Пространственная структура эктатомина, порообразующего токсина из яда муравья Ectatomma tuberculatum тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук

ордена трудового красного знамени институт биоорганическои химии им. м.м.шемякина и ю.а.овчинникова

На правах рукописи

НОЛЬДЕ Дмитрий Евгеньевич

пространственная структура эктатомина, п0р00бразувдег0 токсина из яда муравья

Ectatomma tuberculatum

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

автореферат

диссертации на сойскание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в груше ядерного магнитного резонанса Института Оиоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Защита состоится " 23 " ноября 1994 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.35.01 при Институте Оиоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГС 11-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

доктор химических наук

А.С.Арсеньев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, вед.н.с. кандидат химических наук, с.н.с.

В.Н.Бушуев Ю.Н.Уткин

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, Химический факультет

Автореферат разослан " 21 " октября 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

Актуальность проблемы. В настоящее время одно из центральных мест в современной биоорганической химии занимает вопрос о механизмах проникновения внутрь или переносе через клеточные мембраны различных биологических макромолекул (например, белков). Эти процессы сопровождаются значительными изменениями пространственной структуры участвующих в них белков. Детальные механизмы кон-формационных изменений представляют интерес как с точки зрения механизма функционирования отдельных белков, так и для изучения более общих процессов структурной реорганизации белков (например, сворачивание их нативной структуры).

В этой связи представляют интерес структурные аспекты функционирования порообразующих,токсинов. Токсины этого семейства -белковые молекулы, образующие при взаимодействии с мебранами ионные каналы. Характерной особенностью строения порообразующих белков является существование двух различных форм их пространственной организации: водорастворимой и мембранной. Для выяснения механизма их функционирования необходимо определить пространственную организацию молекулы как в водной среде, так и в мембране.

I

Ранее в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН был впервые выделен и охарактеризован основной токсический компонент яда муравья Ectatomma tuberculatum, нэзванный эктэто-мином. Эктатомин обладает очень высокой токсичностью: летальная доза при внутримозговом введении мышам составляет 6,8 мкг/кг.' Показано, что эктатомин обладает каналообразущей активностью.

Цель работы. Установление пространственной структуры эктато-мина в водном растворе, а также исследование конформационной возможности образования эктатомином мембранного канала.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании данных 'н-ЯМР спектроскопии определено положение дисульфидных связей и впервые получена детальная пространственная структура эктатомина в водном растворе. Показана возможность встраивания эктатомина в мембрану без изменения вторичной структуры. Предложена модель образования эктатомином мембранного канала. Полученные результаты позволяют лучше понять связь структуры и функции токсинов, механизмы процессов, происходящих при встраивании водорастворимых белков в мембрану, а также позволят более целенаправленно вести дальнейшие исследования механизмов токсического действия эктатомина.

Аппробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на 9-ом двустороннем Российско-Германском симпозиуме по химии белков и пептидов (Пущино, Россия, 1994) и на 3-ей мевдународной конференции молодых ученых по молекулярной биотехнологии (Аскона, Швейцария, 1994). Полученный набор структур эктатомина депонирован в Брукхевенскую Базу Данных по пространственным структурам белков. По теме диссертации опубликовано две статьи.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, экспериментальной части и выводов. В первой главе, являющейся литературным обзором, рассмотрены работы, посвященные порообразувдим токсинам, исследованию их структуры и функции, а также проведен анализ преимуществ и недостатков различных физико-химических методов, использованных в этих исследованиях. Во второй главе диссертации изложены отнесение сигналов в спектрах 'н-ЯМР эктатомина и расчет пространственной структуры молекулы по данным спектрскопии ЯМР. Третья глава посвящена исследованию возможностей реорганизации белка при встраивании в мембрану и

построению модели ионного канала. В экспериментальной части приведены сведения об используемых в диссертационной работе оборудовании, веществах, методах получения и обработки спектров 'н-ЯМР, а также методах расчетов. Диссертация изложена на 146 страницах, содержит 31 рисунок и 8 таблиц, список цитированной литературы содержит 136 названий.

Пространственная структура эижтожияа б бодном растворе.

