Разработка усовершенствованного метода синтеза 5-фосфотиоэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Введение

Глава I.Методы химического синтеза аналогов НК,модифицированных по межнуклеотидным фосфатным группамС обзор литературы).

1.1. Введение

1.2. Тиофосфатные аналоги НК.

1.2.1. Синтез 5'-фосфотиоэфирных(5'1^) аналогов Ж.

1.2.2. Синтез фосфотионатных аналогов НК.

1.3. Фосфамидные аналоги НК.,

1.3.1. Синтез 5'-фосфамидных(5'Рм) аналогов НК

1.3.2. Синтез зЦ&осфамидных(3'Рм) аналогов НК

1.3.3. Синтез амвдофосфатных аналогов НК.

1.4. Фосфонатные аналоги НК.

1.4.1.Синтез 3- и б^-фосфонатныхСЗ^и 5jP0) аналогов НК

1.4.2. Синтез бЁ-фосфонатныхСЙР^) аналогов НК.

1.4.3. Синтез 5^-метилфосфонатных(51Р0+) аналогов НК

1.4.4. Синтез фосфонометильных(Рс) аналогов НК.

1.5. Синтез фосфотриэфирных(Р^) аналогов НК.

1.6. Синтез фосфитныхСР^) аналогов НК.

Глава 2. Результаты и обсуждение результатов.

2.1. Исследование кинетики реакции алкилирования

2.1 Л. Определение порядка реакции алкилирования.

2.1.2. Зависимость констант скорости реакции алкилирования от различных факторов

2.1.2.1. Зависимость ^ реакции алкилирования от природы противокатионов реагентов.

2.1.2.2. Зависимость Kj реакции алкилирования от концентрации воды в реакционной смеси.

2.1.2.3.Зависимость Kj реакции алкилированияот добавок солей.

2.1.2.4. Зависимость Kj реакции алкилирования от рН . .43 2.1.2.5.Зависимость Kj реакции алкилирования от температуры.

2.1.3. Рекомендации для синтеза 5'Р^-аналогов НК

2.2. Синтез электронейтральных мономеров INpgR+.

2.2.1. Выбор структуры и метода синтеза мономеров.

2.2.2. Синтез алкилирущего реагента (R+Br)I".

2.2.3. Синтез алкилтиофосфатов NpsR+*

2.2.4. Реакция иодирования NpsR+.

2.2.5. Синтез 1Тр^+реакциеЙ переалкилирования ITpsCNEt

2.3. Исследование кинетики реакции INpsR+o Тр£ в ДШ?А

2.4. Синтез б'Р^-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов

2.4.1. Синтез ^-аналогаТ-С*!^ (ХХШ).

2.4.2.Синтез б'Р^-аналога гексадекадезоксирибонуклеотида(ХШ.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Исходные материалы.

3.2. Основные методы работы.

3.3. Методики синтеза.

3.3.1.Синтез 2-6poM-[N-(п-диэтилметиламино)фенил]прошонамида иодида (R+Br )1~

3.3.2. Синтез мономеров INpgR

3.3.3. Синтез ITpsR+H3 ITpgCN Et реакцией переалкилирования

3.3.4. Синтез 5'Р5-аналогов (ХХШ) и (XXIV)

3.4. Методики кинетических измерений.

3.5. Реакция циклизации мономеров INpsR+

Выводы.

Быстрое развитие исследований в области молекулярной биологии и генной инженерии стимулирует не только разработку новых методов синтеза олигонуклеотидов[1,2], но и их разнообразных аналогов [3-5]. Интерес к таким соединениям обусловлен наличием у них специфических физико-химических и биологичест-ких свойств, отсутствующих у природных НК. Основными областями применения таких соединений являются физико-химические исследования, направленные на изучение структуры и функций НК [31, а также исследования, связанные с изучением молекулярных механизмов действия и субстратной специфичности ферментов метаболизма НК [4,5]. Некоторые аналоги НК проявляют противовирусную активность [6,7].

