Разработка микрометодов анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВ Игорь Олегович

РАЗРАБОТКА МИКРОМЕТОДОВ АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ, КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОФ ВЭЖХ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Специальность: 02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2006

Диссертационная работа выполнена на кафедре аналитической химии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в группе аналитической химии белка института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Глубокое Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Макаров Николай Васильевич кандидат химических наук Кириллова Юлия Геннадьевна

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится 20 декабря 2006 года в 12м на заседании диссертационного совета Д 212.120.05 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86, ауд. М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «, .» ноября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Ю.А. Ефимова

Актуальность работы. В настоящее время клинические исследования все больше ориентируются на использование инструментальных микрометодов анализа для диагностики наиболее распространенных и опасных социально-значимых заболеваний. Значительная часть этих методов не полностью и не всегда обеспечивает своевременное и качественное их диагностирование, что часто не отвечает современным требованиям мониторинга биохимического статуса человека.

Свободные аминокислоты и короткие пептиды, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. В ряде случаев они могут выступать в роли молекулярных маркеров определенных заболеваний. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания. Большинство существующих методов аминокислотного анализа является либо недостаточно чувствительными и селективными для их идентификации, либо требуют дерива-тизации аминокислот, что существенно усложняет процесс их определения. Проблема простого и экономичного анализа свободных генетически кодируемых аминокислот до сих пор до конца Не решена. В то же время клинический анализ аминокислот требует их пред- или постколоночной модификации для высокочувствительного и селективного определения. Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях может быть связано также с генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.

Между тем необходимая для аминокислотного и нуклеотидного анализа аппаратура импортного производства, как правило, является дорогостоящей и малодоступной для большинства клинических лабораторий. Ситуация усугубляется еще и тем, что многие приборы являются узкоспециализированными для каждого вида заболевания, вследствие чего наблюдается множественное дублирование диагностических методов как по аппаратуре, так и по методологии. Это резко повышает стоимость клинических исследований и усложняет сравне-

* Автор выражает благодарность руководителю группы аналитической химии белка ИБХ РАН стл.с., кхн. ИЗ. Назимову за постоянную помощь, внимание и обсуждение результатов.

ние полученных результатов анализа. Таким образом, разработка новых методик, расширяющих возможности использования общедоступного аналитического оборудования отечественного производства для высокочувствительного экспрессного и надежного определения свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов как для структурного анализа биополимеров и их фрагментов, так и в клинико-диагностических целях является актуальной научной задачей.

Цель работы. Целью диссертационной работы является разработка комплекса инструментальных высокочувствительных микрометодов анализа свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием отечественной инструментальной базы.

Научная новизна.

1. Разработаны методики определения не модифицированных генетически кодируемых а-аминокислот с использованием методов капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-фотометрическим и рефрактометрическим способами детектирования.

2. Разработаны и применены в клинической практике методики совместного определения низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови с использованием методов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с флуориметриче-ским и прямым УФ-фотометрическим способами детектирования.

3. Разработана методика определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов на основе анализа продуктов аллель-специфичной полимеразной цепной реакции методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметри-ческим детектированием.

Практическая значимость. Разработанный метод аминокислотного анализа позволяет определять микроколичества генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации, что существенно упрощает существующую схему анализа. Разработан и предложен для практического использования комплекс методов анализа молекулярных маркеров сосудистых катастроф (гомоцистеин, цистеин, глутатион), а также фрагментов мутантного гена венозных тромбозов. В результате проведенной работы удалось показать

возможность эффективного использования отечественной аппаратуры для проведения биохимического анализа как белковых, так и нуклеиновых компонентов на одном и том же приборе для капиллярного электрофореза. Определение серосодержащих аминокислот и пептидов в плазме крови по разработанной в данной работе методике использовали для оценки фактора риска десятков пациентов с достоверно установленным инфарктным и предынфарктным состоянием. Результаты проведенной работы использованы при создании и апробировании в практике биомедицинского анализа универсального экономичного автоматизированного комплекса приборов и методов молекулярной диагностики некоторых социально-значимых заболеваний (инфаркты, инсульты, тромбозы), разрабатываемого в институте аналитического приборостроения РАН.

На защиту выносятся:

- способы определения генетически кодируемых аминокислот в водном растворе без их предварительной дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии;

- оптимизированные условия дериватизации низкомолекулярных аминотио-лов плазмы с использованием флуорогенных реагентов (монобромобиман и 5-иодоацетамидофлуоресцеин);

- методика анализа низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза;

- результаты определения содержания гомоцистеина в плазме крови методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного зонального электрофореза;

- способ определения мутантного гена венозных тромбозов с использованием • капиллярного гель-электрофореза в линейном поли-N.N'-диметилакриламиде.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8-м Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (15-19 октября 2001 г. Москва, Россия), 3-м Международном симпозиуме по методам разделения в бионауках (13-18 мая 2003 г., Москва, Россия,), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Секция химия. 12-15 апреля 2005 г., Москва,

Россия), 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (12-14 сентября 2005 г., Анапа, Россия), 3-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (25-27 октября 2005 г., Москва, Россия), 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова (13-14 октября 2005 г., Москва, Россия), Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (25-30 июня 2006 г., Москва, Россия), 31-м Международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ (24-29 июня 2006 г., Стамбул, Турция), 2б-м Международном симпозиуме по разделению белков, пептидов и полинуклеотидов (16-20 октября 2006 г., Инсбрук, Австрия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Материал диссертации изложен на 147 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литературных источников состоит из 187 наименований.

Содержание работы

Во введении дано обоснование темы, сформулированы цели исследования и положения, выносимые па защиту, отмечена его научная новизна и практическая значимость. Приведены данные об апробации и публикации результатов исследования, а также о структуре и объеме диссертации.

1-ая глава. Приведены общие сведения о существующих методах анализа исследуемых соединений. Более подробно описаны хроматографические методы и ряд общепринятых способов идентификации. Рассмотрены методы определения низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови, а также фрагментов ДНК. Проведено сравнение существующих методик анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов и обоснована актуальность проведения дальнейших исследований в этой области.

2-ая глава. Приведены данные о материалах, реагентах, способах приготовления используемых растворов и выполнении работы.

.....3-я глава. Результаты и обсуждение.

Определение свободных кодируемых аминокислот

Содержание свободных аминокислот (АК) в физиологических жидкостях является диагностическим параметром ряда заболеваний. Выполненное исследование направлено на разработку методики, позволяющей быстро и надежно их разделять и идентифицировать. Анализ смесей таких АК проводили, используя капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ). Выбор этих методов был обусловлен простотой и доступностью используемого в них оборудования, а также низкой себестоимостью необходимых реактивов и расходных материалов. Изучали возможность детектирования свободных АК с использованием простого универсального и экономичного рефрактометрического способа, применение которого невозможно в классическом методе аминокислотного анализа. Установлено, что для этих целей также возможно применение прямого УФ детектирования;

При разработке методики анализа смесей АК методом КЗЭ с рефрактометрическим детектированием особое внимание уделяли определению

5 10 1S 20 Время, мин Рис.1. Разделение смеси 8 свободных

АК методом КЗЭ с использованием рефрактометрического детектирования Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 90 см, эффективная длина 75 см. Л) Буфер: 60 мМ борат натрия, рН 11,0. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 93 мкА. Температура: 21,0 °С оптимального состава фонового элек-Время ввода пробы: 7,0 с (электрокинетически,

напряжение при вводе пробы - 5 кВ). Введенные тролита. Для ЭТОГО был проведен СКри-каличества АК - 0,1 нг; аланин, тирозин - 0,2 нг.

Идентификация: 1 - Аргинин; 2 - Лизин; 3 - ЭОП; НИНГ С использованием бораТНЫХ, фос-4 - Пролин; 5 - Аланин; б - Тирозин; 7 - Серии; 8

-Аспарагиновая к-та; 9 т Метионин. фатнЫХ, ацетатных, цитратных, TRIS И

CAPS буферных систем, а также их различных сочетаний на примере модельной смеси из 8 АК с различными по природе и свойствам радикалами и максимально различающимися значениями рК, аминогруппы. Пример разделения такой смеси с использованием боратного фонового электролита приведен на рис. 1.

Оптимальным фоновым электролитом для разделения свободных АК данным методом является раствор, содержащий 60 мМ боратного буфера (рН 11,0). С его использованием было изучено влияние различных факторов (напряжение, сила тока, внутренний диаметр и эффективная длина капилляра, способ ввода пробы) на эффективность разделения и показано, что в условиях эксперимента не удается провести полное разделение смеси всех кодируемых АК. Из эксперимента следует, что приемлемо разделяются АК, для которых разница во времени миграции превышает 1 мин. По этой причине методом классического КЗЭ не могут быть разделены и идентифицированы при совместном присутствии глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, гистадин, фенилаланин и тирозин, а также аспарагиновая, глутаминовая кислоты и цистеин. Коэффициент селективности доя них очень низок и близок к 1. Легко выделяются и идентифицируются аргинин, лизин, пролин, серии, аспарагиновая кислота и метионин, т.е. АК, имеющие время миграции 5,5-10,0, 15 и 19,5-20,8 мин. Коэффициент селективности для этой группы АК имеет значение в интервале 1,1 - 1,3. При использовании фосфатного фонового электролита (рН 11,4) наблюдалась аналогичная общая картина разделения, но с худшим разрешением пиков. Выполненные исследования показывают, что классический КЗЭ с рефрактометрическим окончанием позволяет в лучшем случае провести полное разделение и идентификацию в водном растворе не более 8 АК. При этом содержание индивидуальных АК из указанных неразделяемых в такой смеси не должно превышать двух.

Эффективность разделения АК заметно улучшается при добавлении метанола к фоновым электролитам с рН < 7. При использовании в качестве фонового электролита 150 мМ фосфатного буфера (рН 2.0) с добавкой 30%об. метанола удалось разделить 16 из 20-ти генетически кодируемых АК (рис. 2). К сожалению, для полного разделения данной смеси требуется значительное время.

