Процессы разделения фурокумариновых фотосенсибилизаторов в сверхкритических флюидах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Покровский Олег Игоревич

ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ФУРОКУМАРИНОВЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ ФЛЮИДАХ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 "ОЯ 2013

005539274

Москва - 2013

005539274

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова Российской академии наук и на Химическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: академик

Лунин Валерий Васильевич

кандидат химических наук Паренаго Ольга Олеговна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Даванков Вадим Александрович

доктор технических наук, доцент Платонов Игорь Артемьевич

Ведущая организация: ФГБУН Институт химии растворов

им. Г.А. Крестова РАН

Защита диссертации состоится «12» «декабря» 2013 года в 11. часов на заседании диссертационного совета Д 002.021.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова Российской академии наук по адресу 119991, г. Москва, Ленинский пр-т, 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОНХ РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, Ленинский проспект, 31. Автореферат см. на сайте www.igic.ras.ru и на сайте ВАК.

Автореферат разослан «11» ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Очертянова Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Хроматография является основным инструментом решения задач, связанных с выделением биологически активных веществ из природного сырья. Основные проблемы препаративной хроматографии заключаются в высокой длительности процессов разделения и в большом расходе дорогостоящих токсичных органических растворителей. Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) имеет ряд преимуществ перед жидкостной в указанном отношении. Сверхкритические флюиды (СКФ) как состояние вещества, промежуточное по своим свойствам между жидкостью и газом, характеризуются управляемой растворяющей способностью, высокими коэффициентами диффузии и низкой вязкостью. Эти свойства позволяют проводить многие разделительные процессы в СКФ с более высокой скоростью по сравнению с аналогичными жидкостными без потери эффективности разделений. Вместе с тем эти же свойства обусловливают и значительную сложность разработки СКФ-методов. Так, в настоящее время не существует единого универсального подхода к разработке методов разделений с помощью СФХ. Прежде всего, это связано с многообразием различных межмолекулярных взаимодействий, которые могут влиять на селективность разделения в СФХ. Разработка универсальных алгоритмов построения методик разделений сложных смесей веществ с помощью сверхкритических флюидов является актуальной задачей, решение которой будет способствовать практическому использованию этой перспективной технологии. Дня ее решения необходимо наличие описания роли различных типов межмолекулярных взаимодействий в удерживании в СФХ на различных типах сорбентов, что и определяет актуальность темы данного исследования.

Объекты и предмет исследований

Фурокумарины - класс гетероциклических конденсированных соединений, замещенных фуранопроизводных бензопиранона. Эти соединения используются в лечении многих кожных заболеваний, прежде всего псориаза и витилиго, в борьбе с Т-клеточной лимфомой, а также с

различными вирусными заболеваниями. Источником фурокумаринов являются многие виды растений, преимущественно принадлежащих семействам Зонтичные, Тутовые, Рутовые и Бобовые. Выделение индивидуальных фурокумаринов из растений представляет собой одну из тех сложных сепарационных проблем, для которых характерны низкая производительность известных процессов, большой расход растворителей, сложность достижения высокой степени чистоты конечных продуктов.

Наиболее востребованными с практической точки зрения и одновременно наиболее сложными в разделении являются три метоксипроизводных простейшего линейного фурокумарина псоралена — 5-метоксипсорален (5-МОП), 8-метоксипсорален (8-МОП) и 5,8-диметоксипорален (5,8-диМОП). Эти соединения, чьи структурные формулы представлены на рис. 1, являлись основными объектами исследований в настоящей работе.

Бергаптен, Ксантотоксин, Илопимпинеллин,

5-метоксипсорален, 8-метоксипсорален, 5,8-диметоксипсорален,

5-МОП 8-МОП 5,8-диМОП

Рис. 1. Структурные формулы метоксипсораленов Целью работы являлась разработка универсального метода выделения фурокумаринов из экстактов растительного сырья с помощью сверхкритической флюидной хроматографии. В соответствии с поставленной целью основными задачами работы являлись:

1. Изучение селективности различных сорбентов, применяемых в сверхкритической флюидной хроматографии, по отношению к линейным фурокумаринам.

2. Выбор оптимального хроматографического режима и типа сорбента, обеспечивающих наибольшую селективность при

разделении линейных фурокумаринов в сверхкритической флюидной хроматографии.

3. Оптимизация параметров разделения фурокумаринов в сверхкритической флюидной хроматографии.

4. Установление механизмов, обеспечивающих селективность сорбции фурокумаринов в найденных условиях.

5. Разработка препаративной методики на основе лабораторной и верификация ее применимости для выделения лекарственных фурокумаринов из экстрактов растительного сырья в индивидуальном виде.

Научная новизна работы

1. Впервые получены данные о селективности разделения модельных фурокумаринов — метоксипроизводных псоралена — в сверхкритической флюидной хроматографии на широком круге силикагелевых сорбентов.

2. Предложен новый метод разделения смесей фурокумариновых фотосенсибилизаторов с использованием сверхкритической флюидной хроматографии на силикагелевом сорбенте с привитыми пентафторфенильными группами.

3. Предложено объяснение закономерностям элюирования метоксипсораленов в условиях сверхкритической флюидной хроматографии, основанное на анализе вкладов различных межмолекулярных и внутримолекулярных взаимодействий, характерных для линейных фурокумаринов, в их удерживание на сорбентах различной природы.

4. На основе лабораторной методики разработан препаративный метод выделения лекарственных фурокумаринов из экстрактов растительного сырья, который был успешно испытан при препаративном выделении фурокумаринов псоралена и бергаптена из экстрактов листьев инжира (Ficus carica L.).

Практическая значимость работы

1. Разработанный метод разделения смесей фурокумаринов с помощью сверхкритической флюидной хроматографии на пентафторфенильных сорбентах применим для препаративного выделения лечебных фурокумаринов из экстрактов растительного сырья.

