Рентгеноструктурное исследование бактериальной формиатдегидрогеназы с разрешением 3.0 А тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

российская академия наук

ОРДКНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

АЛЕШИН Александр Евгеньевич

УДК 548.737

РЕНТГШОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С РАЗРЕШЕНИЕМ 3.0 1

Специальность 01.04.18 -кристаллография и

физика кристаллов

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1992.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. Л.В.Шубникова РАН.

Научный руководитель; доктор химических наук, профессор Э.Г.Арутюнян.

Официальна оппоненты: доктор химических наук, профессор П.М.Зоркий.

доктор наук,

член-корр. РАН ¡0.Т.Стручков.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. Шемякина.

Защита диссертации состоится 11 ноября 1992. г.. в 12.30 чао. на заседании специализированного совета Д 002.58.01 при Институте кристаллографии РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно сзнакомхйъся в библиотеке Института кристаллографии РАН.

Автореферат разослан " октября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физ.-ыат. коу^^!——^ В.М.Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. НАД-завиеимая формиатдегцдрогеназа (ФДГ) формиат: НАД+ оксидоредуктаза КФ 1.2.1.2.) метилотрофных бактерий 'зеийотопай ер. 101 катализирует последнюю стадию метаболизма мета-юла - окисление формиата до СС^ при сопряженном восстановлении икотинашададениндинуклеотида (НАД) в НАДН. Сходные по физико-имическим свойствам формиатдегидрогеназы обнаружены в высших рас ■ениях, дрожжах и микроорганизмах. Изучение механизма действия и :труктурных. принципов организации данного фермента необходимо для юнимания метаболизма формиата в живых организмах. ФДГ принадлежит : обширному классу НАД(Ф)-зависимых ферментов, которые при всем ногообразии катализируемых ими реакций имеют ряд консервативных ¡войств, определяемых природой используемого кофермента. Эта осо-¡енность, сочетающаяся с древностью использования живыми организма- . и молекулы НАД в окислительно-восстановительных реакциях, выделяет [АД (Ф)-зависимые ферменты как уникальный объект для изучения происхождения и эволюционирования ферментов, использующих сложные кофакторы. Проведенные к настоящему времени физико-химические исслг-(ования ФДГ показали, что данный фермент является очень удобным и нтересным объектом и для изучения собственно НАД-зависимого дегид-отрования. В отличие от хорошо изученных к настоящему времени де~ идрогеназ, ФДГ имеет очень простой субстрат. Отсутствие в катали-¡ируемой реакции стадии переноса протона с субстрата на фермент, юггрякенной с процессом дегидрирования, позволит существенно паеши->ить представления о движущих силах реакции, в особенности, при (иссоциации комплекса фермент-{[АДН-продукт.

Перечисленные выше задачи невозможно решить без детального знамя пространственной структуры исследуемого фермента. Рентгеновская ¡ристаллография в настоящее время является единственным методом, 1ающим такую информацию. Более того, в случае НАД-зависимых дегид-хэгеназ, у которых ферментативный процесс сопровождается существенней структурными перестройками активного центра, рентгено-!труктурний анализ является также и ключевым методом изучения моха-1изма действия.

Проведенные к настоящему времени работы по выделению и секвени-юванию гена ФДГ открывают широкие возможности для комплексного

изучения данного фермента генетическими, биохимическими и кржтял-■ лографичесними методами.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью настоящей рсмоты явилось изучнни* мнгодом полиизоморфных производные пространственной структуры тройного комплекса ФДГ (фермгят-НАД-авид) о разрешением 3.0 Î, получении данных об организации активного центра и проведение сравнительного анализа структуры новой НАД-зависимой дегидрогеназц с другими известными ферментами этого класса

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Определена на атомном уровне пространственная структура ФДГ. Проведен анализ вторичной структуры фермента. Используя иийормацию О месте расположения молекулы НАД в белке, охарактеризован активный центр. Прове я сравнительный ана.г'4 ФДГ с другими структурно изученными дегидрогеназами, выявлен^ общие закономерности й отличия в пространственной организации этих ферментов и в их взачмодейг^вии с молекулой НАД.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Построенная модел1. о'мка нопьоля ет сразу же после сбора данных высокого разрешения провести крие■ таллографическое уточнение модели, расшифровать имекяциеся кристаллы апоформи, фермента и двойного комплекса ФДГ-НАД методом молекулярного замещения, что явится основой в определении механизма действия формента. Знание организации активного центра зволяет уя->* сейчас начать работы по модификации интересуемых остатков методом направленного мутагенеза.- Появилась возможность модифицировать ряд свойств фермента о целью расширения путей его .ютехнологического применения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Резу таты работы докладывались на V Ьсесоюз ном симпозиуме "Структура биологических макро;олекул" (Звенигород, 1987), Y Всесоюзной научной. конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва,1987), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пуишно,1988), 12 Европейской криеталл^графическ::. ксмференции (Москва, 1989) и ряде других.