с прямым УФ детектированием (Х„огл = 208 нм) Капилляр: внутренний диаметр 75 мкм, полная длина - 65 см, эффективная длина - 50 см. Буфер: 150мМ фосфат + 30% метанола, рН-2,0. Напряжение: 10 кВ. Сила тока: 76 мкА. Температура: 28,0 "С. Время ввода пробы: 1,5 с (вакуум).

Идентификация: 1 - лизин , 2 - аргинин, 3 -гистидин, 4 - глицин, 5 - аланин, 6 -валин, 7 -изолейцин, 8-лейцин, 9-серии, 10-треонин, 11-метионин, 12-фенилаланин, 13-глу-таминовая кислота, 14- пролин, 15-аспарагиновая кислота, 16-тирозин.

Поскольку; примененный классический КЗЭ при рН > 7 не обеспечил требуемого качества разделения, то было решено применить к анализу свободных АК метод МЭКХ с прямым УФ детектированием. В качестве детергента в буферные растворы добавляли додецилсульфат натрия (ДЦСН). В процессе работы применяли различные концентрации компонентов фонового электролита. Наилучшие результаты были получены при использовании фонового электролита, содержащего 133 мМ борной кислоты, 33 мМ бората натрия и 100 мМ ДЦСН, рН 9,5. Использование электролита указанного состава существенно увеличило число анализируемых АК при одновременном их определении при значениях рН фонового электролита, лежащих в основной области. На рис. 3 приведена электр офореграм-ма смеси 14 АК.

AU 0.1

3

10 15

20

25 30 35 Время, мин

Рис. 3. Разделение смеси 14 свободных АК методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-детектированием Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 122 см, эффективная длина 3S см. Буфер: 133 шМ борная кислота, 33 шМ тетраборат натрия (рН 9.5) 100 тМ додецилсульфат натрия. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 4S мкА. Температура: 27,5 °С. Время ввода пробы: 3,0 с (вакуум). Введенные количества АК - 5,0 нг. Алании, валин, изолейцин и глицин - 7,0 нг. Идентификация: 1 - Валин, 2 - Алании, 3 - Изолейцин, 4 - Глицин, 5 - Серин, 6 - Треонин, 7 -Тирозин, 8 - Гистидин, 9 - Фенипаланин, 10 — Аргинин, 11 - Лизин, 12 - Цистеин, 13 - Метионин, 14 - Глутаминовая кислота. * - Системные пики.

Обращают на себя внимание полученные значения времен миграции. Несмотря на меньшую эффективную длину капилляра они, как правило, выше, чем в случае классического КЗЭ, что достаточно хорошо согласуется с природой МЭКХ. Это также может быть связано с величиной приложенного напряжения на единицу длины капилляра. Необходимая для разделения АК разница во времени миграции значительно меньше, чем в случае КЗЭ. Достаточно, чтобы она составляла 0,5 мин.

Более детально провели исследование условий разделения 14 генетически кодируемых АК, обычно присутствующих в плазме крови здоровых до-

норов в свободном состоянии. Изучали влияние рН и добавок к фоновому электролиту различных органических растворителей на степень разрешения пиков. Из эксперимента следует, что для достижения полного разделения смеси 14 АК значение рН должно лежать в интервале 9,0-10,0. При рН, лежащим за пределами указанного интервала, не обеспечивается необходимое разрешение АК. Очевидно, при рН< 9 это связано с разницей между значениями рК, (АК), а при рН >10 - из-за частичного распада конъюгатов ДЦСН-АК. Влияние добавок органических растворителей изучали, используя метанол, 2 -пропанол и ацетонитрил. Полученные данные показывают, что добавка любого из органических растворителей приводит к существенному изменению времен миграции и коэффициентов селективности. Характер изменения определяется природой и концентрацией добавки. Метанол и ацетонитрил не улучшают разделение изученных АК, что, по-видимому, связано с их малой способностью образовывать смешанные конъюгаты АК-ДДСН-И, где Я - молекула органического растворителя. Добавка 3-5% 2 -пропанола существенно улучшает степень разрешения компонентов, при относительно небольшом увеличении времени миграции АК. При увеличении концентрации 2-пропанола наблюдается заметный рост времен миграции АК, что приводит к снижению экспрессности определения. Специально проведенные исследования показали, что наилучшее разделение АК в присутствии эффективного количества органического растворителя (2-пропанола) происходит, если фоновый электролит содержит 50 мМ борной кислоты, 33 мМ бората натрия и 50 мМ ДДСН. На рис. 4 приведена электрофореграмма смеси 14 АК.

. ^Приведенные данные свидетельствуют об эффективном разделении 13 из 14 генетически кодируемых АК. Общее время разделения не превышает 30 мин.: Б, времени миграции составляет < 0,03. Несколько большие значения близкие к 0,06-0,08, наблюдается для аланина, валина и гистидина.

AU" 0.025 -

S

<

2

9

0 -u^i

0 5

10 15 20 25 Время, мня

J—/Я—L

Рис. 4. Разделение смеси 14 АК методом МЭКХ с прямым УФ детектированием

(Хпогл = 208 нм)

Капилляр: внутренний диаметр 75 мкм, полная длина 61 см, эффективная длина 41 см. Буфер: 33 мМ тетраборат натрия, 100 мМ борная кислота, 50 мМ ДЦСН, 5% 2-лропанол, рН«10,2. Напряжение: 25 кВ. Сипа тока: 65 мкА. Температура: 29,5 "С. Время ввода пробы: 1,5 с (вакуум). Введенные количества АК - 0,5 нг.

Идентификация: 1 -Лизин; 2 - Пролин; 3 - Фенилаланин; 4 - Алании; S - Валин; б - Глицин; 7 - Гистидин; 8 - Тирозин; 9 - Лейцин+Изолейцин; 10-Серии; 11 -Треонин; 12 - Глутаминовая кислота; 13 -Цистеин.

Достигнутый уровень разрешения позволил провести исследования по количественному определению рассмотренных АК. Был проведен анализ модельной смеси 14 АК известного состава. Исследования показали, что метод МЭКХ с прямым УФ детектированием при использовании боратного буферного раствора, содержащего 3-5% 2-пропанола позволяет количественно определять 14-16 генетически кодируемых АК с погрешностью (Sr) 6-8% менее чем за 30 мин. Правильность полученных результатов дополнительно проводили методом «введено-найдено» (табл.1)

Таблица 1

Проверка правильности определения содержания генетически кодируемых АК методом МЭКХ (т°(АК) = 0,50 нг; введено - 1,00 нг)

АК ■ Найдено, нг (п = 5; Р = 0,95) Sr АК Найдено, нг (п = 5; Р « 0,95) sr

Лизин 1,54±0,14 0,072 Гистидин 1,54+0,16 0,084

Пролин 1,54±0,12 0,061 Тирозин 1,47±0,14 0,078

Фенилаланин 1,48±0,07 0,040 Лейцин 1,51 ±0,15 0,067

Алании 1,52±0,15 0,079 Цистеин 1,51±0,14 0,076

Валин 1,49±0,14 0,076 Серин 1,49±0,20 0,084

Глицин 1,55±0,16 0,082 Треонин 1,49±0,15 0,070

Анализ гомоиистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови . методом обрашенно-фазовой ВЭЖХ

Гомоцистеин (Hey) и сопутствующие ему аминотиолы (AT) (кодируемая аминокислота - цистеин (Cys), трипептид глутатион (GSH)) в плазме крови являются молекулярными маркерами нарушения функций сердечно-сосудистой системы. Основной целью данного исследования являлась разработка метода определения содержания гомоцистеина как достоверного фактора риска таких заболеваний.

Количественный анализ низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови включает в себя восстановление дисульфидных связей, депротеинизацию плазмы крови, модификацию аминотиолов соответствующими реагентами, разделение и идентификацию модифицированных аминотиолов методом ОФ ВЭЖХ или КЭ с тем или иным способом детектирования. В данной работе окисленные и связанные с белком аминотиолы восстанавливали трифенилфосфином. Для удаления катионов тяжелых металлов использовали добавку ЭДТА. Предложенная методика восстановления обеспечила быстрое (< 15 мин) и полное восстановление (> 96%) дисульфидов и высвобождение сульфгидрильных групп при комнатной температуре. Выходы реакций восстановления определяли, используя стандартную методику измерения содержания свободных AT. Высокомолекулярные белки плазмы крови осаждали 5-сульфосалициловой кислотой. Ее концентрация была оптимизирована в процессе исследования, что позволило избежать потери чувствительности из-за разбавления на стадии нейтрализации. Модификацию свободных сульфгидрилов проводили монобромобиманом (mBrB) или 5-иодоацетамидо-флуоресцеином (5-IAF). Необходимое значение pH поддерживали с помощью диэтаноламина (рКв = 8,9) и ортофосфата на-

трия, в зависимости от используемого для модификации AT реагента. Использование диэтаноламина позволило проводить прямое контролирование образование целевых продуктов масс-спектрометрически. Для идентификации производных AT применяли фотометрический и флуориметрический способы детектирования. Производные охарактеризовывали методами абсорбционной, флуо-риметрической и Macc-(MALDI-TOF, ESI) спектроскопии. Фотометрическое и флуориметрическое детектирование проводили при длинах волн, выбранных по спектрам поглощения (Нсу-МВ - 234 нм) и флуоресценции , производных Hey (390 нм (возбуждение) и 478 нм (флуоресценция)). Из спектра флуоресценции конъюгата Hcy-AF следует, что при флуориметрическом детектировании для возбуждения оптимальна длина волны 462 нм, а для флуоресценции - 504 нм. Для унификации методик определения и проверки принципиальной возможности использования одного и того же детектора для идентификации как моноби-мановых, так и флуоресцеиновых производных изучали эффективность возбуждения на длине волны 390 нм. Интенсивность полученного максимума флуоресценции, и, как следствие, чувствительность определения была на порядок величины ниже, чем при использовании для возбуждения излучения на длине волны 462 нм.

