Развитие и применение метода ХПЯ для изучения спин-селективных реакций радикалов биологически важных молекул в водных растворах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Кирютин Алексей Сергеевич

РАЗВИТИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХПЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СПИН-СЕЛЕКТИВНЫХ РЕАКЦИЙ РАДИКАЛОВ БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ МОЛЕКУЛ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

□□3471123

003471123

Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Юрковская Александра Вадимовна (Институт «Международный томографический центр» СО РАН)

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Лешина Татьяна Викторовна (Институт химической кинетики и горения СО РАН)

доктор химических наук, профессор Талзи Евгений Павлович (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН)

Ведущая организация Институт химической физики

им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится «17» июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 003.014.001 при Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан «И» мая 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одной из фундаментальных задач химической физики является установление механизма протекания элементарного акта химических реакций для последующего целенаправленного воздействия на химические процессы. С этой целью изучаются свойства активных короткоживущих промежуточных частиц биологически важных молекул - аминокислот и нуклеотидов. Метод химической поляризации ядер (ХПЯ) позволяет исследовать процессы формирования и распада неравновесных ядеряо-сгошовых состояний продуктов спин-коррелированных радикальных реакций по спектрам ЯМР. Актуальным является развитие и применение высокочувствительных импульсных методов магниторезонансной спектроскопии, основанных на явлении ХПЯ, что начали делать относительно недавно и всего в нескольких лабораториях мира. Импульсный метод ХПЯ позволяет разделить вклад от геминальных процессов и провести количественный кинетический анализ радикальных реакций на микросекундной временной шкале. Установленная в работе линейная зависимость между сигналами в геминальных спектрах ХПЯ и константами СТВ открывает путь для определения структуры очень короткоживущих радикалов, регистрация которых традиционными методами ЭПР затруднена вследствие их низкой стационарной концентрации. Получение кинетической информации о протекании реакции восстановления радикалов нуклеотидов аминокислотами в широком диапазоне значений рН как модельной реакции для «химического» пути быстрой и эффективной репарации нуклеиновых кислот, защищающей их от повреждений, является актуальным.

Обычно для получения данных о подвижности частиц используют зависимость ядерной релаксации от напряженности магнитного поля. При интерпретации не рассматривается спин-спиновое взаимодействие, потому что данные получают при низком спектральном разрешении, что является существенным недостатком. Развитие метода быстрого переключения поля с высоким спектральным разрешением при регистрации позволяет выявить влияние скалярного спин-спинового взаимодействия на релаксацию и ХПЯ в слабых магнитных полях.

Целями диссертационной работы являются:

1. Установление линейной зависимости между интенсивностями сигналов в геминальных спектрах ХПЯ и константами сверхтонкого взаимодействия в радикалах с большим числом магнитных ядер.

2. Применение метода ХПЯ для определения относительных констант СТВ с ядрами 'Н и 13С в короткоживущих катион-радикалах триптофана и с ядрами аденозин-5'-монофосфата.

3. Исследование реакции переноса электрона с аминокислот (триптофан, тирозин, метионин и гистидин) на радикалы гаунозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений рН и определение констант скоростей этой реакции.

4. Изучение влияния скалярных спин-спиновых взаимодействий на зависимость ядерной Ti-релаксации от напряженности магнитного поля и когерентный перенос ХПЯ.

Методы исследования. Все экспериментальные данные получены методом ядерного магнитного резонанса при времяразрешенной регистрации сигналов продуктов фотохимических реакций, инициированных импульсным лазерным излучением.

Научная новизна работы. Впервые создана установка ХПЯ с временным разрешением на базе ЯМР спектрометра с магнитным полем 14.1 Тл для регистрации сигналов ЯМР 'Н, |3С и i5N. При использовании новой установки была установлена линейная зависимость сигналов геминальной ХПЯ от констант СТВ в многоспиновых радикальных парах и впервые зарегистрированы геминальные спектры ХПЯ ПС и 1SN. В работе впервые определены знаки и относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия для 13С в короткоживущих катион-радикалах триптофана и 15N для катион-радикалов нуклеотида AMP. Методом ХПЯ с временным разрешением была изучена реакция восстановления радикалов GMP аминокислотами в водных растворах и получены константы скорости этих реакций для четырех различных радикалов GMP при pH от 1.3 до 13.3. Впервые продемонстрировано влияние скалярного спин-спинового взаимодействия на зависимость ядерной релаксации от напряженности внешнего магнитного поля и выявлен когерентный перенос ядерной поляризации между скалярно-связанными ядрами на примере аденозин-5'-монофосфата.

Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для дальнейших фундаментальных исследований в области спиновой химии в институтах МТЦ СО РАН, ИХКГ СО РАН, Московском государственном университете, Новосибирском государственном университете, Институте химической физики им. H.H. Семенова РАН, Казанском физико-техническом институте им. Е.К. Завойского РАН и в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Автор защищает:

1. Пропорциональную зависимость интенсивностей геминальной ХПЯ от констант СТВ в радикалах с большим числом магнитных ядер, в которых ширина спектра ЭПР намного больше, чем константа СТВ любого из ядер.

2. Кинетику ХПЯ в трехкомпонентной системе, содержащей 2,2'-дипиридил, гуанозин-5'-монофосфат и аминокислоту (триптофан или тирозин) в водных растворах при значениях pH от 1.3 до 13.3.

3. Влияние спин-спиновых взаимодействий на полевую зависимость ХПЯ и дисперсию Ti-релаксации.

Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований, в постановке задач диссертационной работы, обсуждении результатов, формулировке выводов н подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Основная часть экспериментальных исследований выполнена лично автором. Часть экспериментов проведена совместно с к.х.н. с.н.с. Морозовой О.Б. при непосредственном участии автора.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, апрель 2003 г.), 69-70th Annual Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) (Берлин, Дрезден, Германия, 04-09 марта 2005 г., 27-31 марта 2006 г.), International Symposium on Modern Problems of Chemical Physics (Казань, Россия, 31 октября - 04 ноября 2006 г.), Modem Development of Magnetic Resonance (Казань, Россия, 24-29 сентября 2007 г.), 10th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena (Венеция, Италия, 18-21 июня 2007 г.), 11th Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Methods for biomolecular magnetic resonance" (Валамброса (Флоренция), Италия, 3-8 июня 2007 г.), The 5th Conference on Field Cycling NMR Relaxometry (Турин, Италия, 30 мая - 3 июня 2007 г.), 6th Asia Pacific EPR/ESR Symposium (Каирнс, Австралия, 13-18 июля 2008 г.), Central European Conference on Photochemistry (Бад Хофгастайн, Австрия, 10-14 февраля 2008 г.), 49th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference (Асиломар, Калифорния, США, 9-14 Марта 2008 г.), Современные проблемы химической физики (Ереван, Армения, 21-24 октября 2008 г.)

Публикации. Материалы диссертации изложены в 5 статьях, а также в 15 тезисах международных и российских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 169 наименований, и приложения. Работа изложена на 160 страницах, содержит 84 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературы. В первом разделе обсуждается роль радикалов триптофана в процессах, протекающих в биологических системах. Особое внимание уделено проблеме детектирования радикалов триптофана. Второй раздел посвящен недавно обнаруженной неэнзиматической репарации ДНК и нуклеотидов по так называемому «химическому пути» восстановительной репарации ДНК, который эффективно конкурирует с относительно медленными ферментативными процессами для защиты генетической информации. В третьем и четвертом разделе описываются основы метода химической поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением. Подробно описано формирование неравновесной химической поляризации ядер по радикально-парному механизму. Приведены примеры кинетических зависимостей ХПЯ при различных параметрах. Показано, как проявляются эффекты ХПЯ в спектрах ЯМР и от чего зависит знак поляризации. В пятом разделе представлен обзор фотохимических реакций с участием дипиридила, триптофана, тирозина и гуанозик-5'-монофосфата. Рассмотрены известные на сегодняшний день фотохимические свойства перечисленных реагентов. Представлены результаты проведенных ранее кинетических экспериментов ХПЯ с участием триптофана, тирозина и гуанозин-5'-монофосфата. Рассмотрено влияние реакции внутримолекулярного переноса электрона на кинетику ХПЯ в дипептиде триптофан-тирозин.

Во второй главе описаны принципы работы и характеристики установок, на которых были проведены эксперименты ХПЯ и эксперименты по изучению Т^релаксации. Особое внимание уделено созданной автором работы установки ХПЯ с временным разрешением 1 мкс на базе ЯМР-спектрометра (Во = 14.1 Тл, Сн = 600 МГц). Данная установка позволяет регистрировать спектры ХПЯ на ядрах 'Н, 13С, "И с высоким спектральным и временным разрешением. Описана установка с быстрым переключением магнитного поля, позволяющая изучать эффекты ХПЯ и ядерную Тгрелаксацию в зависимости от магнитного поля в широком диапазоне от 0.1 мТл до 7 Тл.

В третьей главе рассмотрена теоретическая модель, объясняющая линейную зависимость геминальной ХПЯ от констант СТВ. Показано, что для многоспиновых радикальных пар интенсивность ХПЯ (Р,) пропорциональна константам СТВ (я,). Это соотношение выполняется в том случае, когда ширина спектра ЭПР или эффективная константа СТВ всей радикальной пары намного больше, чем константа СТВ на любом отдельно взятом ядре. Использование квантово-механического расчета ХПЯ по модели

Адриана в сильном магнитном поле показало, что увеличение числа ядер в радикальной паре приводит к пропорциональности интенсивности ХПЯ от констант СТВ (рис. 1).

Константы СТВ. Гс Константы СТВ, Гс

Константы СТВ. Гс Константы СТВ, Гс

Рисунок 1. Зависимость расчетной интенсивности ХПЯ от констант СТВ при AgB ~ 5 Гс, А|11ЫХ = 10 Гс а) N = 3, б) N = 4, в) N = 6, г) N = 10.

Ограничения на использование пропорциональности Pl = Са, с целью определения неизвестных констант СТВ из геминальных спектров ХПЯ получены на основании теоретического моделирования.

• Магнитное поле должно быть В0 >4.7 Тла

• Разность g-факторов радикалов Ag Й0.ООО26

• Максимальное значение константы СТВ Ашах £15 Гс

• Общее число магнитных ядер в радикальной паре N Ы2

При соблюдении всех условий, точность определения констант СТВ составит менее 0.5 Гс, а коэффициент определения R2 >0.99.

Примечания: * Выбор такого значения магнитного поля связан с существующими установками для измерения ХПЯ, большая часть которых построена на базе спектрометров с магнитным полем выше или равным 4.7 Тл (1>н=200 МГц). 6 Наблюдения, полученные в ходе данной работы показывают, что вероятность встречи радикальной пары со значением Ag < 0.0002 крайне низкая.

