Получение и физико-химические свойства липосомальных форм ДОФА, дофамина и их боратных производных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ ь им

На правах рукописи

БОРИСОВА НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ ДОФА, ДОФАМИНА И ИХ БОРАТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1997

Работа выполнена на кафедре Еиотехнэпсгки Московской ордена Трудоссго Красного знамени Государственной академии тонкой химичвехой технологии и.'л.М.В-Ломоносоаз

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

А.П. Каплун

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат химических наук, научн. сотр.

Г.А.Серебренникова И.И.Михайпеа

Ведущая организация: Научно-производственный центр медицинской биотехнологии МЗ РФ

Государственной академии тонкой химической технологу им. М В.Ломоносова по адресу: 117571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мосховсхс Государственной академии тонкой химической технолог» мм.М.В.Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул.М.Пироговская, 1

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кацдидэт химических наук, с.н.с. А.И.Лютик

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Несмотря на то, что первое предположение о роли дофамина (ДА) как медиатора центральной нервной системы было выдвинуто в 1957 г., было бы ошибочно утверждать, что достижения последних лет полностью раскрывают молекулярный механизм протекания болезни Паркинсона. В 1362 г. впервые для лечения болезни Паркинсона был применен биологический предшественник ДА - 1.-ДСФА ("Лзводопа").

Вследствие периферического декарбоксилироаания, а также ограниченной проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для ДОФА терапевтический эффект возможно достичь лишь за счет больших доз этого препарата, что в свою очередь сопряжено с многочисленными побочными эффектами, т.к. ДА имеет рецепторы в сердце и других органах.

С целью предотвращения декарбоксилироаания ДОФА вне мозга было предложено одновременное введение ДОФА с ингибиторами периферической ДОФА-декарбоксилазы. Эта же проблема побудила некоторых авторов разработать методику получения медных и цинковых комплексов оснований Шиффа ДОФА и дофамина, что позволяет снизить периферическое взаимодействие с кофактором декарбоксилазы - пиридоксальфосфатом за счет образования полностью координированной формы. Тем не менее полностью предотвратить декарбоксилирование не удастся. Таким образом, является весьма актуальной разработка новых лекарственных препаратов и лекарственных форм, лишенных вышеперечисленных недостатков.

Одним из подходов может быть использование липосомальных форм ДОФА. ДОФА, заключенный в Лс, должен быть защищен от периферического декарбоксилирования. С другой стороны, т.к. известно, что объем

Сокращения: ДА (дофамин) - 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламин, ДОФА • 1.-3-<3,4-дигидроксифвнил)-2-аминолропионовая кислота, ДМФХ - димиристомлфоофатидилхолин, ДХН

- деэоксихолат натрия, Ктх - катехолы, Кр - коэффициент распределения, Лс - липосомы, ПОЛ

- переписное окисление липидов, ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота, ПРТБК - продукты реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, Хол - холестерин, ФХ - яичный фосфатидилхолин

распределения липосомальной формы меньше, чем у соответствующих растворов, то она может создавать большие эффективные концентрации лекарственного препарата, что должно приводить к уменьшению дозы и, как следствие, снижению побочных эффектов. Кроме того, липосомальная форма может выступать как депо, т.е. увеличивать время дейсгвия препарата. Цель данной работы состояла в получении и изучении физико-химических свойств липосомальных форм ДОФА(ДА) и их боратных производных. Научная новизна работы. Впервые были изучены физико-химические свойства липосомальной формы ДОФА(ДА) и их боратных производных, которая предлагается в качестве антипаркинсонического средства.

Выявлены особенности взаимного антиоксидантного влияния компонентов липосомальных препаратов (ДОФА/ДА и ФХ) в зависимости от агрегативной формы (раствор, мицеллы, Лс), состава и концентрации липидов.

Обнаружена ведущая роль в защите Ктх от окисления физической изоляции их бислоем от внешней среды.

Были получены и охарактеризованы липосомальные формыДОФА(ДА)боратов аммония и 1-гдамантиламмония. Данные по комплексным солям 1-адамантиламмония в литературе отсутствуют.

.С помощью ИК, масс-спектроскопии и ЯМР на ядрах 1Н и 11В были изучены особенности строения полученных комплексов. Помимо этого, кондухтометрическим методом определены их равновесные параметры. Практическая значимость. Биологические испытания показали, что использование Лс с ДОФА как средства доставки в мозг позволяет в 10 раз снизить дозу препарата и увеличить в 2-3 раза время его действия. Положения, выносимые на защиту:

1. Получение и физико-химическое исследование липосомальных препаратов ДОФА и дофамина, в том числе определение степени включения в Лс и их размера, оценка коэффициента распределения между лилидной и водной фазами, изучение кинетики выхода веществ и влияние на целостность липосомального бислоя ДОФА и дофамина.

2. Установление закономерностей взаимного влияния на окисление компонентов липосомальных препаратов ДОФА и ДА.

3. Изучение физико-химических свойств ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония.

4. Конструирование липосомальных форм полученных комплексных соединений и определение их характеристичных свойств (степени включения, соотношения активное вещество/липид, выхода включенного вещества из Лс). Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 5th Liposome research days (Шизуока, Япония, июль, 1996); 1-м Европейском конгрессе по фармакологии (Милан, Италия, август, 1995); IV Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Волгоград, Россия, сентябрь, 1996); Юбилейной научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения Н.А.Преображенского (Москва, Россия, октябрь, 1996); конференции "Liposome advances: progress in drug and vaccine delivery" (Лондон, Англия, 16-20 декабря 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы три статьи, 5 тезисов докладов на научных конференциях.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах

машинописного текста, содержит рисунков, таблиц, список литературы включает ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общепризнанным препаратом антипаркинсонического действия является "Леводопа". Однако его применение сопряжено рядом побочных явлений, обусловленных внецеребральным метаболизмом ДОФА, и, как следствие, высокой терапевтической дозой.

В процессе работы были выявлены вопросы, которые необходимо было решить для достижения поставленной цели: 1) исследовать взаимное влияние окисления Ктх и ФХ; 2) найти способ увеличения растворимости ДОФА и, тем самым, получить Лс с большим соотношением ДОФА/ФХ. Боратные комплексы, по нашему мнению, должны были подойти для реализации последней цели. Кроме того, боратные комплексы Ктх, как известно, мог/т защищать их от окисления. Не исключено также, что боратные комплексы будут лучше

удерживаться в Л с. Наконец, использование 1-адамантиламмониевых комплексных солей может обеспечить потенциально возможный синергизм лечебных свойств обоих веществ, т.к. препарат "Мидантан" также используется для лечения болезни Паркинсона (он уменьшает обратный захват ДА пресиналтической мембраной). Для реализации поставленных задач работа была построена в несколько этапов:

- получение и характеристика (в частности изучение взаимного влияния компонентов на окисление друг друга) лилосомальных препаратов ДОФА и дофамина;

- получение ДОФА(ДД)боратных комплексов 1-адамантиламмония й аммония с последующим включением их в Лс;

- определение физико-химических свойств синтезированных хелатов.

1. Физико-химические свойства и методы исследования липосомалькых форм ДОФА и ДА

Получение липосомальных форм ДОФА и ДА

Для формирования одноламеллярных малых везикул был использован метод гидратация лилидной пленки с последующим озвучиванием. Настоящая методика позволяет получать Лс, размер которых колеблется в пределах 100 нм. Исходное соотношение смеси липидов, состоящей из ФХ и Хол, составляло 7:3 (моль/моль) соответственно. Концентрация включенного Ктх была выбрана близкой к концентрации насыщенного раствора ДОФА (12.7 мМ).

Полученные везикулы отделяли от не включившегося в Лс вещества с помощью гель-фильтрации на сефадексе <3-100. Для расчета степени включения определяли количество Ктх в лилосомальной фракции и во фракции с не включенным в Лс веществом. Концентрацию вещества определяли спектрофотометрически при Х-260 нм.

Определение эффективности включения в липосомы инкорпорированных веществ и размера липосом

Простой способ количественного анализа включенных в липосомы веществ состоит в определении степени включения (Р, %) по формуле

Р = [ЛУ/СД^ + /*У'ЯХ100%, ------ (1)

где А, А' - оптическое поглощение Ктх (при 280 нм) в липосомальной фракции с объемом V и во фракции с не включенным веществом (V) после разрушения Лс 0.2 мл 5.4% раствора ДХН (на 0.4 мл образца) соответственно.

Найденная нами степень включения (6-7%) соответствует Лс с диаметром 90-100 нм и хорошо согласуется с данными, полученными с помощью электронной микроскопии* (негативное контрастирование). Диаметр частиц, наблюдаемых на микрофотографиях, составлял 60-100 км. На основании данных по степени включения Ктх было вычислено соотношение активное вещество/липид, которое достигало 0.012 (моль/моль). Важным параметром для веществ, предназначенных для введения в мозг, является коэффициент распределения.

Определение коэффициента распределения

Коэффициент распределения (/Ср) служит количественной характеристикой степени сродстаа исследуемых соединений к мембране. Очевидно, что для веществ с низкой величиной Кр (полярные) и с очень большой (гидрофобные) проникновение через ГЭБ затруднено. В случае гидрофильных молекул - вследствие практически полной нерастворимости в липидном бислое клеток эпителия капилляров мозга. Для гидрофобных же веществ необходимо решить другую проблему - доставку их к ГЭБ.

Значение Кр определяли в системе октанол/вода, которое в случае ДОФА оказалось равным 0.006, а ДА<0.001 (рН~7). Определение проводили, исходя из равновесной концентрации изучаемых веществ, на основе измерений оптического поглощения (280 нм) в органической и водной фазах.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что в бислое Ктх практически отсутствуют.

"Р-ЯМР исследования

Изучение взаимодействия исследуемых веществ с модельными мембранами проводили с использованием 31Р-ЯМР спектроскопии.

Для Лс с включенным дофамином анизотропия химического сдвига

'Исследования проводились совместно с к.ф-м.н. Григорьевым В.Б., НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН

сигналов ядер 3,Р составила 50 м.д., что соответствовало по значению анизотропии химического сдвига для липосом с включенным ДОФА. Это, в свою очередь, совпадает со значениями, характерными для водных дисперсий ФХ с бислойной фазой.

Форма сигнала а1Р-ЯМР-спектров (асимметричность с плечом со стороны слабого поля) также свидетельствовала о ламеллярной липидной фазе с анизотропным движением молекул фосфолипида в пределах мембраны вне зависимости от способа получения.