Проанализированы индивидуальные монобромбимановые (MB) и ацета-мидофлуоресцеиновые (AF) производные AT, а также их модельные смеси. Индивидуальные монобромбимановые производные Cys, Hey и GSH элюирова-лись со временами удерживания (мин) 6,01 ±0,19, 10,76 ±0,17 и 11,89 ±0,11 соответственно (рис. 5)'.

Такое же время удерживания сохраняется при использовании смесей ами-нотиолов известного состава. Полученные экспериментальные данные позволили рассчитать выход реакции модификации. Он составил не менее 97%, что хорошо согласуется с известными данными, но полученными в более жестких условиях пробоподготовки. Образующиеся производные были выделены из смеси и охарактеризованы масс-спекгрометрически.

Флуоресцеиновые производные Cys, Hey и GSH элюировались со временами удерживания (мин) 8,49 ±0,12; 10,46 ±0,15 и 12,96 ±0,14 соответственно (рис. 6).

1 Хроматографический анализ проводился на отечественном высокоэффективном жидкостном хроматографе «МилиХром А-02» (ЭкоНова, Новосибирск)

194 тУ

■МП . , __ Су»-М8 ии А Щ. Ч 1 I <1 нсу-мв 1Л »1 11 11 *"«

Рис, 5. ОФ ВЭЖХ модельной смеси аминотиолов, модифицированных моно-бромобиманом. Суз-МВ-50,0 мкМ, Нсу-МВ-25,0 мкМ, С5-МВ-25,0 мкМ. Флуориметрическое детектирование = 390 нм, Я.„сп = 478 нм)

Рис. 6. ОФ ВЭЖХ модельной смеси аминотиолов, модифицированных 5-иодоацетамидофлуоресцеином. Суз-ЛР-100,0 мкМ, Нсу-АР-150,0 мкМ, СБ-АР-130,0 мкМ. Флуориметрическое детектирование (Х,га1Л= 390 нм, Хисл= 478 нм)

При использовании в качестве метки 5-1АР достигается лучшее разрешение пиков тиол-флуоресцентных коньюгатов по сравнению с тиол-монобимановыми коиьюгатами. Выход реакции модификации АТ 5-1АР, определенный экспериментально по уменьшению интенсивности пика флуоресцентной метки, составил 95%. Все полученные производные были выделены из смеси и охарактеризованы масс-спектрометрически.

Полученные данные послужили основой для разработки способа количественного определения гомоцистеина. Для построения градуировочной кривой использовали образцы смесей с его содержанием от 2,5 до 100 мкМ. Выбранный интервал включает диапазон физиологических концентраций Hey (5-50 мкМ). В качестве метки использовался шВгВ. Полученная градуировочная зависимость площади хроматографического пика от содержания гомоцистеина в смеси линейна во всем изученном концентрационном интервале и описывается уравнением:

Н = 13,32С(Нсу) + 6,13 (R2= 0.9994).

Относительное стандартное отклонение результатов определения по площади пика не превышает 0,083, а по времени выхода - 0,026. Предел обнаружения флуориметрического детектирования MB-производных составляет ~1 мкМ (рис. 7).

Рис. 7. Изменение площади хроматографического пика от концентрации Нсу Эффективность методики подтверждается сравнением хроматограмм, полученных для индивидуальных веществ и для образцов плазмы крови, подготовленных по предлагаемой методике. Выполненные исследования позволили разработать методику количественного определения гомоцистеина, цистеина и глутатио-на в плазме крови и успешно использовать ее для руганного анализа вышеупомянутых ,АТ в виде их МВ-производных (рис. 8). При разработке методики дополнительный контроль проводили методом «введено-найдено» (табл. 2).

Рис. 8. ОФ ВЭЖХ плазмы крови здорового донора. Cys-MB-192,4 мкМ, Нсу-МВ-10,1 мкМ, GS-MB-15,7 мкМ. Флуориметрическое детектирование

Таблица 2

Определение Hey в виде MB-производных методом микроколоночной ВЭЖХ с флуориметрическим детектрованием

С°(Нсу), мкМ Введено, мкМ Найдено, мкМ (п = 5; Р - 0,95) Sr

9,7 100,0 110,8±10,7 0,078

18,8 100,0 120,7±9,3 0,062

31,1 100,0 131,1±8,0 0,049

По разработанной методике проанализированы более 50 образцов плазмы крови здоровых и страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями различной степени тяжести пациентов. Для здоровых пациентов среднее значение содержания (мкМ) AT в плазме крови, полученной из вены, натощак, утром составляло: для Hey 12,75 ±3,21, для GSH 9,53 ±1,17 и для Cys 206,34 ±24,61. Полученные значения концентраций попадают в интервал референсных значений, приводимых в литературе. Для пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, найденная концентрация Hey в плазме крови зависела от тяжести заболевания. Результаты коррелируют с клиническим состоянием пациентов.

Исследована возможность анализа AT с применением такого более дешевого и распространенного способа детектирования как фотометрический. Эксперимент показал, что он обеспечивает чувствительность, которая позволяет определять патологически высокое содержание AT в плазме крови. При использовании фотометрического детектирования предпочтительней использовать в качестве

15

метки 5-1АР, поскольку в этом случае достигается разрешение пиков до базовой

Рис. 9 ОФ ВЭЖХ модельных смесей аминотиолов, модифицированных монобро-мобиманом (а) и 5-иодоацетамидофлуоресцеином (б). A) Cys-MB-50,0 мхМ, Нсу-МВ-25,0 мкМ, GS-MB-25,0 мкМ. Б) Cys-AF-50,0 мкМ, Hcy-AF-75,0 мкМ, GS-AF-25,0 мкМ. Фотометрическое детектирование 234 нм, Хб= 250 и 300 нм)

Таким образом, выполненная работа позволила оптимизировать стадию пробоподготовки, проводить ее в «мягких условиях» с гарантированным количественным выходом анализируемого компонента. На ее основе разработана методика, позволяющая быстро и достоверно определять содержание низкомолекулярных AT в плазме крови здоровых и больных пациентов. Погрешность измерений не превышает 8,5%. Нижняя граница интервала измеряемых концентраций (2,5 мкМ) свидетельствует о принципиальной возможности применения

0,1 All

ч

0

1

данной методики для определения пониженного содержания Hey в плазме крови. Предел обнаружения описанного метода составляет 1мкМ. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов и может быть использована для рутинного применения.

Определение гомоиистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови с применением капиллярного электрофореза

Для анализа AT данным методом применяли фотометрический и флуоримет-рический* способы детектирования. Стадия пробоподготовки существенно не отличалась от разработанной для хроматографи-ческого анализа AT.

Модельную смесь MB- производных Hey, Cys и GSH анализировали методом капиллярного электрофореза (КЭ) с прямым УФ детектированием. Длина волны детектирования (234 нм) была выбрана в соответст-. 1| Ш II вии с локальным максимумом поглощения

{/^■МЦ* Щ0 МВ-АТ конъюгатов. При выбранных усло-

о s lü йнй" виях разделения конъюгат гомоцистеина

Рис. 10. КЗЭ модельной смеси AT, имеет время миграции 6,18 ±0,16; цистеина -

модифицированных mBrB 6 85 ±0 20 и гллтпиона - 8 54 ±0 17 мин со-

Нсу-МВ-700,0 мкМ, Суз-МВ-300,0 мкМ ö'8 j ±0"iU и ГЛуТаТиона й':'4 ±U»1' мин' ^ GS-MB- 700,0 мкМ. (Х„ога - 234 им). ответственно (рис. 10). По сравнению с

Капилляр: внутренний диаметр so мкм, пол- вЭЖХ применяемый метод КЗЭ позволяет ная дойна 82 см, эффективная длина 62 см.

Буфер: 50 мМ тстраборат натрия рН=11.0. сократить время анализа AT на 2-3 мин.

Напряжение: 2 5 Сила тока: 58 мкА. Выполненные исследования показа-

Температура: 29,5 С Время ввода пробы: 3 с.

(вакуум) ли, что чувствительности метода КЗЭ с

прямым УФ-детектированием недостаточно для определения малых количеств Hey в плазме крови. При содержании гомоцистена 10 мкМ отношение сигнал/фон составляет 2,5-3, а относительное стандартное отклонение лежит в интервале 0,3-0,5. Данный метод применим для контроля содержания Hey в плазме крови больных с патологически высоким его содержанием (> 25 мкМ). Относительное стандартное отклонение при определении таких концентрациях составляет 0,12 для MB-Cys, 0,18 для МВ-Нсу и 0,17 для MB-GS.

1 Капиллярный зональный электрофорез с флуориметрическим детектированием проводился на капиллярном ионном анализаторе «Нанофор 02» (ИАиП РАН, Санкт-Петербург)

Таблица 3

Анализ Hey в виде MB-производных методами ОФ ВЭЖХ с флуориметриче-ским и КЗЭ с фотометрическим детектированием (п = 5; Р = 0,95)

Метод определения С±ДС,мкМ sr

ОФВЭЖХ 9,7±0,4 0,035

ОФ ВЭЖХ/КЗЭ 22,5±1,8/26,9±6,5 0,066/0,18

ОФ ВЭЖХ / КЗЭ 28,1±2,9 / 26,4±5,1 0,082/0,12

ОФВЭЖХ/КЗЭ 31,1±1,3/27,4±5,2 0,033/0,14

Модельные смеси AF-производных исследовали методом КЗЭ с прямым фотометрическим (рис. 11) и флуориметрическим (рис. 12) детектированием (табл. 3). Фотометрическое детектирование проводили на длине волны 492 нм, что соответствует длине волны возбуждения 5-IAF. При флуориметрическом детектировании длина волны возбуждения составляла 473 нм, а эмиссии 514 нм. Установлено, что использование 5-ИАФ позволяет увеличить чувствительность определения Hey методом КЗЭ с флуориметрическим детектированием.