ГОК;;,1КА1Ш. Материалы да'.'серт-сиии опубликованы в отчета*- нескольких кон^еренцлГ п 4с"'«'",ьях1 список которых приведен « кснц» автореферата.

OF'3.1 РАБОТ:«. Jliw-jnsi^ta есю-л-ит нь^д-'ч »с-.. четырех ГЛ'.У, закгл'Ш?гк--. i-uhoic-fc. ИСЛ'УО'ч'-. '-.' ; '.ni считай cmvjr.a литературы ч со:»р:*!1 Г«'.-ун:-:ов » 1' .'• 0° '.'Ц.

- 5 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ кратко излагает цель и актуальное:;- проведенных исследований.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОЬУ.Г состоит из двух глав.

ГЛАВА 1. Структурная организация НАД(Ф)-связывающих ферментов.

НАД и НАДФ являются кофакторами огромного количества ферментов, 1Торые классифицируются в зависимости от катализируемой ими ре а; ции, а именно: восстанявливающш карбонильную связь называются дегидрогеназами, Шиффово основание или диоульфидьую связь - редук-тэзами и ароматическую углерод-кислородную связь - гидроксилазами. Во всех ферментатиших реакциях для нуклесфлдъной атаки в НАД(Ф)+ используется исключительно Од атом никотинашдного кольца, что делает ¡эту молекулу' унииеро;мьнш переносчиком окислительного (в случае НАД) или восстановительного ( в олучае НАДФ) эквивалента между различными реакциями в клетке. Все НАД(Ф)-завксимые ферменты строго различают эти молекулы [1].

В настоящее время че'ГГГ'п фермента: алкогольдегидрогеназа (АДГ), малатдегадрогеназа (МДГ), .лпктчтл.м'Идроу'наза (ЛДГ) и глицераль-дегид-З-фосфатдешдрогенчуа (ГАФД) яил.иится наиболее структурно изученными дегидрогеназши. Среди редуктаз таковыми является догид-рофолатррдуктааа и глутятионредуктаза, а среда гидроксилаз - Р-ОН-бензогидроксилаза. Для больлчшртвн из этих ферментов известна структура объектов, полученных различных источников.

В строения дегидрогеназ было чянлено существенное сходство. Йх еуЛгед»ш;\:.' состоя? из двух структурных доменов. Один из доменов преимущественно от^етстпен за связыван'/г1 субстрата, а другой -молекулы НАД. Кром" того, коферментстязынагавде домены имеит сходную структурную организацию, котс^я получила название укладка Рос-смаш-. Осгалише НАЛ' Ъ) -зависимые ферменты имеют меньше топологических 'ходстп, однако, у всех них коферментсвязывающал часть одержи г структурные элементы аналогичные дегадрогеназным [1].

В п* рвой главе подробно рассматриваются принципы оргглэдзации молекулы перечисленных выше дегн^рогеназ, их взаимодействие с кофактором, конфирмационные изменения, которые претерпевают фермо'Д-ты в процессе связывания НАД и субстрата, приведено современное понимание механизма действия дегидрогеназ.

ГЛАВА 2. Физико-химические и кинетические свойства НАД-зависююй формиатдегигдогеназы.

В этой главе представлены результаты энзимологических йсследо-ваний ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101, полученные к настоящему времени, приведены условия выделения и кристаллизации апоформи ФДГ и двух ее комплексов.

Молекула ФДГ является дамером с молекулярным весом субъединицы около 40 кД. Кинетические исследования фермента показали, что ФДГ неупорядоченно связывает субстраты, способна окислять различные сложные ефиры муравьиный кислоты, первичным продуктом в • случае окисления формката является молекула СС2-

Из данных малоуглового рентгеновского рассеяния растворов комплексов фермента с- аналогами кофермента и субстрата следует, что фермент претерпевает различные конформационные перестройки в про-цёссе катализа [2]. Яаибольшие изменения геометрических параметров наблюдались для комплекса ФДГ с восстановленной формой кофермента. Результаты .по кристаллизации и предварительному рентгеноструктур-ному исследованию ФДГ [3] также свидетельствуют о различии конфор-ыации апоформы фермента и его комплексов с молекулой НАД.- В частности, кристаллы апофермента имеют группу симметрии ;Р2^ и параметры ячейки 118.55*70.11*54.6Ä, >=113.7 - Кристаллы комплекса ФДГ с НАД и тройного комплекса фермент-НАД-азид (аналога переходного состояния реакции) имеют одинаковую симметрию ячейки- - R212121 и1 близкие длины ребер - 116. 0Ä*113.31*63.48 и 116.3&*113.4Ä*63.7Ä, соответственно. .