Данное соотношение пропорциональности экспериментально проверено на модельных системах с известными константами СТВ. В качестве модельной системы была выбрана радикальная пара тирозина с 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном. Тушение триплетной молекулы тетракарбоксибензофенона (ТСВР) тирозином (ТугОН) при рН = 8.1 приводит к

образованию спин-коррелированной радикальной пары {ТугО'+ТСВР"} в триплетном состоянии. Последующая рекомбинация синглетной пары дает поляризованные диамагнитные продукты ТугОН и ТСВР. На рисунке 2 (а) представлены эффекты ХПЯ для ТугОН и ТСВР, зарегистрированные после рекомбинации геминальной радикальной пары. Значительные эффекты ХПЯ наблюдались для р-СНг протонов, ароматических протонов Н2, НЗ, Н5, Нб в тирозине и для протонов Н2, Н2', Н5, Н5', Н6, Н6' в ТСВР. Из спектра ХПЯ были получены интенсивности сигналов всех протонов (табл. 1).

На рисунке 2 (б) показана зависимость интенсивности ХПЯ от констант СТВ для данных радикалов. Поскольку знак ХПЯ меняется при изменении знака Д?, то данные ХПЯ для ТСВР были помножены на -1. Это дает возможность одновременно проверить линейность для ТугОН и ТСВР. Зависимость практически идеально описывается соотношением Р, = Са, . Рассчитанная по методу наименьших квадратов прямая линия, показанная на рисунке 2 (б), соответствует экспериментальным данным с коэффициентом корреляции 0.955.

протоны ту!

протоны тс в Р

• у/ о/

А / 0 (б)

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0,6 0.8

йэнстанты СТВ (ЭПР), мТл

10 7.1 7.1 7.1 1.1 7.0 C.I G.S 3.2 3.0 2.1 1 С

Химический сдвиг, м.д.

Рисунок 2.

(а) Спектр 'Н ХПЯ для ТугОН (5 нМ) и ТСВР (0.1 мМ) прирН = 8.1 (200 МГц). Число накоплений: 128, 7=0, длительность РЧ-импульса 3 мкс, что соответствует я/4-импульсу.

(б) Зависимость интенсивности !Н ХПЯ для протонов ТугОН и ТСВР от констант СТВ. Результаты вычисления для протонов ТугОН и ТСРВ показаны черными и белыми символами соответственно. Прямая линия - наилучший расчет по функциям Л = Ca¡ и = - Cb:

Таблица 1. Интенсивности ХПЯ протонов ТСВР и ТгрН, константы СТВ радикалов соответствующих

Ядро (молекула) Интегралы ХПЯ, отн. ед.* Константы СТВ, мТл (ХПЯ)" Константы СТВ, мТл (ЭПР)

Н2 (ТСВР) 28.2±0.5 -0.183±0.003 -0.253

Н6 (ТСВР) 38.7±1 -0.251±0.006 -0.265

Н5 (ТСВР) -12.5±1 0.081±0.006 0.0897

Н2,6 (ТугОН) 20.7±1 0.134±0.006 0.15

Н3,5 (ТутОН) -100±1 -0.649±0.006 -0.615

/3,-СН2(ТуЮН) 71.3±2 0.770±0.026" 0.77

ЗгСН, (ТугОН) 47.3±2

Примечание." Значения нормированы на -100 для Н3,5. 6 Значения констант СТВ получены делением интегралов ХПЯ на -154 (Н2(ТСВР); Нб(ТСВР); Н5(ТСВР)), 154 (Н2,6(ТугОН); НЗ,5(ТутОН)) и на 77 (0,-СН2; Д-СН2) для перевода в единицы мТл и учета числа эквивалентных ядер.11 Для двух бета-протонов использовалось среднее арифметическое значение.

Аналогичные эксперименты ХПЯ были проведены с тирозином, обогащенным изотопами 15К и 13С. Впервые был получен геминальный "С ХПЯ-спектр полностью обогащенного тирозина. Оказалось, что как и в случае протонов, интенсивности сигналов ХПЯ для каждого углерода пропорциональны соответствующим константам СТВ в радикале тирозина ТугО".

Полученные экспериментальные результаты подтверждают теоретические предсказания, что открывает возможность определения констант СТВ для короткоживущих радикалов с помощью интегрирования сигналов в геминальном спектре ХПЯ. Таким образом, ХПЯ с временным разрешением - высокочувствительный инструмент для количественного анализа распределения спиновой плотности в короткоживущих радикалах, для которых зачастую невозможно получить данные методом ЭПР.

Катион-радикал триптофана ТгрН'+ образуется в реакции переноса электрона с аминокислоты на триплетный краситель ТР аналогично реакции с тирозином. В качестве красителя использовали фламинмононуклеотид (РМ1Ч) и 2,2'-дипиридил (Бр). Формирование ядерной поляризации происходит в ходе синглет-триплетной эволюции с последующей рекомбинацией синглетной радикальной пары [ТгрН О'"]:

ТгрН + Ъ т[ТгрН'+.. .04 <-. 5[ТгрН'+.. .0'"] - ТгрН + О Обнаруженная геминальная ХПЯ отражает магнитные свойства катион-радикала ТгрН'+, а не его депротонированную форму радикала Тгр", в котором отсутствует протон в положении N1. Депротонирование ТгрН'+ (рКа —4.3) при рН = 7-Н) должно проходить за более долгий период по сравнению со временем жизни этого радикала в геминальной паре, которое в СО С8 СЭ С2 С6 С5 С4 С7 СЗ Са Ср

V т

Jju_ и JL

176 174

|—|—I |—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I

136128 126 124 122 120 118

1—I—'

112

■—|—.—г |—I—'—Г Г~

108 106 56 5428

26

8, ррт

(С = ЗмМ) с FMN (С = 0.3 мМ) в DjO при pH = 9.0. Во время накопления сигнала пС включалось широкополосное подавление сигналов протонов. Энергия лазера на выходе 100 мДж; длительность регистрирующего импульса 4 мкс; угол поворота 90°; 512 накоплений. Внизу — моделированный спектр 13С ХПЯ, полученный при использовании параметров из таблицы 2.

низковязких растворах составляет около 10 не. На рисунке 3 приведены экспериментально полученный геминальный 13С спектр ЯМР Ь-триптофана в Б^О, обогащенного изотопами 13С и 15>4, с широкополосным подавлением протонного резонанса ['Н] и расчетный спектр ХПЯ. В силу низкого природного содержания ,3С (1.1%) сигналы ХПЯ от ИМЫ отсутствуют.

Таблица 2. |3С константьг СТВ для катион-радикала триптофана.

Углерод Интегралы Константы СТВ, мТл Константы СТВ, мТл Константы СТВ, мТл

ХПЯ* (ХПЯ)6 (DFT, в вакууме) (DFT, в воде)

С2 19±4 -0.28i0.06 -0.280 -0.227

СЗ -100±5 1.45±0.07 0.629 1.254

С4 -41±4 0.59±0.06 0.475 0.619

С5 24±4 -0.35±0.06 -0.233 -0.499

С6 -27±4 0.39*0.06 0.032 0.443

С7 11±4 -0.1б±0.06 0.290 -0.182

С8 -7±4 0.10±0.0б -0.359 0.092

С9 43±5 -0.62±0.07 -0.545 -0.891

Са -45±4 0.65±0.06 0.008 0.025

CP 28±4 -0.41±0.0б -0.357 -0.512

СО 0±3 0±0.04 0.027 -0.045

Примечание. " Значения нормированы на -100 дня СЗ. 5 Значения констант СТВ получены делением интегралов ХПЯ на -69 для перевода в единицы мТл.

Используя соотношение пропорциональности между интенсивностями ХПЯ и константами СТВ, были определены относительные константы 13С СТВ короткоживущего катион-радикала триптофана. При сравнении их с DFT-расчетами были получены значения констант СТВ, приведенные в таблице 2. По-видимому, это первая экспериментальная характеристика магнитных свойств свободного катион-радикала триптофана на момент написания диссертационной работы (вне стабилизирующей среды белка). Отсутствие в литературе до 2008 года данных об ЭПР-спектрах свободного катион-радикала триптофана ТгрН'+ (или его нейтральной формы Тгр') может объясняться многими факторами, приводящие к уширению спектра и ослаблению сигнала.

Удостоверившись в высокой точности простого соотношения пропорциональности между ХПЯ и константами СТВ, мы применили метод ХПЯ для характеризации распределения спиновой плотности в радикале нуклеотида AMP. В этом радикале имеется только два поляризуемых протона (Н2 и Н8), в то время как спиновая плотность в основном распределена между ядрами азота. Следовательно, необходимо измерить константы СТВ для азота. Поскольку основной изотоп азота 14N является квадрупольным ядром, то для характеризации распределения спиновой плотности в радикале мы использовали обогащенный изотопом 15N по всем положениях AMP. Насколько нам известно, это первые результаты по ХПЯ с временным разрешением, полученные для ядер ,5N. До настоящего времени 1SN ХПЯ изучалась только в стационарном варианте метода.

Реакция между AMP и фотовозбужденным 2-метилнафтохиноном (MeNQ), в водном растворе приводит к формированию триплетной радикальной пары {AMP" + MeNQ"} . В результате обратного переноса электрона образуются поляризованные молекулы AMP и MeNQ. «Темновой» спектр и спектр ХПЯ 1SN для AMP показаны на рисунке 4. Полученные химические сдвиги соответствуют ранее опубликованным. Можно сделать вывод, что только три ядра азота имеют значительную спиновую плотность, а именно: N1, N3 и N10, для которых из спектра ХПЯ (рис. 4) было получено следующее соотношение интенсивностей поляризации: ^>Ni:i>N3:i>Nio=0.25:l:2.07. В радикале AMP, помимо грех ядер азота, имеются протоны и атомы дейтерия, поэтому число магнитных ядер достаточно велико для того, чтобы обеспечить пропорциональность между ХПЯ и СТВ. В результате получаем следующее соотношение для констант СТВ l5N: ят:яю:ашо=0.12:0.48:1.00.

N7

N1

N3

N9

Пг

N

Э

AMP

A'

н

/ н

V-

■/г

235 230 225 220 1 75 1 70 85

Химический сдвиг, ррт

N10

80

I

75

Рисунок 4. N-ЯМР спектр (вверху) и спектр N-ХПЯ (внизу) для полностью изотопно-обогащенного AMP (С = 3.6 мМ) с 2-метилнафтохиноном при рН = 7.9 (60.8 МГц). Число накоплений: 39000 (ЯМР), 8400 (ХПЯ); т=0; длительность РЧ-импульса 30 мкс, что соответствует я/2-импульсу.

В четвертой главе приведены результаты изучения реакции переноса электрона с триптофана и тирозина на радикалы гуанозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений. С целью изучения механизма химической репарации ДНК (РНК) была выбрана модельная система, состоящая из трех компонентов: пуриновое основание (гуанозин-5'-монофосфат), аминокислота (^ацетил-производная тирозина или триптофана) в качестве восстанавливающего агента для радикала гуанозина и краситель (2,2'-дипиридил) для инициирования фотохимической реакции. Измерения кинетики ХПЯ проводились в ходе

обратимой фотореакции, сопровождаемой последовательным окислением и восстановлением основания РНК - ОМР. Целью исследования было выявить влияние рН на механизм радикального восстановления, определить структуру образующихся интермедиатов и получить детальную информацию об их реакционной способности в диапазоне значений рН от 1.3 до 13.3.

