Пероксидазы хрена и сои для определения фенольных и эндопероксидных соединений в водных, водно-органических средах и гидрофильных ионных жидкостях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

005003055

Поляков Алексей Евгеньевич

ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА И СОИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ И ЭНДОПЕРОКСИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ВОДНЫХ, ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ И ГИДРОФИЛЬНЫХ ионных жидкостях

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

'-1 ДЕК 2011

Москва-2011

005003055

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат химических наук, доцент Мугинова Светлана Валентиновна

доктор химических наук, профессор Евтюгин Геннадий Артурович,

Казанский государственный университет, кафедра аналитической химии

доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич,

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, кафедра химической этимологии

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, г. Москва

Защита состоится 21 декабря 2011 г. в 15 ч. 00 мии. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации размещен на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова: www.chem.msu.rn и на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из актуальных направлений ферментативных методов анализа является разработка подходов к чувствительному, селективному и экспрессному определению ограниченно растворимых или нерастворимых в воде субстратов оксидоредуктаз в водно-органическом и неводном растворах пробы. Эта проблема сегодня стоит наиболее остро для растительных иероксидаз, которые инактивируются в присутствии органических растворителей, особенно полярных. В настоящее время для сохранения нативной структуры пероксидаз и, следовательно, обеспечения эффективного катализа в неблагоприятных для анализа ферментативными методами условиях предложен ряд подходов: иммобилизация биокатализатора на различных носителях, лиофилизация, заключение фермента в полиэлектролитные комплексы и др. Альтернативным является подход, основанный на использовании в качестве среды для проведения ферментативных реакций вместо полярных молекулярных органических растворителей гидрофильных ионных жидкостей (ИЖ) - высокополярных растворителей ионного типа. ИЖ выгодно отличаются от органических растворителей возможностью регулирования их физико-химических свойств варьированием природы катиона и аниона, негорючестью, пренебрежимо малым давлением паров, термической устойчивостью, уникальной растворяющей способностью и др. Изучение пероксидазного катализа в ИЖ началось с конца 90-х гг., однако имеющиеся в литературе сведения отрывочны и порой противоречивы. Для решения вопроса о целесообразности применения гидрофильных ИЖ вместо полярных органических растворителей в реакциях с участием растительных пероксидаз, а также для оценки аналитических перспектив ИЖ в пероксидазном катализе актуальными представляются систематические исследования кинетики превращения одних и тех же субстратов в присутствии растительных пероксидаз и растворителей двух типов (ионного и молекулярного).

Практическая значимость таких исследований возрастет, если при их проведении будут сопоставлены каталитическая активность и субстратная специфичность двух коммерческих растительных пероксидаз: пероксидазы хрена, ИХ (высокоактивного и стабильного фермента, давно и успешно зарекомендовавшего себя в практике биохимического анализа), и пероксидазы сои, ПС (аналитические возможности которой пока изучены недостаточно; до конца не выявлен круг практических задач, для решения которых целесообразна замена ПХ на её более дешевый соевый аналог). Эти пероксидазы отличаются степенью гликозилирования и значениями изоэлектрической точки белка: ПХ - катионный фермент, а ПС -анионный.

Указанные различия могут оказаться существенными при решении ещё одного круга задач, к числу которых относятся проблемы ферментативного определения в водных средах некоторых медленно окисляемых субстратов пероксидаз (например, катехоламинов) и эндопероксидных соединений (ЭПС) — пространственно затрудненных аналогов основного субстрата-окислителя, пероксида водорода. Актуальность таких задач обусловлена потребностью в чувствительных, селективных и одновременно экспрессных и простых методиках определения

катехоламинов (производных пирокатехина) и антималярийных ЭПС в различных объектах, в частности в фармацевтических. Цели работы заключались в:

• выработке подходов к определению с использованием ПХ и ПС медленно окисляемых и ограниченно растворимых в воде фенольных соединений, а также антималярийных ЭПС в водных и водно-органических средах;

• выборе препарата пероксидазы, наиболее перспективного для определения катехоламинов, антималярийных ЭПС (природных и синтетических) и производных фенола в водных и водно-органических растворах;

• оценке перспектив использования гидрофильных ИЖ вместо полярных молекулярных органических растворителей в составе реакционной среды для пероксидазного превращения и ферментативного определения фенольных соединений;

• разработке с использованием ПХ и ПС методик определения фенольных соединений и антималярийных ЭПС в фармацевтических препаратах.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

о оптимизировать условия проведения реакций пероксидазного окисления катехоламинов в водной среде в отсутствие и присутствии активаторов; о выяснить оптимальные условия проявления влияния антималярийных ЭПС на скорость различных индикаторных реакций, катализируемых пероксидазами; о изучить кинетику реакций окисления катехоламинов и производных фенола (гваякола и о-хлорфенола) в присутствии каждой пероксидазы в водной и смешанных средах (вода - полярный органический растворитель, вода - гидрофильная ИЖ) соответственно;

о оптимизировать составы реакционных сред для проведения катализируемых ПХ и ПС реакций окисления гваякола и о-хлорфенола /яреот-бутилгидропероксидом в присутствии молекулярных растворителей и гидрофильных ИЖ; о разработать ферментативные методики определения рада фенольных соединений и ЭПС в водных и водно-органических средах;

о апробировать разработанные ферментативные методики в анализе фармацевтических препаратов.

Научная новизна. В результате проведенных систематических исследований кинетики катализируемых ПХ и ПС реакций окисления катехоламинов (допамина, а-метилдопы, адреналина и добутамина) и производных фенола (гваякола и о-хлорфенола) выявлены аналитические перспективы использования этих пероксидаз для определения перечисленных соединений в водных и смешанных средах различного состава (вода - полярный молекулярный растворитель; вода -гидрофильная ИЖ). Установлена зависимость скорости реакций превращения катехоламинов от источника выделения пероксидазы и природы субстрата-восстановителя, а реакций окисления гваякола и с-хлорфенола трет-бутилгидропероксидом ещё и от природы катиона ИЖ и буферного раствора как сорастворителя. Показаны преимущества использования гидрофильных ИЖ

(тетрафторборатов 1-бутил-З-мстилимидазолия, |ВМ1т][ВР4], и Ы-бутил-4-метилпиридиния, |ВМРу][ВР4|) перед полярными молекулярными растворителями (диметилсульфоксидом, ацетонитрилом, N,N-димeтилфopмaмидoм, 1,4-диоксалом) при проведении реакций пероксидазного окисления гваякола и о-хлорфенола трет-бутилгидропероксидом в реакционных средах с содержанием воды не более 40 об.%.

С использованием ПХ предложены новые индикаторные системы для чувствительного, экспрессного и простого ферментативного определения допамшга, а-метилдопы, адреналина и добутамина в фармацевтических препаратах, а также для определения 1,2,4,5-тетраоксана. Показана целесообразность использования неферментативной индикаторной системы НС1 - Н202 - I" для определения артемизинина на уровне его концентраций в растительном сырье и фармацевтических препаратах.

Практическая значимость работы. Показано, что в гидрофильных ИЖ ([ВМ1т][ВР4] и [ВМРу][ВР4]) даже при их содержаниях >60 об.% (в отличие от полярных молекулярных растворителей) в сочетании с оптимальными буферными растворами (сорастворителями ИЖ) и выбранным препаратом фермента сохраняется не менее 20% каталитической активности пероксидаз в реакциях превращения их фенольных субстратов.

Установленные в работе закономерности пероксидазного катализа в присутствии изученных полярных апротонных растворителей и гидрофильных ИЖ позволяют на этапе планирования эксперимента целенаправленно выбирать подходящий растворитель для превращения и определения субстрата фенольной природы.

Практическую значимость имеют разработанные чувствительные, экспрессные и простые ферментативные методики определения в водных растворах добутамина, адреналина, допамина и а-метилдопы, основанные на реакциях их окисления в отсутствие и присутствии активаторов (о-фенилендиамина, гормона Т4 и 4-аминоан-типирина), а также предложенные индикаторные системы (о-дианизидин - ПХ - Н2Ог и НС1 - Н202 - Г) для ферментативного определения 1,2,4,5-тетраоксана и неферментативного определения артемизинина соответственно.

Автор выносит на защиту:

■ результаты изучения кинетики реакций катализируемого ПХ и ПС окисления катехоламинов (допамина, а-метилдопы, адреналина и добутамина) и пирокатехина пероксидом водорода в отсутствие и присутствии активаторов в водной среде;

■ результаты изучения влияния артемизинина и 1,2,4,5-тетраоксана на скорость катализируемых ПХ реакций;

" данные по изучению каталитических свойств ПХ и ПС в реакциях окисления гваякола и о-хлорфенола пероксидом водорода и трет-бутилгидропероксидом в водной, водно-органической средах и в присутствии гидрофильных ИЖ; • установленные условия и закономерности протекания пероксидазного окисления фенольных соединений в водной и водно-органических средах;

■ ферментативные методики определения ряда катехоламинов, 1,2,4,5-тетраоксана в водных, а гваякола и о-хлорфенола - водно-органических средах и в присутствии ИЖ, в том числе и в фармацевтических препаратах.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 10 международных и всероссийских конференциях (съездах, симпозиумах): International Conference «Chimia 2009» (Констанца, Румыния, 2009), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России - 2009» (Краснодар, 2009), International conference «Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications» (Архангельск, 2009), 15 European Conference on Analytical Chemistry «EUROanalysis XV» (Инсбрук, Австрия, 2009), 1-ой Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), 13 Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistiy Society «Isranalytica 2010» (Тель-Авив, Израиль, 2010), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Клязьма, 2010), 2 Russian-Hellenic Symposium with International Participation «Biomaterials and bionanomaterials: Recent advances and safety - toxicology issues» (Ираклион, Крит, Греция, 2011), 16 European Conference on Analytical Chemistry, Challenges in Modern Analytical Chemistry «EUROanalysis XVI» (Белград, Сербия, 2011), а также на семинаре «Химический анализ медицинских объектов» в рамках выставки «Аналитика ЭКСПО-2011» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей в международных и российских журналах и 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, съездах и симпозиумах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 230 стр. машинописного текста, содержит 90 рисунков и 43 таблицы, и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы, включающего 313 источников, и 7 приложений.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 3 главы. В первой главе изложены общие сведения о катехоламинах и лекарственных средствах на их основе, обсуждены методики определения катехоламинов в фармацевтических препаратах спектроскопическими, кинетическими и биохимическими методами. Во второй главе приведены сведения о структуре и механизме действия антималярийных ЭПС, систематизированы и обсуждены литературные данные о методиках их определения инструментальными методами в различных объектах. Третья глава посвящена применению ИЖ в биотехнологии, ферментативном катализе и биохимических методах анализа. Кратко описаны основные физико-химические свойства ИЖ, использованных в указанных целях.

Экспериментальная часть работы представлена главами 4 - 8. В четвертой главе перечислены исходные вещества, их характеристики, оборудование; приведены методики приготовления растворов и проведения спектрофотометрических, хроматографических, масс-спектрометрических и других измерений. В пятой главе обоснован выбор для исследования пероксидаз из двух растительных источников (ПХ

и ПС), а также определяемых соединений. В шестой главе представлены результаты изучения кинетики реакций пероксидазного окисления катехоламинов и пирокатехина в водной среде в отсутствие и присутствии о-фенилендиамина (ФДА); гормонов Тз и '!'•; 4-аминоантипирина; оптимальные условия ферментативного определения катехоламинов. Рассчитаны и сопоставлены константы скоростей ферментативного (пероксидом водорода в присутствии ПХ и Т4) и неферментативного (КЮ4) окисления допамина. На основе полученных данных подтверждена целесообразность использования в индикаторной системе для определения допамина биокатализатора. Обсужден механизм ускорения гормоном Т4 катализируемого ПХ окисления допамина и адреналина. Приведены аналитические характеристики ферментативных методик определения в водном растворе катехоламинов и пирокатехина, а также результаты определения катехоламинов в фармацевтических препаратах. В седьмой главе описаны результаты изучения влияния эндопсроксидов, артемизинина и 1,2,4,5-тетраоксана, на скорость катализируемых пероксидазами 6 индикаторных реакций, скорость которых контролировали спектрофотометрическим и люминесцентным методами; данные по оптимизации условий катализируемой ПХ реакции окисления о-дианизидина в присутствии 1,2,4,5-тетраоксана и неферментативной реакции окисления иодид-ионов пероксидом водорода, выделяющимся из артемизинина в кислой среде; представлены аналитические характеристики разработанных ферментативной и неферментативной методик определения 1,2,4,5-тетраоксана и артемизинина. В восьмой главе обсуждены результаты сравнительного изучения кинетики катализируемых ПХ и ПС реакций окисления гваякола и о-хлорфенола в водной и водно-органической средах, а также в присутствии гидрофильных ИЖ. Обоснован выбор для исследования конкретных полярных органических растворителей и ИЖ. Приведены оптимальные условия проведения индикаторных реакций в изученных средах; сопоставлены рассчитанные кинетические параметры ферментативных реакций; представлены аналитические характеристики ферментативных методик определения гваякола и о-хлорфенола в воде и смешанных средах. Представлены результаты ферментативного определения гваякола в стоматологическом препарате «Гваяфен№3» в средах вода -диметилсульфоксид (75:25 об.%) и вода - [ВМ1т][ВР„] (20:80 об.%).

В Заключении к гл. 8 обобщены результаты спектрофотометрических, рефрактометрических, вязкозиметрических измерений в средах вода - полярный апротонный органический растворитель и вода - гидрофильная ИЖ. Сделана попытка выявить взаимосвязь относительной каталитической активности ПХ и ПС в реакциях окисления гваякола (ГК) и о-хлорфенола (о-ХФ) в средах разного состава и разных содержаний органических растворителей, при которых достигается 50% ингибирование обоих ферментов, с параметрами полярности (£зоЫ) изученных молекулярных органических растворителей и ИЖ, а также с параметрами их гидрофобности (1о£Р).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Реагенты и аппаратура, использованные в работе

Использовали лиофилизованные препараты («Sigma», США) ПХ и ПС (ЕС 1.11.1.7) с RZ = 2.7 и 0.5 и каталитическими активностями 266 и 90 ед.хмг1 по пирогаллолу соответственно. Растворы пероксидаз (1 - 30 мкМ) готовили растворением их препаратов в 0.1 М фосфатном буферном растворе, pH 7.0. Точные концентрации ПХ и ПС устанавливали спектрофотометрическим методом (£403= 10.2 и 9.4x104 М"'хсм"' для ПХ и ПС соответственно). Твердые препараты и растворы ферментов хранили в холодильнике при -18 и +4°С соответственно. Использовали субстраты ферментов, а также артемизинин, гормоны Т4 и Т3, 4-аминоантипирин производства «Sigma», США.

Буферные растворы готовили, используя растворы дигидро- и гидрофосфата калия, бифталата калия, малеиновой кислоты, лимонной кислоты и КОН, имидазола, 2,4,6-коллидина, 4-(2-гидроксготил)-1-пиперазинэтансульфоновой (ГЭИЭС), морфолинэтансульфоновой (МЭС) кислот и трис(гидроксиэтил)амино-метана (Трис). Применяли этанол, диметилсульфоксид (ДМСО), ацетонитрил, 1,4-диоксан и ИД-диметилформамид (ДМФА); коммерческие и синтезированные препараты гидрофильных ИЖ ([BMIm][BF4] и [BMPy][BF4]). Квалификация используемых реагентов была не ниже ч.д.а. Для приготовления всех водных растворов использовали деиошзованную воду, очищенную на установке «Millipore» (Франция) с удельной электропроводностью не более 18.2 МС2*см''.

Спектры поглощения или кинетику реакций регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV mini-1240A» (Япония, точность ±0.0003 опт. ед; / = 1 см). При проведении индикаторных реакций в ячейках полистирольного планшета оптическую плотность реакционных растворов измеряли на микропланшетном фотометре «Multiskan EX» («Thermo Labsystems», Финляндия; точность измерения оптической плотности ±0.007 опт. ед.; /=1 см). Спектры флуоресценции и хемилюминесценции (при выключенной ксеноновой лампе) регистрировали на спектрофлуориметре «Shimadzu RF 5301», Япония.