ГЛАВА 3.. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1. Сбор экспериментальных данных.

Для решения задачи по определению структуры ФДГ были выбрани кристаллы тройного комплекса фермент-НАД-азид (в дальнейшем будут называться холоформои}, поскольку наличие кофермента и аналога субстрата в активном центре повышает информативность модели Кроме того, молекула НАД 'защищает активный центр от взаимодействия и тяа:эг лими атомами, что упрощает попек изоморфных производных.

Кристаллизация холофорим ФДГ проводилась по №тодике, предложенной Я.Д.Деведхиевш-и Мчудафицираванной В.С.Ламзиныы применительно к новим услсшям наделения фоКритике монокристаллы полу-

чали методом дифузии парах: в пробе объемом 0.5 мл - 1 /.г/мл белка, ЗЗЯ сульфата аммония, 5 об. % МВД, 5 мМ НАД и'азида натрия, 1мМ ЭДТА; противораствор объемом 2.5 мл содержал 52? сульфата аммония и 5 об.Ж МПД. рН растворов задавалось равным 7.0 0.1 М фосфатным буфером. Криста. 1 размером порядка 1*0.7*0.5 мм вырастал; при температуре 20°С через 20 дн'-л. Пространственная группа кристаллов -Р212121, параметры ячейки 11ь.0й * 113.ЗА * 63.4Д, в независимой "'юти ячейки содержится целая молекула, содержащая две субъединтц

Поскольку для молекулы ФДГ отсутствуют структушо расшифрованные гомологи, определение структуры этого фермента основывалось на методе полиизоморфного замещения.

Тяжело атомные производные получались настаиванием кристаллов в специальных консервирующих растворах, содержащих метку. Тестирование большого количества тяжелоатомных соединений показало, что отсутствуют реагенты, позволяющие настаивать кристаллы до полного насыщения меткой без нарушения изоморфизма, что осложняло воспроизводимость результатов. Для съемок данных с разрешением 3 X били отобраны производные кристаллы, полученные настаиванием в парахлор-меркурийбензоате (ГШ.1В) и уОрАо..,. Условия настаивания производь-х приведены в таблице 1. ПХМБ-производное, .¿олученное при более низких значениях рН и количестве метки в растворе, сравнимом с количеством молекул белка в кристалле, оказалось отличным от на- ивав-иегося при больших концентрациях, повтому оно • также было использовано для определения фаз. ,

Таблиц.-!

Условия получения тяжелоатошых производных холоформы ФДГ

тяжелоатомное соединение концентрация, тМ гД буф£ер время, суток кол о мест связывания

ПХМБ-1 0.1 7.0 МаРОд 3 4

ТШШ-2 3»кол-во белка 6.3 ЯаКН 1.5 2

уранилацетат 10.0 (6.0 МаАо 1 Ю

После предварительного отбора производных по прецессионным

рентгенограммам зон НКО их качество определялось тестовыми съемками на четырехкруашом одаоканальном дифрактометре Syntex Р21. Дифрагирующая сила кристалла ПХМВ-1 тгрси ¿йодной оказалась столь велика, что при радиационном распаде равном 15% удалось собрать набор до разрешения 3.5 А. Этот набор решено било использопать для определения фаз. Все остальные данные высокого разрешения собирались на дифрактометре с позиционно-чувствительным детектором КАРД-4, разработанном и построенном в Институте кристаллографии РАН (Москва). Преимуществом этого прибора является высокое быстродействие, позв.о-лившее собрать наборы данных разрешением ЗА со средней скоростью -2-3 дня/кристапл.

Все съемки на дифрактометре КАРД-.; . доводились в оквинпглонной геометрии с д=у=13.5°, ось 1 кристалла - параллельна оси вращения. Расстояние кристалл-детектор равнялось 600 мм. Для уменьшения рассеяния на атомах всацуха и агерь интенсивности отраженных рефлексов этот промежуток заполнялся гелиевым буфером. Во ¡¿сех съемках, за исключением съемки уранмльной производной, использовался графитовый монохромзтор. Уранильная производная снималась с никелевым фильтром^ чтобы предотвратить перекрывание рефлекс* из-за больших■ размеров кристалла. Коллиматор подбирался таким, чтобы в направлена;, перпендикулярном оси вращени; кристалл, имевший форму вытянутой призмы, не выходил.за пределы пучка ( 0.8-1.2 мм). Объем, в котором регистрировались интенсивность и фон, равнялся 3-5 каналам вдоль осей камеры и 5 иагам сканирования по о' (ciar сканирования = 0.25°). Объем менялся в зависимости от у и |i и оценивался по сильным рефлексам. Фон измерялс в первом и пятом интервалах по ü в тех же каналах где, и интенсивность рефлекса для уменьшения влияния неоднородности камеры.

