Разработка и исследование микрочиповых аналитических систем для жидкостно-жидкостной экстракции и химических реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Казаков Василий Александрович

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОЧИПОВЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНОЙ ЭКСТРАКЦИИ И ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Специальность 02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Москвин Леонид Николаевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Зенкевич Игорь Георгиевич, кандидат технических наук Евстрапов Анатолий Александрович

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «. 20 » октября 2005 г.

В /5час. ООмин. на заседании диссертационного совета Д-212.232.37 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государсгвенном университете по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний пр., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. A.M. Горького по адресу: 199134, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.

Автореферат разослан « /V » сентября 2005 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

А.Г. Папсуева

¿Мб

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Увеличение количества объектов анализа и одновременно определяемых аналитов при серийном анализе проб, особепно в областях биоаналитической химии и медицинской лабораторной диагностики, необходимость быстрого определения содержания компонентов в различных объектах окружающей среды, живого мира и человека требует применения производительных автоматизированных аналитических систем В современной аналитической химии при анализе различных объектов все более широкое применение находят миниатюрные аналитические системы, основанные на применении микрофлюидных чипов (МФЧ). МФЧ представляют собой устройства плапарной геометрии площадью несколько квадратных сантиметров с разветвленной сетью микроканалов и микрореакторов с размерами по ширине и глубине в диапазоне от десятков мкм до нескольких мм.

Интегрирование в одном чипе нескольких дозаторов, смесителей, реакторов и колонок потенциально позволяет совместить стадии пробоподготовки и разделения аналитов с последующим детектированием сигнала в одном устройстве, и возникает возможность появления целого класса устройств с новыми функциональными, пользовательскими и аналитическими характеристиками.

Наряду с переносом традиционных аналитических методик пробоподготовки и определения веществ различными методами в микромасштаб без существенных изменений, при использовании чипов появляются возможности, часто недостижимые или труднореализуемые в макромасштабе. Это относится и к способам реализации жидкостной экстракции веществ в потоке в микроканалах чипов, и к одновременному проведению нескольких химических реакций в мультиреакторных чипах. В связи с этим необходимы теоретические и экспериментальные исследования по разработке новых микрочиповых аналитических систем, а также изучение процессов массопереноса в микрокапалах чипа в гомогенной и мультифазных жидкостных системах и оптимизация условий проведения химических реакций в микрореакторах.

Цель работы. Разработка и создание микрочиповых аналитических систем для проведения жидкостно-жидкостной экстракции веществ в микроканалах и химических реакций в микрореакторах с флуоресцентным детектором, позволяющим с высокой чувствительностью и пространственным разрешением проводить детальное изучение процессов, протекающих в микроструктурах чипов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: моделирование динамики протекания процессов массопереноса в микроканалах чипа; разработка системы детектирования и оценка её аналитических характеристик; практическое изучение процессов массопереноса в однофазной, двухфазной и трехфазной системах в потоке в микроканале чипа,

а также оптимизация условий проведения химической реакции (дериватизации катехоламинов) в микрореакторах мультиреакторного чипа.

Научная новизна. Предложена модель диффузионного переноса веществ в однофазных и двухфазных системах при контакте ламинарных микрофлюидных жидкостных потоков в микроканале чипа. Сравнением результатов численного моделирования и экспериментальных данных доказана адекватность предложенной модели. На основе результатов моделирования оценены равновесное время контакта потоков в микроканале чипа и соответствующие ему скорости движения жидкостей по микроканалу заданных размеров и формы.

Разработаны, созданы и исследованы аналитические системы на основе микрочипов для проведения жидкостной экстракции и химических реакций с флуоресцентным детектором на основе ПЗС-матрицы (прибор с зарядовой связью) и светодиода. Проведена оптимизация и оценка аналитических характеристик данного детектора применительно к микрочиповым системам.

Проведено изучение динамики процессов переноса веществ в поперечном сечении микроканала чипа в однофазной и двухфазной микрофлюидных системах потоков, достигнуто существенное ускорение экстракции веществ по сравнению с макромасштабом. Предложена экстракционная система с образованием трех фаз при контакте двух начальных микрофлюидных потоков жидкостей, обнаружен эффект значительного ускорения распределения вещества в подобной системе даже по сравнению с экстракцией в системе двух несмешивающихся жидкостей в микрочипе.

Оптимизирован ввод малых количеств проб в микрореакторы мультиреакторного чипа при проведении химической модификации внешней поверхности чипа. Выбраны оптимальные условия проведения модельной реакции (дериватизации катехоламинов) в микрореакторах чипа в зависимости от рН и температуры среды. Проведено сравнительное изучение кинетики взаимодействия норадреналина, адреналина и дофамина с 4-фтор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом в микрореакторах чипа.

Практическая значимость работы. Разработаны микрочиповые аналитические системы для проведения жидкостной экстракции в потоке и химических реакций в микрореакторах, на основе которых возможно создание микрочипового анализатора, обеспечивающего возможность проведения аналитических операций за десятки секунд с малым расходом реагентов (десятки нл/с) и малым объемом вводимых проб (2 мкл на реактор). Полученные результаты могут быть использованы при анализе веществ в областях медицинской лабораторной диагностики, биохимии и аналитической химии.

В резулыахах исследований заинтересованы институты биохимического и медицинского профиля, а также организации аналитического приборостроения: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (1 .Москва),

Институт аналитического приборостроения РАН (г.С-Петербург), НПФ АП «Люмэкс» (г.С-Петербург), Kanagawa Academy of Science and Technology (Япония)

Положения, выносимые на защиту.

1. Модель диффузионного переноса вещества в плоскости поперечного сечения микрокаиала чипа для однофазной и двухфазной систем и экспериментальное подтверждение ее адекватности.

2. Микрочиповые аналитические системы для проведения жидкостной экстракции веществ в потоке и химических реакций в микрореакторах с флуоресцентным детектором па основе ПЗС-матрицы и светодиода. Характеристики экспериментальных установок флуоресцентного детектирования с использованием эпифлуоресцентной оптической схемы возбуждения и сбора флуоресценции. Их применимость для определения аналитов в микрореакторах чипа и для детального изучения распределения веществ в поперечном сечении микроканала чипа.

3. Исследование динамики распределения веществ (флуоресцентные красители) в однофазной и двухфазной системах ламинарных соприкасающихся микрофлюидных потоков в микроканале чипа.

4. Исследование динамики образования трехфазной системы при контакте двух ламинарных жидкостных потоков в микроканале чипа и одновременного распределения вещества (флуоресцентный краситель) в этой системе.

5. Оптимизация условий протекания модельной реакции (дериватизация катехоламинов) в микрореакторах девятиреакторного чипа в зависимости от температуры и pH среды.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 7 тезисах докладов на конференциях. Основные результаты работы докладывались на следующих конференциях: Colloquium Spectroscopicum Internationale CSI ХХХШ (2003, Granada, Spain); V Всероссийская конференция no анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003» (2003, С-Петербург) (2 доклада); Всероссийская конференция «Аналитика России-2004» (2004, Москва) (2 доклада); «Pittconv2005» (2005, Orlando (FL), USA), 2-я Всероссийская конференция «Аналитические приборы» (2005, С-Петербург).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включая 64 рисунка, 15 таблиц и 169 наименований в списке цитируемой литературы.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Во введении дано обоснование актуальности создания микрочиповых аналитических систем. Здесь же сформулирована цель работы, указаны её новизна и практическая значимость.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Критически, с точки зрения возможности создания микрочиповых систем, интегрирующих несколько стадий химического анализа, рассмотрены основные операции, проводимые в микроструктурах чипов. МФЧ могут использоваться в аналитической химии как при пробоподготовке (жидкостная или твердофазная экстракция, абсорбция), так и при разделении смесей аналитов с последующим их определением (капиллярный электрофорез, электрохроматография). Характерной особенностью является возможность совмещения нескольких аналитических операций с одной или многими пробами на одном чипе, изготовленном из стекла и/или кремния, различных видов пластика.

Основными требованиями, предъявляемыми к микрочиповым системам детектирования являются высокая чувствительность из-за малого абсолютного количества определяемого вещества и совместимость детектора с чипом. Наиболее удовлетворяют этим требованиям спектроскопические методы, среди которых наиболее популярны в микрочиповой практике люминесцентные методы. Преимуществами использования последних являются высокая чувствительность, возможность детектирования сигнала в полупрозрачных структурах в любой локальной области чипа, а также возможность регистрации двухмерного распределения сигнала в плоскости чипа.

Следует отметить, что существующие варианты микрочиповых систем не полностью реализуют все потенциальные возможности, что связано, например, с недостаточной изученностью процессов массопереноса в потоке в микроканале. Наряду с распространенным в аналитической практике методом экстракции в двухфазной системе до сих пор не реализованы новые способы проведения экстракции, например, в трехфазной системе.

На основании обзора литературы была сформулирована задача настоящего исследования, заключающаяся в разработке и создании аналитических систем на основе стеклянно-кремниевых микрочипов с флуоресцентным детектором. Кроме того, поставлены задачи теоретического и экспериментального исследования процессов массопереноса, происходящих в микроканале, с целью создания систем и новых способов реализации жидкостной экстракции, а также задачи исследования протекания химических реакций в микрореакюрах.

2. СОЗДАНИЕ МИКРОФЛЮИДНЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ

МФЧ, использованные в настоящей работе, были изготовлены методом анизотропного химического травления микроструктур (микроканалы, микрореакторы) в кремниевых пластинах с последующей анодной посадкой на кремний покровных пластин стекла.