Одними из наиболее перспективных соединений этого типа являются 5^-фосфотиоэфирные аналоги НК, содержащие неприродные Р-$-0(5*)-межнуклеотидные связи Ш-Ю]. Замена 0(5)-атомов на атомы серы приводит к некоторому удлинению межнуклеотид-ной связи в таких производных НК, изменению ее геометрии [II], [12] и появлению новых свойств. Так, они проявляют большую устойчивость к ферментативному гидролизу по сравнению с природными прототипами [10,13], но легко расщепляются окислителями [14]. Вторичная структура таких аналогов похожа на структуру Ж, они образуют комплементарные комплексы с полинуклеоти-дами[9,141. Рассматриваемые аналоги являются субстратами ряда ферментов метаболизма НК, таких,как ДНК-полимераза IE.coli [15], полинуклеотидлигаза и полинуклеотидкиназа фага Т4 СЕ6], а также различных нуклеаз [10,13]. Дальнейший прогресс в этой исследований области связан с расширешешфизико-химических и субстратных свойств таких производных НК с целью выявления перспектив их практического применения. Для обеспечения таких исследований разнообразными по длине и составу 5'Р$-аналогами НК необходим эффективный и быстрый метод их синтеза. Известные методы не обеспечивали решение этой задачи.Они немногочисленны [9,10,17], однотипны и основаны на использовании высокой нуклеофильности тиофосфата[18] и его производных. Ключевой стадией в этих способах является реакция алкилирования Ps -компонента( на первой стадии Nps ) 5-активированными нуклеотидными мономерами, например, 5^-0-тозил-[9]или 5Цдезокси-5-иоднуклеозид-3^0-(5 --Р-цианэтил) тиофосфатами [19,20] в ДИФА или смесях его с водой. Ранее нами было показано, что наибольшая скорость реакции алкилирования достигается при применении Li^-солей Nps и иод-мономеров lNp$CNEt[20-22]. Но скорость реакции и в этом случае была невысокой, уменьшаясь значительно к тому же на конечных стадиях синтеза при увеличении длины и отрицательного заряда Ps -компонента. Нацример, длительность реакции алкилирования на первой стадии синтеза 5PS-аналога нонатимидилата составляла 1ч , а на восьмой - 20ч. Увеличение длины Р5-компонента сопровождается резкш ухудрекием растворимости его Li^-солей в да$А, вследствие чего реакция большую часть времени протекает в гетерофазном режиме, что также приводит к значительному уменьшению ее скорости121]. Перечисленные недостатки ограничивают сферу применения метода [21] , наиболее эффективного . из известных, синтезом сравнительно коротких 5'РБ-аналогов НК.

Таким образом, разработка усовершенствованного метода синтеза З^-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, отличающегося от известных способов большей скоростью и эффективностью, являлась весьма актуальной задачей. Ее решение затруднялось практически полным отсутствием данных о механизме реакции алкилирования, лежащей в его основе.

Основными вопросами, решению которых посвящена данная работа, являются следующие. Во-первых, проведено систематическое исследование кинетики реакции алкилирования на примере взаимодействия Tps с иодпроизводными lTpsCN Et и IT в ]Щк с целью выяснения ее механизма и поиска путей увеличения ее скорости. Во-вторых, определена зависимость реакционной способности иодпроизводных в данной реакции от их строения, в частности, от их заряда, a -компонента - от типа соли. На основе найденных закономерностей выбрана структура иодмономеров и тип соли Ps-компонента, обеспечивающие повышение скорости реакции алкилирования, и разработан метод синтеза таких моно-ров. В-третьих, проведено исследование кинетики реакции полученных мономеров с Tps в ДМФА.