Интенсивность рефлексов вычислялась простым суммированием по матрице с заранее рассчитанным положением на камере. Для снижения систематических опивок, всегда возможных в столь сложном эксперименте, необходимая статистическая точность измерений достигалась съемкой всех четырех сжаа-.'Тр:чыл отражений (интервал сканирования по u = 0-3604) на позьпеннс:?. с^срогти. интенсивности и ошибки которых впоследетког взьесекко склалвьались по формулам:

Í « Г(1 Г 4 , г! Г «, г'

U ) I'" - J V1"- i

где 1е - взвешеннья интенсивность, 1( - интенсивность симметрично-эквивалентного рефлекса, 01 - его статистическая ' ошибка, 0£ -взвешенная статистическая ошибка.

Перед началом с Лора данных' измерялась кривая пропускания для учета поглощения по Иортсу-Смлилсу и контрольные зоны (аи = 1.25°) с шагом 30-90° для учета радиационного распада и проверки разъюсти-ровки кристалла.

Все наборы собирались о одной установки кристалла. Это привело к наличию в наборах некоторой слепой области ( примерно 5%) вдоль оси вращения и низкой точности определения интенсивностей рефлексов вблизи от оси вращения из-за искажений Лоренц-фактора в этой области. Однако эта проблема была решена подключением данных несколько более низкого разрешения, отснятых на дафрактомечре БуМех. Параметры всех использованных для кристаллографических расчетов наборов данных приведены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристики массивов экспериментальных Данных

соединение разреш. Л "нез "статистика,& j 1>Юа Roy» X Ror X прибор

нативн.1 4.2 8000 7600 82 54 - - f.yntex

ПХМЕ-1 3.5 11000 10300 80 50 - 15 2

нативн.2 3.0 88000 15400 93 75 5-1 - 1

UO,Ao, 3.0 88000 1570и 96 76 4.8 15 0 КАРД-4

ПХМБ-2 з.о 88000 14700 95 74 5.2 14 0

Н^ - полное колличество ре! ксов, отснятых на дифрь.л'ометре,

й-уп = £ |1( <1>|/х ii ; йсг » е i -|?р| \/е |ут»i .

где 1| - интегральная интенсивность Асимметричного рефлекса, | Ррь| - амплитуд.-! структурного фактора производного кристалла, |Ур| - амплитуда структурю: фактора нативного кристалла.

3.2. Кристаллографические расчеты.

Расчетная часть работа выполнена на ЭВМ NORD-500 в основном по программам комплекса "BLANC", который создан в лаборатории структу-

pu йелка Института кристаллографии РАН А.А.Еагкным. Часть использованных в работе программ била созлада при участии Л.В.Малюшной, А.И.Рыскина, Т.Н.Сафоновой.

При первичной обрабо! <се экспериментальных данных осуществлялось введение поправок на поглощение по методу Нортса-Филипса, на фактор Лоренца, поляризацию и на радиационный распад (в случае наборов, отснятых на Sintex). Дг'Л^е производилась сортировка рефлексов в наборах по индексам, усреднение симметричных отражений (формула 1) и пересчет интенсивностей в амплитуда структурных факторов.

Приведение массипов экспериментальных данных к шкале нативного белка в комп. ксе "BLAMC" производится по алгоритму Вильсона, который предполагает изотропность коэффициента приведения. В hivjsm случае такое упрощенное шкалирование оказалось недостаточно эффективным, поскольку экспермента"ьные данные, собранные на дифрактометрах Syntex и КАРД имел! различающееся с/отематические ошибки.

Для осуществления анизотропного шкалирования программа "EGAL" (BLANC) была нами слегка модифицирована. Суть изменений сводилась к тому, что наборы данных разбивались на меныш'а части (50-300 рефлексов в зависимости от разрешения), кадс,ая из которых шкалиро-В"чась независимо. Шкалируемые области перекрывались, в этих местах шкальные факторы усреднялись. Диф,. жтометрические данные, отснятые На Sintex были анизотропно прошкалированы к нативному набору с КАРД. Оба кативных набора били впоследствии об" чинены, повторяющиеся рефлексы успеднялись со взвепиваняем (1). полнота суммарного набора Еозросла С о9£ (КАРД.33) ЛЯ 95% ,(ЗЯ).

Локализация мест связывания тяжелых атоуоч в ячейке ртутных производных проводилась по разностным синтезам Паттерсона (разрешение 4.2 А) с коэффициентам'.. |AF|2=| |?рь|-|Рр| |2, где |Ррь|"и !?Р| -модули структурных факторов кристаллов производного и нативного белка, соответственна, ранилъная производная расшифровывалась по разностны синтезам Фурье разреве;шьм с коэФГ.таентамн

Д?*егр(1аР)..В качестве ф13 структурных факторов аР использовались фазы, рассчитанные по и 1Ш.1Б-2 производным.