2. Предложенный в работе подход к выбору оптимального сорбента для разделения смесей веществ в сверхкритической флюидной хроматографии представляет перспективы для разработки методов разделения сложных практически важных смесей веществ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработка метода разделения смесей фурокумаринов методом сверхкритической флюидной хроматографии на силикагелевых сорбентах с привитыми пентафторфенильными группами.

2. Описание закономерностей элюирования и разделения метоксипсораленов в сверхкритической флюидной хроматографии с использованием представлений о характерных для этих веществ межмолекулярных и внутримолекулярных взаимодействиях.

3. Препаративное масштабирование лабораторной методики разделения фурокумаринов, ее апробация в разделении экстрактов растительного сырья с выделением лекарственных фурокумаринов в индивидуальном виде.

Личный вклад соискателя состоял в самостоятельном выполнении экспериментальных работ по оптимизации методик сверхкритической флюидной экстракции и сверхкритической флюидной хроматографии, в активном участии в обсуждении полученных результатов, в подготовке статей и докладов по материалам работы, выступлениях на научных семинарах и конференциях. Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (г. Москва, Клязьма, 2008), V Научно-практической конференции с международным участием «Сверхкритические флюиды: основы, технологии, инновации» (г.

Суздаль, 2009), 5-ой международной конференции по сверхкритической флюидной хроматографии (г. Нью-Йорк, США, 2011), 13-ой европейской конференции по сверхкритическим флюидам (г. Гаага, Нидерланды, 2011), 6-ой международной конференции по сверхкритической флюидной хроматографии (г. Брюссель, Бельгия, 2012), 11-й международной конференции по фундаментальным основам адсорбции (г. Балтимор, США, 2013), VII Научно-практической конференции с международным участием «Сверхкритические флюиды: основы, технологии, инновации» (г. Зеленоградск Калининградской области, 2013). Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы. Материал изложен на 137 страницах и содержит 28 рисунков, 10 таблиц и библиографию из 187 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность выбранной темы исследований, сформулирована основная цель работы и задачи, которые необходимо решить для ее достижения, отражены научная новизна и практическая значимость работы.

Глава 1. Литературный обзор

В этой главе представлен обзор методов выделения лечебных фурокумаринов из растительного сырья с использованием различных сепарационных технологий, таких как экстракция, перекристаллизация, винтеризация и хроматография. Проведен детальный анализ известных хроматографических методов разделения фурокумариновых смесей, как аналитических, так и препаративных. Рассмотрены подходы к разработке методов разделения в сверхкритической флюидной хроматографии с насадочными колоннами; продемонстрировано, что ключевыми факторами, определяющим селективность разделения в сверхкритической флюидной хроматографии, является выбор сорбента и, в несколько меньшей степени, природа подвижной фазы.

Глава 2. Экспериментальная часть

В этой главе приведены характеристики исходных веществ и материалов, изложены методики проведения сверхкритической флюидной экстракции растительного сырья с учетом его предварительной подготовки, методики разделений смесей веществ в сверхкритической флюидной хроматографии на всех типах использовавшегося хроматографического оборудования - лабораторного, микропрепаративного и препаративного. Приведены методики проведения квантовохимических расчетов внутримолекулярных взаимодействий в метоксипсораленах а также межмолекулярных взаимодействий метокси-псораленов с гексафторбензолом как моделью пентафторфенильного сорбента методами РВЕ и B3LYP в рамках теории функционала электронной плотности, а также методом Хартри-Фока с использованием теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка с помощью программного пакета FireFly. Представлены методики физических методов анализа (1Н ЯМР1, ИК-спектроскопии2, УФ-спектроскопии3) выделенных индивидуальных фурокумаринов. Описана схема масштабирования оптимизированной лабораторной методики разделения фурокумаринов для препаративных целей и проведения тестовых испытаний по выделению фурокумаринов псоралена и бергаптена из экстрактов листьев инжира Ficus carica L.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

В основу подхода к поиску неподвижной фазы, обеспечивающей требуемую селективность при разделении фурокумаринов в сверхкритической флюидной хроматографии, был положен принцип ортогональной системы скрининга [1]. Этот принцип базируется на анализе вкладов различных межмолекулярных взаимодействий сорбента с аналитом с использованием метода LSER (Linear Solvation Energy Relationship) в варианте Абрахама, в рамках которого вклад различных типов взаимодействий выражается следующим уравнением: log к = с + еЕ + vV + аА + ЬВ + sS,

' - Регистрация спектров ЯМР выполнена Д.Ю. Чешковым (ИОФ РАН, г. Москва)

2 - Регистрация и расшифровка ИК-спектров проводилась Е.С. Шубиной (ИНЭОС РАН, г. Москва)

3 - Регистрация и интерпретация УФ-спектров проводилась С.А. Гончуковым (МИФИ, г. Москва)

где к - коэффициент удерживания аналита в определенных условиях;

с - константа, связанная с геометрическими характеристиками хроматографической колонки и наполняющего ее сорбента;

Е - избыточная мольная рефракция, обусловленная вкладами пи-электронов и неподеленных электронных пар атомов;

V - характеристический молекулярный объем Макгована;

А — кислотность аналита, обусловленная способностью выступать донором водородных связей;

В - основность аналита, обусловленная способностью выступать акцептором водородных связей;

Б - общая полярность/поляризуемость молекулы аналита, определяемая наличием дипольного и более высоких мультипольных моментов;

строчные буквы при заглавных обозначают долевые коэффициенты для каждого слагаемого.

Согласно этим представлениям, селективность разделения структурно близких нехиральных молекул может быть обусловлена значительным вкладом в удерживание на сорбенте одного из пяти приведенных факторов либо однонаправленным действием нескольких факторов при существенном различии разделяемых компонентов по способности к участию в таких взаимодействиях.