Таким образом, введение ДОФА (или дофамина) в Лс не вызывает структурные изменения их бислоя, что не удивительно - согласно определенным значениям Кр концентрация Ктх в бислое крайне мала.

Кинетика высвобождения Ктх из липосом

Липосомапьные. препараты после отделения от не включившегося вещества - неравновесные системы: заключенное внутрь них соединение может вытекать. Кинетика выхода - важная характеристика, во многом определяющая возможность практического использования данного препарата.

Для определения стабильности при хранении Лс с включенными ДОФА или дофамином из свежеприготовленного препарата после отделения Лс от не включившегося вещества через 1, 1,5 и 5 ч отбирали аликвоты и снова разделяли на колонке с сефадексом 6-100. В случае Лс с ДОФА мы наблюдали только один пик, соответствующий Лс с веществом. При элюции Лс с дофамином через 5 ч появлялся второй пик, характерный для фракции с не включенным веществом (37% от исходного количества)(рис. 1). Это объясняется, по-видимому, тем, что в области физиологических значений рН 1-2% ДА находится в незаряженной форме. легео проникающей через

Рис 1. Выход (в % от исходного количества Ктх) ДА из Лев течение 5 ч. 22°С, рН 6.8.

лйпидный бислой. Тогда кз:; ДОФА в аналогичных условиях представляет

собой цвиттерион.

Немаловажным также является устойчивость к окислению включенных

соединений, т.к. Ктх легко окисляются кислородом воздуха.

Окисление катехоламинов и фосфатидилхолина в липосомальных

ДОФА (ДА)

Было обнаружено*, что пустые Лс при длительном введении сами способны улучшать показатели двигательной активности у мышей с экспериментальной моделью синдрома Паркинсона. Известно, что при паркинсонизме усиливается свободнорадикальное окисление липидов, продукты которого обладают токсическим действием на клеточные мембраны. С другой стороны, ненасыщенные фосфолипиды обладают антиоксидантными свойствами. Не исключено, что терапевтический эффект липосомального препарата ДОФА обусловлен в некоторой степени антиоксидантными свойствами ФХ. Помимо этого, ДОФА и ДА сами легко окисляются кислородом. Поэтому представляет интерес изучение взаимного влияния рассматриваемых веществ на окисление друг друга.

На первом этапе было изучено влияние ДОФА и ДА, заключенных в Лс, на перекисное окисление ФХ в процессе хранения липосом (4°С, рН 6.5), а также при инициации окисления Ре(И)-аскорбатом. Для определения интенсивности перекисного окисления липидов использовался метод определения продуктов ПОЛ по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Линейная регрессия экспериментальных данных позволила вычислить скорость накопления ПРТБК в "пустых" Лс и в липосомах с включенными ДОФА (ДА)(табл. 1).

'Все биологические эксперименты проводились ас л. Института общей патологии и патологической физиологии РАМН Юрасовым В.В.

Условия эксперимента Константа скорости накопления ПРТБК, .103 мкмоль/л.ч Коэффициент корреляции

"Пустые" липосомы, первые 9 суток 16.2±0.6 0.993

"Пустые" липосомы, через 9 суток 112±6 0.997

Липосомы с ДОФА 6.25±1.7 0.777

Липосомы с ДА 3.29+0.3 0.951

•Состав Лс: ФХ:Хол (7:3 моль/моль) (4°С, рН 6.5). С„йпилоа = 0.16%, Сктж = 2.0 мМ.

Антиоксидантная активность ДОФА и ДА в липосомах также проявлялась при ге(П)-аскорбат-индуцированном ПОЛ, когда процесс окисления липидоа значительно ускоряется (табл. 2).

Таблица 2. Относительное количество ПРТБК в "пустых" Лс и Лее включенными ДОФА (ДА) в присутствии индукторов окисления (Ре(И)+аскорбат)

Исследуемые препараты до инкубации инкубация с Ре^аскорбат

"Пустые" липосомы 100±2 343±6

Липосомы с ДОФА 100±4 107±2

Липосомы с ДА 100±3 105±3

'Состав Лс: ФХ:Хол (7:3 моль/моль). 40 мин инкубации. Слигаздм = 0.16%, Сктх = 2.0 мМ.

Таким образом, была отмечена антиоксидантная активность катехолов в липосомах при хранении и в ходе аскорбат-зависимого ПОЛ.

Дальнейшая работа была направлена на выявление характера влияния ФХ на процессы окисления включенных в Лс ДОФА (ДА).

Окисление исследовали как при хранении лилосомального препарата в физиологическом растворе (рН 6.5, 22°С), так и в условиях ускоренного окисления при щелочных значениях рН (8.9) и насыщении препарата воздухом. В первом случае оказалось, что охисление ДОФА и ДА в Лс происходило

заметно медленнее, чем в соответствующих растворах (рис. 2).

-------- 4,<

2 4 б г и п Вреил.суг

Рис.2. Динамика окисления ДОФА (1, 2) и ДА (3, 4) в 0.9 % растворе №С1 (рН 6.5) (2, 4) и инкапсулированных в липосомы иэ смеси ФХ+Хол, 7:3 (моль/моль) (1, 3). СщгО.в мМ,

Сяио«дов=0.1

При инициации окислительных процессов в более жестких щелочных аэробных условиях (0.1М буфер, рН 8.9) наблюдалось снижение скорости

окисления при добавлении ФХ, причем при изоляции Ктх внутри Лс отмечался наибольший эффект (табл. 3).

Таблица 3. Скорость окисления' Ктх в разных системах

Система Относительная скорость окисления

ДОФА ДА

Ктх в буфере 100±6 78±5

Ктх + (ФХ + Хол) + ДХН (105:1:3)(моль/моль/ моль) в буфере 10±2 14±2

Ктх внутри Лс в буфере 0.4±0.2 0.2±0.2

Исходные концентрации: С»х>Хоя 3 0.8%, С*тх = 2 5 «М. 0.1 М глициновый буфер (рН

8.9), 25°С.

•Примечание: здесь и далее скорость рассчитывали как изменение оптической плотности 390 нм) в ед. времени. Скорость реакции окисления в растворе ДОФА принята аа 100

ед.

Приведенные выше результаты показывают, что ФХ и ДОФА (ДА) в липосомапьных препаратах ингибируют окисление друг друга, что возможно, например, в том случае, если они конкурируют за окислитель, и (или) окисление каждого из них происходит относительно независимо.

Конкурентный характер окисления Ктх продемонстрирован для мицеллярных растворов на рис. 3, из которого видно, что увеличение концентрации липидов приводит к уменьшению скорости окисления как ДОФА, так и ДА.

Рис. З.Скорость окисления Ктх в 0.1М глициновом буфере (рН 8.9, 25°) при барботировании воздухом (5 мл/мин) в мицеллярных растворах: Ктх + ДХН (1); Ктх + ДХН + 0.1% (ФХ+Хол)(7:3)(2); Ктх + ДХН + 0.2% (ФХ+Хол)(7:3)(3); Ктх + ДХН + 0.8% (ФХ+Хол)(7:3)(4). Ск„ = 2.5 мМ. Сдхн = 0.3 мг/мл. Черные столбцы - ДОФА, белые - ДА.

Полученные данные свидетельствуют о наличии химического фактора, ингибирующепо окисление внутрилипосомального Ктх. Однако в состав липидного бислоя помимо ФХ входит также Хол. Поэтому для выяснения степени влияния Хол в рассматриваемом процессе дальнейшее исследование проводилось с Лс, содержащими только ФХ. При этом количество ненасыщенных связей не уменьшается, а вязкость бислоя уменьшается в 10 раз. Как было установлено, полное удаление Хол практически не оказывает влияние на скорость окисления включенного вещества (рис. 4), т.е. этот процесс практически не зависит от вязкости бислоя.

в а

s г О о

Рис. 4. Окисление ДОФА в Лс. состоящих из ФХ+Хол (7 3)<1). ФХ (2), ДМФХ+Хол(7:3)(3); ДМФХ (4). Сдофа=16.6 мМ. 5% липидная суспензия, 25°С, 0.1 М глициновый буфер, рН 8.9

С другой стороны, замена ФХ на ДМФХ позаолила выявить роль топологического фактора ("физического" барьера) в защитной антиоксидантной функции бислоя Лс. Тем самым исключалось конкурентное связывание О2 двойными связями ненасыщенного липида. 8 частности, из табл. 4 видно, что скорость окисления ДОФА в Лс, содержащих ДМФХ+Хол, в 3 раза превышает значение скорости окисления Ктх в Лс из ФХ+Хол. Тогда как это значение в 150 раз меньше, чем соответствующее значение для ДОФА, находящегося в растворе.

Таблица 4. Окислительная активность ДОФА в Лс и растворе

Скорость о<исления ДОФА, огн. ед Состав Лс

0.21 ФХ+Хол (7:3)

0.7 ДМФХ+Хол (7:3)

100 Раствор

Сдофа=1<5.6 мМ. 5% липидная суспензия, 25°С, 0.1 М глициновый буфер, рН 8.9

Отсюда следует значительная роль топологического фактора в рассматриваемых системах: липидный бислой Лс способен изолировать находящийся внутри него ДОФА(ДА) от основной массы растворенного в воде кислорода.

Таким образом, в условиях проведения настоящих экспериментов было показано, что Ктх и ФХ проявляют взаимную антиоксидантную активность.

11

2. Получение и основные физико-химические свойства ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония

С целью повышения концентрации внутрилипосомального раствора ДОФА нами был синтезирован моноДОФАборатный комплекс аммония (II) который служил моделью для дальнейших экспериментов с моноДОФАборат 1-адамантиламмонием (IV). Кроме того, соответствующие комплексные соли с ДА (I, III) за счет своей ионной природы потенциально способны предотвращать выход Ктх, имеющий место в случае липосомальной формы с ДА.

R

NH3+

(VII, VIII)

где R - (CHjb-NHj (I, III, V, VII), CHrCH(NHj)COOM (II, IV. VI, VIII).

Комплексы формировали при взаимодействии эквивалентных количеств Ктх, ортоборной кислоты и карбоната аммония или "-аминоадамантана (рН 6.57):

н3в03 +

НО

НО

-со2,н2о

R

nh4+

H3B03 +

но

но

Работа по изучению важнейших характеристик комплексов была реализована с помощью методов ЯМР, ИК, масс-спектрометрии и кондуктометрии.

Метод ЯМР-спектроскопии* на ядрах 1Н и 11В использовали для анализа структуры полученных комплексных соединений. В ПМР-спектре продуктов взаимодействия В(ОН)з, Ктх с (NH4)2CC>3 или 1-аминоадамантаном в DjO появляется новая группа пиков в области сильного поля (5 = 6.35-6.24 м.д.), которая может быть приписана протонам пирокатехольного фрагмента, связанного с атомом В.