Измеряли pH буферных растворов на рН-метре «Mettler Toledo» (Швейцария) с точностью ±0.01 ед. pH. Спектрофотометрическое титрование водно-органических растворов о-ХФ 1 М раствором гидроксида тетраэтиламмония («Fluka», Венгрия) проводили в стеклятюй термостатированной при 25.0±0.ГС ячейке объёмом 50 или 100 мл в атмосфере Ar при непрерывном перемешивании, регистрируя УФ-спектры поглощения титруемых растворов на спектрофотометре «Specord 200РС» («Analytik Jena AG», Германия). Измеряли pH водно-органических растворов в различные моменты титрования на рН-метре «Эксперт-001.1.101» («Эконикс-эксперт», Россия) с комбинированным стеклянным электродом «ЭСК-10601/7» (Россия), откалиброванным по водным стандартным буферным растворам. Показатели преломления водно-органических растворов (и0л) измеряли на рефрактометре «ИРФ-454 Б2М» (Россия) (точность измерений ±1хЮч, диапазон измерений 1.2 - 1.7). Вязкость водно-органических растворов (т)) измеряли на капиллярном стеклянном вязкозиметре ВПЖ-1 (диаметр капилляра 0.73 мм, Россия), погруженном в

вязкозиметрический термостат Ь01Р ЬТ-910 (Россия, точность ±0.1°С). Препараты ИЖ высушивали на роторном испарителе «ВисЫ», Швейцария.

Обоснование выбора изучаемых ферментов и определяемых соединений

Пероксидазу хрена широко применяют в химическом анализе; сс структура и свойства хорошо известны. Напротив, свойства и аналитические возможности пероксидазы сои еще активно изучаются. Несмотря на близкие молекулярные массы, высокий процент (57%) гомологии структур и одинаковое количество дисульфидных мостиков, ПХ и ПС отличаются степенью гликозилирования биомолекул (9 и 4 центров гликозилирования соответственно) и значением изоэлектрической точки белка (р1 составляют 8.8 и 4.1). К началу наших исследований в литературе отмечена большая стабильность ПС по сравнению с ПХ при рН - 3 и в фосфатном буферном растворе (рН 6.0, 7.0 и 8.0) при повышенной температуре вплоть до 80°С. Установлено, что ПС обладает меньшей субстратной специфичностью к ФДА, о-дианизидину, ГК и пирокатехину в водной среде по сравнению с ПХ.

Систематические исследования каталитических свойств нативных ПХ и ПС в реакциях окисления различных фенольных соединений и ЭПС в водных, водно-органических средах и гидрофильных ИЖ и сопоставление полученных данных ранее никто в мире не проводил.

Выбор в качестве определяемых веществ катехоламинов: допамина (ДА), адреналина (АД), а-метилдопы (МД), добутамина (ДБ), обусловлен потребностью в простых и экспрессных методиках их определения в фармацевтических препаратах в диапазоне концентраций их10"6-10"3 М, альтернативных существующим фармакопейным методикам. Самостоятельный научный интерес представляло изучение эффективности катализа ПХ и ПС реакций окисления пероксидом водорода природных и синтетических катехоламинов, а также пирокатехина, производными которого они являются.

Интерес к изучению катализируемых псроксидазами реакций превращения эндопероксидов - природного антималярийного лекарственного вещества артемизинина (АМ), и его синтетического аналога 1,2,4,5-тетраоксана (ТО) (рис. 1), объясняется актуальностью разработки простых и экспрессных методик их определения в растительном сырье и лекарственных субстанциях соответственно. ЭПС содержат в структуре своих молекул пероксидные мостики, что позволяет рассматривать их в качестве возможных кандидатов на роль субстратов-окислителей пероксидаз. Концентрации ЭПС в растительном сырье и фармацевтических препаратах варьируют в диапазоне 10"5 - Ю"2 М.

о

Рис. 1. Структуры исследуемых в работе ЭПС: АМ (слева) и ТО (справа).

Выбор ГК и о-ХФ в качестве модельных фенолы/ых соединений обусловлен рядом причин. Во-первых, они входят в круг тех фенолов, которые загрязняют поверхностные воды и почвы, поступая туда со стоками предприятий целлюлозно-бумажной, нефте- и коксохимической, сланцеперерабатывающей промышленности; во-вторых, ГК и о-ХФ являются субстратами пероксидаз. Достоинством ГК и о-ХФ как модельных субстратов является также образование окрашенных продуктов в результате их окисления в водных и водно-органических растворах, что позволяет контролировать скорость этих процессов простым и удобным спектрофотометрическим методом.

Субстратами-окислителями перечисленных выше соединений служили хорошо растворимый в воде Нг02 или ограниченно растворимый в воде /-ВиООН. Благодаря высокой растворимости последнего в большинстве полярных органических растворителей, он, в отличие от Н7О2, способен окислять ГК и о-ХФ как в водной, так и в водно-органических средах в присутствии пероксидаз.

Пероксидазы хрена и сои в реакциях превращения катехоламинов

Для разработки чувствительных и селективных ферментативных методик определения катехоламинов и пирокатехина в фармацевтических препаратах изучили кинетику их индивидуального окисления пероксидом водорода в присутствии ПХ и ПС. Установили, что скорости ферментативного окисления катехоламинов и пирокатехина возрастали в ряду: ДА = МД < АД < ДБ < пирокатехин, а их величины зависели от природы фермента (в присутствии ПХ скорости были в 1.5-2 раза выше, чем в случае ПС) и природы буферного раствора. На примере ДА показали, что константы скоростей отдельных стадий, £+5, индикаторной реакции (схема 1) с участием ПХ в 4.7, 2.3 и 1.4 раза соответственно превышали таковые для реакций в присутствии ПС.

Схема 1 ферментативного окисления фенольных субстратов пероксидазы в рамках «пинг-понге механизма

£+^0,— Е.Н,0,-Ц СргН + АН,~ Е-Г,АН;^Н Ср<Ш + ЛП2 Ср<Ш.ЛК,-^ Е+А1Г - Ь3 | к.,

1—• Н,0 1—' АН-

где Е, Срс11 и Срс1И — исходный фермент и его промежуточные окисленные формы соответственно, ЛН2 и АН — исходный субстрат (донор электронов или протонов) и его окисленная форма (радикал) соответственно.

Таким образом, для превращения катехоламинов предпочтительнее использовать в качестве биокатализатора ПХ, а не ПС. Скорость ферментативного окисления катехоламинов максимальна в фосфатном буферном растворе. Отмечено возрастание скорости окисления ДБ с уменьшением р/<а основного компонента буферного раствора (рис. 2). Установленные оптимальные условия проведения пероксидазного окисления катехоламинов и пирокатехина приведены в табл. 1.

г

Сопоставление кинетических параметров реакции пероксидазного окисления ДА, АД (схема 1, с таковыми для некаталитической реакции их окисления периодатом калия показало, что по сравнению с ферментативным, нефермептативное окисление ДА, АД протекает менее эффективно (константы скорости (&+6) ниже в 5 и 20 раз в случаях ДА и АД соответственно), что обосновывает целесообразность применения биокатализатора (ПХ) для разработки методик определения катехоламинов в фармацевтических препаратах.

Д V, мкМ мин-1

Трис-НС1 (8.08) ГЭПЭС (7.47) Имидазольный (6.95) Фосфатный (6.82)

Рис. 2. Зависимость скоростей пероксидазного окисления катехоламинов (ДА (1), МД (2), АД (3), ДБ (4)) от природы буферного раствора (в скобках - рКл основного компонента буферной смеси, рН 7.0; концентрации: катехоламин - 0.1 мМ, ПХ (заливка), ПС (без заливки) - 700 нм, Н202 - 0.4 мМ; п = 3, Р = 0.95). АУ - разность скоростей ферментативной и неферментативной реакций.

Таблица 1. Оптимальные условия проведения реакций индивидуального окисления ДА. МД, АД, ДБ и пирокатехина пероксидом водорода, катализируемых ПХ (0.1 М фосфатный буферный раствор)

Индикаторная система ?Чпах> НМ рН Концентрации

ПХ, нМ Н202, мкМ

ДА - Н,02 465 7.0 900 400

МД-Н202 481 7.0 700 200

АД-Н202 480 8.6 350 200

ДБ - Н202 481 9.2 40 100

Пирокатехин - Н202 400 7.5 30 100

Расчет кинетических параметров индикаторных реакций показал, что в выбранных условиях (табл. 1) ДБ и пирокатехин являются быстро окисляемыми субстратами Г1Х (константа скоростьлимитирующей стадии > 106 М"'*с"'), в то время как ДА, АД и МД - средне окисляемые субстраты (/с+5 в диапазоне Ю4- 10б М" 'хс"1). Для повышения скорости ферментативного окисления последних целесообразно использовать активаторы.

На основании литературных данных выбрали в качестве активаторов ФДА, гормоны Та и Т3, а также 4-аминоантипирин, применение которых позволяет

повысить скорость окисления катехоламинов. В результате изучения кинетики резкций окисления ДА, АД и МД в присутствии ФДА, Т4, Т3 и 4-аминоантипиршга выявили, что оптимальным активатором пероксидазного окисления ДА и АД является Т4, а для индикаторной реакции с участие?.» МД - 4-аминоантипирин. На рис. 3 приведены кинетические кривые обсуждаемых ферментативных реакций в отсутствие и присутствии соответствующих активаторов.

А 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05

..з А о-з

.2 0.25

0.2

а 0.15

1 0.1

2

— 6 0.05

20

40

60

80

/,С

120 С

Шроксидазя 'Жг хрена

Рис. 3. Кинетические кривые катализируемого ПХ окисления ДА (1), МД (2) и АД (5) в отсутствие (слошные линии) и присутствии (пунктирные линии) Т4 {а) и МД в отсутствие и присутствии 0.1 мМ 4-аминоантипирина (б) (0.1 М фосфатный буферный раствор, рН 7.0; концентрации: а - ДА (АД, МД ) - 0.1 мМ, ПХ - 600 нМ, Т4 - 40 мкМ, Н202 - 0.4 мМ; б - МД - 0.1 мМ, ПХ - 250 нМ, Н.02 - 0.2 мМ).

Активирующее действие 4-аминоантипирина на реакцию пероксидазного окисления МД - следствие эффекта «субстрат-субстратной» активации, который проявляется в том, что в рассматриваемой паре восстановителей 4-аминоантипирин ускоряет окисление «медленного» субстрата - МД.

В результате изучения кинетики катализируемых ПХ реакций окисления ДА, АД и МД и масс-спектро-метрического анализа реакционной смеси до и после проведения реакций предложена кинетическая схема, объясняющая ускоряющее действие гормона Т4 на их скорость. Тироидный гормон является донором образующихся на начальной стадии свободных радикалов (ТД необходимых для дальнейшего окисления катехоламинов (КА). Тот факт, что фосфат-ионы в отличие от компонентов изученных органических буферных смесей не могут перехватывать свободные радикалы Т4", участвующие в окислении катехоламинов, свидетельствует в пользу применения фосфатного буферного раствора для проведения этих индикаторных реакций.

Выбранные оптимальные условия проведения реакций окисления ДА, АД и МД в присутствии ПХ и активаторов представлены в табл. 2.

ГГ.-1

т4-+ка

КА- + 0, 0.- + ПХ

Т, + КА-КАЧО,-Е-1 +0г

Таблица 2. Оптимальные условия проведения катализируемых ПХ реакций окисления катехоламинов и пирокатехина пероксидом водорода в присутствии активаторов

Аналит ^-тах, им Буферный раствор (рН) Концентрации

ПХ, нМ Активатор, мкМ Н202, мМ

ДА 435 0.1 М Фталатпый (5.5) 15 100 (ФДА) 400

465 0.1 М Фосфатный (5.4) 670 50 (T«) 250

МД 481 0.1 М Фосфатный (6.2) 600 30 (4-Аминоантипирии) 200

АД 480 0.1 М Фосфатный (8.6) 150 15 (T«) 100

На основе выявленных активирующих эффектов разработаны ферментативные методики определения катехоламинов и пирокатехина (табл. 3). Чувствительность ферментативной методики определения ДБ на основе его индивидуального окисления пероксидом водорода (в отсутствие активаторов) вполне достаточна для анализа фармацевтических препаратов. Применение активаторов для определения ДА, АД и МД позволило в 10, 5 и 10 раз соответственно понизить их с„ по сравнению с методиками, основанными на ферментативных реакциях их индивидуального окисления. При замене ФДА на Т4 с„ ДА понизилась в 2 раза; при использовании 4-амшюантипирина вместо Т4 коэффициент чувствительности при определении МД повысился более чем в 25 раз (табл. 3).

Таблица 3. Аналитические характеристики разработанных ферментативных методик определения катехоламинов и пирокатехина (н = 5; Р = 0.95)__

Аналит Активатор Уравнение градуировоч- ДОК", •Sr

ной зависимости мкМ при с„

ДБ - / = (0.8±0.1)л + (3.1±0.8) 5-20 0.09

Пирокатехин - _у = (1.2±0.1)*+(11±6) 20 - 200 0.13

ДА - у = (2.3А0.1) х + (0.4±0.1) 5 -300 0.06

ФДА у = (1.4±0.1)л + (128±1) 1-200 0.08

т4 ji = (0.9±0.1)*-(1.5±0.2) 0.5 - 300 0.08

АД - у = (3.1±0.3) х + (4±1) 20 -300 0.18

т4 у = (1.4±0.1) х + (1.4±0.3) 4-300 0.09

МД - у = (2.7±0.8)л + (1.1±0.8) 100-400 0.25

т4 у = (4±1)х10"2 л + (25±2) 100-400 0.23

4-Аминоантиппр11н у = (1.1±0.1) л + (5±2) 10 - 100 0.18

" ДОК - диапазон определяемых концентраций. 6 у - К, мкМхмин"1, х-с, мкМ.

Ферментативные методики определения ДА, АД, МД и ДБ апробированы при анализе фармацевтических препаратов (табл. 4 и 5), в состав которых помимо катехоламинов входили указанные в табл. 4 компоненты.

Чувствительность и селективность предложенных ферментативных методик позволяет определять катехоламины в различных по составу лекарственных формах (табл. 5: инъекциях1, таблетках2, лиофилизатах3) в широком диапазоне содержаний

действующего вещества (от 2 до 50 масс. %). Разработанные ферментативные методики более экспрессны (время анализа 15-20 мин), просты и менее трудоемки, чем известные из литературы спектрофотометрические, электрохимические методики определения катехоламинов в фармацевтических препаратах, а также фармакопейные потенциометрические методики.

Таблица 4. Селективность разработанных ферментативных методик определения катехоламинов

Аналит Информация о мешающем влиянии компонентов,

(тестируемая входящих в состав фармацевтических препаратов

концентрация)__

Ь-Цистеин мешает выше 4-кратных избыточных количеств; №28205 в 2-кратных, лактоза, сахароза, фруктоза при более, чех« 10-кратных избыточных количествах мешают; ИаС! не мешает вплоть до 100-кратных избыточных количеств Лидокаин и ЫаС1 не мешают вплоть до 50 и 200 мМ концентраций соответственно в фармацевтических препаратах; Ма28205 мешает при более, чем 2-кратных избыточных количествах Тальк, крахмал, этилцеллюлоза, стеарат магния, стеариновая кислота ие мешают определению после фильтрования анализируемого раствора

Манпитол не мешает на уровне его концентраций (10-100 мкМ) в фармацевтических препаратах

Таблица 5. Результаты определения ДА, АД, МД и ДБ в фармацевтических препаратах с использованием разработанных ферментативных методик (I) и методом ВЭЖХ-МС (П) (я = 3, Р = 0.95)

Фармацевтический препарат Ед. сод. Найдено Паспорт.

I II содерж.

«Дофамин-Ферейн» «Ферейн», Россия1 мгхмл"' 4.6 ±0.2 5.2 ±0.5 5

«Допамин-Солвей» «Solvay Pharma», Россия1 мг 62 ±10 59 ±6 60

«Ксилокаин-Адреналина» «Astra Zeneca», мкгхмл"1 5.1 ±0.3 4.8 ±0.4 5.0

Германия1

«Допегит» «Egis», Венгрия2 мг 230 ±20 245 ± 16 250

«Добутамин-ГЕКСАЛ» «Hexal», Германия3 мг 244 ±16 - 250

Артемизппии и 1,2,4,5-тетраоксан в индикаторных реакциях с участием пероксидаз

Для оценки перспективности использования растительных пероксидаз для определения антималярийных ЭПС изучили ферментативные системы, приведенные в табл. 6. Выбранные индикаторные системы различались не только методом контроля скорости реакций (спектрофотометрический или люминесцентный), но и тем, что в некоторых индикаторных реакциях (в табл. 6 они выделены курсивом) ЭПС предварительно дериватизировали растворами минеральных кислот.

