Пиноленовая кислота в липидах семян PINACEAE: распределение, выделение и химическая модификация тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РТ6 Ой

, з им в®

На правах рукописи

ФАМ Куок Лонг

ПИНОЛЕНОВАЯ КИСЛОТА В ЛИПИДАХ СЕМЯН РтАСЕАЕ: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 1996

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Научный руководитель — кандидат химических наук В.И. СВЕТАШЕВ

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Э.Я. Костецкий

кандидат химических наук C.B. Исай

Ведущая организация — Институт биоорганической химии РАН

(г. Москва)

Защита диссертации состоится "Уj" JLcQl-JL- 1996 г. в ■fO часов на заседании Диссертационного совета Д 003.99.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Тихоокеанском институте биоортанической химии ДВО Российской академии наук (690041 г. Владивосток, пр. 100 —летия Владивостока, 159).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ДВО

РАН.

Автореферат разослан "¿t1996 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 003.99.01

кандидат химических наук ^ Г.И. Прокопенко

.А/1 "«г

Актуальность темы. Пиноленовая {all—eis — 5,9,12 — октадекатриеновая)

кислота относится к группе необычных неметиленразделенных жирных кислот (НМР ЖК). В семенах растений семейства Pinaceae эта кислота является главной среди ряда гомологичных соединений и ее содержание достигает 27%. Известно, что масло, содержащее пинолековую кислоту, обладает целебным действием и рекомендуется для диетического питания, однако биологическая активность пиноленовой кислоты практически не изучена. Отчасти это обусловлено тем, что пиноленовая кислота не является коммерчески доступным продуктом. Скрининг содержания, выяснение перспективных источников и разработка методов препаративного выделения этой кислоты поможет создать основу для широких биохимических исследований. Кроме того, изучение распределения пиноленовой кислоты и ее гомологов в семенах— голосеменных растений необходимо для разработки перспективных способов хемосистематики растений этого отдела. Важный материал для определения пути биосинтеза пиноленовой кислоты может дать молекулярный состав триглицеридов (ТГ) семян, в состав которых входит эта кислота. Однако прямой анализ молекулярного состава ТГ семян голосеменных растений не проводился. Из пиноленовой кислоты можно синтезировать ряд важных производных природных ЖК, которые должны обладать физиологической активностью. Изолированная двойная связь в молекуле этой ЖК позволяет проводить эксперименты по определению сравнительной реакционной способности двойных связей ЖК. Таким образом, изучение распределения пиноленовой кислоты и ее гомологов в липидах голосеменных растений, разработка способов ее получения и химическая модификация дает возможность решения комплекса актуальных задач химии и биохимии жирных кислот.

Цель работы. Изучение распределения пиноленовой кислоты и других неметиленразделеных жирных кислот в липидах семян некоторых видов Pinaceae, изучение кинетики восстановительного гидразинолиза этих кислот, препаративное выделение и химическая модификация пиноленовой кислоты. Научная новизна. Изучен состав жирных кислот, содержание пиноленовой кислоты и ее гомологов и распределение триглицеридов по молекулярной массе в семенах 8 видов растений рода Pinus. Доказана возможность хемосистематики растений семейства Pinaceae на основании состава ЖК

семян. Впервые определен состав "молекулярных видов" триглицеридов, содержащих остатки пиноленовой кислоты и ее гомологов, из семян Pinns koraiensis. Предложен эффективный способ препаративного выделения чистой пиноленовой кислоты. На примере иодлактона пиноленовой кислоты доказана возможность каталитического гидрирования ненасыщенных иодлактонов; этим методом синтезирована eis — 5 — октадеценовая кислота. Предложен общий метод предварительного расчета оптимального времени восстановительного гадразинолиза эфиров ЖК по' предполагаемой химической структуре. Определены константы скорости гадразинолиза А5, Д9, А12 и Al5 двойных связей. Проведено окисление пиноленовой кислоты с помощью соевой 15—липокигеназы.

Практическая пенность работы. В ходе работы получены новые данные по распределению пиноленовой кислоты и липидному составу семян Pinaceae. Разработан новый подход к анализу "молекулярных видов" ТГ, содержащих НМР ЖК.. Предложен общий метод расчета оптимального времени восстановительного гадразинолиза эфиров ЖК по предполагаемой химической структуре. Определены константы скорости восстановления Д5, Д9, Д12 и Д15 двойных связей в молекулах эфиров С—18 ЖК. Разработан новый способ синтеза моноеновых Д5 ЖК. Синтезирована 13 — гидрокси — 5,9,11 — октадекатриеновая кислота.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи. Объем работы. Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц, 15 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список использованной литературы содержит 96 ссылок.

1. Сравнительное исследование состава жирных кислот и триглиперилов в семенах растений рола Pinus.

На территории Вьетнама произрастают 6 видов растений рода Pinus — Pinus krempHi, Р. dalatensis, Р. meikusii, Р. massoniana, Р. calibea и Р. kesyia. Вид Р. calibea был завезен с о. Куба, является наиболее массовым и возделывается, как быстрорастущая техническая культура. Два вида

Р. йаШсп51$ и Р. кгстрШ являются эндемиками, произрастающими в отдаленных горных провинциях Вьетнама. Остальные виды встречаются в других районах Юго — Восточной Азии. Как показал анализ литературы, липидный состав семян Ршасеае из Вьетнама, не изучался.

Мы исследовали липидный состав семян 6 видов вьетнамских растений и сравнили его с таковым для двух видов {Р. котепвгв, Р. зШпса), которые были собраны в другом географическом регионе, в Приморском крае России.

1.2. Анализ состава жирных кислот общих липидов

Содержание общих липидов в сырых семенах невелико и колеблется в пределах 10 — 20% (табл. 1.). Состав ЖК общих липидов анализировали методов ГЖХ. В липидах изученных семян растений было определено 17 основных ЖК (табл. 1).