Съемка спектров тех же соединений в DMSOd6 дает возможность определить сигналы NH2- и ОН-групп, избежав быстрого обмена их протонов. Так, в ПМР-спектре ДАбората аммония отсутствовали сигналы протонов фенольных групп. Неизменным оставался сигнал с химическим сдвигом 7.85 м.д., который относился к протонам концевой NHj-rpynnbi. Кроме того, отсутствие изменений химических сдвигов в области алифатических протонов (2Н, т, 2.91; 2Н, т, 2.67) в спектрах продуктов взаимодействия как моно, так и диДАбората аммония (1-адамантиламмония) свидетельствовали о том, что

атом N не вовлечен в координационную связь с В. Мостиковая связь устанавливается между атомами В и О.

В условиях физиологического значения рН при взаимодействии борной кислоты с Ктх в реакционной смеси присутствуют как борная кислота, так и комплексы. Данные 11В-ЯМР исследований полученных комплексов представлены в табл. 4.

Таблица 4. Интегральные интенсивности монокомплексов ДОФА и дофамина

Соединение Интегральная интенсивность (%)

В(ОН)3 дикомплекс монокомплекс

II, IV 43 4 53

I.V 43 4 53

IV, VIII 26 - 74

III, VII 20 - 80

Таким образом, в условиях проведения эксперимента получается смесь веществ с преимущественным содержанием в ней монокомплекса. Значительный избыток Ктх в соотношении исходных компонентов (50:1, 10:1, 4:1) приводил лишь к 10-20% повышению содержания дикомплекса.

Наличие монокомплексов и комплексов двойного состава было зафиксировано с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления iS2Cf. Так, в спектрах моноДОФА(ДА)боратов аммония помимо фрагментных ионов (М* -ОН) наблюдались молекулярные ионы с m/z 401 и 313, отвечающие соответствующим дикомплексам.

Присутствие в полученных хелатах координационной связи 02>в<0г, установленное с помощью 11В-ЯМР спектроскопии, было подтверждено также

'Работа проводилась совместно с научн. сотр. кафедры Биотехнологии МИТХТ Алексеевой С.Г.

на основании результатов метода дифференциальной ИК-спектроскопии, который позволяет идентифицировать в полученных комплексных соединениях частоты колебаний, появляющиеся в результате координации.

В спектрах хелатов появляются новые по сравнению с исходными характеристические полосы поглощения при 904 и 940 см-1, которые соответствуют валентным колебаниям связи В(4)<(ОН)2. В области валентных колебаний связи 02>В(4)<02 (1064-1054 см"1) проявляется легко

идентифицируемая сильная широкая полоса.

Для определения константы равновесия системы (1^, Кг), состоящей из Ктх и борат-аниона (схема 1) был использован кондуктометрический метод.

Схема 1

К,

В(ОН)3 + Н20 В(0Н)4' + Н+

н

В(ОН)4" +2

н

-4Н20

o/V

Различие в электролитических свойствах моно- и дикомплексов нашло количественное выражение в разных значениях констант равновесия, которые сведены в табл.5.

15

Таблица 5. Логарифмы констант равновесия при разных температурах

Соединение \одКьКг(П0С) 1одК,,К2(27°С)

I 2.48±0.04 2.4110.04

V 4.00+0.06 4.4310.07

И 2.75±0.05 2.90+0.05

VI 4.0310.06 4.05Ю.06

VII 2.68±0.05 2.7610.05

VIII 2.76±0.05 2.7310.05

На основании кондуктометрических исследований было установлено, что комплексная соль моноДАборат аммония (I) облада ет меньшей устойчивостью по сравнению с соответствующей 1-адамантиламмониевой солью (VII). Значения констант равновесия моноДОФАборат аммония (II) и 1-адамантиламмония (VIII) сопоставимы. Большей стабильностью отличаются . комплексы двойного состава (V, VI). Согласно литературным данным, полученные константы боратных комплексов ниже известных значений равновесных констант исследуемых Ктх с Си2+(7.7) и Мд2+ (4.7), но сопоставимы с Са2+ (2.7).

3. Конструирование липосомального препарата с высоким соотношением Ктх/лилид

В основе конструирования липосомальных форм комплексных соединений лежали методы и подходы, аналогичные тем, которые были использованы для получения липосомальных форм Ктх.

Как было установлено спектрофотометрически, степень включения моноДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония для 5% дисперсии находилась в пределах 5-7%, что совпадает со значениями, полученными для соответствующих Лс с ДОФА (ДА). Это в свою очередь является косвенным доказательством найденного ранее размера Лс (60-100 нм), т.к. в случае малых

одноламеллярных Лс при заданной концентрации липидов для гидрофильных веществ степень включения однозначно определяется размером везикул. Максимальное значение концентрации боратных солей, которого удалось достичь, составило 0.8М. При этом значение отношения активное вещество/липид оказалось разным 0.5:1 (моль/моль). Сравнение полученного значения с соответствующим соотношением, характеризующим липосомальную форму ДОФА, показывает, что око в случае комплексов в 42 раза выше значения соответствующего соотношения, характеризующего липосомальную форму ДОФА.

Таким образом, комплексообраэование ДОФА позволяет существенно повысить в липосомальной форме соотношение активное вещество/липид.

Комплексообразование также может способствовать удерживанию веществ во внутренней полости Лс, что было подтверждено в ходе изучения кинетики выхода моноДАборат аммония и 1-адамантиламмония. Так, в соответствии с полученными результатами для липосомальной формы с включенным моноДАборат 1-адамантиламмонием время полувыхода активного вещества из Лс в 87 раз (по крайней мере 29 сут) превышает соответствующее значение в липосомальной форме, содержащей свободный Ктх.

Таким образом, липосомальная форма активного вещества э виде комплекса характеризуется намного большей устойчивостью во времени, чем Лс, содержащие свободный Ктх.

4. Биологические испытания липосомальных препаратов ДОФА и ДА

Опыты проводились на мышах-самцах (масса 23-25 г) линии С57Виб в возрасте 3 месяцев. Паркинсонический синдром моделировали введением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина в дозе 20 мг/кг 2 раза в день. О развитии болезни судили по изменению основных параметров двигательной активности животных: пройденному пути (в см), времени отдыха (в с), времени передвижения (в с) и числу стоек. Было показано, что

липосомальный препарат ДОФА по сравнению с введенным раствором ДОФА оказывает пролонгированное действие (в 2-3 раза более длительное, чем раствор ДСФА). При этом у животных наблюдается выраженный эффект подавления характерных паркинсонических симптомов, терапевтический эффект достигался при дозах в 10 раз меньших, чем в случае раствора ДОФА.

Еще более показательные результаты были получены при введении Лс с ДА. Оказалось, что липосомы с ДА вызывают терапевтический эффект, сходный с тем, который был получен для Лс, загруженных ДОФА. Тогда как введенный раствор ДА, как и ожидалось, не оказывал никакого действия на двигательную активность мышей. Отсюда можно заключить, что липосомальная форма ДОФА (ДА) - объект исследования настоящей работы, существенно улучшает доставку лекарства в мозг. Это происходит скорее всего за счет предотвращения периферического метаболизма Ктх и уменьшения объема распределения. Таким образом, биологические исследования показали, что поставленные нами цели достигнуты.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы липосомальные препараты ДОФА и дофамина для лечения болезни Паркинсона.

2. Определены степень включения инкорпорированных соединений: 67% для 5% дисперсий, проведена оценка коэффициента распределения между липидной и водной фазами (Кр • 0.006 для ДОФА и Кр<0.001 для ДА (октанол/вода)), размер липосом (60-100 нм). "Р-ЯМР исследования показали, что введение ДОФА/дофамина в липосомы не нарушает структуру бислоя.

3. Установлена взаимная антиоксидантная активность ДОФА/ДА и ФХ. Было показано, что как ДА, так и ДОФА в исследуемой системе проявляют свойства антиоксидантов по отношению к ФХ. С другой стороны, Лс защищают Ктх от окисления. Этот эффект в значительной степени определяется изоляцией молекул внутри Лс от основного пула растворенного в воде кислорода.

4. С помощью ИК-, масс-спектров и ЯМР на ядрах 1Н и 11В была подтверждена структура соединений типа МА и МА2 (где М - центральный ион, А - адденд). Показано, что в условиях физиологического значения рН образуется смесь соединений с преимущественным содержанием монокомплексов.

5. Потенциометрическим методом исследована равновесная система, содержащая исследуемые комплексные соединения. Как было установлено, устойчивость моноДАбората 1-адамантиламмония выше, чем у соответствующей комплексной соли аммония. Значения равновесных констант моноДОФАборатов аммония и 1-адамантиламмония сопоставимы.

6. Биологические испытания подтвердили наличие эффекта при введении липосомальных препаратов с ДОФА по сравнению с введенным раствором ДОФА: длительность действия увеличилась в 2-3 раза при дозах в 10 раз меньших.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Yurasov V.V., Kryzhanovsky G.N., Nikushkin E.V., Borisova N.V., Kaplun A.F., Shvets V.I. Effect of liposome containing L-DOPA on striatum dopamine metabolism in experimental Parkinsonian syndrome // Pharmacological research. 1995. V. 31. Suppl. B. Abstracts presented at the First European Congress of Pharmacology. Milan, Italy. 1995. P. 109.

2. Kaplun AP., Yurasov V.V., Zhigaltsev I.V., Bogomolov O.V., Borisova N.V., Kucheryanu V.G., Borduikov M.M., Nikushkln E.V., Kryzhanovsky G.N., Shvets V.t. Liposomes containing L-DOPA: reciprocal inhibition of PC and L-DOPA oxidation // The Fifth Liposome Reseach Days. 3-6 July 1996. Azalea, Shlzuoka, Japan. P. 64.

3. Борисова H.B., Каплун A.M., Швец В.И., Юрасов В.В., Крыжановский Г.Н. Использование липосомапьной технологии для доставки лекарственных препаратов в мозг на примере лечения болезни Паркинсона // IV Международная конференция "Наукоемкие химические технологии". 9-14 сентября 1996. Волгоград-Астрахань, Россия. С. 148-150.

4. Борисова Н.В., Каплун А.П., Богомолов О.В., Григорьев В.Б., Юрасов В.В., Никушкин Е.В., Крыжановский Г.Н., Швец В.И. Физико-химические свойства

липосомных форм 1-3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и дофамина // Биоорган, химия. Т. 22. N 10-11. 1996. С. 851-856.