ДА(ЮмкМ)

АД(ЮмкМ) МД (20 мкМ) ДБ (10 мкМ)

Проведенные исследования показали, что из всех изученных индикаторных систем для ферментативного определения ТО возможно применять лишь систему !, в которой ЭПС выступает в роли соокислителя основного субстрата биокатализатора. К сожалению, пи в одной из исследоваиных ферментативных систем аналитический сигнал не был пропорционален концентрации AM. Установлено, что для определения AM целесообразно применять кинетический метод, измеряя скорость накопления иода в реакции окисления иодид-иона пероксидом водорода, выделяющегося из AM после его обработки раствором HCl.

Таблица 6. Изученные индикаторные реакции с участием ЭПС и ПХ

№ Индикаторная система Аналит pH Индикаторное вещество

(к, нм)

Спектрофотометрический метод контроля скорости реакции

I. о-Дианизидин - ЭПС (Н2Ог) AM/TO 5.5 Продукт окисления о-дианизидина (455)

II. ТМБ" - ЭПС (Н20:) AM/TO 5.3 Продукт окисления ТМБ (375)

III. AM + HCl -»РР + Н202 (1) Индигокармин - Н202 (2) ТМБ-ЩО, AM 4.8 Индиго кармин (613) Продукт окисления ТМБ (655)

Люминесцентный метод контроля скорости реакции

IV. Люминол - ЭПС АМ/ТО 11 Аминофталат (425)

IVa. Люминол - Н202 АМ 11 Аминофталат (425)

V. Пиронин Б - ПХ ТО 7.5 Пиронин Б (Х.0,5 345, 547)

а3,3*,5,5'-тетраметилбензидин.

В оптимальных условиях проведения индикаторных реакций с участием АМ (концентрации: НС1 - 2.5 М; К1 - 30 мМ; время накопления Пг02 - 5 мин; 350 нм) и ТО (концентрации: ПХ - 0.45 нМ, о-дишгазидин - 0.1 мМ, Н202 - 0.2 мМ, ацетатный буферный раствор, рН 4.2; 460 нм) разработали неферментативную (АМ) и ферментативную (ТО) методики их определения с аналитическими характеристиками, представленными в табл. 7.

Таблица 7. Аналитические характеристики методик определения АМ после его кислотного разложения по реакции с К1 и ТО по катализируемой ПХ реакции окисления о-дианизидина перокездом водорода (п = 6, Р = 0.95)

ЭПС Уравнение градуировочной зависимости0 ДОК, мМ ■SV

а Аа b Ab при с„

АМ 0.7 0.1 0.08 0.01 0.15-1 0.01

ТО 3.5 0.3 2.3 0.2 0.2-0.6 0.07

"у = (а ± Да) х + (b ± ДЬ), гд ey-V, мкМ*мин~х - концентрация ЭПС, мМ.

Чувствительность разработанной ферментативной методики определения ТО невысока (сн = 0.2 мМ) и в полной мере не удовлетворяет требованиям фармацевтического анализа. К сожалению, ни в одной из изученных индикаторных

систем в присутствии Г1Х не проявил свое действие АМ, однако для оценки качества растительного сырья при производстве АМ разработанная методика его определения кинетическим методом (с„ = 0.15 мМ) вполне пригодна.

Пероксидазное окисление гваякола н о-хлорфенола в водных и водно-органических средах

Для сравнительного изучения пероксидазного катализа в водных и водно-органических средах разного состава в качестве модельных индикаторных реакций использовали реакции окисления ГК и о-ХФ растворами Н202 или /-ВиООН. Из широкого круга коммерческих гидрофильных ИЖ выбрали две ИЖ, содержащие один и тот же анион - [ВБ/], но разные катионы - [ВМ1га+] и [ВМРу+]. Согласно литературным данным, имидазолиевые ИЖ используют в ферментативном катализе наиболее часто; второе место по распространенности занимают ИЖ на основе катиона пиридиния. В качестве полярных молекулярных органических растворителей для проведения реакций пероксидазного окисления ГК и о-ХФ выбрали ДМСО, ДМФА, ацетонитрил, 1,4-диоксан и этанол.

Пероксидазное окисление фенольных соединений в водной среде проводили в оптимальных условиях, приведенных в табл. 8. Из изученных буферных растворов (фосфатный, цитратно-фосфатный, МЭС, Трис-малеиновый, малеиновый и фталатный) эффективность превращения обоих фенольных субстратов максимальна в 0.1 М фосфатной буферной смеси. Для достижения одной и той же скорости окисления ГК требовалось ИХ в 3 раза больше, чем ПС, а для окисления о-ХФ наоборот необходимо в 3.5 раза большее количество ПС (табл. 8).

Таблица 8. Оптимальные условия проведения пероксидазного окисления ГК и о-ХФ в 0.1 М фосфатном буферном растворе

Источник пероксидазы

^тпах» нм

рН

Б, нМ

Концентрации

Субстрат, мкМ

Окислитель, мМ

ю

и

и

© ><

о

ПХ ПС ПХ

ПС

470 415

6.0 5.5

10 3

15 50

1000 3500 60

120

?-ВиООН

Н202

120 220 0.25

0.35

Пероксидазное окисление ГК и о-ХФ в среде вода - полярный органический растворитель. На рис. 4 и 5 в виде диаграмм для наглядности представлены зависимости относительной активности (а/а0, соотношение каталитической активности пероксидаз в присутствии и отсутствие органического растворителя соответственно) ПХ и ПС в реакциях окисления ГК и о-ХФ трет-бутилгидропероксидом от содержания (10 - 40 об.%.) органических растворителей в реакционном растворе. Концентрации компонентов индикаторных реакций соответствуют оптимальным для водной среды (табл. 8). Из рис. 4 и 5 видно, что при увеличении содержания органического растворителя относительная активность пероксидаз в обеих индикаторных реакциях в присутствии большинства

растворителей резко уменьшается. Исключение составляет реакция окисления о-ХФ в среде вода - ДМСО в присутствии ПХ. Скорость окисления ГК при содержании органического растворителя < 5 об.% практически не отличается от таковой в водном растворе в присутствии обоих ферментов. Уже при концентрации органического растворителя ¡5 об.% ПХ инактивирована более чем на 50%, в то время как ПС в реакции окисления ГК более активна в среде ДМСО и ацетонитрила. Для дальнейшей работы выбрали максимальные содержания органических растворителей, при которых скорость реакции ещё достаточна для регистрации, а степень ингибирования пероксидаз не превышает 75%.

Рис. 4. Зависимость относительной активности ПХ и Ш в реакции окисления ГК от содержания ДМСО, ацетонитрила и этанола (концентрации: ПХ -9 нМ; ГК - 0.9 мМ; /-ВиООН - 120 мМ; ПС - 2.7 нМ, ГК-3.6 мМ, /-ВиООН - 220 мМ; 0.1 М фосфатный буферный раствор, рН 6.0; 470 нм).

5 10 15 2025 30 ДМСО

шр I

10 '5 20 25 30 Г, Н,СК 5 ю

Этанол 01,.,

15

ирг. р-ЛИ'

Скорость окисления о-ХФ при содержании органического растворителя 10 об.% в присутствии ПС практически не отличается от таковой в водном растворе, в то время как скорость катализируемой ПХ реакции возрастает почти в 2 раза (рис. 5). Лишь этанол понижает скорость реакции с участием ПХ. Аналогичную картину наблюдали в системе ГК - /-ВиООН, в которой при увеличении содержания этанола от 3 до 10 об.% степень ингибирования пероксидаз (главным образом, ПС) повышалась от 5 до 50% соответственно.

Рис. 5. Зависимость относительной активности ПХ и ВС от объемного содержания органического растворителя* в индикаторной системе с о-ХФ (концентрации: ПХ - 170 нМ, ПС -50 нМ, о-ХФ - 0.1 мМ, /-ВиООН - 50 мМ; 415 нм) (*растворители расположены в порядке возрастания \о%Р; содержания органических растворителей составляют 10, 20, 30, 40 об.%).

200 150 100 50

ДМСО дМФА

1

снзск

Диоксан Этанол

При содержаниях любого органического растворителя более 10 об.%,

реакции окисления о-ХФ

каталитическая активность пероксидаз понижается. Наименьшее инактивирующее действие на ПХ при окислении о-ХФ оказывает ДМСО, в присутствии 40 об.% которого активность фермента сохраняется на «водном» уровне. Для соевого фермента самой «благоприятной» средой оказался ацетонитрил, при 40 об.% которого

каталитическая активность ПС уменьшается до 25%, однако в других изученных растворителях она падает до 15%.

Из данных табл. 9 видно, что концентрации обеих пероксидаз увеличиваются в 1.5 - 1.8 раз при переходе от водной к водно-органической среде. Исключение составляет концентрация ПХ в среде вода-ацетонитрил, в которой она такая же, как и в водной среде. Во всех случаях концентрация ПС в 2 - 4 раза ниже концентрации ПХ. В водно-органических средах при использовании ПХ и ПС в 10 - 17 раз и 2.5 раза соответственно возрастают оптимальные концентрации ГК. Оптимальная концентрация /-ВиООН при переходе в водно-органическую среду в случае ПС не меняется, в то время как в присутствии ПХ повышается в 1.2 - 2.4 раза. Для проведения реакций, катализируемых ПХ и ПС, в водно-органической среде требуется ~ 20-кратное избыточное количество /-ВиООН по отношению к ГК, в водной - 130- и 60-кратные избыточные количества соответственно.

Таблица 9. Оптимальные условия проведения индикаторных реакций пероксидазного окисления ГК и о-ХФ в водно-органических средах

Среда

Оптимальные концентрации ДМСО Ацетонитрил ДМФА

ПХ | ПС ПХ | ПС ПХ | ПС

Буферный раствор, рН

Реакция окисления ГК 0.1 М Фосфатный, рН 6.0

Фермент, нМ 16.5 4.0 10.0 4.5 20 6

ГК, мМ 15.0 9.0 8.5 9.0 12 10

/-ВиООН,'мМ 290 220 145 220 210 240

Растворитель, об.% 20 25 25 20 35 20

Реакция окисления о-ХФ

Оптимальные концентрации ДМСО Ацетонитрил ДМФА

Буферный раствор, рН 0.1 М Цитратно-фосфатный, 5.5

Фермент, нМ 170 50 170 60 170 а

о-ХФ, мкМ 100 100 100 100 35 -

¿-ВиООН, мМ 25 25 25 25 13 -

Растворитель, об.% 40 40 25 30 30 -

Оптимальные концентрации 1,4-Диоксан Этанол

Буферный раствор, рН 0.1 М Цитратно-фосфатний, 5.5

Фермент, нМ 240 - 50 40

о-ХФ, мкМ 160 - 100 100

/-ВиООН, мМ 13 - 25 60

Растворитель, об.% 25 - 20 20

реакция в этой среде в изученных условиях не протекает.

Пероксидазное окисление фенольных соединений в среде вода -гидрофильная ИЖ. При окислении ГК и о-ХФ в присутствии 25 об.% ИЖ и более необходимо применять буферные системы органической природы (табл. 10), поскольку компоненты фосфатного и цитратно-фосфатного буферного растворов, обеспечивающих высокую каталитическую активность пероксидаз в водной среде и смесях молекулярных растворителей с водой (табл. 9), в ИЖ осаждаются. Выбор оптимального буферного раствора (его природы, рН и концентрации) как сорастворителя ИЖ позволил нам изучить кинетику пероксидазного окисления ГК и

о-ХФ при высоких объёмных содержаниях (> 60 об.%) гидрофильных ИЖ в реакционной смсси. Для окисления ГК трет-бутилгидропероксидом в присутствии [ВМРу][ВР4] и [ВМ1т][ВР4] оптимальными оказались буферные системы (коллидиновая и имидазольпая соответственно), компоненты которых содержали структурные элементы исследуемых ИЖ. В среде ииридиниевой ИЖ о-ХФ не окислялся ни в одной из изученных буферных систем, а в качестве оптимального сорастворителя для [ВМ1т][ВР4] выбрали 0.1 М МЭС-КОН буферный раствор.

Таблица 10. Относительная активность (а/а,„ %) ИХ и ПС в реакциях окисления ГК и о-ХФ трет-бутилгидропероксидом в зависимости от природы буферного раствора -сорастворителя ИЖ (концентрации: ПС - 8.0 нМ, ПХ - 10.0 нМ; /-ВиООН - 120 мМ, ГК - 1 мМ, о-ХФ -0.1 мМ; 0.05 М буферные растворы, рН 7.0 (ГК) и 5.5 (о-ХФ))

Среда (об.%) Фермент а/а0, %

Имидазол-НС1 2,4,6-Коллидин-НС1 Трис-НС1 1

Окислснис ГК

[ВМРу][ВР4] - буферный ПХ - - -

раствор (60:40) ПС 39" 34 12

[ВМ1т][ВР4] - буферный ПХ 6 8 3

раствор (80:20) ПС 23 9 -

Окисление о-ХФ

МЭС-КОН Трис-малеиновый

[ВМ1т][ВР4] - буферный раствор (70:30) ПХ 110 65

а В имидазольном и коллидиновом буферных растворах относительные активности ПС сопоставимы, однако воспроизводимость результатов измерений в коллидиновом буферном растворе выше С?гз 0.11, п = 3).

Вследствие высокой динамической вязкости ИЖ по сравнению с растворами молекулярных растворителей оптимален следующий порядок введения компонентов в реакционную систему: ИЖ - ¿-ВиООН - буферный раствор - ГК (о-ХФ) - фермент.

Установлено, что характер зависимостей относительной активности ПХ и ПС в реакциях окисления ГК и о-ХФ от содержания ИЖ в реакционном растворе различен. В системе о-ХФ - г-ВиООН каталитическая активность соевого фермента в присутствии уже 20 об.% имидазолиевой ИЖ понижалась до 20% и приближалась к нулю при 95 об.% этого ионного растворителя (рис. 6, а). Напротив, относительная активность ПХ в диапазоне содержаний [ВМ1т][ВР4] от 20 до 60 об.% превышала 100% (т.е. в присутствии ИЖ скорость реакции была больше, чем в её отсутствие), а затем уменьшалась и при 95 об.% ИЖ составляла -20% от её исходной величины.

При 80 об.% [ВМРу][ВР4] и выше реакция окисления ГК в присутствии ПХ, не протекала, в то время как каталитическая активность ПС в той же реакции сохранялась на уровне 7-9% при 70 об.% пиридиниевой ИЖ (рис. 6,6). С повышением содержания [ВМ1т]ГВР4] относительная активность ПС понижалась в меньшей степени, чем ПХ.

140 105 70

35

шш

35.0 ■

28.0 '

21.0 ■

14.0 •

в 7.0 ■

о.о 1-

ь

20 40 60

70 80 95

<унж, об.%

75 85 95 |ВМ1тЦВР4]

60 70 80 90 |ВМРу]|ВР4]

Шиж, об.%

Рис. 6. Зависимость относительной активности ПХ (заливка) и ПС (без заливки) в реакциях окисления о-ХФ (я) и ПС (б) трет-бутилгидропероксидом от содержания [ВМ1т][ВР4] и [ВМРу][ВР4] (а - 0.1 М МЭС-КОН буферный раствор; концентрации: ПХ -20 нМ, ПС - 80 нМ, о-ХФ - 0.1 мМ, /-ВиООН - 40 мМ; 415 нм; б - 0.05 М имидазольный ([ВМ1т][ВР4]) и коллидиновый (([ВМРу][ВР4]) буферные растворы; ПС - 8 нМ, ПХ - 10 нМ; ГК - 0.9 мМ; /-ВиООН - 122 мМ; 470 нм).

В табл. 11 приведены оптимальные условия проведения реакций окисления ГК и о-ХФ в присутствии ИЖ. Благодаря использованию ИЖ вместо полярных молекулярных растворителей, стало возможным проведение изученных катализируемых пероксидазами реакций в присутствии значительно больших содержаний ионного органического растворителя в индикаторной системе (60 об.% и выше), при которых катализ в присутствии молекулярных растворителей отсутствовал (табл. 9).