Для изучения процессов массопереноса был разработан Н-образный микрочип (Н-чип), топология которого и габаритные размеры приведены на рис.1,а. Микрочип представлял собой совокупность двух боковых микроканалов подвода жидкостных потоков, центрального микроканала их контакта и двух боковых микроканалов слива жидкостей из микрочипа. Расположение боковых микроканалов под прямым углом по отношению к центральному было обусловлено технологичностью изготовления, а дайна центрального микроканала, равная 45 мм, была ограничена стандартом на размер технологических заготовок. Выбор прямой формы микроканалов без поворотов был связан со стабилизацией поверхности раздела при создании соприкасающихся потоков фаз по микроканалу. Форма поперечного сечения микроканала чипа с указанием размеров приведена на рис.1,Ь. Размеры поперечного трапецевидного сечения микроканала были выбраны, как результат компромисса между уверенным детектированием сигнала в микроканале и скоростью распределения вещества в его поперечном сечении.

Для проведения химических реакций был разработан 9-ти реакторный чип (9р-чип). В микрочипе, как видно из рис.1,с, были расположены 9 ячеек ввода проб, которые соединялись с 9 микрореакторами и общим каналом слива. Плотность расположения микрореакторов задавалась из учета одновременного детектирования сигнала от всех реакторов и была ограничена возможностями технологии изготовления. Выбранные размеры микрореакторов, приведенные на рис. 1,<1, являлись результатом компромисса между малым количеством используемых проб и уверенным детектированием сигнала.

55 мм

С) . 60 мм

Рис.1 Микрофлюидиый Н-чип для изучения массопереноса веществ

(a). Форма и размеры поперечного сечения микроканала Н-чипа

(b) Микрофлюидный 9р-чип для проведения химических реакций (с) Форма и размеры

микрореактора 9р-чипа (ф.

Разработанная экспериментальная установка, в которой использовались Н-чип или 9р-чип, состояла из трех систем. В системе создания микрофлюидных жидкостных потоков в качестве побудителей потоков жидкостей использовались микроптприцевые насосы Типичные скорости жидкостных потоков в микроканале составляли единицы-десятки мкл/мин. Система детектирования была создана на основе эпифлуоресцентной схемы возбуждения и сбора флуоресценции при использовании микроскопа. Подобная схема характеризуется расположением потоков возбуждающего излучения и флуоресценции на одной опшческой оси, расположенной под прямым углом к плоскости чипа На рис.2 приведена схема экспериментальной микрочиповой установки флуоресцентного детектирования. Источником возбуждения флуоресценции служил твердотельный светодиод 3, для фильтрации длинноволнового излучения которого использовался светофильтр 4. Для отражения излучения диода на плоскость чипа 1 использовалось дихроичное зеркало 5, которое было прозрачно для флуоресцентного излучения пробы. Регистрация флуоресценции после выделения спектрального диапазона флуоресценции светофильтром б производилась при помощи ПЗС-матрицы 7, находящейся в корпусе видеокамеры. Оцифрованный платой АЦП 8 сигнал с

матрицы выводился на компьютер 9.

Рис.2. Микрочиповая установка флуоресцентного детектирования: 1-микрочип; 2-объектив; 3- светодиод; 4,6-светофильтры; 5-дихроичное зеркало; 7-ПЗС-матрица; 8-АЦП; 9-компьютер Стрелками показаны потоки возбуждающего (а) и флуоресцентного (Ь) излучения.

В качестве модельных веществ при изучении массопереноса были выбраны красители флуоресцеин и родамин 6Ж; изучение протекания реакций в микрореакторах проводили на примере образованием флуоресцирующих продуктов, используемых веществ были выбраны спектралыше характеристики элементов системы детектирования, которые позволяли проводить регистрацию флуоресценции в спектральном диапазоне 530-580 пм или 580-640 нм при возбуждении флуоресценции излучением в диапазоне 470-490 нм или 520-540 нм. Оптические характеристики установок, такие как поле наблюдения и разрешающая способность позволяли проводить одновременное детектирование флуоресцентного сигнала сразу от всех микрореакторов 9р-чшта или наблюдать за протеканием процессов массопереноса в поперечном сечении микроканала Н-чипа.

дериватизации катехоламинов с На основании характеристик

Разработанная система поддержания и контроля температуры в микрореакторах 9р-чгипа позволяла проводить нагревание реакционной смеси в диапазоне температур от 30 до 60° С, при использовании внешних но отпошениго к чипу термоэлектрических модулей. Скорости нагрева жидких проб в микрореакторах составляли -4.5 °С/с.

3. ОЦЕНКА И ОПТИМИЗАЦИЯ РАБОЧИХ ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ ПЗС-МАТРИЦЫ

Экспериментальные микрочиповые установки флуоресцентного детектирования были созданы на основе ПЗС-матриц. Выбор ПЗС-матрицы в качестве детектора флуоресцентного излучения был обусловлен возможностью получения двухмерного распределения интенсивности флуоресценции в микроструктурах чипа, возможностью одновременного считывания сигнала от различных зон в плоскости микрочипа в пределах наблюдаемой области и возможностью накопления сигнала во времени непосредственно на самой матрице. Используемые в работе ПЗС-матрицы характеризовались размерами фотоприемной поверхности 6 (тип 1/3") или 8 мм (тип 1/2").

Сначала в качестве детектора флуоресценции была выбрана наиболее доступная матрица типа 1/3", которая управлялась в режиме телевизионного сигнала с фиксированным временем экспозиции кадра (40 мс) и была неохлаждаемой в ходе работы. Оцифровка сигнала матрицы проводилась при использовании 8-битной платы АЦП. Измерение интенсивности флуоресценции проводили в стеклянных капиллярах внутренним диаметром 600 мкм при использовании боратных буферных растворов (10 мМ, рН 9.18) флуоресцеина и родамина 6Ж. Для расширения диапазона определяемых концентраций эа счет увеличения отношения сигнал/шум использовали алгоритм усреднения и математической обработки нескольких кадров изображения. При этом значение шума уменьшалось пропорционально корню квадратному из числа обработанных кадров. Пределы обнаружения детектора по флуоресцеину или родамину 6Ж для 50 кадров при этом составляли - 10"6 М, а линейный диапазон определяемых концентраций составлял примерно 2 порядка (~ 2х10"6- 3.5х10'4 М).

С целью улучшения характеристик дегекгора была выбрана ПЗС-матрица типа 1/2", режим управления которой позволял изменять время экспозиции кадра изображения в диапазоне от 160 мс до 20 минут. При этом температура матрицы в ходе работы поддерживалась равной -10 °С. Оцифровка аналогового сигнала от матрицы проводилась с разрядностью 12 бит. Оценку аналитических возможностей охлаждаемой ПЗС-матрицы типа 1/2" проводили при использовании боратных буферных растворов флуоресцеина (10 мМ, рП 9.18) или спиртовых растворов родамина 6Ж, помещенных в микрореакторы 9р-чипа или микроканалы Н-чипа. Пределы обнаружения детектора по родамину при проведении измерений интенсивности флуоресценции в микроканале Н-чипа

составляли -5x10"6 М, а по флуоресцеину при проведении измерений в микрореакюрах 9р-чипа составляли ~ 2х10"9 М при времени экспозиции кадра 1.6 с. Подобная разница объясняется изменением светосилы и эффективности сбора флуоресценции установки детектирования при изменении ее оптических характеристик, 1аких как поле зрения и интегральное увеличение системы, а также изменением характеристик объекта наблюдения (МФЧ). В диапазоне времен экспозиции 0.16-1.6 с линейный диапазон определяемых детектором концентраций составлял ~2 5 порядка. Следует отметить высокую чувствительность разработанного флуориметрического детектора: например, в пересчете па абсолютное количество определяемого вещества концентрация 2х10'а М, исходя из объема микрореактора 260 нл, соответствует -5x101 моль или ~ 107 молекул (флуоресцеин).

4. ПРОЦЕССЫ МАССОПЕРЕНОСЛ В МИКРОКАНАЛЕ ЧИПА Моделирование процессов переноса вещества в поперечном сечении микроканала проводилось для предварительной оценки скоростей потоков жидкостей но микроканалу. Модельные представления, учитывающие реальные размеры сечения микроканала (рис.1,Ъ), позволяли оценить равновесное время контакта жидкостей в нем. Построение моделей базировалось на принципе диффузионного распределения вещества Сродамин, флуоресцеин) в гомогенной водной среде или двухфазной chcicmc с учетом коэффициента распределения Данное допущение является вполне оправданным при создании двух ламинарных соприкасающихся потоков жидкостей в микроканале чипа.

Математический аппарат для количественного описания процессов диффузии был основан на применении дифференциального уравнения Фика и его численном решении в частных производных. При моделировании диффузии флуоресцеина в водной среде и моделировании диффузионного переноса родамина из водной в органическую фазу (октанол-1) проводили расчеты изменения концентрации во времени в отдающей и принимающей частях системы при условии равенства их объемов. Коэффициент распределения флуоресцеина в водной системе принимался равным 1, а коэффициент распределения родамина в системе «вода-октанол» на основании эксперименталышх данных составлял 11.7 При расчетах использовали компьютерные программы Macsyma Front End V.2.7.0 и MathCad2001.

Численные расчеты изменения концентрации вещества во времени в каждой точке плоскости поперечного сечения микроканала проводили при использовании дифференциального уравнения Фика для двух координат диффузии (двухмерная модель диффузии):

dC(x,y,t) D ? d2C(x,y,t) | d2C(x,y,t) dt 1 дх1 ду2

где С- концентрация вещества I, моль/дм3, в момент времени I в точке раствора внутри канала с координатами х и у; ГЬ-коэффициент диффузии вещества I в воде или коэффициент диффузии вещества I в октаноле.