5. Борисова Н.В., Каплун А.П., Богомолов О.В., Жигальцев И.В., Юрасов В.В., Швец В.И. II Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию со дня рождения НАПреображенского. 21-22 октября 1996. Москва, Россия. С. 128130.

6. Kaplun А.Р., Borisova N.V., Yurasov V.V., Zhigaltsev I.V., Kucheryanu V.G., Borduikov M.M., Nikushkin E.V., Kryzhanovsky G.N., Shvets V.l. Are the intraliposomai DOPA and dopamine proofed against the oxidation due to egg PC bilayer, being the chemical oxygen "trap"?// Conference "Liposome advances: progress in drug and vaccine delivery". 16-20 December 1996/ London. UK. P. 20

7. Kaplun A.P., Yurasov V.V., Zhigaltsev I.V., Bogomolov O.V., Borisova N.V., Kucheryanu V.G., Borduikov M.M., Nikushkin E.V., Kryzhanovsky G.N., Shvets V.l. Liposomes containing L-DOPA: reciprocal inhibition of PC and L-DOPA oxidation// Progress in Drug Delivery Systems. Ed. S. Hirota, Sh. Okada. V.V. 1996. P. 175178.

8. Борисова H.B., Жигальцев И.В., Богомолов О.В., Каплун А.П., Юрасов В.В., Кучеряну В.Г., Никушкин Е.В., Крыжановский Г.Н., Швец 8.И. // Биоорг. химия. Т. 23. N 4. 1997. С.289-294.

Подписано в печать 15.05.97. Формат 60*90/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уч.изд. л. ^е? Тираж 100 экз. Заказ №

•ИПЦ ВДГХГ им. М.В.Ломоносова пр. Вернадского, 86

Список сокращений

Введение 2

1. Литературный обзор "Конструирование лекарственных препаратов для проникновения в мозг"

Введение 4-6 1.1. Гемато-энцефалический барьер и его функциональные особенности 7

12. Проникновение веществ в мозг с помощью ОВС 9

1.3. Применение молекулярной модификации для создания потенциальных антипаркинсонических пролекарственных форм

Ь-ДОФА и дофамина 14

1.4. Липосомы как инструмент доставки лекарственных препаратов в мозг 19

1.4.1. Функциональные липосомы для лечения опухолей мозга 22

1.4.2. Использование липосом для лечения болезни Паркинсона 25

2. Обсуждение результатов

2.1. Получение липосом, содержащих ДОФА и дофамин 28

2.2. Физико-химические свойства липосомальных форм ДОФА и дофамина

2.2.1. Определение коэффициента распределения 30

2.2.2. МР-ЯМР исследования 32

2.2.3. Определение эффективности включения Ктх в Лс 34

2.2.4. Определение размера Л с 36

2.2.5. Кинетика высвобождения Ктх из Лс 37

2.3. Окисление в Лс, содержащих ДОФА (и дофамин): взаимное влияние компонентов

2.3.1. Влияние внутрилипосомальных Ктх на перекисное окисление лип идо в 39

2.3.2. Изучение роли ФХ на окисление внутрилипосомальных Ктх 43

2.4. Получение и физико-химические свойства ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония

2.4.1. Введение 50

2.4.2. Синтез ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония 53

2.4.3. ЯМР-исследования полученных комплексных соединений 55

2.4.4. Применение ИК-спектроскопии 64

2.4.5. Масс спектроскопия ДОФА(ДА)боратов аммония и

1 -адамантиламмония

2.4.6. Определение равновесной константы реакции образования комплексов 72

2.4.7. Растворимость в воде и термическая устойчивость полученных комплексных соединений 83*

2.5. Конструирование лекарственного препарата с высоким содержанием Ктх/липид

2.5.1. Получение липосомальной формы ДОФА(ДА)боратов аммония и 1 -адамантиламмония 84

2.5.2. Изучение кинетики высвобождения комплексов из Лс

2.6. Биологические испытания полученных соединений 87

3. Экспериментальная теть 89

4. Выводы

1. Литературный обзор "Конструирование лекарственных препаратов для проникновения в мозг"

Введение 4-6 1.1. Гемато-энцефалический барьер и его функциональныеособенности 7-812. Проникновение веществ в мозг с помощью ОВС 9-131.3. Применение молекулярной модификации для создания потенциальных антипаркинсонических пролекарственных формЬ-ДОФА и дофамина 14-181.4. Липосомы как инструмент доставки лекарственныхпрепаратов в мозг 19-211.4.1. Функциональные липосомы для лечения опухолей мозга 22-241.4.2. Использование липосом для лечения болезни Паркинсона 25-272. Обсуждение результатов2.1. Получение липосом, содержащих ДОФА и дофамин 28-302.2. Физико-химические свойства липосомальных форм ДОФА и дофамина2.2.1. Определение коэффициента распределения 30-322.2.2. МР-ЯМР исследования 32-342.2.3. Определение эффективности включения Ктх в Лс 34-362.2.4. Определение размера Л с 36-372.2.5. Кинетика высвобождения Ктх из Лс 37-382.3. Окисление в Лс, содержащих ДОФА (и дофамин): взаимное влияние компонентов2.3.1. Влияние внутрилипосомальных Ктх на перекисное окислениелип идо в 39-432.3.2. Изучение роли ФХ на окисление внутрилипосомальных Ктх 43-492.4. Получение и физико-химические свойства ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония2.4.1. Введение 50-522.4.2. Синтез ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония 53-542.4.3. ЯМР-исследования полученных комплексных соединений 55-632.4.4. Применение ИК-спектроскопии 64-702.4.5. Масс спектроскопия ДОФА(ДА)боратов аммония и1 -адамантиламмония 712.4.6. Определение равновесной константы реакции образования комплексов 72-832.4.7. Растворимость в воде и термическая устойчивость полученных комплексных соединений 83*оьстр.

2.5. Конструирование лекарственного препарата с высоким содержанием Ктх/липид2.5.1. Получение липосомальной формы ДОФА(ДА)боратов аммонияи 1 -адамантиламмония 84-852.5.2. Изучение кинетики высвобождения комплексов из Лс 862.6. Биологические испытания полученных соединений 87-883. Экспериментальная теть 89 -1004. Выводы 1015. Список литературы 102 -116 Приложение 117-126Список сокращений2-АЭ 2-АминоэтанолГЭБ Гемато-энцефалический барьерДА 3,4 -Дигидроксифенилэтиламин (дофамин)ДОФА Ь-З,4-дигидроксифенилаланинДПФХ ДипальмитоилфосфатидилхолинДСФХ ДистеароилфосфатидилхолинДХН Дезоксихолат натрияКхх КатехолыкР Коэффициент распределенияЛс Липосомы2-МП К N - м ети л п ир и ди ния -2 -кар б ал ьдокси мОВС Окислительно-восстановительные системыПОЛ Перекиси о е окисление липидовПЭГ ПолиэтиленгликольПРТБК Продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотойТБК 2-тиобарбитуровая кислотаТГА 9-амино-1,2,3,4-тетрагидроакридинтгаом 1,2-дигидроксибензол-З,5-дисульфонатФИ ФосфатидилинозитолФХ Яичный фосфатидилхолинХол Холестеринц.н.с. Центральная нервная системаЭДТА Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая сольВведениеНесмотря на то, что первое предположение о роли дофамина (ДА) как медиатора центральной нервной системы было выдвинуто в 1957 г., было бы ошибочно утверждать, что достижения последних лет полностью раскрывают молекулярный механизм протекания болезни Паркинсона. В 1962 г. впервые для лечения болезни Паркинсона был применен биологический предшественник ДА - 1.-ДОФА ("Леводопа").

Вследствие периферического декарбоксилирования, а также ограниченной проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для ДОФА терапевтический эффект возможно достичь лишь за счет больших доз этого препарата, что в свою очередь сопряжено с многочисленными побочными эффектами, т.к. ДА имеет рецепторы в сердце и других органах.

С целью предотвращения декарбоксилирования ДОФА вне мозга было предложено одновременное введение ДОФА с ингибиторами периферической ДОФА-декарбоксилазы, в качестве которых в последнее время используют [И1 -(0,1.-серил)-М2-(2,3,4-тригидроксибензил)гидразин (бенсеразид) и 0,1-а-гидразино-а-метил-р-(3,4дигидроксифенил)пропионовую кислоту ("Карбидопа").

Эта же проблема побудила некоторых авторов разработать методику получения медных и цинковых комплексов оснований Шиффа ДОФА и дофамина, что позволяет снизить периферическое взаимодействие с кофактором декарбоксилазы - пиридоксальфосфатом за счет образования полностью координированной формы.

Бородом и др. был разработан изящный подход по преодолению ГЭБ, согласно которому направленная доставка веществ в мозг может осуществляться с помощью переносчиков, обладающих окислительно-восстановительными свойствами.

В качестве альтернативного способа в настоящей работе предлагается использование липосомальных форм ДОФА. ДОФА, заключенный в Лс, должен быть защищен от периферического декарбоксилирования. Сдругой стороны, т.к. известно, что объем распределения липосомальной формы меньше, чем у соответствующих растворов, то она способна создавать большие эффективные концентрации лекарственного препарата, что должно приводить к уменьшению дозы и, как следствие, снижению побочных эффектов. Кроме того, липосомальная форма может выступать как депо, т.е. увеличивать время действия препарата.

Учитывая вышеизложенное, цель настоящей работы состояла в получении и изучении физико-химических свойств липосомальных форм ДОФА(ДА) и их боратных производных.

Использование боратных комплексов было обусловлено необходимостью увеличения растворимости ДОФА в Лс. Тем самым оказывалось возможным получение Л с с большим соотношением ДОФА/ФХ. Кроме того, боратные комплексы Ктх, как известно, могут защищать их от окисления. Не исключено также, что боратные комплексы будут лучше удерживаться в Лс. Наконец, использование 1-адамантиламмониевых комплексных солей может обеспечить потенциально возможный синергизм лечебных свойств обоих веществ, т.к. препарат "Мидантан" используется для лечения болезни Паркинсона (он уменьшает обратный захват ДА пресинаптической мембраной).