На рисунке 5 показан ароматический участок спектров ХПЯ, полученных в фотореакциях ЭР с ИИР, РР с Туг и ИР с обоими реагентами. Вертикальная шкала для спектров подобрана таким образом, чтобы верхняя левая пара спектров имела одинаковую интенсивность сигнала Н8 йМР, а правая - сигнала Н3,5 Туг. Спектры, полученные при задержках 0 и 100 мкс, имеют одинаковую вертикальную шкалу.

-1---1-'-1-г- -'-1-'-1-'-—1-г- -'-1-'-1-1-1—

8.0 7.5 7.0 8.0 7.5 7.0 8.0 7.5 7.0

8, М.Д. 5, М.Д. 6, М.Д.

Рисунок 5. Ароматический участок спектров ХПЯ 'Н стот, полученных в фотореакциях 2,2 -дипиридила с гуанозин-5 -монофосфатом (С = 23 мМ) (слева), ЬГ-ацетилтирозина (С = 35 мМ) (справа) и со смесью гуанозин-5'-монофосфата (С = 20 мМ) и ^-ацетилтирозина (С = 10 мМ) (в середине); рН = 7.5. Верхние спектры получены сразу после лазерного импульса, нижние - через 100 мкс после лазерного импульса.

Сигналы в спектре ХПЯ наблюдались для протонов, не обменивающихся с водой, и

имеющих ненулевые константы СТВ в промежуточных радикалах. Знаки сигналов ХПЯ

соответствуют правилам Каптейна. В данном случае наблюдалась усиленная абсорбция для

Н3,4 и Н5 дипиридила, Н2,6 тирозина и эмиссия Н8 гуанозина и Н3,5 тирозина (усиленная

абсорбция также обнаружена для непоказанных р-СН2 протонов тирозина). При других значениях рН наблюдались качественно те же спектры ХПЯ, что и в нейтральном растворе. Различие состояло в рН-зависимых химических сдвигах протонов диамагнитных молекул, но для радикальной стадии реакции это не принципиально.

В нейтральном растворе механизм тушения триплетного ВР тирозином и гуанозином, представляет собой перенос атома водорода. В результате формируются нейтральные радикалы БРН\ ТугО" н О(-Н)". Кинетические зависимости ХПЯ, полученные для бинарных растворов БР/вМР и ОР/Тут, показаны на рисунках 6 и 7 (символы • и О соответственно). В обоих случаях вначале наблюдается рост поляризации, сформированной в бимолекулярных реакциях в объеме, а затем спад до стационарного значения, зависящего от времени релаксации ядер в радикалах. Вырожденный электронный обмен в этих условиях неэффективен ни для тирозина, ни для гуанозина в соответствующих парах ТугО'/ТугОН и С(-Н)'Ю, а вырожденный перенос атома водорода слишком медленный и не конкурирует с бимолекулярной гибелью радикалов.

В трехкомпонентной смеси кинетика ХПЯ как тирозина, так и вМР зависит от эффективности реакции переноса электрона и от начального соотношения концентраций реагентов. Реакция переноса электрона С(-Н)' +ТугОН й(-Н) + ТугОН' происходит независимо от спинового состояния реагентов и переводит радикал вМР в диамагнитное состояние. Поскольку поляризация вышедших из клетки радикалов противоположна по знаку геминалыюй, реакция переноса электрона приводит к компенсации ХПЯ для вМР. Это проявляется в виде спада кинетики ХПЯ, скорость которого возрастает с увеличением концентрации донора электрона (тирозина). Для тирозина реакция переноса электрона служит дополнительным источником неполяризованных радикалов, которые приобретают ядерную поляризацию в бимолекулярной реакции гибели с радикалами ЭР. В связи с этим стационарное значение ХПЯ по отношению к геминалыюй поляризации для тирозина выше в присутствии ОМР.

Увеличение концентрации тирозина ускоряет спад кинетики ХПЯ для гуанозина. В данных экспериментальных условиях этот спад может быть описан как псевдомономолекулярный. Для тирозина изменение величины ХПЯ по отношению к начальному значению определяется не только скоростью реакции переноса электрона, но и начальным соотношением радикалов тирозина и гуанозина, возникших в результате реакции тушения. Чем больше начальная доля радикалов ОМР, тем более высокая концентрация радикалов тирозина может быть получена в результате реакции переноса электрона. В предельном случае, если бы начальная концентрация радикалов тирозина была нулевой и источником радикалов тирозина была бы только реакция переноса электрона, то наблюдался

бы рост ХПЯ тирозина от нуля до некоторого стационарного значения. Набор кинетических данных для рН = 7.5 был получен при различных концентрациях йМР и тирозина. Масштаб вертикальной шкалы кинетики ХПЯ тирозина выбран следующим образом: первая экспериментальная точка кинетики с самой низкой концентрацией тирозина принята за единицу. Видно, что, несмотря на более чем пятикратное различие начальных значений ХПЯ, стационарные значения отличаются менее чем в два раза.

Рисунок 6. Кинетика ХПЯ протона Н8 гуанозин-5'- Рисунок 7. Кинетика ХПЯ протонов Н3,5 Ы-монофосфата, полученная при рН = 7.5: 17 мМ бМР ацетилтирозина, полученная при рН = 7.5: 35 мМ Туг (•); 22 мМ йМР с 2.5 мМ Туг (*); 20 мМ вМР с 10 (°>: 17 мМ 0МР с 20 мМ ^ (■)> 20 мМ смр с 10 мМ Туг (Д). Сплошные линии - результаты мМ Туг (Л), 21 мМ СМР с 5 мМ Туг (♦), 22 мМ ОМР численного моделирования. с 2 5 мМ ТУ1 (*)• Сплошные линии - результаты

численного моделирования.

Моделирование экспериментальных кинетических зависимостей системой дифференциальных уравнений позволило определить константу скорость реакции переноса электрона с тирозина на радикал гаунозин-5'-монофосфата. В данном случае при рН = 7.5 значение составило ке = 6.0±107 М"'с"'.

Аналогичные измерения были проведены при других значения рН и с другой аминокислотой - триптофаном. Обобщенные результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.

Таким образом, в качестве модели химической репарации ДНК путем быстрого заполнения электронной вакансии основания нуклеиновой кислоты из протеинового окружения была выбрана реакционная система, включающая фотохимическое окисление основания РНК гуанозина-5'-монофосфата в присутствии ароматической аминокислоты (тирозина или триптофана). Преимуществом используемого при этом метода химической

Таблица 3. Данные о частицах, участвующих в реакции переноса электрона между радикалами гуанозин-5'-

рН Радикал гуанозина Тирозин К, м-'с1 рН Радикал гуанозина Триптофан ки М-'с'1

1.3 СН^' (7.1+3.0)х108 1.3 (1.0±0.3)х109

2.9 СГ ТугОН 2.9 С+>

7.5 С(-Н)' (6.0±1.0)х107 7.5 С(-Н)' ТгрН (2.6±0.4)х108

11.3 ТугО" (1.6±0.4)хЮ8 11.0

13.3 С(-2НГ <6x106 13.3 0(-2Н)" (1.2+0.3)х107

полярпзации ядер с временным разреше1шем состоит в возможности разделения вкладов от геминальных радикальных пар и радикальных пар в объеме, что позволяет проследить кинетику радикальных превращений. Полученные кинетические данные для реакции переноса электрона между радикалами СМР, образованными фотохимически, и аминокислотами имели сильную зависимость от степени протонирования реагентов. Детальное кинетическое изучение четырех форм радикальных интермедиатов гуанозина-5'-монофосфата, участвующих в реакции восстановления путем переноса электрона с аминокислот, оказалось возможным благодаря значительному усилению сигналов ЯМР за счет эффектов ХПЯ в реакциях триплетно-возбужденного дипиридила с СМР и аминокислотами. Для обеих аминокислот полученные нами данные показали, что различные формы радикала йМР, а именно: ОН**" (рН = 1.3), (рН = 2.9), С(-Н)' (рН = 7.5, 11.0, 11.3) и С(-2Н)" (рН = 13.3), характеризуются разными окислительными свойствами. Значение константы скорости окислительно-восстановительной реакции составило от (1.0±0.3)х109 М"'сполученной для С1"" или ОН++' с триптофаном, до величины меньше б.ОхЮ6 М"'с"' для реакции восстановления радикала С(-2Н)~" тирозином. Общим свойством изучаемой реакции переноса электрона явилось то, что эффективность этой реакции была выше в кислотной среде; также как и в случае триптофана.

Помимо рассматриваемых аминокислот эффективность восстановительного переноса электрона на радикал гуанозина была проверена для метионина и М-ацетилгистидина, в фотореакциях которых также наблюдаются значительные эффекты ХПЯ. Влияние добавления этих аминокислот на кинетику ХПЯ не обнаружено вплоть до концентрации 40 мМ. Это согласуется с данными по восстановлению радикала гуанозина в ДНК-плазмиде производными метионина, константа скорости которого составила 105 М"'с"1. Восстановление производными гистидина не наблюдалось.

Пятая глава диссертационной работы посвящена изучению влияния скалярных спин-спиновых взаимодействий на динамику ядерной поляризации и дисперсию ^-релаксации в произвольном магнитном поле. В первом разделе пятой главы была изучена зависимость

индивидуальных времен Tj -релаксации протонов AMP и GMP от магнитного поля в широком диапазоне значений напряженности от 0.1 мТл до 7 Тл с шагом 0.1 мТл. В силу того, что AMP и GMP - небольшие молекулы, их молекулярное движение является быстрым во всем диапазоне магнитных полей до 7 Тл. Экспериментально полученная зависимость времен релаксации протонов обусловлена влиянием внутримолекулярного спин-спинового

На рисунке 8 показана дисперсия Тррелаксации ароматических протонов AMP и GMP. Несмотря на то, что в молекуле AMP времена релаксации протонов Н2 и Н8 очень сильно отличаются (примерно в 3 раза), в слабых полях (менее 30 мТл) их намагниченность приходит к равновесию с одинаковыми временами релаксации. Это связано со спин-спиновым взаимодействием между двумя протонами, которое приводит к сильной связи этих протонов в данном диапазоне магнитных полей (<30 мТл). Результаты проведенного численного моделирования этой системы (рис. 8, сплошные линии) хорошо согласуются с переход от релаксации протонов с индивидуальными Ti к релаксации с общим Ti в тех же магнитных полях.

Для молекулы GMP, которая имеет только один ароматический протон Н8, кривая дисперсии Ti-релаксации качественно выглядит по-другому (рис. 8). Значение Ti для протона Н8 молекулы GMP плавно уменьшается в слабых магнитных полях, хотя для молекулы AMP время релаксации соответствующего протона Н8 сначала увеличивается, а затем уменьшается. Такое поведение дисперсии релаксации Н8 молекулы GMP мы объясняем спин-спиновым взаимодействием между протонами Н8 и НГ. Поскольку в этой системе нет ядерных спинов, релаксирующих дольше, чем спин Н8, то его релаксация только укорачивается за счет сильной связи с протонами рибозы в слабых магнитных полях.

