Производные нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные звенья 2'-О-алкильного типа: 2'-аминокислотные и 2'-альдегидные олигонуклеотиды тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский государственный университет

имени м.в. Ломоносова

химический факультет

Казанова Евгения Викторовна

604614261

производные нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные звенья 2'-0-алкильного типа: 2'-аминокислотные и 2'-альдегидные олигонуклеотиды

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 5 НОЯ 7010

москва -2010

004614261

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химическог факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Орецкая Татьяна Семеновна

кандидат химических наук Зубин Евгений Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Коршунова Галина Анатольевна

доктор биологических наук Шумянцева Виктория Васильевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 30 ноября в 16.00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 29 октября 2010 года.

Учёный секретарь ^

Диссертационного совета, ^г

кандидат химических наук, / я у

доцент ^ 7) // Смирнова И.Г.

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Модифицированные производные нуклеиновых кислот (НК) широко используются в молекулярной биологии и медицине, так как обладают уникальными свойствами, в том числе, способностью блокировать экспрессию генов, избирательно связываясь с комплементарными последовательностями ДНК, РНК и белками.

Одним из направлений в химии нуклеиновых кислот является разработка методов синтеза НК-производных, содержащих модифицированные звенья 2'-0-алкилыюго типа (рис. 1) |РоНппауа, N. е1 а1., 2009]. Такие олигонуклеотиды могут быть успешно использованы в структурно-функциональных исследованиях, направленных на изучение различных биохимических процессов. Введение в олигонуклеотидную цепь остатков 2'-0-алкилнуклеозидов представляется удобным, так как в этом случае вероятное искажение структуры двутяжевых НК-фрагментов будет относительно незначительным. Кроме того, в случае модификации при С2'-атоме существует возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигонуклеотида.

б Ь—\ б о—\ б о—V

®0-р=0 >~он ®0-р=0 >~л э0-р=0 ун

¿ 0 л но он i о

\ ис \ и11 \ и»

V.?)

,0

0 О и и

б Ь—V О о—\ _ б о—\

^я ео-Р=о У^Р» о-р=о и»

Рис. 1. 2'-Модифицированные олигонуклеотиды.

В рамках изложенного выше подхода ранее были разработаны эффективные методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих в своем составе нуклеотиды с карбоксильной (ис), 1,2-диольной (и11, и11"0) и альдегидной группами (и0, иаар) (рис. 1). В качестве синтонов в процессе получения таких модифицированных соединений были выбраны 2'-0-аллил и 2'-0-карбоксиметилуридин. Успешное использование данного синтетического метода позволяет продолжить изучение способов синтеза и свойств новых производных 2'-0-алкильного типа, что является актуальной задачей химии нуклеиновых кислот.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-0-алкильных производных нуклеиновых кислот двух типов: 2'-аминокислотных и 2'-альдегидных олигонуклеотидов. Отдельной частью работы было изучение физико-химических свойств олигонуклеотидов и характера их взаимодействия с различными биомолекулами.

Основными этапами работы были получение модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в автоматическом синтезе олигонуклеотидов по амидофосфитной схеме и подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь. Оценка перспектив использования 2'-аминокислотных олигонуклеотидов в качестве искусственных рибонуклеаз и изучение характера взаимодействия 2'-альдегидных производных ДНК с фактором транскрипции NF-кВ также являлись важными задачами настоящей работы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В представленной работе предложен новый эффективный метод синтеза ранее неописанных 2'-аминокислотных производных олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов, содержащих остатки амидов фенилаланина, гистидина и лизина. Показано, что такие олигонуклеотиды обладают способностью расщеплять модельные РНК-субстраты в выбранных условиях.

В настоящей работе впервые изучено взаимодействие 2'-диоксоазапентильных производных ДНК с фактором транскрипции NF-кВ. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидсодержащих олигонуклеотидов нового типа и 2'-оксоэтильных производных, описанных ранее. Особое внимание уделено изучению специфичности комплексообразования и ковалентного связывания модифицированных олигонуклеотидов с фактором транскрипции. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в условиях конкурентного ингибирования, показывают, что реакция 2'-альдегидсодержащих дуплексов с ДНК-узнающими белками носит неспецифический характер.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых типов биологически активных производных нуклеиновых кислот, селективно расщепляющих РНК-мишени в клетке. Изучение свойств 2'-альдегидных олигонуклеотидов способствует дальнейшему развитию методов конъюгации биомолекул с различными соединениями. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 1 обзор в российских периодических изданиях. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференция молодых учёных по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2006», Москва, Россия, Международная конференция "Физико-химическая биология", 30.07. - 03.08.2006, Новосибирск, Россия, Spring-Meeting "Protein-nucleic acid interactions", March 2008, Rauischholzhausen, Germany, IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05. - 15.05.2008, Новосибирск, Россия.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного ингибированию различных стадий сигнального каскада фактора транскрипции NF-кВ с помощью низкомолекулярных соединений и фрагментов нуклеиновых кислот, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (286 ссылок), содержит 25 рисунков, 15 схем, 3 таблицы.

Содержание работы.

1. Производные нуклеиновых кислот, содержащие аминокислотные остатки в 2'-положении углеводного фрагмента

Синтетические олигонуклеотиды и их аналоги используются в антисенсовой биотехнологии для лечения вирусных и наследственных заболеваний, так как обладают способностью избирательно блокировать экспрессию генов. Однако применение фрагментов нуклеиновых кислот ограничено в силу низкой эффективности проникновения через биомембраны и относительно быстрой деградации внутри клетки. Для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотидов, таких как способность проникать в клетку и стабильность к действию ферментов нуклеинового обмена используют различные подходы, одним из которых является получение конъюгатов с молекулами пептидов. В данном случае пептидный фрагмент может способствовать проникновению НК-фрагмента через клеточную мембрану и его локализации в определенном компартменте клетки. Наряду с этим присоединение остатков аминокислот к олигонуклеотидам также может способствовать увеличению эффективности их проникновения в клетку и стабильности по отношению к ферментам нуклеинового обмена. Кроме того, было показано, что олигонуклеотиды, содержащие остатки основных и гидрофобных аминокислот, способны расщеплять РНК-субстраты. Такие искусственные рибонуклеазы могут найти применение как в молекулярной биологии для исследования структуры РНК, так и в медицине для антивирусной терапии, поскольку генетический материал многих вирусов представлен молекулами РНК. Таким образом, разработка новых методов синтеза аминокислотных олигонуклеотидов является актуальной задачей химии нуклеиновых кислот, так как позволяет получать производные НК, обладающие рядом дополнительных свойств, таких как рибонуклеазная активность или способность проникать через клеточную мембрану.

1.1. Синтез З'-амидофосфитов уридин-2'-аминокислот

Синтез З'-амидофосфитов 2'-аминокислотных производных уридина 10а-с представлен на схеме 1. 3',5'-0-(Тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридин 2 был получен из уридина 1 под действием реагента Маркевича - 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана (Т1РБ5С12). Защита положения 3 уридина пивалоилоксиметильной группой (РОМ) делает возможным избирательное алкилироваиие 2'-гидроксила остатка рибозы в 3',5'-защищенном нуклеозиде. Методика введения пивалоилоксиметильной группы предполагает промежуточное блокирование 2'-гидроксильной группы триметилсилильной защитой, которая затем удаляется моногидратом и-толуолсульфокислоты. Нами для получения 3-пивалоилоксиметильного производного был применен метод межфазного катализа. В этих условиях промежуточное блокирование 2'-гидроксильной группы не требуется. Таким образом, с выходом 70% был получен З-пивалоилоксиметил-З',5' -0-( 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-уридинЗ. Следующей стадией явилось получение 3,3',5'-защищенного 2'-0-(2-бензилокси-2-оксоэтил)уридина 4. Ранее нами была успешно использована методика 2'-0-алкилирования в присутствии сильного органического основания - 2-трет-бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диазафосфорина (ВЕМР). В данной работе вместо более дорогостоящего ВЕМР использовали обладающий аналогичными свойствами /иреш-бутилимино-/ир«с(пирролидино)фосфоран (ВТРР). Таким

образом, алкилирование соединения 3 бензилбромацетатом в присутствии ВТРР проходило селективно по 2'-гидроксилу с выходом продукта реакции 91%. Далее бензиловый эфир 4 был восстановлен до спирта 5. Реакцию проводили с использованием боргидрида натрия при кипячении в смеси растворителей ТГФ-метанол (5:1 об.) в течение 3 ч. Выход соединения 5 составил 70%. Следует отметить, что в процессе восстановления также происходит удаление пивалоилоксиметильной защиты. В результате реакции спирта 5 с Л^'-дисукцинимидилкарбонатом в присутствии триэтиламина в хлористом метилене был получен активированный карбонат 6 с практически количественным выходом. Нами было показано, что данное производное нестабильно в условиях колоночной хроматографии на силикагеле, поэтому его вводили в реакцию с аллиловым эфиром L-фенилаланина и метиловыми эфирами //'"-тритил-Ь-гистидина и ЛГ-Ртос-Ь-лизина без хроматографического выделения. Производное фенилаланина было выбрано в качестве модельного для отработки условий проведения реакции. Выходы соединений 7а-с составили 89%, 81% и 90%. Аминокислотные производные уридина 7а-с далее обрабатывали тригидрофторидом триэтиламина в ТГФ для удаления защиты Маркевича, в результате чего с высокими выходами были получены соединения 8а-с. Блокирование 5'-гидроксильной группы нуклеозида осуществляли с использованием диметокситритильной защитной группы (DMTr). После хроматографического выделения на колонке с силикагелем получали аминокислотные производные 5'-0-защищенных нуклеозидов 9а-с с выходом 85-90%. Далее соединения 9а-с фосфитилировали с использованием 6uc(N,N-диизопропиламино)-2-цианзтоксифосфина и тетразолида диизопропиламмония. В результате были получены З'-амидофосфиты уридина 10а-с, содержащие остатки фенилаланина, гистидина и лизина. Строение всех соединений подтверждали данными ЯМР 'Н, |3С и 3|Р (для амидофосфитов), времяпролетной масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбционной ионизацией (MALDI-TOF) и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI).

1.2. Синтез модифицированных олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов. содержащих 2'-аминокислотные производные уридина

З'-Амидофосфиты 2'-модифицированных нуклеозидов использовали в автоматическом твердофазном синтезе без хроматографической очистки после тщательного высушивания в вакууме. Для получения олигонуклеотидов использовали 0.2-0.5М растворы модифицированных амидофосфитов в абсолютном ацетонитриле и синтетический цикл, в котором время присоединения модифицированного звена к растущей цепи увеличивали до 30-60 мин. В этих условиях степень превращения на стадии конденсации, определенная по оптическому поглощению диметокситритил-катиона, составляла приблизительно 95-97%. После завершения твердофазного синтеза полученные НК-фрагменты обрабатывали концентрированным водным раствором аммиака в течение 12-18 ч при 55°С. При этом происходило отщепление олигонуклеотидов от полимерного носителя и удаление защитных групп. Деблокирование имидазольного кольца гистидина осуществляли под действием 80%-ной уксусной кислоты в течение нескольких дней при комнатной температуре.

Схема 1

О Н1Ч'

3 \ / —_А ° РотС1, ТВАНЭ^ Д Р'уОу О „ Д р-лЯо^ №ВН4>

;—' С6н5м ^Уд ]—( ад. Ма2С03, СН2С12>Г ± }—( ВТРР, ТНР, N—( МеОН-ТНР

I ^1-6 'ОН 1^-6 'ОН | О ^ ъ

V)- ¿-V

I / 4 О —РИ

НО 'ОН

;зги ип ^ :5Ги ип ' О-

шч

„А

Л сго°а°Г> нА А А

^ Г 0 0 А I .Л-' -о : . .Л^ ........ ^¿Ьг

X Р^Ч1 °_1 Л —Л Р^Ч" Е'зМ,НР)з но^о г

V-/ СН2С12,В3М "Ул МеСМ,И3М -у? У-( ТНР Н, С6Н5М

Ъ-х 14,-6 о-л I -о-л НО О^

а 4 ОН 4 О 4 о

5

о-О

сГ м:

7 а-с \ он 8а< V ОВ

О 2

«л лл^- «Л

Э-^оУ^ ^_^ ОМТгО-Д^О^'

\_/ тетразолид \_/

I б о^

^^ диизопропиламмония, СН2С12 ^ 0.