Таблица 11. Оптимальные условия проведения реакций окисления ГК и о-ХФ трет-бутилгидропероксидом, катализируемых ПС (I) и ПХ (II), в присутствии ИЖ

Среда (об. %) Концентрация

Фермент, нМ /-ВиООН, мМ Фенольный субстрат, мМ

Г [ВМРу][ВР4] - 0.05 М 2,4,6-коллидин - НС1, рН 7.0 (60:40) [ВМ1ш][ВР4] - 0.05 М имидазол -НС1, рН 7.0 (80:20) 0- [ВМ1т][ВР4] - 0.1 М МЭС-КОН буферный раствор, рН 5.5 (70:30) К - Г-ВиООН 60(1) 45 (I) \Ф - г-ВиООН 200 (II) 145 170 50 1 3 0.4

Сравнительный анализ кинетики пероксидазного окисления ГК и о-ХФ в водной и смешанных средах. Введение в реакционную смесь полярных апротонных органических растворителей (например, ДМСО, ацетонитрила) и ИЖ приводило к изменению эффективности катализа с участием растительных пероксидаз по сравнению с таковой в водной среде (табл. 12).

В среде 25 об.% ДМСО или 20 об.% ацетонитрила ГК эффективнее превращается ПС, чем ПХ, в то время как в водной среде ситуация противоположная.

Как и в случае ГК, в присутствии 40 об.% ДМСО или 30 об.% ацетонитрила о-ХФ яяяястся наилучшим субстратом для ПС, но не для ГТХ. Однако в среде 20 об.% этанола обе пероксидазы в реакции превращения о-ХФ ведут себя одинаково.

Таблица 12. Эффективность катализа (А'зфф) ПХ (I) и ПС (И) в реакциях окисления ГК и о-ХФ в водной и сметанных средах в рамках упрощенной схемы «пинг-понг» механизма (оптимальные условия табл. 9 и 11)

Субстрат к,фф*10-4, М-'хс"1

Н20 ДМСО Ацетонитрил ДМФА

I II I II I II I 1 II

ГК о-ХФ 8.52 43.3 0.91 10.4 0.13 0.78 0.28 9.8 0.11 0.69 0.22 3.9 Не изучено 0.69 |

Субстрат 1,4-Диоксан Этанол [ВМ1т][ВР4] [ВМРу][ВР4]

ГК о-ХФ Не изучено 0.78 | - Не изучено 11.7 | 11.2 0.88 0.26 _ 0.22

" нет возможности для расчета констант.

В 30 об.% [ВМ1т][ВР4] о-ХФ в присутствии ПС не окисляется, в то время как катализ ПХ в этой среде характеризуется величинами сравнимыми с таковыми для сред вода-молекулярный органический растворитель. Эффективность превращения ГК в средах [ВМ1т][ВР4] и [ВМРу][ВР4] сопоставима с таковой в смесях воды с ДМСО или ацетонитрилом, однако содержание последних в 3-4 раза ниже по сравнению с ИЖ.

Важно отметить, что если в водной среде использование пероксидазы хрена для превращения обоих субстратов предпочтительнее пероксидазы сои, то в смешанных средах целесообразнее применять соевый фермент. В ионных жидкостях выбор фермента определяется природой субстрата-восстановителя.

Строгой корреляции относительной каталитической активности растительных пероксидаз с характеристиками изученных водно-органических реакционных сред (показателями их преломления, динамической вязкостью), а также с параметрами полярности и гидрофобности молекулярных органических растворителей и гидрофильных ИЖ не обнаружили. Тем не менее, для выбора «дружелюбного» по отношению к пероксидазе апротонного молекулярного растворителя и гидрофильной ИЖ для превращения субстратов фенольной природы параметр гидрофобности растворителя нам представляется наиболее адекватной характеристикой.

Ферментативное определение ГК и о-ХФ в водных и водно-органических средах разного состава. В оптимизированных условиях окисления ГК и о-ХФ трет-бутилгидропероксидом (табл. 9 и 11) разработали методики их определения в среде полярных молекулярных органических растворителей и ИЖ (табл. 13).

Применение ПС в реакции превращения о-ХФ позволяет определять его с большей чувствительностью в присутствии ДМСО и ацетонитрила (шире ДОК и выше коэффициент чувствительности, чем в присутствии ПХ). Выбор ПС в качестве оптимального биокатализатора реакции окисления ГК оправдан только более широкими ДОК по сравнению с методикой в присутствии ПХ. Применение

[ВМ1т][ВР4], а в случае окисления ГК и [ВМРу][ВР4], позволяет незначительно понизить с„ фенольных соединений, при этом их ДОК остаются такими же (табл. 13, выделенные ряды), как и в присутствии молекулярных органических растворителей. Для определения ГК и о-ХФ на уровне их концентраций 10"6 - 10"5 М индикаторные реакции рекомендуется проводить в водной среде, а для больших концентраций (на уровне 10"4 - 10"3 М) - в водно-органической. Для определения фенольных субстратов оптимальными являются среды вода - ДМСО (фермент - ПС) и вода - [ВМ1т][ВР4] (фермент - ПС и ПХ для определения ГК и о-ХФ соответственно).

Таблица 13. Аналитические характеристики методик определения ГК и о-ХФ в водной и водно-органической средах с использованием ПХ (I) и ПС (II) (и=3, Р~ 0.95)

Среда (об.%) Фер- ДОК, мМ а" ±Аа ь ±д ь г •Гт

мент мин"1 мкМхмин"' При Сн

ГК

Вода I 0.02-0.15 43 5 0.1 0.5 0.998 0.04

II 0.1-0.5 5.1 0.8 0.1 0.2 0.991 0.04

ДМСО (25) I 0.1-1.5 4.9 0.9 0.2 0.5 0.995 0.06

II 0.2-3.6 1.3 0.3 0.5 0.4 0.993 0.05

Ацетонитрил (20) I 0.2-0.9 4.0 0.3 -0.03 0.2 0.998 0.04

II 0.5 - 9.0 0.8 0.1 0.4 0.4 0.993 0.04

[ВМ1т][ВР4] (80) II 0.1-3 2.8 0.6 1 1 0.985 0.06

[ВМРу][ВР4] (60) II 0.05-1 8 4 0.4 1 0.967 0.06

о-ХФ

Вода I 0.003-0.03 34 3 1.0 0.5 0.966 0.05

II 0.003 - 0.1 22 2 3.6 0.9 0.968 0.08

ДМСО (40) I 0.02-0.5 13 1 1.5 0.9 0.988 0.04

II 0.003 - 0.04 24 3 3.2 0.5 0.961 0.04

Ацетонитрил (25) I 0.02-0.6 10 1 4.2 2.3 0.968 0.06

Ацетонитрил (30) II 0.003 - 0.07 15 1 1.1 0.2 0.993 0.05

[ВМ1т][ВР4] (70) I 0.01 - 0.3 11 1 1.0 0.7 0.982 0.07

У = (а ± Да) х + (Ъ ± ДЬ), где .у - V, мкМ*мин"1; х - концентрация ГК или о-ХФ, мМ.

Разработанные ферментативные методики определения ГК апробированы в анализе фармацевтического препарата «Гваяфен №3», применяемого в стоматологии. Это лекарственное средство представляет собой ограниченно растворимую в воде маслянистую жидкость, содержащую помимо ГК фенол, формальдегид и дексаметазон. Показано, что фенол и формальдегид не влияют на результаты определения ГК. Результаты ферментативного определения ГК в средах вода - ДМСО и вода - [ВМ1т][ВР4] представлены в табл. 14.

Проведенные исследования показали возможность использования ионной жидкости [ВМ1т][ВР4] для ферментативного определения ГК в жидких фармацевтических препаратах, ограниченно смешивающихся с водой.

Таблица 14. Результаты ферментативного определения ГК в средах ДМСО - вода и [ВМ1т][ВР4] - вода, полученные методом градуировочиого графика (I) и методом добавок (II) (п ~ 5, Р =■ 0.95) _*__

Среда Метод а ±Аа Ъ ±д ь Найдено гваякола,

10"3хмшГ' мкМхмин'1 г на 100 г

Вода -ДМСО (75:25 об.%) I II 2.2 4.4 0.3 0.7 0.3 0.8 0.4 0.3 49 ± 4 Паспортное содержание 41 ±3

Н20 - [ВМ1т][ВБ4] (20:80 об.%) II 4.0 0.8 1.5 0.7 31 ± 2 30

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения гидрофильных ИЖ, главным образом [ВМ1т][ВР4], как альтернативы полярным молекулярным органическим растворителям в катализируемых ПХ и ПС реакциях превращения их фенолышх субстратов. Несмотря на то, что использование ИЖ не позволило существенно улучшить аналитические характеристики ферментативных методик определения фенольных соединений по сравнению с характеристиками методик в присутствии молекулярных полярных растворителей, важным итогом исследования является выявленная «дружелюбность» ИЖ по отношению к нативным пероксидазам, возможность регулирования эффективности и селективности пероксидазного окисления фенольных субстратов путем варьирования природы катиона ИЖ. Это открывает возможности дальнейшего использования гидрофильных ИЖ (пока ещё относительно дорогих растворителей) в катализируемых пероксидазами реакциях превращения и определения их малорастворимых субстратов (например, серосодержащих органических соединений, фенилфенолов), в сенсорных технологиях при создании биочувствительных материалов как основы оптических и электрохимических биосенсоров. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования пероксидазы сои вместо пероксидазы хрена в ферментативных методах анализа водно-органических растворов.

ВЫВОДЫ

1. На основе выявленного стимулирующего действия гормона Т4 и 4-аминоанти-пирина на скорость реакций превращения средне окисляемых субстратов пероксидаз хрена и сои - допамина, адреналина, а также а-метилдопы, предложены индикаторные системы для их ферментативного определения в водной среде: допамип (адреналин) - Т4 - Н202, а-метилдопа - 4-аминоантипирин - Н202. Определение добутамина возможно без применения специальных приемов повышения скорости индикаторной реакции. Показано, что для определения катехоламинов целесообразнее использовать пероксидазу хрена.

2. С применением предложенных индикаторных систем разработаны чувствительные, простые и экспрессные ферментативные методики определения в водной среде добутамина, адреналина, допамина и а-метилдопы в диапазонах их

концентраций 5 - 20, 1 - 200, 0.5 - 300 и 10 - 100 мкМ соответственно. Разработанные методики превосходят известные спектрофотометрические по чувствительности в 5 раз, а по экспрессное™ в 2 - 4 раза (время анализа 15-20 мин). Методики успешно применены в анализе твердых и жидких лекарственных форм фармацевтических препаратов.

3. В результате изучения пяти ферментативных и одной неферментативной индикаторных систем показано, что для определения в водной среде эндопероксидов артемизинина и 1,2,4,5-тетраоксана целесообразно использовать системы: HCl-Н202 -1" и о-дианизидин - пероксидаза хрена - Н202 соответственно. Разработана неферментативная методика определения 0.15 - 1 мМ артемизинина; показана принципиальная возможность ферментативного определения 0.2 - 0.6 мМ 1,2,4,5-тетраоксана.

4. В результате сравнительного изучения кинетики катализируемых пероксидазами хрена и сои реакций окисления /ирет-бутилгидропероксидом гваякола и о-хлорфенола в присутствии N.N-диметилформамида, 1,4-диоксана, анетонитрила и ДМСО выбраны оптимальные биокатализатор (пероксидаза сои) и полярные молекулярные растворители (ацетонитрил и ДМСО), при использовании которых оба фенольных субстрата окисляются наиболее эффективно.

5. Проведение индикаторных реакций окисления гваякола и о-хлорфенола в присутствии гидрофильных ионных жидкостей - тетрафторборатов 1-бутил-З-метилимидазолия ([BMIm][BF4]) и ЬГ-бутил-4-метилпиридиния ([BMPy][BF4]) -вместо ДМСО, ацетонитрила и других полярных молекулярных растворителей обеспечивает сохранение 20 - 30 % ферментативной активности при высоких (60 - 80

06.%) содержаниях ИЖ в системе. В присутствии более 40 об.% ДМСО, ацетонитрила и других растворителей пероксидазы хрена и сои не катализируют окисление фенольных субстратов.

6. Выявлена зависимость эффективности превращения гваякола и о-хлорфенола пероксидазами в присутствии изученных гидрофильных ионных жидкостей от источника фермента, природы субстрата-восстановителя, а также природы катиона ионной жидкости и буферного водного раствора как её сорастворителя. Наиболее активным ферментом в реакции окисления гваякола в присутствии обеих ионных жидкостей является пероксидаза сои. При высоких (70 об.%) содержаниях [BMIm][BF4] пероксидаза хрена окисляет о-хлорфенол в 4 раза эффективнее, чем пероксидаза сои. В среде [BMPy][BF4] превращение о-хлорфенола не катализирует ни тот, ни другой фермент. Оптимальными буферными системами при окислении гваякола и о-хлорфенола в присутствии 80 и 70 об.% [BMIm][BF4] являются соответственно 0.05 М имидазол - HCl с pH 7.0 и 0.1 М 2-(М-морфолино)этансульфо-новая кислота - КОН с pH 5.5.

7. С использованием пероксидазы сои разработаны методики определения гваякола в средах вода-ДМСО (75:25 об.%) и вода-ацетонитрил (80:20 об.%) с с„ 0.2 и 0.5 мМ,

а также нода-[ВМ1т][ВР4] (20:80) и 8oaa-|BMPy][BF4l (40:60) с си 0.1 и 0.05 мМ

соответственно (v,.<0 06, п-3) Возможность практического использования предложенных ферментативных методик продемонстрирована на примере анализа ограниченно растворимого в воде стоматологического препарата «Гваяфеи №3». С применением пероксидаз хрена и сои разработаны методики определения о-хлорфенола с с„ 3 - 7 мкМ в водно-органических средах при их оптимальных составах и в присутствии 70 об.% [BMIm][BF4],

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях:

1. Поляков А.Е., Ябяоцкий К.В., Мугинова С.В., Веселоеа И.А., Шехоецоеа Т.Н. Ферментативное определение допамина в фармацевтических препаратах. // Зав. Лаб. Диагностика материалов. 2009. № 12. С. 18 - 23.

2. Мугинова С.В., Галимова А.З., Поляков А.Е., Шехоецоеа Т.Н. Ионные жидкости в ферментативном катализе и биохимических методах анализа: возможности и перспективы. Обзор. // Жури, аналит. химии. 2010. Т. 65. № 4. С. 341-362.

3. Muginova S. V., Gaiimova A.Z., Poliakov A.E., Shekhovtsova T.N. Hydrophilic ionic liquids as novel reaction media for the determination of guaiacol using horseradish and soybean peroxidases. //Mendeleev Commun. 2011. V. 21. P. 97 - 98.

4. Poliakov A.E., Dumshakova A.V., Muginova S: V., Shekhovtsova T.N. A peroxidase-based method for the determination of dopamine, adrenaline, and a-methyldopa in the presence of thyroid hormones in pharmaceutical forms. // Talanta. 2011. V. 84. P..710 -716.

5. Poliakov A.E.. Muginova S. V., Shekhovtsova T.N. Determination of catecholamines in pharmaceutical formulations. Review. II Curr. Top. Anal. Chem. 2011. V. 8. P. 51 - 75.

тезисах докладов:

1. Polyakov A.E., Muginova S.V., Shekhovtsova T.N. Application of stimulatory effect of L-thyroxine and related compounds in the reactions of peroxidases oxidation of catecholamines for their determination. International Conference Chimia 2009. Constanta, Romania. 2009, May 13 - 16. P. 46.

2. Мугинова C.B., Галимова A.3., Поляков A.E., Шехоецоеа Т.Н. Роль природы и состава реакционной среды — водной, водно-органической и ионных жидкостей — при определении субстратов и эффекторов щелочных фосфатаз и пероксидаз. Аналитика России-2009. Краснодар, 2009, 27 сентября - 3 октября. С. 144.

3. Veselova I.A., Muginova S.V., Kireyko A.V., Polyakov A.E., Shekhovtsova T.N. Determination of catecholamines and phenothiazanes using the effect of substratesubstrate activation in the reactions catalyzed by horseradish peroxidase. International conference «Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications». Arkhangelsk, 2009, June 12-24, P. 92.

4. Muginova S.V., Polyakov A.E., Sharapova V.Yu., Shekhovtsova T.N. Determination of phenolic substrates of plant peroxidases in water miscible ionic liquids and polar organic solvents. EUROANALYSIS-2009. Innsbruck, Austria. 2009, September 6-10. P127-B1.