Для того чтобы рассчитать пространственную структуру эктато-мина по данным спектроскопии ЯМР, на первом этапе проведено отнесение сигналов в спектрах к положению в аминокислотной последовательности. Данная процедура состояла из двух частей: идентификации спиновых систем и последовательного отнесения сигналов. На начальном этапе отнесения выделены сигналы спиновых систем отдельных аминокислотных остатков эктатомина в двумерных спектрах оок-собу (корреляционная спектроскопия с двухквантовым фильтром) и тосз¥ (тотальная корреляционная спектроскопия) снятых при 30°С. Сравнение спектров ггоебу, снятых при 10 и 30°с, позволило идентифицировать положение соответствующих спиновых систем в спектрах, снятых при 10°с. Отнесение сигналов к определенному положен™ остатков в первичной структуре выполнено путем анализа а - и ^-связей ядерного эффекта Оверхаузера

(ЯЭО) между амидными протонами Ц+1)-го остатка и, соответственно, протонами сан, сцн и нн предыдущего по последовательности 1-го остатка (рис. I). В качестве стартовых точек для последовательного отнесения были взяты сигналы 6 остатков треонина (положения в аминокислотной последовательности (10, 14, 28, 3', 8' и 26', здесь и далее штрих после номера остатка означает принад-

и,х+З) (1,1 + 4) с!ам (1,1+3)

и,1+1)

с!вч (1, 1+1) (1,1 + 1) н-и обмен

а-спираль

■ • В • • м В В я » _ • • ■ ■

• • м ■ ш • • — ш

• • ■ ■ Ш яя т — ■ т ■ • • и т т • • ■

• ■ В В ■ В К В ■ В В В ■ В в • • • В В ш в в • • В В В • в

в ■ • • I ■ а I • ■ ■ В • • ■ ■ в • ■ * ■ В т ■ * • • ш ■ ■

■ • ■ ■ • • • аш шш • ■ • В в • в а • • т ■ ■ ■ ■ __I

X X X X X X X X X X X X X X X X

1 5 10 79 25 .....39. 35 37

н-о обмен <1в!1 ЦД+П <1,1+1) (±,1+1) аа„(1,1+з)

аоЧ (1,1+4) а аВ (1,1+3)

я-сптоаль

ЕШЕИЕ

а-сшталъ~

«-едтяд,

иггпкт сртькбмакксеобгатмткккс е к

1' 5- ' J

10'

х х х х х

.>11

■ • В ■ ■

1Ь* 20'

X X X X X

• I . . ш ■ . ■ • ■!■■■• •

■ наш ■ ■ ■ ■

■ ■■■■* ■■■ а.11 • II. '

"м* н • • ■ — « ■

« « • • • щ

• < • и • • • * ' I I 1 ' ' '

25" 30' 34'

X X X X X X X

■ -

I I

«

■

Рис. 1. Аминокислотная последовательность цепей а (вверху) и в (внизу) эктатомина, положение дисульфидных связей и карта й-связей с участием га, с0^ и с^н (протоны свн остатков пролина рассматривались как протоны кн). Высота закрашенных прямоугольников характеризует интенсивности кросс-пиков ЯЭО в спектре коебу. Кружком отмечены а-связи, которым соответствуют перекрытые кросс-пики ЯЭО. В правой части диаграммы показан набор а-связей, характерных для канонической правой о—спирали. Прямоугольниками отмечены а—спиральные участки молекулы эктатомина, крестиками обозначены остатки с замедленным обменом протонов га на дейтерий растворителя. Положение дисуль4идных связей определено по результатам предварительного расчета структуры (табл. 1).

Рис. 2. Фрагмент спектра tocsy (« = 2,8 - 5,5 м.д., ч, = 6,5 -9,4 м.д.) эктатомина в юде (зо°с, рн=з,о). Показано отнесение кросс-пиков nh/c0^ для всех остатков, а также кросс-пиков га/с^н для остатков ser и Thr. Здесь и далее использовано одаобуквенное обозначение аминокислотных остатков, штрих после номера остатка означает принадлежность остатка цепи в. Неподписанные кросс-пики соответствуют боковым цепям остатков Lys и Arg, а также пикам nh/c^h других остатков.