0,1 At/

Рис. 11. КЗЭ модельной смеси АТ, модифицированных 5-иодоацетамидо-флуоресцёином с прямым УФ детектированием

Нсу-АЫ00,0 мкМ, Суз-АР-ЗОО.О мкМ, ОЗ-АР-700,0 мкМ. (Х™л = 492нм). Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 68 см, эффективная длина 53 см. Буфер: 25 мМ тетраборат натрия, 25 мМ фосфат натрия рН " 11.2. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 22 мкА. Температура: 25,0 "С. Время ввода пробы: 5 с (электрокинетически, напряжение при вводе пробы - 5 кВ).

Рис. 12. КЗЭ модельной смеси АТ, модифицированных 5-иодоацетамидо-флуоресцеином с флуориметрическим детектированием

Нсу-АР-15,0 мкМ, Су5-АР-!5,0 мкМ, ОБ-АР-15,0 мкМ. (Хто," 473 нм, Хна," 514 нм) Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 65 см, эффективная длина 57 см. Буфер: 25 мМ тетраборат натрия, 25 мМ фосфат натрия рН = 11,2. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 18 мкА. Температура: 25,0 °С. Время ввода пробы: 5 с (электрокинетически, напряжение" при вводе пробы - 5 кВ).

Разработанные методики определения содержания гомоцистеина в плазме крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза внедрены в практику биомедицинского анализа ЗАО «Медицинские технологии, Лтд».

Определение мутаиий в молекулах ДНК методом капиллярного гель-электро&ореза

Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях также может быть обусловлено генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.

В данной работе исследовали возможность использования доступной отечественной КЭ аппаратуры для определения мутаций в молекулах ДНК на примере фрагментов мутантного гена венозных тромбозов, с применением аллель-специфичной ПЦР. Разделение нуклеотидов проводили методом капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) с применением немодифицированных капилляров из кварцевого стекла диаметром от 25 до 100 мкм. В качестве сепаративной матрицы использовали линейный поли-Л^ЛЧдиметилакриламид (пДМА) отечественного производства. Выбор данного полимера связан с возможностью его использования в чип-варианте КГЭ. пДМА синтезировали в ЗАО «Синтол» из мономера ди-метилакриламида путём радикальной полимеризации. Длину цепи контролировали изменением температуры или добавлением ловушек радикалов. Использовали полимеры, содержащие 5-8% мономера пДМА. В качестве фоновых электролитов применяли 0,1 М TBE (0,1 М TRIS, 0,1 М борной кислоты и 2,5 мМ ЭДГА; pH = 83) и 0,1М TAPS (М-трис(гидроксиметил)метил-З-аминопропансульфоновая кислота; pH = 8,3) Все исследуемые полимеры имели низкий уровень дативной флуоресценции (<0,5 AU). Полимеры, приготовленные с использованием 0,1М TAPS, позволяют проводить до 5 разделений без перезаполнения капилляра гелем, в то время как содержащие TBE допускали не более 3. Указанные полимеры обеспечивают разрешающую способность, сравнимую с соответствующими западными аналогами, но при этом более доступны по цене.

Исследования смеси флуоресцентно меченых полинуклеотидов с длинами 5-1525-35-45-55-65-75-85-95-100-101 и.о. соответственно при содержании 10"9 М каждого из них позволили определить оптимальный состав полимера для разделения

олигонуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. (рис. 13). Таковым является гель на основе пДМА, содержащий 6% мономера, 7М мочевины и 0,1М TAPS.

5-15-25-35-45-55-65-75-85-95-100-101 н.о.

Капилляр: внутренний диаметр - 50 мкм, полная длина - 45 см, эффективная длина - 38,5 ем. Полимер: 6% мономера пДМА, 0,1M TAPS, 7М мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение: 10 кВ. Сила тока: 4,3 мкА. Температура: 25,0 "С. Время ввода пробы 10 с (электрокинетически, напряжение при наборе пробы - 10 кВ).

Оптимизация условий разделения (напряжение, сила тока, эффективная длина и диаметр капилляра) позволила достичь разделения до базовой линии оли-гонуклеотиодов общей длиной менее 100 н.о. и разницей по длине 1 н.о. (рис. 14.).

Рис. 14. Разделение смеси полинуклеотидов с разницей по длине в 1 н.о. Капилляр: внутренний диаметр - 50 мкм, полная длина - 65 см, эффективная длина - 57,5 см. Полимер: 6% мономера пДМА, 0,1М TAPS, 7М мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение: И кВ. Сила тока: 5,1 мкА. Температура: 25,0 "С. Время ввода пробы 10 с(электрокинетически, напряжение при наборе пробы -10 кВ).

Полученные данные были положены в основу разработки системы быстрой и эффективной диагностики мутантного гена венозных тромбозов (Leiden гена фактора V системы свёртывания крови человека).

Для доказательства возможности совместного определения продуктов дикого и мутантного типов (разница 5 н.о.) были проведены следующие ПЦР: 1. ДНК дикого типа (без мутации) + праймер дикого типа; 2. ДНК дикого типа (без мутации) + праймер FV Leiden; 3. ДНК с гетерозиготной мутацией FV Leiden + праймер FV Leiden; 4. праймер FV Leiden без ДНК. Продукты реакции после обработки формамидом и разведения водой подвергали анализу методом КГЭ с флуориметрическим детектированием. Анализ образцов 1 и 3 показал в смеси после ПЦР наличие продукта, а образцов 2 и 4 - его отсутствие. Для подтверждения указанной закономерности был проведен анализ смеси образцов му-тантный праймер/мутантный продукт и праймер дикого типа/продукт дикого типа в соотношении 1:1 (рис. 15).

Капилляр: внутренний диаметр - 50 мкм, полная длина - 4S см, эффективная длина - 38,5 см. Полимер 6% мономера пДМА, 0,1М TAPS, 7М мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение: 12 кВ. Сила тока: 6,5 мкА. Температура: 25,0 °С. Время забора пробы: 10 с (алектрокинетически, напряжение при наборе пробы -10 кВ).

Полученные данные показывают возможность совместного определения продуктов аллель-специфичной ПЦР мутации FV Leiden и дикого типа. Предложенный подход, а именно подбор и синтез аллель-специфичных праймеров разной длины и общего встречного праймера с последующим анализом методом КГЭ с флуориметрическим детектированием, может быть распространен для диагностики и других генетически обусловленных заболеваний. Следует также отметить возможность проведения анализа олигонуклеотидов на стандартной отечественной аппаратуре, применяемой для анализа аминокислот и коротких пептидов.

Выводы.

1. Разработаны методики анализа генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с рефрактометрическим и прямым УФ детектированием. Изучено влияние состава и значения pH фонового электролита, а также добавок органических растворителей на эффективность разделения.

2. Методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ детектированием проведено количественное определение модельной смеси 14 генетически кодируемых свободных аминокислот.

3. Разработана методика быстрого и достоверного определения содержания низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови здоровых и больных пациентов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Показана принципиальная возможность применения данной методики для определения пониженного содержания гомоцистеина в плазме крови. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов.

4. Показана возможность определения патологически высоких концентраций гомоцистеина в плазме крови методом капиллярного зонального электрофореза с фотометрическим детектированием. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов. Изучена возможность применения 5-иодоацетамидофлуоресцеина в качестве поглощающей и флуорогенной метки.

5. Разработана методика селективного определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов (мутация FV Leiden) методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметрическим детектированием. Показана возможность анализа нуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. и с разницей по длине в 1 н.о.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Мельников И.О., Назимов И.В., Стукачева Е.А., Глубокое Ю.М. Определение содержания гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови.//Ж. Анал. Хим. -2006. -Т. 61. -№ 11. -С. 1185-1191.

2. Мельников И.О., Глубокое Ю.М., Назимов И.В. Капиллярный электрофорез свободных аминокислот с рефрактометрическим и прямым УФ-детектированием. И Инф.-анал. бюлл. «Ученые записки МИТХТ». М.: МИТХТ. -2004. Вып. И. -С. 54-57.

3. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Анализ низкомолекулярных аминотиолов методами капиллярного электрофореза и ОФ ВЭЖХ с флуоресцентной и прямой УФ-детекцией, // Ж. «Современные наукоемкие технологии». М.: Академия Естествознания, -2005. -№3. -С.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov YuM. HPLC and HPCE detenninatíon of homocysteine as a criterion of vascular diseases risk factor. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.l. -P. 256.

5. Мельников И.О., Назимов И.В., Лобазов А.Ф., Попкович Г.В. Капиллярный электрофорез немодифицированных аминокислот. // Тез. докл. 8-ой Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу, Москва, октябрь 2001, С. 23.

6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Capillary Electrophoresis Of Coded Nonmodified Amino Acids With Refractometric Detection. II 3ri International Symposium on Separations in Biosciences, Москва, май 2003, -P. 263.

7. Мельников И.О., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови методами КЭФ и ОФ ВЭЖХ. // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». М.: МГУ, 2005. Секция химия. -Т. 1. -С. 31.

8. Назимов И.В., Мельников И.О., Глубоков ЮЛ!., Сивоплясова Е.А. Инструментальные микрометоды определения гомоцистеина как фактора риска

сердечно-сосудистых заболеваний. // Материалы 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии», Анапа, сентябрь 2005,-С. 15-16.

9. Мельников И.О., Назимов И.В., Сивоплясова ЕЛ., Глубокое Ю.М Микрометоды количественного определения гомоцистеина в плазме крови. // Материалы 3-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, октябрь 2005,-С. 61.

10. Мельников И.О., Сивоплясова Е.А., Глубокое Ю.М., Назимов И.В. Определение фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний с использованием хроматографических методов анализа. // Материалы 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва, октябрь 2005, -С. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva Е.А., Glubokov Yu.M. Separation and identification of blood low molecular weight aminothiols by reversed phase high performance liquid chromatography and capillaiy electrophoresis. // International congress on analytical sciences ICAS-2006, Москва, июнь 2006, -P. 204.