Для реализации поставленных задач работа была построена в несколько этапов:конструирование и изучение физико-химических свойств липосомальной формы ДОФА и ДА;- исследование их характеристичных свойств, в частности изучение взаимного влияния компонентов на окисление друг друга;- получение ДОФА(ДА)боратных комплексов 1-адамантиламмония и аммония;- определение физико-химических свойств синтезированных хелатов;- включение ДОФА(ДА)боратов аммония и 1-адамантиламмония в Лс и изучение свойств данных липосомальных форм.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОРКОНСТРУИРОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПРОНИКНОВЕНИЯ В МОЗГВВЕДЕНИЕНовые классы лекарственных соединений, а с ними и усовершенствованные лекарственные формы - таков результат взаимодействия химиков, биологов, фармацевтов и врачей. Одной из первых и до сих пор наиболее распространенной бесспорно считается таблетированная форма. За этой общепризнанной технологией стоит необходимость знания точной дозировки потенциального лекарственного средства в устойчивой и приемлемой форме [1]. Передозировка же опасна риском усиления побочный явлений.

Однако ряд болезней, в том числе появившиеся в последнее время, требуют внедрения новых систем доставки веществ, включая антиопухолевые агенты, циток ины, иммуномодуляторы, вакцины и т.п. Эти системы призваны селективно обеспечивать орган-мишень переносимым лекарством в малых дозах и за ограниченное время. К их основным свойствам относятся:- повышенная комфортность лечения за счет более точного, легкого и менее частого дозирования;- повышенная безопасность, обусловленная сокращением контакта лекарственного препарата с тканями и клетками, находящимися за пределами направленного действия препарата;- разнообразие и, вместе с тем, индивидуальный подход в выборе необходимых концентраций лекарственного средства;- эффективная абсорбция в органе-мишени;- терапевтическая концентрация препарата поддерживается на заданном уровне достаточно долго.

Традиционные формы введения лекарственных препаратов в организм в конце 70-х гг. пополнились еще одной - матричной [2]. Процесс инкапсулирования состоит из 2 стадий: 1) измельчение лекарственного вещества с последующим распределением в дисперсионной среде и 2) покрытие его частиц полимерной пленкой. В качестве материала дляизготовления матриц и микросфер вполне применимы гидрофобные вещества типа восков, но с точки зрения контроля характеристик высвобождения лекарства исключительно благоприятными представляются полимеры такие, как поли(1./(01)-молочная кислота) с/без трибутилцитратом, сополимер {.-молочной и гликолевой кислот.

Использование микоадгезивных полимеров - технология будущего, которая позволит уменьшить захват препарата органами желудочно-кишечного тракта [3]. В последнее время были также созданы не адсорбируемые полимерные конъюгаты, высвобождение вещества из которых идет с помощью азоредуктазы [4]. Фермент синтезирует колония бактерий, химически связанная с полимерным носителем.

Не так давно появились работы по использованию наночастиц -коллоидных полимерных носителей [5]. Предполагается, что за счет их малого размера возможно будет повысить стабильность и абсорбцию системы переноса, а также осуществить количественный перенос активного вещества в клетки [6]. В работе [7] отмечалось значительное усиление фармакологической активности и пролонгированное действие инсулина и гидрокортизона, связанных с наночастицами.

Наночастицы, в частности, могут быть получены из ацетата холестерина [8]. После впрыскивания органического раствора в водную фазу получают устойчивую эмульсию (м/в). Микроэмульсии и липопротеиды низкой плотности обычно используют для транспортировки к клетке жирорастворимых лекарственных веществ.

В последнее время появились данные по использованию в качестве доставки лекарств биосом [10]. Они состоят из липидного матрикса, включающего в себя как полярные, так и неполярные липиды (например,соевый лецитин и моноаци л глицерин), которые формируют частично упорядоченную липофильную фазу. Липидный матрикс может содержать до 50% воды (по массе). Спонтанное образование биосом происходит в условиях избыточного количества воды. Биологическая эффективность биосом была продемонстрирована на примере биосом с включенным низкомолекулярным гепарином. Они могут включать как гидрофильные, так и гидрофобные вещества в зависимости от состава бислоя.

Универсальным характером по отношению к природе переносимых молекул отличаются также Лс. Липосомы как средства доставки лекарств обладают весьма широкими функциональными возможностями, в том числе они могут выступать в качестве депо для доставки веществ в мозг. Однако транспорт лекарственных веществ в мозг осложнен вследствие наличия гемато-энцефалического барьера.

Настоящий обзор включает не только рассмотрение возможных путей проникновения активных веществ в мозг. В частности, особое внимание уделяется конструированию антипаркинсонических лекарственных препаратов.

ГЕМАТО-ЭНЦЕФАПИЧЕСКИЙ БАРЬЕР И ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕОСОБЕННОСТИВ качестве мишени для направленного транспорта веществ в мозг может выступать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Концепция ГЭБ возникла в конце XIX века, когда немецкий бактериолог Пауль Эрлих [11] обнаружил, что некоторые красители, введенные внутривенно, сохраняются во всех органах, кроме мозга. Ученый объяснял эти результаты низким сродством используемых красителей к клеткам мозга. Позднее ученик Эрлиха - Гольдманн опроверг это предположение на основании данных по непосредственному введению трипанового синего в цереброспинальную жидкость кроликов и собак [12]. Краситель находился в паренхиме мозга, но не проникал в кровь, т.к. не был обнаружен в других органах. Поэтому было выдвинуто новое предположение о существовании некоторого барьера, отделяющего ц.н.с. от крови. Как было установлено значительно позже, этот барьер, названный гемато-энцефалическим, в отличие от капилляров в других органах, образован непрерывным слоем плотно прилежащих друг к другу клеток [13]. Сеть плотно прилегающих друг к другу клеток эпителия предотвращает проникновение в мозг большинства веществ через межклеточные поры и нивелирует действие осмотического давления, которое обычно контролирует обмен веществ между кровью и тканями.

Вещества могут проникать через ГЭБ либо путем пассивной диффузии (вещества незаряженные, вода, мочевина и т.п.) и посредством активного транспорта (глюкоза, некоторые аминокислоты) [14-17]. Механизм проникновения пептидов, за некоторым исключением, до конца не раскрыт [18-20]. Известно, что информационные опиатные пептиды (р-эндорфин, энкефалины) могут как пассивно проникать в мозг, так и с помощью транспортных белков (пептидной транспортной системы 1) [21]. Перенос молекулы инсулина из крови в мозг осуществляется посредствомспецифической транспортной системы, связанной с рецепторами, расположенными в церебральных микрососудах [22].

Скорость проникновения веществ в мозг определяется не только природой самих соединений (в случае активного транспорта), но и функциональными особенностями строго специфичной системы транспортных белков ц.н.с. [23-24]. Было установлено, что проницаемость ГЭБ неодинакова в различных отделах мозга и, кроме того, может изменяться под влиянием некоторых факторов.

Как было установлено [25], в мозге имеются "безбарьерные" зоны, куда введенные в кровь вещества поступают почти беспрепятственно. В некоторых отделах мозга проницаемость ГЭБ по отношению к биогенным аминам, электролитам выше, чем в других отделах мозга.

Согласно имеющимся литературным данным, ГЭБ может стать проницаем в результате некоторых физиологических и токсикологических процессов [26]. К факторам разрушения ГЭБ в экспериментальных условиях относятся: арахидоновая кислота, эйкозаноиды, брадикинин, гистамин и свободные радикалы [27]. Механизм их действия заключается 1) в изменении уровня кальция в цитозоле; 2) индукции системы вторичных мессенджеров, что в целом приводит к изменению проницаемости ГЭБ [28]. Кроме того, предложены другие методы повышения проницаемости ГЭБ [29]. Среди них следует отметить метод, в основе которого лежит использование химерных белков [30]. Однако эти методы малоэффективны. Проблема преодоления непроницаемости гемато-энцефалического барьера до сих пор остается актуальной. Ряд заболеваний, в том числе болезнь Паркинсона, тесно связаны с ней.

ПРОНИКНОВЕНИЕ ВЕЩЕСТВ В МОЗГ С ПОМОЩЬЮ ОВСОдно из возможных решений проблемы доставки веществ в мозг может быть найдено с помощью метода, основанного на получении окислительно-восстановительных систем (ОВС). Направленный транспорт веществ в ц.н.с. посредством химических систем доставки был разработан Бородом с соавторами [31, 32]. Этот способ позволяет создавать формы с замедленным выделением активного вещества. Существует 2 основополагающих подхода к проблеме транспорта лекарств в мозг с помощью ОВС.

Выводы

1. Сконструированы липосомальные формы ДОФА и дофамина (ДА), которые могут быть использованы в дальнейшем для изучения их антипаркинсонического действия.

2. Определены степень включения инкорпорированных соединений (6-7% ), проведена оценка коэффициента распределения между липидной и водной фазами (Кр = 0.006 для ДОФА и Кр<0.001 для ДА (октанол/вода)), размер липосом (Лс) (60-100 нм). 31Р-ЯМР исследования показали, что введение ДОФА/дофамина в липосомы не нарушает структуру бислоя.

3. Установлена взаимная антиоксидантная активность ДОФА/ДА и фосфатидилхолина. Было показано, что как ДА, так и ДОФА в исследуемой системе проявляют свойства антиоксидантов по отношению к ФХ. С другой стороны, скорость окисления катехолов в Лс в значительной степени определяется изоляцией молекул внутри Лс от основного пула растворенного в воде кислорода.

4. Получены моноДОФА(ДА)бораты аммония и 1 -адамантиламмония.

С помощью ИК-, масс-спектров и ЯМР на ядрах ^Н и ^В была подтверждена структура соединений типа МА и МА2 (где М - центральный ион, А - адденд). Показано, что в условиях физиологического значения рН (Н3В03:Ктх, 0.5М:0.5М) образуется смесь соединений с преимущественным содержанием в ней монокомплексов (в случае 1-адамантиламмониевых комплексных солей 80%, а аммониевых - -50%).

5. Потенциометрическим методом изучена равновесная система, содержащая исследуемые комплексные соединения. Как было установлено, устойчивость моноДАбората 1-адамантил аммония выше, чем у соответствующей комплексной соли аммония.

6. Биологические испытания подтвердили наличие терапевтического эффекта при введении липосомальных препаратов ДОФА и дофамина.

1. Robinson D.H., Mauger J.W. Drug delivery systems//Amer. J. hosp. pharm. 1991. V.48. Suppl. 1. Pp. 14-23.

2. Биополимеры. Под ред. Иманиси Ю. М: Мир. 1988. Сс. 518-535.

3. Ganderton D. Current innovations in drug delivery//Drug des. deliv. 1987. N2. Pp. 1-7.

4. Pimlott S., Addy M. A study into mucosal absorption of isosorbide dinitrate at different intraoral sites//Oral surg. Oral med. Oral pathol. 1985. N59. Pp. 145-148.

5. Kreuter J. Peroral administration of nanoparticles//Adv.Drug Del. Rev. 1991. V.7. N1. Pp. 71-86.

6. Speiser P.P. Nanoparticles and liposomes: a state of the art//Methods find. exp. clin. Pharmacol. 1991. V. 13. N5. Pp. 337-342.