В результате решения указанных задач разработан усовершенствованный метод синтеза 5 Ps-аналогов олигодезоксирибо-нуклеотидов, ключевой стадией которого является реакция алкилирования Вьц/\/+-солей Np^ новыми мономерами - 2',5-дщдезок-си-5-иоднуклеозид-3-0-^ -P-[lV -(п-диэтилметиламино) фенил]кар-бамоилэтил]тиофосфатами, представляющими собой электронейтральные внутренние соли, в безводном ДМФА. Средние затраты времени на проведение одной стадии синтеза снижены в 10 раз, в том числе на проведение реакции алкилирования - в 100 раз,по сравнению с известным методом [21]. Достигнута независимость скорости реакции алкилирования от длины и заряда Ps -компонента. Эффективность метода продемонстрирована на примере синтеза ^-аналогов гексатимидилата и гексадекадезоксирибонуклеотида. Структура последнего соответствует одному из фрагментов гена гормона человека ангиотензина I. Доступность 5 Pg-аналогов такой длины позволила существенно расширить, исследование их биохимических свойств, в частности, провести изучение их матричных свойств в системе ДНК-полимеразы I E.coli [15].

- 87 -ВЫВОДЫ.

1. Разработан усовершенствованный метод синтеза 5ч)юсфотж>-эфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих нецри-родные Р -S-С(b)-межнуклеотидные связи, ключевой стадией которого является реакция алкилирования Buz,A/+-солей Nps новыми электронейтральными мономерами IWpsR+ в ДОА. Применение таких мономеров и солей Nps приводит к увеличению скорости реакции алкилирования в среднем,на одну стадию синтеза, более чем в 100 раз по сравнению с известным методом и достижению ее независимости от длины и заряда Ps -компонента. Данным методом синтезированы 5-фосфотиоэфирные аналоги гексатимидилата и гексадекадезоксирибо-нуклеотвда с выходом,соответственно, 51,6 и 12%.

2. Изучен механизм образования нецриродной Р -S-С(Й -межнук-леотидной связи реакцией алкилирования на примере взаимодейст- . вия различных солей "Ips с галоидпроизводными RX (RX =ITpsCNEt дт,

BrEt ) в ДОА и 96% водном ДОА при 22°. Показано, что: а)порядок этой реакции по 1ps зависит от типа его соли и концентрации: цри увеличении последней в диапазоне 0,001-0,1 М он уменьшается от I до 0 в случае Li и №а+-солей Tps и не изменяется в случае тетраалкиламмониевых солей Tps , равняясь I; порядок реакции.по галоидцроизводным ИХ не зависит от их концентрации и равен I; б) эффективная константа скорости второго порядка реакции алкилирования зависит от типа соли Tps и заряда RX , а константа скорости первого порядка этой реакции - от концентрации воды в реакционной среде, природы и концентрации добавляемой соли, от рН. Наибольшая скорость данной реакции достигается в случае электронейтральных галоидпроизводных RX , Bu^N^cojie Тр$,при рН 7,5-8 в отсутствии воды и солей; в) наиболее вероятной причиной обнаруженных зависимостей является. образование ионных аосоциатов реагентов с катионами.

3. На основании полученных кинетических данных предложено использовать в качестве мономеров для синтеза 5^-фосфотиоэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов новые соединения - иодпро-изводные нуклеотидов INp$R+ , представляющие, собой электронейтральные внутренние соли, и разработан метод их синтеза.

4. Исследована кинетика реакции алкилирования ВьцМ^-солиТрд новыми мономерами INpsR+b №Ш>к при 22°. Установлено, что: а)кинетика данной реакции подчиняется закону второго порядка; б) константа скорости второго порядка изученной реакции в 40 раз превышает соответствующую константу скорости реакции отрицательно-заряженных мономеров INpsCNEt вследствие нейтрализации, отрицательного заряда, осуществленной в иодпроизводных INpsR* .