Жирнокислотные профили всех исследованных видов сходные. Количество насыщенных жирных кислот варьируется от 6.3 до 10.4%, моноеновых — от 17.8 до 27.0% и полиеновых — от 63.8 до 74.9%. Наибольшее количество (42 — 55%) составляла линолевая кислота 18:2(п —6). Во всех исследованных видах были обнаружены четыре основных неметилен — разделенных Д5 ЖК. Главным компонентом была пиноленовая кислота (18:3 Д5,9,12). Наиболее богат этой кислотой вьетнамский вид Р. таззотапа. В нем также отмечено наибольшее содержание (4.9%) гомолога пиноленовой кислоты — 18:2 Д5,9. В среднем же 18:2 Д5,9 содержится от 1 до 3%. Межвидовые вариации в количестве эйкозатриеновой кислоты (20:3 Д5,11,14), были более значительны: от 0.8% для Р. когшегигв до 5.2% для Р. кезу!а. Во всех видах в небольшом количестве присутствовала эйкозадиеновая (20:2 Д5,11) кислота.

По содержанию Д5 ЖК с 20 атомами углерода изученные нами виды можно условно разделить на две группы. К первой относятся Р. таэзомапа, Р. merku.su, Р. сап'Ьеа, Р. кевуа, в которых довольно много кислоты 20:3 Д5,11,14 и ее гомолога 20:2 Д5,11 (от 3% до 6%). Во вторую группу входят виды Р. с1аШепя(5, Р. кгетрШ, Р. котте№1з и Р. БШпса с содержанием 20:3 Д5,11,14 менее 2%. Вероятно, дифференциация по содержанию С —20 Д5 ЖК является наиболее существенным отличием между изученными видами семейства Ршасеае. Тог факт, что в одну группу попали северные виды (Р. когтелэ/я и

Р. ¡Шпса) и эндемичные высокогорные вьетнамские виды (Р. ёаШепи'я и Р. ктетрШ) может служить указанием, что различие в содержании полиеновых С —20 Д5 ЖК связано с климатическими условиями существования данных видов (например, с сезонным изменением температуры).

Таблица 1. Состав жирных кислот (%) общих липидов семян 8 видов семейства Ршасеае и содержание общих липидов (%) в семенах этих растений. Названия видов: 1: Ртия тазвотапсг, 2: Р. тегкивп; 3: Р. сапЬеа; 4: Р. ке$у1а', 5: Р. (1а1а1еп51з; 6: Р. кгетрШ; 7: Р. ¿о/а;еЛ515; 8: Р. зЛтса.

Номер вида

Кислота 1 2 3 4 5 6 7 8

14:0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — —

16:0 4.1 5.3 5.4 5.5 7.1 6.1 4.7 4.4

16:1 (п —9) 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - -

16:1 (п —7) 0.2 0.1 0.1 0.1 0.4 0.1 0.1 0.1

18:0 1.8 4.6 2.0 1.4 1.8 2.2 2.0 2.6

18:1 (п — 9) 17.0 16.7 19.3 18.7 20.7 24.3 27.0 25.1

18:1 (п-7) 0.8 0.5 0.7 0.7 1.4 0.4 0.3 0.5

18:2 Д5,9 4.5 1.7 2.5 2.7 2.8 3.3 2.0 1.7

18:2 (п —6) 47.4 54.9 46.0 43.6 47.4 51.1 45.3 43.2

18:3 Д5,9,12 18.4 10.3 18.3 18.2 12.2 7.3 14.9 18.1

18:3 (п —3) 0.4 1.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.2 0.2

20:0 0.2 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3

20:1 (п —9) 0.3 0.4 0.7 0.8 0.8 0.6 1.1 1.3

20:2 Д5,11 0.4 0.3 0.3 0.5 0.4 0.1 0.1 0.1

20:2 (п-6) 0.6 0.8 0.6 1.0 0.7 0.7 0.5 0.6

20:3 Д5,11,14 ' 3.1 2.6 2.5 5.2 1.9 1.3 0.8 0.9

20:3 (п-6) 0.2 - 0.3 0.5 - .0.2 - 0.1

Содержание 21.8 10.3 21.8 17.5 14.2 15.6 20.9 18.1

липидов

1.3. Определение структуры А5 ЖК

Для полной идентификации необычных НМР ЖК был применен метод ■ * аналитической иодлактонизации, разработанный нами ранее. Сумму солей ЖК обрабатывали иодом в слабощелочной среде. В этих условиях только ЖК, содержащие двойные связи при 4 —ом и 5 —ом атомах углерода, образуют циклические производные — иодлактоны; ЖК другого строения в реакцию не вступают и остаются без изменений (рис. 1). Затем иодлактоны отделяли от непрореагировавших ЖК и восстанавливали в исходные А4 (Д5) кислоты; при этом не происходит изменение положения и конфигурации двойных связей.

6-ИОДОЛАКТОН

Рис. 1. Выделение Д5 ЖК с помощью реакции

иодолактонизации на примере смеси пиноленовой (18:3 Д5Д12) и линоленовой (18:3 Дб.9,12) кислот.

Из смеси общих ЖК семян Р. когтеп$15 мы получили фракцию Д5 ЖК, содержащую 4 основных компонента с углеродными числами 18.46 (10.5%), 18.96 (82.8%), 20.38 (1.6%) и 20.85 (4.6%). ИК-спектр суммарной фракции Д5 ЖК показал отсутствие поглощения, характерного для транс—двойных связей Для определения положения двойных связей сумму Д5 ЖК переводили в соответствующие пирролидиды и анализировали методом ГЖХ —МС. Схема фрагментации молекулярных ионов пирролидидов 3 —х А5 ЖК, составленная на основании данных МС, представлены на рис. 2. Используя данные МС, ИК — спектроскопии и ГЖХ, мы определили компоненты, как а'5 —5,9 — октадекадиеновая (ЕСЬ 18.46), пиноленовая 18:3 Л5,9,12 (ЕСЬ 18.96), эйкозадиеновая 20:2 Д5,11 (ЕСЬ 20.38), эйкозатриеновая 20:3 Д5,11,14 (ЕСЬ 20.85) кислоты.