7. Leuroux J.C., Allemann E., Dejaeghere F., Doelker E. Biodegradable nanoparticles from sustained release formulations to improve site specific drug delivery//J.control, release. 1996. V. 39. N2-3. Pp. 339-350.

8. Sjostrom В., Bergenstahl В. Preparation of submicron drug particles in lecithin-stabilized o/w emulsions. 1 .Model studies of the precipitation of cholesteryl acetate//lnter.J.Pharm. 1992. V.84. N2. Pp. 107-116.

9. Bohlinder К., Olsson В., Ragnarsson G., Singh S.K., Ohman G.S., Wadsten Т., Carlsson A., Herslof B. Use and characteristics of a novel lipid particle-forming matrix as a drug-carrier system//Europ. J. pharm.sei. 1994. V. 2. N4. Pp. 271-279.

10. Erlich P. Uber die Beziehungen von chemische Constitution, Verteilung und pharmakologisher Wirkung//New York.: Wiley. 1906. Pp. 567-595.

11. Goldmann E.E. Vitalfarbung am Zentralnervensystem//Abh. Preuss Akad. Wiss. Phys-Math. 1913. N1. Pp. 1-60.

12. Brightman M.W., Reese T.S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebral brainZZJ.cell biol. 1969. N40. Pp. 648-677.

13. Maher F., Vannucci S.J., Simpson I.A. Glucose transporter proteins in brain//FASEB J. 1994. V.8. N13. Pp. 1003-1011.

14. Van-Bree J.В., De-Boer A.G., Danhof M., Breimer D.D. Drug transport across the blood-brain barrier. III. Mechanisms and methods to improve drug delivery to the central nervous systemZZPharm. world sci. 1993. V.15. N1. Pp. 2-9.

15. Partridge W.M. Blood-brain barrier transport of glucose, free fatty acids and ketone bodiesZZAdv.exp.biol.med. 1991. V.291. Pp. 43-53.

16. Луцевич A.H., Бендер К.И., Купчиков В.В. Белки плазмы крови и транспорт лекарственных веществ через гемато-энцефалический барьер/УФармак. токсикол. 1991. Т.54. N1. Сс. 70-76.

17. Smith Q.R. The blood-brain barrier and the regulation of amino acids uptake and availability to brain//Adv. exp. med. biol. 1991. V.291. Pp. 55-71.

18. Begley D.J. Peptides and the blood-brain barrier: the status of our understandingZZAnn.NY Acad. sci. 1994. V.739. Pp. 89-100.

19. Banks W.A., Kastin A.J., Barrera C.M. Delivering peptides to the central nervous system: dilemmas and strategiesZZPharm. res. 1991. V.8. N11. Pp. 1345-1350.

20. Banks W.A., Kastin A.J. Peptide transport for opiates across the blood-brain barrierZZAm. J. physiol. 1990. V.259. N1. Pt.1. Pp. E1-10.

21. Plata-Salaman C.R. Insulin in the cerebrospinal fluidZZNeurosci. biobehav. rev. 1991. V.15. N2. Pp. 243-358.

22. Spector R. Drug transport in the central nervous system: role of carriersZZPharmacology. 1990. V.40. N1. Pp. 1-7.

23. Betz A.L. An overview of the multiple functions of the blood-brain barrierZZNIDA Res. monogr. 1992. V.120. Pp. 54-72.

24. Fenstermacher J.D. The blood-brain barrier is not a "barrier" for many drugsZZNIDA Res. monogr. 1992. V.120. Pp. 108-120.

25. Brust P. Blood-brain barrier transport under different physiological and pathophysiological circumstances including ischemiaZZExp. pathol. 1991. V. 42. N4. Pp. 213-219.

26. Greenwood J. Mechanisms of blood-brain barrier breakdown//Neuroradiology. 1991. V.33. N2. Pp. 95-100.

27. Joo F. Insight into the regulation by second messenger molecules of the permeability of the blood-brain barrier//Microsc. res. tech. 1994. V.27. N6. Pp. 507-515.

28. Pardridge W.M., Boado R.J., Black K.L., Cancilla P.A. Blood-brain barrier and new approaches to brain drug delivery//West. J. med. 1992. V.156. N3. Pp. 281-286.

29. Pardridge W.M. Recent development in peptide drug delivery to the brain//Pharmacol. Toxicol. 1992. V.71. N.1. Pp. 3-10.

30. Bodor N. Novel approaches for the design of membrane transport properties of drugs//Design of biopharmaceutical properties through prodrugs and analogs. Washington: D.C. 1976. Pp. 98-135.

31. Woodard P.A., Winwood D., Brewster M.E., Estes K.S., Bodor N. Improved delivery through biological membranes. XXI. Brain-targeted anticonvulsive agents//Drug design and del. 1990. N.6. Pp. 15-28.

32. Bodor N. Brain-specific drug delivery/ZScience. 1981. V.214. Pp. 13701372.

33. Bodor N. Brain-specific delivery// US Pat. 4,824,850 (CI 514-270, A61 K31/515). 1989.

34. Bodor N. Brain-specific dopaminergic activity involving dopamine conjugates of dihydropyridine carboxamides, dihydroquinoline and dihydroisoquinoline carboxamides// US Pat. 4,727,079 (CI 514-307. A 61 K31/44).1988.

35. Bodor N. Pharmaceutical formulations for parenteral use containing cyclodextrins and dihydropyridine redox systems//Eur.Pat. 335,545 (CI A61 K9/08).1989.

36. Szejtly N. Cyclodexrins and their inclusion complexes. Budapest: Acad. Kiado. 1982. Pp.234-240.

37. Кулаков B.H. Фармакокинетическое изучение конъюгатов декстрана с катехоламинами, обладающими гипотензивной активностью//Фармак. и токсикол. 1988. Т.51. N2. Сс.99-101.

38. Rozenkranz R.P. An historical perspective of dopamine and it's analogs//Proc. West. Pharmacol, soc. 1990. V.33. Pp.15-19.

39. Mc Geer, Searl K. Chemical specifity of dopamine transport in the nigroneostriatal projection/^. neurochem. 1975. V. 24. N2. Pp. 283-288.

40. Barbeau A. L-DOPA therapy in Parkinson's disease: a critical review of nine years experience//Can. med. ass.j. 1969. V.101. Pp. 791-800.

41. Cotzias G.C. Levodopa in the treatment of Parkinsonism//JAmer. med. ass. 1971. V. 218. N13. Pp. 1903-1908.

42. Сэндпер M. Биохимические основы болезни Паркинсона и лечение ее 1.-ДОФА//ЖВХО им.Менделеева Д.И. 1976. N2. Сс. 190-196.

43. Friis М., Paulson О. Blood-brain barrier permeability of L-DOPA in man//Eur. J. clin. invest. 1981. V.11. N3. Pp. 231-234.

44. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.Медицина. 1988. Т.1. С. 163.

45. Repta N. Rectally absorbable form of L-DOPA//US Pat. 4,663,349 (CI 514-535). 1987.

46. В odor N., Kenneth В., Sloan K. Improved delivery through biological membranes. 4. Prodrugs of L-DOPA//J.med.chem. 1977. V.20. N11. Pp. 1435-1445.

47. Agarval J., Nath C. Antiparkinsonian and anticonvulsant activity of some silyl substituted dopamine derivatives//Pharm. res. commun. 1981. V. 13. N10. Pp. 937-947.

48. Cooper D.R., Marrel C. L-DOPA methyl ester a candidate for chronic system delivery of L-DOPA in Parkinson's disease//Clin. neurophamacol. 1984. V.7. N1. Pp. 89-98.

49. Cooper D.R. L-DOPA esters as potential prodrugs: behavioral activity in experimental models of Parkinson's disease//J. Pharm. Pharmacol. 1987. V.39. N8. Pp. 627-635.

50. Ibrecht R. Dopamine derivatives//Ger.Offen. 3,430,310 (CI C07D231/54). 1986.

51. Sakami T.G. The investigation of amino acid reactions by methods of non-aqueous titrimetry//J.biol.chem. 1942. V.144. N1. Pp. 90-107.

52. Bretschneider H., Biemann K. Uber o-acylderivate einiger biogener oxyaminoverbindungen mit primären Aminogruppen. Monatshefte fur Chemie. 1950. B. 51. H.5. Pp. 57-65.

53. Holding Wh. ß-(3,4-Dialkyloxyphenyl)-a-alanine// Ger. Offen. 2,330,653 (CI C0763/100). 1972.

54. Winner Thr., Lannach K. Phenylalaninderivate//Ger. Offen. 2,263,814 (CI C07C103/52). 1972.

55. Watanabe T., Kono K., Tsukamoto G. p-(3,4-Diacyloxyphenyl)alanines//Jpn. Pat. 7,231, 949 (C116 i64). 1972.

56. Watanabe T„ Kono K., Tsukamoto G.// Jpn. Pat. 7,231,950 (CI 16C 64). 1971.

57. Porteiii M., Renzi G. ß-(3,4-Diacetoxyphenyl)-L-alanine//Ger.Offen 2,330,653 (CI C07C/A61 K). 1974.

58. Wimmer Th. a-ß-3,4-Bis(acyloxy)phenyl-L-alanine derivatives//Ger.Offen. 2,263,814 (CI C 07C, A 61 K). 1973.

59. Shih Ch. The chemistry of potential prodrugs of dopamine//Diss.abstr.lnt.B. 1980. V.41. N5. Pp. 1744-1745.

60. Ihara M., Nakajima S. Hydrolysis and acyl migration of a catechol monoester of L-DOPA//J.pharm, sei: 1990. V.79. N8. Pp. 703-708.

61. Bodor N., Sloan K. Novel DOPA/dopamine prodrugs// US Pat. 4,311,706 (CI 514-513). 1982.

62. Ihara M., Tsuchiya Y., Sawasaki Yo. A new potential prodrug to improve the duration of L-DOPA//J.pharm.sci. 1989. V. 78. N7. Pp. 525-529.

63. Hiemke Chr., Kauert G., Kalbhen D. Gas-liquid chromatographic properties of catecholamines, phenylethylamines and indolalkylamines as their propionyl derivatives//J.chrom. 1978. V.153. N2. Pp. 451-460.

64. Hoffman F. Verfahren zur Herstellung von Phenylalaninderivate// Swiss Pat. 562,202. 1975.

65. Sinda J.F. Investigation of some methylated products obtained by reaction of ß-3-4-dihydroxyphenylalanine with diazomethane in methanol-ether//J.org.chem. 1975. V.40. N24. Pp. 3611-3614.