В результате моделирования были получены профили аналитического сигнала (интенсивность флуоресценции) в поперечном сечении микрокапала для различных времен диффузии вещества (контакта фаз) в гомогенной и двухфазной системах. На основании полученных результатов моделирования была проведена оценка скоростей потоков, необходимых для достижения равновесного распределения модельного вещества в системе. Скорости потоков, необходимые для равновесного распределения модельного вещества в поперечном сечении микроканала Н-чипа составили 21 нл/с для однофазной системы и 8 нл/с для двухфазной системы.

Адекватность моделей диффузионного распределения вещества проверяли при сравнении полученных практических результатов с результатами расчетов для условий эксперимента.

Экспериментальное изучение динамики процессов массопереноса в однофазной системе проводилось при создании водных соприкасающихся ламинарных потоков раствора флуоресцеина и боратного буферного раствора в микроканале Н-чипа. На рис.3 показапы экспериментальные фотографии смешивания микрофлюидных потоков жидкостей в микроканале Н-чипа и соответствующие им профили интенсивности флуоресцетщии в поперечном сечении микроканала в зависимости от времени контакта потоков.

Сравнением практических результатов при равных скоростях потоков и модельных представлений был доказан диффузионный характер процессов смешивания потоков при их ламинарном течении по микроканалу (рис.3,Ь).

Рис.3. Протекание смешивания соприкасающихся водных потоков в микроканале Н-чипа во времени (а). Профили флуоресцентного сигнала детектора в поперечном сечении микроканала (соответствуют фотографии-ям) (Ь). Времена контакта потоков (с): 1- 0.1, 2- 1.7, 3- 124. Кривые -результат модельных расчетов.

Система: боратный буферный раствор (10 мМ, рН 9 18) флуоресцеина (Сс^хЮ5 М) / боратный буферный раствор.

Изучение динамики массопереноса в двухфазной системе проводили на примере жидкостно-жидкостной экстракции родамина в системе «октанол-вода» при ламинарном гонении соприкасающихся потоков фаз по микроканалу Н-чипа. Па рис.4 представлены фотографии и профили интенсивности флуоресценции, полученные для данной системы.

250

Рис 4 Жидкостная экстракция родамина 6Ж из водной фазы в октанол в микроканале Н-чипа (а). Профили интенсивности флуоресценции в поперечном сечении микроканала при различных временах контакта фаз (соответствуют фотографиям) (Ь) Времена контакта потоков фаз (с): 1- 0.1/0.5; 21.8/7.1; 3- 3.4/13.6 (водн/орг). Кривые - результаты модельных расчетов. Система: боратный буферный

раствор (10 мМ, рН 9.18) родамина (Со=5х10 М) / октанол-1.

Сравнение практических результатов и модельных представлений для условий проведения эксперимента показало адекватность описания процессов с помощью предложенной модели диффузионною массопереноса (рис.4,Ъ). Как показано в этом разделе, модельные расчеты позволяют также оценивать равновесное время контакта фаз в проточных экстракционных системах для микрокапалов различной формы и геометрических размеров.

Наблюдаемое в условиях эксперимента различие в объемных скоростях потоков фаз по микроканалу (временах контакта фаз) позволяло достичь концентрирования родамина в принимающей фазе (Кко„ц=2.3) даже в условиях неравновесного протекания экстракции в пот-оке (рис.4). Таким образом, было показано, что при реализации жидкостной экстракции в микрочипе путем создания в микроканале двух соприкасающихся ламинарных потоков фаз можно достичь быстрого и достаточно эффективного концентрирования вещества в несколько раз.

На практике не удалось достичь равновесного распределения родамина в двухфазной системе экстракции в потоке, что было связано с нестабильностью поверхности раздела фаз при реализации скоростей микрофлюидных жидкостных но гоков меньше 50 мкл/мин (водная фаза) и 10 мкл/мин (органическая фаза). Стабилизации поверхности раздела при малых скоростях потоков по литературным данным можно достичь при использовании микрочипов со специальной геометрией сечения микроканалов.

На основании полученных результатов по численному моделированию и практических данных (рис. 3-4) можно сделать общий вывод, что равновесное распределение модельного вещества в сечении микроканала чипа наблюдается при времени контакта микрофлюидных потоков несколько десятков секунд. Такие малые равновесные времена контакта потоков в системе без применения механических смесителей обусловлены большим соотношением площадь конгакта/объем жидкости в микроканале и малыми расстояниями диффузии веществ.

Для повышения скорости распределения вещества в поперечном сечении микроканала была предложена трехфазная система экстракции (ТФСЭ). На основании предварительного изучения условий образования ТФСЭ в стационарных условиях в сосуде была выбрана система двух гомогенных растворов Р1 (гептан-хлористый метилен-ацегонитрил = 10:2.5:1 но объему) и Р2 (вода-ацетонитрил = 1.25:1 по объему), при контакте которых происходит образование грех сосуществующих фаз. В качестве модельного вещества при изучении образования ТФСЭ в микроканале использовали родамин 6Ж, вводимый в состав Р2 (Сй=5.72х104М).

Рис.5. Экстракция в образующейся трехфазной системе в микроканале Н-чипа. Образование потоков трех фаз в микроканале (а). Профили интенсивности флуоресценции в сечении микроканала для разных времен контакта двух исходных микрофлюидных потоков (соответствуют фотографиям) (Ь). Время кон-■«■"■»■ такта потоков (с): 1-

Я) Ь) 0.05; 2- 0.15; 3- 0.75; 4-

1.10.

При контакте двух начальных микрофлюидных потоков в микроканале чипа происходило образование неполярной органической фазы, содержащей преимущественно гептан; водной фазы (ВФ) и принимающей по отношению к красшелю ор1анической фазы (ПФ). Стабилизации «струйного» течения грех сосуществующих фаз по микроканалу достигли при соотношении объемных скоростей потоков Р1:Р2=2:1 (рис.5,а).

Для повышения коэффициента распределения родамина между ПФ и ВФ вводили в состав исходного раствора красителя (Р2) добавку КС1. При эгом Краспр родамина при наблюдаемых в эксперименте условиях изменялся от 2.6 (без добавки КС1) до 43.0 (СКсу=300 мМ), а Кк01Ш родамина в ПФ по отношению

100 150

V ......

25(

к Р2 составлял соответственно 1.4 или 1.7. Состав принимающей фазы, содержащей ацетонитрил (-55 %), хлористый метилен (~23 %) и гептан (-22 %) был измерен 1 азохроматографически при наблюдаемом в эксперименте (рис.5) соотношении объемов (объемных скоростей потоков в микроканале) исходных растворов 2:1 (Р1:Р2). Полученные результаты являются обоснованием применимости ТФСЭ на стадии пробоподготовки: возможно выделение аналитов из исходных матричных растворов в новую фазу, преимущественно содержащую широко распространенные в аналитической практике растворители. Более высоких показателей Ккинц и Крашр можно достичь дальнейшей оптимизацией составов исходных растворов, а также реализацией, например, ион-парного механизма экстракции.

На рис. 5,Ь приведены экспериментальные профили аналитического сигнала (АС) в поперечном сечении микроканала. Наблюдаемое значение АС от ПФ (кривая 4), было сравнимо со значением АС от исходного раствора Р2 (кривая 1), хотя равновесный Кконц для этих условий составлял 1.7. Подобный факт объяснялся более высокой скоростью течения потока ПФ по микроканалу по сравнению со скоростью образующегося отдающего водного потока, что обуславливало разбавление красителя при переходе в эту фазу в 1.48 раза (соотношение скоростей потоков) по сравнению со стационарными условиями проведения экстракции. Сравнение Ккшщ, полученного в равновесных условиях проведения экстракции в сосуде и К^ц, полученного в микроканале и приведенного к стационарным условиям, показало высокую эффективность протекания экстракции родамина в ПФ. Для условий эксперимента наблюдался перенос родамина в ПФ на уровне 80 % от равновесного. Малое время установления равновесия в системе обусловлено механизмом протекания массопереноса в условиях выделения большей части ацетонитрила из исходного водно-органического раствора в отдельную фазу с одновременным переходом в нее молекул красителя, а также малой шириной образующейся ПФ в сечении микроканала. Отметим, что подобная мультифазная система экстракции в микроканале чипа предложена впервые. Реализация трехфазной системы в потоке является характеристичной только для микроканалов, а результаты показывают, что достигнуто значительное ускорение экстракции по сравнению даже с микрочиповой реализацией двухфазной системы.

5. ДЕРИВАТИЗАЦИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В МИКРОРЕАКТОРАХ ЧИПА

Задача проведения и оптимизации условий химической реакции в микрореакторах 9р-чина была решена с использованием в качестве модельной реакции дериваттации катехоламинов с реагентом МВИ-Р (4-фтор-7-нитробснзо-2-окса-1,3-диазол) с образованием флуоресцирующих продуктов (^,=460-490 пм; Хст=515-540 нм). Определение содержания катехоламинов (КА) в биопробах, являющихся гормонами в организме человека, является важной задачей при диагностике нервных и психических заболеваний. С точки

зрения минимизации расхода проб и дорогостоящих реагентов в ходе анализа и возможности одновременного анализа нескольких образцов проб привлекательным является использование мультиреакторного чипа.