э Р = -СН2СН=СНг, ^ = -СеНд

С(С6Н5)з

сГТ-Г X. к Тч ь в=-СНз' ^-^п

< ОР ¿м ч он

10а.с В' с Р = -СН3, Р, = (СН2)3МНРшос

Полученные реакционные смеси анализировали с помощью ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ. Строение всех полученных олигонуклеотидов подтверждали данными масс-спектрометрии MALDI-TOF (табл. 1). Целевые олиго-2'-0-метилрибонуклеотиды выделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием гидрофобных свойств 5'-концевой диметокситритильной группы, после чего обрабатывали 80%-ной уксусной кислотой в течение нескольких дней при комнатной температуре и анализировали методом ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ. Последовательности и свойства синтезированных олигонуклеотидов, содержащих один или несколько аминокислотных остатков, суммированы в таблице 1. Олигонуклеотиды vii-xii представляют собой фрагмент каталитического участка рибозима типа головка молотка (hammerhead).

Таблица 1. Свойства модифицированных олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов.а

Олигонуклеотидная maldi-tof ms, Время удерживания,

последовательность (5'—>3') вычнсл ./найден. мин'

i cucccaggculheca 4117.82/4117.85 17.3

ii guccuu^acucc 3736.72/3735.13 15.9

[ii cucccaggcu""ca 4109.79/4109.32 16.6

[v guccuuh,sacucc 3726.71/3726.12 15.8

v cucccaggcul,scaaau 5105.03/5104.02 14.4

vi guccuulysacucc 3719.54/3718.97 14.0

vii u"lsuuly'uu"'sacuccguccg 5457.08/5456.99 13.5

viii u'isuu'"suu",sacuccguccg 5457.08/5457.48 13.5

ix ull,suu1,suul,sacuccguccg 5448.12/5448.49 15.0

x uh,suu"'swly5acuccgucc 5098.02/5098.03 15.8

xi u"'suuh|suuh,sacuccguccg 5466.04/5466.09 17.7

xii u1>suu'"!uul>sacuccguccg 5448.12/5448.00 14.5

°U - амид А/а-{2-[уридин-2'-0-ил]этокси)карбонил-Ь-фенилаланина, U - амид №-{2-[уридин-2'-0-ил]этокси)карбонил-Ь-гистидина, ULys - амид /V"-{2-[ypHflHH-2'-0-ил]этокси)карбонил-Ь-лизина.ь Обращенно-фазовая ВЭЖХ в ион-парном варианте.

1.3. Изучение свойств олигонуклеотидов. содержащих 2'-аминокислотные производные уридина. как инструментов для направленного расщепления РНК

На следующем этапе работы были изучены свойства 2'-аминокислотных олигонуклеотидов как инструментов для направленного расщепления РНК. При выборе последовательностей модифицированных олигонуклеотидов vii-xii мы руководствовались следующими соображениями. Основную роль в активном центре рибонуклеазы А, фермента, способного с высокой скоростью расщеплять РНК, выполняют остатки Hisl2, Hisl 19 и Lys41 [Raines, R., Active Site of Ribonuclease A, 2004]. Остатки гистидина осуществляют основной (Hisl2) и кислотный (Hisl 19) катализ, а остаток лизина стабилизирует структуру переходного состояния. Рибонуклеаза А не обладает избирательностью и гидролизует все межнуклеотидные связи, образуемые З'-гидроксилом пиримидинового нуклеотида. Селективное расщепление межнуклеотидных связей происходит при взаимодействии РНК с рибозимом, недостатком которого является низкая скорость протекания каталитической реакции.

В связи с этим в данной работе для создания искусственной рибонуклеазы, сочетающей основные достоинства РНКазы А и рибозима, предлагается модифицировать рибозим типа Hammerhead («головка молотка») следующим образом: оставить только один 10-звенный З'-концевой участок, отвечающий за гибридизацию, а основную часть центрального фрагмента удалить, заменив ее модифицированными остатками уридина, содержащими гистидин или лизин (рис. 2).

РНК-субстрат

место расщепления^

cg9^9<3g^guc—ac ag з'-g ccugccuca uguc-5'

а ч \

участок ^ Да

связывания

g а°" C-G

g-c

U U

U U

s'-tj <} 9 ^ 9 9 9 f 9 и с- а с a g

з'-g ccugccuca

^хихих

где X - уридин, содержащий в 2'-лоложении остатки лизина или гистидина

Рис. 2. Структура искусственной рибонуклеазы, предложенная в работе.

Для исследования рибонуклеазной активности олигонуклеотиды инкубировали в физиологических условиях (рН - 7.0, 37°С) в присутствии 32Р-меченых РНК-субстратов:

51 5'- CUA GGA CGG AGU САС AGA А

52 5'- CUA GGA CGG AGU САС АСА GAA

53 5'- GGA CGG AGU САА CAG

54 5'- GGA CGG AGU CAU САС AG

55 5'- GGA CGG AGU UCA АСА G

56 5'- GGA CGG AGU CAU АСА G

РНК-последовательности были модельными и содержали сайт расщепления

рибозима типа Hammerhead 5'-СА (выделен цветом), расположенной вблизи каталитически активной группы после образования дуплекса. Реакционные смеси содержали РНК-субстрат и тестируемый олигонуклеотид в соотношении концентраций 1:1. Смеси анализировали методом электрофореза в 15%-ном ПААГе. В качестве контроля использовали аналогичные реакционные смеси без добавления модифицированного олигонуклеотида.

В условиях, приведенных выше, расщепления субстратов не наблюдалось. Поскольку в большинстве аналогичных работ искусственная рибонуклеаза вводится в реакционную смесь в большем избытке по отношению к РНК-субстрату, было принято решение увеличить избыток олигонуклеотида до 50-кратного. Реакции проводились в присутствии имидазольного буфера с субстратами SI, S4 и S6 в течение 48 ч. При пятидесятикратном избытке олигонуклеотидов VII-XII наблюдалось расщепление РНК-субстратов. Следует отметить, что в аналогичных условиях без добавления

модифицированных НК-фрагментов деградации субстратов не наблюдалось (см. рис. 3. контроль). Расщепление РНК в присутствии 2'-аминокислотных олигонуклеотидон VII-XII происходит по двум или по трем сайтам. Такой характер расщепления согласуется с литературными данными [Koroleva, L. et al., 2007; Hall, J. et al., 1996; Mironova, N. et al. 2007]. Анализ картины расщепления показал, что гидролиз РНК-субстратов происходил по сайтам 5'-СрА, 5'-UpA, 5'-UpC и 5'-GpU, которые после образования дуплекса с модифицированными олигонуклеотидами находятся в одноцепочечном фрагменте РНК субстарата, и являются наиболее подверженными расщеплению, как рибозимами, так и рибонуклеазами (рис. 3).

S1: ?"-СрА-5'-GpU-

Субстрат S1 /Ч Субстрат S4 Субстрат S6 Контроль

г — ^ » 'IP <• Г \ .

• 9 * •a Pi

т Ш * т JLJ

УП IX XI УШ X vn XII DC XI „ VIII X XII vn К Vm x, ХП S4 St S6

50mM нмидазол

?'-UpC(S4). ?'-UpA(S6

?'-СрА

"'-GpU

И

Б SI 5 - CUA GGA CGG AGU С'AC AGA

tit

РНК-су бстраты: S4 5-GGACGG AGUCAUCAC

HI

S6 5 - GGA CGG AGT C'AU АСА G

Рис. 3. А. Анализ методом электрофореза в 15%-ном ПААГ РНК-субстратов после инкубации в присутствии пятидесятикратного избытка олигонуклеотидов VII-XII. Пробы инкубировали 1 мин при 94°С, после этого 48 ч при 37°С. Стрелками указаны полосы, соответствующие ] продуктам расщепления, сайты, по которым осуществлялся гидролиз, указаны рядом со стрелками. Б. Направленный гидролиз РНК-субстратов олигонуклеодами VII-XII.

Таким образом, нами синтезированы новые 2'-аминокислотные производные уридина и соответствующие З'-амидофосфиты. С использованием этих производных получены олиго-2'-0-метилрибонуклеотиды, содержащие в своем составе остатки амидов фенилаланина, гистидина и лизина. Продемонстрирована возможность множественного включения модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь. Показано, что j полученные производные олигонуклеотидов, содержащие остатки гистидина и лизина, обладают способностью расщеплять фрагменты РНК в выбранных условиях.

2. Производные нуклеиновых кислот, содержащие 2'-альдегидные группировки 2.1. Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов. содержащих в 2'-положении одного или нескольких нуклеотидных остатков альдегидную группу

Одним из направлений исследований в химии нуклеиновых кислот является I разработка методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих в своем составе химически активные группировки. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот Химического

/

факультета МГУ был разработан метод получения олигонуклеотидов, содержащих в 2'-положении углеводного фрагмента альдегидную группу (рис. 1). Такие реакционноспособные производные применялись для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями и для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации.

Для получения 2'-оксоэтильных производных НК в олигомерную цепь в процессе автоматического твердофазного синтеза встраивают соединение-предшественник, содержащее 1,2-диольную группировку, которую в дальнейшем окисляют до альдегида 14 периодатом натрия (схема 2).

нм

„А

V

Н1Ч

„А

о-

'0 ВгО

О о о В2°

конц. водн. ЫН-5

ОВг

НЫ

Схема 2 о

Н1\1

СЫ

11

12

э V 0

0~Р=0 ¿ч >

и"

13

>н

и0

14

В дальнейшем для получения 2'-альдегидных олигонуклеотидов было предложено использовать З'-амидофосфит 15. Данный подход обладает рядом преимуществ по сравнению с методом, опубликованным ранее. К ним можно отнести меньшее количество стадий, более высокий общий выход конечного продукта, применение менее дорогих реагентов, а также отсутствие необходимости использовать токсичный оксид осмия 0й04.

Таким образом, целью данной части работы было сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов нового типа и 2'-оксоэтильных производных.

З'-Амидофосфит 15 использовали в автоматическом твердофазном олигонуклеотидном синтезе (схема 3).

Схема 3

о о о^кг

о о

х I ^, i и

олигонуклеотидный V

г~1 Г* |*иитв1 ^ 1 О •

О о-д

р^ >-ЫН ОАс

Х'1,

Тг

о о-

Р=0

НЫ'

Ч Гг'^М' конц. водн. ИНз О'Д О -

55°С

НК1

МаЮ4 ^ ОЛ/0'

О О-ч ^0-Р=0 >-МН ОАс

„ О п ?

0-Р=0 он °о-р=о Р

О 0 М 0 М

ОАс ^ ^ОН ^ Н

уЬао ^Jdap

15 16 17 18

Для решения поставленных задач нами был синтезирован ряд модифицированных олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина (5' —>3'):

сели ТТСССССТАТТбСТ ССАССТСССи^'^ЛСТССССТСТ-Х ССАССТСССхЛи<1'"'АОТССССТСТ-Х

11

XIII

XIV

XV

GCACCTCGGAAUda"GTCCCCTCT-X XVI

ATCAAAACAGGACAAAU'taoTGTCCTAAAACCAA XVII

Олигонуклеотиды Х1У-ХУ1 содержат в своем составе З'-концевой аминогексильный линкер X. Встраивание аминоалкильных остатков на З'-конец олигонуклеотидной цепи препятствовало ее деградации под действием З'-экзонуклеаз, что согласуется с литературными данными Репс^ш, I е1 а1., 1992].

2.2. Изучение реакционной способности альдегидной группы в составе модифицированных олигодезоксирибонуклетидов

Наличие альдегидной группы в составе олигонуклеотидов ХШ-ХУП и ее реакционную способность демонстрировали с помощью реакции с дигидразидом янтарной кислоты с последующим восстановлением образовавшегося гидразона цианборгидридом натрия (схема 4).