12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I„ Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Determination of human leiden gene mutation by high performance capillary gel electrophoresis. // 26th International Symposium on the Separations.

: of Proteins, Peptides and Polynucleotides, LMP, Инсбрук, Австрия, октябрь 2006, -P. 24.

Мельников Игорь Олегович

Автореферат диссертации «Разработка микрометодов анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза»

Подписано в печать 31.10.2006. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ.л. 1,5 Тираж 100 экз.

Заказ 218

Отпечатано в типографии ООО «Связь-Принт» Москва, ул. Казакова, д.8а, стр.3

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. а-Аминокислоты и методы их анализа.

1.1.1. Общие положения.

1.1.2. Методы анализа -.

1.1.3. Способы детектирования.

1.2. Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и методы их анализа -.

1.2.1. Гомоцистеин и его метаболизм в организме человека -

1.2.2. Методы анализа гомоцистеина.

1.2.3. Способы идентификации гомоцистеина

1.2.3.1. Методы, не требующие предварительной дериватизации.

1.2.3.2. Методы с предварительной дериватизацией -

1.3. Методы разделения и идентификации полинуклеотидов

1.3.1. Нуклеиновые кислоты. Общие положения

1.3.2. Дезоксирибонуклеиновые кислоты. Методы анализа -

1.3.3. Капиллярный гель-электрофорез. Основы метода.

Область применения -.

1.3.4. Определение мутаций генов - - - - -

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Приготовление рабочих растворов.

2.3. Приборы и оборудование -.

2.4. Общая методология работы.

2.4.1. Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза

2.4.2. Анализ гомоцистеина, цистеина и глутатиона методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза

2.4.3. Анализ олигонуклеотидов методом капиллярного гель-электрофореза.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение свободных кодируемых аминокислот

3.1.1. Определение методом капиллярного зонального электрофореза.

3.1.2. Определение методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.

3.2. Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотилов плазмы крови.

3.2.1. Определение микроколоночной ОФ ВЭЖХ - -

3.2.2. Определение методом капиллярного электрофореза -

3.3. Определение мутаций в молекулах ДНК методом капиллярного гель-электрофореза - - -

4. ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. В настоящее время клинические исследования все больше ориентируются на использование инструментальных микрометодов анализа для диагностики наиболее распространенных и опасных социально-значимых заболеваний. Однако значительная часть этих методов не полностью и не всегда обеспечивает своевременное и качественное их диагностирование, что часто не отвечает современным требованиям мониторинга биохимического статуса человека.

Свободные аминокислоты и короткие пептиды, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. В ряде случаев они могут выступать в роли молекулярных маркеров определенных заболеваний. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания. Наряду с этим большинство существующих методов аминокислотного анализа является либо недостаточно чувствительными и селективными для их идентификации, либо требуют дериватизации аминокислот, что существенно усложняет процесс их определения. Проблема простого и экономичного анализа свободных генетически кодируемых аминокислот до сих пор до конца не решена. В то же время клинический анализ аминокислот требует их пред- или постколоночной модификации для высокочувствительного и селективного определения. Кроме того, изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях может быть связано с генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.

Между тем . необходимая для аминокислотного и нуклеотидного анализа аппаратура импортного производства, как правило, является дорогостоящей и малодоступной для большинства клинических лабораторий. Ситуация усугубляется еще и тем, что многие приборы являются узкоспециализированными для каждого вида заболевания, вследствие чего Автор выражает благодарность руководителю группы аналитической химии белка ИБХ РАН СТ.Н.С., К.Х.Н. И.В. Назимову за постоянную помощь, внимание и обсуждение результатов. наблюдается множественное дублирование диагностических методов как по аппаратуре, так и по методологии. Это резко повышает стоимость клинических исследований и усложняет сравнение полученных результатов анализа. Таким образом, разработка новых методик, расширяющих возможности использования общедоступного аналитического оборудования отечественного производства для высокочувствительного экспрессного и надежного определения свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов как для структурного анализа биополимеров и их фрагментов, так и в клинико-диагностических целях является актуальной научной задачей.

Следует отметить, что наряду с широкоприменяемыми в классических схемах аминокислотного и нуклеотидного анализа хроматографическими методами разделения перспективно использовать метод капиллярного электрофореза. Этот метод позволяет существенно упростить существующие методики определения и обеспечивает большую разрешающую способность, а возможность его стыковки с рядом высокочувствительных детекторов делает его применение выгодным при анализе микроколичеств исследуемых соединений.

Цель работы. Целью диссертационной работы является разработка комплекса инструментальных высокочувствительных микрометодов анализа свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием отечественной инструментальной базы.

Научная новизна.

1. Разработаны методики определения не модифицированных генетически кодируемых а-аминокислот с использованием методов капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-фотометрическим и рефрактометрическим способами детектирования.

2. Разработаны и применены в клинической практике методики совместного определения низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови с использованием методов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с флуориметрическим и прямым УФ-фотометрическим способами детектирования.

3. Разработана методика определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов на основе анализа продуктов аллель-специфичной полимеразной цепной реакции методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметрическим детектированием.

Практическая значимость. Разработанный метод аминокислотного анализа позволяет определять микроколичества генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации, что существенно упрощает существующую схему анализа. Разработан и предложен для практического использования комплекс методов анализа молекулярных маркеров (гомоцистеин, цистеин, глутатион) сосудистых катастроф, а также фрагментов мутантного гена венозных тромбозов. В результате проведенной работы удалось показать возможность эффективного использования отечественной аппаратуры для проведения биохимического анализа как белковых, так и нуклеиновых компонентов на одном и том же приборе для капиллярного электрофореза. Определение серосодержащих аминокислот и пептидов в плазме крови по разработанной в данной работе методике использовали для оценки фактора риска десятков пациентов с достоверно установленным инфарктным и предынфарктным состоянием. Результаты проведенной работы использованы при создании и апробировании в практике биомедицинского анализа универсального экономичного автоматизированного комплекса приборов и методов молекулярной диагностики некоторых социально-значимых заболеваний (инфаркты, инсульты, тромбозы), разрабатываемого в институте аналитического приборостроения РАН.

На защиту выносятся: способы определения генетически кодируемых аминокислот в водном растворе без их предварительной дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии;

- оптимизированные условия дериватизации низкомолекулярных аминотиолов плазмы с использованием флуорогенных реагентов (монобромобиман и 5-иодоацетамидофлуоресцеин); методика анализа низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза;

- результаты определения содержания гомоцистеина в плазме крови методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного зонального электрофореза;

- способ определения мутантного гена венозных тромбозов с использованием капиллярного гель-электрофореза в линейном поли-N,N' -диметилакриламиде.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8-м Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (15-19 октября 2001 г. Москва, Россия), 3-м Международном симпозиуме по методам разделения в бионауках (13-18 мая 2003 г., Москва, Россия,), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Секция химия. 1215 апреля 2005 г., Москва, Россия), 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (12-14 сентября 2005 г., Анапа, Россия), 3-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (25-27 октября 2005 г., Москва, Россия), 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. МБ. Ломоносова (13-14 октября 2005 г., Москва, Россия), Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (2530 июня 2006 г., Москва, Россия), 31-м Международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ (24-29 июня 2006 г., Стамбул, Турция), 26-м Международном симпозиуме по разделению белков, пептидов и полинуклеотидов (16-20 октября 2006 г., Инсбрук, Австрия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики анализа генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с рефрактометрическим и прямым УФ детектированием. Изучено влияние состава и значения рН фонового электролита, а также добавок органических растворителей на эффективность разделения.

2. Методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ детектированием проведено количественное определение модельной смеси 14 свободных генетически кодируемых аминокислот.

3. Разработана методика быстрого и достоверного определения содержания низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови здоровых и больных пациентов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Показана принципиальная возможность применения данной методики для определения пониженного содержания гомоцистеина в плазме крови. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов.

4. Показана возможность определения патологически высоких концентраций гомоцистеина в плазме крови методом капиллярного зонального электрофореза с фотометрическим детектированием. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов. Изучена возможность применения 5-иодоацетамидофлуоресцеина в качестве поглощающей и флуорогенной метки.

5. Разработана методика селективного определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов (мутация FV Leiden) методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметрическим детектированием. Показана возможность анализа нуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. и с разницей по длине в 1 н.о.

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. // М.: Медицина, -1998,-704 с.

2. Johansson L., GafVelin G., Arner E.S. Selenocysteine in proteins-properties and biotechnological use. //Biochim. Biophys. Acta. -2005. -V. 1726. -1.1. -P. 1-13.

3. Kiyukov G.V., Castellano S., Novoselov S.V., Lobanov A.V., Zehtab O., Guigo R., Gladyshev V.N. Characterization of mammalian selenoproteomes. // Science -2003. -V. 300. -1.5624. -P. 1439-1443.

4. Srinivasan G., James C.M., Krzycki J.A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA // Science -2002. -V. 296. -1.5572.-P. 1459-1462.

5. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. // Пер. с англ.: М.: Мир, 1993, - Т. 1. - 384 с.

6. Fisher G, Lorenzo N, Abe H, Fujita E, Frey WH, Emory C, Di Fiore MM, D' Aniello A. Free D- and L-amino acids in ventricular cerebrospinal fluid from Alzheimer and normal subjects. // Amino Acids. -1998. -V.15. -I. 3. -P. 263269.

7. Castillo J., Martinez F., Corredera E., Aldrey J.M., Noya M. Amino Acid Transmitters in Patients With Headache During the Acute Phase of Cerebrovascular Ischemic Disease. // Stroke. -1995. -V. 11. -I. 11 -P. 20352039.

