000. 866. P. 221-230.
24. I. Abe, N. Fujimoto, T. Nishiyama, K. Terada, T. Nakahara. Rapid Analysis of Amino Acid Enantiomers by Chiral-Phase Capillary Gas Chromatography 11 J. Chromatogr. A. 1996. 722. P. 221-227.
25. P. Cao, M. Moini. Quantitative Analysis of Fluorinatcd Ethylchloroformate Derivatives of Non-Protein Amino Acids Using Positive and Negative Chemical Ionization Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1995. 710. P. 303-308.
26. A. Namcra, M. Yashiki, M. Nishida, T. Kojima. Direct Extract Derivatization for Determination of Amino Acids in Human Urine by Gas Chromatography and Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 2002. 776. P. 49-55.
27. K.-R. Kim, J.-H. Kim, C.-H. Oh, T.J. Mabry. Capillary Gas Chromatography of Protein Amino Acids as N(0,S)-isobutoxycarbonyl tert.-Butyldimethylsilyl Derivatives in Aqueous Samples // J. Chromatogr. 1992. 605. P. 241-249.
28. K.-R. Kim, J.-II. Kim, E. Cheong, C. Jcong. Gas Chromatographic Amino Acid Profiling of Wine Samples for Pattern Recognition // J. Chromatogr. A. 1996. 722. P. 303-309.
29. C. Rodicr, R. Sternberg, F. Raulin, C. Vidal-Madjar. Chemical Derivatization of Amino Acids for In Situ Analysis of Martian Samples by Gas Chromatography //J. Chromatogr. A. 2001. 915. P. 199-207.
30. M.W. Duncan, A. Poljak. Amino Acid Analysis of Peptides and Proteins on the Femtomole Scale by Gas Chromatography Mass Spectrometry // Anal. Chem. 1998. 70. 5. P. 890-896.
31. M. Murase, Y. Kimura, Y. Nagata. Determination of Portal Short-Chain Fatty Acids in Rats Fed Various Dietary Fibers by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1995. 664. P. 415-420.
32. G. Manni, F. Caron. Calibration and Determination of Volatile Fatty Acids in Waste Leachatcs by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. 690. P. 237-242.
33. L.K. Ng. Analysis by Gas Chromatography Mass Spectrometry of Fatty Acids and Esters in Alcoholic Beverages and Tobaccos // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 309-318.
34. T. Seppancn-Laakso, I. Laakso, R. Hiltunen. Analysis of Fatty Acids by Gas Chromatography, and its Relevance to Research on Health and Nutrition // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 39-62.
35. P. Husek, P. Simck, E. Tvrzicka. Simple and Rapid Procedure for the Determination of Individual Free Fatty Acids in Serum // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 433-439.
36. II.-J. dc Geus, I. Aidos, J. dc Boer, J.B. Luten, U.A.Th. Brinkman. Characterization of Fatty Acids in Biological Oil Samples Using Comprehensive
37. Multidimensional Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 2001. 910. P. 95103.
38. D.-S. Lee, B.-S. Noh, S.-Y. Bae, K. Kim. Characterization of Fatty Acids Composition in Vegetable Oils by Gas Chromatography and Chemometrics // Anal. Chim. Acta. 1998. 358. P. 163-175.
39. D.M. Hasselbaink, T.II.M. Roemen, G.J. Van der Vusse. Determination of Long-Chain Fatty Acids in Heart and Skeletal Muscle by Capillary Gas Chromatography // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 351-357.
40. E. Tvrzicka, M. Vccka, B. Stankova, A. Zak. Analysis of Fatty Acids in Plasma Lipoproteins by Gas Chromatography Mass Spectrometry. Quantitative Aspects // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 337-350.
41. T. Rezanka, I I. Rezankova. Characterization of Fatty Acids and Triacylglycerols in Vegetable Oils by Gas Chromatography and Statistical Analysis // Anal. Chim. Acta. 1999. 398. P. 253-261.
42. J.L. Guil, M.E. Torija, J.J. Gimenez, I. Rodriguez. Identification of Fatty Acids in Edible Wild Plants by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1996. 719. P. 229-235.
43. I. Brondz, I. Olsen. Determination of Bound Cellular Fatty Acids in Actinobacillus Actinomycetemcomitans and Haemophilus Aphrophilus by Gas Chromatography and Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. 1984. 308. P. 282-288.