С-азы структурах ф'лтсрсь нативного кристалл.1, гассчитыЕались по алгор::гг«у &г:с!у-К;'::к:1, м. ■-.яанясыу Хендгжоснсн И Латмансм для

упрощения к:!.!0.':ц:р-ьа:-!;!л Заз.

Уточняет тяхглых U'fo/^E к&яспцпс-г-тоз заполнения.

позиционных и тешюп. . параметров, шкальных факторов) производилось иттеративно методом наименьших квадратов, а использованием фаз, полученных в предыдущем цикле уточнения, для расч'е' новых структурных факторов. Для уточнения использовались все рефлексы с |Р|>10 И фазы, рассчитать», но всем производным, с т>0.4 (т - фактор достоверности определения фаМ рефлекса). На-заключительных циклах уточнения изотропные температурные факторы тяжелых атомов ПХМБ-1 роизводного били заменены на анизотропные. Результаты - уточнена приведены в таблице 3. Средний фактор достоверности фаз, полученный о использованием уточненных параметров тяжелых атомов, для набора с разрешением ЗА, равнялся 0.57, 3-5Д - 0.62, 3.5А-31 - 0.49.

3.3. Построение синтеза электронной плотности, использование некристаллографической симметрии для уточнения фаз структурных факторов.

Синтез электронной плотности, рассчитанный по данным с разрешением ЗА и фазам, полученным методом изоморфных замещений, оказался

Таблица 3

Результаты уточнения параметров тяжелее атомов в кристаллах ФДГ

производное кол-во т.а. сг <РЬ> <Е> разрешение Д

ПХМБ-1 4 .142 1.05 1,00 54 3.5

ПХМБ-2 2 •Ц 1.69 1.10 60 3.5

Ш2Ас2 10 .15 1.90 1.15 59'. 3.5

Рефлексы с фактором достоверности фаз меньшим 0.4 в расчетах не использовались. й0г=е ||Урь|-|Ур||/ £ 1*4: <|*Ч> = (е 1*4"/ м]1'.2

^ ) г

К»=Е ||Врь|-|Ррк||1?рь|-|Рр||; <Е>=[е ||0Рь1-|Ррь||а/ л|1/а;

. |Рр|,|Р^| - экспериментальные амплитуды структурных факторов натив-ного и производного кристаллов: I|»|| - рассчитанные амплитуды структурных факторов производной и тяжелых атомов;|Е|-ошибка замкнутости фазового, треугольника.

столь низкого качества, что невозможно было дчжо однозяйчно определить границу молекулы. Поэтому было решено попытаться повысить качество синтеза за счет уточнения <у.аз, используя информацию о не-кристаллографиче^'сой симмег i/ии и' ограниченном объеме молекулы в кристаллографической ячейке.

Укладка молекул в ячейке определялась по синтезу электронной плотности низкого разрешения (5i) (рис.1,а). Функция вращения, рассчитанная по алгоритму ¡.роутера, выявила ориентацию оси симметрии молекулы относительно ребер ячейки. По некристаллогрчфически симметричным ртутным атсичм были рассчитаны трансляционные пярамерты втой оси. Hei чьзование информации о положении осей симметрии молекул в ячейке позволило правильно объе,;.,.нигь субъединицы в \'\лекуль (рис.1,6).

Для определения границы молекулы, уточнения параметров оси не-кристаллогрофическс симметрии и усреднения электродной плотности в молекуле использовался ряд написанных нами программ, а основу которых были положены алгоритмы, разработанные a.a. Вягиным для программы AVER. Электронная плотность с разрешением 4.2Ä переводилась систему "координат одной из молекул ячейки так, чтсо.} ось симметрии молекулы совпадала с осью Z систем« координат. Симметричные участки молекулы оказывались в одном сеччяи алектрс ниой плотности, что облегчало определение границы молекулы. Затем, минимизируя Haver-фактор (см. сноску к табл.4), уточнялись параметры оси некристаллографической симметрии. Результирующее зн.'; .гле этих параметров для одной из лолекул ячейки равняется: а=-б5.3°, ß=-65.7°, 7=45°, АХ=0.411»а, АУ=0.20 b, AZ^0.129*c , где а, ß и угль Зйлера, а, b, е - параметры кристаллографической ячейки.

Далее следовала процедура уточнения фаз, которая заключалась иттеративном повторении следующих операций.

1) Расчет синтеза п.-октронной плотности заданного разрешения.

2) Усреднение олоигрьюшх. плотностей субъединиц, связанных осы симметрии молекули.