66. Ginos J.Z., Catzias G.C. New dopaminergic and potential anti-parkinson compounds N, N -substituted-ß-(3,4-dihydroxyphenylethylamines//J. med. chem. 1978. V.21. N2. Pp. 160-165.

67. Bodor N. Novel transient prodrug forms of L-DOPA// US Pat. 3,998,799 (CI 260-112.5R, C 07C103/52). 1976.

68. Shashona V. Fatty acid-drug conjugate for delivery of the drug across the blood-brain barrier//W0 8907,938 (CI A61 K31/16). 1989.

69. Fuller W., Verlander M. DOPA-containing polypeptides. I. Improved synthesis of high-molecular weight-poly-(L-DOPA) and water soluble copolypeptides//Biopolymers. 1978. V.17. N12. Pp. 2939-2943.

70. Goodmann M., Verlander M. Polypeptides containing 3,4-dihydroxyphenylalaine/AJS Pat. 4,125,519 (CI 528-363, C08669/10). 1978.

71. Yanaihora N., Igarashi T., Kuni T. Dopamine derivatives//Ger.Offen. 2,637,600 (CI C07 C103/52). 1977.

72. Prokai L. Chemical delivery system to transport a pyroglutamyl peptide amide to the central nervous system//J.Am.chem.soc. 1994. V.116. Pp. 2643-2644.

73. Felix A., Winter D. Synthesis and antireserpine activity of L-DOPA//J.med.chem. 1974. V.17. N4. Pp. 422-426.

74. Losse G., Barth A. Natiz über die synthese von N-terminalen Peptiden des 3,4-Dihydroxyphenylalanine//J.praktisch. chem. 1963. V. 21. N.4. H.1-2. Pp. 32-35.

75. O'Neill J.J., Veitch F.P., Vagner-Jauregg T. The preparation of phthalyl glycyl DL-ß-(3,4-dihydroxyphenyl)alanine methyl ester//J.org.chem. 1956. V.21. N3. Pp. 13-16.

76. Weinhold P. Prodrugs of dopamine//EP 8,911,401.21 (CI C07 C237/22).1987.

77. Bodor N., Sloan K., Kaminski J.J., Shih Ch. A convenient synthesis of (acyloxy)alkyl a-ethers of phenols//J.org.chem. 1983. V.48. N26. Pp. 5280-5284.

78. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery: Progress and problems//Trends in Biotechnology. 1995. V. 13. N12. Pp. 527-537.

79. Oku N. Basic study and application of functional liposomes//J.Pharm. soc.Japan. 1995. V. 115. N7. Pp. 483-498.

80. Липосомы в медицине. Серия статей из Вестника АМН СССР. 1990.1. N6.

81. Ceve G., Blume G., Zellmer S. Rational liposome design and application optimization based on the simultaneous consideration of the lipid and drug propertiesZ/Liposome in drug delivery 21 years on/Ed. Gregoriadis G. et al. 1990.

82. Yagi K., Naoi M., Sakai H., Abe H., Konishi H., Arichi Sh. Incorporation of ensyme into the brain by means of liposomes of novel composition//J. appl. biochem. 1982. N4. Pp. 121-125.

83. Micklus M.J., Greig N.H., Tung J., RapoportS.I. Organ distribution of liposomal formulations following intracarotid infusion in rats//Bioch. biophis. acta. 1992. V.1124. N.1. Pp. 7-12.

84. Umezawa F., Eto Y. Liposome targeting to mouse brain: mannose as a recognition marker//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 153. Pp. 1038-1044.

85. Gomes I., Sharma S.K. Effect of hyperosmolar mannitol on the delivery of high molecular weight substances entrapped in liposomes to the brain and cultured C6 glioma cells//J. Clin. Biochem. Nutrit. 1995. V.18. N3. Pp. 133-144.

86. Sakamoto A., Ido T. Liposome targeting to rat brain effect of osmotic opening of the blood brain barrier/ZBrain Res. 1993. V. 629. N1. Pp. 171-175.

87. Gennuso R., Spigelman M.K., Chinol M., Zappulla RA Effect of BBB and blood-tumor barrier modification on central nervous system liposomal uptake//Cancer invest. 1993. V.11. N2. Pp. 118-128.

88. Weinstein J.N., Magin R.L., Cysyk R., Treatment of solid L1210 murine tumors with local hypertermia and temperature-sensitive liposomes containing methotrexate//Cancer Res. 1980. V. 40. Pp. 1388-1395.

89. Lin J.C., Lin M.F. Microwave hypertermia-induced BBB alterations//Radiat. Res. 1982. V. 89. Pp. 77-87.

90. Iga K., Hamaguchi N. Enhanced antitumor activity in mice after administration of thermosensitive liposomes encapsulating cisplatin with hyperthermia//J.Pharmacol.Exp. Ther. 1991. N257. Pp. 1203-1207.

91. Kakimuna K., Tanaka R., Takahashi H., Watanabe M., Nakagawa T., Kuroki M. Targeting chemotherapy for malignant brain timor using thermosensitive liposomes and localized hypertermia//J.neurosurg. 1996. V.84. Pp.180-184.

92. Huwyler J., Wu D.F., Pardridge W.M. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes//Proc.Nat.Acad.sci. USA. 1996. V. 93. N24. Pp. 14164-14169.

93. Wang J.V., Xu Y.R., Huang K., Sun L.Y. Proliposome targeting to rabbit brain tissue//J.Pharm.Pharmacol. 1995. V. 47. N12A. Pp. 1053-1054.

94. Mehta S.C., Lu D.R. Targeted drug delivery for boron neutron therapy//Pharm.res. 1996. V. 13. N3. Pp. 344-351.

95. Wang J.-Y., Xu Yu-Ru, Huang K., Sun L.-U. Proliposome targeting to rabbit brain tissue//J. pharm. Pharmacol. 1995. V.47. Pp. 1053-1054.

96. Kobayashi K., Han M., Watarai Sh., Yasuda T. Availavility of liposomes as drug carriers to the brain//Acta med. Okayama. 1996. V.50. N2. Pp. 67-72.

97. LeWitt PA. The pharmacology of Levodopa in treatment of Parkinson's disease. An uptake//Handbook of experimental pharmacology/Ed.Calne D.B. 1989. V.88. Pp. 325-384.

98. Lloyd K.G., Daidson L., Hornykiewicz O. The neurochemisfry of Parkinson's disease: effect of L-DOPA therapy//J. pharmac. exp. ther. 1975. N195. Pp. 453-464.

99. Miranda M., Amicarelli F., Volpe A.R., Poma A., Masciocco L., Carmignani M. Specific increase of L-DOPA levels in plasma upon infusion of tyrosinase containing liposomes//Gen. pharmca. 1993. V.24. N6. Pp.1319-1322.

100. Miranda M., Amikarelli F., Poma A., Ragnelli A.M., Arcadi A. Liposomes as a tool for enzyme therapy: models of employment in catecholamine related disorders//Chim. oggl. 1989. N7. Pp. 9-12.

101. Cederbaun J.M., Breck L., Kutt H., McDowell F.H. Contolled-release levodopa/carbidopa. 1. Sinemet CR3 treatment of response fluctuations in Parkinson's disease//Neuroloy. 1987. V.37. Pp. 233-241.

102. During M.J., Freese A., Sabel B.A. et al. Controlled release of dopamine from a polymeric brain implant: in vivo characterization//Ann. neurol. 1989. V.25. Pp. 351-356.

103. Freese A., Sabel BA, Saltzman W.M., et al. Controlled release of dopamine from a polymeric brain implant: in vitro characterization//Exp. neurol. 1989. V.103. Pp. 234-238.

104. McRae-Degueurce A., Hjorth S., Dillon D.L., et. al. Implantable microencapsulated dopamine (DA): A new method for slow-release DA delivery into brain tissue//Neurosci. lett. 1988. N92. Pp. 303-309.

105. Puglisi G., Fresta M., C. La Rosa, Ventura C.A., Panico A.M., Mazzone G. Liposomes as a potential drug carrier for citicoline (CDP-choline) and the effect of formulation conditions on encapsulation efficiency/VPharmazie. 1992. V. 47. H.3. Pp. 211-215.

106. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука. 1986. С. 45.

107. Досон Р., Элиотт Д., Элиотт У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. С. 23.

108. Kirby Ch., Clarke J., Gregoriadis G. Effect of the cholesterol content of small unilamellar liposomes on their stability in vivo and in vitro//Biochem. J. 1980. V.186. N2. Pp. 591-598.

109. Gregoriadis G. Liposomes in therapeutic and preventive medicine: The development of the drug-carrier consept//Ann. N.Y. Acad. sci. 1978. V.308. Pp. 343-370.

110. Palmeira C.M., Oliveira C.R. Partitioning and membrane disordering effects of dopamine antagonists: influence of lipid peroxidation, temperature and drug concentration/Archives biochem. biophys. 1992. V.295. N1. Pp. 161-171.

111. Custodio J.B.A., Almeida L.M., Madeira V.M.C. A reliable and rapid procedure to estimate drug partitioning in biomembranes//Biochem. biophys. res. comm. 1991. V.176. N3. Pp. 1079-1085.

112. Connors К A. Textbook of Pharmaceutical analysis//John Wiley and Sons, Inc. 1967. Pp. 277-294.

113. Руднев Д.Н. Исследование некоторых механизмов действия КА, стероидов и их сочетания на биомембраны. М.: Дисс. на звание канд. мед. наук. 1978. Сс. 118-121.

114. Drechsler М., Banchmann D., Brandl М.//Abstracts of Fourth Liposome Reseach flays Conference (Freiburg, Germany). 1995. P.80.

115. Lasic D.D., Ceh В., Stuart M.C.A., Guo L., Frederik P.M., Barenholz Y. Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: Lessons for drug delivery//Biochim.biophys. acta-biomemb. 1995. V.1239. N2. Pp. 145-156.

116. Sotomatsu A., Nakano M., Hirai Sh. Phospholipid peroxidation induced by the catechol-Fe 3+ (Cu 2+ ) complex: a possible mechanism of nigrostriatal cell damage/ZArch. biochem.biophys. 1990. V.283. N2. Pp. 334-341.

117. Гуляева H.B., Лузина Н.Л., Левшина И.П., Крыжановский Г.Н. Стадия ингибирования ПОЛ при стрессе//Бюл. эксперим. биол.мед. 1988. N12. Сс. 660-663.

118. Сергеев Т.В., Сейфулла Р.Д., Дунаев В.Г., Руднев Ю.К.Эффект радиозащитных биогенных аминов на перекисное окисление липидов//Бюл. экспер. биол. мед. 1976. Т.81. N2. Сс. 169-171.