В настоящей работе был предложен следующий подход к выбору оптимального сорбента для разделения. С помощью ЬБЕЯ-анализа разделений большой группы модельных соединений в условиях СФХ возможно провести оценку вклада каждого из пяти факторов в удерживание на определённых типах сорбентов [1]. Выбирая те из сорбентов, для которых удерживание преимущественно определяется одним-двумя факторами, и проводя разделение модельных смесей на них, мы получаем оценку склонности аналитов к разным типам межмолекулярных взаимодействий с сорбентом. На базе этих данных появляется возможность направленно оптимизировать тип неподвижной фазы в СФХ, а также проводить выбор компонентов подвижной фазы, которые могут способствовать проявлению определённых взаимодействий,

либо наоборот, нивелировать их в зависимости от стоящей задачи. Типы хроматографических сорбентов, использовавшихся в данной работе, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Типы хроматографических сорбентов, использовавшихся

Схематическое изображение модификатора поверхности сорбента Полное название типа сорбента Краткое название типа сорбента, используемое в тексте

£ Немодифицированный силикагель Силикагель

^Ы-оЛ, АЛоЛ^Ло« он Силикагель с привитыми диольньми группами «Диол»

Ж' „О С -О-Я-^ш Силикагель с привитыми нитрильными группами «Нитрил»

С. Силикагель с привитыми аминогруппами «Амино»

Силикагель с привитыми бутильными группами «С4»

С — о Силикагель с привитыми октальными группами «С8»

Силикагель с привитыми октадецильными группами «Си»

Силикагель с привитыми 2-этилпиридиновыми группами 2ЭП

Силикагель с привитыми фенилгексильными группами «Фенил»

Г 1 Силикагель с привитыми пентафторфенильными группами «ПФФ»

5ЛЛЛ»«Д»«5 Пористый графитированный углерод «Графит»

Для установления возможности использования факторов кислотности и основности (А и В) в качестве движущей силы хроматографического

10

разделения фурокумаринов в СФХ были проведены испытания серии полярных силикагелевых сорбентов — немодифицированные силикагели, диольные и нитрильные фазы (см. табл. 1). При выборе водородных связей как движущей силы разделения в качестве модификаторов подвижной фазы используются протонные спиртовые сорастворители. Результаты скрининга разделений трех метоксипсораленов на таких сорбентах при использовании метанола и изопропанола как сорастворителей подвижной фазы СФХ приведены в табл. 2 и 3.

Как видно из приведенных данных, силикагелевые сорбенты с привитыми полярными группами не обеспечивают необходимой селективности в разделении фурокумаринов в СФХ. При использовании сорастворителей, которые могут выступать донорами протонов в водородных связях - метанола, изопропанола — все три метоксипсоралена элюируются с очень близкими коэффициентами удерживания даже при небольших долях сорастворителей в подвижной фазе. При содержании протонного сорастворителя выше 10-12 об. % добиться полного разделения трех компонентов не удается. 5-МОП, элюирующийся первым, сравнительно легко ~ отделяется от оставшихся 8-замещенных метоксипсораленов на всех испытанных алифатических полярных сорбентах. Разделение же 8-МОПа и 5,8-диМОПа представляется затруднительным в таких системах.

Таблица 2. Коэффициенты удерживания метоксипсораленов на силикагеле и сорбентах с полярными алифатическими группами при использовании метанола в качестве сорастворителя в СФХ (относительная

Колонка Аналит Коэффициент удерживания

Соде ржание метанола в подвижной фазе, об. %

2 3 5 7 10 12

Сшшкагель квмоп 2,29 2,04 1,72 1,66 1,46 1,06

к5,8МОП 2,72 2,35 1,94 1,83 1,58 1,15

квмоп 2,72 2,46 1,94 1,93 1,68 1,28

Диол к5МОП 2,29 2,31 2,23 2,20 1,85 1,41

к5,8МОП 2,60 2,54 2,37 2,20 1,85 1,41

квмоп 2,60 2,54 2,48 2,35 2,01 1,61

Нитрил к5МОП 2,80 2,56 2,18 2,04 1,76 1,35

к5,8МОП 3,34 2,97 2,50 2,30 1,95 1,52

квмоп 2,93 2,67 2,29 2,15 1,88 1,52

Таблица 3. Коэффициенты удерживания метоксипсораленов на силикагеле и сорбентах с полярными алифатическими группами при использовании изопропанола в качестве сорастворителя в СФХ (относительная погрешность определения коэффициентов селективности Аг - 0.02). ___

Колонка Аналит Коэффициент удерживания

Соде ржание метанола в подвижной фазе, об. %

Силикагель к5МОП 5,32 4,25 3,26 2,65 1,97 1,83

к5,8МОП 6,65 4,98 3,54 2,92 2,16 1,96

квмоп 6,40 4,98 3,54 2,92 2.16 1,96

Диол к;моп 3,97 3,58 3,26 2,99 1,92 2,06

к5,8МОП 4.61 4,00 3,54 3,23 2,05 2,21

квмоп 4,61 4,00 3,54 3,13 1,92 2,06

Нитрил к5МОП 4,48 3,73 3,13 2,78 2,23 1,94

к5,8МОП 5,28 4,29 3,58 3,04 2,50 2,15

квмоп 4,67 3,84 3,24 2,78 2,31 2,01

Такое поведение обусловлено превалирующим вкладом водородных связей в удерживание при использовании сорбентов данного типа и сорастворителей, которые могут выступать донорами этих связей. Данный тип межмолекулярных взаимодействий не обеспечивает селективности разделения метоксипсораленов.

При использовании апротонных сорастворителей в подвижной фазе -ацетонитрила, ацетона, этилацетата — регистрировались качественно схожие результаты с заметно большими временами удерживания, меньшей эффективностью разделения и большими отклонениями формы пиков от гауссовой. Полное разделение всех трех целевых веществ с использованием сорбентов данной группы достигалось лишь при использовании таких слабополярных апротонных сорастворителей, как этилацетат. При этом наблюдались искаженные формы хроматографических пиков, а времена удерживания были неприемлемо велики. Пример такого разделения приведен на рис. 2.

8 5.»

5

j

ц

. л .____/ 1 м ч

.........1.....—1.........1.........1.........1.........1.........1.........1.........1

Время, мин

Рис. 2. Элюирование метоксипсораленов с сорбента «Силикагель»; подвижная фаза -СОг/ЕЮАс 85/15, давление 150 бар, температура 25°С.