■ 3) Размножение уореднеш-оЛ электронной плотности на независим»! часть элементарней ячейки; электронная плотность вне границ молекул задается рзй'лэЯ нулю.

4) Насчет структурных факторо-j. по модифицированной электронно! плотное, с помощью обратного преобразования Фурье.

Рис 1.(а).Участок динтеза электронной плотности ФДГ с разрешением 5д. (б). Упаковка молекул ФДГ в ячейке. Стрелкой указана ось молекулярной симметрии

Таблица 4

Ход уточнения фаз структурных факторов кристалла ФДГ на основе учета некристаллографичеексй симметрн.-.

Номер цикла Ra ver^ % Е <И> Rf, sí

0 0.57

1 59 4.5 . 0.80 18° 41

É 45 4.г 0.83 40°

3 39 3.9' 0.83 44° 34

4 38

фаза.

Ра ' - значеыя

<ш> - средний фактор достоверно л определения фаз, <?i рассчитанная после 1-го цикла уточнения. R¿v»r=£ |рг р2| / ¿ ра) , где ( электронной плотности в точках, связанных осыэ ьекристаллографи-ческой симметрии.

Rp = I IFo-lc,- í'Uol/EPl.o : Е = [е (Poaloj- Pino)2/!» j1/2.

где Poaioj- амплитуды структурных факторов, рассчитанные после усррчнепия и шкалированные к нативноыу набору. Fleo - амплитуды зтруктурних факторов нативного белка.

Расчет нового набора фаз путем перемножения распределений вероятности изоморфных фаз и колоколообразных распределений рассчитанных фаз с дисперсией, про гормональной расхождению между рассчитанными и экспериментальными структурными амплитудами. '

Уточнение фьз приводилось последовательно при разрешении 3.5А и ЗА. Синтез с разрешением 3.51 использовался для уточнения положения ос:и некристаллографической симметрии и границы молекулы. Параметру характеризующие лад заключительного уточнения фаз при разрешении ЗК,приведены в таблице 4.

По уточненным фа-=ям было построено два синтеза электронно плотности с разрешением ЗА в масштабе 2.5А/см и 1А/см. Первый ис пользовался для определения укладки ц л в молекуле ФДГ, о вторе для встраивания остатков в электронную плотность, при помом минн компаратора Ричардса и пластмассовых моделей аминокислот фирн Nikolson. Используя программу Даймо^а, по координатам реперных атс мов, полученных в комиарагоре, строилась модель белк;

Встраивание молекулы НАД не вызвало затруднений, однако ис азида надежно проидентифицировать не удалось. Возможно,это сьязано тем, что тяжелоатомные производные настаивались растворах, ï содержавших этот ион.

Предварительное кристаллографическое уточнение модели ФПГ, проведенное В.С.Ламзюшм и Б.С.Строкопытовым с использованием програмк OORELS и PROLSQ при разрешении ЗА, показало, что модель имеет удовлетворительное качество. Для данных между' ЮЛ и ЗА разрешенш и структурных факторов больше Ю R-фактор равнялся 27.1S6 при среднеквадратичном отклонении от идеальных длин связей равном 0.042А.

ГЛАВА 4. Структура формиатдегидрогеназы. Сравнение..'ФДГ о другими структурно изученными дегидрогеназами.

Молекула формкатде"идрогенази состоит из двух симметричны,-субъединиц, очень плотно упакованных в глобулу (рис.2). Расположение ьоех элементов вторичной структуры субъединиц ФДГ вдоль поли-пептидноЯ цепи приведено нг рисунке 3. Полипептидная цепь каждой ! субъединиц организована в глобулярную двухдоменную структуру. Дом! tiu дэгндрогензз-(в том числе и ФДГ) имеют определенное функционал: ное значение: од и прбммуйественчэ ответствен«! за связывание НА, другой определяет каталитический соолства фермента. В молекуле Ф.

Рис.2.Стереоизображение укладки цепи в молекуле ФДГ (тройной ■>мплекс ФДГ-НАД-азид).

1 АКУМУЬШ) РУРСУРКТУА йОШЧиШУ РСаОЮТРК АЮРТРСОП 50 ' 01 " (32) (33)

51 СБУПЕЬСГД КПЕЖНИ, УУгеВКСРР 5УРЕПЕТ,УЕА РУУГБОРРИР 100

сП 1)4 ' ' "' 35

101 АУЪТРНШК АШКШТА СТОБРНУтд вАЮИШУТА ЕУТУУМЭТвУ 150

(рб) ~~" 33 ""ей '