Ввод проб в микрореакторы 9р-чипа (рис.1) осуществлялся при использовании шприца с предварительным раскапыванием образцов в ячейки ввода. С целью оптимизации ввода малых количеств проб в микрореакторы и предотвращения их неконтролируемого растекания по поверхности кремниевой подложки чипа проводили химическую модификацию поверхности подложки. При использовании модификатора диметилдихлорсилана удалось повысить контактный угол смачивания кремния водой от 40-50 до 80-90°. При этом минимальный объем пробы для успешного заполнения одного реактора чипа составлял 2 мкл.

С целью минимизации влияния конкурирующей реакции гидролиза реагента в щелочной среде и ускорения протекания дериватизации при использовании 12 мМ боратных буферных растворов норадреналина проводили оптимизацию условий проведения реакции от рП (от 7.0 до 9.0) и температуры реакционной смеси в микрореакторах (от 20 до 60 °С). Реакционную смссь готовили смешиванием буферного раствора катехоламина с ацетонитрильным раствором реагента в соогношении 1:1 по объему. Оптимальными с точки зрения скорости проведения дериватизации и минимизации вклада продукта гидролиза реагента N604'' в общий сигнал флуоресценции были признаны рН реакционной смеси 8.3-8.6 и температура внутри микрореактора, Т=50°С. В эшх условиях деривашзация проходила за 3-4 минуты с момента приготовления смеси при расходе реакционной смеси на один микрореактор 4 мкл. Было продемонстрировано одновременное проведение дериватизации норадреналина в 9 микрореакторах с детектированием флуоресцентного

300

сигнала от всех реакторов.

Рис б Зависимости скорости возрастания АС от концентрации катехоламина в растворе в микрореакторах 9р-чипа.

1- адреналин;

2- норадреналии;

3- дофамин

Условия: рН реакционной смеси 8.5; температура реакционной смеси 22 "С.

0 12 3 4

С ,х Ю-5 моль/дм*

Было проведено сравнительное изучение кинетики взаимодействия норадреналина, адреналина и дофамина с реагентом N30-? в микрореакторах чипа. При построении зависимостей скорости роста флуоресцентного сигнала от концентрации КА в реакционной смеси проводили вычитание из общего сигнала детектора фонового сигнала и сигнала флуоресценции продукта гидролиза реагента, измеренных в отдельных микрореакторах, заполненных водой или холостой реакционной смесью соответственно.

По наклону кривых 1-3 (рис.б) и с учетом квантовых выходов продуктов дериватизации, дофамин взаимодействовал с ГОЮ-Б в 3 раза быстрее, чем норадреналин, и в 7 раз быстрее, чем адреналин. Подобный факт объясняется различиями в химическом строении молекул КА.

Полученные зависимости скорости роста флуоресцентного сигнала от концентрации катехоламина в реакционной смеси линейны, что может служить основой для определения КА в растворах кинетическими методами при использовании микрочипов.

ВЫВОДЫ

1. Созданы микрочиповые аналитические системы на основе разработанных стеклянно-кремниевых чипов для проведения жидкостной экстракции в потоке или химической реакции в микрореакторах с использованием флуоресцентного детектора на основе ПЗС-матрицы и твердотельного светодиода.

2. Предложена и подтверждена экспериментально модель диффузионного переноса вещества при ламинарном течении соприкасающихся микрофлюидных потоков по микроканалу, позволяющая предсказать размеры микроканалов и топологию чипа.

3. Проведено изучение динамики процессов массопереноса в гомогенной водной среде и системе двух несмешивающихся жидкостей. Показано, что время, необходимое для диффузного смешивания и экстракции в микроканале чипа с размерами поперечного сечения порядка 200 мкм (ширина)хЮО мкм (глубина), может быть значительно сокращено но сравнению с аналогичными процессами, реализуемыми в макромасштабе (20 с для смешивания и 50 с для экстракции).

4. Предложена система экстракции с образованием трех сосуществующих фаз в микроканале при контакте двух начальных микрофлюидных потоков. Показано, что механизм массопереноса существенно отличается от двухфазной системы и продемонстрирована высокая эффективность экстракции модельного вещества в образующуюся принимающую фазу для времени контакта двух исходных растворов около 1 с.

5. Оптимизирована процедура ввода малых количеств реакционной смеси в мультиреакторный чип путем проведения химической модификации поверхности чипа Объемы вводимых проб составили 2-4 мкл при заполнении одного микрореактора. На примере дериватизации катехоламинов с реагентом NBD-F проведена оптимизация условий протекания реакции в микрореакторах в зависимости от рН и температуры, и показана возможность применения созданной микрочиповой системы для проведения стадии дериватизации при анализе катехоламинов.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

Статьи:

1. Сляднев M. Н., Казаков В. А., Щербаева М. В., Ганеев А. А., Москвин Л. Н., Золотое Ю. А. Система детектирования для микрофлюидных чипов на принципах эпифлуоресцентной видеомикроскопии и ее аналитические возможности'/ Журнал аналитической химии. 2005. Т.60. № 4. С. 357-366.

2. Сляднев М.Н., Казаков В.А., Макаров Е.Д., Ганеев А.А., Москвин Л.Н. Микрофлюидная система экстракции с химически индуцированным образованием трех фаз в потоке// Научное Приборостроение. 2005. Т.15. №2. С. 11-20.

3. Сляднев М.Н., Казаков В.А., Лаврова М.В., Ганеев А.А., Москвин Л.Н. Микрочиповая мультиреакторная система для биохимического анализа// Научное Приборостроение. 2005. Т.15. №2. С.41-50.

4. Kazakov V.A., Lavrova M.V., Ganeev A.A., Moskvin L.M., Slyadnev M.N. Surface Modification of Microchip Input Reservoirs for Pressure-induced Sample Injection into Microreactors//Analytical Sciences. 2005. V.21. No.4. P 293-294.

Тезисы докладов:

1. Slyadnev M., Kazakov V., Scherbaeva M., Ganeev A. Development of a CCD-bazed Fluorescence Imaging Detector for Multiplex PCR System on a microchip//Colloquium Spectroscopicum Internationale CSI ХХХШ. Granada (Spain), 7-12 Septcmbcr 2003. MO-O-18, P. 35.

2. Сляднев M.H., Катков B.A., Щербаева M.B., Ганеев А.А., Москвин Л.Н. Флуориметрический детекгор для микрофлюидных систем//Тез. докл. V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003». Санкт-Петербург, 6-10 октября 2003 г. С. 83.

3 Сляднев М.Н., Казаков В.А., Щербаева М.В., Ганеев А.А. Микрочиповые аналитические системы для биохимической и медицинской диагностики// Тез. докл. V Всероссийской конференции по анализу объектов

окружающей среды «Экоаналитика-2003». Санкт-Петербург, 6-10 октября 2003 г. С. 84.

4. Сляднев М.Н., Казаков В.А., Щербаева М.В., Ганеев A.A., Москвин JI.H. Микрофлюидные аналитические системы для жидкостно-жидкостной экстракции//Тез. докл. Всероссийской конференции «Аналитика России-2004». Москва, 27 сентября - 1 октября 2004 г. С. 95.

5. Сляднев М.Н., Казаков В.А., Щербаева М.В., Ганеев A.A. Бесконтактный нагрев жидкости и контроль температуры в микрочиповом ПЦР-анализаторе//Тсз. докл. Всероссийской конференции «Аналитика России-2004». Москва, 27 сентября - 1 октября 2004 г С. 99.

6. Slyadnev M.N., Kazakov V.A.., Scherbaeva M.V., Ganeev A.A., Moskvin L.N. Development of a Microchip Real-Time PCR System with a Fluorescence Imaging Detector//Pittcon42005. Orlando (FL, USA), 27 Feb.- 04 March 2005. P. 910.

7. Сляднев M.H., Казаков B.A., Ганеев A.A., Москвин JI.H. Микрофлюидная трехфазная система экстракции в потоке с образованием акцепторной фазы//Тез. докл. 2-ой Всероссийской конференции «Аналитические приборы». Санкт-Петербург, 27 июня - 1 июля 2005 г. С. 126-127.

Отпечатано копировально-множительным участком отдела обслуживания учебного процесса физического факультета СПбГУ. Приказ № 571/1 от 14.05.03. Подписано в печать 09.05 с оригинал-макета заказчика. Ф-т 30x42/4, Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз., Заказ № 247/с 198504, СПб, Ст. Петергоф, ул. Ульяновская, д. 3, тел. 428-43-00.