- б -

лежносгь остатка к цепи в), спиновые системы которых были идентифицированы благодаря наличию характерных кросс-пиков в областях ын - сан (рис. 2) и сан - алифатические протоны; а также 4 ароматических остатков туггэ, тгрв, тгр18 и тгр1', которые были однозначно идентифицированы из-за характерных кросс-пиков в ароматической области спектра. Для отнесения сигналов использовались спектры, зарегистрированные при температуре 10 и 30°с.

Анализ аа(|-, и а^-связей позволил на этом этапе установить в общих чертах вторичную структуру эктатомина. На рис. I представлена карта а-связей. Анализ ЯЭО-контактов мевду протонами основной цепи и местоположение остатков с замедленной скоростью обмена амидных протонов с растворителем (рис. I) позволил определить участки «-спирали и водородные связи, принимающие участие в ее образовании. Вторичная структура обеих цепей эктатомина характеризуется двумя «-спиральными участками (ьуБ5-А1а19

И Аар25-СуБ34, ЦеПЬ А; ТЬгЗ'-А1а17' И БеггЗ'-СуБ32', ЦвПЬ В) С

короткой перемычкой между ними.

Для наиболее полного учета всех экспериментальных данных кросс-пики однозначно отнесенные в спектрах яоеэу были проинтегрированы. На этом этапе однозначно отнесено было 692 кросс-пика. Среди них было 448 внутриостаточных контактов, 172 контакта между соседними остатками, 51 контакт между средне-удаленными по аминокислотной последовательности остатками, в контактов мевду удаленными остатками и 13 межцепочечных.

Процедура расчета пространственной структуры эктатомина по данным спектроскопии ЯМР включала в себя шесть этапов: (I) анализ локальной пространственной структуры с помощью программы соыгоииш для расчета ограничений на углы <р, ф и (2) предва-

рительный расчет пространствешой структуры с помощью дистанционного геометрического алгоритма (программа diana); (3) полуавтоматическое переотнесение кросс-пиков noesy на основе полученных структур; (4) точное вычисление ограничений на межпротонные расстояния, полученных из спектров noesy, с использованием программы mardigras; (5) расчет набора конформаций программой diana с уточненными ограничениями на межпротонные расстояния; (6) энергетическая минимизация полученных структур с помощью программы charmm. Для устранения ошибок в отнесении кросс-пиков и более полного учета данных ЯЭО набор структур, полученных на стадии 5, использовался для проверки и уточнения отнесения кросс-пиков ЯЭО. Таким образом, до получения самосогласованного отнесения всех кросс-пиков ЯЭО после стадии 5 вычисления возобновлялись со стадии 3.

Локальная структура эктатомина получена путем согласования полной матрицы релаксации протонов кавдого из дипептидных фрагментов, включающих протоны данного остатка и hn протон следующего по последовательности аминокислотного остатка, с экспериментальными интенсивностями кросс-пиков noesy. Диапазоны значений углов <р, х1 и х ограничивали областью, в пределах которой хорошо согласуются экспериментальные и расчетные интенсивности кросс-пиков ЯЭО и не нарушаются стерические ограничения. В результате получено 126 ограничений на торсионные углы (58 на *>, 42 на ф, 17 на х1 и 9 на х2).

Для предварительного расчета трехмерной структуры эктатомина ограничения на межпротонные расстояния определяли путем эмпирической калибровки, основанной на 1/г6 зависимости объема кросс-пика от межпротонного расстояния. Для определения конформации пептидной связи между пролином и предпролиновым остатком торси-

Таблица I.

Анализ расположения дисульфидных связей в эктатомине.

Номер остатка 12 22 34 10' 20' 32'

12 9,07 1,84 14,0 8,58 11,4

22 15,7 14,6 14,8 1,88 10,3

34 6,04 19,2 14,4 16,2 13,7

10' 15,3 17,3 16,7 15,6 4,23

20' 16,3 2,14 19,8 18,0 11,7

32' 13,8 14,6 17,8 10,8 14,6

В таблице приведены минимальные (над диагональю) и средние (под диагональю) значения расстояний (в А) между se атомами остатков цистеина для набора из 10 структур, полученных после предварительного расчета программой diana. Подчеркнутые значения соответствуют идентифицированным дисульфидным связям.

онные углы и всех предпролиновых остатков не фиксировались. В результате был получен набор из 20 структур с достаточно низкими значениями штрафных функций. Анализ распределения углов и предпролиновых остатков показал, что все пептидные связи х-рго транс-конфигурацию.