119. Кучеряну В.Г., Атаджанов М.А., Никушкин Е.В., Загоревский В.А., Шаркова Л.М. Перекисное окисление липидов в хвостатых ядрах при экспериментальном паркинсоническом синдроме//Бюлл.эксперим.биол.мед. 1989. N1. Сс.39-41.

120. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.:Наука. 1972. Сс.136-140.

121. Кулинский В.И. Механизм действия катехоламинов на окислительно-восстановительные процессы/ЛГезисы конференции "Механизм действия гормонов", Ташкент. 1976. Сс. 56-62.

122. Pelizzetti E., Mentasti Ed., Pramauro Ed. Kinetics and mechanism of oxidation pathways of some catecholamines with periodic acid//J.chem. soc. Perkin. Trans. II. 1976. N14. Pp/ 1651-1655.

123. Fukuzawa K., Seko Т., Minami K., Terao J. Dynamics of iron-ascorbate-induced lipid peroxidation in charged and uncharged phospholipid vesicles//Lipids. 1993. V.28. N6. Pp. 497-503.

124. Tse D.C.S., McCreery R.L., Adams R.N. Potential oxidative pathways of brain catecholamines//J.med.chem. 1976. V.19. N1. Pp. 37-40.

125. Maiorino M., Zamburlini A., Roveri A., Ursini F. Copper-induced lipid peroxidation in liposomes, micelles, and LDL: which is the role of vitamin E?//Free radical biol.med. 1995. V.18. N1. Pp. 67-74.

126. Trautner E.M., Messer M. Inhibition of adrenaline oxidation by borate//Nature. 1952. V.169. Pp. 31-32.

127. Antikainen P.J., Terauen K. Chelation of adrenaline with boric acid in aqueous solutions//Suom.Kem. 1966. V.39. N12. Pp. 285-288.

128. Soloway A.H. Stability and synthesis of phenylboronic acids//J.Amer.chem.soc. 1959. V.81. Pp. 3017-3019.

129. Soloway A.H. Penetration of brain and brain tumor by aromatic aompounds as a function bo molecular sustituents//J.pharmacol.exptl.therap.1960. V.129. Pp. 310-314.

130. Soloway A.H. Evaluation of boron compounds for use in neutron-capture therapy of brain tumors. I. Animal investigations//J.Pharmacol.exptl.therap.1961. V.134. Pp. 117-122.

131. Soloway A.H. Penetration of brain and brain tumor by aromatic aompounds as a function fo molecular sustituents//J.med.pharm, ehem. 1962. N5. Pp. 191-196.

132. Yoshino K., Okamoto M., Kakihana H., Yoshihiro M. Chemical assay of boron and its distribution in melanoma-bearing subjects//Neutron capture therapy. Proc. 2nd Int.Symp. 1986. Pp. 291-302.

133. Yoshino K., Takahashi H., Toriis S., Kakihana H. Complex formation of p-borophenylalanine with L-DOPA (a precursor of melanine metabolism) and oxidation reaction of the analogs/ZKyoto Daigaku Genshiro Jikkensho. 1993. KURRI-TR-382. Pp. 33-38.

134. Baraldi E., Cavani L., Seghedoni S., Chiossi KTX., Roli L., Scacchetti A.T., Baraghini KTX.F. Assay of urinary free Ktx: routine use in a clinical chemistry laboratory//Chromatographia. 1987. V. 24. Pp. 407-410.

135. Andrew R., Watson D. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of Parkinsonian patients and normal controls//Neurochem. res. 1993. V.18. N11. Pp. 1175-1177.

136. Betto P.KTX. HPLC monitoring of plasma catechol levels in the characterization of Parkinson's disease//!tal.chim.clin. 1992. V.17. N6. Pp.441-453.

137. Imai Y., I to S., Maruta K., Fujita K. Simultaneous determination of CA and serotonin by liquid-chromatography after treatment with boric-acid gel//Clin.chem. 1988. V.34. iss.3. Pp.528-530

138. Tanaka S., Kaneta T., Yoshida H. Isotachoforetic separation and behavior of catechol derivatives//J. Chrom. 1990. V.498. N1. Pp. 205-211.

139. Tanaka S., Kaneta T., Yoshida H. Capillary isotachophoretic separation of catechol and its derivatives using the reaction with terminating ion//Anal. Sei. 1989. V. 5. N2. Pp. 217-218.

140. Schafer H. Uber die Gleichgewichte zwischen Borationen, Brenzkatechin und Brenzkatechin-borationen in wassriger Losung und über die Darstellung von Monobrenzkatechinboraten/ZZ.fur anorg.allg.chem. 1942. Bd. 250. H.2. Pp. 127-143.

141. Schafer H. Borsaure Komplexverbindungen//Allg.chem. A. 1948. N1. Pp. 73-76.

142. Schafer H. Borsaure und Oxyverbindungen. IY. Neue Salze der Dibrenzkatechinborsaure//Z. fur Anorg. Chem. 1949. V.259. Pp. 86-91.

143. Камянов И.М., Полис Я.Ю., Купнек А.Г. Мидантан и его применение в терапии и профилактике//М.Медицина. 1987. Сс. 3-10.

144. Gorin PAJ., Mazurek М. 13С magnetic resonance spectroscopic evidence for formation of borate complexes of polyhydroxy compounds // Carbohydrate Res. 1973. N 27. Pp. 325-329.

145. Kennedy G.R., How M.J. The interaction of sugars with borate: an N.M.R. spectroscopic study// Carbohydrate Res. 1973. N28. Pp. 13-19.

146. Жунке А. Ядерный магнитный резонанс в органической химии. М.: Мир. 1974. С. 44.

147. Heller G., Seeger К. Mixed esters of boric acid with aminoalcohols and dilols Hl.Naturforsch. В: Chem.Sci. 1988. V.43. N5. Pp. 547-556.

148. Robert K.M., Nachtrieb N.H., Nuclear magnetic resonance study of borate-polyborate equilubrium in aqueous solution//!norg.chem. 1967. V.6. N6. Pp. 1189-1192.

149. Yoshino K., Kotaka M., Okamoto M., Kakihana H. 11 B-NMR study of the complex formation of borate with catechol and L-DOPA//Bull.chem.soc.Jap. 1979. V.52. N10. Pp. 3005-3009.

150. Mohr S., Heller G., Timper U., Woller K-H. Neue Untersuchungen an borsaureestern von Brenzcatechin und einiger Catecholamine in wassriger Losung und an Feststoffen // Z. fur Naturforschung. В: Chem. Sei. 1990. V. 45 N3. Pp.308-322.

151. Carter J.E. Johnson J.H., Baaske D.M. Dopamine hydrochloride//Anal.profile of drug substances. 1982. V.11. Pp.34-47.

152. Gomez R., Hagel R.B. Levodopa/ZAnal. profile of drug substances. 1976. V.5. Pp. 131-145.

153. Pistorins C.W.F. IR and Raman potential function of boric acid // J.Chem. Phys, 1959. V.31. N6. Pp. 127-135.

154. Желиговская H.H., Черняев И.И. Химия комплексных соединений. М: Высшая школа. 1966. Сс. 356-363.

155. Foil A., Wilkins M., Wilkins Ch. H. Infraread spectra and charecteristic frequencies of inorganic ions//Anal. Chem. 1952. V.24. N8. P. 1253.

156. Алекперов Э.Р., Резник A.M. Комплексообразование бора с азот и кислородосодержащими лигандами//Журнал координ. химии. 1993. N1. Сс. 5-14.

157. Rajan K.S., Skripkus A., Marks G.E., Davis J.M. Coordination of biogenic amines with synaptosomal and vesicular metal ions: equilibrium and spectral studies in model systems// Bioinorg. chem. 1976. N6. Pp. 93-117.

158. Sundqvist B.U.R. // Biological mass spectrometry. Eds. A.L.Burlingame. JAMcCloskey. Amsterdam: Elsevier. 1990. P. 37.

159. Antikainen P.J., Witikainen U. The oxyanion chelates of o-diphenols. Part III. The chelation of boric acid with dopamine//Finn. Chem. Lett. 1974. N4. Pp. 156-158.

160. Albert A. Quantitative studies of the avidity of naturally occuring substances for trace metals//Biochem.J. 1950. V. 47. N4. Pp. 531-537.

161. Antikainen P.J., Witikainen U. A comparative study on the ionization of catechol amines in aqueous solutions//Acta Chem. Scand. 1973. V. 27. N6. Pp.2075-2082.

162. Yasunobu K.T., Norris E.R. Mechanism of borate inhibition of diphenol oxidation by tyrosinase//^ of biol. chem. 1957. V. 227. N1. Pp. 473-482.

163. Yoshino K., Kakihana H., Okamoto M., Yoshihiro M. Chemical behavior of dopaborate and 10B-p-borophenylalanine//Proc. 2nd Int. Symp. on Neutron capture therapy. 1985. Pp. 55-60.

164. Pizer R., Babcock L. Mechanism of the complexation of boron acids with catechol and substituted catechols//lnorg. chem. 1977. V. 16. N7. Pp. 52-56.

165. Васильева М.Г., Лапыкина B.M., Махарашвили H.A., Соколова А.Л., Сойфер В.М., Цкирия Н.Г.//Анализ бора и его неорганических соединений. М.Агомиздат. 1965. С. 5.

166. Краткий справочник физико-химических величин. Под ред. А.А. Равделя и А.М.Пономаревой. Л.Химия. 1983. С.123.

167. Pettit L.D. Critical evaluation of equilibrium constants in solution. Part A. Stability constants of metal complexes//Pure and appl. chem. 1984. V. 56. N2. Pp. 247-292.

168. Rajan K.S., Davis J.M. Interactions of iron with biogenic amines and ATP//J. inorg. nucl. chem. 1976. V.38. Pp. 897-905.

169. Rajan K.S., Mainer S. Formation and stabilities of the ternary metal chelates of L-3,4-dihydroxyphenyl alanine (l-DOPA) with a number of secondary ligands//J. inorg. nucl. chem. 1978. V. 40. Pp. 2089-3099.

170. Rajan K.S., Mainer S. Studies on chelation of L-DOPA with metal ions and metal ATP systems//Bioinorg. chem. 1978. V.9. Pp. 187-203.

171. Rajan K.S., Skipkus A., Marks G.E., Davis J.M. Coordination of biogenic amines with synaptosomal and vesicular metal ions: equilibrium and spectral studies in model systems/ZBioinorg. chem. 1976. N6. Pp. 93-117.