№16596

РНБ Русский фонд

2006г4 10946

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Микрофлюидные чипы в аналитической химии и биохимии

1.2. Способы изготовления микрофлюидных чипов

1.3. Системы подачи проб и реагентов

1.4. Системы детектирования для микрочипов

1.5. Поддержание и контроль температуры в микроструктурах чипов

ГЛАВА 2. СОЗДАНИЕ МИКРОЧИПОВЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ

2.1. Микрофлюидные чипы для изучения процессов массопереноса веществ и проведения реакций

2.2. Система подачи проб и реагентов

2.3. Система флуоресцентного детектирования при использовании ПЗС-матрицы

2.4. Система нагрева жидкости и поддержания температуры в микрореакторах чипа

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА И ОПТИМИЗАЦИЯ РАБОЧИХ ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЗС-МАТРИЦЫ

3.1. Оценка аналитических характеристик системы детектирования при использовании ПЗС-матрицы телевизионной камеры наблюдения

3.2. Оценка и оптимизация рабочих параметров системы детектирования при использовании ПЗС-матрицы специализированной камеры

ГЛАВА 4. ПРОЦЕССЫ МАССОПЕРЕНОСА В МИКРОКАНАЛЕ ЧИПА

4.1. Моделирование процессов массопереноса в микроканале чипа

4.2. Динамика процессов массопереноса вещества в гомогенной системе двух водных микрофлюидных потоков в микроканале чипа

4.3. Динамика процессов массопереноса вещества в системе микрофлюидных потоков двух несмешивающихся жидкостей в микроканале чипа

4.4. Процессы массопереноса вещества в трехфазной жидкостной системе в микроканале чипа

4.4.1. Изучение условий образования трехфазной системы в стационарных условиях

4.4.2. Образование трехфазной системы и динамика процессов массопереноса вещества в ней в микроканале чипа

ГЛАВА 5. ДЕРИВАТИЗАЦИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В МИКРОРЕАКТОРАХ ЧИПА

5.1. Оптимизация ввода проб в микроструктуры мультиреакторного чипа

5.2. Дериватизация катехоламинов в микрореакторах чипа

Увеличение количества объектов анализа и одновременно определяемых аналитов при анализе проб, особенно в областях биоаналитической химии и медицинской лабораторной диагностики, необходимость быстрого определения содержания компонентов в различных объектах окружающей среды, живого мира и человека требует применения производительных автоматизированных аналитических систем. Б современной аналитической химии при анализе различных объектов все более широкое применение находят миниатюрные аналитические системы, потенциально позволяющие совмещать в одном устройстве несколько стадий химического анализа и проводить одновременное определение содержания компонентов в нескольких пробах.

Развитие технологий микроэлектроники привело к появлению и использованию для аналитических целей микрофлюидных чипов (МФЧ). Они представляют собой миниатюрные устройства планарной геометрии, в которых создана разветвленная сеть микроструктур (микроканалов и микрореакторов). Площадь МФЧ составляет всего несколько квадратных сантиметров, а размеры микроструктур по ширине и глубине обычно находятся в диапазоне от десятков мкм до нескольких мм.

К преимуществам применения микрочипов следует отнести малый расход проб и реагентов в ходе проведения анализов; возможность интеграции стадий пробоподготовки и определения на едином устройстве; ускорение протекания химических реакций, процессов массо- и теплопереноса из-за значительного увеличения отношения площадь поверхности/объем по сравнению с обычными реакторами и другие. Типичные объемы проб при работе с чипами находятся в диапазоне от нл до сотен мкл, что позволяет использовать такие устройства не только при определении традиционных веществ неорганической природы, но и, например, при анализе объектов в областях медицинской клинической диагностики, биохимии и лабораторной криминалистике, где расход дорогостоящих реагентов и малый объем проб часто являются ключевыми факторами.

Традиционно микрочипы изготавливают из пластин стекла и/или кремния путем химического или ионным травления в них микроструктур и спеканием двух пластин для получения готового изделия. Мнкрочипы из пластика часто изготавливают методом термопластической штамповки или лазерной фотоабляцни пластин материала, а для герметизации микроструктур проводят процедуру ламинирования.

В настоящее время показаны возможности проведения и интеграции на одном чине ряда операций и процессов: (бно)химических реакций в проточной мнкроканальной системе или в микрореакторе; жидкостной и твердофазной экстракции в потоке; абсорбции; разделения компонентов смеси методами хроматографии и капиллярного электрофореза.

Существующие работы в направлении микрочиповой тематики часто фокусируются на переносе традиционных методик пробоиодготовки и определения веществ различными методами в микромасштаб без существенных изменении. Однако при использовании чипов появляются возможности, часто недостижимые или труднореализуемые в макромасштабе, что связано с характеристическим особенностями микроструктур. Это относится и к способам реализации жидкостно-жпдкостной экстракции (ЖЖЭ) веществ в потоке в микроканалах чипов, и к параллельному проведению нескольких химических реакций в мультиреакторпых чипах. Потенциальным преимуществом при использовании микрофлюидных систем для проведения ЖЖЭ является, прежде всего, высокое соотношение площади поверхности контактирующих потоков к объёму фаз и малые расстояния диффузии веществ в поперечном сечении микроканала, что позволяет рассчитывать на высокие скорости протекания экстракции.

Предварительные оценки показывают, что в микроканалах возможна реализация устойчивых мультифазных систем в потоке, добиться существования которых в макромасштабе затруднительно, а их применение может привести к значительному ускорению процессов массопереноса веществ. Кроме того, до сих пор актуальными являются задачи ввода минимальных объемов проб, параллельного проведения нескольких химических реакций н одновременного анализа нескольких проб в мультиреакторпых чипах, и решение этих задач позволяет приблизиться к созданию микрочиповых анализаторов.

Таким образом, необходимы теоретические и экспериментальные исследования по разработке новых микрочиповых аналитических систем, а также изучение процессов массопереноса в микроканалах чипа в гомогенной и мультифазных жидкостных проточных системах и оптимизация условий проведения химических реакций в нескольких микрореакторах чипа с минимальным расходом реакционной смеси.

Цель данной работы заключалась в разработке и создании микрочиповых аналитических систем для проведения ЖЖЭ веществ в потоке в микроканалах и химических реакций в микрореакторах МФЧ с флуоресцентным детектором, позволяющим с высокой чувствительностью и пространственным разрешением проводить детальное изучение процессов, протекающих в микроструктурах чипов.

- 139-ВЫВОДЫ

1. Созданы аналитические системы на основе разработанных стеклянно-кремниевых микрочигюв для проведения жидкостной экстракции в потоке в микрокапале или химической реакции в микрореакторах при использовании флуоресцентного детектора на основе ПЗС-матрицы с использованием в качестве источников возбуждения флуоресценции твердотельных светодиодов. При создании установок детектирования реализована эпифлуоресцентная схема возбуждения и сбора флуоресценции. К преимуществам создания подобных установок следует отнести высокую чувствительность детектора во всей видимой области спектра и возможность легкой перестройки системы детектирования при замене ее спектральных элементов (светодиод, интерференционные светофильтры и др.). Эти особенности способствуют расширению аналитических возможностей системы детектирования, и становится возможным наблюдать флуоресценцию веществ в микроструктурах чипов, начиная от области зеленой флуоресценции и заканчивая красной областью видимого света.

2. Проведено изучение динамики процессов массопереноса веществ в поперечном сечении микроканала Н-образного чипа в гомогенной водной среде (диффузия флуоресцеина) и системе двух иесмешивающихся жидкостей (экстракция родамина 6Ж из водной в октанольную фазу). С помощью предложенных моделей диффузионного переноса вещества в плоскости сечения микрокаиала чипа, адекватно описывающих происходящие в условиях экспериментов процессы, доказан преимущественно диффузионный механизм процессов массопереноса при ламинарном течении соприкасающихся микрофлюидных потоков по микроканалу. На основе модельных представлений проведена оценка скорости протекания подобных процессов в микроканале чипа до равновесного состояния. Процессы диффузии в микроканале чипа с размерами поперечного сечения порядка 200 (ширина)* 100 (глубина) мкм протекают в водной среде до равновесия примерно за 20 с с момента подачи растворов в микрочип. Равновесное время протекания процессов экстракции в системе «октапол-вода» занимает в таком же микроканале порядка 50 с, что объясняется большой вязкостью октанола.

3. В качестве варианта ускорения протекания массопереноса веществ в сечении микроканала чипа предложена трехфазная система экстракции с образованием трех сосуществующих фаз при смешивании двух гомогенных растворов в микроканале. По распределению родамина 6Ж в трехфазной системе в поперечном сечении микроканала чипа показано, что высокая степень равновесности в системе в условиях одновременного с образованием фаз распределения красителя наступает за время контакта начальных потоков около 1 с.

4. Проведена оптимизация ввода малых количеств проб и реагентов в девятиреакторный чип путем химической модификации поверхности чипа. МппИхМальные объемы раскапываемых на поверхность чипа проб для успешного заполнения микрореакторов составили 2 мкл на реактор.

5. Проведена оптимизация условий проведения дериватизации катехоламинов с реагентом ИВО-Б в мнкрореакторах девятиреакторного чипа в зависимости от рН реакционной смеси и температуры. Объем реакционной смеси при заполнении микрореакторов составлял 4 мкл/реактор. Показано, что при рН порядка 8.5 и температуре порядка 50 °С предколоночпая дернватизация занимает 3-4 минуты.

1. Сляднев М.Н. Интегрированные химические микрочипы в аналитической химии.// Партнеры и конкуренты. 2003. Л" 6. С. 26-33.

2. Беленький Б.Г., Комяк Н.И., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Суханов B.JI. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 1).// Научное приборостроение. 2000. Т. 10. N° 2. С. 57-64.

3. Беленький Б.Г., Комяк Н.И., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Суханов B.J1. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 2).// Научное приборостроение. 2000. Т. 10. JV° 3. С. 3-16.

4. Беленький Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип-анализаторы.// Клиническая лабораторная диагностика. 2001. Л*° 3. С. 26-31.

5. Беленький Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип-анализаторы (продолжение).// Клиническая лабораторная диагностика. 2001. Л» 4. С. 25-32.

6. Tang Т., Badal М., Ocvirk G., Lee W. Е., Bader D. E., Bekkaoui F., Harrison D. J. Integrated Microfluidic Electrophoresis System for Analysis of Genetic Materials using Signal Amplification Methods.// Anal. Chem. 2002. V.74. P. 725-733

7. Paegel B.M., Blazej R.G., Mathies R.A. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample preparation and electrophoretic analysis.// Current Opinion in Biotechnology. 2003. V.14. P.42-50.