1.Шабарова З.А. Методы синтеза фрагментов ДНК.- В кн.: Итоги та-уки и техники, ВИНИТИ АН СССР, сер.молекул, биология, 1980,т. 12, ч.2, 0.6-61

2. Wu R., Bahl С.P., Narang S.A. Synthetic oligodeoxynuclecfa.des for analyses of ША structure and function,- In: Progress in Hucleic Acids Res, and Mol.Biology, 1978, v.21, Academic Press Hew York etc., p. 102-141

3. Шомштейн З.А., Гиллер С.А. Модельные аналоги нуклеиновых кислот.- В кн.: Успехи химии гетероцшслов.Рига, 1976, с.307-322

4. Eckstein Р, Investigation of enzyme mechanisms with nucleosidephosphorothioates.- Angew.Chem.int.edn.,1975,v.14, N 3, p.160166.5*Eckstein P. Phosphorothioate analogues of nucleotides.- Accounts Chem. Res,,1979, v.12, N 1, p.204-210

5. Clercq E. de, Eckstein P., Merigan T.C. Interferon induction through chemical modification of a synthetic polyribonucleotide. Science, 1969, v.165, N 3898, p.1137-1143

6. Eckstein P., Gindl H. Polynucleotides, containing a thiophos-phate backbone,- Eur,J.Biochem., 1970, v.13,N 2, p.558-564

7. Michelson A.M. Polynucleotides.IY.The synthesis of oligonucleotides analogs, substituted in sugar's residue.- J.Chem.Soc., 1962, N 3, p.979-982

8. Nagyvary J.,Chladek S., Roe J# The synthesis of 5'-thioanalogs of polydeoxyribonucleotides.- Biochem.Biophys.Res.Commun. ,1970s v.39, N 5, p.878-882

9. Cook A.P. Nucleoside S-alkyl phosphorothioates.IV.Synthesis of nucleoside phosphorothioate monoesters.- J.Amer.Chem.Soc.,1970, v.92, Ы 1, p.190-195

10. Потапов В.A.,Рыбаков B.H. ,Богачев B.C. ,Ривкин М.Й. Думарев В.

11. П. Репарирующая репликация 5-5-тиофосфатного аналога гексаде-кадезокоирибонуклеотида,катализируемая ДНК-полимеразой I E.coli.-Биоорган. химия,1983, т. 9, Ж7, с. 954-957

12. Рыбаков В.Н., Ривкин М.И. ,Богачев B.C., Кумарев В.П. Сшивка аналогов олигодезоксинуклеотидов с P-S-ССЙ-связями полинук-леотвдлигазой фага Т4.- Биоорган.химия, 1981,т.7, $9, с.1423-1425

13. A.C.9I065KCCCP). Способ получения олигодезокситиотимцдила-тов/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, Л.В.Баранова, В.Ф.Кобзев.-Опубл. в Б.И. ,1982, № 9

14. Пальм В.А. Основы количественной теории органических реакций. -2-е изд.перераб. и доп.- Л:Химия,Ленинградское отд. ,1977,с.335, 94-95

15. A.C.9I0650(CCCP). Производные дезокситионуклеотидов как мономеры для синтеза полидезокситионуклеотвдов и способ их получения/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.

16. Баранова,- Опубл. в Б.И., 1982, В 9

17. Кумарев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова А.вУшофосфатные аналоги нуклеиновых кислот.II. Синтез и свойства б-Б-тиофосфатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов.- Биоорган, химия, 1982, т.8, 16 II, с.1525-1534

18. А.С.899571(СССР). Олигодезокситионуклеотиды, проявляющие матричные свойства в РНК-полимеразной системе E.coli/ В. П.Кума-рев, B.C.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.Баранова, М.И.Ривкин.-Опубл, в Б.И., 1982, Л 3

19. Nemer M.J., Ogilvie К.К. Ribonucleotide analogues having novel intemucleotide linkages.- Tetrahedron lett.,1980, v.21, H 43, p.4149-4152