Результаты измерений кинетики поляризации ароматических протонов AMP показаны на рисунке 9. В первом случае (а) перед переключением магнитного поля B]r*Bim= 0.1 мТл спиновая система находилась в термодинамическом равновесии в магнитном поле Br = 7 Тл.

Магнитное поле, мТл

Рисунок 8. Дисперсия релаксации ароматических протонов AMP (круги относятся к протону Н2, квадраты - к протону Н8) и GMP (треугольники - к протону Н8). Линиями показаны расчетные зависимости: сплошные линии — модель двухспиновой системы (Н2 и Н8 для AMP, Н8 и НГ для GMP); пунктирные линии - модель трехспиновой системы (Н8, Н2 и НГ). Расчеты выполнялись с учетом полного оператора релаксации.

экспериментальными данными, предсказывая

При нулевой задержке (т = 0) поляризация обоих протонов практически одинаковая (рис. 9 (а)). Во втором случае применялся неселективный радиочастотный импульс длительностью 180°, инвертирующий населенности всех спинов. Затем в этом же поле (BR = 7 Тл) следовала задержка г„, = гГ"21п2 , при которой поляризация протона Н2 обращалась в нуль, а поляризация протона Н8, релаксирующего быстрее, восстанавливалась в абсорбцию. Такая комбинация пмпульса и задержки привела к различным начальным поляризациям протонов Н2 н Н8 при измерении кинетики релаксации (рис. 9 (б)).

а б

12345678910

Время, С

Рисунок 9. Кинетика релаксации поляризации протонов Н2 и Н8 в магнитном поле 0.1 мТл. Первый случай (а) соответствует равновесной спиновой системе в магнитном поле 7 Тл при задержке т = 0 (одинаковые начальные поляризации обоих протонов при нулевой задержке), второй случай (б) - спиновая система в начальный момент времени т = 0 в поле 7 Тл не находилась в термодинамическом равновесии (начальные поляризации на протонах Н2 и Н8 существенно отличались). Сплошные линии показывают экспоненциальную компоненту (верхние графики) и осцилляторную (нижние графики).

В обоих случаях экспериментальные данные описывались экспоненциальной функцией, умноженной на осцилляторную часть: М' = А' ехр(-//7]')(1 + В' ътфпу^ + ф'^ + С' (рис. 9). В первом случае (а) отклонения от экспоненциальной функции очень малы, в то время как в случае (б) они уже значительны. Частота биений соответствует расщеплению состояний двухспиновой системы с /2= 0. Она была рассчитана на основании константы J¡¡2ш и разницы

ларморовских частот прецессии ¿V = | = ^(УЯ2.Н8)2 +(5у)г . В выбранном поле

(5,„,=0.1 мТл) частота составляет v23 ч/далг=0.24 Гц, что меньше, чем разрешение спектров ЯМР в рассматриваемом случае. Осцилляции сигналов протонов Н2 и Н8 имеют противоположную фазу, что свидетельствует о когерентном перераспределении поляризации в процессе Ti-релаксации сильно связанной системы. Несмотря на то, что в момент времени х = О когерентность отсутствует, она образуется позже из-за различия населенностей собственных состояний. В случае (б) в момент времени т = 0 присутствует ненулевая когерентность. Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что релаксация населенностей и когерентностей связана при условии »1.

Второй раздел пятой главы посвящен изучению влияния спин-спинового взаимодействия на ХПЯ. При изучении зависимости ХПЯ пуриновых нуклеотидов от магнитного поля в слабых магнитных полях (В«100 мТл) наблюдалась поляризация протона Н2 молекулы AMP, который не был поляризован в сильном магнитном поле. В сильных магнитных полях все спины поляризуются в соответствии с их константами СТВ в радикальном состоянии. В частности, отсутствие геминальной поляризации на ядре в сильном магнитном поле (в случае AMP это Н2), указывает на малое значение константы СТВ в радикальном состоянии с этим ядром. Вопреки этому утверждению, некоторые спектры ХПЯ для AMP, полученные в слабом магнитном поле (рис. 11, спектр 3), не отражают распределение спиновой плотности в радикалах, что указывает на то, что ядро Н2 поляризуется не напрямую.

Эксперименты по переносу ХПЯ в варьируемом магнитном поле выполнялись на установке в Институте экспериментальной физики Свободного университета Берлина. Измерения проводили согласно диаграмме, показанной на рисунке 10. Образец облучали эксимерным лазером (ХеС1, 308 нм) в течение времени rL (этап 1) с частотами от 1 до 50 Гц и энергией импульса до 150 мДж через гибкий световод. Варьируя задержку Tw в слабом магнитном поле, получали эволюцию неравновесной поляризации во времени. Типичные времена переноса датчика с образцом в поле детектирования (7 Тл) составляли от 300 мс до 1с (этап 3). Регистрацию спектров ЯМР (этап 4) проводили приложением РЧ-импульса и

ч Tw *tr Во

Bpol

/

/ /\л rf

1 2 3 pyVVV«vvvv"'— 4

Время, f-

Рисунок 10. Схема проведения измерений по переносу поляризации.

накоплением спада свободной индукции с последующим Фурье-преобразованием. Спектр ХПЯ получали вычитанием «темпового» спектра ЯМР из спектра ЯМР, полученного при лазерном облучении и при сохранении всех остальных параметров.

В экспериментах первого типа при фиксированном времени облучения 7/. (предполагая, что когерентности не усредняются за достаточно короткое время 7г.) варьировали время ожидания в поле 1 мТл (рис. 11 (а)). При малых значениях т»- интенсивность ХПЯ на протоне Н8 гораздо выше, чем на протоне Н2. Тем не менее, при длительных задержках 7у поляризация на Н2 возрастает, а спустя одну секунду становится даже больше, чем на Н8. Оба значения, " (-0/(Л) > осциллируют около значения (/г)/2 , где (1,) = (1и) + {11г) • в магнитном поле 1 мТл справедливо с^з»5с и частота колебаний =•/• Несмотря на быструю релаксацию, из-за которой биения закончились после 2.5 с, нам удалось определить частоту колебаний (0.24 Гц) и оценить константу спин-спинового взаимодействия между Н2 и Н8 в 0.24 Гц.

1 .о •

"1-'-г-

B.3 8.2

Химический сдвиг, ррт

Рисунок 11, Кинетики переноса ХПЯ между протонами Н2 и Н8 молекулы AMP (а) в зависимости от времени ожидания 7ц/ в поле й^л = 1 мТл при фиксированном времени облучения т, = 0.2 с; (б) в зависимости от времени облучения Ti при фиксированном времени ожидания 7V = 0. Символы соответствуют: (•) поляризации протонов Н8, (о) поляризации протонов Н2. ХПЯ формируется в фотореакциях AMP с Dp-d8. Справа показаны: ЯМР-спектр в магнитном поле 7 Тл (спектр 1), ХПЯ-спектры при = 7 Тл (спектр 2) и при Вр„! = 1 мТл (спектр 3), полученные при TL = 0.2 с, Tw = 0 и г,г = 0.3 с. Интенсивности ХПЯ нормированы на суммарную поляризацию в начальный момент времени.

В экспериментах второго типа было зафиксировано время Ьу = 0 и регистрировали интенсивность ХПЯ на обоих протонах как функцию времени облучения tl (рис. 11 (а)). Для того, чтобы число фотонов при разных значениях и было постоянно, варьировали частоту вспышек лазера. Как и в предыдущем случае, при коротких временах tl поляризация на протоне Н8 значительно больше чем, на Н2. При больших временах облучения поляризация на Н8 спадает, а на Н2 - растет. После двух секунд облучения поляризация на протонах Н8 и Н2 выравнивается, то есть наблюдается полное перераспределение ХПЯ. Время перераспределения согласуется с вышеописанным условием tJ- 1 при J= 0.24 Гц.

Обе экспериментальные зависимости находятся в полном соответствии с теоретическими расчетами. Видно, что при коротких задержках протон Н2 поляризован незначительно, но накапливает поляризацию, перенесенную с протона Н8 при длинных задержках или длинных временах облучения. Наблюдение биений в экспериментах при варьировании Tw позволило сделать вывод, что перенос ХПЯ происходит когерентно за счет сильной связи спинов в слабом магнитном поле. Следует отметить, что для такого малого значения J = 0.24 Гц изменение магнитного поля от 1 мТл до 7 Тл происходит неадиабатически. В проведенных экспериментах не удалось достичь режима адиабатического переключения магнитного поля из-за короткой продольной релаксации протонов Н2 и Н8 в слабом магнитном поле (Tj =€.5 с) (рис. 8).

Приложение содержит экспериментально полученные и моделированные спектры ЯМР ('Н, 13С) высокого разрешения исследуемых соединений (триптофан, тирозин, аденозин-5'-монофоефат, гуанозин-5'-монофосфат). В таблицах приведены значения химических сдвигов и констант спин-спинового взаимодействия, определенных из спектров ЯМР. Эти значения использовались при моделировании спектров ХПЯ (*Н, 13С) и зависимости Ti-релаксации протонов пуриновых нуклеотидов от напряженности магнитного поля.

выводы.

1. Создана установка и отработана методика для регистрации ХПЯ магнитных ядер ('Н, 13С, 15N) с микросекундным временным разрешением на базе ЯМР-спектрометра (Во = 14.1 Тл) и импульсного лазера (Nd:YAG).

2. Установлено, что в многоядерных радикальных парах, для которых ширина спектра ЭПР больше, чем константа СТВ для любого из ядер, интенсивности сигналов в геминальных спектрах ХПЯ в сильном магнитном поле прямо пропорциональны величинам констант СТВ в радикалах.

3. Впервые зарегистрированы геминальные спектры |3С ХПЯ L-триптофана и 15N ХПЯ аденозин-5'-монофосфата, на основании анализа которых определены знаки и относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия в катион-радикалах триптофана и нуклеотида.

4. Изучена реакция переноса электрона с триптофана и тирозина на радикалы гаунозин-5'-монофосфата при рН водных растворов от 1.3 до 13.3. Установлено, что в кислотных растворах перенос электрона протекает значительно быстрее, чем в щелочных растворах. При одинаковых условиях триптофан является более эффективным восстанавливающим агентом, чем тирозин.

5. Изучена релаксационная дисперсия протонов пуриновых нуклеотидов (AMP и GMP) в диапазоне магнитных полей от 0.1 мТл до 7 Тл. Показано, что на зависимость Ti-релаксации от магнитного поля влияет спин-спиновое взаимодействие. Установлено, что следствием сильной связи спинов Н2 и Н8 в молекуле AMP является когерентное перераспределение неравновесной поляризации и неэкспоненциальная кинетика Tj-релаксации протонов AMP.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Transfer of CIDNP among coupled spins at low magnetic field / Ivanov K. L., Miesel K., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H. M. // Applied Magnetic Resonance. -2006. - T. 30. - №3-4. - pp. 513-534.

2. 'H and 13C Hyperfine Coupling Constants of the Tryptophanyl Cation Radical in Aqueous Solution from Microsecond Time-Resolved CIDNP / Kiryutin A. S., Morozova О. В., Kuhn L. Т., Yurkovskaya A. V., Hore P. J. // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - T. 111. - №38. - pp. 11221-11227.