] АНГУУШШД 1УШГЬР5НЕ УУАККССиША РСУБНАУР1Е АМНУСТУААС 200 аК " 7Г оо (,!■)} {¡А

201 В1СЬАУЦШ. АРРРНУЬНУТ РШЛЖУК КЕШ7Г1ШТ ЕЕГМУРУСРУ 250

Ш ив ' (0Ю) ой ' 71

251 УТШС"ЧРЕ ТЕНМЮТЕТЬ К1,тСАУ1У №ГАМШ!№ ОдУШЮС 300

зр г к "" «Г"

301 МЛСУАЙРУИ РРОРАРКРНР ТОУМРУРСЫТ РН15СТТЫ'А СШШАСТЙЕ 350 ■ (ЗР аП Ц", • ~~аЗ

351 И^ЕСРРЕОИР ШОШЛУСЮ САистаАШУжрАтссз ЕЕА 393

(01 1-1 И

Рис.3.Вторичная структура суСъединицы ФДГ. Подчеркнуто:--

а-спираль, ■•• - ?-цепь; (¡¡) - участок цепи, имеющий развернутую кон;ормааию, но ке образугааиЯ 0-лист. .

структурную организации, аналогичную коферментсвязываювдам доменам других дегидрогеназ, имеет ближний к оси домен (рис.2, 4 и Ъ).

Коферментсвязывающий домен ФДГ условно моасно разделить на две функционально различающиеся части. Первая включает в себя а-спираль и длинную петлю (остатки 164-191), вытянутую вдоль молекулярной оси. Эти элементы образуют контакт с себе подобными и? другой субъеданицы. Вторая часть содержит значительно больший участок цеш: (192-332) и представляет собой собственно НАД-свя.:пвающий домен. Она имеет в своей основе левозакрученный (3-лист, состоящий из семи примерно параллельных /3-цепей. Угол поворота крайних р-цепей относительно друг друга равен приблизительно 90". Все 0-цепи соединены между собой а-спираляш, образуя семь повторяющихся ¿¡-а единиц. Эти элементы уложены в сверхвторичную структуру Россмана (рис.6) к представляют собой два мононуклеочидсвязывающих субдомена, соединенных петлей («8-спираль). Адекинсвязывающая часть (М-аВ-рВ-аС-рС) не имеет отклонений от канонической укладки НАД-связывающего домена дегидрогеназ, в то время как никотинамидная на один аС-/ЗС элемент длиннее. НАД-связывахщий домен дегидрогеназ имеет ось псевдосимметрии. 1роходящуи между 0А и р-слоями. Этот факт вместе с фактом отсутствия симметрии в НАД(Ф)-связывяюиих доменах других ферментов (например, дигид-рофолатредуктазы) служит аргументом в пользу гипотезы происхозадения данного домена дегидрогеназ сг? единого гена-предшественника. Дополнительные рй,ай и аА элементы в ФДГ, в рамках этой гипотезы, могут рассматриваться как возникшие позже за счет каталитического домена.

Коферментсвязыващий домен ФДГ. аналогично соответствующему домену АДГ, находится внутри полипептидной цеш (остатки 146-332). В ЛДГ ГАФД и МДГ этот домен расположен на Ы-конце ■цепи. Другим сходством с АДГ является пространственное положение доменов в молекуле и положение топологически консервативной у дегадрогеназ а-спирали (аА - в ФДГ) в аминокислотной последовательности. Тем но менее, несмотря на схожесть четвертичной организации, относительная ориентация и контакт симметричных субъединиц в втих ферментах принципиально различается. Другим фактом, отрицающим близкое родство АДГ и ФДГ, является различие организации каталитического детина и механизм:; действия (АДГ - металлозависимый Фйрмент).

Каталитический домен ФДГ условно можно разделить на 3 '"к'ти

Рис.4-Диаграмное представление ?уСъедишцы Указана ось симметрии молекулы.

молекулы ФДГ.

Рис.5.Стереоизображение конформации полилептидной цепи в субъединице ФДГ.

(рис.4). Первая, образованная остатками 9-59, представляет собой неупорядоченную петлю, охватывающую домен со стороны, удаленной от области связывания кофермента. Л-Концевая половина петли имеет обширный контакт с коферментсвязываххцим доменом противоположной субъединицы. Вторая часть каталитического домена более компактна и представляет собо*. пягицепочечный параллельный левозакпученный р-лисг, окруженный четырьмя а-спиралями. Топология этого участка (рис.6) напоминает топологию коферментсвязываюцего домена дегидро-геназ с тем отличием, что отсутствует рА-оВ элемент. В этом заключается принципиальное отличие каталитического домена ФДГ от других известных дегидрогеназ, где данный домен имеет в своей основе антипараллельный р-лист. И наконец, третья, С-концевая часть каталитического домен; представлена остатками 332-393, которые находятся вблизи с аденинсвязывающей областью противоположного домена.