Здесь и далее: «5» - 5-МОГ1, «8» - 8-МОП, «5,8»- 5,8-диМОП

Таким образом, ни одна из испытанных систем с полярными сорбентами не обеспечивает требуемой селективности в разделении структурно близких фурокумаринов в СФХ, что хорошо согласуется с представлениями об участии целевых соединений во взаимодействиях типа водородная связь.

Известно, что при проведении разделения на неполярных алкилированных силикагелях в СФХ селективность преимущественно определяется факторами V (молекулярный объем) и, в меньшей степени, Е (поляризуемость, определяемая вкладом пи-электронов и электронов неподеленных пар).

8 5,8

5

ZJ VI

-,....... . .—™—Н-~—П+—„—-

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Время, мин

Рис. 3. Элюирование метоксипсораленов с сорбента С|8. Подвижная фаза СО2/1РЮН 98/2, давление 100 бар, температура 25°С

Испытанные алкильные сорбенты (силикагели с привитыми

бутильным, октальным и октадецильным заместителями) показали низкую

селективность в разделении метоксипсораленов. Прежде всего, последние практически не удерживаются на неполярных алкильных фазах в СФХ. На рис. 3 приведен типичный вид хроматограмм, регистрируемых при использовании алкильных сорбентов.

Варьирование типа и доли сорастворителей в подвижной фазе вплоть до уменьшения его до нуля не позволяет достичь удовлетворительного разделения метоксипсораленов на данных сорбентах. Объемный фактор, как ожидалось, не обеспечивает селективности при разделении структурно близких и изомерных соединений. Примечательно, что коэффициенты удерживания на сорбентах данного типа растут с удлинением цепи алкильного заместителя, и при этом появляется определенная частичная селективность в разделении. По-видимому, это связано с увеличением вклада Е-фактора в удерживание в ряду сорбентов С4 - С8 - С)8. Такое поведение является нехарактерным для жидкостной обращенно-фазовой хроматографии, но может наблюдаться для сверхкритической флюидной хроматографии, поскольку природа подвижной фазы в СФХ способствует проявлению межмолекулярных взаимодействий этого типа.

В отсутствие способности аналитов выступать сильными донорами либо акцепторами водородных связей факторы 8 и Е могут управлять хроматографическим разделением и обеспечивать селективность по отношению к фурокумаринам. Вклад этих факторов в удерживание является превалирующим при использовании сорбентов с ароматическими группами в структуре модификаторов.

На рис. 4-7 приведены хроматограммы, регистрируемые при использовании сорбентов, селективность которых по отношению к аналитам определяется вкладами диполь-дипольных и пи-электронных взаимодействий — фенилгексильного, 2-этилпиридинового, пентафтор-фенильного и графитового.

Порядок элюирования МОПов с сорбентов 2ЭП и «фенил» - 1г(8-МОП) < Цб-МОП) < 1г(5,8-диМОП), с пентафторфенильного и графитового сорбентов - 1г(8-МОП) < 1г(5,8-диМОП) < 1г(5-МОП), где 1г - время удерживания.

Рис. 4. Элюирование метоксипсораленов с сорбента «Фенил»; подвижная фаза -С02/ТГФ/Ме0Н 99/0.2/0.8, давление 100 бар, температура 25°С

В

5.8

S

!\

s

-у—-—^-* wJ w

Время, WM4

Рис. 5. Элюирование метоксипсораленов с сорбента 2ЭП; подвижная фаза - CCViPrOH 95/5, давление 100 бар, температура 25°С

5,8

1

5

_ .. LI 1 1

V

0 1 2 3 4 5

Время, мин

Рис. 6. Элюирование метоксипсораленов с сорбента ПФФ; подвижная фаза - СО2ЛРЮН 97/3, давление 100 бар, температура 25°С

0 7

в 5,8

5 ft

.............ft................

W yw

Время, uw

Рис. 7. Этоирование метоксипсораленов с графитового сорбента; подвижная фаза -С02/СНС13/Ме0Н 50/37.5/12.5, давление 150 бар, температура 25°С

По всей видимости, отличия порядка элюирования обусловлены различным соотношением вкладов диполь-дипольных и пи-электронных взаимодействий в удерживание на этих сорбентах. Разделение, которое достигается при использовании пентафторфенильного сорбента, представляет особый интерес с точки зрения анализа роли пи-электронных взаимодействий [2]. В диссертации было показано, что этот тип неподвижной фазы обладает самой высокой селективностью по отношению к целевым аналитам. Он позволяет проводить разделение с высокой скоростью при низких долях сорастворителя в подвижной фазе. Пентафторфенильные сорбенты традиционно используются в тех случаях, когда необходимая селективность разделения может быть достигнута за счет пи-электронных взаимодействий, однако в случае СФХ метоксипсораленов полученная селективность была аномально высокая даже с учетом особой роли этих взаимодействии при использовании ПФФ.

Для объяснения высокой селективности сорбентов, содержащих ароматические группы в своей структуре, в особенности пентафторфенильного и графитового, а также необычного порядка элюирования метокспсораленов с них, была проведена серия квантовохимических исследований внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий, характерных для 8-МОП и 5-МОП. В табл. 4 приведены данные расчетов энергий взаимодействия 5- и 8-МОП с гексафторбензолом по механизму пи-стекинга, а также Т-образного аттрактивного контакта типа неподеленная пара - пи-система [3]. Из этих

16

данных следует, что пи-электронные взаимодействия обоих видов не могут быть причиной наблюдавшейся высокой селективности сорбентов с ароматическими привитыми группами по отношению к изомерным метоксипсораленам. И энергии взаимодействия типа пи-стэкинг, и энергии Т-образного взаимодействия для 5-МОП и 8-МОП очень близки по величине. Следовательно, данные контакты не могут обеспечивать преимущественную сорбцию одного из этих соединений.