44. О. Daglioglu, М. Tasan, В. Tunccl. Determination of Fatty Acid Composition and Total Trans Fatty Acids of Turkish Biscuits by Capillary Gas-Liquid Chromatography// Eur. Food Res. Technol. 2000. 211. P. 41-44.
45. I. Brondz, II. Nordbo, А.Л. Schcic. Detection of Microbial-Derived Fatty Acids in Carious Dentin by Gas Chromatography and Gas Chromatography Mass Spectrometry//J. Chromatogr. B. 1997. 700. P. 255-260.
46. A.G. Casado, E.J.A. Hernandez, P. Espinosa, J.L. Vilchcz. Determination of Total Fatty Acids (Cg С2г) in Sludges by Gas Chromatography - Mass Spectrometry//J. Chromatogr. A. 1998. 826. P. 49-56.
47. A.L. Henderson, W.-W. Cao, R.-F. Wang, M.-II. Lu, C.E. Cemiglia. The Effect of Food Restriction on the Composition of Intestinal Microflora in Rats // Exp. Gerontol. 1998. 33. 3. P. 239-247.
48. J. Vclasco, O. Berdeaux, G. Marquez-Ruiz, M.C. Dobarganes. Sensitive and Accurate Quantitation of Monocpoxy Fatty Acids in Thermoxidized Oils by Gas-Liquid Chromatography//J. Chromatogr. A. 2002. 982. P. 145-152.
49. H.G. Wahl, A. Chrzanowski, C. Muller, H.M. Liebich, A. Hoffmann. Identification of Furan Fatty Acids in Human Blood Cells and Plasma by Multidimensional Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1995. 697. P. 453-459.
50. M.-J. Paik, K.-O. Lee, II.-S. Shin. Determination of Very-Long-Chain Fatty Acids in Serum by Gas Chromatography Nitrogen-Phosphorous Detection Following Cyanomethylation //J. Chromatogr. B. 1999. 721. P. 3-11.
51. J. Giacometti, С. Milin, N. Wolf. Monitoring the Estcrification of Sorbitol and Fatty Acids by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. 704. P. 535-539.
52. T.P. McGinnis. Quantitative Determination of Fatty and Resin Acids in Kraft: Black Liquors as their Trimcthylsilyl Derivatives by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. 829. P. 235-249.
53. Y. Ghoos, B. Geypcns, M. Hide, P. Rutgeerts, G. Vantrappen. Analysis for Short-Chain Carboxylic Acids in Feces by Gas Chromatography with an Ion-Trap Detector//Anal. Chim. Acta. 1991. 247. P. 223-227.
54. Y.J. Yang, M.H. Choi, M.-J. Paik, II.-R. Yoon, B.C. Chung. Gas Chromatographic Mass Spcctromctric Determination of Plasma Saturated Fatty Acids Using Pentafluorophenyldimcthylsilyl Derivatization // J. Chromatogr. B. 2000. 742. P. 37-76.
55. K.S. Docherty, P.J. Ziemann. On-Line, Inlet-Based Trimethylsilyl Derivatization for Gas Chromatography of Mono- and Dicarboxylic Acids // J. Chromatogr. A. 2001. 921. P. 265-275.
56. J. Giacometti. Determination of Aliphatic Alcohols, Squalene, a-Tocopherol and Sterols in Olive Oils: Direct Method Involving Gas Chromatography of the Unsaponifiable Fraction Following Silylation//Analyst. 2001. 126. P. 472-475.
57. D.L. Chance, K.O. Gerhardt, T.P. Mawhinney. Gas-Liquid Chromatography -Mass Spectrometry of Primary and Secondary Fatty Alcohols and Diols as their tert. -Butyldimethylsilyl Derivatives//J. Chromatogr. A. 1997. 771. P. 191-201.
58. К. Komarck, V. Pitthard, E. Kostrubani£ova, S. Skvarcnina, J. Hoffmann. Capillary Gas Chromatography Mass Spectrometry of Lower Oxycthylenated Aliphatic Alcohols//J. Chromatogr. A. 1997. 773. P. 219-226.
59. B.M. Matthew, C. Anastasio. Determination of Halogenatcd Mono-Alcohols and Diols in Water by Gas Chromatography with Electron Capture Detection // J. Chromatogr. A. 2000. 866. P. 65-77.
60. M. Morvai, I. Molnar-Perl. Simultaneous Determination of Organic Acids and Sugars in Apples by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1990. 520. P. 201-207.