3. Electron Transfer between Guanosine Radical and Amino Acids in Aqueous Solution. 1. Reduction of Guanosine Radical by Tyrosine / Morozova О. В., Kiryutin A. S., Sagdeev R. Z., Yurkovskaya A. V. // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - T. 111. - №25. - pp. 7439-7448.

4. Electron Transfer between Guanosine Radicals and Amino Acids in Aqueous Solution. II. Reduction of Guanosine Radicals by Tryptophan / Morozova О. В., Kiryutin A. S., Yurkovskaya A. V. // Journal of Physical Chemistry В. - 200B. - Т. 112. - №9. - pp. 2747-2754.

5. High-resolution study of nuclear magnetic relaxation dispersion of purine nucleotides: Effects of spin-spin coupling / Kiryutin A., Ivanov K., Yurkovskaya A., Vieth H.-M. // Solid State Nuclear Magnetic Resonance. - 2008. - T. 34. - №1-2. - pp. 142-149.

6. Study of tryptophan radicals by CIDNP method / Kiryutin A. S. //41st Undergraduate and Graduate International Science Conference "Student and Scientific and Technical Progress" / Novosibirsk, Russia, 04.2003. - p. 34.

7. Short-lived radicals of purine bases in aqueous solution: reactivity and characterization by magnetic resonance / Kiryutin A. S., Morozova O., Yurkovskaya A., Vieth H.-M. // 70th Annual Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) / Berlin, Germany, 04-09.03.2005. CPP 30.12.

8. Characterization of Short-lived Radicals of Purine Bases in Aqueous Solution by Magnetic Resonance / Kiryutin A. S., Ivanov K. L., Vieth H.-M. // 69th Annual Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) / Dresden, Germany, 27-31.03.2006. CPP 12.28.

9. Dynamic Polarization and Relaxation in Systems of Coupled Nuclear Spins / Kiryutin A. S., Korchak S. E., Ivanov K. L., Vieth H.-M., Yurkovskaya A. V. // International Symposium on Modern Problems of Chemical Physics / Kazan, Russia, 31.10-04.11.2006.

10. Coherent transfer of CIDNP in biologically important molecules at low magnetic field / Miesel K., Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // XXII International conference on magnetic resonance of biological system (ICMRBS) / Goettingen, Germany, 20-25.08.2006. - S. 212.

11. Influence of the Spin-Spin Couplings on Ti Relaxation Dispersion / Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Miesel K., Vieth H.-M. // Modern Development of Magnetic Resonance / Kazan, Russia, 24-29.09.2007. - p. 30.

12. 'н and "С hyperfme coupling constants of the tryptophanyl cation radical in aqueous solution from microsecond time-resolved CIDNP / Kiryutin A. S., Morozova О. В., Kuhn L. Т., Yurkovskaya A. V., Hore P. J. // 10th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena IS. Servolo, Venice, Italy, 18.06-21.06.2007. - p. 64.

13. Coherent transfer of hyper-polarization due to strong coupling of spins / Miesel K., Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // 11th Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Methods for biomolecular magnetic resonance" / Vallombrosa (Florence), Italy, 03-08.06.2007. - p. 88.

14. Influence of spin-spin couplings on longitudinal relaxation dispersion / Miesel K., Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // The 5th Conference on Field Cycling NMR Relaxometry/Torino, Italy, 30.05-03.06.2007. - 015.

15. Re-distribution of hyperpolarization infield cycling NMR experiments with high resolution detection / Yurkovskaya A. V., Ivanov K. L., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // The 5th Conference on Field Cycling NMR Relaxometry / Torino, Italy, 30.05-03.06.2007. - 02.

16. Electron transfer between guanosine radical and amino acids in aqueous solution: TR-CIDNP study / Yurkovskaya A. V., Morozova О. В., Kiryutin A. S., Vieth H. M. // 10th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena / S.Servolo, Venice, Italy, 18-21.06.2007. - p. 5.

17. Determination of EPR Parameters of Adenosine- and Guanosine-monophosphate Radicals from CIDNP Field Dependence / Kiryutin A. S., Ivanov K. L., Morozova О. В., Zimmermann H., Yurkovskaya A. V., Vieth H.-M. // 6th Asia Pacific EPR/ESR Symposium / Cairns, Australia, 13-18.07.2008.-PJ1.

18. Modelling of fast DNA repair by reductive electron transfer from amino acids to GMP radicals. Time resolved photo-CIDNP study at variable pH / Yurkovskaya A. V., Morozova О. В., Kiryutin A. S. // Central European Conference on Photochemistry / Bad Hofgastein, Austria, 1014.02.2008. - 026.

19. Modelling Fast DNA Repair by Electron Transfer between Guanosine Radical and Aminoacids: A Microsecond Time-Resolved Photo-CIDNP Study / Yurkovskaya A. V., Morozova О. В., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // 49th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference / Asilomar Conference Center, Pacific Grove, CA, USA. - p. 52.

20. Перенос электрона между радикалом гуанозина и аминокислотами: исследование методом ХПЯ с временным разрешением / Юрковская А. В., Морозова О. Б., Кнрютин А. С., Фит Х.-М., Сагдеев Р. 3. // Современные проблемы химической физики / Ереван, Армения, 21-24.10.2008.-С. 35-36.

Подписано к печати 6 мая 2009 г. Тираж 100 экз. Заказ № 858. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Роль радикалов триптофана в живой природе и проблемы детектирования.

1.2. Неэнзнматическая репарация ДНК и нуклеотидов.

1.3. Основы метода ХПЯ с временным разрешением.

1.4. Феноменологическое проявление ХПЯ в спектрах ЯМР.

1.5. Физико-химические свойства реагентов реакций.

1.5.1. Фотохимические реакции DP с ТгрН.

1.5.2. Фотохимические реакции DP с ТугОН.

1.5.3. Фотохимические реакции DP с GMP.

1.5.4. Внутримолекулярный перенос электрона в дипептиде ТгрН-ТугОН.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Методы исследования.

2.1.1. Описание установки ХПЯ с временным разрешением в магнитном поле 4.7 Тл (vh=200 МГц).

2.1.2. Описание установки ХПЯ с временным разрешением в магнитном поле 14.1 Тл (vH=600 МГц).

2.1.3. Описание установки с быстрым переключением поля и регистрацией спектров ЯМР высокого разрешения для измерения Ti релаксации и ХПЯ в различных магнитных полях.

2.1.4. Измерение рН.

2.2. Реактивы и растворители.

Результаты и обсуждение.

Глава 3. Определение констант СТВ.

3.1. Теоретическая модель и обоснование линейной зависимости геминальной ХПЯ от констант СТВ.

3.2. Условия для пропорциональности ХПЯ константам СТВ.

3.3. Анализ спектров *Н и 13С ХПЯ тирозина.

3.4. Анализ спектров 'Н и 13С ХПЯ триптофана.

3.5. 15NХПЯ аденозин-5-монофосфата.

Глава 4. Изучение реакций, моделирующих химическую репарацию ДНК (РНК).

4.1 Восстановление радикала GMP тирозином при различных значениях рН.

4.2 Восстановление радикала GMP триптофаном при различных значениях рН.

Глава 5. Влияние скалярных спин-спиновых взаимодействий на динамику ядерной поляризации и дисперсию Ti-релаксации в произвольном магнитном поле.

5.1 Дисперсия Ti-релаксации пуриновых нуклеотидов.

5.1.1. ЯМРД необменивающихся протонов пуриновых оснований AMP и GMP.

5.1.2. ЯМРД протонов остатка рибозы в AMP и GMP.

5.1.3. Неэкспоненциальная кинетика релаксации системы связанных спинов.

5.2. Когерентное перераспределение ХПЯ в системе спинов, связанных скалярным взаимодействием.

5.2.1. Критерий переноса поляризации.

5.2.2. Когерентный перенос ХПЯ в молекуле AMP.

Выводы.

Список используемой литературы.

Свободные радикалы играют важную роль во многих биохимических процессах. К сожалению, их изучение во многих случаях затруднительно из-за их короткого времени жизни. Традиционными методами для регистрации радикалов являются методы ЭПР и ЭНДОР. Спектры высокореакционных радикалов регистрировать можно в замороженных матрицах, при этом зачастую регистрируются только вторичные более стабильные радикалы, а данные кинетических исследования в таких условиях не сопоставимы с условиями для реакций в растворах. Альтернативным подходом, использованным в данной работе для изучения короткоживущих радикалов биологически важных молекул в водном растворе, является метод химической поляризации ядер (ХПЯ), который повышает чувствительность ЯМР на несколько порядков. Преимуществом метода ХПЯ с временным разрешением, который был использован в данной работе, состоит в том, что он позволяет легко разделять вклады от геминальных (длительностью несколько наносекунд) и внеклеточных (микросекундный и миллисекундный диапазоны) процессов. Кроме того, из кинетики ядерной поляризации можно определить константы скоростей химических реакций и значения времен ядерной релаксации радикалов. Метод ХПЯ позволяет точно соотнести константу СТВ с положением магнитного ядра в радикале и определить ее знак и величину. На современном уровне развития ЯМР-спектроскопии это можно сделать для всех магнитных ядер в радикале. В ЭПР-спектроскопии положение сигналов обычно не зависит от знака константы СТВ, а для отнесения СТВ в структуре радикала зачастую требуется использование изотопного замещения реагентов. Новизна предлагаемого подхода состоит в применении количественного анализа геминальных спектров ХПЯ для магнитных ядер *Н, 13С и 15N для определения констант СТВ в радикалах биологически важных молекул. В данной работе было экспериментально проверено и теоретически обоснованно, что в многоядерных радикальных парах относительные интенсивности линий в геминальном спектре ХПЯ пропорциональны величинам констант СТВ в радикалах на данных ядрах. Это является существенным развитием метода ХПЯ, поскольку открывает возможность определять константы СТВ в многоядерных радикальных парах. Установив это важное соотношение для радикалов с известными константами СТВ, впервые были определены относительные константы

13 1

СТВ в катион-радикале триптофана для ядер Си Да также константы СТВ в катион-радикале аденозин-5'-монофосфата для ядер 15N, которые также были получены впервые. Таким образом, расширена область применения метода ХПЯ с временным разрешением на ядра 13С и 15N.

Особый интерес представляет процесс репарации ДНК - важнейшей биомолскулы в организмах, хранящей генетический код. На данный момент вопрос о молекулярных механизмах, отвечающих за репарацию ДНК, остается открытым. В данной работе методом ХПЯ изучены реакции аминокислот (триптофана и тирозина) с радикалами наиболее легко окисляемого нуклеотида - гаунозин-5-монофосфата (GMP). Реакция переноса электрона с радикала гуанозинмонофосфата на аминокислоты моделирует «химический» путь репарации ДНК. Этот новый путь защиты генетической информации был предположен относительно недавно и пока еще полностью не доказан, но должен быть на несколько порядков быстрее и эффективнее, чем традиционный энзиматический путь репарации нуклеиновых кислот, который протекает на шкале времени от сотен миллисекунд до нескольких часов. В работе показано, что созданный фотохимически радикал нуклеотида быстро (на микросекундной временной шкале) и эффективно восстанавливается аминокислотами до диамагнитной молекулы при варьировании значения рН водных растворов в широких пределах. Реакция (GMP" + АА —► GMP + АА') оказывает сильное влияние на кинетику ХПЯ как аминокислоты (АА), так и GMP. Скорость реакции прямо пропорциональна концентрации АА, к = ке*[АЛ]. От кислотности среды зависит структура и протонированное состояние радикалов и диамагнитных молекул и, соответственно, эффективность переноса электрона и вырожденный электронный обмен.