126 152 180 200

18:2 Д5.9

113 140 166 194 220

126 152 100 206 234 260

Рис. 2. Схема фрагментации молекулярных ионов пирролидидов Д5 ЖК.

ИЗ 140 166 194 220 248 126 152 180 203 234

113 140 166 194 222 248

126 152 180 206 234 262

20:3 Д5,11,14

113 140 166 194 222 248 274

1.4. Состав ЖК семян растений Сутпозрегтае как хемосистематический признак

Состав ЖК липидов зрелых семян растений является устойчивой характеристикой данного вида и подвержен незначительным вариациям. Присутствие или отсутствие некоторых необычных ЖК в лнпидах семян можно рассматривать как хемотаксономический признак. Отмечается, что пиноленовая и эйкозатриеновая (20:3 Д5Д1Д4) кислоты встречается в семенах растений нескольких семейств и могут служить для характеристики как семейств, так и родов, и даже отдельных видов растений. Мы использовали наши данные по составу ЖК семян и аналогичные литературные данные по другим видам Сутхкирегтае, чтобы с их помощью проследить связь между видами этого отдела.

На рис. 3 представлен результат мультивариантного анализа состава

жирных кислот из липидов семян 29 видов растений отдела Сутпозрегтае,

относительно первых двух принципиальных компонент. Для анализа

использовали данные по содержанию ЖК из табл. 1 и аналогичные

8

.литературные данные. 51.3% всех вариаций использованных данных связано с 1-й компонентой (ось 1), и 13.3% вариаций — со 2-й компонентой (ось 2).

0.00 -0.06 -0.12 -0.18 -0.24 -0.30

25

2& ,4 23

19 Г Ъ» "I'

9 \ V« IS 1

\ 1 У

- 28 27

12 ----

11

10

24

13

15

Рис. 3. Результаты

статистического

анализа

хемометрических данных по содержанию ЖК в семенах 29 видов Сутпохрегтае методом

принципиальных компонентов, относительно первой (ось 1) и второй (ось 2) компонент.

-0.38 -0.29 -0.20 -0.П -0.02 0.07 0.16 0.2S

Ось 2

Ось 1

Названия видов: 1, Pinas massoniana; 2, Р. merkusii; 3, Р. caribea; 4, Р. kesyia; 5, Р. dalatensis; 6, Р. krempfii; 7, Р. koraiensis; 8, Р. sibirica; 9, Cycas revoluta; 10, Ginkgo biloba; 11, Taxus aispidata; 12, T. canadensis; 13, Torreya nucífera; 14, Podocarpus macrophylla; 15, Podocarpus nagi; 16, Picea jezoensis; 17, Larix leptolepis; 18, Cedrus deodara; 19, P. densiñora; 20, Р. thunbergii; 21, Р. koraiensis; 22, Р. pentaphylla; 23, Taxodium districhum; 24, Sciadopitys verticillata; 25, Cryptomeria japónica; 26, Chamaecyparis pisifera; 27, Juniperus rigida; 28, J. chinensis; 29, Ephedra sinica.

В первом приближении можно утверждать, что расстояние между точками на рис. 3 пропорционально количеству различий в ЖК составе семян данных видов растений. Отчетливо видно, что 15 видов образуют компактную группу. В нее входят все виды, исследованные нами (1—8), и 7 других видов, исследованные ранее, которые также относятся к семейству Pinaceae (16, Picea jezoensis; 17, Larix leptolepis; 18, Cedrus deodara; 19, Pinns densiflora; 20, P. thunbergii; 21, P. koraiensis; 22, P. pentaphylla). Остальные виды, принадлежащие другим семействам, в отмеченную группу не вошли. Полученный результат означает, что состав ЖК семян растений семейства Pinaceae является специфическим хемосистематическим признаком, и на основании данных о ЖК составе семян можно вычленить растения данного семейства из других семейств отдела Gymnospermae. Состав ЖК семян

Ртасеае обладает общими хемотаксономическими характеристиками только на уровне семейства, а для каждого рода и вида этого семейства является уникальным и видоспецифичным.

Наши данные по хемометрическому сравнению 29 видов Сушпоэрегтае показывают, что географический фактор не является определяющим в относительной связи между видами, поскольку в компактную группу, отмеченную на рис. 3, входят 6 видов, собранных в северных и южных провинциях Вьетнама, 2 вида из Приморского края России, 7 видов, собранных в различных районах Японии.

Наибольшее влияние на группировку видов Сутпоэрегшае на рис. 3, имели вариации в содержании пиноленовой и линоленовой кислот. Следовательно, различие в содержании этих двух кислот можно считать определяющим признаком для хемосистематики голосеменных растений. Для подавляющего большинства видов СутпоБрегтае наблюдается обратная зависимость в количестве пиноленовой и линоленовой кислот. Весьма вероятно, что в семенах Сутповреггоае имеют место два конкурентных пути биосинтеза: линоленовой кислоты из линолевой с помощью Д15 — десатуразы и пиноленовой кислоты из линолевой с помощью Д5—десатуразы. Преимущество одного из указанных путей биосинтеза приводит к изменению в соотношении пиноленовой и линоленовой кислот, которое, как мы показали, имеет важное значение для хемосистематики Сутповрегтае. Можно предположить, что различные семейства отдела СутпоБрегтае характеризуются специфическим соотношением активностей Д5— и Д15— десатураз.