Анализ внутримолекулярных движений в 8-МОП показал, что наличие заместителя в 8-ом положении не является препятствием для участия молекулы в Т-образном взаимодействии. Результаты расчета одномерной поверхности потенциальной энергии процесса вращения метоксигруппы в 8-МОП различными методами представлены на рис. 8. При использовании метода Хартри-Фока (ОТ) вычисленное значение барьера равно 2.5 ккал/моль, в методах теории функционала электронной плотности - около 1 ккал/моль (метод РВЕ —1.1 ккал/моль, метод ВЗЬУР -0.9 ккал/моль). Полученные значения достаточно малы, чтобы можно было говорить о практически незатрудненном вращении метоксигруппы при комнатной температуре (рис. 8). При необходимости метоксигруппа в 8-МОП принимает такую конформацию, в которой может реализовываться Т-образный контакт ароматической системы с атомами кислорода псораленовой структуры.

Таблица 4. Результаты расчетов значений энергий комплексов

ДЕ взаимодействия, ккал/моль

8-МОП 5-МОП

Комплекс типа пи-стэкинг -3.5 -3.8

Т-образный комплекс -4.6 -4.5

36 73 106 144 180 216 252 288 324 360 Угол вращения Б.'

36 72 106 144 1 80 216 252 298 324 360 У г ».и вращгыня Б,'

Рис. 8. Поверхность потенциальной энергии (ППЭ) вращения метоксигруппы в 8-МОП Иное поведение наблюдается при анализе внутреннего вращения метоксигруппы в 5-МОП (рис. 9). Было обнаружено, что атом кислорода метоксигруппы участвует во внутримолекулярном аттрактивном взаимодействии с С4-Н4 группой пиранонового кольца. В диссертации показано, что существование такой связи подтверждается литературными данными по рентгеноструктурному анализу 5-метоксипсоралена и других 5-алкоксипроизводных линейных и ангулярных фурокумаринов, а также данными спектроскопии ЯМР. Данные расчетов свидетельствуют о том, что наличие этого внутримолекулярного контакта приводит к значительному повышению дипольного момента молекулы 5-МОП, что и обусловливает его более сильную сорбцию на пентафторфенильном и графитовом сорбентах по сравнению с 8-метокси- и диметоксипсораленом.

ППЭ вращения метоксигруппы в 5-МОП РВЕ0«-311+<3(с1)

4.5 ] ИЧ

О 45 90 135 180 225 270 315 360 Угол вращения метоксигруппы. градус

Рис. 9. Поверхность потенциальной энергии вращения метоксигруппы в 5-МОП Масштабирование лабораторной методики было успешно проведено с переносом с аналитических колонок геометрией 100 мм (длина) на 3 мм (внутренний диаметр), заполненных сорбентом с размером частиц 1.7 мкм, на препаративные колонки 250 мм (длина) на 30 мм (диаметр), заполненных сорбентом с размером частиц 5 мкм. На рис. 10 и 11 приведены хроматограммы, соответственно, аналитического и препаративного разделения экстрактов листьев инжира с помощью созданных методик.

I -

0 0 0 5 1.0 15 2.0 2.5 3.0 3.5 40 4 5 5.0

Время, мин

Рис. 10. Аналитическое СФХ-разделение экстракт листьев инжира

Рис. 11. Препаративное СФХ-разделение экстракт листьев инжира с накоплением фурокумаринов псоралена и 5-МОП в индивидуальном виде

Препаративная методика позволила вести накопление двух основных

фурокумариновых компонентов листьев инжира - псоралена и 5-МОП — с

чистотой 99% и производительностью порядка 1 г в день. С использованием данной методики была наработана тестовая партия субстанций псоралена и 5-МОПа для создания препаратов для ПУФА-терапии и проведения испытаний их биоэквивалентности имеющимся на рынке аналогам.

Основные результаты и выводы

1. Впервые проведен скрининг сорбентов различной природы с целью поиска наиболее селективных условий разделения смесей структурно близких линейных фурокумаринов методом сверхкритической флюидной хроматографии.

2. Для обеспечения высокой селективности разделения фурокумаринов в СФХ предложено использовать сорбенты с ароматическими привитыми группами, среди которых оптимальными являются силикагелевые сорбенты с пентафторфенильными модификаторами.

3. Разработан новый метод разделения фурокумариновых смесей на пентафторфенильных сорбентах с помощью сверхкритической флюидной хроматографии. Метод успешно опробован при анализе составов экстрактов различных перспективных растительных источников лечебных фурокумаринов.

4. Показана применимость разработанного метода для масштабирования до препаративных объемов. С использованием масштабированного СФХ-метода проведено выделение в индивидуальном виде фурокумаринов псоралена и бергаптена из экстракта листьев инжира (Ficus carica L.) в количествах, необходимых для изготовления пробной партии препаратов для проведения испытаний биоэквивалентности.

5. Наличие внутримолекулярного аттрактивного взаимодействия в 5-оксипроизводных псоралена является структурной особенностью, которая обусловливает высокую селективность сорбентов с ароматическими группами по отношению к изомерным метоксипсораленам.

Список публикаций

1. Аносов А.К., Гончуков С.А., Марколия А.А., Мошнин М.В., Паренаго О.О., Покровский О.И. К вопросу об эффективности ПУФА терапии // Альманах клинической медицины. - 2008. - Т. 17. - ч.2. -С. 26-29.

2. Покровский О.И., Марколия А.А., Лепешкин Ф.Д., Кувыкин И.В., Паренаго О.О., Гончуков С.А. Выделение линейных фурокумаринов из семян Ammi Majus с помощью сверхкритической флюидной экстракции и хроматографии // Сверхкритические флюиды: Теория и Практика. - 2009. - Т. 4. - No 4. - С. 61-72.

3. Покровский О.И., Крутикова А.А., Устинович К.Б., Паренаго О.О., Мошнин М.В., Гончуков С.А., Лунин В.В. Препаративное разделение метоксипроизводных псоралена с помощью сверхкритической флюидной хроматографии // Сверхкритические флюиды: теория и практика. - 2013. - Т. 8. - № 1. - С. 14-35.