20. Letsinger R.L., Lunsford W.B. Synthesis of thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates.- J.Amer. Chem.Soc., 1976, v.98, Ж 11, p.3655-3661

21. Корана Г. Новые направления в химии биологически важных эфи-ров фосфорной кислоты.-М. :Мир, 1964, с.ПО-143

22. Letsinger R.L., Muiigall W.S. Phosphoroamidate analogs of oligonucleotides.» J.Org.Chem., 1970, v.35, N 11, p.3800-3803

23. Agarwal K.L., Yamazaki A.,Cashion P.I., Khorana H.G. Chemical synthesis of polynucleotides.- Angew.Chem.int.edn.Engl.,1972, v.11, N 6, p.451-459

24. Eckstein P. Diuridine-3' ,5 '-thiophosphate.- Tetrahedron Lett., 1967, N 36, p.3495-3499

25. Хадсон P. Структура и механизм реакций фосфорорганических соединений,- М.: Мир, 1967, с.146-149

26. Malkieviez А., Smrt J. Synthesis of thymidinephosphorothio-yl(0^ )thymidine via phosphorothioate-0,0,S-triesters.~ Tetrahedron Lett.,1973, N 7, p.491-492

27. Malkievicz A., Smrt J. Oligonucleotidic compounds.XLII. Synthesis of thymidi^hosphorothioylCO^'-O^')thymidinephosphoro-thioylCO^'-O5')thymidine.- Coll.Czech.Chem.Commun.,1973, v.38, H 10, p.2953-2961

28. Malkievicz A., Smrt J.Oligonucleotidic compounds.XLIII.Synthesis of some diribonucleoside phosphates analogues containing the phosphorothioic-0,0-diester bond.- Coll.Czech.Chem.Commun<1973, v.38, N 10, p.2962-2975

29. Burgers P.M.J., Eckstein P. Diastereomers of S'-adenosyl^'-O-uridyl-phosphorothioate: chemical synthesis and enzymatical properties.- Biochemistry, 1979, v.18, N 4, p.592-596

30. Burgers P.M.J., Eckstein P. Synthesis of dinucleosidemono-phosphorothioates via addition of sulphur to phosphite tri-esters.-Tetraheron Lett.,1978, N 40, p.3835-3838

31. Marlier I.P., Bencovic S.I. A highly efficient chemical synthesis of Rp and Sp adenylO'-S'Jadenyl-OjO-phosphorothioate.-Tetrahedron Lett., 1980, v.21, N 12, p.1121-1124

32. Lesnikowski Z.J.,Smrt J., Stec W.J., Zielinski W.B. A new rout to 0,0-dinucleoside esters of phosphorothionic acids.-Bull.Acad.pol.Sci.ser.sci.chim.,1978, v.26, N 9, p.661-663.

33. Uznanski В., Wiewiarowski W., Stec W.J. The chemical synthesis of Rp and Sp diastereomers of thymidyl-(3'-5')thymidyl-0,0-phosphorothioate.- Tetrahedron Lett., 1982, v.23, Iff 41, p.4289-4292

34. Green G.L., Letsinger R.L. Formation of internucleotide 3'-5' phosphoroamidate links by direct coupling of a phosphoryl and amino groups.- Nucl.Acids Res., 1975, v.2, N 7, p.1123-1127

35. Letsinger R.L,, Heavner G.A. Synthesis of phosphoromonoami-date diesters nucleotides via the phosphite-azide coupling method.- Tetrahedron Lett.,1975, U 2, p.147-150

36. Ажаев A.B.,Кочеткова С.В., Озоло A.M., Цилевич Т.А. Синтез

37. З-амино-З-дезоксинуклеозидов и их производных.-В кн.: Новости химии нуклеозидов и нуклеотидов.Рига, I978,c.9-II

38. Соколова Н.И., Киселева Е.Г., Горкун А.Ф., Шабарова З.А. Новый метод синтеза олигодезоксирибонуклеотидов с фосфамид-ной межнуклеотидной связью.- Биоорган.химия, 1984, т. 10,1. I, с.75-78