8. Sato K., Hibara A., Tokeshi M., Hisamoto H., Kitamori T. Integration of Chemical and Biochemical Analysis Systems into a Glass Microchip.// Anal. Sci. 2003. V. 19. P. 15-22.

9. Eijkel J.C.T., de Mello A.J. and Manz A. A miniaturised total chemical analysis system: ц-TAS in "Organic Mesocsopic Chemistry", IUPAC monograph (Ed. H. Masuhara, F.C. Schryver), 1999.

10. Lindner D. The Micro-Chemlab project: Micro Total Analysis System R&D at Sandia National Laboratories.// Lab Chip. 2001. V. 1. P. 15N 19N.

11. TiidosAJ., Besselink G.A.J., Schasfoort R.B.M. Trends in miniaturized total analytical systems for point-of-care testing in clinical chemistry.// Lab Chip. 2001. V. 1. P. 83-95.

12. Kopf-Sill A.R. Successes and challenges of lab-on-a-chip.// Lab Chip. 2002. V. 2. P.42N-47N.

13. Sanders G.H.W., Manz A. Chip-based microsystems for genomic and proteomic analysis.// Trends Anal. Chem. 2000. V.19. P. 364-378.

14. Li J., Le Riche Т., Tremblay T. L., Wang C., Bonneil E., Harrison D. J., Thibault P. Application of Microfluidic Devices to Proteomics Research.// Molecular&Cellular Proteomics. 2002. V.1.2. P. 157-168.

15. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века.// Вестник РАН. 2003. Т.73. № 5. С. 412-426.

16. De Mello A.J. Seeng single molecules.// Lab Chip. 2003. V.3. P. 29N-34N.

17. Lagally E., Medintz I., Mathies R. A. Single-Molecule DNA Amplification and Analysis in an Integrated Microfluidic Device.//Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 565-570.

18. Tan Y.-C., Fisher J.S., Lee A.I., Cristini V., Lee A.P. Design of microfluidic channel geometries for the control of droplet volume, chemical concentration, and sorting.// Lab Chip. 2004. V.4. P. 292-298.

19. Giinter A., Khan S.A., Thalmann M., Trachsel F., Jensen K.F. Transport and reaction in microscale segment gas-liquid flow.// Lab Chip. 2004. V. 4. P. 278-286.

20. Shinohara K., Sugii Y., Aota A., Hibara A., Tokeshi M., Kitamori Т., Okamoto T. High-speed micro-PIV measurements of transient flow in microfluidic devices.// Mesurement Science and Technology. 2004. V.15. P.l965-1970.

21. Сляднев М.Н., Казаков В.А., Макаров Е.Д., Ганеев A.A., Москвин JI.H. Микрофлюидная система экстракции с химически индуцированным образованием трех фаз в потоке.// Научное Приборостроение. 2005. Т. 15. №2. С. 11-20.

22. Kikutani Y., Hisamoto Н., Tokeshi М., Kitamori Т. Micro wet analysis system using multi-phase laminar flows in three-dimensional microchannel network.// Lab Chip. 2004. V.4. P. 328-332.

23. Ueno К., Kim H.-B., Kitamura N. Channel Shape Effects on the Solution-Flow Characteristics and the Liquid/Liquid Extraction Efficiency in Polymer MicroChannel Chips.// Anal. Sei. 2003. V.19. P. 391-394.

24. Kim H.-B., Ueno К, Chiba M„ Kogi O., Kitamura N. Spartially-Resorved Fluorescence Study on Liquid/Liquid Extraction Processes in Polymer Micrichannels.// Anal.Sei. 2000. V.16. P. 871-876.

25. Schilling E.A., Kamholz A.E., Yager P. Cell Lysis and Protein Extraction in a Microfluidic Device with Detection by a Fluorogenic Enzyme Assay.// Anal.Chem. 2002. V.74. P. 1798-1804.

26. Weigl B.H., Yager P. Microfluidic Diffusion-Bazed Separation and Detection.// Science. 1999. V. 283. P. 346-347.

27. Slentz B.E., Penner N.A., Regnier F.E. Capillary electrochromatography of peptides on microfabricated poly(dimethylsiloxsane) chips modified by cerium(IV)-catalyzed polymerization.// J. Chromatogr. A. 2002. V.948. P.255-233.

28. Harrison D.J., Fluri K, Seiler К., Fan Z., Effenhauser C.S., Manz A. Micromachining a Miniaturized Capillary Electrophoresis Bazed Chemical Analysis System on a Chip.// Science. 1993. V.261. P. 895-897.

29. Kricka L.J., Wilding P. Microchip PCR.// Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P. 820825.

30. Lee D.S., ParkS.H., Yang H., ChungK.-H., Yoon Т.Н., Kim S.J., Kim K, Kim Y.T. Bulk-micromachined submicroliter-volume PCR chip with very rapid thermal response and low power consumption.// Lab Chip. 2004. V.4. P. 401-407.

31. Сляднев M.H., Казаков B.A., Лаврова M.B., Ганеев A.A., Москвин JI.H. Мпкрочиповая мультиреакторная система для биохимического анализа.//Научпое Приборостроение. 2005. Т. 15. №2. С.41-50.

32. Eijkel J.C.T., PrakA., Cowen S., Craston D.H., Manz A. Micromachined heated chemical reactor for pre-colomn derivatization.// J. Chromatogr. A. 1998. V. 815. P. 265-271.

33. Harrison D.J., Fan Z., Fluri K, Seiler К. Integrated Electrophoresis Systems for Biochemical Analyses.// Technical Digest: Sensor and Actuator Workshop, June 13-17, 1994, Hilton Head Island, S.C., P. 21-24.

34. Mangru S.D., Harrison D.J. Chemiluminescence Detection in Integrated Post-Separation Reactors for Microchip-Bazed Capillary Electrophoresis and Affinity Electrophoresis.// Electrophoresis. 1998. V.19. P.2301-2307.

35. Kuttcr J.P., Ramsey R.S., Jacobson S.C., Ramsey J.M. Determination of Metal Cations in Microchip Electrophoresis using on-Chip Complexation and Sample Stacking.// J. Microcolomn Separations. 1998. V.10. P. 313-319.

36. Liu Y.J., Foote R.S., Jacobson S.C., Ramsey R.S., Ramsey J.M. Electrophoretic Separation of Proteins on a Microchip with Noncovalent, Postcolomn Labeling.// Anal.Chem. 2000. V. 72. P. 4608- 4613.

37. Fang Z.L., Fang Q. Development of a low-cost microfluidic capillary-electrophoresis system coupled with flow-injection and sequential-injerction sample introduction.// Fresenius'J. Anal.Chem. 2001. V.370. P. 978-983.

38. Becker H., Locascio L.E. Polumer microfluidic devices.// Talanta. 2002. V. 56. P. 267287.

39. De Mcllo A.J. Plastic fantastic? // Lab Chip. 2002. V.2. P. 31N-36N.

40. Fintschenko Y., Van den Berg A. Silicon microtechnology and microstructures in separation science.//J. Chromatogr. A. 1998. V.819. P. 3-12.

41. Tjerkstra R. IV., De Boer M., Berenshot E., Gardeniers J. G. C., Van den Berg A., Ehvenspoek M. Etching Technology for microchannels.// Proc. IEEE MEMS'97. 1997. P.147-152.

42. Seidel H., Csepregi L., Heuberger A., Baumgartel H. Anisotropic etching of crystalline silicon in alkaline solutions; I Orientetion dependence and behavior of passivation layers.// J. Electrochemical Soc. 1990. V.137. No.l 1. P. 3612-3622.

43. Tjerkstra R.W., De Boer M., Berenshot E., Gardeniers J.G.C., Van den Berg A., Ehvenspoek M. Etching technology for chromatography microchannels.// Electrochimica Acta. 1997. V. 42. Nos. 20-22. P. 3399-3406.

44. Van den Berg A., Lammerink T.S.J. Micrototal Analytical Systems: Microfluidics Aspects, Integration Concept and Applications.//Top.Curr. Chem. 1997. V.194. P.21-49.

45. Futterer C„ Mine N. Bormuth V., Codarbox J.-H., Laval P., Rossier J., Viovy J.-L. Injection and flow control for microchannels.// Lab Chip. 2004. V.4. P.351-356.

46. WuZ., Jensen H., GambyJ., BaiX., Girault H.H. A flexible sample introduction method for polymer microfluidic chips using a push/pull pressure pump.// Lab Chip. 2004. V.4. P. 512-515.

47. Hong C.-C., Afumgesan S., Kim S., Beaucage G., Choi J.-W., Ahn C.H. A functional on-chip pressure generator using solid chemical propellant for disposable lab-on-a-chip.// Lab Chip. 2003. V.3. P. 281-286.

48. Schwarz M.A., Hauser P.C. Recent developments in detection methods for microfabricated analytical devices.// Lab Chip. 2001. V.l. P. 1-6.

49. Wang J. Electrochemical Detection for microscale analytical systems: a review.// Talanta. 2002. V.56. P. 223-231.

50. De Mello A.J. Chip-MS: Coupling the large with the small.// Lab Chip. 2001. V.l. P. 7N-12N.

51. Lichtenberg J., Dc Rooij N. Verpoorte E. Sample pretreatment on microfabricated devices.// Talanta. 2002. V.56. P. 233-266

52. Dc Mello A.J., Beard N. Dealing with 'real' samples: sample pre-treatment in microfluidic systems.// Lab Chip. 2003. V. 3. P. 11N-19N.