1.5. Анализ "молекулярных вилов" триглиперилов

В семенах растений семейства Ртасеае присутствует значительное количество неметиленразделенных Д5 ЖК, однако до настоящего времени данные о составе "молекулярных видов" триглицеридной композиции, содержащие эти необычные ЖК, отсутствуют. Первоначально мы определили распределение ТГ в липидах семян 8 видов растений семейства Ртасеае по молекулярной массе. Из общих липидов каждого вида мы выделили чистую фракцию ТГ, которую подвергли исчерпывающему гидрированию над двуокисью платины, и анализировали методом ГЖХ.

Таблица 2. Состав гидрированных триглицеридов (%) из семян Ртасеае.

Вид Триглицерид

С —48 С —50 С —52 С —54 С —56 С— 58

Р. таэзопгапа Сл. 4.3 21.7 64.7 8.8 0.5

Р. сапЬеа Сл. 0.3 15.0 71.5 12.1 1.1

Р. тегкияН 0.2 1.1 15.3 73.5 9.0 Сл.

Р. кезуга Сл. 1.0 15.0 65.8 17.3 1.0

Р. с1а1а1епз1з Сл. 2.6 15.4 71.8 9.7 0.5

Р. кгетрШ Сл. 1.3 16.2 75.6 7.0 Сл.

Р. кога1епз15 Сл. 0.4 16.6 76.1 6.6 0.3

Р. ¿¡Ыпса Сл. 2.0 13.5 77.2 7.3 Сл.

Примечание:

Сл. — содержание менее 0.2%

В смеси гидрированных ТГ семян (табл. 2) основную часть составили ТГ С —52, С —54, С—56; из них преобладал тристеарин (С —54). Распределение ТГ по молекулярной массе для 8 изученных видов Ртасеае сильно напоминает распределение ТГ из других растительных масел, содержащих небольшое количество С —20 ЖК, является отражением распределения общих ЖК по числу атомов углерода и мало зависит от степени ненасыщенности ЖК. Присутствие необычных Л5 ЖК практически не влияет на состав гидрированных ТГ.

При анализе "молекулярных видов" ТТ мы использовали комбинацию аргентационной ТСХ и высокотемпературной капиллярной ГЖХ на поляризуемой фазе, степень полярности которой возрастает с повышением температуры. Как вспомогательный метод, мы применили ГЖХ МЭЖК. В качестве объекта отработки методики мы выбрали семена Р. когшеп£1.ч — наиболее доступный источник липидного материала.

Анализ "молекулярных видов" ТГ проводили по схеме, предложенной для анализа ТГ растительных масел:

На первой стадии, ТГ разделяли по степени ненасыщенности с помощью препаративной аргентационной ТСХ. Мы сравнили несколько различных методов, описанных ранее. Лучшие результаты были получены при

использовании силикагеля с 10% АдМОэ, Система гексан —эфир, 30:70 хорошо разделяла основные полиненасыщенные фракции при однократной элюции и обеспечивала удовлетворительное время хроматографии в пределах 1 ч, легко удалялась при высушивании пластинки. Одна пластинка размером 20 х 38 см обеспечивала хорошее разделение около 15 мг общих ТГ.

Общие ТГ из семян Р. когтепз1з разделили на 7 основных фракций, которые подвергли дальнейшему анализу. Фракции нумеровали снизу вверх.

Аликвоту каждой фракции ТГ омыляли и состав ЖК анализировали методом ГЖХ. Количество вещества в каждой фракции определяли по методу внутреннего стандарта.

На следующей стадии мы анализировали полученные аргентационной ТСХ фракции ТГ методом ГЖХ на капиллярной колонке с поляризуемой высокотемпературной фазой типа 400—65НТ (Оиа<Згех). Колонка обладает высокой эффективностью, позволяет проводить анализ смесей, содержащие ТГ С —60, и обеспечивает разделение изомеров ТГ с одинаковым числом атомов углерода и разной степенью ненасыщенности. Компоненты предварительно идентифицировали по расчету "углеродных чисел", с использованием заведомых стандартов. Затем теоретически рассчитывали состав ЖК каждой фракции, исходя из состава ТТ, и сравнивали полученный результат с реальным составом ЖК, которые был получен прямым экспериментом на предыдущей стадии анализа.

На последнем этапе мы оптимизировали, в случае необходимости, качественный состав каждой фракции ТГ с учетом максимальной сходимости результатов реконструированного и реального составов ЖК.

В таблице 3 суммированы результаты анализа ТГ по всем фракциям и рассчитан общий состав "молекулярных видов" ТГ, исходя из весовой доли каждой фракции.

Основными "молекулярными видами" ТГ в семенах Р. котшеп513 были пента- и гексаеновые ТГ С-54: ОН (13.5%), ООЬп (11.7%), 01Хп (9.2%). В меньшем количестве присутствовали БИл (3.2%), Ш.' (3.9), Ш. (3.4). Наиболее ненасыщенный ТГ Г.Т.Т.п содержался в количестве 4.1%. Не исключено, что среди неидентифицированных ТГ из фракции 7 присутствовало небольшое количество октаена Ил1л. Среди триеновых и тетраеновых ТГ с общей формулой С-54 доминировали ООО (6.6%) и ООЬ (6.4%).

Таблица 3. Состав "молекулярных видов" ТГ во фракциях (%), полученных препаративной ТСХ, и состав "молекулярных видов" общих ТГ (%) из семян Р. когтею^я.