В аминокислотной последовательности эктатомина присутствуют 6 остатков цистеина, но при этом отсутствуют свободные сульфгид-рильные группы. На основе анализа распределения расстояний между

о

sp атомами остатков цистеина в наборе конформаций, полученных в результате предварительного расчета (Табл.1) сделан вывод, что в молекуле реализуется следующий набор дисульфидных связей: сувгг-

Cys20', Cysl2-Cys34 И CyslO'-Cys32'.

Для проверки и уточнения отнесения кросс-пиков, которые на

предыдущем этапе рассматривались как неоднозначные, полученный программой diana набор из 10 конформаций использовался для полуавтоматической корректировки отнесения кросс-пиков. На основе отнесения сигналов протонов с помощью программы easy для кавдого кросс-пика в спектре noesy получали набор возможных отнесений. Затем из набора удаляли те отнесения, для которых расстояния между соответствующими протонами во всех полученных структурах

превышали 6 А. В случае, когда у кросс-пика оставалось несколько

¡

вариантов отнесения, отнесение проводилось вручную, основываясь на точных значениях химических сдвигов, форме линий в сечениях кросс-пика и распределении межпротонных расстояний в наборе конформаций, полученном программой diana на предыдущем этапе. Набор кросс-пиков, уточненный в результате описанной выше процедуры, после интегрирования использовался для вычисления более 'точных ограничений на расстояния (с учетом эффекта спиновой диффузии) и последующего расчета пространственной структуры с помощь'ю дистанционного алгоритма. Процедура корректировки отнесения)кросс-

I

i

пиков ЯЗО и расчет структуры программой diana повторяли десять раз, и при последней итерации отнесение всех кросс-пиков осталось неизменным. В результате получен набор из 969 однозначно отнесенных кросс-пиков (555 внутриостаточных, 201 между соседними, ПО - мевду средне-удаленными, 36 - между удаленными остатками и 67 межцепочечных).

Для более точного вычисления ограничений на межпротонные расстояния использовали алгоритм mardigras, основанный на анализе полной матрицы релаксации протонов молекулы. Для учета зависимости результата расчета программой mardigras от начальной структуры расчет проводил! 10 раз с использованием различных конформаций, полученных на предыдущем этапе, в качестве старто-

вых. Если ограничения на расстояние между парой протонов были определены как минимум при 7 расчетах программой mardigras, то в качестве ограничений сверху и снизу использовали, соответственно, максимальные и минимальные полученные значения. Число ограничений, полученных программой mardigras, меньше чем число однозначно отнесенных кросс-пиков ЯЭО, так как некоторые кросс-пики соответствуют протонам, находящимся на фиксированном расстоянии друг от друга, а для некоторых низкоинтенсивных кросс-пиков расстояния не были найдены из-за большой спиновой диффузии. На последнем этапе получено 755 ограничений сверху и снизу на межпрогонные расстояния (404 внутриостаточных, 178 между соседними, 92 между среднеудаленными и 29 между удаленными остатками и 52 межцепочечных ).

Для определения стереоспецифического отнесения протонов ме-тиленовых и изопропильных метильных групп использовали программу glomsa, а для /з-метиленовых групп остатков, для которых была оценена одна из констант 3JHCa_c|3H. стереохимическое отнесение проводилось вручную, если к этому времени определился угол х1 этого остатка. К последней стадии расчета установлено стереохимическое отнесение для двух а-, 28 э-, 7 у- и 3 б-метиленовых групп, a также грех изопропильных групп. Окончательный набор из 20 структур эктатомина рассчитан программой diana с учетом информации о всех стереохимических отнесениях, ограничениях на межпротонные расстояния, рассчитанных программой mardigras, а также о положении водородных и дисульфидных связей.

Для последующей минимизации конформационной энергии полученного набора структур использовалась программа charmm. Минимизация проводилась без ограничений на межпротонные расстояния и торсионные углы. В результате получен набор из 20 структур экта-

Цепь а

Цепь В

10 20 30 37 1'

Номер остатка

1||...{,.!......1..:,..!.....Н'.'н

ю' го' зо" 34'

Номер остатка

Рис. з. Углы <р, ф, и х1 аминокислотных остатков в 20 энергетически уточненных структурах эктатомина.