53. Tokeshi M., Minagawa Т., Uchiyama K, Hibara A., Sato K., Hisamoto H., Kitamori T. Continuous Flow Chemical Processing on a Microchip by Combining Micro Unit Operations and a Multiphase Flow Network.//Anal. Chem. V. 74. 2002. P. 1565-1571.

54. Sorouraddin H.M., Hibara A., Kitamori T. Use of a thermal lens microscope in integrated catecholamine determination on a microchip.// Fresenius'J. Anal. Chem. 2001. V.371. P.91-96.

55. Shinohara K., Sugii Y., Okamoto K, Madarame H., Hibara A., Tokeshi M., Kitamori T. Measurement of pH fild of chemically reacting flow in microfluidic devices by laser-induced fluorescence.//Meas. Sci. Technol. 2004. V.15. P. 955-960.

56. Tanaka Y., Slyadnev M.N., Sato K, Tokeshi M., Kim H.-B., Kitamori T. Acceleration of an Enzymatic Reaction in a Microchip.//Anal.Sci. 2001. V.17. P. 809-810.

57. Sato K., Tokeshi M„ Kitamori Т., Saw ad a T. Integration of Flow Injection Analysis and Zeptomole-Level Detection of the Fe(ll)-o-Phenanthroline Complex.// Anal.Sci. 1999. V.15. P. 641-645.

58. Mel in J., Gimenez G., Roxhed N., Van der Wijngaart W., Stemme G. A fast passive and planar liquid sample micromixer.// Lab Chip. 2004. V. 4. P. 214-219.

59. Neils C., Tyree Z., Finlayson В., Folch A. Combinatorial mixing of microfluidic streams.// Lab Chip. 2004. V. 4. P. 342-350.

60. Kopp M.U., De Mello A.J., Manz A. Chemical amplification: continuous-flow PCR on a chip.// Science. 1998. V.280. P.1046.

61. Sclmeegafi I., Brautigam R., Kohler J.M. Miniaturized flow-through PCR with different template types in a silicon chip thermocycler.// Lab Chip. 2001. V.l. P.42-49.

62. Северин E.C. Биохимия. М.:ГЕОТАР-МЕД, 2003, 380 с.

63. Kamholz A.E. Proliferation of microfluidics in literature and intellectual property.// Lab Chip. 2004. V.4. P. 16N-20N.

64. Евстрапов А. А., Курочкип В. E., Буляиииа A. JI., Петряков А. О., Рудницкая Г. Е., Сальникова Т. А., Алексеев Я. И. Экспресс-анализ олигонуклеотидов на плаиариом микрофлюидном чипе.// ЖАХ. 2004. Т. 59. Лзб. С. 587-595.

65. Эпгельгардт X. Практическое руководство по капиллярному электрофорезу./ иод ред. Волощука A.M. М.: РАН, 1996, 231 с.

66. Основы аналитической химии./ иод ред. Золотова Ю.А. М.: Высшая школа, 2002, в 2-х томах.

67. Effenhauser C.S., Man: A., Widmer H.M. Glass Chips for High-Speed Capillary Electophoresis Separations with Submicrometer Plate Heights.// Anal. Chem. 1993. V.65. P. 2637-2642.

68. Sato K., Tokcshi M., Sawada Т., Kitamori T. Molecular Transport between Two Phases in a MicroChannel.//Anal. Sci. 2000. V. 16. P. 455-456.

69. Surmeian M., Hibara A., Slyadnev M., Uchiyama K, Hisamoto H., Kitamori T. Distribution of Methyl Red on the Water-Organic Liquid Interface in a MicroChannel.// Anal. Lett. 2001. V. 39. No. 9. P. 1421-1429.

70. Ismagilov R.F., Stroock A.D., Kcnis P.J.A., Whitcsides G. Experimental and theoretical scaling laws for transverse diffusive broadening in two-phase laminar flows in microchannels.// Appl. Phys. Lett. 2000. V.76. No. 17. P. 2376-2378.

71. Hisamoto H., Horiuchi Т., Tokcshi M, Hibara A., Kitamori T. On-chip Integration of Neutral Ionophore-Based Ion Pair Extraction Reaction.// Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 1382-1386.

72. Minagawa Т., Tokcshi M., Kitamori T. Integration of a wet analysis system on a glass chip: determination of Co(II) as 2-nitroso-l-naphthol chelates by solvent extraction and thermal lens microscopy.// Lab Chip. 2001. V.l. P. 72-75.

73. Marnyama Т., Kaji Т., Ohkawa Т., Sotowa K, Matsushita H., Knbota F., Kainiya N„ Kusakabc K„ Goto M. Intermittent partition walls promote solvent extraction of metal ions in a microfluidic device.//Analyst. 2004. V. 129. No. 11. P. 1008-1013.

74. Hibara A., Nonaka N. Tokeshi M., Kitamori T. Spectroscopic Analysis of Liquid / Liquid Interfaces in Multiphase Micro flows.//J. Am. Chem. Soc. 2003. V.I25. P. 14954-14955.

75. Sakamoto K., Nakanishi H., Tokeshi M„ Yoshida Y., Kitamori T. A Stable Two Phase Flow by "Sombrero" Channel.// 8th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, September 26-30, 2004, Malm5, Sweden, pp. 213-215.

76. Kumemura M, Korenaga T. Quantitative Extaction of Al3f in Water using Dispersed Droplet in T-Shaped MicroChannel.// 8th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, September 26-30, 2004, Malmo, Sweden, pp. 454-456.

77. Ueno M., Hisamoto H., Kitamori T.,Kobayashi S. Phase-Transfer alkylation reactions using microreactors.// Chem. Commun. 2003. P.936-937.

78. Hisamoto H., Saito Т., Tokeshi M„ Hibara A., Kitamori T. Fast and high conversion phase-transfer synthesis exploiting the liquid-liquid intcrfase formed in a microchannel chip.//Chem. Commun. 2001. P. 2662-2663.

79. Surmeian M., Slyadnev M.N., Hisamoto H., Hibara A., Uchiyama K, Kitamori T. Three-Layer Flow Membrane System on a Microchip for Investigation of Molecular Transport.// Anal. Chem. 2002. V.74. P. 2014-2020.

80. Kattcr J.P., Jacobson S.C., Ramsey J.M. Solid Phase Extraction on Microfluidic Devices.// J. Microcolomn Separations. 2000. V.12. P. 93-97.

81. Yu C., Davcy M.H., Svcc F., Frcchet J.M.J. Monolithic porous polymer for on-chip solid phase extraction and preconcentration prepared by photoinitiated in situ polymerization within a microfluidic device.//Anal. Chem. 2001. V.73. P. 5088-5095.

82. Jcmcrc А.В., Olcschnk R., Ouchcn F., Fajuyigbe F., Harrison J.D. An Integrated Solid Phase Extraction System for Sub-Pico Molar Detection.// Electrophoresis. 2002. V.23. P. 3537-3544.

83. Dc Mello A.J. On-Chip chromatography: the last twenty years.// Lab Chip. 2002. V.2. P. 48N-54N.

84. McEnery M., Tan A., Alderman J., Patterson J., OWfathuna S.C., Glennon J.D. Liquid chromatography on-chip: progression towards a ц-total analysis system.// Analyst. 2000. V.125.P. 25-27.

85. Пресс Ф.П. Фотолитографические методы в технологии полупроводниковых приборов и интегральных микросхем. М.: Советское радио, 1978, 123 с.

86. Lacher N.A., Dc Rooij N.F., Vcrpoorte E., Lunte S.M. Comparison of the performance characteristics of poly(dimethylsiloxane) and Pyrex microchip electrophoresis devices for peptide separations.//J. Chromatogr. A. 2003. V.1004. P.225-235.

87. Christel L. A., Petersen K., McMillan IF., Nortlmip M.A. Rapid, Automated Nucleic Acid Probe Assays Using Silicon Microstructures for Nucleic Acid Concentration.// Journal of Biomcchanical Engineering. 1999. V.121. No.2. P. 22-27.

88. Lao A. I. K., Lee T.M., Hsing I.M., Ip N.Y. Precise temperature control of microfluidic chamber for gas and liquid phase reactions.// Sensors and Actuators A. 2000. V. 84. P. 11-17.

89. Kazakov V.A., Lavrova M.V., Ganeev A.A., Moskvin L.M., Slyadnev M.N. Surface Modification of Microchip Input Reservoirs for Pressure-induced Sample Injection into Microreactors.//Anal.Sci. 2005. V.21. No.4. P.293-294.

90. Ehrnstrôm R. Miniaturization and Integration: challenges and breakthroughs in microfluidics.// Lab Chip. 2002. V.2. P.26N-30N.

91. RuanoJ. M., Glidlc A., Cleary A., Walmsley A., Aitchison J., Cooper J.M. Design and fabrication of a silica on silicon integrated optical biochip as a fluorescence microarray platform.//Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18. P. 175-179.

92. Ymeti A., Kanger J.S., Grève J., Lambeck P.V., Wijn R., Heideman R.G. Integration of microfluidics with a four-channel integrated optical Young interferometer immunosensor.//Applied Optics. 2003. V. 42. P. 5649-5655.

93. Proskurnin M.A., Slyadnev M.N., Tokeshi A/., Kitamori T. Optimization of Thermal Lens Microscopic Measurements in a Microchip.// Anal. Chim. Acta. 2003. V.480. P. 79-95.

94. Tokeshi M., Yamaguchi J., Hattori A., Kitamori T. Micro thermal lens optical systems.// Anal. Chem. 2005. V.77. P. 626-630.