Содержание молекулярных видов ТГ, %

Вид ТГ Номера фракций ТГ Общие ТГ

1 2 1 3 1 4 51 6

РРО 2.5 0.3

РРЬ 0.8 2.7 0.5

Неизв. 0.9 0.1

РЭО 3.1 0.4

РОО 27.1 3.7 3.8

РСЖ 2.1 27.6 8.0 6.0

Р1Х 16.0 3.7

Р1Л' 16.1 2.4

Р1Хп 25.9 25.8 7.7

ББО 3.5 0.4

эоо 9.0 1.1

ООО 44.6 9.0 6.6

эоь 5.2 0.7

001. 1.8 43.9 6.4

БШ 4.9 1.1

ОШ 9.2 2.1

Неизв. 1.9 0.3

Неизв. 3.3 0.8

он. 52.6 8.9 13.5

ООЬп 67.1 9.5 11.7

БЦл 14.6 5.5 3.2

ОШ1 62.2 22.1 9.2

Ш/ 22.0 3.9

г.т.т 1.2 18.2 3.4

Шл 59.9 4.1

Неизв. 7.2 0.5

РЬЕш 2.0 0.3

Р1_Е1 9.3 0.6

ЕБО 2.8 0.3

ЕшОО 2.6 0.3

Епп1Х 6.0 1.4

ООЕ1 3.6 0.5

1±Ес1 3.3 0.6

ОШ 6.4 4.0 1.6

Ет1Хп 2.3 0.3

11Е1 1.5 0.1

Примечание:

Принятые сокращения названий остатков ЖК, входящих в состав ТГ: Р, 16:0; Б, 18:0; О, 18:1(п-9); Ц 18:2(п-б); V, 18:2 Д5,9; Ьп, 18:3 А5.9,12; Е, 20:0; Еш, 20:1(п —9); Ей, 20:2 Д5,11; Н1, 20:3 Д5,11,14.

Основными "молекулярными видами" ТГ С —52 были РОЬ (6.0%) и РЬЬп (7.7%). В меньшем количестве содержались РОО (3.8%), Р1Х (3.7%) и РЬЬ' (2.4%). ТГ С —50 составили незначительную часть от общей массы липидов. ТГ С —56 также, как и ТГ С —54, имели высокую степень ненасыщенности, наиболее заметными были Ет1А (1.4%) и 013 (1.6%).

Анализ "молекулярных видов" ТТ Р. кога)еп513 показал, что их распределение в основных чертах повторяет данные, полученные для других источников липидов, имеющих сходный ЖК состав. Наиболее существенные отличия составе ТГ Р. Когспелв!^ были связаны с содержанием "молекулярных видов", имеющих остатки пиноленовой кислоты и ее гомологов. Общие ТГ были обогащены пентаеновыми ТГ, в состав которых входят остатки октадекатриеновой (пиноленовой) кислоты (1л). Например, в соевом масле, содержащем кислоты 16:0 (11.5%), 18:0 (4,1%), 18:1 (27.9%), 18:2 (50.9%) и 18:3 (6.4%), основными ТГ являются 'ЦХ (15.2%), ОН- (16.8%), ООЬ (10.5%), РЦ. (13.5%), РОЬ (10.1%), а ООЬп и ООл содержится только 1.0% и 3.6%, соответственно. В то же время, ООЬп и ОПп в липидах Р. когспет-¡я — одни из главных ТТ (11.7% и 9.2%, соответственно). Аналогичная закономерность наблюдалась для ТГ С —52. Содержание пентаена РИп в Р. когшепз« почти втрое выше, чем в указанном выше соевом масле.

Таким образом, пиноленовая кислота 18:3 Д5,9,12, ацильные остатки которой входят в состав в ТГ Р. когтепз1з, служит эквивалентом линоленовой кислоты 18:3 (п — 3), и "молекулярные виды" ТГ с остатками пиноленовой кислоты являются доминирующими.

Октадекадиеный гомолог пиноленовой кислоты (18:2 Д5,9) входил в состав ряда ТГ только в паре с ацильным остатком изоменой ему линолевой кислоты. Нам не удалось идентифицировать заметное количество ТГ, которые бы содержали два остатка кислоты 18:2 Д5,9, равно как не было отмечено присутствие ТГ с двумя остатками пиноленовой кислоты или ее С —20 гомологов. Это наблюдение хорошо согласуется с данными Такаги о том, что Д5 ЖК в ТГ голосеменных растений сосредоточены в основном в положении ел — 1 или эп — 3.

Распределение С —56 ТГ, содержащих С —20 гомологи пиноленовой кислоты, в основном соответствовало профилю распределения аналогичных ТГ С —54.

Сходство состава общих ЖК и гидрированных ТГ восьми изученных видов семян позволяет предположить, что различия в количестве индивидуальных ТГ между отдельными видами растений невелики, и отдельные вариации укладываются в общую картину, полученную при изучении ТГ наиболее доступного вида Р. когагепя^Б.

2. Препаративное выделение пиноленовой кислоты

Известен метод выделения пиноленовой кислоты с помощью иодолактонизации из перегнанных смоляных кислот. Как справедливо отмечали авторы, из исходного сырья можно получить пиноленовую кислоту с чистотой не более 80%, поскольку исходные жирные кислоты содержат несколько гомологов пиноленовой кислоты, которые также вступают в реакцию иодолактонизации и загрязняют конечный продукт. Чтобы получить высокочистую пиноленовую кислоту, авторы использовали предварительное обогащение кислот кристаллизацией с мочевиной или тщательную дистилляцию исходного продукта. Мы предложили одностадийный способ препаративного выделения пиноленовой кислоты ш суммы ЖК Р. кога/сп^чь с использованием обращенно фазовой (ОФ) хроматографии.

С помощью классического варианта ВЭЖХ на полупрепаративной ОФ колонке (9 мм х 250 мм) было получено 2 — 3 мг пиноленовой кислоты с чистотой более 98% за один цикл; удельный расход метанола составил около 50 мл на 2 мг продукта. Этот вариант хроматографии оказался малоэффективным. Поэтому мы применили хроматографию низкого давления на ОФ колонке (50 мм х 300 мм). За счет резкого увеличения нагрузки на колонку (до 15 г МЭЖК/цикл), мы получали за 1 цикл около 2.5 г метилового эфира пиноленовой кислоты с чистотой 93%. Чистота полученного продукта была достаточной для большинства наших экспериментов, при этом удельный расход подвижной фазы (метанола) снизился на порядок. Свободную пиноленовую кислоту получали омылением соответствующего метилового эфира.