Другим важным аспектом данной работы является исследование влияния скалярного спин-спинового взаимодействия ядер (J) как на зависимость ядерной Ti релаксации от магнитного поля, так и на когерентное перераспределение гиперполяризации (на примере ХПЯ) между ядрами в слабых магнитных полях. В магнитных полях, когда разность химических сдвигов ядер становится сравнимой с константами спин-спинового взаимодействия, любая спиновая система становится сильно связанной. Поэтому времена релаксации уже относятся не к индивидуальным спинам, а к общим спиновым состояниям. Так, если ядра имели существенно разные Ti в сильном поле ЯМР спектрометра, то при выполнении условия Ti>l/J в слабых полях они имеют близкие Ti, а в случае двух спинов - равные Ть Величина скалярного спин-спинового взаимодействия обычно составляет несколько герц, а времена релаксации ядер, как правило, составляют несколько секунд. Доказательство необходимости учета сильной связи ядер в слабых полях, приводящей к когерентному перераспределению поляризации, особенно важно с методической точки зрения. Проведенное исследование показало, что влияние сильной связи ядер необходимо учитывать при изучении полевых зависимостей ХПЯ с целью получить информацию о константах СТВ и об обменном взаимодействии в радикалах и радикальных парах. Кроме того, учет спин-спинового взаимодействия важен при изучении дисперсии релаксации с целью получить времена корреляции молекулярного движения для того, чтобы избежать систематических ошибок в интерпретации экспериментальных данных. Результаты, полученные в данной работе, открывают путь для направленного манипулирования гиперполяризацией путем переноса ее с исходно поляризованных ядер на ядра-мишени.

В первой главе представлен обзор литературы, посвященный значению радикалов триптофана в процессах живой природы. Дано описание неэнзиматической репарации ДНК. Представлены важные для данной работы результаты фотохимических исследований реакций между триплетным 2,2'-дипиридилом и ТгрН, ТугОН и GMP. Подробно описано явление ХПЯ и метод ХПЯ с временным разрешением, позволяющий получать кинетические данные.

Во второй главе описаны три установки ХПЯ, на которых проводились эксперименты. Особое внимание уделено созданной автором работы установке ХПЯ с временным разрешением в магнитном поле 14.1 Тл, на которой были получены спектры ХПЯ 13С и

В третьей главе приводится теоретическое обоснование пропорциональности сигналов в спектре ХПЯ константам СТВ. На основе модели, предложенной д.ф.-м.н. Ивановым К.Л., выведены условия применимости метода ХПЯ для получения значений констант СТВ из анализа геминальных спектров ХПЯ. Приведено сравнение интенсивностей 'Н и 13С ХПЯ с известными константами СТВ радикала тирозина. Получены относительные значения констант СТВ для ядер 'Н, 13С катион-радикала триптофана и для ядер 15N катион-радикала аденозин-5-монофосфата.

Четвертая глава посвящена изучению реакций переноса электрона с молекул тирозина и триптофана на радикалы GMP, моделирующих «химическую» репарацию ДНК. Описаны результаты измерений проведенных в широком диапазоне значение рН от 1.3 до 13.3, определены константы скорости реакции переноса электрона с участием аминокислот и радикалов GMP.

В пятой главе рассмотрено влияние спин-спиновых взаимодействий ядер на зависимость Ti-релаксации от магнитного поля. Особый интерес представляет когерентный перенос гиперполяризации в различный магнитных полях от 0.1 мТл до 7 Тл, обнаруженный при изучении полевой зависимости ХПЯ аденозин-5-монофосфат.

В конце диссертации приведены основные результаты и выводы работы, список цитируемой литературы и приложение В приложении приведены экспериментальные и моделированные спектры ЯМР он и С) триптофана, тирозина, аденозин-5-монофосфата и гуанозин-5-монофосфата. Выписаны химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия, определенные для перечисленных выше молекул и использованные для модельных расчетов в работе.

Выводы

1. Создана установка и отработана методика для регистрации ХПЯ магнитных ядер (!Н, 13С, 15N) с микросекундным временным разрешением на базе ЯМР-спектрометра (Во = 14.1 Тл) и импульсного лазера (Nd:YAG).

2. Установлено, что в многоядерных радикальных парах, для которых ширина спектра ЭПР больше, чем константа СТВ для любого из ядер, интенсивности сигналов в геминальных спектрах ХПЯ в сильном магнитном поле прямо пропорциональны величинам констант СТВ в радикалах.

3. Впервые зарегистрированы геминальные спектры 13С ХПЯ L-триптофана и 15N ХПЯ аденозин-5-монофосфата, на основании анализа которых определены знаки и относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия в катион-радикалах триптофана и нуклеотида.

4. Изучена реакция переноса электрона с триптофана и тирозина на радикалы гаунозин-5-монофосфата при рН водных растворов от 1.3 до 13.3. Установлено, что в кислотных растворах перенос электрона протекает значительно быстрее, чем в щелочных растворах. При одинаковых условиях триптофан является более эффективным восстанавливающим агентом, чем тирозин.

5. Изучена релаксационная дисперсия протонов пуриновых нуклеотидов (AMP и GMP) в диапазоне магнитных полей от 0.1 мТл до 7 Тл. Показано, что на зависимость Ti-релаксации от магнитного поля влияет спин-спиновое взаимодействие. Установлено, что следствием сильной связи спинов Н2 и Н8 в молекуле AMP является когерентное перераспределение неравновесной поляризации и неэкспоненциальная кинетика Ti-релаксации протонов AMP.

1. Staicture and interactions of amino acid radicals in class I ribonucleotide reductase studied by ENDOR and high-field EPR spectroscopy / Lendzian F. // Biochimica et Biophysica Acta, Bioenergetics. 2005. - T. 1707. - №1. - C. 67-90.

2. Intraprotein radical transfer during photoactivation of DNA photolyase / Aubert C., Vos M. H., Mathis P., Eker A. P. M., Brettel K. // Nature. 2000. - T. 405. - №6786. - C. 586-590.

3. Origin of the transient electron paramagnetic resonance signals in DNA photolyase / Gindt Y. M., Vollenbroek E., Westphal K., Sackett H., Sancar A., Babcock G. T. // Biochemistry. -1999. -T. 38. -№13. -C. 3857-3866.

4. Multifrequency High-Field EPR Study of the Tryptophanyl and Tyrosyl Radical Intermediates in Wild-Type and the W191G Mutant of Cytochrome с Peroxidase / Ivancich

5. A., Dorlet P., Goodin D. В., Un S. // Journal of the American Chemical Society. 2001. - T. 123. -№21. -C. 5050-5058.

6. Tryptophan-Based Radical in the Catalytic Mechanism of Versatile Peroxidase from Bjerkandera adusta / Pogni R., Baratto M. C., Giansanti S., Teutloff C., Verdin J., Valderrama

7. B., Lendzian F., Lubitz W., Vazquez-Duhalt R., Basosi R. // Biochemistry. 2005. - T. 44. -№11. -C. 4267-4274.

8. Evidence from Spin-Trapping for a Transient Radical on Tryptophan Residue 171 of Lignin Peroxidase / Blodig W., Smith А. Т., Winterhalter K., Piontek K. // Archives of biochemistry and biophysics. 1999. - T. 370. - №1. - C. 86-92.

9. Identification by ENDOR of Trpl91 as the free-radical site in cytochrome с peroxidase compound ES / Sivaraja M., Goodin D. В., Smith M., Hoffman В. M. // Science. 1989. - T. 245. - №4919. - C. 738-740.

10. Electrostatic Control of the Tryptophan Radical in Cytochrome с Peroxidase / Barrows T. P., Bhaskar В., Poulos T. L. //Biochemistry. 2004. - T. 43. - №27. - C. 8826-8834.

11. Versatile Peroxidase Oxidation of High Redox Potential Aromatic Compounds- Site-directed Mutagenesis, Spectroscopic and Crystallographic Investigation of Three Long-range

12. Electron Transfer Pathways / Perez-Boada M., Ruiz-Duenas F. J., Pogni R., Basosi R., Choinowski Т., Martinez M. J., Piontek K., Martinez A. T. // Journal of Molecular Biology. -2005. T. 354. - №2. - C. 385-402.

13. The role of tryptophan 272 in the Paracoccus denitrificans cytochrome с oxidase / MacMillan F., Budiman K., Angerer H., Michel H. //FEBS Letters. 2006. - T. 580. - №5. -C. 1345-1349.

14. Radicals associated with the catalytic intermediates of bovine cytochrome с oxidase / Rich P. R., Rigby S. E. J., Heathcote P. // Biochimica et Biophysica Acta, Bioenergetics. 2002. -T. 1554. -№3. -C. 137-146.

15. Light-induced electron transfer in a cryptochrome blue-light photoreceptor / Giovani В., Byrdin M., Ahmad M., Brettel K. //Nature Structural Biology. 2003. - T. 10. - №6. - C. 489490.

16. Distinguishing features of indolyl radical and radical cation: implications for tryptophan radical studies in proteins / Walden S. E., Wheeler R. A. // Journal of Physical Chemistry. -1996. T. 100. - №5. - C. 1530-1535.

17. First Evidence of Anchimeric Spin Derealization in Tryptophan Radical Cation / Walden S. E., Wheeler R. A. //Journal of the American Chemical Society. 1997. - T. 119. - №13. -C. 3175-3176.

18. The g-values and hyperfine coupling of amino acid radicals in proteins: Comparison of experimental measurements with ab initio calculations / Un S. // Magnetic Resonance in Chemistry. 2005. - T. 43. - №Spec. Issue. - C. S229-S236.

19. Hydrogen Atom Transfer in Ribonucleotide Reductase (RNR) / Siegbahn P. E. M., Eriksson L., Himo F., Pavlov M. // Journal of Physical Chemistry B. 1998. - T. 102. - №51. -C. 10622-10629.

20. Reaction of Bovine Cytochrome с Oxidase with Hydrogen Peroxide Produces a Tryptophan Cation Radical and a Porphyrin Cation Radical / Rigby S. E. J., Juenemann S., Rich P. R., Heathcote P. // Biochemistry. 2000. - T. 39. - №20. - C. 5921-5928.

21. Density Functional and MP2 Calculations of Spin Densities of Oxidized 3-Methylindole: Models for Tryptophan Radicals / Jensen G. M., Goodin D. В., Bunte S. W. // Journal of Physical Chemistry. 1996. - T. 100. - №3. - C. 954-959.

22. Protein Radicals in Enzyme Catalysis / Stubbe J., van der Donk W. A. // Chemical Reviews. 1998. - T. 98. - №2. - C. 705-762.