8. Hanley W.B. Adult phenylketonuria. // Am. J. Med. -2004. -V. 117. -I. 8. -P. 590-595.

9. Garibotto G, Tessari P, Verzola D, Dertenois L. The metabolic conversion of phenylalanine into tyrosine in the human kidney: does it have nutritional implications in renal patients? // J. Ren. Nutr. -2002. -V. 12. -1.1. -P. 8-16.

10. Lee K.S., Drescher D.G. Fluorometric amino-acid analysis // Int. J. Biochem. -1978.-V. 9.-1.7.-P. 457-467.

11. Дейл 3., Мацек К., Янак Я. Жидкостная колоночная хроматография. // Пер. с англ.: М.: Мир, 1978,-Т. 2. - 471 с.

12. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот. // Под ред. М. А. Прокофьева. М.: Изд-во МГУ, 1985, - 248 с.

13. Хефтман Э. Хроматография. Практическое приложение метода. // Пер. с англ.: М.: Мир, 1986, -Т. 1. - 336с.

14. Cole W.G., Chan D., Chambers G.W., Walker I.D., Bateman J.F. Deletion of 24 amino acids from the pro-alpha 1(1) chain of type I procollagen in a patient with the Ehlers-Danlos syndrome type VII. // J. Biol. Chem. -1986. -V. 261. -1.12. -P. 5496-5503.

15. Shively J.E. The chemistry of protein sequence analysis. // EXS. -2000. -V. 88. -P. 99-117.

16. Nazimov I.V., Levina N.B. Unified system for high speed analysis of DNS- and PTG amino acidsIII Chem. Pept. and Prot. -1986. -Vol. 3. -P. 119-126.

17. Кибардин С. А., Макаров К. А., Тонкослойная хроматография в органической химии. М.: Наука, 1974, 156 с.

18. Bhushan R., Reddy G.P. Thin layer chromatography of dansyl and dinitrophenyl derivatives of amino acids. A review. // Biomed. Chromatogr. -1989. -V. 3. -I. 6.-P. 233-240.

19. Практическая химия белка. // Под ред. А. Дарбре, пер.с англ. Н.А. Алданова, И.В. Назимова, П.Д. Решетова, М.: Мир, 1989, 611 с.

20. Hara S., Hayashi S. Correlation of retention behaviour of steroidal pharmaceuticals in polar and bonded reversed-phase liquid column chromatography. //J. Chromatogr. A. -1977. -V. 142. -P. 689-703.

21. Ivanov A. R., Nazimov I. V., Lobazov A. P., Popkovich G. B. Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillaiy electrophoresis with refractometric detection. // J. Chromatogr. A. -2000. -V.894.-1.1-2.-P. 253-257.

22. Манаенков О.В., Сидоров А.И., Сульман Э.М. Экспресс-определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без их предварительной дериватизации. // Ж. Анал. Хим. -2003. -Т. 58. -№10. -С. 1093-1096.

23. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Capillary Electrophoresis Of Coded Nonmodified Amino Acids With Refractometric Detection. // 3rd International Symposium on Separations in Biosciences, Москва, май 2003, -P. 263.

24. Мельников И.О., Глубокое Ю.М., Назимов И.В. Капиллярный электрофорез свободных аминокислот с рефрактометрическим и прямым УФ-детектированием. // Инф.-анал. бюлл. «Ученые записки МИТХТ». М.: МИТХТ. -2004. Вып. 11. -С. 54-57.

25. Геккелер К., Экштайн X. Аналитические и препаративные лабораторные методы. // Справ. Изд.: Пер. с нем. М.: Химия, 1994, - 416 с.

26. Carducci C., Birarelli M., Leuzzi V., Santagata G., Serafini P., Antonozzi I. Automated method for measurement of amino acids in urine by high-perfomance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. -1996. -V. 729. -1.1. -P. 173-180.

27. Yang L.-L., Zhang De.-Q., Yuan Z.-B. Enantioseparation of o-phthaldiadehyde derivatized amino acids using (3-CD-modified micellar electrokinetic chromatography in the mixed aqueous-organic media. // Anal. Chim. Acta. -2001.-V. 433.-1.1.-P. 23-30.

28. Paez X., Rada P., Hernandez L. Neutral amino acids monitoring in phenylketonuric plasma microdialysates using micellar electrokinetic chromatography and laser-induced fluorescence detection. // J. Chromatogr. B. -2000.-V. 739.-P. 247-254.

29. Thorsen G., Bergquist J. Chiral separation of amino acids in biological fluids by micellar electrokinetic chromatography with laser-induced fluorescence detection. // J. Chromatogr. B. -2000. -V. 745. -P. 389-397.

30. Qi M., Li X-F, Stathakis C., Dovichi N.J. Capillary electrochromatography with thermo-optical absorbance detection for the analysis of phenylthiohydantoin-amino acids. Ill Chromatogr. A. -1999. -V. 853. -1.1-2. -P. 131-140.

31. Степанов K.B., Пирогов A.B., Шпигун O.A. Идентификация электрофоретических пиков фенилтиогидантоиновых производных аминокислот. //Ж. Анал. Хим.-2006. -Т.61. -№1. -С. 10-17.

32. Xu J.-J, Peng Y., Bao N., Xia Х.-Н., Chen H.-Y. Simple method for the separation and detection of native amino acids and the identification of electroactive and non-electroactive analytes. // J. Chromatogr. A. -2005.-V. 1095.-1.1-2.-P. 193-196.

33. Klampfl C.W. Recent advances in the application of capillary electrophoresis with mass spectrometric detection. // Electrophoresis. -2006. -V. 27. -1.1. -P. 3-34.

34. Poinsot V., Lacroix M., Mauiy D., Chataigne G., Feurer В., Couderc F. Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis. // Electrophoresis. -2006.-V.27.-I. l.-P. 176-194.

35. Satake K., Take Т., Matsuo A., Tazaki K., Nigara Y. Amino Acid Analyzer Using 2,4, 6-Trinitrobenzenesulfonic Acid. // J. Biochem. -1966. -V.60. -I. 1. -P. 12-16.

36. Lau O.W., Mok C.S. Indirect conductimetric detection of amino acids after liquid chromatographic separation. // Anal. Chim. Acta. -1995. -V. 300. -1.1-3. -P. 183-191.

37. Tcherkas Y.V., Kartseva L.A., Krasnova I.N. Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. //J. Chromatogr. A. -2001. -V. 913. -1.1-2. -P. 303-308.

38. Collins R.N. Separation of low-molecular mass organic acid-metal complexes by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. -2004. -V. 1059.1.1-2.-P. 1-12.

39. Whitehead К., Hedges J.I. Electrospray ionization tandem mass spectrometric and electron impact mass spectrometric characterization of mycosporine-like amino acids. // Rapid. Commun. Mass Spectrom. -2003. -V. 17. -V. 18. -P. 2133-2138.

40. Buczek O., Yoshikami D., Watkins M., Bulaj G., Jimenez E.C., Olivera B.M. Characterization of D-amino-acid-containing excitatory conotoxins and redefinition of the I-conotoxin superfamily. // FEBS J. -2005. -V. 272. -1.16. -P. 4178-4188.

41. Лебедев A.T. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: Бином, 2003,-493 с.

42. Zaluzec EJ., Gage D.A., Watson J. Т. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometiy: Applications in Peptide and Protein Characterization // Protein Expr. Purif. -1995. -V. 6. -1.2. -P. 109-123.

43. Zoppa M., Gallo L., Zacchello F., Giordano G. Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC-ESI-MS/MS. //J. Chromatogr. B. -2006. -V. 831. -1.1-2. -P. 267-273.

44. Song Y., Shenwu M., Zhao S., Hou D., Liu Y.M. Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometiy. // J. Chromatogr. A. -2005. -V. 1091.-1.1-2.-P. 102-109.

45. Starke I., Kleinpeter E., Kamm B. Separation, identification, and quantification of amino acids in 1-lysine fermentation potato juices by gas chromatography-mass spectrometry. //Fresenius J. Anal. Chem. -2001. -V. 371. -P. 380-384.

46. Minniti G., Piana A., Armani U., Cerone R. Determination of plasma and serum homocysteine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.//J. Chromatogr. A.-1998.-V. 828.-1.1-2.-P. 401-405.

47. Bolander-Gouzille С. Determination of homocysteine. Why, when and how. Stockholm. 1999.71 p.

48. Magera M.J., Lacey J.M., Casseta В., Rinaldo P. Method for the determination of total homocysteine in plasma and urine by stable isotope dilution and electrospray tandem mass spectrometry. // Clin.Chem. -1999. -V. 45. -I. 9. -P. 1517-1522.

49. Dalton M.L., Gadson P.F., JR., Wrenn W.R., Rosenquist Т.Н. Homocysteine signal cascade: Production of phospholipids, activation of protein-kinase С and the induction of c-fos and c-myb in smooth muscle cells. // FASEB J. -1997. -V.ll.-1.8.-P. 703-711.

50. Dudman N.P.B., Tyrrell P.A., Wilcken D.E.L Homocysteinemia: depressed plasma serine levels. // Metabolism. -1987. -V. 36. -1.2. -P. 198-201.

51. Fortin L.-J., Genest Jr J. Measurement of homocysteine in prediction of arteriosclerosis // Clin. Biochem. -1995. -V. 28. -1.2. -P. 155-162.

52. Clarke R, Lewington S., Landray M. Homocysteine, renal function, and risk of cardiovascular disease. // Kidney Int. -2003. -V. 63. -S. 84. -P. S131-S133.

53. Aronow W.S., Ahn C. Association between plasma homocysteine and coronary artery disease in older persons. // Am. J. Cardiol. -1997.-V.80. -I. 9. -P. 12161218.

54. Gomes C., Rolin Т., Regland В., Oreland L. Decreased methionine adenosyitransferase activity in erythrocytes of patient with dementia disorders. // Eur. Neuropsychopharmacol. -1995. -V. 5. -1.2. -P. 107-114.