3. Химическая модификация пиноленовой кислоты и ее гомологов

3.1. Гидрирование иодлактона пиноленовой кислоты

Гидрирование насыщенных иодлактонов водородом над соответствующим катализатором в жестких условиях приводит к замещению иода на водород. Мы проверили возможность гидрирования ненасыщенных иодлактонов в насыщенные соединения без удаления галогена. Иодлактон пиноленовой кислоты гидрировали водородом над платиновым катализатором в метаноле при обычном давлении и комнатной температуре (рис. 4).

I

Н2ЛЧО2

S - ИОДОЛАКТОН КИСЛОТЫ18.-3 ¿5.9,12

6-ИОДОЛАКТОН К.ИСЛОТЫ18:! Д5

Рис. 4. Схема гидрирования иодлактона пиноленовой кислоты (18:3 Д5,9,12) и восстановления насыщенного продукта в eis — 5 — октадеценовую кислоту.

Полученный насыщенный иодлактоя дополнительно очищали полупрепаративной ВЭЖХ на обращенной фазе. Выход реакции составил 89%. Насыщенный иодлактон восстанавливали триметилсилилиодидом (TMS-I) в eis —5 —октадеценовую кислоту (94% чистоты) с общим выходом 54% на исходный иодлактон пиноленовой кислоты. Структура полученных насыщенного иодлактона и кислоты была подтверждена методами 'Н—ЯМР и масс—спектрометрии. 5—октадеценовая кислота впервые была получена из пиноленовой кислоты через ее иодлактон, при этом доступность исходного сырья и хорошая чистота полученного целевого продукта делают этот метод вполне конкурентоспособным с методами прямого химического синтеза.

Основным побочным продуктом реакции (5—10%) при гидрировании иодлактона пиноленовой кислоты был метиловый эфир иодгидрина пиноленовой кислоты, который образуется при раскрытии лактонного цикла в

присутствии метанола. Метиловый эфир иодгидрина октадеценовой кислоты восстанавливается в метиловый эфир соответствующий кислоты, в результате -образуется смесь 5 —октадеценовой кислоты и ее метилового эфира. Поэтому, в зависимости от цели синтеза, проводили либо дополнительное омыление смеси до свободной кислоты, либо дополнительное метилирование НС1/МеОН до метилового эфира.

Успешное гидрирование иодлактона показывает, что возможно получение аналогичным способом 5 —эйкозеновой кислоты из АК или ЭПК, а также 4 — докозеновой кислоты из ДГК, поэтому синтез у— и 5 — иодлдктонов, с последующим их гидрированием и восстановлением, может быть использован как метод получения Д4(Д5) моноеновых ЖК.

3.2. Восстановительный гилразинолиз пиноленовой кислоты и ее гомологов

Частичное восстановление гидразином полиеновых жирных кислот (восстановительный гидразинолиз) часто используется для определения положения двойных связей в исходной молекуле ЖК. Фракцию моноенов отделяют, и, установив структуру всех полученных моноеновых ЖК, реконструируют положение двойных связей в исходной полиеновой ЖК. Очевидно, что необходимо получить как можно более высокий выход моноеновой фракции.

Восстановительный гидразинолиз пиноленовой кислоты (18:3 Д5Д12) (или ее эфира) протекает по следующей схеме:

[18:2 Д5,9 148:1 Д5

18:3 Д5,9,12 •{ 18:2 Д5.12 ■{ 18:1 Д9 -> 18:0

[18:2 Д9,12 118:1 Д12

Пиноленовая Фракция Фракция Насыщенная

кислота диенов моноенов фракция

На первой стадии эксперимента мы оптимизировали условия гидразинолиза для получения максимального выхода моноеновой фракции ЖК.

На выход моноенов в процессе восстановления ЖК гидразином влияют несколько основных факторов: температура и время реакции, концентрация МЭЖК и гидразина, природа окисляющего агента, используемого для

превращения гидразина в диимин. По результатам двух серий предварительных линейных экспериментов мы выбрали перекись водорода как окисляющий агент и температуру реакции 60°С. В дальнейшем эти условия не изменялись.

Таблица 4. Планы полных факторных экспериментов (ПФЭ) по оптимизации реакции восстановительного гидразинолиза метилового эфира пиноленовой кислоты с указанием результатов каждого опыта (YcpJ, выполненного в 4 —ч повторностях (п = 4), и среднего квадратичного отклонения (S).

Номер Номер Кол — во Кол —во Время X] Х2 Хз Yep S

ПФЭ опыта NH2NH2 н2о2 реакции (отн.ед.)

(мкл) (мкл) (мин)