5. Мугинова C.B., Веселоеа И.А., Поляков A.E., Олейник Л.И., Шехоецоеа Т.Н. Ферментативные методы определения катехоламинов и фенольных соединений в

готовых жидких и мягких лекарственных формах. I Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции». Москва. 2009, 1 - 4 декабря. С. 199-200.

6. Muginova S„ Veselova /., Ро!уакду_А^ Yablotskiy К., Shekhovtsova Т. Enzymatic determination of catecholamines: various approaches to enhancing sensitivity. Isranalytica 2010. Tel-Aviv, Israel. 2010, January 19-20. P. 120.

7. Поляков A.E„ Шарапова В.Ю., Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Гидрофильные ионные жидкости и полярные органические растворители в ферментативных методах определениях фенольных соединений. Конференция «Аналитическая химия - новые методы и возможности». Клязьма. 2010. 26 - 30 апреля. С. 229.

8. Мугинова С.В., Весепова И.А., Яблоцкий К.В., Поляков А.Е., Шеховцова Т.Н. Ферментативное определение катехоламинов в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях. Материалы семинара «Химический анализ медицинских объектов» в рамках выставки «Аналитика ЭКСПО-2011» Москва, 2011, 26 - 29 апреля. С. 30 - 34.

9. Muginova S.V., Poliakov А.Е., Myasnikova D.A., Shekhovtsova T.N. Application of hydrophilic ionic liquids for the reactions catalyzed by plant peroxidases, native and encapsulated in a cellulose matrix. «Biomaterials and bionanomaterials: Recent advances and safety - toxicology issues». Heraklion, Crete, Greece. 2011, May 5 - 12. P. 43.

10. Muginova S., Poliakov A., Myasnikova £>., Shekhovtsova T. Novel aspects of the application of water-miscible ionic liquids in catalysis by plant peroxidases: formation of the reaction media and supporting material for the enzyme immobilization. «EUROANALYSIS-2011». Belgrade, Serbia. 2011, September 11 - 15. BC21.

11. Poliakov A.j Petrova D., Muginova S., Shekhovtsova T. Novel approaches to kinetic determination of antimalarial compounds. «EUROANALYSIS-2011». Belgrade, Serbia. 2011, September 11 - 15. P. 34.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. Т.Н. Шеховцовой и сотрудникам лаборатории кинетических методов анализа за постоянное внимание и помощь в обсуждении результатов; д.х.н. А.А. Формановскому и к.х.н. Г.В. Колесникову за синтез ионных жидкостей; д.х.н., вед.н.с. А.О. Терентьеву (ИОХРАН им. Н.Д. Зелинского) за предоставленный препарат 1,2,4,5-тетраоксана; д.х.н. С.А. Еремину за образцы гормонов Т4 и 7V д.х.н. А.В. Пирогову и к.х.н. Е.Б. Пашковой за определение катехоламинов методом ВЭЖХ-МС; Е.А. Кочновой за проведение масс-спектрометрических исследований; к.х.н. Д.С. Косякову, к.х.н. ПЛ. Иванченко, а также стажеру М.В. Панфиювой и аспиранту А.В. Ладесову за помощь в проведении эксперимента в САФУг. Архангельска; д.х.н. Л.Г Томиловой за предоставлениеч роторного испарителя для высушивания ионных жидкостей; д.фарм.н. Е.И. Калениковой за организацию рефрактометрических измерений.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракты: №11868 от 25.05.2010 и №П991 от 27.05.2010) и РФФИ (гранты: №07-03-0055ба, М09-03-00823а).

Подписано в печать:

18.11.2011

Заказ № 6293 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Методы определения катехоламинов. в фармацевтических препаратах.

1.1. Спектроскопические, кинетические и биохимические методы определения катехоламинов.

1.1.1. Спектроскопические методы.

1.1.1.1. Спектрофотометрия в УФ и видимой областях спектра.

1.1.1.2. Люминесцентный метод.

1.1.1.3. Метод ядерного магнитного резонанса.

1.1.2. Кинетические методы.

1.1.3. Биохимические методы.

Глава 2. Определение эндопероксидных соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях.

2.1. Общие сведения об эндопероксидных соединениях.

2.2. Инструментальные методы определения антималярийных эндопероксидных соединений.

2.2.1. Хроматографические методы.

2.2.1.1. Методы газовой хроматографии.

2.2.1.2. Методы жидкостной хроматографии.

2.2.2. Оптические методы.

2.2.3. Ферментативные методы.

2.2.4. Электрохимические методы.

Глава 3. Применение ионных жидкостей' в биотехнологии и биоаналитической химии.

3.1. Общие сведения об ионных жидкостях.

3.2. Ионные жидкости в химическом анализе и биотехнологии.

3.3. Использование ионных жидкостей в ферментативном катализе и биохимических методах анализа.

3.3.1. ИЖ как реакционная среда для проведения ферментативных реакций.!.

3.3.2. Применение ионных жидкостей для создания оптических биосенсоров.

Экспериментальная часть.

Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений.

4.1. Исходные вещества.

4.2. Посуда, аппаратура.

4.3. Методики эксперимента.

4.4. Обработка результатов измерений.

Глава 5. Обоснование выбора изучаемых ферментов и определяемых соединений.

Глава 6. Пероксидазы хрена и сои в реакциях превращения' катехоламинов.

6.1. Кинетика реакций индивидуального пероксидазного окисления катехоламинов.

6.2. Кинетика реакций пероксидазного окисления катехоламинов в присутствии активаторов.

6.2.1. Пероксидазное окисление допамина в присутствии о-фенилендиамина.

6.2.2. Пероксидазное окисление катехоламинов в присутствии тироидных гормонов.

6.2.3. Пероксидазное окисление а-метилдопы в присутствии 4-аминоантипирина.

6.3. Разработка ферментативных методик определения катехоламинов и пирокатехина.

6.4. Ферментативное определение катехоламинов в фармацевтических препаратах.

Глава 7. Артемизинин и 1,2,4,5-тетраоксан в индикаторных реакциях с участием пероксидаз.

7.1. Спектрофотометрические системы.

7.2. Люминесцентные системы.

7.3. Разработка методик определения артемизинина и 1,2,4,5-тетраоксана.

Глава 8. Пероксидазное окисление гваякола и о-хлорфенола в водных и водно-органических средах.

8.1. Обоснование выбора молекулярных органических растворителей и гидрофильных ионных жидкостей.

8.2. Оптимизация условий пероксидазного окисления модельных фенольных соединений в водных и водно-органических средах.

8.2.1. Водная среда.

8.2.2. Среда вода-молекулярный органический растворитель.

8.2.3. Среда вода-гидрофильная ионная жидкость.

8.3. Сравнительный анализ кинетики пероксидазного окисления гваякола и о-хлорфенола в водной и смешанных средах.

8.4. Разработка ферментативных методик определения гваякола и о-хлорфенола в водно-органических средах и в присутствии ионных жидкостей.

8.5. Анализ фармацевтического препарата на основе гваякола.

Актуальность работы. Одним из актуальных направлений ферментативных методов анализа является разработка подходов к чувствительному, селективному и экспрессному определению ограниченно растворимых или нерастворимых в воде субстратов оксидоредуктаз в водно-органическом и неводном растворах пробы. Эта проблема сегодня стоит наиболее остро для растительных пероксидаз, которые инактивируются в присутствии органических растворителей, особенно полярных. В настоящее время для сохранения нативной структуры пероксидаз и, следовательно, обеспечения эффективного катализа в неблагоприятных для анализа ферментативными методами условиях предложен ряд подходов: иммобилизация биокатализатора на различных носителях, лиофилизация, заключение фермента в полиэлектролитные комплексы: и др. Альтернативным является подход, основанный на использовании в качестве среды для проведения ферментативных реакций вместо полярных молекулярных органических растворителей гидрофильных ионных жидкостей (ИЖ) - высокополярных растворителей ионного типа. ИЖ выгодно отличаются от органических растворителей возможностью регулирования их физико-химических свойств варьированием природы катиона и аниона, негорючестью, пренебрежимо малым давлением паров, термической устойчивостью, уникальной растворяющей способностью и др. Изучение пероксидазного катализа в ИЖ началось с конца 90-х гг., однако имеющиеся в литературе сведения отрывочны и порой противоречивы. Для решения вопроса о целесообразности применения гидрофильных ИЖ вместо полярных органических растворителей в реакциях с участием растительных пероксидаз, а также для оценки аналитических перспектив ИЖ в пероксидазном катализе актуальными представляются систематические исследования кинетики превращения одних и тех же субстратов в присутствии растительных пероксидаз и растворителей двух типов (ионного и молекулярного).

Практическая значимость таких исследований возрастет, если при их проведении будут сопоставлены каталитическая активность и субстратная специфичность двух коммерческих растительных пероксидаз: пероксидазы хрена, ПХ (высокоактивного и стабильного фермента, давно и успешно зарекомендовавшего себя в практике биохимического анализа), и пероксидазы сои, ПС (аналитические возможности которой пока изучены недостаточно; до конца не выявлен круг практических задач, для решения которых целесообразна замена ПХ на её более дешевый соевый аналог). Эти пероксидазы отличаются степенью гликозилирования и значениями изоэлектрической точки белка: ПХ — катионный фермент, а ПС — анионный.

Указанные различия мо1ут оказаться существенными при решении ещё одного круга задач, к числу которых относятся' проблемы ферментативного определения в>, водных средах некоторых медленно окисляемых субстратов пероксидаз (например, катехоламипов) и эндопероксидных соединений (ЭПС) — пространственно- затрудненных аналогов основного субстрата-окислителя, пероксида водорода: Актуальность таких задач обусловлена потребностью в чувствительных, селективных и одновременно экспрессных и простых методиках определения катехоламинов*(производных пирокатехина) и-антималярийных ЭПС в различных объектах, в частности в фармацевтических. Целиработызаключались в:

• выработке подходов к определению с использованием, ПХ" и* ПС медленно окисляемых и ограниченно растворимых в воде фенольных соединений; а также антималярийных ЭПС в водных и водно-органических средах;

• выборе препарата пероксидазы,, наиболее перспективного для определения; катехоламинов, антималярийных1 ЭПС (природных и синтетических) и производных фенола в водных и водно-органических растворах;

• оценке перспектив5 использованиям гидрофильных ИЖ вместо полярных молекулярных органических растворителей, в составе реакционной среды» для пероксидазного превращения и ферментативного определения фенольных соединений;

• разработке с использованием ПХ и ПС методик определения фенольных соединений и антималярийных ЭПС в фармацевтических препаратах.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи: о оптимизировать условия проведения реакций пероксидазного окисления катехоламинов в водной среде в отсутствие и присутствии активаторов; о выяснить оптимальные условия-проявления влияния антималярийных ЭПС на скорость различных индикаторных реакций, катализируемых пер оксид азами; о изучить кинетику реакций окисления катехоламинов и производных фенола (ГК и о-ХФ) в присутствии каждой пероксидазы в водной и смешанных средах (вода - полярный органический растворитель, вода - гидрофильная ИЖ) соответственно; о оптимизировать составы реакционных сред для проведения катализируемых ПХ и ПС реакций окисления ГК и о-ХФ /ирет-бутилгидропероксидом в присутствии молекулярных растворителей и гидрофильных ИЖ; о разработать ферментативные методики определения- ряда фенольных соединений и ЭПС в водных и водно-органических средах; о апробировать разработанные ферментативные методики в анализе фармацевтических препаратов.

Научная^ новизна работы. В результате проведенных систематических исследований! кинетики катализируемых ПХ и ПС реакций1 окисления катехоламинов (допамина (ДА), а-метилдопы (МД), адреналина (АД) и добутамина (ДБ)) и производных фенола (гваякола (ГК) и о-хлорфенола (о-ХФ)) выявлены, аналитические перспективы использования этих нероксидаз для, определения перечисленных соединений в водных и смешанных средах различного состава (вода - полярный молекулярный растворитель; вода - гидрофильная* ИЖ). Установлена зависимость скорости реакций превращения катехоламинов от источника выделения пероксидазы и природы субстрата-восстановителя, а реакций окисления ГК и о-ХФ ти^е/я-бутилгидропероксидом ещё и от природы катиона ИЖ и буферного раствора как сорастворителя. Показаны преимущества использования гидрофильных ИЖ (тетрафторборатов 1-бутил-З-метилимидазолия, [ВМ1ш][ВГ4], и К-бутил-4-метилпиридиния, [ВМРу] [ВГ4]) перед полярными молекулярными растворителями (диметилсульфоксидом, ацето нитрилом, Ы,]^диметилформамидом, 1,4-диоксаном) при проведении реакций пероксидазного окисления ГК и о-ХФ /ирет-бутилгидропероксидом в реакционных средах с содержанием воды не более 40 об.%.

С использованием ПХ предложены новые индикаторные системы для чувствительного, экспрессного и простого ферментативного определения ДА, МД, АД и ДБ в фармацевтических препаратах, а также для определения ТО. Показана целесообразность использования неферментативной индикаторной системы НС1 — Н202 -1" для определения АМ на уровне его концентраций в растительном сырье и фармацевтических препаратах.

Практическая значимость. Показано, что в гидрофильных ИЖ ([ВМ1т][ВР4] и [ВМРу][ВР4]) даже при их содержаниях > 60 об.% (в отличие от полярных молекулярных растворителей) в сочетании с оптимальными буферными растворами (сорастворителями ИЖ) и выбранным препаратом фермента сохраняется не менее 20% каталитической активности пероксидаз в реакциях превращения их фенольных субстратов.

Установленные в работе закономерности пероксидазного катализа в присутствии изученных полярных апротонных растворителей и гидрофильных ИЖ позволяют на этапе планирования эксперимента целенаправленно' выбирать подходящий растворитель для превращения и определения субстрата фенольной природы.

Практическую значимость имеют разработанные чувствительные, экспрессные и простые ферментативные методики определения в водных растворах ДБ, АД, ДА и МД, основанные на реакциях их окисления в отсутствие и присутствии активаторов (о-фенилендиамина, гормона Т4 и 4-аминоан-типирина), а также предложенные индикаторные системы (о-дианизидин - ПХ - Н202 и НС1 -Н202 -1") для ферментативного определения ТО и неферментативного определения АМ соответственно.

Автор выносит на защиту: результаты изучения кинетики реакций катализируемого ПХ и ПС окисления катехоламинов (ДА, МД, АД и ДБ) и пирокатехина пероксидом водорода в отсутствие и присутствии активаторов в водной среде; результаты изучения влияния АМ и ТО на скорость катализируемых ПХ реакций; данные по изучению каталитических свойств ПХ и ПС в реакциях окисления гваякола и о-хлорфенола пероксидом водорода и ятрет-бутилгидропероксидом в водной, водно-органической средах и в присутствии гидрофильных ИЖ; установленные условия и закономерности протекания пероксидазного окисления фенольных соединений в водной и водно-органических средах; ферментативные методики определения ряда катехоламинов, ТО в водных, а ГК и о-ХФ - водно-органических средах и в присутствии ИЖ, в том числе и в фармацевтических препаратах.

Обзор литературы

В обзоре литературы систематизированы и обсуждены сведения из научных публикаций, посвященных инструментальным методам, определения

I катехоламинов и антималярийных ЭПС в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях, а.также свойствам и применению ИЖ в биотехнологии и биохимических методах анализа.

183 Выводы

1. На основе выявленного стимулирующего действия гормона Т4 и 4-аминоанти-пирина на скорость реакций превращения средне окисляемых субстратов пероксидаз хрена и сои — допамина, адреналина, а также а-метилдопы, предложены индикаторные системы для их ферментативного определения в водной среде: допамин (адреналин) - Т4 - Н2О2, а-метилдопа — 4-аминоантипирин - Н202. Определение добутамина возможно без применения специальных приемов повышения скорости индикаторной реакции. Показано, что для определения катехоламинов целесообразнее использовать пероксидазу хрена.

2. С применением предложенных индикаторных систем разработаны чувствительные, простые и экспрессные ферментативные методики определения в водной среде добутамина, адреналина, допамина и а-метилдопы в диапазонах их концентраций 5 - 20, 1 - 200, 0.5 - 300 и 10 - 100 мкМ соответственно. Разработанные методики превосходят известные спектрофотометрические по чувствительности в 5 раз, а по экспрессности в 2 - 4 раза (время анализа 15-20 мин). Методики успешно применены в анализе твердых и жидких лекарственных' форм фармацевтических препаратов.