Схема 4

о О 0 0

НИ'^!) 9 Н НУ |) ™ Я

®0-р=0

О п 9 Я 9 П 9

|-мн ОН о-Р-0 Р U0-P=0 ^NH и0-р=0 Ьмн

Ö„ 0 М_ 0^ 0 м о о^ о У

^ —ОН ^ Н ^ N-NH ^ HN-NH

17 18 19 Ьл Р 20 у-^ О

о о

HN-NH2 H'N-NHj

Анализ реакционной смеси проводили методом ион-парной ВЭЖХ. Строение целевого продукта подтверждали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

2.3. Изучение термической стабильности олигодезоксирибонуклезидов. содержащих остатки 2'-0-Г2-(2.3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина1

Термическую стабильность дуплексов, образованных модифицированными олигонуклеотидами и комплементарными им ДНК-матрицами, изучали по изменению флуоресценции красителя SYBR Green I [Ririe, К. et al., 1997] (табл. 2). Введение в состав олигонуклеотидов остатка 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина не вызывает заметной дестабилизации ДНК-дуплексов. Температура плавления дуплексов меняется в пределах 2°С, что согласуется с данными по изучению термической стабильности дуплексов, содержащих остатки 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина. Отметим, что наличие 3'-концевого аминолинкера не влияет на термическую устойчивость ДНК-дуплексов (дуплексы А и В, табл. 2).

' Для изучения термической стабильности и особенностей комплексообразования с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции ^-кВ использовали 2'-диольные олигонуклеотиды, так как альдегидные аналоги проявляют высокую реакционную способность и могут быть нестабильны в условиях проведения эксперимента,

Таблица 2. Термическая стабильность ДНК-дуплексов.

Шифр ДНК-дуплекс (5'-*373'->5') Т„л,°с (±1)

А GCACCTCGGTAAGTCCCCTCT GAGCCATTCAGGGGAGATG 73

В GCACCTCGGTAAGTCCCCTCT-X X-GAGCCATTCAGGGGAGATG 73

С XIV GCACCTCGGUd*°AAGTCCCCrCT-X X-GAGCCA-' TTCAGGGGAGATG 71

D GCACCTCGGATAGTCCCCTCT GAGCCTATCAGGGGAGATG 71

Е GCACCTCGGATAGTCCCCTCT-X X-GAGCCTATCAGGGGAGATG 72

F XV GCACCTCGGAUaaoAGTCCCCTCT-X X-GAGCCTA'' TCAGGGGAGATG 70

G GCACCTCGGAATGTCCCCTCT GAGCCTTACAGGGGAGATG 73

Н GCACCTCGGAATGTCCCCTCT-X X-GAGCCTTACAGGGGAGATG 73

I XVI GCACCTCGGAA^GTCCCCTCT-X X-GAGCCTTA'''CAGGGGAGATG 71

2.4. Комплексообразование 2'-диольных олигонуклеотидов с субъединицами р50 и р65 (Ьактора транскрипции NF-kB

В качестве модельных объектов для изучения взаимодействия с 2'-диол- и 2'-альдегидсодержащими олигонуклеотидами были выбраны субъединицы р50 и рб5 фактора транскрипции NF-kB. Белки семейства NF-kB способны образовывать различные гетеро- и гомодимеры и специфично связываться в энхансерных областях большого числа генов с 10-звенной последовательностью ДНК (кВ-участком): 5'-GGRRNNYCCC-3'/3'-ССYYNNRGGG-5' (R = A, G; Y = Т, С; N = A, G, Т, С). NF-kB - универсальный фактор транскрипции, который активируется при воздействии на клетку различных стимулов, вызывающих клеточный стресс, и контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла [Gilraore, Т. et al., 2006; Sen, R. et al, 1986]. Объектами исследования в данной работе являлись субъединицы р50 и р65 фактора транскрипции NF-kB человека, которые содержали на N-конце дополнительный белок - глутатион-S-трансферазу (GST).

Для выяснения особенностей комплексообразования 2'-диольных производных ДНК с субъединицами фактора транскрипции NF-kB р50 и р65 нами были сконструированы олигонуклеотидные дуплексы, содержащие единичные остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина (С, F, I, М) или 2'-0-(2,3-дигидрокси-пропил)уридина (К, N) в различных положениях олигонуклеотидной цепи (табл. 3). Модифицированные дуплексы С, F, I, К содержат кВ-участок из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (Ig-кВ) (Sen, R. et al, 1986], дуплексы М и N не содержат участков узнавания белка и служат отрицательным контролем. Комплексообразование

проводили при температуре 20°С в течение 30 мин. Способность модифицированных ДНК-дуплексов формировать комплексы с выбранными белками изучали методом «торможения» в 6%-ном ПААГ (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность комплексообразования ДНК-дуплексов с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции NF-kB.

Шифр ДНК-дуплекс (5'—3'/3'->5') Степень связывания , %

p50 p65

J GCACCTCGGAAAGTCCCCTCT GAGCCTTTCAGGGGAGATG 97 98

С XIV GCACCTCGGÜ^AAGTCCCCTCT-X X-GAGCCT'' TTCAGGGGAGATG 95 95

F XV GCACCTCGGAUa*°AGTCCCCTCT—X X-GAGCCTT''' TCAGGGGAGATG 95 95

I XVI GCACCTCGGAAUd"GTCCCCTCT-X X-GAGCCTTT"' CAGGGGAGATG 97 94

К XVIII ACCTCGGAAlfGTCCCCTCT GAGCCTTA' CAGGGGAGA 90 -

L ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT 80 82

М XVII ATCAAAACAGGACAAAÜa*°TGTCCTAAAACCAA TAGTTTTGTCCTGTTTA'' ACAGGATTTTGGTT 80 75

N XIX CTCCCAGGCÜ^CAAAT GAGGGTCCGA'GITTA 50 -

кВ-Участок из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов подчеркнут.

♦Приведены средние значения, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. Ошибка измерений не превышала 15%. «-»- не определяли.

Контролями при комплексообразовании служили немодифицированный ДНК-дуплекс J, содержащий кВ-сайт, и L, не содержащий кВ-сайта. Показано, что диолсодержащие дуплексы обоих типов эффективно связываются с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции NF-kB. При этом было обнаружено, что связывание белков с дуплексами L и М, не содержащими кВ-сайт, протекает с выходом 75-82%. В этом случае наличие модификации также не влияло на эффективность взаимодействия с субъединицами р50 и р65 NF-kB. Следует отметить, что самая низкая эффективность комплексообразования ~50% в случае более короткого дуплекса N (15 н.п.), по-видимому, обусловлена меньшим количеством НК-белковых контактов. Полученные результаты, свидетельствующие о низкой специфичности узнавания субъединицами NF-kB ДНК-мишени, согласуются с литературными данными [Lumley, М. et al., 2004; Nijnik, А. et al., 2003; Kunsch, С. et al., 1992; Zabel, U. et al., 1991]. Для поиска условий более специфичного узнавания ДНК-мишени образование комплексов изучалось в присутствии возрастающих количеств KCl и poly(dI»dC). Оптимальными условиями для образования специфического комплекса является соотношение концентраций субъединиц р50 или р65 и ДНК-дуплекса 5:1. Связывание следует проводить в присутствии KCl, так как в этом случае наблюдается

максимальное снижение выхода комплекса с неспецифическим дуплексом, а комплексообразование с кВ-лигандом уменьшается незначительно.

2.5. Ковалентное связывание 2'-альдегидных олигонуклеотидов с р50 и рб5 субъединицами фактора транскрипции №-кВ

Как известно, взаимодействие е-аминогруппы остатков лизина белка с 2'-альдегидной группой в модифицированной ДНК приводит к образованию основания Шиффа, которое затем восстанавливают до вторичного амина цианборгидридом натрия (схема 5).

Схема 5

Ыа10„

I-« « У'

'Л!/

Г> ° '°~г а °

О-Р-О ) \ о-р=о у-н

Л но он 4, 0

V \22

га ° °'г

О-Р-О у- н о

23

га 0 0-Р=0 ^—мн

г = -СН2- ИЛИ -СН2СОЫНСН2-

Для изучения взаимодействия субъединицы р50 и р65 №-кВ с 2'-альдегидными производными ДНК нами были сконструированы олигонуклеотидные дуплексы О-Т, содержащие единичные остатки 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина (иаар) или 2'-0-(2-оксоэтил)уридина (1)°) в различных положениях олигонуклеотидной цепи (табл. 4). Для получения 2'-альдегидных ДНК-дуплексов 1,2-диольную группировку в составе олигонуклеотидов окисляли периодатом натрия с последующей гибридизацией с комплементарными матрицами (схема 5 и табл. 4).

На первом этапе ковалентное связывание с использованием дуплекса О (с кВ-участком) проводили в условиях, оптимальных для образования специфического комплекса (соотношение белок - дуплекс 5:1, 330 мМ КС1, см. раздел 2.4), однако при этом формирования конъюгата не наблюдалось, что может быть связано с низким избытком белка относительно ДНК-дуплекса для эффективного протекания реакции. Далее была предпринята попытка изменить методику аффинной модификации таким образом, чтобы образование конъюгата происходило уже после образования специфического комплекса (схема 6).

Схема б

Однако в этом случае выходы продуктов реакции были очень низкими и составляли 1-2%, кроме того, наблюдалось образование нескольких продуктов, что, вероятно, связано с деградацией белка под действием периодата натрия. В этой связи далее ковалентное связывание осуществляли в рамках метода, представленного на схеме 5.

Таблица 4. Эффективность ковалентного связывания ДНК-дуплексов с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции ЫБ-кВ.

Шифр ДНК (5'—>373'—>5') Выход ДНК-белкового конъюгата , %

р50 р65

О 01 02 ССАССТСССийарАА6ТССССТСТ-Х X—САвССТ'''ТТСАССвбАСАТС 9 6

Р Р1 Р2 ССАССТСССАи^АСГССССТСТ-Х Х-САСССТТ ТСАССССАСАТв 10 5

О <22 ССАССТСССААи^СТССССТСТ-Х X—САвССТТТ САвввбАСАТС 12 6

вСАССТСССААи^СТССССТСТ-Х 10 -

И 1*2 АССТСССААи°СТССССТСТ вАСССТТА САСССвАСА 15 -

Ш АССТСССААи°СТССССТСТ 9 -

8 82 АТСААААСАбСАСАААи^ТСГССТААААССАА ТАБТТТТСТССТбТТТА'' АСАСвАТТТТССТТ 7 3

Т Т1 Т2 СТСССАСССи°САААТ САСйСТССвА СГТТА 9 -

кВ-Участок из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов подчеркнут.

"Приведены средние значения, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах.

Ошибка измерений не превышала 15%. «-» - не определяли.

Отработку оптимальных условий получения ковалентно связанных комплексов р50 с ДНК проводили с использованием дуплекса О. За основу брали условия, предложенные в работе [Романенков, и др., 2006]: отношения концентраций белок - дуплекс варьировали от 20:1 до 100:1, температура инкубации 20°С или 37°С, время инкубации 30 мин. Для

субъединиц р50 и р65 наибольшие выходы конъюгатов достигались при отношении концентрации белок - дуплекс 50:1, температуре реакции 20°С, времени инкубации 30 мин.

В табл. 4 приведена эффективность ковалентного связывания различных ДНК-лигандов с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции ИР-кВ. Дуплексы О-Я содержали кВ-участок, дуплексы 8 и Т не содержали участков узнавания и служили отрицательным контролем. Анализ взаимодействия р50- и р65-субъединиц NF-кB с фрагментами ДНК методом электрофореза в 12%-ном ПААГ представлен на рис. 4.

дуплекс О

Агрегаты ДНК- " * белок на границе 12 5-4; раздела гелей-..........

Коньюгаты -*

ДНК-белок

дуплекс Р> < дуплекс Q > < дуплекс 5 (

1254512 .1 4512345

«ж* «я» *м> * Щ

шя-Ш. ш Щк ш

ДНК

Рис. 4. Анализ методом электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии ДСН продуктов ковалентного связывания р50 (дорожки 2-3) и р65 (дорожки 4-5) субъединиц №-кВ с модифицированными ДНК-дуплексами О, Р, О, в. Дорожки 1- ДНК-дуплексы О, Р, 0, 8. В дорожках 2-3 отношения концентрации р50 к концентрации ДНК-дуплекса - 20:1, 50:1. В дорожках 4-5 отношения концентраций р65 к концентрации ДНК-дуплекса - 20:1, 50:1.