4. Покровский О.И., Устинович К.Б., Паренаго О.О., Лунин В.В. Возможность существования внутримолекулярных водородных связей в 8-метоксипсоралене // Журн. физ. хим. - 2013 . - Т. 87. - № 8. - С. 1-4.

5. Кувыкин И.В., Лепёшкин Ф.Д., Марколия А.А., Паренаго О.О., Покровский О.И., Гончуков С.А., Мошнин М.В. Разработка методики получения сверхкритического флюидного экстракта семян Амми большой (Ammi majus L.) и анализ полученного экстракта // V Международная научно-практическая конференция «Сверхкритические флюиды: основы, технологии, инновации», г. Суздаль, 15-18 сентября 2009 г., Сборник тезисов, С. 84.

6. О. Pokrovskiy, К. Ustinovich, О. Parenago, S. Gonchukov, V. Lunin. Isolation of Furocoumarins from Ammi Majus by SFE and SFC // Materials of the 5th International conference on Packed Column SFC, 2022 July 2011, New York, USA.

http://gTeenchemistrygroup.org/pdf/2011/Pokrovskiv SFC 2011 Poster.pdf

7. O.O. Parenago, K.B. Ustinovich, F.D. Lepeshkin, O.I. Pokrovskiy, V.V. Lunin. SFE/SFC of photosensibilizing furocoumarins from Umbelliferae

plant // Proceedings of the 13th European meeting on supercritical fluids, 9-12 October 2011, Hague, 8 p.

8. O. Pokrovskiy, A. Krutikova, K. Ustinovich, O. Parenago, V. Lunin. Role of aromatic intermolecular interactions in SFC isolation of skin disease PUVA-therapy agents from SFE extracts of Umbelliferae plants // Materials of the 6th International conference on Packed Column SFC, 3-5 October 2012, Brussels, Belgium. http://greenchemistrvgroup.org/pdf/2012/Pokrovskiv.pdf

9. Oleg I. Pokrovskiy, Alia A. Krutikova, Konstantin B. Ustinovich, Olga O. Parenago, Valeriy V. Lunin. Separation of isomeric furocoumarins from Umbelliferae plants extracts for PUVA-therapy of psoriasis by supercritical fluid chromatography // Proceedings of the 11th International conference on the fundamentals of Adsorption, 19-24 May 2013, Baltimore, USA. 2 p.

10. О.И. Покровский, К.Б. Устинович, А.А. Крутикова, O.O. Паренаго, В.В. Лунин. Роль ароматических взаимодействий в разделении метоксипроизводных псоралена методом сверхкритической флюидной хроматографии // VII Научно-практическая конференция с международным участием "Сверхкритические флюиды: основы, технологии, инновации", 16-21 сентября 2013 г., г. Зеленоградск Калининградской области, Сборник тезисов, С. 39-41.

Список цитируемой литературы

1. West С., Lesellier Е. Orthogonal screening system of columns for supercritical fluid chromatography // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1213. -P. 105-113.

2. Huff E.M. Interactions of Polar and Charged Molecules with Pi-electron Systems - ProQuest, 2009. - 212 p.

3. Grimme S. Do special noncovalent pi-pi stacking interactions really exist? // Angew. Chem. Int. Ed. - 2008. - Vol. 47. - P. 3430-3434.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ И НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ Н.С. КУРНАКОВА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0420136533В

Покровский Олег Игоревич

ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ФУРОКУМАРИНОВЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В

СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ ФЛЮИДАХ

02.00.04 - физическая химия

Диссертация на соискание степени кандидата химических наук

Научные руководители: академик РАН, заведующий сектором Лунин В.В.

к.х.н., с.н.с. Паренаго О.О.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...............................................................................................9

1.1. Физиологическая активность фурокумаринов.....................................................................9

1.2. Источники фурокумаринов..................................................................................................13

1.3. Нехроматографические методы выделения фурокумаринов из растительного сырья...16 1.3.1. Жидкостная экстракция.................................................................................................16

1.3.3. Сверхкритическая флюидная экстракция....................................................................17

1.3.4. Выделение смесей фурокумаринов из тотальных экстрактов...................................22

1.4. Хроматография фурокумаринов..........................................................................................25

1.4.1. Аналитическая хроматография фурокумаринов.........................................................25

1.4.1.1. Газовая хроматография фурокумаринов...................................................................25

1.4.1.2. Жидкостная хроматография фурокумаринов...........................................................29

1.4.2. Препаративная жидкостная хроматография фурокумаринов....................................36

1.6. Оптимизация метода разделения в сверхкритической флюидной хроматографии.........40

1.6.1. Суть метода сверхкритической флюидной хроматографии.......................................40

1.6.2. Оптимизация СФХ-метода............................................................................................44

1.6.2.1. Неподвижные фазы в СФХ.........................................................................................44

Использование данных ЬБЕК-анализа для скрининга сорбентов в СФХ...........................49

1.6.2.2. Состав подвижной фазы в СФХ.................................................................................52

1.6.2.3. Остальные параметры.................................................................................................55

1.6.2.4 СФХ фурокумаринов...................................................................................................58

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...............................................................................61

2.1. Аналитическая сверхкритическая флюидная хроматография тестовой смеси фурокумаринов.............................................................................................................................61

2.3. Методика проведения хроматографических экспериментов............................................62

2.4. Источники фурокумаринов..................................................................................................63

2.5. Хроматографические колонки..............................................................................................64

2.6. Растворители..........................................................................................................................66

2.7. Идентификация хроматографических пиков......................................................................66

2.8. Масштабирование методик СФХ-разделения фурокумаринсодержащих экстрактов на препаративные объемы................................................................................................................67

2.9. Квантовохимические расчеты..............................................................................................69

2.10. Спектроскопия ЯМР индивидуальных фурокумаринов..................................................71

2.11. УФ-спектроскопия...............................................................................................................72

2.12. ИК-спектроскопия фурокумаринов...................................................................................73

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................................75

3.1. Скрининг сорбентов для разделения фурокумаринов.......................................................75

Полярные неароматические сорбенты...................................................................................75

/ Алкильные сорбенты................................................................................................................79

Сорбенты с ароматическими привитыми группами.............................................................81