3. В результате изучения пяти ферментативных и одной неферментативной' индикаторных систем показано, что для определения в водной среде эндопероксидов артемизинина и 1,2,4,5-тетраоксана целесообразно использовать системы: HCl —Н202 —Г и о-дианизидин - пероксидаза хрена - Н202 соответственно. Разработана неферментативная методика определения 0.15-1 мМ артемизинина; показана принципиальная возможность ферментативного определения 0.2 - 0.6 мМ 1,2,4,5-тетраоксана.

4. В результате сравнительного изучения кинетики катализируемых пероксидазами хрена и сои реакций окисления /лреш-бутилгидропероксидом гваякола и о-хлорфенола в присутствии И^-диметилформамида, 1,4-диоксана, ацетонитрила и ДМСО выбраны оптимальные биокатализатор (пероксидаза сои) и полярные молекулярные растворители (ацетонитрил и ДМСО), при использовании которых оба фенольных субстрата окисляются наиболее эффективно.

5. Проведение индикаторных реакций окисления гваякола и о-хлорфенола в присутствии гидрофильных ионных жидкостей - тетрафторборатов 1-бутил-З-метилимидазолия ([ВМ1т][ВР4]) и ]чГ-бутил-4-метилпиридиния ([ВМРу][ВР4]) -вместо ДМСО; ацетонитрила и других полярных молекулярных растворителей обеспечивает сохранение 20 - 30 % ферментативной активности при высоких (60 -80 об.%) содержаниях ИЖ в системе. В присутствии более 40 об.% ДМСО, ацетонитрила и других растворителей пероксидазы хрена и сои не катализируют окисление фенольных субстратов.

6. Выявлена зависимость эффективности превращения гваякола и о-хлорфенола пероксидазами в присутствии изученных гидрофильных ионных жидкостей от источника фермента, природы субстрата-восстановителя, а также природы катиона ионной жидкости и буферного водного раствора как её сорастворителя. Наиболее активным ферментом в реакции окисления гваякола в присутствии обеих ионных, жидкостей является пероксидаза сои. При высоких (70 об.%) содержаниях [ВМ1ш][ВР4] пероксидаза хрена, окисляет о-хлорфенол в 4 раза эффективнее, чем пероксидаза сои. В среде [ВМРу][ВР4] превращение о-хлорфенола не катализирует ни тот, ни другой фермент. Оптимальными буферными системами при окислении гваякола и о-хлорфенола в присутствии 80 и 70 об.% [ВМ1т][ВР4] являются соответственно 0.05 М* имидазол - НС1 с рН 7.0 и 0.1 М 2-(Ы-морфолино)этансульфо-новая кислота - КОН с рН 5.5.

7. С использованием пероксидазы сои разработаны методики определения гваякола в средах вода-ДМСО (75:25 об.%) и вода-ацетонитрил (80:20 об.%) с с„ 0.2 и 0.5 мМ, а также вода-[ВМ1ш][ВР4] (20:80) и вода-[ВМРу][ВР4] (40:60) с сн 0.1 и 0.05 мМ соответственно (лу<0.06, п=3). Возможность практического использования предложенных ферментативных методик продемонстрирована на примере анализа ограниченно растворимого в воде стоматологического препарата «Гваяфен №3». С применением пероксидаз хрена и сои разработаны методики определения о-хлорфенола с с„ 3 - 7 мкМ в водно-органических средах при их оптимальных составах и в присутствии 70 об.% [ВМ1ш][ВР4].

1. Jacobs L., Samli A. C., Jedlik T. The nightmare of international product piracy. // 1.d. Market. Manag. 2001. V. 30. P. 499-509.

2. Next Generation Pharmaceutical Europe. Доступна онлайн по электронному адресу: http://www.ngpharma.eu.com/

3. Richard J., Wurtman M.D. Catecholamines and Neurologic Diseases. // N. Engl. J. Med. 1970. V. 282. P. 45-46:

4. Factor S:A}., Schneider A.S. Peripheral catecholamine output in Parkinson's disease: effects ofdmg treatment: //Exp. Neurol: 1995. V. 131\ P: 64-68:

5. Gil E.S., De Melm G.R. Electrochemical? biosensors fin; pharmaceutical analysis. II Brazilian J. Pharm. Sei; 2010. V. 46. P. 375-391.

6. Solich P., Sklenärovä H., Poläsek Mi, Karlicek R. Application of Flow Injection Technique im Pharmaceuticals Analysis. Part I::. Spectrophotomelric' andi Chemiluminescence Detection. http://www.flowinjection.com/Brochures/solich.pdf

7. Solich P., Sklenärovä H., Poläsek M., Karlicek R. Application of Flow Injection Technique in Pharmaceutical Analysis. Part ID: Other spectroscopic methods and electroanalytical detection:.// J. Flow Injection Anal. 2001. V. 18. P. 118-125.

8. Evgen'ev M.I., Garmonov S.Yu., Shakirova L.Sh. Flow-Injection Analysis of Pharmaceuticals. //J: Anal. Chem. 2001. V. 56. P. 313-323.

9. Perry M., Li Q., Kennedy R.T. Review of recent advances in analytical techniques for the determination of neurotransmitters. // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 653. P. 1— 22.

10. Poliakov A.E., Muginova S.V., Shekhovtsova T.N. Determination of catecholamines in pharmaceutical formulations. // Curr. Top. Anal. Chem. 2011. V. 8. P. 51-75.

11. Elizarova Т.Е., Shtyleva S. V., Pletneva Т. V. Using Near-Infrared Spectroscopy for the Identification of Pharmaceuticals and Drugs. // Pharm. Chem. J. 2008. V. 42. P. 432-434.

12. Alvarenga L., Ferreira D., Altekruse D., Menezes J.C., Lochmann D. Tablet identification using near-infrared spectroscopy (NIRS) for pharmaceutical quality control. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2008. V. 48. P. 62-69.

13. Полюдек-Фабини P., Бейрих Т. Органический анализ. Д.: Химия. 1981. 624 с.

14. El-Kommos M.E., Mohamed F.A., Khedr A.S. Spectrophotometric determination of some catecholamine drugs using metaperiodate. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1990. V. 73. P. 516-520.

15. Sorouraddin M.H., Manzoori J.L., Kargarzadeh E., Haji Shabani A.M. Spectrophotometric determination of some catecholamine drugs using sodium bismuthate. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. V. 18. P. 877-881.

16. Sajjan A. G., Melwanki M. В., Seetharamappa J. Spectrophotometric determination of certain vicinal dihydroxybenzene derivatives with sodium bismuthate. // J. Anal. Chem. 2001. V. 56. № 9. P. 827-829.

17. Vieira I.C., Fatibello-Filho O. Spectrophotometric determination of methyldopa and dopamine in pharmaceutical formulations using a crude extract of sweet potato root (Ipomoea batatas (L.) Lam.) as enzymatic source. // Talanta. 1998. V. 46. P. 559-564.

18. Nagaraja P., Murthy K.C.S., Rangappa K.S., Gowda N.M.M. Spectrophotometric methods for the determination of' certain catecholamine derivatives in pharmaceutical preparation. //Talanta. 1998. V. 46. P. 39-44.

19. Madrakian T., Afkhami A., Khalafi L., Mohammadnejad M. Spectrophotometric determination of catecholamines based on their oxidation' reaction' followed1 by coupling with 4-aminobenzoic acid. // J. Braz. Chem., Soc. 2006. V. 17. №7. P. 1259-1265.

20. Ribeiro P.R.S., Pezza L., Pezza H:R. Spectrophotometric determination of methyldopa in pharmaceutical formulations. // Eclet. Quim. 2005. V. 30. P. 23-28.205

21. Gadkariem E.A., Ibrahim K.E.E., Kamil N.A.A., Haga M.E.M., El-Obeid FLA. A new spectrophotometric method for the determination of methyldopa. // J. Saudi Pharm. 2009. V. 17. P. 303-309.

22. Aman T., Khan I. U., As lam N. Ahmad /.Spectrophotometric determination of methyldopa in pure and pharmaceutical preparations. //Anal. Lett. 1998. V. 31. P. 1007-1020.

23. Now- El-Dien F. A, El-Nahas R.G, El-Nahas A.G. Simple Analysis Used in Diagnosis and Follow-up of Schizophrenic Patients. // J: Autom. Methods Manage. Chem. 2006. V. 2006 P. 1-5.

24. AJkhami A., Nouri-Zadeh A. Sensitive-spectrophotometric determination of methyldopa and adrenaline. II Asian J; Chem. 2002. V. 14. № 2.P. 867-873.'.

25. Issopoulus P.B. High-sensitivity spectrophotometric determination of trace* amounts , of levodopa, carbidopa and (x-methyldopa. // J: Anal; Chem. 1990. V. 336. № 2. P. 124-128;

26. Wang H.Y., Sun Y., Tang B. Study on fluorescence property of dopamine and determination of dopamine by fluorimetry. // Talanta. 2002. V. 57. PI 899-907.

27. Kim W.H., Karim M.M., Lee S.H. Simultaneous determination of levodopa and carbidopa by synchronous fluorescence spectrometry using double scans. //Anal. . Chim. Acta: 2008; V. 619. P; 2-7.

28. Wang H.Y., Hui Q.S., Xu L.X., Jiang J.G., Sun Y. Fluorimetric determination of dopamine in; pharmaceutical products and urine using ethylenediamine as the fluorigenic reagent. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 437. P. 93-99.

29. Karim M.M., Alam S.M., Lee S.H. Spectrofluorimetric estimation of norephinephrine using ethy,enediamine condensation method. // J. Fluoresc. 2007. V. 17. № 4. P. 427-426.

30. Guo Y., Yang J., Wu X., Du A. A sensitive fluorimetric method for the determination of epinephrine. // J. Fluoresc. 2005. V. 15. P. 131-136.

31. Su Y., Wang J., Chen G. Determination of epinephrine based on its enhancement for electrochemiluminescence of lucigenin. // Talanta. 2005. V. 65. P. 531—536.

32. Afkhami A., Nematollahi D., Khatami H.A. Kinetic-spectrophotometric determination of L-dopa, methyldopa, dopamine and adrenaline. // Asian J. Chem. 2002. V. 14. P. 333-338.

33. Tubino M., Batista D.C.D.V., Rodrigues, J.A.R. Kinetic Method for the Determination of a-Methyldopa in Pharmaceutical Preparations: Analytical Procedure and Reaction Mechanism Considerations. // Anal. Lett. 2006. V. 39. P. 327-339.

34. Gotardo, M.A., Lima, L.S., Sequinel, R., Rufino, J.L., Pezza, L., Pezza, H.R. A simple spectrophotometric method for the determination of methyldopa using p-chloranil in the presence of Hydrogen Peroxide. // Eclectic Chem. 2008. V. 33. P. 712.

35. Pagani A.P., Cabezón M.A., Ibáñez G.A. Simultaneous Kinetic-Spectrofluorometric Determination of Levodopa and Carbidopa Using Partial Least-Squares Regression. // Anal. Sci. 2009. V. 25. P. 633-638.

36. Afkhami A., Khatami X.A. The determination of some catecholamines with the help of KI04 KI system. // J. Anal. Chem. 2003. V. 58. № 2. P. 157-160.i ii 207

37. Moccelini S.K., Fernandes S.C., Vieira I.C. Bean sprout peroxidase biosensor- based on L-cysteine self-assembled monolayer for the determination of dopamine. // Sens.

38. Actuators B. 2008'. Y. 133. P; 364-369.

39. Brondani D., DupontJ., Spinelli A., Vieira I.C. Development, of biosensor based on1. V,ionic liquid and corn peroxidase immobilized on chemically crosslinked chitin. //

40. Sens. Actuators B. 2009. V. 138. P. 236-243.

41. Mataveli L.R. V., Antunes N.J., Brigagao M.R.P.L., De Magalhaes C.S., Wisniewskii

42. C., Luccas,P.O. Evaluation ofa simple and*low cost potentiometric biosensor for pharmaceutical'and in vivo adrenaline determination.' // Biosens. Bioelectron. 2010. V. 26.' P. 798-802.

43. Sotomayor M.D.P.T., Tanaka A.A., Kubota L.T. Development of an enzymeless biosensor for the determination of phenolic compounds. I I Anal. Chim. Acta. 2002. V. 455. № 2. P. 215-223.

44. Sotomayor M.D.P.T., Tanaka A.A., Kubota L.T. Development of an Amperometric

45. Sensor Highly Selective For Dopamine and Analogous Compounds Determinationi ,

46. Using Bis(2,2'-Bipyridil) Copper(II) Chloride Complex. // Electroanalysis. 2003: V.15. P.' 787-796.

47. Sotomayor M.D.P.T., Tanaka A.A., Kubota L.T. Tris (2,2'-bipyridil) copper (II)chloride complex: a biomimetic tyrosinase catalyst in the amperometric sensor construction. // Electrochim. Acta. 2003. V. 48. P. 855-865.

48. De Oliveira R.W Z., Neves A., FreiVa/.C.Developmcntofanew biomimetic sensor based on an FelllFell complex for the determination of phenolic compounds. // Sens. Actuators B. 2008. V. 129. P. 424-430.

49. Balasoiu SC., Van Stadem R:-I.S., Van Staden J. F., Pruneanu S., Radii G.-L. Carbon and diamond paste microelectrode based on Mn(III) porphyrins for the determination of dopamine. // Anal. Cliim. Acta. 2010. V. 668. P. 210-207.

50. Liu C., Zhao Y., Wang Y. Artemisinin: current» state and- perspectives for biotechnologicallproduction-oJ&aniantimalarial ding; // Appli Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 11-20. .

51. Lius Y , Lu H, Pang F. Solubility of artemisinin* in: seven: different pure solvents' from (283.15 to 323.15) K. //J. Chem: Eng. Data. 2009. V.54: P. 762-764.

52. Muraleedharan К. M;, Avery M.'A. Progress in the development of peroxide-based!: anti-parasitic agents;■•// Drug discovery, today; 2009. V.14; Pi'793-803:

53. Biagini G.A., O'Neill P.M., Nzila A., Ward S.A., Bray P.G. Antimalarial chemotherapy: young gunssobbackto the,future?1// Trends Parasitoli 2003: Л09!PI " 479-487.

54. Bornstik K., Paik I., Shapiro T.A., Posner G.Hi, Antimalarial- chemotherapeutic peroxides: artemisinm^ yingzhaosui A andirelated? compounds: // Int. J. Parasitol. 2002. V. 32; P. 1661-1667.

55. HsuE. Thehistory ofqinghao inthe cHinesemateriamedica-: // Trans. R. Soc. Tropi, Med. Hyg: 2006. V. 10.0. P. 505-508.

56. Хаекинс Э.Дж.Э. Органические перекиси, их получение и реакции. М.: Химия, 1964. С. 300-313.

57. Терентъев А.О: Синтез и превращения органических.пероксидов. Реакции с использованием пероксида водорода. Дисс. . докт. хим. наук. М.:ИОХ, 2009. 332 с.

58. Liu S., Tian N., Li J., Huang J., Liu Z. Simple and rapid-micro-scale quantification of artemisinin in living Artemisia annua L. by improved gas chromatography with electron-capture detection. // Biomed. Chromatogr. 2009. V. 23- P. 1101-1107.

59. Sanjeev K., Uhlemann A-C, Haynes R.K. Artemisinins: mechanisms of action and potential for resistance. // Drug Resistance Updates. 2004. V. 7 P. 233-244.

60. Thomas C.G., Ward S.A., Edwards G. Selective determination, in plasma, of artemether and its major-metabolite, dihydroartemisinin, by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection. // J. Chromatogr. 1992. V. 583. P. 131— 136.

61. Shishan Z. High-perfomance liquid chromatographic determination of artemisinin (Qinghaosu) in human plasma and saliva. // Analyst. 1987. V. 112. P. 661-664.

62. Edwards G. Measurement of artemisinin and its derivatives in biological fluids. // Trans. Royal Soc. Tropical Med. Hygiene. 1994. V. 88. P. 37-39.

63. CoronaTM1 charged aerosol detector, application note: Artemisinin and derivatives. http://data.radanal.cz/corona/70-6466.pdf211 ' . • ■ '

64. Avery B.A., Venkatesh K.K., Avery MA Rapid determination of artemisinin and related analogues using high-performance liquid chromatography and an evaporative light scattering detector. // J. Ghromatogr., B. 1999: V. 730. P. 71-80.