Рис. 4. Стереоизображение 20 структур эктатомина, совмещенных по тяжелым атомам основной цепи участков ьуэ5-су534 и тагэ'-суБ32': а) тяжелые атомы основной цепи и остатков пролина; б) все тяжелые атомы участков совмещения.

Таблица 2.

Значения попарного среднеквадратичного отклонения. (СКО) положения тяжелых атомов в наборе из 20 структур эктатомина.

Участок Основная цепь Все тяжелые атомы

1-37 И 1'—34' 1, ,25 + 0,27 1,84 + 0,28

5-34 И 3'-32' 0, ,75 + 0,21 1,38 + 0,19

5-34 0, ,46 + 0,14 1,17 + 0, 17

3'-32' 0, ,77 + 0,22 1,41 + 0,23

томина, согласующихся с данными ЯМР и обладающих низкой энергией. распределение торсионных углов <р, ф и характеризующее точность определения структуры, приведено на рис. 3. Значения среднеквадратичного отклонения атомов при совмещении по различным участкам структуры приведены в таблице 2. На рис. 4 показано стереоизображение полученного набора структур.

Из рис. 3 и 4 видно, что конформация основной цепи хорошо

определилась На а-СПИраЛЬНЫХ участках (Lys5-Lys20 И Asp25-Gly35 цепи а, тьгз' - Lysis' и ser23' - cvs32' цепи в). Основная цепь на петлевых участках (Lys21 - Gly24 цепи а и Lysl9' - Gly22' цепи в) имеет несколько конформаций, a n- и с-концевыз участки обеих цепей подвижны. Из-за высокой степени гомологии в первичной последовательности двух цепей эктатомина (рис. I) наблюдается гомология и в их пространственном строении. Каждая цепь образует "шпильку" из двух антипараллельных спиралей, соединенных короткой петлей из 4 остатков. При этом остатки cys22, ser23, cys20' и Giu2i' находятся в развернутой конформации. Таким обра-

зом, поворот полипептидной цепи происходит плавно, без образования э-изгиба. Этим объясняется быстрый дейтерообмен амидных протонов этого участка. Все медленно обменивающиеся амидные протоны находятся на «-спиральных участках молекулы и участвуют в образовании водородных связей типа ш1-о14 типичных для «-спиралей.

Все четыре спирали эктатомина амфифильны. Спираль ьуээ-ьузго содержит два остатка пролина (рго1з и рго17), которые сильно нарушают «-спиральную структуру. Остаток пролина препятствует образованию двух а-спиральных водородных связей (этим объясняется быстрый дейтерообмен амидных протонов следующих после пролина остатков). В результате спираль изгибается. Оба остатка пролина вызывают изгиб спирали на £40° (присутствие пролина в спирали белка обычно вызывает изгиб на £30°). Так как два остатка пролина находятся на одной стороне спирали, суммарный изгиб составляет 280°. Спираль тьгз'-А1а17' также имеет изгиб на ¡¡ЗО", вызываемый остаком Ргои'. Следует заметить, что присутствие пролина в спирали вызывает разрыв двух водородных связей, сопровождаемый тем, что карбоксильные группы 1-4-го и д.-з-го остатков (где 1 -номер остатка пролина), а также амидная группа 1+1-го остатка экспонируются в растворитель. В результате пролин ведет себя как гидрофильный остаток. Этим объясняется, почему остатки пролина располагаются на гидрофильных поверхностях спиралей.

Три внутримолекулярные дисульфидные связи играют важную роль в поддержании структуры белка. Две внутрицепочечные дисульфидные связи (суз12-сузз4 и сузю'-суэзг') соединяют концы антипараллельных «-спиралей и стабилизируют структуру "шпильки". Межцепочечная дисульфидная связь соединяет петлевые участки, не образующие регулярных вторичных структур, то есть довольно подвижные. Таким образом, взаимное расположение двух цепей молекулы стаби-

лизируется электростатическими, гидрофобными и другими невалентными взаимодействиями между спиралями.

Из-за большого числа остатков лизина основная часть поверхности молекулы заряжена положительно. Это делает возможным взаимодействие эктатомина с отрицательно заряженными молекулами (например, липидами). Боковые цепи всех остатков лизина экспонированы в растворитель и, по всей видимости, подвижны. Подвижность же неполярных боковых цепей, формирующих гидрофобное ядро молекулы, сильно ограничена из-за взаимодействия а-спиралей.