39. Воробьев О.Е., Соколова Н.И., Мельникова В.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Динуклеозидфосфо-(Рм-»н)-аминокислоты.- Докл. АН СССР, 1966, т.166, J& I, с.95-98

40. Соколова Н.И., Гурова Г.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Нуклеопептиды. Синтез тимидилил- (3^5) -аденозино (Р N)-амидов. Вестник МГ7, сер.химия, 1969, № 5, с. 104-105

41. Соколова Н.И., Пономаренко И. В., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Обратимая модификация межнуклеотидных фосфатных груш в олигодезоксирибонуклеотидах.- Докл. АН СССР, 1980, т.253, В 6, с.1395-1398

42. Соколова Н.И., 1*урова Г.И., Гатинская А.Г., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Свойства межнуклеотидного-(Рм-*н )-узла в модельных соединениях.- Мол.биология, 1969, t.3,b.6,c.837-845

43. Потапов В.К., Вейко В.П., Шабарова З.А. Блокирование межнуклеотидной фосфатной группы при твердофазном синтезе олиго-дезоксирибонуклеотидов.- Биоорган.химия, 1979, т.5,113,с.468-470

44. Nemer M.J#, Ogilvie К.К. Phosphoramidate analogues of diri-bonucleoside monophosphates.- Tetrahedron Lett., 1980, v.21, N 43, p.4153-4154

45. Letsinger R.L., Schott M.E. Selectivity in binding a phenan-thridium-dinucleotide derivative to homopolynucleotides.- J. Amer.Chem.Soc.,1981, v.103, N 24, p.7394-7396

46. Jones G.H.,Albrecht H.P., Damodaran N.P., MoffattJ.G. Synthesis of isosteric phosphonate analogs of some biologically important phosphodiesters.- J.Amer.Chem.Soc., 1970, v.92,1. К 18, p.5510-5511

47. Holy A., Guinberger D., Smrt J., Sorm P. Synthesis of a GpUpU analogues containing 5,-deoxyuridine-5,*-phosphonicacid and its effect upon the binding of ^дУа1уд ^ 14c alanyl-tRNA to ribosomes.- Biochim.Biophys.Acta, 1967» v. 138, N 1, p.207-209

48. Rammler D.H., Bagdasarian A., Morris F. Inhibition of mic-rococcal nucleas with 5'-deoxythymidine-5'-phosphonic acid containing oligomers.-Biochemistry,1972,v.11,N 1,p.9-12

49. Rammler D.H., Yengoyan L., Paul A.V., Bax P.S. Nucleoside phosphonic acids,II,The synthesis of 5'-deoxythymidine 5'-phosphonic acid and its pyrophosphate derivatives.- Biochemistry, 1967, v.6, N 6, p.1828-1837

50. Holy A.Synthesis and biological activity of some analogues of nucleic acid components.- Ins Phosphorus chemistry directed towards biology. New York, 1980, p.53-54

51. Agarwal K.L., Riftina P. Synthesis and enzymatic properties of deoxyribooligonucleotides containing methyl and phenyl phosphonate linkages.- Nucl.Acids Res., 1979, v.6, N 9, p. 3009-3024

52. Miller P.S., Yano J., Yano E.,Carrol C., Yagraman K., Ts'o P.O.P. Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside methyl phosphonates.-Biochemistry, 1979, v.18, N 23, p.5134-5143

53. Catlin J.C., Cramer P. Deoxyoligonucleotide synthesis via the triester method.- J#Org.Chem.,1973,v.38,N2,p.245-252

54. Stawinski J., Hozumi Т., Narang S.A.,Bahl C.P., Wu R. Aryl-sulfonyltetrazoles, new coupling reagent and further improv-ments in the triester method for the synthesis of deoxyribooligonucleotides.- Nucl.Acids Res.,1977,v.4,N1,p.353-371