65. Koobkokkruad T., ChochaiA., Kerdmanee C., De-Eknamkul W. TLG-densitometric analysis of artemisinin for the rapid screening of high-producing plantlets of Artemisia annua L. II Phytochem. Anal. V. 18. P. 229-234.

66. Application note: Determination of artemisinin in artemisia annua leaf by HPTLG. http://www.sepscience.com/GetMethod/b5193783-0fb5-48i3-aa2e-256di3701a9d

67. Sreevidya T.V., Narayana B. Spectrophotometric determination of artemisinin and dihydroartemisinin. // Indian J. Chem. Tech. 2008. V. 15. P. 59-62.

68. Sreevidya .T. V., Narayana B. A simple and rapid spectrophotometric method for the determination of artesunate in pharmaceuticals; // Eur. J. Anal: Chem. 2009. V.4. P.119.126. . ■

69. Bhárati A., Sabat S.C. A spectrophotometric. assay for quantification of artemisinin. // Talanta. 2010. V. 82. P. 1033-1037.

70. Chen L., Liu L., Shen H. Spectrofluorimetric determinations of artemisinini with pyronine B as the substrate for horseradish peroxidase. // Ghin. Sci. Bulletin. 2005. V. 50. № 17. P. 1834-1838.

71. Chen L., Yin H:, Yang Z, Zhang K., Liu L., Shen H. Fluorescence determination of artemisinin using tyrosinase as catalyst and pyronine B as monitor. // Chin. J. Anal. Chem. 2005. V. 23. P. 1047-1052.

72. Celebi T., Arik M., Onganer Y. Analysis of fluorescence qtienching of pyronin B and pyronin Y by molecular oxygen in aqueous solution. // J. Lumin: 2007. Y. 126. P. 103-108.

73. Yang X., Gan Т., Zheng X, Zhu D., Wu K. Electrochemical determination of artemisinin using a multi-wall carbon nanotube film-modified electrode. // Bull. Korean Chem Soc. 2008. V. 29. P. 1386-1390.

74. Gong F., Xiao Z., Cao Z., Wu D: A selective artemisinin-sensor using metalloporphyrhr as a recognition element entrapped in the Au-nanoparticles-chitosan modified electrodes. // Talanta. 2007. V. 72. P. 1453-1457.

75. Debnath C., Haslinger E., Likussar W., Michelitsch A. Determination of the antimalaria drug artemether in pharmaceutical preparations by differential pulse polarography. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 41. P. 638-643.

76. Кустов JI.M., Васина T.B., Ксенофонтов В.А. Ионные жидкости как каталитические среды. // Рос. хим. журн. Сер. хим. 2004. Т. 48. № 6. С. 13-35.

77. Hagiwara R., Ito Y. Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions. // J. Fluor. Chem. 2000. V. 105. P: 221-227.

78. Ionic liquid in Synthesis. / Ed. P. Wasserscheid, T. Welton. Weinheim: Wiley-VCH Verlag, 2002. 364 p.

79. Olivier-Bourbigou H., Magna L. Ionic liquids: perspectives for organic and catalytic reactions. // J. Mol. Cat. 2002: V. 182-183. P. 419-437.

80. Мугинова-, C.B., Галимова A.3., Поляков A.E., Шеховцова Т.Н.: Ионные жидкости в ферментативном- катализе и биохимических методах анализа: возможноси и перспективы. // Журн. анал. химии: 2010: Т. 65. № 4. С. 341-362.

81. Асланов JI.A., Захаров M.A., Абрамычева H.JI. Ионные жидкости в'ряду растворителей: М.: МГУ, 2005. 272 с.

82. Pham Т.Р.Т., Cho C.-W., Yun Y.-S. Environmental fate and toxicity of ionic liquids: A review. // Water Res. 2010. V. 44. P. 352-372.

83. Wei D., Ivaska A. Application of ionic liquids in electrochemical sensors. // Anal. Chim. Acta. 2008. V. 607. P. 126-135.

84. Rantwijk F., Lau R.M., Sheldon R.A. Biocatalytic transformations in ionic liquids. // Trends Biotechnol. 2003. V. 21. № 3. P. 131-138.

85. Fletcher K.A., Pandey S. Effect of water on the solvatochromic probe behavior within room-temperature ionic liquid l-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate. // Appl. Spectr. 2002. V. 56. № 2. P. 266-271.

86. Ropel L., Belveze L.S., Aki S.N.K., Stadtherr M.A., Brennecke J.F. Octanol-water partition coefficients of imidazolium-based ionic liquids. // Green Chem. 2005. V. 7. № 2. P. 83-90.

87. Diaz-Garcia M.E., Valencia-Gonzalez M.J. Enzyme catalysis in organic solvents: a promising field for optical biosensing. // Talanta. 1995. V. 42. № 11. P. 1763-1773.

88. Kaar J.L., Jesionowski A.M., Berberich J.A., Moulton R., Russel A.J. Impact of ionic liquid physical properties.on lipase activity and stability. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 4125-4131.

89. Тяги P., Гупта M.H. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков (ферментов). // Биохимия. 1998. Т. 63. № 3. С. 398-407.

90. Zhao H., Baker G.A., Song Z., Olubajo O., Zanders L., Campbell S.M. Effect of ionic liquid properties on lipase stabilization under microwave irradiation. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009. V. 57. P. 149-157.

91. Tran C.D., Lacerda S., Oliveira D. Absorption of Water by Room-Temperature Ionic Liquids: Effect of Anions on Concentration and State of Water. // Appl. Spectr. 2003. V. 57. № 2. P. 152-157.

92. Хачатрян K.C. Применение ионных жидкостей для экстракции и определения органических соединений. Дисс. . канд. хим. наук. М.: МГУ, 2006. 173 с.

93. Serdakowski A.L., Dordil J.S. Enzyme activation for organic solvents made easy-.-// Trends Biotechnol. 2007. V. 26. № 1. P. 48-54.

94. Sgalla S., Fabrizi G., Gacchi S:, MaconeA, BonamoreA.,BofjiA. Horseradish peroxidase imibnic liquids:,Reactions with water insoluble phenolic substrates. // J. MolKCat: B::Ehzymi 2007: V; 44^ Pi 144-1^81

95. Oter O., Ertekin- K., Derinkyu S. Photophysical and! optical oxygen sensing-ptoperties;'of4ris(bipy^ liquid modified solLgeltmatrix: // Mater. Chem:.Phys; 2009!:^: 113; P:322^328i

96. VH. BorisoviS.Mi,,Waldhierbased! onsilicone-encapsulated* room-temperaturer ionic: liquids. // Chem. Mater. 2007. V. 19. P. 6187-6194. ; ; \ .

97. Kragl.U., EcksteimM^KaftzikN. Enzyme catalysis in^ionic liquids; // Gurr. ©pins

98. Biotechnol. 2002. V. 13. P. 565-57L 139; El Seoud O.A., Koschella A, Fidale L.C., Dorn S:, Heinze T. Applications of Ionic Liquids in Carbohydrate Chemistry: A Window of Opportunities. // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 2629-2647.

99. Xie H., Zhang S., Li S. Chitin and chitosan dissolved in ionic liquids as reversible sorbents of C02. // Green Chem. 2006, V. 8. P. 630-633.

100. Li B., Filpponen I., Argyropoulos DiS. Acidolysis of woodsin ionic liquids. // J. Ind; Eng. Chem. 2010. V. 49. P. 3216-3136.

101. Turner MiB:, Spear S.K., Huddleston J.G., Holbrey J.D;, Rogers R.D- Ionic liquid salt-induced inactivation and unfolding of cellulose from Trichoderma reesei. // Green Chem. 2003. V. 5. № 4. P. 443-447.

102. Rantwijk F., Secundo F., Sheldon R. Structure and activity Candida antarctica lipase B in ionic liquids. // Green Chem. 2006. V. 8; № 31 P. 282-286.

103. Okrasa K., Guibe-Jampel E., Therisod M. Ionic Liquids as a New Reaction Medium for, Oxidase—Peroxidase-Catalyzed Sulfoxidation. // Tetrahedron: Asymmetry. 2003. V. 14. P. 2487-2490.

104. Gas Chromatography. // Anal. Chem: 2004. V. 76. P. 6819-6822. 161. Qiu H., Jiang S., Liu X. N-methylimidazolium anion-exchange stationary phase for high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1103: P. 265-270.

105. Waichigo M.M., Riechel T.L., Danielson N.D. Ethylammonium Acetate as a Mobile Phase Modifier for Reversed Phase Liquid Chromatography. // Chromatographia. 2005. V. 61. P. 17-23.

106. Waichigo M.M., Danielson N.D. Comparison of Ethylammonium Formate to Methanol as a Mobile Phase Modifier for Reversed Phase Liquid Chromatography. // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 599-606.

107. Waichigo M.M., Hunter B.M., Riechel T.L., Danielson N.D. Alkylammonium formate ionic liquids as organic mobile phase replacements for reversed-phase liquid chromatography. // J. Liq. Chromatogr. Rel: Technol; 2007. V. 30. P. 165184.

108. He L., Zhang W., Zhao L., Liu X., Jiang S. Effect of l-alkyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids as the eluent on the separation of ephedrines by liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1007. P. 39-45.

109. Zhang W., He L., Gu Y., Liu X., Jiang S. Effect of Ionic Liquids as Mobile Phase Additives on Retention of Catecholamines in* Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. //AnaL Lett. 2003. V. 36: P. 827-838.

110. Electrodeposition from ionic liquids. / Ed. F. Endres, D: MacFarlane, A. Abbotta. Weinheim: Wiley-VCH Verlag, 2008. P. 66.

111. Yang WW., Lu Y. С., XiangZ.Y., Luo G.S. Monodispersed microcapsules enclosing ionic liquid of l-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate. // React. Funct. Polym. 2007. V. 67. P. 81-86.

112. Klibanov A.M. Improving enzymes by using them in organic solvents. // Nature. 2001. V. 409. P. 241-246.

113. Zhao H. Biocatalysis in ionic liquids. Доступна онлайн по электронному адресу: http://www.scitopics.com/Biocatalysisinionicliquids.html.

114. Roosen С., MiXller P., Greiner L. Ionic liquids in biotechnology: applications and perspectives for biotransformations. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 81. P. 607-614.

115. Sheldon R.A., Madeira L.R., Sorgedrager M.J., Van, Rantwijk F., Seddon K.R. Biocatalysis in ionic liquids. // Green Chem. 2002. V. 4. № 2. P. 147-151.

116. Electrochemical; aspects of ionic liquids. / Ed; Hi Ohno. Hoboken: Wiley-Interscience, 2005. 408 p.

117. Lozano P., Diego Т., Iborra J.L. Immobilization of enzymes, for use in ionic liquids. In Methods in biotechnology: immobilization of enzymes and cells. / Ed. by J.M. Guisan. Totowa, USA.: Humana Press Inc., 2006. V. 22. P. 257-268.

118. Sheldon R. Catalytic reactions in ionic liquids. // Chem. Commun. 2001. P. 2399-'2407. . ■:'■"'■.'. .

119. Quijano G., Convert A., Amrane A. Ionic liquids: Applications and future trends in bioreactor technology. // Bioresourse Tech. 2010. V. 101. P. 8923-8930.

120. Мартинек К., Левашов AtBi, Клячко H.JIi, Березит ШВ; Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях. Стабилизация фермента путем включения в обращенные мицеллы. // Дою1. АН СССР. 1977. Т. 236. №4. С. 920-923.

121. Schofer S.H., Kaftzik N., Wasserscheid P., Kragl U. Enzyme catalysis in ionic liquids: lipase catalysed; kinetic resolution of 1-phcnylethanol. with improved enantioselectivity. // Chem. Commun. 2001. V. 46. P. 425-426.

122. Madeira LaurR-,; Van1 Rantwijk F., Seddon K.R., Sheldon R.A. Lipase-catalyzed i^ctions;in;.ionic-liqmds:7/ Org; i^tt;.2000;''V. 2. P: 4189-4191.

123. Kim K.-W., Song B;, Choi M.-Y., Kim M.-J. Biocatalysis in Ionic Liquids: Markedly Enhanced Enantioselectivity of Lipase. // Org. Lett. 2001. V. 3. P. 1507-1509.

124. Husum T.L., Jorgensen C.T., Christensen M.W., Kirk O. Enzyme catalyzed synthesis in ambient temperature ionic liquids. // Biocatal. Biotransform. 2001. V. 19. P. 331-338.

125. ParkS., Kazlauskas R.J. Improved preparationand use ofroom-temperature ionic liquids in lipase-catalyzed enantioand regioselective-acylations. // J. Org. Chem.2001: V. 66. P. 8395-8401.

126. Moon Y.H., Lee S.M., Ha S.LI., Koo Y.-M. Enzyme-catalyzed reactions in ionic liquids. // Korean J. Chem. Eng. 2006. V. 23. № 2. P. 247-263.

127. Silva; W.S:D;, Lapis A.A.M, Suarez P;A:Z., Neto , B A.D. Enzyme-mediated epoxidation of methyl oleate:supported!;by immidazolium-based ionic liquids. // J. Mol: Cat. B: Enzym. 2011. V. 68. P. 98-103. ;

128. Yuan Y, Bat S., Sun Y. Comparison of lipase-catalyzed enantioselective esterification of (±)-menthol in ionic liquids and organic solvents. I I. Pood; Chem. 2006. V: 97. P. 324-330;

129. Nara SiJ., Hdrjani J:R:, Salunkhe M.M. Lipase-catalysed transcsterification in ionic liquids and organic solvents: a comparative study. // Tetrahedron Lett. 2002. Y: 43; P. 2979-2982. '

130. De Diego T., Lozano P., Abad M.A., Steffensky K, Vaultier M, Iborra J:L. On the nature of ionic liquids and their effects on lipases that catalyze ester synthesis; // J. Biotechnol. 2009. V. 140; P. 234-241.

131. Maruyama T., Yamamura H., Kotani T., KamiyaN., Goto M. Poly (ethylene glycol-lipase complexes that are highly active and enantioselective in ionic liquids. // Org. Biomol Chem. 2004. V. 2. № 8. P. 1239-1244.

132. Itoh T., Akasaki E., Kudo K, Shirakami S. Lipase-catalyzed enantioselective acylation in the ionic liquid solvent system: Reaction of enzyme anchored to the solvent. // Chem. Lett. 2001. V. 30. P. 262-263.

133. Lozano P., De Diego T., Carrie D., Vaultier M., Iborra J.L. Continuous green biocatalytic processes using ionic liquids and supercritical carbon dioxide. // Chem. Commun. 2002. V. 46. P. 692-693.

134. Reetz M.T., Wiesenhofer W., Francio G., Leitner W. Biocatalysis in ionic liquids: batchwise and continuous flow processes using supercritical carbon dioxide as the mobile phase. // Chem. Commun. 2002. V. 46. P. 992-993.

135. Zhao H., Malhotra S. V. Enzymatic resolution of amino acid esters using ionic liquid N-ethyl pyridinium trifluoroacetate. // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 1257-1260.

136. Noritomi H., Suzuki K., Kikuta M., Kato S. Catalytic activity of a-chymotrypsin in enzymatic peptide synthesis in ionic liquids. // Biochem. Eng. J. 2009. V. 47. P. 2730.

137. Eckstein M., Sesing M., Kragl U., Adlercreutz P. At low water activity a-chymotrypsin is more active in an ionic liquid than in non-ionic organic solvents. // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 867-872.

138. Lou W.-Y., Xu R., Zong M.-H. Hydroxynitrile lyase catalysis in ionic liquid-containing systems. // Biotechnol. Lett. 2005. V. 27. P. 1387-1390.

139. KaftzikN., Wasserscheid P., Kragl U. Use of ionic liquids .to increase the yield and enzyme stability in^the 3-galactosidase catalysed synthesis of N-acetyllactosamine. // Org. Proc. Res. Dev. 2002. V. 6. P. 553-557.

140. Yang Z., Yue Y.-J., Xing M. Tyrosinase activity in ionic liquids. // Biotechnol. Lett.2008. V. 30. P. 153-158.

141. Yang Z., Yue Y.-J., Huang W.-C., Zhuang Z.-M., Chen Z.-T., Xing M. Importance of the ionic nature of ionic liquids in« affecting enzyme performance. // J. Biochem.2009. V. 145. P. 355-364.