Дуплексы 0-0 реагируют с р50-субъединицей фактора транскрипции №-кВ со сравнимыми выходами 9-12% независимо от положения модифицированного звена в кВ-участке. Отметим, что дуплекс в без кВ-участка и одноцепочечные олигонуклеотиды 01 и К1 также образовывали конъюгаты с р50 с выходом 7-10% (табл. 4). По-видимому, это связано с тем, что диольные аналоги 01 и Я1 - олигонуклеотиды XVI и XVIII, также формировали комплекс с белком. Для 2'-оксоэтильного дуплекса И выход продуктов аффинной модификации с р50 был выше и составлял 15%, однако также наблюдалось образование конъюгата с неспецифическим дуплексом Т с выходом 9% (табл. 4). Выходы конъюгатов субъединицы р65 с дуплексами О-О составляли 5-6% и, как и в случае субъединицы р50, не зависели от положения модификации в кВ-участке (табл. 4). Субъединица р65 также реагировала с дуплексом в, не содержащим участок узнавания (рис. 4, дуплекс 8, дорожки 4, 5, табл. 4). Отметим, что для р50 и р65 наблюдается образование нескольких продуктов с различной подвижностью, что связано, по-видимому, с взаимодействием нескольких молекул ДНК с различными остатками лизина, расположенными в НК-узнающем центре или на поверхности белка.

2.6. Изучение конкурентного ингибирования реакции 2'-альдегидных олигонуклеотидов с субъединицей р50 фактора транскрипции №-кВ

Следующим этапом работы явилось исследование ковалентного связывания ?'~Р-меченных модифицированных дуплексов О и И с р50 в присутствии возрастающих

количеств немеченых ДНК-лигандов (рис. 5). В роли последних выступали: а) немодифицированные ДНК-дуплексы с участком узнавания; б) ^модифицированные ДНК-дуплексы без участка узнавания; в) модифицированный ДНК-дуплекс или олигонуклеотид без участка узнавания. Такой подход является стандартным для определения специфичности ковапентного связывания НК с белком. Использование в качестве неспецифического модифицированного лиганда одноцелочечного олигонуклеотида обусловлено тем, что его диольный аналог олигомер XVII обладал наименьшим сродством к белку.

О 20 40 60 80

Соотношение концентраций ннгибитор'реагент

Рис. 5. Зависимость относительного выхода ДНК-белковых конъюгатов от соотношения концентраций ингибитор/реагент. Исследование ковапентного связывания: р50 с ДНК-дуплексом О, содержащим остаток Udap, в присутствии лигандов L, J и Sl; J - ДНК-дуплекс, содержащий кВ-участок; L - ДНК-дуплекс, не содержащий кВ-участка; S1 - реакционноспособный олигонуклеотид (табл. 4). Ошибка измерений не превышала 15%. За 100% принимали максимальный выход комплекса ДНК-белок без добавления ингибитора.

Из рис. 5 видно, что присоединение ДНК-дуплекса О к субъединице р50 ингибируется в случае всех типов конкурирующих молекул ДНК. Добавление в реакционную смесь немодифицированных лигандов снижает выход конъюгата не более, чем на 50%. Возможно, изменение характера кривой ингибирования и выход ее на плато при 40-60-кратных избытках лиганда связано с тем, что образование основания Шиффа происходит достаточно быстро, и лиганд без модификации не способен эффективно конкурировать с 32Р-меченным модифицированным фрагментом ДНК.

Одинаковый характер изменения выхода конъюгата в присутствии ДНК с кВ-участком и ДНК произвольной последовательности, не содержащих модифицированных звеньев, вероятно, связан с низкой специфичностью взаимодействия р50 с ДНК-мишенью. Во всех случаях наибольший ингибирующий эффект наблюдался при добавлении в инкубационную смесь реакционноспособных лигандов без участка узнавания (рис. 5, кривая S1).

Мы предполагали, что подобный характер конкурентного ингибирования может быть связан с тем, что образование ковалентной связи происходит одновременно с протеканием первой стадии узнавания белком ДНК-лиганда в рамках двухстадийного механизма, когда более прочный специфический комплекс образуется на второй стадии. Подобный механизм показан для ряда белков, таких как репликационный белок А, ТАТА-связывающий белок и эндонуклеаза рестрикции EcoRV. Однако в работах [Ferreira, D. et

18

al., 2008; Hart, D. et al., 1999] показано, что связывание фактора транскрипции NF-кВ с кВ-сайтом происходит в одну стадию.

Неизбирательный характер ковалентного связывания субъединицы р50 фактора транскрипции NF-кВ с 2'-оксоэтильными и 2'-диоксоазапентильными дуплексами, по-видимому, связан с тем, что реакция альдегидных групп олигонуклеотидов с е-аминогруппами остатков лизина происходит параллельно с формированием специфического комплекса ДНК-белок. Возможно, быстрое протекание химической реакции препятствует специфическому взаимодействию ДНК-связывающего белка с лигандом (рис. 6).

Рис. 6. Схематичное изображение взаимодействия реакционноспособного ДНК-дуплекса с белком.

Это предположение подтверждается данными аффинной модификации эндонуклеазы рестрикции БвоИ и субъединицы р50 фактора транскрипции реакционноспособными аналогами ДНК [Судьина, А. и др., 2005; Романенков, А. Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2006]. Авторами было обнаружено, что 2'-оксоэтильная группировка в составе модифицированного нуклеотидного остатка, введенного в центральное положение участка узнавания ДНК, образует ковалентную связь с остатками лизинов, которые удалены от ДНК-узнающего центра белка при образовании специфического ДНК-белкового комплекса.

Таким образом, нами были синтезированы производные ДНК, содержащие в своем составе остатки 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина. Впервые было изучено их взаимодействие с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции №-кВ. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов двух типов: 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных. В случае оксоэтильных дуплексов выходы ковалентного связывания были приблизительно в 1.5 раза выше, что может быть связано с различием в строении модифицированных звеньев. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в условиях конкурентного ингибирования, показывают, что реакция 2'-альдегидсодержащих дуплексов с субъединицами фактора транскрипции №-кВ носит неспецифический характер. Неизбирательное протекание химической реакции происходит на фоне низкой специфичности связывания ОТ-кВ с НК-лигандами в выбранных условиях.

На сегодняшний день основной сферой применения модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот остаются функциональные исследования в области молекулярной

биологии. Олигонуклеотиды, содержащие реакционноспособные группы, могут использоваться для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями, например, красителями или молекулами, которые способствуют проникновению НК в клетку. Кроме того, модифицированные аналоги нуклеиновых кислот целесообразно использовать для исследования взаимодействия биомолекул, в частности, для определения молекулярных партнеров НК в различных биологических системах.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан новый эффективный метод синтеза З'-амидофосфитов 2'-аминокислотных производных уридина:

- адлилового эфира №-{2-[3'-0-(ДГ,Л'-диизопропиламино-2-цианэтоксифосфш1ил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси}карбонил-Ь-фенилаланина,

- метилового эфира Ма-(2-[3'-0-(//,Л/'-диизопропиламино-2-цианэтоксифосфинил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси}карбонил-М1т-тритил-Ь-гистидина,

- метилового эфира Д'а-{2-[3'-0-(М,//-диизопропиламино-2-цианэтоксифосфинил)-5'-0-(4,4'-димстокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси|карбонил-/УЕ-(9-флуоренилметокси-карбонил)-Ь-лизина.

С использованием этих соединений были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие 2'-аминокислотные производные уридина.

2. Показано, что 2'-аминокислотные производные олигонуклеотидов обладают способностью гидролизовать модельные РНК-субстраты в выбранных условиях.

3. Изучены свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина, как лигандов субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции №-кВ. Определены оптимальные условия образования специфических комплексов фрагментов НК с субъединицами транскрипционного фактора.

4. Сравнительное исследование химических свойств фрагментов ДНК, содержащих остатки 2'-СЦ2,5-диоксо-3-азапентил)уридина и 2'-0-(2-оксоэтил)уридина, показало, что оксоэтильные производные обладают более высокой реакционной способностью в условиях ковалентного связывания с НК-узнающими белками. Продемонстрирован неспецифический характер взаимодействия 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных производных с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции ЫР-кВ.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях: Статьи

1. Казанова Е.В.. Зубин Е.М., Качалова А.В., Стеценко Д.А., Гейт М.Дж., Орецкая Т.С. Синтез олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов, содержащих в положении 2' остатки а-аминокислот. // Известия Академии наук. Серия химическая (2007) N 4, с. 775-783.

2. Долинная Н.Г., Кубарева Е.А., Казанова Е.В.. Зигангирова Н.А., Народицкий Б.С., Гинцбург A.JL, Орецкая Т.С. Низкомолекулярные ингибиторы различных компонентов сигнального каскада фактора транскрипции NF-kB. // Успехи химии (2008) 77, N 11, с. 1036-1052.

3. Хомякова Е.А., Казанова Е.В.. Зубин Е.М., Кубарева Е.А., Молочков Н.В., Рязанова Е.М., Орецкая Т.С. 2'-Альдегидные олигонуклеотиды. Синтез и применение для аффинной модификации ДНК-узнающих белков. // Биоорганическая химия (2010) 36, N3, с. 343-353.

Тезисы конференций

1. E.V. Kazanova "Incorporation of side chain groups of basic amino acids into oligonucleotides via the 2'-position of uridine." // Материалы международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ -2006». Секция «Химия». Отделение «Кафедра английского языка», с. 210.

2. Е.В. Казанова. Е.М. Зубин, А.В. Качалова, ДА. Стеценко, Т.С. Орецкая "Синтез олигонуклеотидов, содержащих в 2'-положении остатки а-аминокислот." // Международная конференция "Физико-химическая биология", 30.07. - 03.08.2006, Новосибирск, Россия, с. 112.

3. E.V. Kazanova, T.S. Oretskaya. "Affinity modification of transcription factor NF-кВ by reactive 2'-aldehyde oligonucleotides." II Spring-Meeting "Protein-nucleic acid interactions", March 2008, Rauischholzhausen, Germany.

4. E.A. Хомякова, Е.В. Казанова. А.В. Качалова, Е.М. Зубин. "2'-Модифицированные олигонуклеотиды. Синтез и применение." // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05. - 15.05.2008, Новосибирск, Россия, с. 103.

Подписано в печать:

27.10.2010

Заказ № 4373 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ИНГИБИРОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЙ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ №-кВ С ПОМОЩЬЮ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ФРАГМЕНТОВ НУКЛЕИ1ЮВЫХ КИСЛОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

3.1. Введение

3.2. Биологические функции фактора №-кВ

3.3. Сигнальные пути активации фактора ОТ-кВ

3.4. ЫБ-кВ как редокс-чувствительный фактор транскрипции

3.5. №-кВ и воспалительные процессы

3.6. Активация ОТ-кВ, злокачественное перерождение клеток и апоптоз

3.7. Низкомолекулярные ингибиторы активности №-кВ

3.7.1. Низкомолекулярные ингибиторы №-кВ, обладающие противовоспалительными и антиоксидантными свойствами

3.7.2. Сулиндак и его метаболиты

3.7.3. Циклопентеноновые простагландины

3.7.4. Флавоноиды и фенольные соединения

3.7.5. Биологически активные компоненты микроорганизмов и растений и их синтетические аналоги

3.7.6. Глюкокортикоидные ингибиторы

3.7.7. Ингибиторы протеосомы

3.7.8. Алкилируюицие реагенты

3.8. Олигонуклеотидные ингибиторы ОТ-кВ

3.8.1. Антисмысловые олигонуклеотидные ингибиторы ЫР-кВ

3.8.2. Олигонуклеотидные ингибиторы-рибозимы

3.8.3. Ингибиторы №-кВ на основе з1РНК

3.8.4. Олигонуклеотидные ингибиторы, образующие тройные спирали с кВ-участками

3.8.5. Олигонуклеотидные ингибиторы-«ловушки» субъединиц фактора транскрипции №-кВ

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый эффективный метод синтеза З'-амидофосфитов 2'-аминокислотных производных уридина:

- аллилового эфира Л/а-{2-[3'-0-(А^,//-диизопропиламино-2-цианэтокси-фосфинил)-5,-0-(4,4'-диметокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси}карбонил-Ь-фенилаланина,

- метилового эфира А/а-{2-[3'-0-(Л^,А^-диизопропиламино-2-цианэтоксифосфинил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси}карбонил-А^т-тритил-Ь-гистидина,

- метилового эфира А'а-{2-[3'-0-(Аг,Л^диизопропиламино-2-цианэтоксифосфинил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин-2'-0-ил]этокси}карбонил-А'Е-(9-флуоренилметокси-карбонил)-Ь-лизина.

С использованием этих соединений были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие 2'-аминокислотные производные уридина.