55. Kraszewski A,, Stawinski J., Wiewiorowski M. The case of SUlphonation in the chemical synthesis of oligonycleotides.-Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N 10, p.2301-2305

56. Knorre D.G., Zarytova V.F. Reactive phosphorylating intermediates in nucleic acid chemistry.- In: Phosphorus chemistry directed towards biology. New York, 1980, p.13-31

57. Miller P.S., Dicon N., Pulford M., Mc.Parland K.B. Oligo-thymidilate analogues having stereoregular alternating me-thylphosphonate/ phosphodiester backborn.- J.Biol.Chem., 1980, v.255, N 20, p.9659-9665

58. Miller P.S., Agris C.H., Murakami A., Reddy P.M.,Spits S.A., Ts'o P.O.P. Preparation of oligodeoxyribonucleoside methyl-phosphonates on a polysterene support.- Nucl.Acids Res., 1983, v.11, N 18, p.6225-6242

59. Michelson A.M., Todd A.R. Nucleotides.Part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3':5'-internuc-leotidic linkage.- J.Chem.Soc., 1955* ^ 8, p.2632-2638

60. Letsinger R.L., Mahadevan V. Oligonucleotide synthesis on a polymer support.- J.Amer.Chem.Soc.,1965,v.87,N15,p.3526-3527

61. Eckstein P., Rizk J. Synthese von oligonucleotiden uber phosphorsauretriester.- Angew.Chem.,1967,bd.79,N 1513.684-687

62. Rees C.B., Saffhill R. Oligonucleotide synthesis via phos-photriester intermediates: the phenyl-protecting group.-J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1968, N 13, p.767-768

63. Miller P.S., Pang K.N.,Kondo N.S., Ts'o P.O.P. Synthesis and properties of adenineand thymine nucleosides alkyl phos-photriesters, the neutral analogs of dinucleoside monophosphates.- J.Amer.Chejjt.Soc.,1971 »v.93, H 22, p.6657-6665

64. Miller P.S.,Barrett J.S.,Ts'o P.O.P. Synthesis of oligode-oxyribonucleotide ethyl phosphotriesters and their specific complex formation with transfer Ribonucleic acid.- Biochemistry, 1974,v.13, IT 13, p.4887-4896

65. Smrt J. Protection of the internucleotidic bond after its synthesis. An approach to the synthesis of oligonucleotidic chain».-Tetrahedron Lett. ,1972, IT 33, p.3437-3438

66. Boer de, G., Miller P.S., Ts'o P.O.P. Hydrogen-bonded complexes of adenine and thymine nucleoside alkyl phosphotri-esters in deuteriochloroform.- Biochemistry, 1973, v.12, N 4, p.720-726

67. Петренко В.A., Поздняков П.И., Сиволобова Г.Ф., Шубина Т.Н. Неионные аналога олигонуклеотидов. Синтез триэфирных олиго-нуклеотидов. реакцией переэтерификации.- Биоорган.химия, 1980, т.6, Xt 3, с.431-435.

68. Петренко В.А., Поздняков П.й. Синтез триэфирных аналогов ди^езоксинуклеози^осфатов, содержащих остаток гидроксил-амина.- Биоорган.химия, 1983, т. 9, № 6, с.832-837

69. Абрамова Т.В., Лебедев А.В. Исследования диастереомеров неионных аналогов олигонуклеотидов. Синтез и разделение диастереомеров этиловых эфиров ди- и тетратимидилатов.- Биоорган, химия, 1983, т.9, №6, с.824-831

70. Doub G.W., Tamelen,van,E.E, Synthesis of oligoribonucleo-tides based on facile cleavage of methyl phosphotriester intermediates. -J. Amer. Chem, Soc. ,1977, v, 99,N40, p. 3525-3528

71. Kraus С.A. The ion-pair concept.: its evolution and some application.» J.Phys.Chem., 1956,v.60, N 2, p.129-141

72. Паркер А. Д. Скорости реакции бимолекулярного. замещения в протонных и диполярных апротонных растворителях.- Успехи химии, 1971» т.40, в.12, с.2203-2249

73. HO.Winstein S.,Savedoff L.G.,Smith S., Stevens J.D.R., Gall J.S, Ion pair, nucleophilicity and salt effect in bimolecular nucleophilic substitution.- Tetrahedron Lett. ,.*I960,N9,p.24-3!