55. Wilcken D.E.L., Reddy S.G., Gupta V.J. // Homocysteinemia, ischemic heart diseas, and the carrier state for homocystinuria. // Metabolism. -1983. -V. 32. -1.4.-P. 363-370.

56. Refsum H., Wesenberg F., Ueland P.M. Plasma homocysteine in children with acute lymphoblastic leukemia: changes during a chemotherapeutic regimen including methotrexate.//Cancer Res.-1991.-V.51.-1.3.-P. 828-835.

57. Refsum H., Helland S., Ueland P.M. Radioenzymic determination of homocysteine in plasma and urine. // Clin. Chem. -1985. -V. 31. -1.4.624-628.

58. Ubbink J.B. Assay methods for the measurement of total homocysteine in plasma. // Semin. Thromb. Hemost -2000. -V. 26. -P. 233-241.

59. Powers HJ., Moat SJ. Developments in the measurement of total plasma homocysteine. // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. -2000. -V. 3. -P. 391-397.

60. Andersson A., Isaksson A., Hultberg B. Homocysteine export from erythrocytes and its implication for plasma sampling. // Clin. Chem. -1992. -V. 38. -I. 7. -P. 1311-1315.

61. Rasmussen K., Moller J. Total homocysteine determination in clinical practice. // Ann. Clin. Biochem. -2000. -V. 37. -P. 627-648.

62. Nauck M., Bisse E., Nauk M., Wieland H. Pre-analytical conditions affecting the determination of the plasma homocysteine concentration. // Clin. Chem. Lab. Med.-2001.-P. 675-680.

63. Потехин O.E., Исследование специфических антител к возбудителям инфекционных заболеваний методом иммуноферментного анализа, 21.07.2003, ЗАО "А/О ЮНИМЕД"

64. Sundrehagen Е. Enzymatic Assay for homocysteine and a kit therefore. // Axis Biochemicals ASA. EP 623174/US5631127

65. Ubbink J.B., Hayward Vermaak WJ., Van der Merwe A., Becker PJ. The effect of blood sample aging and food consumption on plasma total homocysteine levels. // Clin. Chim. Acta. -1992. -V. 207. -1.1-2. -P. 119-128.

66. Тест-система, предназначенная для количественного определения общего L-гомоцистеина в человеческой сыворотке или плазме методом иммуноферментного анализа http://www.biochemmack.ru

67. Gupta V.J., Wilcken D.E.L. The detection of cysteine-homocysteine mixed disulphide in plasma of normal fasting man. // Eur. J. Clin. Invest. -1978. -V. 8. -1.4.-P. 205-207.

68. Araki A., Sako Y. Determination of free and total homocysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. //J. Chromatogr. B. -1987. -V.422. -P. 43-52.

69. Feussner A., Rolinski В., Weiss N., et al. Determination of total homocysteine in human plasma by isocratic high-performance liquid chromatography. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1997. -V.35. -1.9 -P. 687-691.

70. Ubbink J.B., Hayward Vermaak W.J., Bissbort S. Rapid high-performance liquid chromatographic assay for total homocysteine levels in human serum // J. Chromatogr. B. -1991. -V. 565 -1.1-2. -P. 441-446.

71. Moat S.J., Bonham J.R, Tanner M.S., et al. Recommended approaches for the laboratory measurement of homocysteine in the diagnosis and monitoring of patients with hyperhomocysteinaemia. // Ann. Clin. Biochem. -1999. -V. 36. -P. 372-379.

72. Myung S.-W., Kim M., Min H.-K., Yoo E.-A., Kim K.-R. Determination of homocysteine and its related compounds by solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. -1999. -V. 727. -I. 1-2.-P. 1-8.

73. Kataoka H., Takagi K., Makita M. Determination of total plasma homocysteine and related aminothiols by gas chromatography with flame photometric detection. // J. Chromatogr. B. -1995. -V. 664. -1.2. -P. 421-425.

74. Chu R.C., Hall C.A. The total serum homocysteine as an indicator of vitamin B12 and folate status // Am. J. Clin. Path. -1988. -V. 90. -P. 446.

75. Ueland P.M., Refsum H., Stabler S.P., Malinow M.R., Andersson A., Allen R.H. Total homocysteine in plasma or serum. Methods and clinical applications. // Clin. Chem. -1993. -V. 39. -1.9. -P. 1764-1779.

76. Saetre R., Rabenstein D.L. Determination of cysteine in plasma and urine and homocysteine in plasma by high-pressure liquid chromatography. // Anal. Biochem. -1978. -V. 90 -1.2. -P. 684-692.

77. Rabenstein D.L., Yamashita G.T. Determination of homocysteine, penicilamine, and their symmetrical and mixed disulfides by liquid chromatography with electrochemical detection. // Anal. Biochem. -1989. -V. 180. -1.2. -P. 259-263.

78. Pfeyffer C.M., Huff D.L., Gunter E.W. Rapid and accurate HPLC assay for plasma total homocysteine and cysteine in a clinical laboratory setting. // Clin. Chem. -1999. -V. 45. -1.2. -P. 290-292.

79. Causse E., Siri N., Bellet H., Champagne S., Bayle C., Valdiguie P., Salvayre R., Couderc F. Plasma homocysteine determined by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. // Clin. Chem. -1999. -V.45. -I. 3. -P. 412-414.

80. Kang S.-S., Wong P.W.K., Curley K. The effect of D-penicillamine on protein-bound homocysteine in homocystinurics. // Pediatr. Res. -1982. -V. 16. -I. 5. -P. 370-372.

81. Nakashima K., Umekawa C., et al., High-performance liquid chromatography/chemiluminiscence determination of biological thiols with N-4-(6-dimethylamino-2-benzofuranyl)phenyl.maleimide. // -1987. J. Chromatogr. В. -V. 414. -P. 11-17.

82. Stabler S.P., Marcell P.D., Podell R., Allen R.H. Quantitation of total homocysteine, total cysteine, and methionine in normal serum and urine capillary gas chromatography-mass spectrometry. // Anal. Biochem. -1987. -V. 162.-1.1. -P. 185-196.

83. Jacobsen D.J., Gatautis V.J., Green R Determination of plasma homocysteine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. // Anal. Biochem.-1989.-V. 178.-1.1.-P. 208-214.

84. Chou S.-T., Ко L.-E., Yang C.-S. High performance liquid chromatography with fluorimetric detection for the determination of total homocysteine in human plasma: method and clinical applications. //Anal. Chim. Acta. -2001. -V. 429. -1.2.-P. 331-336.

85. Kang S.H., Kim J.-W., Chung D.S. Determination of homocysteine and other thiols in human plasma by capillary electrophoresis. // J. Pharm. Biomed. Anal. -1997.-V. 15.-1.9-10.-P. 1435-1441.

86. Kim I.-J., Park S.-J., Kim H.-J. Chiral separation of homocysteine by derivatization with 4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,l,3-benzoxadiazole followed by capillary electrophoresis using y-cyclodextrin. // J. Chromatogr. A. -2000. -V. 877.-1.1-2.-P. 217-223.

87. Kosower E.M., Kosower N.S. Bromobimane probes for thiols in Methods Enzymol. //Acad. Press Inc.-1995. -V. 251. -P. 133-148.

88. Fontana A., Toniolo C. Detection and determination of thiols, in Methods Enzymol. // Acad. Press Inc. -1999. -V. 251. -P. 271-324.

89. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Sixth edition 1996 Molecular Probes Inc. 680.22,48-52

90. Carducci C, Birarelli M, Nola M, Antonozzi I. Automated high-performance liquid chromatographic method for the determination of homocysteine in plasma samples. // J Chromatogr A. -1999. -V. 846. -1.1-2. -P. 93-100.

91. Chwatko G., Bald E. Determination of cysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection after pre-column derivatization with 2-chloro-l-methylpyridinium iodide. // Talanta. -2000. -V. 52.-1.3. -P. 509-515.

92. Bald E., Kaniowska E., Chwatko G., Glowacki R. Liquid chromatographic assessment of total and protein-bound homocysteine in human plasma. // Talanta. -2000. -V. 50. -1.6. -P. 1233-1243.

93. Cole D.E.C., Lehotay D.C., Evrovski J. Simplified simultaneous assay of total plasma homocysteine and methionine by hplc and pulsed integrated amperometry. // Clin. Chem. -1998. -V. 44. -1.1. -P. 188-190.

94. Pietzsch J., Julius U., Hanefeld M. Rapid determination of total homocysteine in human plasma by using N(0,S)-ethoxycarbonyl ethyl ester derivatives and gas chromatography-mass spectrometry. // Clin. Chem. -1997. -V. 43. -I. 10. -P. 2001-2004.

95. Myung S.-W., Kim M., Min H.-K., Yoo E.-A., Kim K.-R. Determination of homocysteine and its related compounds by solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. -1999. -V. 727. -I. 1-2.-P. 1-8.

96. Chwatko G., Bald E. Determination of different species of homocysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 949. -1.1-2. -P. 141-151.142

97. Stabler S.P., Marcell P.D., Podell E.R., Allen R.H. Elevation of serum cystathionine levels in patients with cobalamin and folate deficiency. // Blood. -1993. -V. 81. -1.12. -P. 3404-3413.

98. Pasas S. A., Lacher N. A., Davies M.I., Lunte S.M. Detection of homocysteine by conventional and microchip capillary electrophoresis/electrochemistry. // Electrophoresis. -2002. -V. 23. -1.5. -P. 759-766.

99. Uji Y., Motomiya Y., Hanyu N., Ukaji F., Okabe H. Protein-bound homocystamide measured in human plasma by HPLC. // Clin. Chem. -2002. -V.48.-1.6.-P. 941-944.

100. Kang S.H., Wei W., Yeung E.S. On-column derivatization for the analysis of homocysteine and other thiols by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. //J. Chromatogr. В.: Biomed. Sci. Appl. -2000. -V. 744. -I. l.-P. 149-156.