1 50 50 90 - 1 - 1 1 76 43

2 50 150 90 - 1 1 1 104 24

3 150 50 90 1 - 1 1 236 46

1 4 150 150 90 1 1 1 • 264 25

5 50 50 30 -1 - 1 -1 8 5

6 50 150 30 -1 1 -1 21 9

7 15 5 30 1 - 1 -1 52 26

8 15 15 30 1 1 -1 72 20

1 200 105 1 -1 234 10-

2 2 200 135 1 1 156 21

3 100 105 -1 - 1 294 18

4 100 135 -1 1 298 ' 31

1 120 120 110 -1 - 1 1 313 8

2 120 160 110 -1 1 1 289 1

3 160 120 110 1 - 1 1 287 15

4 160 160 110 1 1 1 246 8

3 5 120 120 90 - 1 - 1 -1 323 12

6 120 ■160 90 - 1 1 -1 317 6

7 160 120 90 1 - 1 -1 312 2

8 160 160 90 1 1 -1 272 15

9 140 140 100 0 0 288 24

10 140 140 100 0 0 288 20

1 80 80 90 -1 — 1 1 303 10

2 80 120 90 -1 1 1 309 5

3 120 80 90 1 - 1 1 337 14

4 4 120 120 90 1 1 1 325 6

5 80 80 75 -1 - 1 -1 258 9

6 80 120 75 -1 1 -1 253 6

7 120 80 75 1 - 1 -1 304 7

8 120 120 75 1 1 -1 294 16

Оптимизацию условий восстановительного гидразинолиза проводили с помощью ряда последовательных полных факторных экспериментов (ПФЭ). В качестве трех независимых переменных (факторов) были приняты количество гидразина (Х|), количество перекиси водорода (х2) и время реакции (х3). Выход процесса У (зависимая переменная) определяли, как общее количество образовавшихся моноеновых эфиров ЖК (табл. 4).

Окончательное уравнение функции отклика в виде линейного уравнения регрессии имело вид

У=298 + 17 X! - 3 х2 + 21 х3 - 3 х,х2 - 5.6 х^з + 1 х2х3 - 2 х^хз В этом уравнении значимыми (с 95% вероятностью) являются коэффициенты при X] и х3. Поскольку оба эти коэффициента положительны, мы приняли значения верхних уровней этих двух факторов как оптимальные, а именно, количество гидразина 120 мкл и время реакции 90 мин. Коэффициент при х2 в последнем уравнении не значимый, поэтому мы приняли за оптимальное нижнее значение уровня этого фактора (количество перекиси водорода 80 мкл).

По результатам проведенной оптимизации мы приняли в качестве стандартных условий для проведения реакции восстановительного гидразинолиза МЭЖК следующие параметры:

а) температура реакции 60°С,

б) соотношение компонентов реакции: метанол 1.1 мл, гидразин гидрат 120 мкл, 30% перекись водорода 80 мкл.

в) количество МЭЖК около 5 мг.

Принятые стандартные условия восстановительного гидразинолиза обеспечивают хороший выход (46%) моноеновой фракции при разумном времени реакции (около 90 мин). В этих стандартных условиях мы проводили дальнейшие кинетические исследования и рассчитывали константы скорости реакций.

Мы провели восстановительный гидразинолиз метилового эфира пиноленовой кислоты в стандартных условиях, и дополнительно провели гидразинолиз метиловых эфиров линолевой и олеиновой кислот.

По кинетической кривой убывания исходного эфира пиноленовой кислоты мы рассчитали константу скорости восстановления эфира пиноленовой кислоты до суммы эфиров диеновых кислот; аналогично были

вычислены константы скорости восстановления эфира линолевой кислоты до суммы моноенов, и восстановления эфира олеиновой кислоты до эфира стеариновой кислоты. Средние значения констант скорости расходования эфироэ кислот составили:

метиловый эфир пиноленовой кислоты к18:з= 0.0315 мин метиловый эфир линолевой кислоты к18;2 = 0.0264 мин-1 метиловый эфир олеиновой кислоты к-18:1= 0.0129 мин-1 Константа скорости восстановления эфира линолевой кислоты (к^д) равна сумме констант двух параллельных реакций — восстановления по Д9 (к4д) и Л12 двойным связям (кЛ12):

к18;2 = кд9 + кд)2, если принять к18;1 = клд, то кд 12 = Л18:2 - кдэ = 0.0264 - 0.0129 = 0.0135 (мин -1). Как правило, скорость восстановления двойных связей, входящих в 1,4 —диеновую систему, выше, чем изолированных двойных связей. По числовым данным кинетической кривой восстановления эфира 18:2 Д9,12 константа скорости восстановления Д12 двойной связи, вводящей в 1,4 — диеновую систему

кд12 = 0.0131 мин-1. Хорошее совпадение этого значения с полученным ранее (0.0135 мин-1) позволяет постулировать, что в нами условиях в первом приближении скорость восстановления отдельных двойных связей не зависит от присутствия других двойных связей. Следовательно, константу скорости восстановления исходного эфира полиеновой ЖК (кЕ) в первом приближении можно рассчитать по правилу аддитивности как сумму констант скорости восстановления отдельных двойных связей к,:

кх = 2 к,

В то же время, анализ кинетических кривых восстановления пиноленовой кислоты убедительно показывает, что решающее влияние на скорость гидразинолиза двойной связи оказывает ее положение в углеродной цепи ЖК. По правилу аддитивности

кд5 = к,8:3-кд9-кд12 = 0.0315- 0.0264 = 0.0051 (мин-1),

т.е. константа скорости восстановления Д5 связи в 2.5 раза меньше, чем А9 или Д12 связей, расположенных на большем расстоянии от карбонила.

Этот результат не укладывается в стандартную схему распределения скоростей восстановления отдельных двойных связей, согласно которой двойные связи, расположенные на конце ЖК цепи, восстанавливаются легче, нежели центральные, что было убедительно показано на примере ДЗ, Д4 и Д15 двойных связей. Возможно, "нестандартное поведение" Д5 двойной связи обусловлено взаимодействием с я — электроной системой карбонильной группы, и частичным перераспределением электронной плотности в циклическом 6 —членном интермедиате.

Время достижения максимального выхода моноеновой фракции (1тах) при восстановлении эфира диеновой ЖК определяется по уравнению

1тах = 1п(к2/к3)/(к2-к3),. при восстановлении эфира триеновой ЖК определяется по уравнению к,(к2-кз)е-111[тах+(к2кз-к1к2)е-1'21тах+(к,кз-к2кз)е-Ь'тах = 0, где к( — константа скорости восстановления триена в диены,

к2 — константа скорости восстановления диенов в моноены, кз — константа скорости восстановления моноенов.