23. Ribonucleotide reductase-a radical enzyme / Reichard P., Ehrenberg A. // Science. 1983. - T. 221. - №4610. - C. 514-519.

24. Electron paramagnetic resonance and nuclear magnetic resonance studies of class I ribonucleotide reductase / Graeslund A., Sahlin M. // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 1996. - T. 25. - C. 259-286

25. Tyrosine radicals are involved in the photosynthetic oxygen-evolving system / Barry B. A., Babcock G. T. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1987. - T. 84. - №20. - C. 7099-7103.

26. A metalloradical mechanism for the generation of oxygen from water in photosynthesis / Hoganson C. W., Tabcock G. T. // Science. 1997. - T. 277. - №5334. - C. 1953-1956.

27. Excited-state properties of Escherichia coli DNA photolyase in the picosecond to millisecond time scale / Heelis P. F., Okamura Т., Sancar A // Biochemistry. 1990. - T. 29. -№24. - C. 5694-5698.

28. Role of tryptophans in substrate binding and catalysis by DNA photolyase / Kim S.-T., Heelis P. F., Sancar A // Methods in Enzymology. 1995. - T. 258. - C. 319-343.

29. Charge transfer between tryptophan and tyrosine in proteins / Butler J., Land E. J., Pruetz W. A., Swallow A. J. // Biochimica et Biophysica Acta, Protein Structure and Molecular Enzymology. 1982. - T. 705. - №2. - C. 150-162.

30. Long-range electron transfer between tyrosine and tryptophan in peptides / Faraggi M., DeFelippis M. R., Klapper M. H. // Journal of the American Chemical Society. 1989. - T. 111. -№14. -C. 5141-5145.

31. Electron-transfer reactions of tryptophan and tyrosine derivatives / Jovanovic S. V., Harriman A., Simic M. G. // Journal of Physical Chemistry. 1986. - T. 90. - №9. - C. 19351939.

32. Intramolecular Electron Transfer in Tryptophan-Tyrosine Peptide in Photoinduced Reaction in Aqueous Solution / Morozova О. В., Yurkovskaya A. V., Vieth H.-M., Sagdeev R. Z. // Journal of Physical Chemistry B. 2003. - T. 107. - №4. - C. 1088-1096.

33. Reversibility of Electron Transfer in Tryptophan-Tyrosine Peptide in Acidic Aqueous Solution Studied by Time-Resolved CIDNP / Morozova О. В., Yurkovskaya A. V., Sagdeev R. Z. // Journal of Physical Chemistry B. 2005. - T. 109. - №8. - C. 3668-3675.

34. Direct demonstration of electron transfer between tryptophan and tyrosine in proteins / Pruetz W. A., Butler J., Land E. J., Swallow A. J. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1980. - T. 96. - №>1. - C. 408-414.

35. No Vend of historyV for photolyases / Sancar A. // Science. 1996. - T. 272. - №5258. -C. 48-49.

36. Chemical magnetoreception in birds: the radical pair mechanism / Rodgers С. Т., Ноге P. J. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2009. T. 106. - №2. - C. 353-360.

37. Electron Spin Resonance Study of Electron and Hole Transfer in DNA: Effects of Hydration, Aliphatic Amine Cations, and Histone Proteins / Cai Z., Gu Z., Sevilla M. D. // Journal of Physical Chemistry B. 2001. - T. 105. - №25. - C. 6031-6041.

38. Guanine is the target for direct ionisation damage in DNA, as detected using excision enzymes / Melvin Т., Cunniffe S. M., O'Neill P., Parker A. W., Roldan-Arjona T. // Nucleic acids research. 1998. - T. 26. - №21. - C. 4935-4942.

39. UV Laser Photolysis of DNA: Effect of Duplex Stability on Charge-Transfer Efficiency / Douki Т., Angelov D., Cadet J. // Journal of the American Chemical Society. 2001. - T. 123. -№46. - C. 11360-11366.

40. Oxidative Nucleobase Modifications Leading to Strand Scission / Burrows C. J., Muller J. G. // Chemical Reviews. 1998. - T. 98. - №3. - С. 1109-1151.

41. How Easily Oxidizable Is DNA? One-Electron Reduction Potentials of Adenosine and Guanosine Radicals in Aqueous Solution / Steenken S., Jovanovic S. V. // Journal of the American Chemical Society. 1997. - T. 119. - №3. - C. 617-618.

42. Repair of Guanyl Radicals in Plasmid DNA by Electron Transfer Is Coupled to Proton Transfer / Milligan J. R., Aguilera J. A., Hoang O., Ly A., Tran N. Q., Ward J. F. // Journal of the American Chemical Society. 2004. - T. 126. - №6. - C. 1682-1687.

43. Proton-Coupled Electron Transfer in Guanine Oxidation: Effects of Isotope, Solvent, and Chemical Modification / Weatherly S. C., Yang I. V., Armistead P. A., Thorp H. H. // Journal of Physical Chemistry B. 2003. - T. 107. - №1. - C. 372-378.

44. Purine bases, nucleosides, and nucleotides: aqueous solution redox chemistry and transformation reactions of their radical cations and e- and OH adducts / Steenken S. // Chemical Reviews. 1989. - T. 89. - №3. - C. 503-520.

45. Mechanistic Comparison of High-Fidelity and Error-Prone DNA Polymerases and Ligases Involved in DNA Repair / Showalter A. K., Lamarche B. J., Bakhtina M., Su M.-I., Tang K.-H„ Tsai M.-D. // Chemical Reviews. 2006. - T. 106. - №2. - C. 340-360.

46. Lagging Strand Replication Proteins in Genome Stability and DNA Repair / Rossi M. L., Purohit V., Brandt P. D., Bambara R. A. // Chemical Reviews. 2006. - T. 106. - №2. - C. 453-473.

47. Evaluation of Molecular Models for the Affinity Maturation of Antibodies: Roles of Cytosine Deamination by AID and DNA Repair / Samaranayake M., Bujnicki J. M., Carpenter M., Bhagwat A. S. // Chemical Reviews. 2006. - T. 106. - №2. - C. 700-719.

48. Catalytic promiscuity and the divergent evolution of DNA repair enzymes / O'Brien P. J. // Chemical Reviews. 2006. - T. 106. - №2. - C. 720-752.

49. DNA Repair in Plants / Kimura S., Sakaguchi K. // Chemical Reviews. 2006. - T. 106. -№2. - C. 753-766.

50. Repair of oxidative guanine damage in plasmid DNA by indoles involves proton transfer between complementary bases / Ly A., Tran N. Q., Ward J. F., Milligan J. R. // Biochemistry. 2004. - T. 43. - №28. - C. 9098-9104.

51. Reactivity of DNA Guanyl Radicals with Phenolate Anions / Ly A., Bandong S. L., Tran N. Q., Sullivan K. J., Milligan J. R. // Journal of Physical Chemistry B. 2005. - T. 109. -№27. -C. 13368-13374.

52. Peptide Repair of Oxidative DNA Damage / Milligan J. R., Tran N. Q., Ly A., Ward J. F. //Biochemistry. 2004. - T. 43. -№17. -C. 5102-5108.

53. Involvement of proton transfer in the reductive repair of DNA guanyl radicals by aniline derivatives / Ly A., Tran N. Q., Sullivan K., Bandong S. L., Milligan J. R. // Organic & Biomolecular Chemistry. 2005. - T. 3. - №5. - C. 917-923.

54. Repair of oxidative DNA damage by amino acids / Milligan J. R., Aguilera J. A., Ly A., Tran N. Q., Hoang O., Ward J. F. // Nucleic Acids Research. 2003. - Т. 31. - №21. - C. 6258-6263.

55. Interaction of dGMP radical with cysteamine and promethazine as possible model of DNA repair / Willson R. L., Wardman P., Asmus K. D. // Nature. 1974. - T. 252. - №5481. -C. 323-324.

56. Electron-Transfer Oxidation Properties of DNA Bases and DNA Oligomers / Fukuzumi S., Miyao H., Ohkubo K., Suenobu T. // Journal of Physical Chemistry A. 2005. - T. 109. -№15.-C. 3285-3294.

57. Time-resolved CIDNP study of native-state bovine and human a-lactalbumins / Morozova О. В., Yurkovskaya A V., Sagdeev R. Z., Мок К. H., Ноге P. J. // Journal of Physical Chemistry B. -2004. -T. 108. -№39. C. 15355-15363.

58. Time-Resolved CIDNP Study of Non-Native States of Bovine and Human a-Lactalbumins / Morozova О. В., Ноге P. J., Bychkova V. E., Sagdeev R. Z., Yurkovskaya A. V. // Journal of Physical Chemistry B. 2005. - T. 109. - №12. - C. 5912-5918.

59. Nuclear magnetic resonance emission and enhanced absorption in rapid organometallic reactions / Ward H. R., Lawler R. G. // Journal of the American Chemical Society. 1967. -T. 89. -№21. -C. 5518-5519.

60. Mechanism explaining nuclear spin polarizations in radical combination reactions / Closs G. L. // Journal of the American Chemical Society. 1969. - T. 91. - №16. - C. 4552-4554.

61. Chemically induced dynamic nuclear polarization. III. Anomalous multiplets of radical coupling and disproportionation products / Kaptein R., Oosterhoff L. J. // Chemical Physics Letters. 1969. - T. 4. - №4. - C. 214-216.

62. Effect of glycyrrhizic acid on lappaconitine phototransformation / Kornievskaya Valeria S., Kruppa Alexander I., Polyakov Nicholas E., Leshina Tatyana V. // The journal of physical chemistry. B. 2007. -T. 111.-№39. - C. 11447-11452.

63. Photo-CIDNP Reveals Differences in Compaction of Non-Native States of Lysozyme / Schloerb C., Mensch S., Richter C., Schwalbe H. // Journal of the American Chemical Society. 2006. - C. ACS ASAP.

64. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / Бучаченко А. Б., Сагдеев Р. 3., Салихов К. М. Новосибирск: Наука, 1978.

65. Absolute chemically induced nuclear polarizations and yields from geminate radical-pair reactions. A test of high-field radical-pair theories / Vollenweider J. K., Fischer H. // Chemical Physics. 1988. - T. 124. - №3. - C. 333-345.

66. Химическая поляризация ядер в исследовании механизма реакций органических соединений / Грагеров И. П., Киприанова JI. А., Левит А. Ф. Киев, 1985.

67. Simple rules for chemically induced dynamic nuclear polarization / Kaptein R. // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 1971. - №14. - C. 732-733.

68. Time-resolved СПЖР: applications to radical and biradical chemistry / Closs G. L., Miller R. J., Redwine O. D. // Accounts of Chemical Research. 1985. - T. 18. - №7. - C. 196-202.

69. Time-resolved CEDNP in laser flash photolysis of aliphatic ketones. A quantitative analysis / Vollenweider J. K, Fischer H., Hennig J., Leuschner R. // Chemical Physics. -1985. T. 97. - №2-3. - C. 217-234.

70. Laser flash photolysis with NMR detection. Microsecond time-resolved CIDNP: separation of geminate and random-phase processes / Closs G. L., Miller R. J. // Journal of the American Chemical Society. 1979. - T. 101. - №6. - C. 1639-1641.