3.2. Механизмы удерживания фурокумаринов на полярных сорбентах.................................85

3.3. Инверсия порядка элюирования 8-МОП и 5,8-диМОП.....................................................87

3.4. Механизм удерживания фурокумаринов на обращенно-фазовых сорбентах..................90

у 3.5. Сорбенты с ароматическими группами...............................................................................93

3.6. Разделение метоксипсораленов на пористом графитированном углеродном сорбенте .99

\

3.7. Механизмы взаимодействия пентафторфенильных сорбентов с метоксипсораленами

......................................................................................................................................................103

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ............................................................................................................116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................118

У

I

Основные обозначения и сокращения

СКФ - сверхкритический флюид

СФХ - сверхкритическая флюидная хроматография

СФЭ - сверхкритическая флюидная экстракция

ЖЭ - жидкостная экстракция

ГХ - газовая хроматография

ЖХ - жидкостная хроматография

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВСПХ - высокоскоростная противоточная хроматография

УФ - ультрафиолетовый (детектор)

МС - масс-спектрометрический (детектор)

НФ - нормально-фазовый (режим разделения)

ОФ - обращенно-фазовый (режим разделения)

ПФ - подвижная фаза

НПФ - неподвижная фаза

НЖФ - неподвижная жидкая фаза

ПФФ - пентафторфенил

2ЭП -2-этилпиридин

ЛЗЭС - линейная зависимость энергии сольватации ВЭТТ - высота, эквивалентная теоретической тарелке

ВВЕДЕНИЕ

Фурокумарины - класс гетероциклических конденсированных соединений, замещенных фуранопроизводных бензопиранона. Эти соединения используются в лечении многих кожных заболеваний, прежде всего псориаза и витилиго, в борьбе с Т-клеточной лимфомой, а также с различными вирусными заболеваниями. Источником фурокумаринов являются многие виды растений, преимущественно принадлежащих семействам Зонтичные, Тутовые, Рутовые и Бобовые. Выделение индивидуальных фурокумаринов из растений представляет собой одну из тех сложных сепарационных проблем, для которых характерны низкая производительность известных процессов, большой расход растворителей, сложность достижения высокой степени чистоты конечных продуктов.

Наиболее востребованными с практической точки зрения и одновременно наиболее сложными в разделении являются три метоксипроизводных простейшего линейного фурокумарина псоралена - 5-метоксипсорален (5-МОП), 8-метоксипсорален (8-МОП) и 5,8-диметоксипорален (5,8-диМОП).

Основная проблема, связанная с выделением фурокумаринов из растительного сырья -необходимость в достаточном эффективном сепарационном методе, который позволял бы выделять индивидуальные компоненты из сложных смесей. Экстракты фурокумарин-содержащих растений содержат сотни различных химических компонентов, в том числе иногда несколько десятков производных кумарина, включая разные фурокумарины. Существуют эффективные химические методы очистки производных кумарина от соединений других классов, но к настоящему моменту не разработано достаточно эффективного универсального сепарационного процесса, позволяющего выделять лечебные фурокумарины из экстрактов растений с требуемой чистотой и производительностью. Для разделения смесей фурокумаринов чаще всего применяют высокоэффективную хроматографию (ВЭЖХ) и противоточную жидкостную хроматографию, но все существующие препаративные хроматографические методы очистки фурокумаринов не

удовлетворяют указанным требованиям в полной мере. Прежде всего это связано с тем, что фурокумарины - сложные объекты для разделения ввиду структурной близости многих представителей этого класса химических веществ и отсутствия в их структурах групп, способных обусловливать существенную разницу в сорбции на типовых сорбентах либо в растворимости в традиционных растворителях. На это накладывается то обстоятельство, что хороший разделительный метод должен быть универсальным, то есть позволять вести препаративное накопление не одного выбранного, а в идеале любого возможного фурокумарина, так как для фототерапии псориаза и других кожных заболеваний со схожей симптоматикой в разных условиях применяются различные фурокумарины.

Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) - элюентный хроматографический метод, завоевавший большую популярность в последнее время в сфере препаративной очистки низкомолекулярных соединений. Этот метод родственен методу высокоэффективной жидкостной хроматографии, но в качестве подвижной фазы в нем используется не жидкость, а сверхкритический флюид. Особые свойства сверхкритических флюидов - сочетание наличия управляемой растворяющей способности с низкой вязкостью, высокой изотермической сжимаемостью, высокими коэффициентами диффузии - делают их чрезвычайно привлекательными средами для проведения разнообразных транспортных химических процессов - экстрации, импрегнации, формирования микро- и наноструктурированных материалов, гетерогенных реакций и хроматографии. При использовании сверхкритического флюида в качестве подвижной фазы в хроматографии за счет сочетания низкой вязкости и высокой сжимаемости среды элюирование через один и тот же сорбент можно проводить со скоростями в 2-3 раза выше по сравнению с жидкостной хроматографией, и при этом благодаря высоким коэффициентам диффузии процессы массопереноса внутри пор сорбентов успевают проходить с достаточной скоростью, чтобы эффективность элюирования не снижалась на больших скоростях подачи подвижной фазы. Это приводит к тому, что производительность СФХ-метода, как правило, в несколько раз выше, чем производительность аналогичного по селективности ВЭЖХ-метода. При этом в отличие от ВЭЖХ в СФХ существует множество приемов тонкой настойки

хроматографического разделения, также связанных с особыми свойствами подвижной фазы в сверхкритическом флюидном состоянии. Это обстоятельство дает дополнительные преимущества при разработке универсальных методов разделения, так как позволяет быстро подстраивать однажды разработанный метод под изменившиеся условия - другое сырье, другое соотношение компонентов в разделяемой смеси и т.п. - без необходимости проводить полную оптимизацию процесса.