2. Показано, что 2'-аминокислотные производные олигонуклеотидов обладают способностью гидролизовать модельные РНК-субстраты в выбранных условиях.

3. Изучены свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-<9-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина, как лигапдов субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции ОТ-кВ. Определены оптимальные условия образования специфических комплексов фрагментов НК с субъединицами транскрипционного фактора.

4. Сравнительное исследование химических свойств фрагмешов ДНК, содержащих остатки 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина и 2'-0-(2-оксоэтил)уридина, показало, что оксоэтильные производные обладают более высокой реакционной способностью в условиях ковалентного связывания с НК-узнающими белками. Продемонстрирован неспецифический характер взаимодействия 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных производных с субъединицами р50 и р65 фактора транскрипции ЫР-кВ.

1. Dolinnaya N.G., Zubin Е.М., Kubareva E.A., Zatsepin T.S., Oretskaya T.S. Design and synthesis of 2'-functionalized oligonucleotides. Their application for covalent trapping the protein-DNA complexes. // Curr. Org. Chem. (2009) 13. 1029.

2. Freier S.M., Altmann K.I I. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes. // Nucleic Acids Res. (1997) 25. 4429.

3. Sen R., Baltimore D. Inducibility of к-immunoglobulin enhancer-binding protein NF-кВ by a posttranslational mechanism. // Cell (1986) 46. 705.

4. Schmitz M.L., Mattioli I., Buss H., Kracht M. NF-кВ: a multifaceted transcription factor regulated at several levels. // Chembiochem. (2004) 5. 1348.

5. Nabel G.J., Verma I.M. Proposed NF-kB/IkB family nomenclature. // Gems Dev. (1993) 7. 2063.

6. Schmitz M.L., Baeuerle P.A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-кВ. // EMBO J. (1991) 10. 3805.

7. Ghosh G., Duyne G., Ghosh S., Sigler P.B. Structure of NF-кВ p50 homodimer bound to а кВ site. II Nature. (1995) 373. 303.

8. Mueller C.W., Rey F.A., Sodeoka M., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of the NF-кВ p50 homodimer bound to DNA. // Nature. (1995) 373. 311.

9. Козлов И.А., Кубарева E.A. Взаимодействие димера субъединицы р50 фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // Yen. биол. химии (1998) 38. 77.

10. Романенков А.С., Устюгов А.А., Зацепин Т.С., Никулова А.А., Колесников И.В., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с Д1IK. // Биохимия (2005) 70. 1474.

11. Metelev V., Romanenkov A., Kubareva Е., Zubin Е., Polouchine N., Zatsepin Т., Molochkov N., Oretskaya T. Structure-based cross-linking of NF-кВ p50 homodimer and decoy bearing a novel 2'-disulfide trapping site. // IUBMB Life (2006) 58. 654.

12. Umczawa K., Chaicharoenpong C. Molecular design and biological activities of NF-кВ inhibitors. // Mol. Cells (2002) 14. 163.

13. Wu J.T., Krai J.G. The NF-kB/IkB signaling system: a molecular target in breast cancer therapy. II J. Surg. Res. (2005) 123. 158.

14. Алмазов В.П., Кочетков Д.В., Чумаков П.М. р53 инструмент для терапии злокачественных заболеваний человека. И Мол. биол. (2007) 41. 947.

15. Philip M, Rowley D.A., Schveiber H. Inflammation as a tumor promoter in cancer induction. // Semin. Cancer Biol. (2004) 14. 433.

16. Baeuerle P.A., Henkel Т. Function and activation ofNF-кВ in the immune system. // Annu. Rev. Immunol. (1994) 12. 141.

17. Lin R., Gewert D., Hiscott J. Differential transcriptional activation in vitro by NF-icB/Rel proteins. II J. Biol. Chem. (1995) 270. 3123.

18. Thompson J.E., Phillips R.J., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Ghosh S. IkB-3 regulates the persistent response in a biphasic activation ofNF-кВ. // Cell (1995) 80. 573.

19. Liou H.-C, Hsia C.Y. Distinctions between c-Rel and other NF-кВ proteins in immunity and disease. // Bioessays (2003) 25. 767.

20. Brockman J.A, Scherer D.C., McKinsey T.A, Hall S.M, Qi X, Lee W.Y, Ballard D.W. Coupling of a signal response domain in IicB-a to multiple pathways for NF-кВ activation. // Mol. Cell Biol. (1995) 15. 2809.

21. Brown K., Gerstberger S., Carlson L, Franzoso G., Siebenlist U. Control of 1кВ-а proteolysis by site-specific, signal-induced phosphorylation. II Science (1995) 267. 1485.

22. Kretz-Remy C., Mehlen P., Mirault M.-E., Arrigo A.-P. Inhibition of 1кВ-а phosphorylation and degradation and subsequent NF-кВ activation by glutathione peroxidase overexpression. //./. Cell Biol. (1996) 133. 1083.

23. Rothwarf D.M., Zandi E., Natoli G., Karin M. IKK-y is an essential regulatory subunit of the IkB kinase complex. И Nature (1998) 395. 297.

24. Kim H.J, Ilawke N, Baldwin A.S. NF-кВ and IKK as therapeutic targets in cancer. // Cell Death Differ. (2006) 13. 738.

25. Dejardin E, Droin N.M., Delhase M, Haas E„ Cao Y, Markis C, Li Z.W, Karin M., Ware C.F, Green D.R. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-кВ pathways. II Immunity (2002) 17. 525.

26. Barre В, Perkins N.D. A cell cycle regulatory network controlling NF-кВ subunit activity and function. // EMBO J. (2007) 26. 4841.

27. Меньшикова Е.Б, Ланкин В.З, Зенков H.K, Бондарь И.А, Круговых Н.Ф, Труфакин В. А. "Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксид анты". Слова, Москва, 2006. С. 512-520.

28. Гесслер H.H., Аверьянов A.A., Белозерская Т.А. Активные формы кислорода в регуляции развития грибов. // Биохимия (2007) 72. 1342.

29. Georgiou C.D., Patsoukis N., Papapostolou I., Zervoudakis G. Sclerotial metamorphosis in filamentous fungi is induced by oxidative stress. // Integr. Compar. Biol. (2006) 46. 1.

30. Lowenstein C.J., Padalko E. iNOS (NOS2) at a glance. II J. Cell Sci. (2004) 117. 2865.

31. Pinkus R., Weiner L.M., Daniel V. Role of quinone-mediated generation ofhydroxyl radicals in the induction of glutathione S-transferase gene expression. II Biochemistry (1995) 34. 81.

32. Pinkus R., Weiner L.M., Daniel V. Role of oxidants and antioxidants in the induction of AP-1, NF-кВ, and glutathione S-transferase gene expression. II J. Biol. Chem. (1996) 271. 13422.

33. Kaul N., Choi J., Forman H.J. Transmembrane redox signaling activates NF-кВ in macrophages. II Free Radie. Biol. Med. (1998) 24. 202.

34. Marshall H.E., Stamler J.S. Nitrosative stress-induced apoptosis through inhibition of NF-кВ. II J. Biol. Chem. (2002) 277. 34223.

35. Li Y., Leung L.K., Spear B.T., Glauert H.P. Activation of hepatic NF-кВ by phénobarbital in rats. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 229. 982.

36. Oka S., Kamata H., Kamata K., Yagisawa H., Hirata H. N-acetylcysteine suppresses TNF-induced NF-кВ activation through inhibition of IkB kinases. IIFEBS Lett. (2000) 472. 196.

37. Umezawa K. Inhibition of tumor growth by NF-кВ inhibitors. // Cancer Sci. (2006) 97. 990.

38. Baldwin A.S., Jr. Inhibition of tumor growth by NF-кВ inhibitors. // Annu. Rev. Immunol. (1996) 14. 649.

39. Kruppa G., Thoma В., Machleidt T., Wiegmann K., Kroenke M. Inhibition of tumor necrosis factor (TNF)-mediated NF-кВ activation by selective blockade of the human 55-kDa TNF receptor. IIJ Immunol. (1992) 148. 3152.

40. Rothe M., Wong S.C., Henzel W.J., Goeddel D.V. A novel family of putative signal transducers associated with the cytoplasmic domain of the 75 kDa tumor necrosis factor receptor. // Cell (1994) 78. 681.

41. Legrand-Poels S., Bours V., Piret B., Pflaum M., Epe B., Rentier B., Piette J. Transcription factor NF-kB is activated by photosensitization generating oxidative DNA damages. // J. Biol. Chem. (1995)270. 6925.

42. Guo Z., Shao L., Du Q., Park K.S., Geller D.A. Identification of a classic cytokine-induced enhancer upstream in the human iNOS promoter. // FASEB J. (2007) 21. 535.

43. Korhonen R., Lahti A., Kankaanranta H., Moilanen E. Nitric oxide production and signaling in inflammation. // Ciirr. Drug Targets Inflamm. Allergy (2005) 4. 471.

44. Ricciardolo F.L., Sterk P.J., Gaston B., Foikerts G. Nitric oxide in health and disease of the respiratory system. II Physiol. Rev. (2004) 84. 731.

45. Seybold V.S., Jia Y.P., Abrahams L.G. Cyclo-oxygenase-2 contributes to ccntral sensitization in rats with peripheral inflammation. // Pain (2003) 105. 47.

46. Mattson M.P., Camandola S. NF-kB in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders. II J.Clin.Invest. (2001) 107. 247.

47. Gupta S., Sen S. Role of the NF-kB signaling cascade and NF-kb-targeted genes in failing human hearts. II J. Mol. Med. (2005) 83. 993.

48. Gupta S., Young D., Maitra R.K., Gupta A., Popovic Z.B., Yong S.L., Mahajan A., Wang Q., Sen S. Prevention of cardiac hypertrophy and heart failure by silencing of NF-kB. // J. Mol. Biol. (2008) 375. 637.

49. Thangapazham R.L., Sharma A., Maheshwari R.K. Multiple molecular targets in cancer chemoprevention by curcumin. // AAPS J. (2006) 8. E443.

50. Maheshwari R.K., Singh A.K., Gaddipati J., Srimal R.C. Multiple biological activities of curcumin: a short review. // Life Sci. (2006) 78. 2081.

51. Pollard J.W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. // Nat. Rev. Cancer {2004)4. 71.

52. Perkins N.D. NF-kB: tumor promoter or suppressor? // Trends Cell Biol. (2004) 14. 64.

53. Gilmore T.D., Koedood M„ Piffat K.A., White D.W. Rel/NF-KB/lKB proteins and cancer. // Oncogene (1996) 13. 1367.

54. Gilmore T.D. The Rel/NF-KB/lKB signal transduction pathway and cancer. // Cancer Treat Res. (2003) 115. 241.

55. Delhalle S., Blasius R., Dicato M., Diederich M. A beginner's guide to NF-kB signaling pathways. IIAnn. N.Y. Acad. Sci. (2004) 1030. 1.

56. Bharti A.C., Aggarwal B.B. Chemopreventive agents induce suppression of nuclear factor-kB leading to chemosensitization. IIAnn. N.Y. Acad. Sci. (2002) 973. 392.

57. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. II Annu. Rev. Biochem. (1999) 68. 383.

58. Grimm S., Bauer M.K., Baeuerle P.A., Schulze-Osthoff K. Bcl-2 down-regulates the activity of transcription factor NF-kB induced upon apoptosis.//./. Cell Biol. (1996) 134. 13.

59. Wang C.Y., Mayo M.W., Korneluk R.G., Goeddel D.V., Baldwin A.S., Jr. NF-kB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. II Science (1998) 281. 1680.

60. Webster G.A., Perkins M.D. Transcriptional cross talk between NF-kB and p53. II Mol. Cell. BioL{ 1999) 19.3485.

61. Xiong S., She II., Takeuchi H., Han B., Engelhardt J.F., Barton C.H., Zandi E., Giulivi C., Tsukamoto H. Signaling role of intracellular iron in NF-kB activation. //./. Biol. Chem (2003) 278. 17646.

62. Kopp E., Ghosh S. NF-kB and rel proteins in innate immunity. // Science (1994) 265. 956.

63. Yin M.J., Yamamoto Y., Gaynor R.B. The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of IkB kinase-(3. // Nature (1998) 396. 77.

64. Wahl C., Liptay S., Adler G., Schmid R.M. Sulfasalazine: a potent and specific inhibitor of nuclear factor kB. II J. Clin. Invest. (1998) 101. 1163.