74. Evans C.C., Sugden S. Exchange reactions and electrolytic dissociation in non-aqueus solvents.- J.Chem.Soc., 1949, H 2, p.270-273

75. Berg A., Ugelstad J. The effect of the solvent on the reaction of Na+ and K+PhO~ in nucleophilic substitution reactions.Part II.Relative reactivity of Na+ and K+PhO~ in different aprotic solvents.-Acta Chem.Scand.,1965»v.19, N 3, p* 742-750

76. ИБ.Широбоков Й.Ю., Островский В.А., Колдобский Г.И. Тетразолы. 1У.Кинетика реакции алкилирования калиевой, соли 5-фенилтет-разола диметилсульфатом в ацетонитриле,- Ж.Орган.химии, 1979, т.15, вып.4, с.839-844

77. Эмануэль Н.М., Кнорре.Д.Г. Курс химической.кинетики.- 3^-е изд. ,перераб.и доп.-М. :Высшая школа,1974,с. 114,116-117,120

78. П7.Ингольд К. Теоретические основы органической химии.- М.: Мир, 1973, с.372-373, 391-392тто

79. J-xo*Verheyden J.P.H.,Moffatt J.G. Halosugar nucleosides.Iodination of the primary hydroxyl groups of nucleosides with methyl-triphenoxyphosphonium iodide.- J.Org.Chem.,1970,v.35, N 7, p.2319-2326

80. А.С.988824(СССР). Способ получения иодпроизводных дезокси-тионутслеотидов/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.Баранова, Н. С. Кобзева.- Опубл. в Б.И., 1982, № 2

81. Терней А.Современная органическая химия.-М:Мир,1981,т2,с548

82. Микельсон А.Химия нуклеозидов и нуклеотидов.М.:Мир, 1966, с510

83. Jardetzky О., Roberts С.К. NMR in molecular biology.- New York etc.: Academic Press, 1981,p.187

84. Kumarev V.P., Rivkin M.I., Bogochev V.S.,Baranova L.V., Merculov VM.« Rybakov V.N. Molecular cloning of synthetic angio-tensine I gene in E.coli. Rout to phisiologically active hormone. FEBS Lett., 1980,v.114,N 2, p.273-277

85. A.C.925964(СССР).Способ получения полидезоксинуклеотидов/ В.П.Кумарев,B.C.Богачев,Л.В.Баранова,М.И.Ривкин.-Опубл.в Б.И., 1982, № 17

86. Schwarz/mann radiochemical/biochemical catalog, 1977,p.91

87. Tu C.P.D.,JayE.,Bahl C.P.,Wu R. A reliable mapping metbod for sequence determination of oligodeoxyribonucleotides by mobility shift analysis.-Analyt.Biochem., 1976,v.74,N1,p.74-93

88. Jay E.,Bambara R., Padmanabhan R. ,Wu R.DNA sequence analysis: a general,simple and rapid method for sequencing large oli-godeoxyribonucleotide fragments by mapping.- Nucl.Acids Res., 1974, v.1, N 2,p.331-353

89. Вейганд К. ,Хильгетаг Г. Методы эксперимента в органической химии.- М. :Химия, 1968, с.235

90. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований.-М.-Л. :Химия, 1964, с.63

91. ТЗО.Беккер Г.,Бергер В.и др.Органикум.- М. :Мир, 1979,т.2,с.353