71. Photo-CIDNP of biopolymers / Hore P. J., Broadhurst R. W. // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 1993. - T. 25. - №4. - C. 345-402.

72. Photo-CIDNP NMR methods for studying protein folding / Мок К. H., Ноге P. J. // Methods. 2004. - Т. 34. - №1. - С. 75-87.

73. Photo-CIDNP studies of proteins / Kaptein R. // Biological Magnetic Resonance. 1982. -T. 4.-C. 145-191.

74. Photochemically induced dynamic nuclear polarization / Goez M. // Advances in Photochemistry. 1997. - T. 23. - C. 63-163.

75. Ultraviolet spectra of N:CC:N compounds / Linnell R. H., Kaczmarczyk A. // Journal of Physical Chemistry. 1961. - T. 65. - C. 1196-1200.

76. Mechanisms of deactivation of the low-lying electronic states of 2,2-bipyridine / Castellucci E., Angeloni L., Marconi G., Venuti E., Baraldi I. // Journal of Physical Chemistry. 1990. - T. 94. - №5. - C. 1740-1745.

77. Photolysis mechanism of aqueous tryptophan / Baugher J. F., Grossweiner L. I. // Journal of Physical Chemistry. 1977. - T. 81. - №14. - C. 1349-1354.

78. Photo-CIDNP in nucleic acid bases and nucleotides / Kaptein R., Nicolay K., Dijkstra K. // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 1979. - №23. - C. 10921094.

79. Photo-CIDNP Study of Biological Molecules / Stob S., 1989.

80. Изучение спиновой поляризации в реакциях фотолиза алифатических кетонов времяразрешенными методами магнитного резонанса / Юрковская А. В. Новосибирск: Международный томографический центр СО РАН, 1997.

81. Field cycling by fast NMR probe transfer: design and application in field-dependent CIDNP experiments / Grosse S., Gubaydullin F., Scheelken H., Vieth H. M., Yurkovskaya A. V. // Applied Magnetic Resonance. 1999. - T. 17. - №2-3. - C. 211-225.

82. Cross-relaxation effects in the photo-CIDNP spectra of amino acids and proteins / Hore P. J., Egmond M. R., Edzes H. Т., Kaptein R. // Journal of Magnetic Resonance. 1982. - T. 49. -№1.-C. 122-150.

83. Role of diffusion-controlled reaction in chemically induced nuclear-spin polarization. II. General theory and comparison with experiment / Adrian F. J. // Journal of Chemical Physics.- 1971. T. 54. - №9. - C. 3912-3917.

84. Basicity, visible spectra, and electron spin resonance of flavosemiquinone anions / Ehrenberg A., Mueller F., Hemmerich P. // European Journal of Biochemistry. 1967. - T. 2.- №3. C. 286-293.

85. CIDNP-Untersuchungen an photoinduzierten Radikalpaar-Reaktionen mit Feldzyklisierung im Magnetfeldbereich von 0 bis 7 Tesla / Grosse S. Berlin: Im Fachbereich Physik, Freien Universitat Berlin, 2000.

86. Flavins and Flavoproteins / Ehrenberg A., Eriksson L. E. G., Mueller F. = ред. Ehrenberg A. Amsterdam: Elsevier, 1966. Vol. 8

87. Spin Polarization and Magnetic Effects in Chemical Reactions / Salikhov К. M., Molin Y. N., SagdeevR. Z., Buchachenko A. L. Amsterdam: Elsevier, 1984.

88. Calculation of SNP effects in weak magnetic fields / Osintsev A. M., Purtov P. A., Salikhov К. M. // Chemical Physics. 1993. - T. 174. - №2. - C. 237-245.

89. Theory of anomalous electron spin resonance spectra of free radicals in solution. Role of diffusion-controlled separation and reencounter of radical pairs / Adrian F. J. // Journal of Chemical Physics. 1971. - T. 54. - №9. - C. 3918-3923.

90. Photoionization of Benzophenone Carboxylic Acids in Aqueous Solution. A FT EPR and Optical Spectroscopy Study of Radical Cation Decay / Saeuberlich J., Brede O., Beckert D. // Journal of Physical Chemistry. 1996. - T. 100. - №46. - C. 18101-18107.

91. Spin-correlated radical pairs in synthetic hairpin DNA / Nakajima S., Akiyama K., Kawai K., Takada Т., Ikoma Т., Majima Т., Tero-Kubota S. // ChemPhysChem. 2007. - T. 8. - №4. - C. 507-509.

92. Photooxidation and decarboxylation of tyrosine studied by EPR and CIDNP chemically-induced dynamic nuclear polarization. techniques / Tomkiewicz M., McAlpine R. D., CociveraM. // Canadian Journal of Chemistry. 1972. - T. 50. - №23. - C. 3849-3856.

93. Time resolved CIDNP study of electron transfer reactions in proteins and model compounds / Morozova О. В., Yurkovskaya A. V., Tsentalovich Y. P., Forbes M. D. E., Hore P. J., Sagdeev R. Z. // Molecular Physics. 2002. - T. 100. - №8. - C. 1187-1195.

94. ID Radical Motion in Protein Pocket: Proton-Coupled Electron Transfer in Human Serum Albumin / Kobori Y., Norris J. R., Jr. // Journal of the American Chemical Society. -2006. -T. 128. -№1. C. 4-5.

95. Two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP as a surface probe of native and partially structured proteins / Lyon С. E., Jones J. A., Redfield C., Dobson С. M., Hore P. J. // Journal of the American Chemical Society. 1999. - T. 121. - №27. - C. 6505-6506.

96. Medium-Dependent Electron and H Atom Transfer between 2-Deoxyadenosine and Menadione: A Magnetic Field Effect Study / Sengupta Т., Choudhury S. D., Basu S. // Journal of the American Chemical Society. 2004. - T. 126. - №34. - C. 10589-10593.

97. Nitrogen-15 nuclear magnetic resonance spectroscopy of some nucleosides and nucleotides / Markowski V., Sullivan G. R., Roberts J. D. // Journal of the American Chemical Society. 1977. - T. 99. - №3. - C. 714-718.

98. БЭС "Химия" /. Москва, 1998. - 580 с.

99. A kinetic study on the interaction of deprotonated purine radical cations with amino acids and model peptides / Pan J., Lin W., Wang W., Han Z., Lu C., Yao S., Lin N., Zhu D. // Biophysical Chemistry. 2001. - T. 89. - №2-3. - C. 193-199.

100. Field-cycling NMR relaxometry / Kimmich R., Anoardo E. // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 2004. - T. 44. - №3-4. - C. 257-320.

101. Collective Relaxation of Protein Protons at Very Low Magnetic Field: A New Window on Protein Dynamics and Aggregation / Luchinat C., Parigi G. // Journal of the American Chemical Society. 2007. - T. 129. - №5. - C. 1055-1064.

102. Blood-pool MRI contrast agents: properties and characterization / Clarkson R. B. // Topics in Current Chemistry. 2002. - T. 221. - №Contrast Agents I. - C. 201-235.

103. Biological applications of relaxometry / Fasano M. // Chimica e l'lndustria (Milan, Italy). 2001. - T. 83. - №10. - C. 89.

104. Nuclear spin relaxation and molecular motion in liquid crystals / Kothe G., Stohrer J. // NATO ASI Series, Series C: Mathematical and Physical Sciences. 1994. - T. 431. -№Molecular Dynamics of Liquid Crystals. - C. 195-206.

105. Magnetic relaxation dispersion studies of biomolecular solutions / Halle В., Denisov V. P. //Methods in Enzymology. 2001. - T. 338. - C. 178-201.

106. Water and monovalent ions in the minor groove of B-DNA oligonucleotides as seen by NMR / Halle В., Denisov V. P. // Biopolymers. 2000. - T. 48. - №4. - C. 210-233.

107. Magnetic relaxation dispersion of lithium ion in solutions of DNA / Victor K. G., Teng C.-L., Dinesen T. R. D., Korb J -P., Bryant R. G. //Magnetic Resonance in Chemistry. 2004. -T. 42. - №6,-C. 518-523.

108. Water molecule binding and lifetimes on the DNA duplex d(CGCGAATTCGCG)2 / Zhou D., Bryant R. G. // Journal of Biomolecular NMR. 1996. - T. 8. - №1. - C. 77-86.

109. High-Resolution Magnetic Relaxation Dispersion Measurements of Solute Spin Probes Using a Dual-Magnet System / Wagner S., Dinesen T. R. J., Rayner Т., Bryant R. G. // Journal of Magnetic Resonance. 1999. - T. 140. - №1. - C. 172-178.

110. Phospholipid bilayer surface configuration probed quantitatively by 31P field-cycling NMR / Roberts M. F., Redfield A. G. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. - T. 101. - №49. - C. 17066-17071.

111. High-Resolution 31P Field Cycling NMR as a Probe of Phospholipid Dynamics / Roberts M. F., Redfield A. G. // Journal of the American Chemical Society. 2004. - T. 126. -№42. - C. 13765-13777.

112. The theory of relaxation processes / Redfield A. G. // Advances in Magnetic Resonance. 1966. - Т. 1. - C. 1-32.

113. Transfer of C1DNP among coupled spins at low magnetic field / Ivanov K. L., Miesel K., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H. M. // Applied Magnetic Resonance. 2006. - T. 30. - №3-4. - C. 513-534.

114. Coherence transfer during field-cycling NMR experiments / Miesel K., Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Vieth H. M. // Chemical Physics Letters. 2006. - T. 425. - №1-3. - C. 71-76.

115. CIDNP transfer via nuclear dipolar relaxation and spin-spin coupling / De Kanter F. J. J., Kaptein R. // Chemical Physics Letters. 1979. - T. 62. - №3. - C. 421-426.

116. Low-field CIDNP in intramicellar radical disproportionation. Violation of equivalency in J-coupled nuclear spin systems / Tarasov V. F., Shkrob I. A. // Journal of Magnetic Resonance, Series A. 1994. - T. 109. - №1. - C. 65-73.

117. Transfer of Parahydrogen-Induced Hyperpolarization to 19F / Kuhn L. Т., Bommerich U., Bargon J. // Journal of Physical Chemistry A. 2006. - Т. 110. - №10. - C. 3521-3526.

118. The creation of off-diagonal elements in chemically induced dynamic nuclear polarization experiments / Schaublin S., Wokaun A., Ernst R. R. // Chemical Physics. 1976. -T. 14.-C. 285-293.

119. Creation of spin coherent states in the course of chemical reactions

120. Salikhov К. M. // Chemical Physics Letters. 1993. - T. 201. - C. 261-264.

121. Carbon-13 NMR spectra of tryptophan, tryptophan peptides, and of native and denatured proteins / Bradbury J. H., Norton R. S. // Biochimica et Biophysica Acta, Protein Structure. -1973. T. 328. - №1. - C. 10-19.

122. Definitive assignment of carbon-13 NMR signals in tryptophan and related molecules / Morales-Rio s M. S., Joseph-Nathan P. // Journal of Heterocyclic Chemistry. 1986. - T. 23.6. -C. 1617-1619.