61. M. Morvai, I. Molnar-Perl, D. Knausz. Simultaneous Gas-Liquid Chromatographic Determination of Sugars and Organic Acids as Trimethylsilyl Derivatives in Vegetables and Strawberries // J. Chromatogr. 1991. 552. P. 337344.
62. M. Morvai, I. Molnar-Perl. Simultaneous Gas Chromatographic Quantitation of Sugars and Acids in Citrus Fruits, Pears, Bananas, Grapes, Apples and Tomatoes //Chromatographia. 1992. 34. 9/10. P. 502-504.
63. I. Boldizsar, K. Horvath, Gy. Szcdlay, I. Molnar-Perl. Simultaneous GS-MS Quantitation of Acids and Sugars in the Hydrolyzates of Immunostimulant, Watcr-Soluble Polysaccharides of Basidiomycetes // Chromatographia. 1998. 47. 7/8. P. 413-419.
64. I. Molnar-Perl. Role of Chromatography in the Analysis of Sugars, Carboxylic Acids and Amino Acids in Food // J. Chromatogr. A. 2000. 891. P. 1-32.
65. F. Bartolozzi, G. Bertazza, D. Bassi, G. Cristoferi. Simultaneous Determination of Soluble Sugars and Organic Acids as their Trimcthylsilyl Derivatives in Apricot Fruits by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 99-107.
66. M.A. Adams, Z.-L. Chen, P. Landman, T.D. Colmer. Simultaneous Determination by Capillary Gas Chromatography of Organic Acids, Sugars and Sugar Alcohols in Plant Tissue Extracts as their Trimcthylsilyl Derivatives // Anal. Biochcm. 1999. 266. P. 77-84.
67. K.-R. Kim, J.-II. Kim, D.-II. Jeong, D.-J. Раек, H.M. Liebich. Gas Chromatographic Profiling Analysis of Urinary Organic Acids from Nonsmokers and Smokers //J. Chromatogr. B. 1997. 701. P. 1-8.
68. G.E. Black, A. Fox. Recent Progress in the Analysis of Sugar Monomers from Complex Matrices Using Chromatography in Conjunction with Mass Spectrometry or Stand-Alone Tandem Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1996. 720. P. 51-60.
69. J. Blcton, P. Mejanclle, J. Sansoulet, S. Goursaud, A. Tchapla. Characterization of Neutral Sugars and Uronic Acids after Methanolysis and Trimethylsilylation fro Recognition of Plant Gums //J. Chromatogr. A. 1996. 720. P. 27-49.
70. M. Tetsuo, C. Zhang, H. Matsumoto, I. Matsumoto. Gas Chromatographic -Mass Spectrometric Analysis of Urinary Sugar and Sugar Alcohols During Pregnancy//J. Chromatogr. B. 1999. 731. P. 111-120.
71. W. Amelung, M.V. Cheshire, G. Guggenberger. Determination of Neutral and Acidic Sugars in Soil by Capillary Gas-Liquid Chromatography after Trifluoroacctic Acid Hydrolysis // Soil Biol. Biochem. 1996. 28. 12. P. 16311639.
72. M.-C. Larrc-Larrouy, C. Feller. Determination of Carbohydrates in Two Fcrralitic Soils: Analysis by Capillary Gas Chromatography after Dcrivatization by Silylation// Soil Biol. Biochem. 1997. 29.9/10. P. 1585-1589.
73. H.J. Chaves das Neves, A.M.V. Riscado, H. Frank. Single Derivatives for GC-MS Assay of Reducing Sugars and Selective Detection by the Nitrogen-Phosphorous Detector (NPD) // J. High. Rcsolut. Chromatogr. & Chromatogr. Commun. 1986. 9. P. 662-666.
74. D.L. Chance, K.O. Gcrhardt, T.P. Mavvhinney. Gas-Liquid Chromatography -Mass Spectrometry of Hydroxy Fatty Acids as their Methyl Esters tert.-Butyldimcthylsilyl Ethers//J. Chromatogr. A. 1998. 793. P. 91-98.
75. P. Husek, P. Matucha. Simple Approach for Analysis of Plasma Oxo-, Hydroxy-and Dicarboxylic Acids//J. Chromatogr. B. 1997. 693. P. 499-502.
76. NIST/EPA/NIII Mass Spectral Library. 1998. Gaithersburg, MD, USA.
77. F.W. McLafferty. Interpretation of Mass Spectra / University Science Books: California, 1980.