По правилу аддитивности можно рассчитать константу скорости восстановления исходного эфира полиеновой ЖК (к^) и приблизительно оценить время достижения максимального выхода моноеновой фракции (1тм). Для этого нужно воспользоваться следующими соотношениями

— для эфира диеновой ЖК: к| = кь к2 ~ 0.5 к::,

— для эфира триеновой ЖК: к) = кг, к2 » 0.66 къ к3 = 0.33 к£.

Мы использовали приведенный выше соотношения для оценки оптимального времени восстановительного гидразинолиза метиловых эфиров линолевой и пиноленовой кислот.

Для эфира линолевой кислоты кг, = 0.0264 мин-1, тогда 1:тах = 52 мин. Экспериментальные данные показывают, что максимальный выход моноеновой фракции достигается в интервале от 50 до 60 мин.

Для эфира пиноленовой кислоты кЕ, = 0.0315 мин-1, тогда 1тах= 104 мин. Экспериментальные данные показывают, что максимальный выход моноеновой фракции достигается в интервале от 90 до 110 мин.

Мы провели дополнительный эксперимент по восстановлению эфира линоленовой кислоты для проверки принятого нами способа оценки времени достижения максимального выхода моноеновой фракции (1гаа11) при восстановительном гидраэинолизе эфиров ЖК.

Расчет константы скорости расходования эфира линоленовой кислоты по кинетической кривой дает значение к1 = 0.060 мин-1, тогда 1тнх = 55 мин. Экспериментальные данные показывают, что максимальный выход моноеновой фракции при гидраэинолизе эфира линоленовой кислоты достигается в интервале от 50 до 60 мин.

Таким образом, до проведения химической реакции можно теоретически рассчитать суммарную константу скорости восстановления метилового эфира полиеновой ЖК, как сумму элементарных констант скоростей восстановления каждой двойной связи. Затем, используя приведенные выше соотношения, можно оценить время реакции, при котором выход моноеновой фракции будет максимальным. Как показали наши данные, точность оценки приемлемая, и теоретически рассчитанное значение попадает в экспериментально полученный интервал времени. При проведении расчетов необходимо учитывать, что полученные значения констант могут быть использованы только для реакций гидразинолиза эфиров ЖК в принятых нами стандартных условиях.

3.3. Липоксигеназное окисление пиноленовой кислоты •

Продукты ферментативного окисления С —18 ПНЖК в настоящее время рассматриваются как возможные структурные аналоги эйкозаноидов в цепях биохимической регуляции животных и растений. С—18 НМР ЖК до настоящего времени не рассматривались как предшественники оксилипинов: в литературе отсутствуют данные о ферментативном окислении пиноленовой кислоты.

Мы провели препаративное окисление пиноленовой кислоты при помощи 15—липиоксигеназы соевых бобов. Конверсия пиноленовой кислоты в этой реакции составила около 17%, основным продуктом окиления (80%) была 13 —гидрокси—5,9,11 —октадекатриеновая кислота.

Биологическая активность 13 —гидрокси —5,9,11—октадекатриеновой кислоты в настоящее время изучается, однако на основании данных о том, что термически поврежденные клетки кожи человека увеличивают продукцию

метаболитов 15 — лиииоксигеназы, можно предположить, что противоожоговая активность пиноленовой кислоты частично связана с ее превращением в 13 — гидрокси — 5,9,11 — октадекатриеновую кислоту.

Выводы

1. Изучен состав жирных кислот, распределение пиноленовой кислоты и ее гомологов, а также триглицеридов по молекулярной массе в липидах семян 8 видов растений рода Pinus. Доказана возможность хемосистематики растений семейства Pinaceae на основании состава ЖК семян.

2. Впервые определен состав "молекулярных видов" триглицеридов, содержащих остатки пиноленовой кислоты и ее гомологов, из семян Pinus koraiensis.

3. Предложен эффективный одностадийный хроматографический способ препаративного выделения чистой пиноленовой кислоты.

4. На примере иодлактона пиноленовой кислоты показана возможность каталитического гидрирования ненасыщенных иодлактонов; этим методом синтезирована eis — 5 — октадеценовая кислота.

5. Оптимизированы условия и изучена кинетика восстановительного гидразинолиза пиноленовой кислоты и ее гомологов. Определены константы скорости восстановления Д5, Д9, Д12 и Д15 двойных связей в молекулах эфиров С —18 ЖК. Предложен способ предварительного расчета оптимального времени гидразинолиза эфиров ЖК по предполагаемой химической структуре.

6. Проведено окисление пиноленовой кислоты до 13—гидрокси —5,9,11 — октадекатриеновой кислоты с помощью соевой 15 — липокигеназы.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Куклев Д.В., Имбс А.Б., Фам Куок Лонг, Безуглов В.В. Липоксигеназные продукты окисления пиноленовой кислоты. Биоорган, химия, 1993, т. 19, N 12, с.1239— 1242.

2. Imbs A.B., Pham Quoc Long. Lipid Composition of Ten Edible Seed Species from North Vietnam, J. Amer. Oil Chem. Soc., 1995, v.72, N8, p.957-961.

3. Imbs A.B., Pham Quoc Long. Fatty Acid and Triacylglycerols in Seeds of Pinaceae Species, Phytochemistry, 1996, v.42, p.408 —411.

Лонг Куок ФАМ

ПИНОЛЕНОВАЯ КИСЛОТА В ЛИПИДАХ СЕМЯН Р1ИАСЕАЕ: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ЛР № 040118 от 15.10.91 г. Подписано к печази 17.04.96 г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл.п.л. 1,5. Уч.-изд.л. 1,39. Тираж 100 экз. Заказ 395.

Отпечатано в типографии издательства "Дальнаука" ДВО РАН 690041, г.Владивосток, ул. Радио, 7