Как видно из рис. 4 третичная структура эктатомина образована 4 плотноупакованными a-спиралями (структура типа 4-спиральной связки). При этом любые две соседние спирали антипараллельны, а оси спиралей в сечении перпендикулярной плоскостью образуют ромб и наклонены друг к другу таким образом, что 4-спиральная связка имеет левую закрутку. Именно такая упаковка 4 взаимодействующих спиралей чаще всего встречается в бежах и является энергетически оптимальной.

Модель транслелбранной поры.

Все четыре спирали эктатомина амфифильны (гидрофобные моменты спиралей Lys5-Lys20, Asp25-Gly35, Thr3'-Lysl8' И Ser23'-Cys3 2' равны, соответственно, О,54, О,59, 0,25 И 0,40) и имеют низкую (по модулю) степень гидрофобности. Подобные спирали распространены в бежах и пептидах, взаимодействующих с поверхностью мембраны, таких как меллитин, 5-гемолизин. Также как мелли-тин и 6-гемолизин эктатомин обладает каналообразующей активностью - образует поры как в мембране ооцитов in vivo, так и в би-слойных липидных мембранах in vitro (Плужников и соавт., 1994).

Проводимость одиночной поры в бислойной лшшдной мембране составляет 70 пСм (150 мМ Nací, рн 7,4). Пора более проницаема для катионов, чем для анионов (РНа*/РС1-=2). Образование поры является потенциал-зависимым и происходит только при положительном цис-потенциале, что соответствует физиологическим условиям. Равновесная мембранная проводимость при концентрациях бежа 0,01 -0,1 мкМ пропорциональна квадрату концентрации, то есть в образовании поры участвуют две молекулы эктатомина (Плужников и со-авт., 1994).

Для получения данных о конформации порообразугацих токсинов в мембране часто используются органические растворители. В настоящей работе в качестве среды, моделирующей мембранное окружение белка, использовали метанол и смесь метанол/хлороформ (I/I). На основе анализа спектров КД эктатомина в воде и метаноле сделан вывод о сохранении эктатомином в метаноле вторичной структуры, характерной для водного раствора. Большое число кросс-пиков между амидными протонами в спектре noesy эктатомина в смеси хлороформ/метанол (рис. 5) свидетельствуют о том, что и в этом растворителе преобладающим типом вторичной структуры эктатомина остается a-спираль.

Как следует из спектров ЯМР (рис. 6), третичная структура эктатомина в органических растворителях сильно отличается от структуры, присущей белку в водном растворе. Вероятно, такие же изменения происходят и при взаимодействии белка с мембраной. Как уже отмечалось, относительное положение а-спиралей, находящихся в одной полипептидной цепи, стабилизируется дисульфидной связью. Поэтому представляется маловероятным, .чтобы оно изменилось при изменении окружения белка. Взаимная же упаковка двух цепей изменяется, так как она стабилизируется, в первую очередь, за счет

СО, м.д.

I Г

8 7

<1)1 м.д.

-7

-8

-9

Рис. 5. Область ян/ян (и , иг = 6,5 - 9,6 м.д.) спектра лоезу (время обмена компонент намагниченности 200 мс) эктатомина в смеси cdci.zcd.oh (1:1), зо°с.

Ч ' ' ' ' I ' ' 1 М ' ' ' М 1 ' 1 ' | ■ ' ' ■ I 8,5 8,0 7,5 7,0 «,5 М.Д.

10,5 10,0 9,5 9,0

Рис. 6. Область ароматических и амидных протонов (6,о - и,о м.д.) в спектре 'н-ЯМР эктатомина в нго (а), в со3он (0) и в смеси сос1з/созон (1:1) (в) при эо°с.

Рис. 7. Стереоизображение "развернутой" структуры эктатомина. а) все тяжелые атомы; 0) тяжелые атомы основной цепи всех остатков и боковых цепей заряженных остатков, а также остатков продана и цистеина.