65. Slater A.F., Kimland M., Jiang S.A., Orrenius S. Constitutive nuclear NF-KB/rel DNA-binding activity of rat thymocytes is increased by stimuli that promote apoptosis, but not inhibited by pyrrolidine dithiocarbamate. // Biochem. J. (1995) 312. 833.

66. Suzuki Y.J., Packer L. Inhibition of NF-kB transcription factor by catechol derivatives. // Biochem. and Mol. Biol. Int. (1994) 32. 299.

67. Yamamoto Y., Yin M.-J., Lin K.-M., Gaynor R.B. Sulindac inhibits activation of the NF-kB pathway. II J. Biol. Chem. (1999) 274. 27307.

68. Rossi A., Kapahi P., Natoli G., Takahashi T., Chen Y., Karin M., Santoro M.G. Antiinflammatory cyclopentenone prostaglandins are direct inhibitors of IkB kinase. II Nature (2000) 403. 103.

69. Straus D.S., Pascual G., Li M., Welch J.S., Ricote M., Hsiang C.H., Senqchanthalangsy L.L., Ghosh G., Glass C.K. 15-Deoxy-A12,14-prostaglandin J2 inhibits multiple steps in the NF-kB signaling pathway. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97. 4844.

70. Cernuda-Morollon E., Pineda-Molina E., Canada F.J., Perez-Sala D. 15-Deoxy-A 12,14-prostaglandin J2 inhibition of NF-kB-DNA binding through covalent modification of the p50 subunit. II J. Biol. Chem. (2001) 276. 35530.

71. Pari L., Tewas D., Eckel J. Role of curcumin in health and disease. // Arch. Physiol. Biochem. (2008) 114. 127.

72. Ingolfsson H.I., Koeppe R.E., II, Andersen O.S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. II Biochemistry (2007) 46. 10384.

73. Duvoix A., Morceau F., Delhalle S., Schmitz M., Schnekenburger M., Galteau M.M., Dicato M., Diederich M. Induction of apoptosis by curcumin: mediation by glutathione S-transferase Pl-1 inhibition. //Biochem. Pharmacol. (2003) 66. 1475.

74. Fremont L. Biological effects of resveratrol. II Life Sci. (2000) 66. 663.

75. HoImes-McNary M., Baldwin A.S., Jr. Chemopreventive properties of trans-resveratrol are associated with inhibition of activation of the IkB kinase. // Cancer Res. (2000) 60. 3477.

76. Ignatowicz E., Baer-Dubowska W. Resveratrol, a natural chemopreventive agent against degenerative diseases. // Pol. J. Pharmacol. (2001) 53. 557.

77. Matsuda H., Kageura T., Morikawa T., Toguchida I., Harima S., Yoshikawa M. Effects of stilbene constituents from rhubarb on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages. // Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10. 323.

78. Tredici G., Miloso M., Nicolini G., Galbiati S., Cavalctti G., Bertelli A. Resveratrol, map kinases and neuronal cells: might wine be a neuroprotectant? // Drug Exp. Clin. Res. (1999) 25. 99.

79. Doss M.X., Potta S.P., Hescheler J., Sachinidis A. Trapping of growth factors by catechins: a possible therapeutical target for prevention of proliferative diseases. // J. Nutr. Biochem. (2005) 16. 259.

80. Patel J.D. Lung cancer in women. // J.Clin.Oncol (2005) 23. 3212.

81. Syed D.N., Afaq F., Kweon M.-H., Hadi N. Bhatia N„ Spiegelman V.S., Mukhtar H. Green tea polyphenol EGCG suppresses cigarette smoke condensate-induced NF-kB activation in normal human bronchial epithelial cells. // Oncogene (2007) 26. 673.

82. Han A.-R., Kim J.-B., Lee J., Nam J.W., Lee I.S., Shim C.K., Lee K.T., Seo E.-K. A new flavanone glycoside from the dried immature fruits of Poncirus trifoliata. // Chem. Pharm. Bull. (2007) 55. 1270.

83. Gehrt A., Erkel G., Anke T., Sterner O. Nitidon, a new bioactive metabolite from the basidiomycete Junghuhnia nitida (Pers.: Fr.) Ryv. II J. Antibiot. (Tokyo) (1998) 51. 455.

84. Woo E.-R., Pokharel Y.R, Yang J.W., Lee S.Y., Kang K.W. Inhibition of nuclear factor-KB activation by 2',8"-biapigenin. // Biol. Pharm. Bull. (2006) 29. 976.

85. Leiba M., Cahalon L., Shimoni A., Lider O., Zanin-Zhorov A., Hecht I., Sela U., Vlodavsky L, Nagler A. Halofuginone inhibits NF-kB and p38 MAPK in activated T cells. // J. Leukoc. Biol. (2006) 80. 399.

86. Gavish Z., Pinthus J.H., Barak V., Ramon J., Nagler A., Eshhar Z., Pines M. Growth inhibition of prostate cancer xenografts by halofuginone. // Prostate (2002) 51. 73.

87. Dvorak Z., Vrzal R., Maurel P., Ulrichova J. Differential effects of selected natural compounds with anti-inflammatory activity on the glucocorticoid receptor and NF-kB in HeLa cells. // Chem. Biol. Interact. (2006) 159. 117.

88. Li Y., Li X., Sarkar F.H. Gene expression profiles of I3C- and DIM-treated PC3 human prostate cancer cells determined by cDNA microarray analysis. // J. Nutr. (2003) 133. 1011.

89. Sarkar F.I I., Li Y. Indole-3-carbinol and prostate cancer. II J. Nutr. (2004) 134. 3493S.

90. Auphan N., DiDonato J.A., Rosette C., Helmberg A., Karin M. Immunosuppression by glucocorticoids: inhibition of NF-kB activity through induction of IkB synthesis. // Science (1995)270.286.

91. Scheinman R.I., Cogswell P.C., Lofquist A.K., Baldwin A.S., Jr. Role of transcriptional activation of IkB a in mediation of immunosuppression by glucocorticoids. II Science (1995) 270.283.

92. Ito K., Jazrawi E., Cosio B., Barnes P.J., Adcock I.M. p65-activated histone acetyltransferase activity is repressed by glucocorticoids: mifepristone fails to recruit HDAC2 to the p65-HAT complex. //./. Biol. Chem. (2001) 276. 30208.

93. Nissen R.M., Yamamoto K.R. The glucocorticoid receptor inhibits NF-kB by interfering with serine-2 phosphorylation of the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. // Genes Dev. (2000) 14. 2314.

94. Chiu F.-L, Lin J-K. Tomatidine inhibits iNOS and COX-2 through suppression ofNF-kB and JNK pathways in LPS-stimulated mouse macrophages. // FEBS Lett. (2008) 582. 2407.

95. Brooks P, Fuertes G, Murray R.Z, Bose S, Knecht E, Rechsteiner M.C, Hendil K.B, Tanaka K, Dyson J, Rivett J. Subcellular localization of proteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells. // Biochem. J. (2000) 346. 155.

96. Adams J, Behnke M, Chen S, Cruickshank A.A, Dick L.R, Grenier L, Klunder J.M, Ma Y.T, Plamondon L, Stein R.L. Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. // Bioorg. Med. Chem. Lett. (1998) 8. 333.

97. Adams J, Palombella V.J, Elliott P.J. Proteasome inhibition: a new strategy in cancer treatment. II Invest. New Drugs (2000) 18. 109.

98. Mack P.C, Davies A.M., Lara P.N, Gumerlock P.I1, Gandara D.R. Integration of the proteasome inhibitor PS-341 (Velcade) into the therapeutic approach to lung cancer. // Lung Cancer (2003) 41. S89.

99. Bold R.J, Virudachalam S, McConkcy DJ. Chemosensitization of pancreatic cancer by inhibition of the 26S proteasome. II J. Surg. Res. (2001) 100. 11.

100. Cusack J.C, Jr, Liu R, Houston M, Abendroth K, Elliott P.J, Adams J, Baldwin A.S, Jr. Enhanced chemosensitivity to CPT-11 with proteasome inhibitor PS-341: implications for systemic nuclear factor-KB inhibition. // Cancer Res. (2001) 61. 3535.

101. Adams J, Polombella V.J, Sausville E.A, Johnson J, Destree A, Lazarus D.D, Maas J, Pien C.S, Prakash S, Elliott P.J. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents. // Cancer Res. (1999) 59. 2615.

102. Meng L, Kwok B.H, Sin N, Crews C.M. Eponemycin exerts its antitumor effect through the inhibition of proteasome function. // Cancer Res. (1999) 59. 2798.

103. Meng L, Mohan R, Kwok B.H, Elofsson M, Sin N, Crews C.M. Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. // Proc. Natl. Acad Sci. USA (1999) 96. 10403.

104. Yamini B, Yu X, Dolan M.E, Wu M.H, Kufe D.W, Weichselbaum R.R. Inhibition of nuclear factor-KB activity by temozolomide involves 06-methylguanine induced inhibition of p65 DNA binding. // Cancer Res. (2007) 67. 6889.

105. Morishita R., Tomita N., Kaneda Y., Ogihara T. Molecular therapy to inhibit NF-kB activation by transcription factor decoy oligonucleotides. // Curr. Opin. Pharmacol. (2004) 4. 139.

106. Perry C.M., Balfour J.A. Fomivirsen. // Drugs (2001) 57. 375.

107. Wu G.S., Petersson S., Spiik A.K., Korsgren O., Tibell A. Antisense NF-kB p65 prolongs experimental alio- and xenograft survival. // Transplant. Proc. (2001) 33. 360.

108. D'Souza M.J., Jin Z., Oettinger C.W. Treatment of experimental septic shock with microencapsulated antisense oligomers to NF-kB. II J. Interferon Cytokine Res. (2005) 25. 311.

109. Neurath M.F., Pettersson S., Meyer zum Buschenfelde K.H., Strober W. Local administration of antisense phosphorothioate oligonucleotides to the p65 subunit of NF-kB abrogates established experimental colitis in mice. II Nat. Med. (1996) 2. 998.

110. Kim S.G., Kim J.S., Kim J.M., Chae Jung H., Sung Song I. Inhibition of proinflammatory cytokine expression by NF-kB (p65) antisense oligonucleotide in Helicobacter pylori-infected mice. // Helicobacter (2005) 10. 559.

111. Sun T., Song W.-G., Fu Z.-J., Liu Z.-H., Liu Y.-M., Yao S.-L. Alleviation of neuropathic pain by intrathecal injection of antisense oligonucleotides to p65 subunit of NF-kB. // Br. J. Anaesth. (2006) 97. 553.

112. Oettinger C.W., D'souza M.J., Akhavein N., Peer G.T., Taylor F.B., Kinasewitz G.T. Pro-inflammatory cytokine inhibition in the primate using microencapsulated antisense oligomers to NF-kB. // J. Microencapsul. (2007) 4. 337.

113. Zhaowei J., D'Souza M.J., Oettinger C.W. Reversal of LPS induced endothelial cell TNF synthesis and increased permeability with microencapsulated antisense oligomers to NF-kB. // J. Microencapsul. (2007) 24. 596.

114. Akhavein N., Oettinger C.W., Gayakwad S.G., Addo R.T., Bejugam N.K., Bauer J.D., Do D., Pollock S.H., D'Souza M.J. Treatment of adjuvant arthritis using microencapsulated antisense NF-kB oligonucleotides. // J. Microencapsul. (2008) 18. 1.

115. Khan A.U. Ribozyme: a clinical tool. // Clin. Chun. Acta. (2006) 367. 20.

116. Yang J., Pan W.H., Clawson G.A., Richmond A. Systemic targeting inhibitor of kB kinase inhibits melanoma tumor growth. // Cancer Res. (2007) 67. 3127.

117. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virusmediated RNA interference. // Science (2002) 296. 550.

118. Brummelkamp T.R., Nijman S.M., Dirac A.M., Bernards R. Loss of the cylindromatosis tumour suppressor inhibits apoptosis.by activating NF-kB. // Nature (2003) 424. 797.

119. Trompouki E., Hatzivassiliou E., Tsichritzis T., Farmer H., Ashworth A., Mosialos G. CYLD is a deubiquitinating enzyme that negatively regulates NF-kB activation by TNFR family members. // Nature (2003) 424. 793.