101. Преображенский H.A., Евстигнеева Р.П. Химия биологически активных природных соединений. // Химия. -1970. -512 с.

102. Сингер М., Берг П. Гены и геномы // Мир. -1998. т. 1. -374 с.

103. Huber C.G. Micropellicular statiohary phases for high-performance liquid chromatography of double-stranded DNA. // J. Chromatogr. A. -1998. -V. 806. -I. l.-P.3-30.

104. Westman E., Eriksson S., Laas Т., Pernemalm P.-A., Skold S.-E. Separation of DNA restriction fragments by ion-exchange chromatography on FPLC columns Mono P and Mono Q.// Anal. Biochem. -1987. -V. 166.-I. l.-P. 158-171.

105. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде E.B. Практическаявысокоэффективная жидкостная хроматография. // -1986. -Москва. -224 с.

106. Eriksson S., Glad G., Pernemalm P.-A., Westman E. Separation of DNA restriction fragments by ion-pair chromatography. // J. Chromatogr. -1986. -V. 359.-1.1.-P. 265-274.

107. Dickman MJ. Effects of sequence and structure in separation of nucleic acids using ion pair reversed phase liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. -2005. -V. 1076.-1.1-2.-P. 83-89.

108. Lee G.-Y., Chen C.-H., Wang T.-H., Lee W.-C. Affinity chromatography of DNA nonporous copolymerized particles of styrene and glycidyl methacrylat with immobilized polynucleotide. // Anal. Biochem. -2003. -V. 312. -1.2. -P. 235-241.

109. Huber C.G., Oberacher H. Analysis of nucleic acid by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. // Mass Spectr. Rev. -2001. -V. 20. -I. 5. -P. 310-343.

110. Ghourchian H., Elyasvandi H. Capacitively-induced pulsed-field gel electrophoresis: A novel method for DNA separation. // Med. Engineer. Phys. -2005. -V. 27. -1.8. -P. 723-727.

111. Brody J.R, Kern S.E. Histoiy and principles of conductive media for standart DNA separation. // Anal. Biochem. -2004. -V. 333. -1.1. -P. 1-13.

112. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. // M.: Наука, 2000. - 780 с.

113. Salimullah М., Mori М., Nishigaki К. High-throughput three-dimensional gel electrophoresis for versatile utilities: A stacked slice-gel system for separations and reactions. // Geno. Prot. Bioinfo. -2006. -V. 4. -1.1. -P. 26-33.

114. Liu S., Guttman A. Electrophoresis microchips for DNA analysis. // Trends Anal. Chem. -2004. -V. 23. -1.6. -P. 422-431.

115. Huber C.G., Oefher PJ., Preuss E., Bonn G.K. High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on non-porous poly(styrene-divinyIbenzene) particles. //Nucleic Acid Res. -1993. -V 21. -1.5. -P.1061-1066.

116. Oefher P.J., Huber C.G., Puchhammer-Stockl E., Umlauft F., Grunewald K., Bonn G.K., Kunz C. High-Performance Liquid Chromatography for Routine Analysis of Hepatitis С Virus cDNA/PCR Products. // BioTechniques. -1994. -V.16. -1.5. -P. 898-908.

117. Chen G., Han X., Zhang L., Ye J. Determination of purine and pyrimidine bases by micellar electrokinetic capillaiy chromatography with electrochemical detection. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 954. -1.1-2. -P. 267-276.

118. Lin Y.-W., Chiu T.-C., Chang H.-T. Laser-indused fluorescence technique for DNA and protein separation by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. B. -2003.-V. 793.-I. l.-P. 37-48.

119. Stults J.T., Marsters J.C. Improved electrospray ionization of synthetic oligodeoxynucleotides. // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1991. -V. 5. -P. 359-363.

120. Huber C.G., Buchmeiser M.R- On-line cation-exchange for suppression of adduct formation in negative-ion electrospray mass spectrometry of nucleic acids. // Anal. Chem. -1998. -V. 70. -P. 5288-5295.

121. Brezinschek H.P., Brezinschek R.I., Lipsky P.E. Analysis of the heavy chain repertoire of human peripheral В cells using single-cell polymerase chain reaction. //J. Immunol. -1995. -V. 155: -P. 190-202.

122. Liu C., Wu Q., Harms A.C., Smith R.D. On-line microdialysis sample cleanup for electrospray ionization mass spectrometry of nucleic acid samples. // Anal. Chem. -1996. -V. 68. -P. 3295-3299.

123. Van Breemen R.B., Martin L.B., Le J.C. Continuous-flow fast atom bombardment mass spectrometry of oligonucleotides. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. -1991. -V. 2. -P. 157-163.

124. Wu K.J., Steding A., Becker C.H. Matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass specrtrometry of oligonucleotides using 3-hydroxypicolinic acid as an ultraviolet-senistive matrix. // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1993. -V. 7. -P. 142-146.

125. Edwards J.R, Ruparel H., Ju J. Mass-spectrometry DNA sequencing. // Mutation Res. -2005. -V. 573. -1.1-2. -P. 3-12.

126. Cohen A.S., Karger B.L. High-performance sodium dodecyl sulfate polyacrylamide capillary gel electrophoresis of peptides and proteins. // J. Chromatogr. -1987. -V. 397. -P. 409-417.

127. Cohen A.S., Najarian D., Smith J.A., Karger B.L. Rapid separation of DNA restriction fragments using capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. -1988. -V. 458.-P. 323-333.

128. Li S.F.Y. Capillary electrophoresis: principles, practice and applications. // Elsevier Science Publishers B.V. -1992. -P. 556.

129. Introduction to capillary electrophoresis // Beckman Instruments Inc. -1994. -P. 44

130. Olivera B.M., Baine P., Davidson N. Electrophoresis of the nucleic acids. // Biopolymers -1964. -V. 2. -1.3. -P. 245-257.

131. Kleparnik K., Mala Z., Doskar J., Rosypal S., Bocek P. An improvement of restriction analysis of bacteriophage DNA using capillary electrophoresis in agarose solution. // Electrophoresis. -1995. -V. 16. -1.1. -P. 366-376.

132. Chiu T.-C., Chang H.-T. Comparison of the separation of large DNA fragments in the presence and absence of electroosmotic flow at high pH. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 979. -1.1-2.-P. 299-306.

133. Kang D., Chung D.S., Kang S.H., Kim Y. Separation of DNA with hydroxypropylmetyl cellulose and poly(ethylene oxide) by capillary gel electrophoresis. //Microchem. J. -2005. -V. 80. -P. 121-125.

134. Jung H.J., Bae Y.C. Theory for capillary electrophoretic separation of DNA in polymer solutions. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 967. -1.2.-P. 279-287.

135. Menchen S., Johnson В., Winnik M.A., Xu B. Flowable networks as DNA sequencing media in capillary columns. // Electrophoresis. -1996. -V. 17. -I. 9. -P. 1451 -1459.

136. Yoshioka H., Mori Y., Shimizu M. Separation and recovery of DNA fragments through a thermoreversible hydrogel composed of poly(ethylene oxide) and polypropylene oxide). // Anal. Biochem. -2003. -V. 323. -12. -P. 218-223.

137. Ren J., Fang N., Wu D. Inverse-flow derivatization for capillary electrophoresis of DNA fragments with laser-indused fluorescence detection. // Anal. Chim. Acta. -2002. -V. 470. -1.2. -P. 129-135.

138. Vegvari A., Hjerten S. Stable homogeneous gel for molecular-sieving of DNA fragment in capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 960. -1.1-2.-P. 221-227.

139. Barbier V., Viovy J.-L. Advanced polymers for DNA separation. // Curr. Opin. Biotech. -2003. -V. 14. -P. 51-57.

140. Song L., Liang D., Chen Z., Fang D., Chu B. DNA sequensing by electrophoresis using mixture of polyacrylamide and poly(N,N-dimethylacrylamide). //J. Chromatogr. A. -2001.-V. 915. -1.1-2. -P. 231-239.

141. Chu В., Liang D. Copolimers solutions as separation media for DNA capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A. -2002. -V. 966. -1.1-2. -P. 1-13.

142. Middaugh C.R., Evans R.K., Montgomery D.L., Casimiro D.R. Analysis of plasmid DNA from pharmaceutical perspective. // J. Pharm. Sci. -1998. -V. 87. -1.2.-P. 130-146.

143. Ren J., Ulvik A., Refsum H., Ueland P.M. Chemical mismatch cleavage combined with capillary electrophoresis: detection of mutations in exon 8 of the cystathionin (3-synthase gene. // Clin. Chem. -1998. -V. 44. -1.10. -P. 2108-2114.

144. Tian H., Brody L.C., Landers J.P. Rapid detection of deletion, insertion and substitution mutations via heteroduplex analysis using capillary- and microchip-based electrophoresis.//Genome Res.-2000.-V. 10.-P. 1403-1413.

145. Brown N.M., Pratt V.M. et al. Detection of 677CT/1298AC "double variant" chromosomes: Implications for interpretation of MTHFR genotyping results. // Genet. Med. -2005. -V. 7. -1.4. -P. 278-282.

146. Michaud E.J., Culiat T.C. et al. Efficient gene-driven germ-line point mutagenesis of C57BL/6J mice. // BMC Genomics. -2005. -V. 6. -P. 164-182.

147. Torres J.M., Ortega E. Quantitation of mRNA levels of steroid 5-a-reductase isozymes: a novel methods that combines quantitative RT-PCR and capillary electrophoresis. // Int. J. Biochem. Cell Biol. -2004. -V. 36. -P. 78-88.

148. Hizli Z.B., Ozarda Ilcol Y., Asian D. Plasma amino acid concentration in healthy pediatric and adult subjects. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S. 1. -P. 334.

149. Fiskerstrand T, Refsum H, Kvalheim G, Ueland PM. Homocysteine and other thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability. // Clin. Chem. -1993. -V. 39. -1.2. -P. 263-271.