невалентных взаимодействий. Неполярные молекулы разрушают гидрофобные взаимодействия, которые играют важную роль в стабилизации структуры эктатомина в воде. Две цепи эктатомина при этом расходятся, образуя развернутую амфифильную структуру. При этом в органических растворителях относительная подвижность двух цепей ограничена слабо, то есть третичная структура практически отсутствует и белок находится в состоянии "расплавленной глобулы". Этим объясняется маленькая дисперсия химических сдвигов сигналов среди отдельных типов протонов, наблюдаемая в спектрах 'н-ЯМР эктатомина в органических растворителях.

С помощью компьютерного моделирования получена "развернутая" структура эктатомина. Как видно из рис. 7, "развернутая" структура амфифильна: все остатки с заряженными боковыми цепями находятся на одной поверхности молекулы, а неполярные остатки - на противоположной. Конформационная потенциальная энергия "развернутой" молекулы несколько больше, чем у структуры, характерной для водного раствора (табл. 3). Возрастание энергии обусловлено нарушением межцепочечных взаимодействий и может быть компенсировано взаимодействиями с поверхностью мембраны и/или с молекулами растворителя. Небольшое увеличение энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий и незначительные изменения других вкладов в энергию подтверждают вывод о том, что взаимное положение двух цепей стабилизируется нековалентными взаимодействиями (в значительной степени гидрофобными).

Таким образом, при взаимодействии с поверхностью мембраны молекула эктатомина "разворачивается" и, скорее всего, образует на поверхности мембраны амфифильную структуру. Для образования поры, молекула (часть молекулы) должна проникнуть внутрь мембраны, при этом гидрофобные остатки должны быть экспонированы в

Таблица 3.

Значения конформационной энергии (кДж/моль) структуры экта-

томина в водном растворе (X) и "развернутой" структуры (и). е^ - суммарная энергия; етон - энергия ван-дер-ваальсовых взаимодействий; ес__, и епт11т - энергии, обусловленные

Б01ГО АпСиЕ РI НгП

нарушениями длин связей, валентных и торсионных углов соответственно; е1ИРВ - энергия, обусловленная нарушением хиральности ер3 и планарности зр2-гибридизованных атомов; е - электростатическая энергия.

структ. е е е е е е ег

тот в оно * ней: ШНЕ 1КРИ EI.EC

i -846 -1419 31,9 234 330 3,7 - -27

ii -795 -1347 31,0 232 309 3,3 -24

неполярную липидную фазу, а заряженные - в полость канала. Такая конформационная перестройка может произойти двумя путями: или за счет взаимодействия мевду гидрофильными поверхностями двух цепей одной молекулы образуется "вывернутая" четырехспиральная связка, или "развернутые" амфифильные молекулы олигомеризуются своими гидрофильными поверхностями. Так как длина одиночной а-спирали эктатомина (15-25 А) недостаточна для проникновения через всю толщину липидного бислоя (30 Я), то в первом случае также необходима олигомеризация белка. Учитывая результаты измерения равновесной мембранной проводимости, описанные выше, можно сделать вывод, что при встраивании эктатомина в мембрану происходит ди-меризация белка. Две молекулы эктатомина могут образовать димер несколькими способами. При этом число а-спиралей, находящихся в поперечном сечении канала, может быть равно 4, 6 или 8. Так как длина коротких спиралей эктатомина много меньше толщины липидного бислоя, димер, образующий в поперечном сечении 8 а-спиралей,

в

Рис. 8. Схема образования трансмембранной поры, а) неспеци$и-ческоз взаимодействие с мембраной; б) конформационная перестройка и прилипание "развернутой" молекулы к поверхности мембраны в отсутствии трансмембранного потенциала, в) и г) два возможных способа димеризации молекулы и образования поры под воздействием трансмембранного потенциала.

может образовать пору только при значительном утончении липидно-го бислоя, что представляется маловероятным. Димер с 4 спиралями в поперечном сечении может образовать канал без деформации ли-пидного бислоя, а димер с 6 спиралями лишь с незначительным его утончением. Диаметры пор, теоретически рассчитанные для 4 и 6 спиралей, равны 4 и 10 А соответственно. Оба значения удовлетворяют ограничению (>3,5 А), полученному на размер поры из проводимости одиночного канала.