142. Laszlo J. A., Compton D. L. Comparison of peroxidase activities of hemin, cytochrome c and microperoxidase-11 in molecular solvents and imidasolium-based ionic liquids. // J. Mol. Cat B: Enzym. 2002. V. 18. P. 109-120.

143. Hinckley G., Mozhaev V. V., Budde C., Khmelnitsky Y.L. Oxidative enzymes possess catalytic activity in system with ionic liquids. // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 2083-2087.

144. Pinto P.C.A.G., Saraiva M.L.M.F.S., Lima J.L.F.C. Oxidoreductase behavior in ionic liquids: A review. // Anal. Sci. 208. V. 24. P. 1231-1238.

145. Hong E. S., Kwon O. Y. Ryu K. Strong substrate-stabilizing effect of water-miscible ionic liquid BMIM.[BF4] in the catalysis of horseradish peroxidase. // Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 529-533.

146. Cao Q., Quan L„ He C., Li N. Li K., Liu F. Partition of horseradish peroxidase with maintained activity in aqueous buphasic system based on ionic liquid. // Talanta. 2008. V. 77. P. 160-165.

147. Sgalla S., Fabrizi G., Cacchi S., Macone A., Bonamore A., Boffi A. Horseradish', peroxidase in ionic liquids. Reactions with water insoluble phenolic substrates // J. Mol. Cat. B: Enzym. 2007. V. 44. P. 144-148.

148. Das D., DasguptaA., DasPlK. Improved, activity of horseradish peroxidase (HRP) in 'specifically designed' ionic liquid. // Tetrahedron-Lett. 2007. V. 48. P. 56355639.

149. Sanjilippo C., D'AntonaN., Nicolosi G. Chloroperoxidase from Caldariomyces fumago is active in the presence of an ionic liquid;as co-solvent. // Biotechnol. Lett. 2004i V. 26. P. 1815-1819:

150. Lichtenecker R.J., SchmidW. Application of various ionic liquids as cosolvents for chloroperoxidase-catalysed biotransformations. // Monatsh. Chem. 2009.V. 140. P. 509-512.

151. Xiong H.Yu, Chen T., ZhangX.H., Wang S. Electrochemical property and analysis application» of biosensors in miscible nonaqueous media—Room-temperature ionic liquid. // Electrochem. Commun. 2007. V. 9. № 7. P. 1648-1654.

152. Wang S.-F., Chen T., Zhang Z.-L., Pang D.-W. Activity and stability of horseradish peroxidase in hydrophilic room temperature ionic liquid and its application in nonaqueous biosensing. // Electrochem. Commun. 2007. V. 9. № 6. P. 1337-1342.

153. Turner M.B., Spear S.K., Holbrey J.D., Daly D.T., Rogers R.D. Ionic liquid-reconstituted cellulose composites as solid support matrices for biocatalyst immobilization. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2497-2502.

154. Klein M.P., Scheeren C.W., Lorenzoni A.S. G., Dupont J., Frazzon J., Hertz P.F. Ionic liquid-cellulose film for enzyme immobilisation. // Process Biochem. 2011. V. 46. P. 1375-1379.

155. Khmelnitsky Yu.L., Mozhaev V.V., Belova A.B., Sergeeva M. V., Martinek K. Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 31-41.

156. Gupta M.N. Enzyme function in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 203. P. 25-32.

157. Gupta M.N., Roy I. Enzymes in organic media. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 2575-2583.

158. Shannon' L.M., Kay E., Lew J.Y. Peroxide isozymes from horseradish roots. Isolation and physicakproperties. // J. Biol. Chem. 1966. V. 249. № 9. P. 21662172.

159. Amisha K.J.K., Behere D.V. Activity, stability and conformational flexibility of seed coat peroxidase. // J. Inorg. Biochem. 2003. V. 94! P: 236-242.

160. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.429с.

161. Дядченко В.П, Трушков И.В1, Брусова Г.П'. Синтетические методы органической химии. М.: МГУ, 2004. С. 128.

162. Greary X., Willis E.D. Preparation of l-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate. // Org. Syntheses. 2005. V. 82. P. 166-169:

163. Кольтгофф И.М., Сендел Е.Б. Количественный анализ. М.: Госхимиздат, 1948. С. 822.

164. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. 2-е изд. М.: Химия, 1967. 200 с.

165. Waite J.H. Calculating extinction coefficients for enzymatically producedf o-quinones. //Anal. Biochem. 1976. V. 75. P. 211-218.

166. Garcia-Moreno M., Moreno-Conesa M., Rodriguez-Lopez J.N., Garcia-Canovas F., Varon R. Oxidation of 4-/er/-butylcatechol and dopamine by hydrogen peroxide catalysed by horseradish peroxidase. //Biol. Chem. 1999. V. 380. P. 689-694.

167. Chen C., Thakker D.R. The Fallacy of using adrenichrome reaction for measurement of reactive oxygen species formed during cytochrome P450-mediatedmetabolism of xenobiotics. // J. Pharmacology Experimantal Therapeutics. 2002. V. 300. P. 417-420.

168. Биохимические методы; анализа: Том 12; Под ред. Дзантиева Б.Б. М.: Наука; 2010.391 с. .

169. Берлина А.Н., Жердев А.В:, Дзаитиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Применение пероксидазы . сои; для иммуноферментного определения сульфаметоксипирадазина в молоке. // Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. №6. С. 614-620;

170. Alpeeva I.S., Sdkharov LYu.,. Efremov Е.Е. Use, of soybean peroxidase in chemiluminescent ELISA. // J. Agr. Food: Ghem; 2006,. V. 54. P. 1584-1587.

171. Vdovenko M.M., Zubkov A.V., Kuznetsova G.I., Delia Ciana L., Kuzmina N.S., Sakharov LYu. Development of ultra-sensitive soybean peroxidase-based Cl-ELISA fori the determination of human thyroglobulin. // J. Immunol; Methods. 2010. V. 362. P. 127-130.

172. Heller A., Vreeke M.S. E. Heller and Company. Soybean peroxidase electrochemical sensor, United States Patent. 1997. US 5665222.

173. Kenausis G., Chen Q., Heller A. Electrochemical glucose and lactate sensors based on "wired" thermostable soybean peroxidase operating continuously and stably at 37 degrees C. // Anal. Chem. 1997. V. 69. № 6. P. 1054-1060.

174. Wright H., Nicell J.A. Characterization of soybean peroxidase for the treatment of aqueous phenols. //Bioresour. Technol. 1999. V. 70: P. 69-79.

175. Al-Ansari M.M., Steevensz A., Al-AasmN., Taylor K.E., Bewtra J.K., Biswas N. Soybean peroxidase-catalyzed removal of phenylenediamines and benzenediols from-water. // Enzyme Microb. Technol. 2009/ V. 45. P." 253-260.

176. Henriksen A., Mirza O., Indiani C., Teilum> G., Wellinder K.G., Gajhede M. Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. // Protein Sci. 200L V. 10: P. 108-115.

177. McEldoon J. P., Dordick J. S. Extraordinary thermal stability of soybean peroxidase. //Biotechnol: Prog. 1996. V. 12. P. 555-558.

178. Amisha Kamal J.K., Behere D.V. Thermal , and'conformational stability of seed coat soybean peroxidase. // Biochem: 2002. V. 41. P: 9034-9042.

179. Ryan B.J., Carolan N., O'Fágáin С. Horseradish' and soybean peroxidases: comparable tools for, alternative niches. // Trends Biotechnol. 2006.,V. 24. P. 355збз:

180. Geng Z., Rao K.J., Bassi A.S., Gijzen M., Krishnamoorthy N. Investigation of biocatalytic properties of soybean seed hull peroxidase. II Catalysis Today. 2001. V. 64. P. 233-238.

181. Azevedo A.M., Prazeres D.M.F., Cabral J.M.S., Fonseca L.P. Stability of free and immobilized peroxidase in aqueous-organic solvents mixtures. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001. Y. 15. P. 147-153.

182. Laverty R. Catecholamines: role in, health and disease. // Drugs. 1978. V. 16. P. 418-440.

183. Альберт А., Сержент E. Константы ионизации кислот и оснований. М.Ленинград: Химия, 1964. С. 126.

184. Антоновский ВШ. Бузланова М.М. Аналитическая-, химия органических пероксидных соединений: М:: Химия; 1978. 308 с.

185. Karon< B.S., Daly Т.М., Scott* G. Mechanisms, of dopamine and dobutamine interference' in biochemical tests- that, use peroxide and peroxidase to generate chromophore. // Clin. Chem. 1998. V. 44: P. 155-160.

186. Веселова И:А., Кирейко A.B., Шеховцова Т.Н. Повышение каталитической, активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном. // Прикл. биохим. микробиол. 2009. Т. 45. № 2. С. 1-6.

187. Шеховцова Т.Н., Мугинова С.В., Веселова И.А. Определение ионов металлов с использованием нативных и иммобилизованных ферментов. // Рос. хим. журн. 2004. Т. 48. № 4. С. 73-82.

188. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.: МГУ, 1981. 92 с.

189. Dunford H.B., Stillman J.S. On the function and mechanism of action of peroxidases. // Coord. Chem. Rev. 1976. V. 19. P. 187-251.

190. Bisaglia M, Mammi S., Bubacco L. Kinetic and structural analysis of the early oxidation productsof dopamine. //Ji Biol. Chem: 2007. V. 282. P. 15597-15605.

191. Weidman S.W., Kaiser E.T. The Mechanism of the periodate oxidation of aromatic systems. Ill: A kinetic: study of the periodate oxidation of catechol. // J. Am. Chem. Soc. 1966. V. 88. № 24. P. 5820-5827.

192. Lebedeva O.V., Ugarova NN. Mechanism of peroxidase-catalyzed oxidation. Substrate-substrate activation in horseradish peroxidase-catalyzed reactions. // Russ. Chem. Bull. 1996. V. 45. № 1. P. 18-25.

193. Bagirova N.A., Shekhovtsova T.N., Shopova E.A., Vanlluystee R.B. Enzymatic determination of a- and р-naphthols using peanut peroxidase. // Mendeleev Commun. 1998. V. 8. P. 155-157. '

194. Klebanoff S.J. An effect of thyroxine1 and related compounds on the oxidation of certain hydrogen donors by the peroxidase system. // J. Biol. Chem. 1959. V. 234. № 9. P. 2437-2442.

195. Whybrow P.C., Prange A.J. A hypothesis of thyroid-catecholamine-receptor interaction: its relevance to affective illness. // Arch. Gen. Psychiatry. 1981. V. 38. P. 106-113.

196. Yamaguchi Yo., Hayashi Ch. Determination of urinary total phenolic compounds with use of 4-aminoantipyrine: suggested screening test for hyperthyroidism and for catecholamine-producing tumor. // Clin. Chem. 1977. V. 23. № 11. P. 2151-2154.

197. Багирова H.A. Ферментативное определение фенолов и ртути(П) с использованием пероксидазы арахиса. Дис. . кан. хим. наук. М.:МГУ, 2000. 262 с.

198. Kaizer J., Csonka R., Speier G. TEMPO-Initiated oxidation of o-phenylenediamine to 2,3-diaminophenazine. // React. Kinet. Catal. Lett. 2002. V. 75. № 2. P. 367-374.

199. Шеховцова Т.Н., Стародумова H.H., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения ртути. //Журн. аналит. химии. 1987. Т. 42. № 10. С. 1824-1828.

200. Попова И.М. Ферментативный метод определения физиологически активных веществ с применением пероксидазы. Дис. . кан. хим. наук. М.:МГУ, 1981. 232 с.

201. Balasz L., Pungor E. Application of standard solution of methylglucamine in acid end point titration with high-frequency display. // Michrochim. Acta. 1962. V. 50. P. 309-313.

202. Takayama K., Nakano M. Mechanism of thyroxine-mediated oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide in the peroxidase-hydrogen peroxide system// Biochem. 1977. V. 16. № 9. P. 1921-1925.

203. Curulli A. Electrochemical direct determination of catecholamines for the early detection of neurodegenerative diseases. // Sensors. 2009. V.9. P. 2437-2445.

204. Izaoumen N., Cubillana-Aguilera L.M., Naranjo-Rodríguez I., Hidalgo-Hidalgo de Cisneros J.L., Bouchta D., Temsamani K.R., Palacios-Santander J.M. P-Sonogel

205. Carbon electrodes: A. new alternative: for the electrochemical determination of catecholamines. // Talanta. 2009: V. 78. P. 370-376.

206. Wang Y., G/ze« Z.-Z. A novel poly(taurine) modified glassy carbon electrode for the simultaneous determination* of epinephrine and dopamine. // Colloid. Surf. B: Biointerfaces. 2009? V. 74: P. 322-327!

207. Najjar F., GorrichonL., В alias M., Andr'e-Barres C., Vial H. Alkylation of natural ; endoperoxide G3-factor. Synthesis and antimalarial activity studies. // Org: Biomol; Chem. 2005: V. 3; P: 1612-1614.

208. Budde C.L., Beyer A., Munir I.Z:, Dordick J.S., Khmelnitsky Yu.L. Enzymatic nitration of phenols. I I J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001. V. 15: P. 55-64.

209. Electronic Ionic Liquids Database http:^LThermo.bouIder.nist.gov/ILThermo/ mainmenu.uix

210. Ropel L., Belveze L.S., Aki S:N.K., Stadtherr M.A., Brennecke J.F. Octanol-water partition coefficients of imidazolium-based ionic liquids. // Green Chem. 2005. V. 7. № 2. P. 83-90.

211. Schussler W., Nitschke L. Death of fish due to surface water pollution by liquid manure or untreated wastewater: analytical preservation of evidence by HPLC. // Water Res. 1999. V. 33. № 12. P. 2884-2887.

212. Alabaster J.S., Lloyd R. Water quality criteria for freshwater fish (in Europe). 2 ed., London: Butterworths, 1982. 361 p.

213. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид — важнейший апротонный растворитель. // Соросовский образовательный журн. 1997. № 9. С. 54-59.

214. Diaz-Garcia М.Е., Valencia-Gonzalez M.J. Enzyme catalysis in organic solvents: a promising field for optical biosensing. // Talanta. 1995. V. 38. P. 1763-1773.

215. Крешков А.П. Основы аналитической химии. М.: Химия, 1970. С. 417.

216. Filho М. V., Stillger Т., Muller М., Liese A., Wandrey С. Is logP а- convenient criterion to guide the choice of solvents for biphasic enzymatic reactions? //Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 2993-2996.

217. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. М.: Мир,41972. 278с.304: Copeland R.A. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and* Data Analysis. 2nd ed: New-York: Wiley-VCH, 2000. P. 412.

218. Henriksen A., Mirza O., Indiani C., Teilum G., Wellinder K.G., Gajhede M. Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. // Protein Sci. 2001. V. 10. P. 108-115.

219. Hudlicky M. Oxidation in organic chemistry. Washington: Am. Chem. Soc., DC, 1990. P. 163.

220. Fishman A., Levy I., Cogan U., Shoseyov O. Stabilization of horseradish peroxidase in aqueous-organic media» by immobilization onto cellulose using a cellulose-binding-domain. // J. Mol. Cat. B: Enzym. 2002. V. 18. P. 121-131.

221. Dai R.-J., Huang II, Chen J., Deng Y.-L., Xiao S.-Y. Nitration reaction catalyzed by horseradish peroxidase in the presence of H202 and NaN02. // Chin. J. Chem. 2007. V. 25. P. 1690-1694.

222. Duran N., BaezaJ., Freer J., Brunei J.E., Gonzalez G.A., Sotomayor C.P., Faljoni-Alario A. Dimethyl sulfoxide as chemical and biochemical probe: conformational effect on peroxidase systems. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V. 103. P. 131-138.

223. Боголицын К.Г., Горбова H.C., Косяков Д.С. Кислотно-основные свойства родственных лигнину фенолов в системе вода-апротонный растворитель. // Журн. физ. химии. 2003. Т. 77. № 4. С. 667-671.

224. Bathurst I., Hentshel С. Medicines for malaria venture: sustaining antimalarial drug development. // Trends Parasitol. 2006. V. 22. P. 301-306.

225. Giancarlo А. В., Neill P. M., Patrick G Bray J and Stephen A Ward. Current drug development portfolio for antimalarial therapies. // Curr. Opin. Pharmacol. 2005. V. 5. P. 473-478.