120. Guo J., Verma U.N., Gaynor R.B., Frenkel E.P., Becerra C.R. Enhanced chemosensitivity to irinotecan by RNA interference-mediated down-regulation of the nuclear factor-KB p65 subunit. // Clin. Cancer Res. (2004) 10. 3333.

121. Surabhi R.M., Gaynor R.B. RNA interference directed against viral and cellular targets inhibits human immunodeficiency Virus Type 1 replication. II J. Virol. (2002) 76. 12963.

122. Brisibe E.A., Okada N., Mizukami H., Okuyama H., Fujii Y.R. RNA interference: potentials for the prevention of HIV infections and the challenges ahead. // Trends Biotechnol. (2003) 7. 306.

123. Lee N.S., Rossi J.J. Control of HIV-1 replication by RNA interference. II Virus. Res. (2004) 102.53.

124. Laderach D., Compagno D., Danos O., Vainchenker W., Galy A. RNA interference shows critical requirement for NF-kB p50 in the production of IL-12 by human dendritic cells. //./. Immunol (2003) 171. 1750.

125. Dillon C.P., Sandy P., Nencioni A., Kissler S., Rubinson D.A., Van Parijs L. Rnai as an experimental and therapeutic tool to study and regulate physiological and disease processes. // Annu. Rev. Physiol. (2005) 67. 147.

126. Achenbach T.V., Brunner B., Heermeier K. Oligonucleotide-based knockdown technologies: antisense versus RNA interference. // Chembiochemistry (2003) 4. 928.

127. Duca M., Vekhoff P., Oussedik K., Halby L., Arimondo P.B. The triple helix: 50 years later, the outcome. //Nucl. Acids Res. (2008) 36. 5123.

128. Buchini S., Leumann C.J. Recent improvements in antigene technology. // Curr. Opin. Chem. Biol. (2003) 7. 717.

129. Seidman M.M., Glazer P.M. The potential for gene repair via triple helix formation. // J. Clin. Invest. (2003) 112. 487.

130. Torigoe H., Hari Y., Sekiguchi M., Obika S., Imanishi T. 2'-0,4'-C-methylene bridged nucleic acid modification promotes pyrimidine motif triplex DNA formation at physiological pH: thermodynamic and kinetic studies. II J. Biol. Chem. (2001) 276. 2354.

131. Lacoste J., Francois J.C., Helene C. Triple helix formation with purine-rich phosphorothioate-containing oligonucleotides covalcntly linked to an acridine derivative. // Nucl. Acids Res. (1997)25. 1991.

132. Hojland T., Kumar S., Babu B.R., Umemoto T., Albaek N., Sharma P.K., Nielsen P., Wengel J. LNA (locked nucleic acid) and analogs as triplex-forming oligonucleotides. // Org. Biomol. Chem. (2007) 5. 2375.

133. Roberts R.W., Crothers D.M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. II Science (1992) 258. 1463.

134. Lacroix L., Arimondo P.B., Takasugi M., Helene C., Mergny J.L. Pyrimidine morpholino oligonucleotides form a stable triple helix in the absence of magnesium ions. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 270. 363.

135. Grunweller A., Ilartmann R.K. Locked nucleic acid oligonucleotides: the next generation of antisense agents? // BioDrugs (2007) 21. 235.

136. Giovannangeli C., Helene, C. Progress in developments of triplex-based strategies. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7. 413.

137. Maher L.J., 3rd. Prospects for the therapeutic use of antigene oligonucleotides. // Cancer Invest. (1996) 14. 66.

138. Praseuth D., Guieysse A.L., Helene C. Triple helix formation and the antigene strategy for sequence-specific control of gene expression. // Biochim. Biophys. Acta (1999) 1489. 181.

139. Vasquez K.M., Wilson J.H. Triplex-directed site-specific genome modification. // Trends Biochem. Sci (1998)23. 4.

140. Hewett P.W., Daft E.L., Laughton C.A., Ahmad S., Ahmed A., Murray J.C. Selective inhibition of the human tie-1 promoter with triplex-forming oligonucleotides targeted to Ets binding sites. // Mol. Med. (2006) 12. 8.

141. Svinarchuk F., Nagibneva I., Cherny D., Ail-Si-Ali S., Pritchard L.L., Robin P., Malvy C., Harel-Bellan A., Chern D. Recruitment of transcription factors to the target site by triplex-forming oligonucleotides. // Nucl. Acids Res. (1997) 25. 3459.

142. Karympalis V., Kalopita K., Zarros A., Carageorgiou H. Regulation of gene expression via triple helical formations. // Biochemistry (2004) 69. 855.

143. Giovannangeli C., Helene C. Triplex-forming molecules for modulation of DNA information processing. // Curr. Opin. Mol. Ther. (2000) 2. 288.

144. Ebbinghaus S.W., Fortinberry H., Gamper H.B., Jr. Inhibition of transcription elongation in the HER-2/neu coding sequence by triplex-directed covalcnt modification of the template strand. // Biochemistry (1999) 38.619.

145. Giovannangeli C., Perrouault L., Escude C., Gryaznov S., Helene C. Efficient inhibition of transcription elongation in vitro by oligonucleotide phosphoramidates targeted to proviral HIV DNA. II J. Mol. Biol. (1996) 261. 386.

146. Perrouault L., Asseline U., Rivalle C., ThuongN.T., Bisagni E.,Giovannangeli C., Le Doan T., Helene C. Sequence-specific artificial photo-induced endonuclcases based on triple helix-forming oligonucleotides. II Nature (1990) 344. 358.

147. Strobel S.A., Dervan P.B. Site-specific cleavage of human chromosome 4 mediated by triple-helix formation. II Science (1990) 249. 73.

148. Francois J.C., Saison-Behmoaras T., Chassignol M., Thuong N.T., Helene C. Sequence-targeted cleavage of single- and double-stranded DNA by oligothymidylates covalently linked to 1,10-phenanthroline. II J. Biol. Chem. (1989) 264. 5891.

149. Bigey P., Pratviel G., Meunier B. Cleavage of double-stranded DNA by "metalloporphyrin-linker-oligonucleotide" molecules: influence of the linker. // Nucl. Acids Res. (1995) 23. 3894.

150. Landgraf R., Chen C.I I., Sigman D.S. R-loop stability as a function of RNA structure and size. // Biochemistry (1994) 33. 10607.

151. Pei D., Corey D.R., Schultz P.G. Site-specific cleavage of duplex DNA by a semisynthetic nuclease via triple-helix formation. 11 Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87. 9858.

152. Hearst J.E. Photochemistry of the psoralens. // Chem. Res. Toxicol. (1989) 2. 69.

153. Kean J.M., Miller P.S. Detection of psoralen cross-link sites in DNA modified by psoralen-conjugated oligodeoxyribonucleoside methylphosphonates. // Bioconjug. Chem. (1993)4. 184.

154. Grigoriev M., Praseuth D., Guieyssc A.L., Robin P., Thuong N.T., Helene C., Harel-Bellan A. Inhibition of gene expression by triple helix-directed DNA cross-linking at specific sites. // Proc. Nail. Acad Sci. USA (1993) 90. 3501.

155. Vickers T.A., Griffith M.C., Ramasamy K., Risen L.M., Freier S.M. Inhibition of NF-kB specific transcriptional activation by PNA strand invasion. // Nucl. Acids Res. (1995) 23. 3003.

156. Kochetkova M., Shannon M.F. DNA triplex formation selectively inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene expression in human T cells. II J. Biol Chem. (1996) 271. 14438.

157. Stuetz AM, Hoeck J, Natt F, Cuenoud B, Woisetschlaeger M. Inhibition of interleukin-4-and CD40-induced IgE germline gene promoter activity by 2'-aminoethoxy-modified triplex-forming oligonucleotides. II J. Biol. Chem. (2001) 276. 11759.

158. Obika S., Uneda T., Sugimoto T., Nanbu D., Minami T., Doi T., Imanishi T. 2'-0,4'-C-Methylene bridged nucleic acid (2',4'-BNA): synthesis and triplex-forming properties. // Bioorg. Med. Chem. (2001)9. 1001.

159. Gilmore T.D., Herscovitch M. Inhibitors of NF-kB signaling: 785 and counting. // Oncogene (2006) 25. 6887.

160. Griesenbach U., Scheid P., Hillery E., de Martin R., Huang, L., Geddes D.M., Alton E.W. Anti-inflammatory gene therapy directed at the airway epithelium. // Gene Ther. (2000) 7. 306.

161. Desmet C, Gosset P, Pajak B, Cataldo D, Bentires-Alj M, Lekeux P, Bureau F. Selective blockade of NF-kB activity in airway immune cells inhibits the effector phase of experimental asthma. // J. Immunol. (2004) 173. 5766.

162. Nakamura H, Aoki M, Tamai K, Oishi. M, Ogihara T, Kaneda Y, and Morishita R. Prevention and regression of atopic dermatitis by ointment containing NF-kB decoy oligodeoxynucleotides in NC/Nga atopic mouse model. II Gene Ther. (2002) 9. 1221.

163. Fichtner-Fiegl S, Fuss I.J., Preiss J.C, Strobcr W, Kitani A. Treatment of murine Thl- and Th2-mediated inflammatory bowel disease with NF-kB decoy oligonucleotides. //./. Clin. Invest. (2005) 115. 3057.

164. Xu M.Q, Suo Y.P, Gong J.P, Zhang M.M, Yan L.N. Prolongation of liver allograft survival by dendritic cells modified with NF-kB decoy oligodeoxynucleotides. // World J. Gastroenterol. (2004) 10. 2361.

165. Bielinska A, Shivdasani R.A, Zhang L.Q, Nabel G.J. Regulation of gene expression with double-stranded phosphorothioate oligonucleotides. II Science (1990) 25. 997.

166. Sharma H.W, Perez J.R, Higgins-Sochaski K, Hsiao R, Narayanan R. Transcription factor decoy approach to decipher the role of NF-kB in oncogenesis. // Anticancer Res. (1996) 16. 61.

167. King D.J, Bassett S.E, Li X, Fennewald S.A., Herzog N.K, Luxon B.A, Shope R, Gorenstein D.G. Combinatorial selection and binding of phosphorothioate aptamers targeting human NF-kB RelA(p65) and p50. // Biochemistry (2002) 41. 9696.

168. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M., DeDionisio L., Heidenreich O., Sullivan S., Xu X., Nerenberg M.I. Effect of phosphorothioate modification of oligodeoxynucleotides on specific protein binding. II J. Biol. Chem. (1994) 269. 26801.

169. Lebruska L.L., Maher L.J., 3rd. Selection and characterization of an RNA decoy for transcription factor NF-kB. // Biochemistry (1999) 38. 3168.

170. Cazenave C., Chevrier M., Nguyen T.T., Helene C. Rate of degradation of a.- and [P]-oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes. Implications for anti-messenger strategies. // Nucl. Acids Res. (1987) 15. 10507.

171. Chu B.C., Orgel L.E. Crosslinking transcription factors to their recognition sequences with Ptll complexes. // Nucl. Acids Res. (1992) 20. 2497.

172. Clusel C., Ugarte E., Enjolras N., Vasseur M., Blumenfeld M. Ex vivo regulation of specific gene expression by nanomolar concentration of double-stranded dumbbell oligonucleotides. // Nucl. Acids Res. (1993) 21. 3405.

173. Gao H.; Chidambaram N., Chen B.C., Pelham D.E., Patel R., Yang M., Zhou L., Cook A., Cohen J.S. Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide bridges. // Bioconjug. Chem. (1994) 5. 445.

174. Gao H., Yang M., Cook A.F. Stabilization of double-stranded oligonucleotides using backbone-linked disulfide bridges. // Nucl. Acids Res. (1995) 23. 285.

175. Zon G. Antisense Research and applications. // Eds. S.T. Crooke. 1993.

176. Cook P.D. Making drugs out of oligonucleotides: a brief review and perspective. // Nucleosides Nucleotides (1999) 18. 1141.

177. Lu K., Duan Q.P., Ma L., Zhao D.X. Chemical strategies for the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates. II Bioconjug. Chem. (2010) 21. 187.

178. Juby C.D., Richardson C.D., Brousseau R. Facile preparation of 3'-oligonucleotide-peptide conjugates. // Tetrahedron Lett. (1991) 32. 879.

179. Arar K., Aubertin A.M., Roche A.S., Monsigny M., Mayer R. Synthesis and antiviral activity of peptide-oligonucleotide conjugates prepared by using Na-bromoacetyl peptides. // Bioconjug. Chem. (1995) 6. 573.