95. Grabtree H.J., Kopp H.U., Manz A. Shah Convolution Fourier Transform Detection. // Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 2130-2134.

96. Zhang Y., Lee H.K., Li S.F. Y. Fluorescence detection in short capillary and chip using a variable wavelength epi-fluorescence microscope.// Talanta. 1998. V.45. P.613-618.

97. Jiang G., Attiya S., Ocvirk G„ Lee W.E., Harrison D.J. Red diode laser induced fluorescence detection with a confocal microscope on a microchip for capillary electrophoresis.//Biosensors and Bioelectronics. 2000. V. 14. P. 861-865.

98. Edmund Optics Company, Laser Diode Selection Guide, www.edmundoptics.com.

99. Melles Griot Company, Wavelength Selection at a Glance, www.lasers.me11esgriot.com/aagwavelength.asp.

100. Molecular Probes Company, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, www.probes.com.

101. Malins C., Harvey T.G., Summergill P., Fielden P.R., GoddardN.J. Embossed polymer leaky waveguide devices for spectroscopic analysis.//Analyst. 2001. V. 126. P. 12931298.

102. Herman P., Maliwal B.P., Lin H.J., Lakowicz J.R. Frequency-domain fluorescence microscopy with the LED as a light source.//J. Microscopy. 2001. V. 203. Pt. 2. P. 176-182.

103. Mohr G.J., Klimant /., Spichiger-Keller U., Wolfbeis O.S. Fluoro Reactands and Dual Luminophore Referencing: A Technique to Optically Measure Amines.// Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 1053-1062.

104. Hashimoto M., Tsukagoshi K., Nakajima R., Kondo K., Arai A. Microchip Capillary electrophoresis using on-line chemiluminescence detection.// J. Chromatogr. A. 2000. V.867. P. 271-279.

105. Xu Y., Bessoth F.G., Eijkel J.C.T., Manz A. On-line Monitoring of Chromium(III) using a fast micromachined mixer/reactor and chemiluminescence detection.// Analyst. 2000. V.125.P. 677-683.

106. Lit Q., Collins G.E. Microchip Separations of Transition Metal Ions via LED absorbance Detection of their PAR Complexes.// Analyst. 2001. V. 126. P. 429-435.

107. Yang J., Liu Y., Ranch C.B., Stevens R.L., Liu R., Leningk R., Grodzinski P. High Sentivity PCR Assay in Plastic Micro Reactors.// Lab Chip. 2002. V.2. P. 179-187.

108. Tanaka Y., Slyadnev M.N., Hibara A., Tokeshi M., Kitamori T. Non-contact photothermal control of enzyme reactions on a microchip by using a compact diode laser.// J. Chromatogr. A. 2000. V. 894. P. 45-51.

109. Conrad Electronic GmbH, Original Faulhaber-Motoren, Publication No. WX0262, www.conrad.de.

110. Lumileds Lighting Company, Luxeon Star Power Light Source, Publication No. DS23 (Jan 2002), www.luxeon.com.

111. Eastman Kodak Company, Conversion of Light (Photons) to Electronic Charge, Publication No. MTD/PS- 0217 (Rev. 1, May 2001), www.kodnk.com/go/ccd.

112. Eastman Kodak Company, Charge-Coupled Device (CCD) Image Sensors, Publication No. MTD/PS-0218 (Rev. 1, May 200 П. www.kodak.com/go/ccd.

113. Sony Corporation, ICX249AC. Diagonal 8 mm (type 1/2) CCD Image Sensor for CCIR BAV Video Cameras, Publication No. E98729A99, www.sony.co.ip.

114. Sony Corporation, ICX259AC. Diagonal 6 mm (type 1/3) CCD Image Sensor for CCIR BAV Video Cameras, Publication No. E99526A99, www.sonv.co.ip.

115. Eastman Kodak Company, Interline image Sensor: KAI-1003M. Dark Current vs. Temperature, Publication No. DS 02-027 (Rev. 0, Feb 2001), www.kodnk.com/go/ccd.

116. Eastman Kodak Company, CCD Image Sensor Noice Sources, Publication No. MTD/PS-0233 (Rev. 2.1, 2005), www.kodak.com/go/imngers.

117. Gao Al, Rowe D.M Optimization of thermoelectric module geometry for waste heat electrical power generation.//J. of Power Sources. 1991. V.38. P. 31-39.

118. Eurotherm Controls Company, Thermosensors ITS.90. Booklet, Publication No. HA 026535, 1998, www.eurotherm.co.uk

119. Gaigalas A. K, Li L., Henderson O., Vogt R., Barr J., Marti J., Weaver J., Schwartz A. The Development of Fluorescence Intensity Standards// J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol. 2001. V. 106. No. 2. P. 381-389.

120. Seybold P.G., Gouterman M., Gallis J. Calorimetric, photometric and lifetime determinations of fluorescence yields of fluorescein dyes// Photochem. Photobiol. 1969. V. 9. P. 229-232.

121. Du H., Fuh R.A., Li J., Corkan A., Lindsey J.S. PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry//Photochem. Photobiol. 1998. V. 68. P. 141-143.

122. Birge R.R. Kodak Laser Dyes. New York: Kodak, 1987, 250 p.

123. Kubin R.F., Fletcher A.N. Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes//J. Luminescence. 1982. V. 27. P. 455-459.

124. Sony Corporation, CXA 1310AQ. Single Chip Processing for CCD Monochrome Camera, Publication No. E89Z21B1X, www.sony.co.ip.

125. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. СПб.:Химия, 1995, 385 с.

126. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник./под ред. Потехина А.А. и Ефимова А.И. СПб.: Химия, 1994, 432 с.

127. Гришаева Т.Н. Методы люминесцентного анализа. СПб.: НПО «Профессионал», 2003, 225 с.

128. Slyadnev M.N., Inoue Т., Harata A., Ogawa T. A rhodamine and a cyaninc dye on the water surface as studied by laser induced fluorescence microscopy.// Colloids and Surfaces. Л. 2000. V.164. P. 155-162.

129. Герасимов Я.И., Древииг В.П., Еремин E.H., Киселев A.B., Лебедев В.П., Папчепков Г.М., Шлыггт А.И. Курс физической химии./ иод ред. Герасимова Я. И. M.-JI.: Химия, 1964, том 1, 623 с.

130. Hu Н., Chin C.-D., Chen L.-J. Liquid-liquid equilibria for the ternary system water+n-dodecane+2-(2-n-hexyloxyethoxy)ethanol.// Fluid Phase Equilibria. 1999. V. 164. P. 187-194.

131. Arce A., Blanco M., Soto A. Quaternary liquid-liquid equilibria of systems with twopartially misciblc solvent pairs: l-octanol+2-methoxy-2-methyIpropane+water+ethanolat 25 °C.//Fluid Phase Equilibria. 1998. V. 146. P. 161-173.t

132. ZhuX., Shaw P.N., Barrett D.A. Cateholamines derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,l,3-benzoxadiazole: characterization of chemical structure and fluorescence properties.// Anal. Chim. Acta. 2003. V. 478. P. 259-269.

133. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии./ под ред. Лисичкина Г.В. М.: Химия, 1986, 246 с.

134. Felbel J., Bieber I., Pipper J., Köhler J.M. Investigations on the compatibility of chemically oxidized silicon (SiOx)-surfaces for applications towards chip-based polymerase chain reaction.// Chemical Engineering Journal. 2004. V.101. P. 333-338.

135. Розен В.Б. Основы эндокринологии. M.: Изд-во МГУ, 1994. 384 с.

136. Chen D.-C., Zhan D.-Z., Cheng С.-IV., Liu А.-С, Chen C.-H. Determination of urine catecholamines by capillary electrophoresis with dual-electrode amperometric detection.// J. Chromatogr. B. 2001. V. 750. P. 33-39.

137. Volin P. Determination of free urinary catecholamines by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection.// J. Chromatogr. B. 1994. V. 655. P. 121-126.

138. Карцова Л.А., Сидорова A.A., Казаков В.А., Бессонова Е.А., Яшин А.Я. Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.// ЖАХ. 2004. Т. 59. Ла 8. С. 826-831.

139. Y. Ohkura, А f. Kai, Н. Nohta. Fluorigenic reactions for biomedical chromatography.// J.Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 85-107.

140. Peterson Z.D., Collins D.C., Bower bank C.R., Lee M.L., Graves S.JV. Determination of catecholamines and mctanephrines in urine by capillary electrophoresis—electro spray ionization-time-of-flight mass spectrometry.// J. Chrom. В. 2002. V. 776. P.221.

141. Bovingdon М.Е., Webster R.A. Derivatization reactions for neurotransmitters and their automation. //J.Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 157-183.

142. ВЭЖХ в биохимии./под ред. Хеншена А., Хупе К., Вельтера Ф. М.: Мир, 1988, 687 с.

143. Bardelmeijer Н.Л., Langeman Н., De Ruiter С., Unserberg IV.J. Derivatization in capillary electrophoresis.// J. Chromatogr. A. 1998. V.807. P. 3-26.

144. Morikawa A., Hamase K., Zaitsu K. Determination of D-alanine in the rat central nervous system and periphery using colomn-switching high performance liquid chromatography.//Anal. Biochem. 2003. V.312. P.66-72.

145. Гауппишн 3., Грефе IO., РелюнеХ. Органическая химия. М.: Химия, 1979, 831 с.

146. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика, перевод с англ. B.JI. Друцы и О.Н. Королевой. М.: Мир, 1991, 539 с.