Конечной целью проекта, в рамках которого выполнялось настоящее исследование, является разработка препаративного метода выделения лечебных фурокумаринов из экстрактов растений с помощью сверхкритической флюидной хроматографии и создание технологии производства лекарственного средства для ПУФА-терапии на его основе. Для разработки препаративного СФХ-метода необходимо предварительно разработать лабораторные методы разделения целевых веществ с помощью данной технологии. В силу большого количества факторов управления хроматографическим процессом и их взаимного влияния процесс оптимизации методики в СФХ достаточно сложен. В случае фурокумаринов ситуация дополнительно осложняется в силу объективных трудностей в создании разделительных процессов для веществ этого класса. Для обеспечения необходимых селективности, эффективности и производительности хроматографического разделения необходимо было провести изучение механизмов удерживания основных целевых фурокумаринов в условиях сверхкритической флюидной хроматографии, что и являлось целью настоящей работы.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести исследование селективности различных сорбентов, применяемых в сверхкритической флюидной хроматографии, по отношению к линейным фурокумаринам;

- изучить механизмы, обеспечивающие селективность сорбции фурокумаринов в условиях СФХ;

- провести оптимизацию всех параметров универсального лабораторного метода разделения фурокумариновых смесей, выделяемых из растительного сырья.

Практическая значимость работы обусловлена получением новых знаний о хроматографическом поведении фурокумаринов в условиях сверхкритической флюидной хроматографии, необходимых для построения препаративного метода очистки лечебных фурокумаринов в промышленных масштабах.

Теоретическая значимость работы обусловлена разработкой подходов к изучению механизмов удерживания в СФХ, основанных на анализе вкладов возможных межмолекулярных взаимодействий в удерживание.

Г)

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Физиологическая активность фурокумаринов

Псориаз - хроническое неинфекционное воспалительное заболевание, поражающее прежде всего кожу человека, приводящее к появлению дерматозов, воспалений, депигментированных участков и прочее. В настоящее время нет надежного способа исцеления от псориаза, все существующие методы борьбы с этим заболеванием сводятся к купированию симптомов, и разница между различными способами заключается в том, насколько эффективно это удается сделать и как долго длится период ремиссии. Один из наиболее эффективных методов лечения псориаза, равно как и многих других кожных заболеваний - ПУФА-терапия. Суть этого метода заключается в следующем: пациент принимает фотосенсибилизирующее лекарственное средство на основе фурокумаринов и затем подвергается облучению ультрафиолетовым светом в диапазоне А (320 - 400 нм). Фурокумарины - трициклические ароматические соединения (рис. 1), производные псоралена - 7Н-фуро[3,2-§][1]бензопиран-7-она, распространенные фитоалексины, синтезируемые многими видами растений [1].

Псорален

н ,с

Ксантотоксин

Сфондин

Пимпинеллин

Рисунок 1. Структурные формулы основных лечебных фурокумаринов

Эти вещества обладают рядом интересных физико-химических свойств, позволяющих им выступать в качестве протекторов от различных видов агрессии, прежде всего микробиологической. Во-первых, фурокумарины - фотоактивные соединения; при поглощении кванта света они переходят в триплетное возбужденное электронное состояние [2], находясь в котором, они могут вступать в различные химические реакции. Прежде всего, возбужденные фурокумарины могут участвовать в [2+2]-циклоприсоединении к двойным связям [3]. Активными в этом процессе являются обе боковых двойных связи ароматической

системы фурокумарина - связь Сг -С5' фуранового кольца и связь Сз - С4 пиранонового

»

кольца (рис. 2).

Рис 2. Нумерация атомов в линейных фурокумаринах

Второе терапевтически важное свойство фурокумаринов - способность к интеркаляции ДНК. Эти соединения имеют некое сродство к ДНК, при попадании в клетку происходит определенное концентрирование фурокумаринов в районе ядра [4]. Также фурокумарины могут участвовать в процессах переноса электронов, результатом которых может становиться генерация активного синглетного кислорода [5]. Среди прочего в запускаемые при этом окислительные процессы вовлекаются и сами фурокумарины. Образующиеся при этом вещества обладают интересной, на настоящий момент не полностью изученной биологической активностью [6]. Так, ряд исследователей полагает, что ключевую роль в ПУФА-терапии ответственны именно фотоокисленные псоралены (ФОПы), при этом вызываемый ими терапевтический эффект никак не связан с интеркаляцией ДНК и фотоприсоединением к тиминовым основаниям [7]. Так, например, при проведении экстракорпорального фотофереза для борьбы с Т-клеточным лимфоцитом у пациентов исчезают экземы, вовсе не подвергавшиеся облучению [8]. В работах коллектива под руководством А.Я. Потапенко было показано, что для многих заболеваний, поддающихся ПУФА-терапии, добиться терапевтического эффекта можно, не прибегая к облучению пациента после приема фурокумаринов, а проведя предварительное облучение растворов фурокумаринов и лишь затем вводя их пациентам [7].

Одной из ключевых проблем в развитии метода-ПУФА терапии является вопрос об

эффективности различных производных псоралена в ПУФА-терапии. В природе встречается

около 150 фурокумаринов [1], и все они обладают различной биологической активностью. В

фармацевтической практике используются не более двух десятков фурокумаринов, из них

около половины применяются в ПУФА-терапии: псорален, 5-метоксипсорален (5-МОП,

бергаптен) и 8-метоксипсорален (8-МОП, 5,8-диметоксипсорален (5,8-диМОП,

11

изопимпинеллин), 4,5',8-триметилпсорален (ТМП, триоксален), 4'-аминометил-4,5',8-

триметилпсорален и 4'-гидроксиметил-4,5',8-триметилпсорален (рис. 1) . Во многом это

обусловлено историческим ходом становления ПУФА-терапии: псорален и его

монометоксипроизводные были первыми фурокумаринами, фото сенсибилизирующая

активность которых была изучена и принята на вооружение медицинским сообществом [9].

Прообраз современной ПУФА-терапии впервые был предложен египетскими учеными в

1940-х годах [10]. Источником фурокумаринов в этих работах служило растение семейства

Зонтичные Амми большая (\Ammi та]и5 Ь.), мажорный фурокумариновый состав которого

представлен тремя метоксипроизводными псоралена - бергаптеном, ксантот