180. Pichon C., Arar K., Stewart A.J., Dodon M.D., Gazzolo L., Courtoy P.L., Mayer R., Monsigny M., Roche A.C. Intracellular routing and inhibitory activity of oligonucleopeptides containing a KDEL motif. II Mol. Pharmacol. (1997) 51. 431.

181. Soukchareun S., Tregear G.W., Haralambidis J. The preparation and characterization of antisense oligonucleotide-peptide hybrids containing viral fusion peptides. // Bioconjug. Chem. (1995) 6.43.

182. Reed M.W., Frada D., Schwartz D.E., Scholler J., Hinrichsen R.D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates. // Bioconjug. Chem. (1995) 6. 101.

183. Koroleva L.S., Serpokrylova I.Y., Vlassov V.V., Silnikov V.N. Design and synthesis of metal-free artificial ribonucleases. // Protein & Peptide Letters (2007) 14. 151.

184. Niittymaki T., Lonnberg H. Artificial ribonucleases. // Org. Biomol. Chem. (2006) 4. 15.

185. Kachalova A.V., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Synthesis of oligonucleotide 2'-conjugates via amide bond formation in solution. // Bioorg. Med. Chem. Letters (2004) 14. 801.

186. Matulic-Adamic J., Beigelman L., Dudycz L.W., Gonzales C., Usman N. Synthesis and incorporation of 2'-amino acid conjugated nucleotides into ribozymes. // Bioorg. Med. Chem. Letters (1995) 5. 2721.

187. Smith Т., LaTour J., Bochkariov D., Chaga G., Nelson P. Bifunctional phosphoramidite reagents for the introduction of histidyl and dihistidyl residues into oligonucleotides. // Bioconjug. Chem. (1999) 10. 647.

188. Korshun V.A., Stetsenko D.A., Gait M.J. Novel uridine-2'-carbamates: synthesis, incorporation into oligodeoxyribonucleotides, and remarkable fluorescence properties of 2'-pyren-l-ylmethylcarbamate. // J. Chem. Soc., Perkin Trans I (2002) 1092.

189. Prhavc M., Lcsnik E.A., Mohan V., Manoharan M. 2'-0-carbamate-containing oligonucleotides: synthesis and properties. // Tetrahedron Lett. (2001) 42. 8777

190. Markiewicz W.T. Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl, a group for simultaneous protection of 3'- and 5'-hydroxy functions of nucleosides. II J. Chem Res. Synop. (1979) 24.

191. Beijer В., Groetli M., Douglas M., Sproat B. Simplified and cost effective syntheses of fully protected phosphoramidite monomers suitable for the assembly of oligo(2'-0-allylribonucleotides). II Nucleosides Nucleotides (1994) 13. 1905.

192. Sekine M., Hata T. Synthesis of short oligoribonucleotides bearing a 3'- or 5'-terminal phosphate by use of 4,4',4"-tris(4,5-dichlorophthalimido)trityl as a new 5'-hydroxyl protecting group. II J. Am. Chem. Soc. (1986) 108. 4581.

193. Groetli M., Eritja R., Sproat B. Solid-phase synthesis of branched RNA/DNA chimeras. // Tetrahedron (1997) 53. 11317.

194. Sekine M. General method for the preparation of AG- and 04-substiluted uridine derivatives by phase-transfer reactions. II J. Org. Chem. (1989) 54. 2321.

195. Зацепин T.C., Романова E.A., Орецкая T.C. Синтез 2'-О-ал ки л ну кл еоз идо к. // Успехи химии (2002) 71. 586.

196. Kachalova A.V., Zatsepin T.S., Romanova Е.А., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Synthesis of modified nucleotide building blocks containing electrophilic groups in the 2'-position. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids (2000) 19. 1693.

197. ChemFiles (Fluka) 2003, 3, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Fluka Riedel Home /Literature/ChemFiles/Vol 3 Nol.html.

198. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Synthesis of 2'-0-2-[(N,N-dimethylamino)oxy.ethyl]modified nucleosides and oligonucleotides. // J. Org. Chem. (2002) 67. 357.

199. Maglott E.J., Glick G.D. Probing structural elements in RNA using engineered disulfide cross-links. // Nucl. Acids Res. (1998) 26. 1301.

200. Dobson N., McDowell D.G., French D.J., Brown L.J., Mellor J.M., Brown T. Synthesis of HyBeacons and dual-labelled probes containing 2'-fluorescent groups for use in genetic analysis. // Chem. Comm. (2003) 11. 1234.

201. Cuenoud B., Casset F., Huesken D., Natt F., Wolf R.M., Atmann K-H., Martin P., Mozer H.E. Dual recognition of double-stranded DNA by 2'-aminoethoxy-modified oligonucleotides. // Angew. Chem. Int. Ed. (1998) 37. 1288.

202. Soai K., Oyamada H., Takase M., Ookawa A. Practical procedure for the chemoselective reduction of esters by sodium borohydride. Effect of the slow addition of methanol. // Bull. Chem. Soc. Jpn. (1984) 57. 1948.

203. Caruthers M.H., Barone A.D., Beaucage S.L., Dodds D.R., Fisher E.F., McBride L.J., Matteucci M., Stabinsky Z., Tang J.-Y. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. // Methods Enzymol. (1987) 154. 287.

204. Podyminogin M.A., Vlassov V.V., Giege R. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts. // Nucl. Acids Res. (1993) 21.5950.

205. Tung C.H., Wei Z., Leibowitz M.J., Stein S. Design of peptidc-acridine mimics of ribonuclease activity. II Proc. Natl. Acad Sci. USA (1992) 89. 7114.

206. Breslow R., Labelie M. Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidazole. HJ. Am. Chem. Soc. (1986) 108. 2655.

207. Raines R.T. Active site of ribonuclease A. // Chem. Rev. (1998) 98. 1045.

208. Murray J.B., Terwey D.P., Maloney L., Karpeisky A., Usman N., Beigelman L., Scott W.G. The structural basis of hammerhead ribozyme self-cleavage. // Cell (1998) 92. 665.

209. Ilertel K.J., Herschlag D., Uhlenbcck O.C. A kinetic and thermodynamic framework for the hammerhead ribozyme reaction. II Biochemistry (\994) 33. 3374.

210. Scott W.G., Finch J.T., Grenfell R„ Fogg J., Smith T., Gait M.J., Klug A. Rapid crystallization of chemically synthesized hammerhead RNAs using a double screening procedure. II J. Mol. Biol. (1995) 250. 327.

211. Hall J., Huesken D., Haener R. Towards artificial ribonucleases: the sequence-specific cleavage of RNA in a duplex. II Nucl. Acids Res. (1996) 24. 3522.

212. Mironova N.L., Pyshnyi D.V., Shtadler D.V., Fedorova A.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. RNase T1 mimicking artificial ribonuclease. // Nucl. Acids Res. (2007) 35. 2356.

213. Zatsepin T.S., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Use of carbonyl group additionelimination reactions for synthesis of nucleic acid conjugates. // Bioconjug. Chem. (2005) 16. 471

214. Zendegui J.G., Vasquez K.M., Tinsley J.H., Kessler D.J., Hogan M.E. In vivo stability and kinetics of absorption and disposition of 3' phosphopropyl amine oligonucleotides. II Nucl. Acids Res. (1992) 20. 307.

215. Ririe K.M., Rasmussen R.P., Wittwer C.T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. // Anal. Biochem. (1997) 245. 154.

216. Grimm S., Baeuerle P.A. The inducible transcription factor NF-kB: structure-function relationship of its protein subunits. // Biochem. ./. (1993) 290. 297.

217. Saccani S., Pantano S., Natoli G. Modulation of NF-kB activity by exchange of dimers. // Mol. Cell. (2003) 11. 1563.

218. Chen Y.Q., Ghosh S, Ghosh G. A novel DNA recognition mode by the NF-kB p65 homodimer. I I Nat. Struct. Biol. (1998) 5. 67.

219. Chen F.E., Huang D.B., Chen Y.Q., Ghosh G. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-kB bound to DNA. II Nature (1998) 391. 410

220. Smith D., Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutathione S-transferase. // Gene (1988) 67. 31.

221. Lumley M, Hart D.J., Cooper M.A., Symeonides S., Blackburn J.M. A biophysical characterisation of factors controlling dimerisation and selectivity in the NF-icB and NFAT families. II J. Mol. Biol. (2004) 339. 1059.

222. Nijnik A., Mott R., Kwiatkowski D.P., Udalova I.A. Comparing the fine specificity of DNA binding by NF-кВ p50 and p52 using principal coordinates analysis. // Nucl. Acids Res. (2003) 31. 1497.

223. Kunsch C., Ruben S.M., Rosen C.A. Selection of optimal кВ/Rel DNA-binding motifs: interaction of both subunits ofNF-кВ with DNA is required for transcriptional activation. // Mol. Cell Biol. (1992) 12.4412.

224. Zabel U., Schreck R., Baeuerle P.A. DNA binding of purified transcription factor NF-кВ. Affinity, specificity, Zn2+ dependence, and differential half-site recognition. // J. Biol. Chem. (1991) 266. 252.

225. Urban M.B., Schreck R., Baeuerle P.A. NF-кВ contacts DNA by a heterodimer of the p50 and p65 subunit. // EMBO J. (1991) 10. 1817.

226. Phelps C.B., Sengchanthalangsy L.L., Malek S., Ghosh G. Mechanism of kB DNA binding by Rel/NF-кВ dimers. //,/. Biol. Chem. (2000) 275. 24392.

227. Hart D.J., Speight R.E., Cooper M.A., Sutherland J.D., Blackburn J.M. The salt dependence of DNA recognition by NF-кВ p50: a detailed kinetic analysis of the effects on affinityand specificity. И Nucl. Acids Res. (1999) 27. 1063.

228. Судьина A.E., Зацепин T.C., Пингоуд В., Пингоуд А., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции SsoII ДНК-дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу. //Биохимия (2005) 70. 1137.

229. Романенков A.C., Устюгов A.A., Зацепин Т.С., Никулова A.A., Колесников И.В., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // Биохимия (2005) 70. 1474

230. Michel F., Crucifix С., Granger F., Eiler S., Mouscadet J.F., Korolev S., Agapkina J., Ziganshin R., Gottikh M., Nazabal A., Emiliani S., Benarous R., Moras D., Schultz P., Ruff M.

231. Structural basis for HIV-1 DNA integration in the human genome, role of the LEDGF/P75 cofactor. UEMBOJ. (2009) 28. 980.

232. Haynes S.R. // RNA-Protein Interaction Protocols / Humana Press. 1999.

233. Wang Z, Wang X, Rana TM. Protein orientation in the Tat-TAR complex determined by psoralen photocross-linking. // J. Biol. Chem. (1996) 271. 16995.

234. Bochkareva E, Korolev S, Lees-Miller S.P, Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. // EMBO J. (2002) 21. 1855.

235. Zhao X, Herr W. A regulated two-step mechanism of TBP binding to DNA: A solventexposed surface of TBP inhibits TATA box recognition. // Cell (2002) 108. 615.

236. Wenz C, Jeltsch A, Pingoud A. Probing the indirect readout of the restriction enzyme EcoRW. И J. biol. chem. (1996) 271. 5565

237. Ferreiro D.U, Sanchez I.E., de Prat G.G. Transition state for protein-DNA recognition. // PNAS (2008) 105. 10797.

238. Hart D.J, Speight R.E, Cooper M.A, Sutherland J.D, Blackburn J.M. The salt dependence of DNA recognition by NF-кВ p50: a detailed kinetic analysis of the effects on affinity and specificity. // Nucl. Acids Res. (1999) 27. 1063.

239. Романенков А.С. ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффииой модификации остатков цистеина и лизина белков. //Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2006.

240. Rohs R, Jin X, West S.M, Joshi R, Honig B, Mann R.S. Origins of specificity in proteinDNA recognition. // Anmi. Rev. Biochem. (2010) 79. 233.

241. Somers D.J, Langridge P, Gustafson J.P. // Methods in Molecular Biology, Plant Genomics / Humana Press. 2009.

242. Kalodimos C.G, BirisN, Bonvin A.M., Levandovski M.M, Guennuegues M, Boelens R, Kaptein R. Structure and flexibility adaptation in nonspecific and specific protein-DNA complexes. II Science (2004) 305. 386.