На рис. 8 приведена возможная схема образования канала,, построенная на основе описанных выше рассуждений. Как и у других порообразугацих токсинов этот процесс включает несколько стадий. Первая стадия обусловлена неспецифичным взаимодействием положительно заряженной молекулы эктатомина с отрицательно заряженной мембраной (рис. 8а). Молекулы липида нарушают гидрофобные взаимодействия мевду двумя цепями эктатомина, две цепи расходятся, и на поверхности мембраны образуется амфифкльная "развернутая" структура (рис. 86). Трансмембранный потенциал (положительный с цис-стороны) вызывает дальнейшее проникновение молекулы в мембрану, происходит дамеризация эктатомина и образование поры. На рис. 8в,г показано два возможных варианта строения поры. К настоящему времени нет экспериментальных данных, позволяющих сказать, какая из предложенных моделей поры реализуется в действительности.

Предложенная схема образования поры объясняет зависимость проводимости мембраны от потенциала. Исходя из этой модели можно также объяснить большую проницаемость поры для катионов, чем для анионов. Так как остатки пролика располагаются на гидрофильных поверхностях спиралей, то есть в полости поры, и при этом про-лин-содержацие спирали тлеют излом, то наиболее узкое место в

трансмембранной поре находится как раз вблизи остатков пролина. Таким образом, селективность канала определяется полярными группами, находящимися вблизи пролинов. Как видно из рис., I, вблизи остатков пролина преобладают незаряженные остатки треонина и серина. Кроме того, как уже отмечалось, присутствие в а-спирали остатков пролина вызывает экспонированность в полость канала карбонильных групп л.-з-ого и л.-4-ого остатков (где 1 - номер остатка пролина). Такое преобладание карбонильных и гидроксиль-ных групп благоприятно для взаимодействия с катионами и объясняет более высокую проницаемость поры для катионов, чем для анионов.

ВЫВОДЫ

1. Получены двумерные спектры 'н-ЯМР эктатомина в водном растворе и проведено полное отнесение сигналов в этих спектрах. На основании полученных данных определены вторичная структура эктатомина и положение дисульфидных связей.

2. По данным спектроскопии 'н-ЯМР проведен расчет пространственной структуры эктатомина в водном растворе. В результате получен набор из 20 структур эктатомина, хорошо согласующихся с данными ЯМР и обладающих низкой конформационной энергией. Среднее попарное среднеквадратичное отклонение положения тяжелых

о

атомов без учета подвижных концевых остатков составило 0,75 а

о

для основной цепи и 1,25 а для всех тяжелых атомов. Показано, что в водном растворе эктатомин образует структуру типа четырех-спиральная связка.

3. С помощью спектроскопии КД и ЯМР показано, что при умень-

шении полярности растворителя вторичная структура эктатомина практически не изменяется, в то время как третичная структура сильно нарушается. Предложена модель пространственной организации бежа в слабополярных растворителях.

4. На основании данных о пространственной организации эктатомина в водном растворе и среде, имитирующей мембранное окружение, предложена модель образования эктатомином трансмембранной поры.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Плужников К.А., Нольде Д.Е., Тертышникова С.М., Суханов С.В., Соболь А.Г., Торгов М.Ю., Филиппов А.К., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Структурно-функциональное исследование основного токсического компонента яда муравья Ectatomma tuberculatum. -

■ Биоорг. химия, 1994, т. 20, № 8-9, с. 857-871.

2. Arseniev A.S., Pluzhnikov К.А., Nolde D.E., Sobol A.G. , Torgov M.Yu., Sukhanov S.V., Grishin E.V. Toxic principle of selva ant venom is a pore forming protein-transformer. - FEBS Lett., 1994, V. 347, N 2-3, p. 112-116.

3. Nolde D.E., Sobol A.G., Pluzhnikov k.A., Arseniev A.S. Structural studies of main toxic component of Ectatomma tuberculatum ant venom using NMR spectroscopy. Abstr. of the 3-rd Intern. Meeting Young Scientist's View of Molecular Biotechnology, Ascona, Switzerland, 1994, p. 16.

4. Arseniev A.S., Pluzhnikov K.A., Nolde D.E., Sobol A.G., Sukhanov S.V., Grishin E.V. Channel forming protein from selva ant venom. Abstr. 9-th Russia-Germany Symposium on Chemistry of Peptides and Proteins. Pushchino, Russia, 1994, p. 5.