Каталитические домены расположены на периферии молекулы ФДГ (рис.2). В центре находятся два коферментсвязывающих домена. Молекулярная ось проходит так, что соответствующие 0-цепи симметричных субъединиц попарно антипараллельни. Коферментсвязивающие домены на протяжении всей поверхности, обращенной друг к другу, иксот очень плотный контакт. Во взаимодействии участвуют оотат1си оА- и «В-спиралей, а также протяженная петля (остатки с 164 по 191). р-Листы каталитического и коферментсвязывающего доменов приблизительно антипараллельны.

Во всех НАД(Ф)-связывающих ферментах наблюдается определенный консерватизм во взаимодействии молекулы НАД с ферментом. ФДГ, в этом отношении, не является исключением. В связывании молекулы НАД преимущественно участвую, остатки коферментсвязываюцего домена, каталитический домен принимает участие в формировании активного центра вокруг никотинамидной части молекулы и закрывает ее от воздействия растворителя.

Молекула НАД имеет открытую конформацию, расстояние между центрами аденинового и никотинамидного колец составляет 14А (рис.7). Адешшовая часть молекулы ориентирована в раствор, никотинамидная часть заходит глубоко в щель между доменами. Аденияовязывающий карман коферментсвязывающего домена формируйся следующими участками цепи: Уа119" А1а199 (конец рА-цепи), Г)1г220-ни<223 (конец рВ-цеш), Ьеи254-ТЬг2б1 (петля, соединяющая и «Е). а9-спираль прикрывает

Рис.б.Диагрзшюе представление 'а) коферментс1Лзивающих доменов дегид^с 'еназ и (ь) N-концевой части каталитического домена ФДГ.

Н15332 Агд234

вход в активный центр со стороны каталитического домена. рА-Цепь короче на один остаток окружающих ее рВ и pD-цепей. В это'! полости формируется участок связывания адениновой рибозы. С 02.' атомом рибозы аналогично другим дегидрогеназам образует водородную связь Азр221, находящийся на С-конце рВ-цепи. Пирофосфатная часть молекулы НАД расположена вблизи от N-конца • вВ-спирали ч, по-видимому, образует водородные связи с азотами основной цепи. С кис-лородами аденинового фосфата образует связи Arg201, находящийся также на »В-спирали. Пирофосфат окружен со сторона каталитического домена остатками, соединяющими р8-цеиъ и «А-цепь, р7 и «4, а также оА-спирали. Адениновая часть НАД, включая фосфат, не защищена полностью от контакта с растворителем. Следует отметить, -что остатки каталитического домена, по-видимому, не имеют водородных' связей с адениновой частью кофермента. Область связывания никотинамиднрй части молекулы НАД образована участками цепи каталитического домена (Gln96-Phe98, Ala120-Ser124) и коферментсвязывающего домена (Glu141-ABn146, Cys255-Pro259, Asn281-Arg234,' Gly307-Val309, His332-Thr337).

Конформационные изменеш!я в дегидрогеназах имеют чзличный характер в зависимости от степени выраженности деления субъедгашцы на структурные домены. ФДГ имеет тот же тип организации субъединицы, что и АДГ из акулы. Им обоим присуще деление субъединицы на два глобулярных структурно-функциональных домена. В АДГ закрывание активного центра В процессе присоединения молекулы НАД достигается движением доменов, преимущественно - каталитических. Аналогичное поведение можно предположить и для ФДГ.

Для определения гомолог.ш остатков коферментсвязывающих доменов дегидрогеназ Россман и соавт. [4] выделили 26 остатков, занимающих топологически.сходные положения в Д-листах.' Эта процедура была нами повторена для ЛДГ, ВДГ, ГАФД и ФДГ, при втом удалось увеличить количество сходных остатков до 29. Среднеквадратичное отклонение в положении соответствующих Со атомов при совмещении р-листов дегид-рогеназ не превышает 1.2 А. Совмещенные по етам остаткам аминокислотные последовател! ¡-¡ости НАД-связывагацих участков дегидрогеназ демонстрируют наличие определенного количества консервативно?, остатков. Ря.яСц авторов [4,5] было выделено в 1Хферментсвязывающеы домене четыре остатка 01у и остаток Asp, занимающих сходные положе-

шя в последовательности й, как полагалось, необходимых для пра-шльного связывания молекулы НАД и для обеспечения укладки цент в аде петли Россмана. Анализ структур ФДГ и МДГ сократил количество :онсервативнцх остатков до 2 (Gly и Asp), остальные Gly могут быть вменены на остатки с небольшими jkobumm группами.

Для описания четвертичной структуры ЛДГ и ГАФД была предложена 4] прямоугольная система координат Р, Q, R, оси которой cobi. дают ! осями молекулярной симметрии в этих белках. Контакты между убъеданицами, порождаемые каждой из осей, ¿-тивилисъ им в соответ-твие. В молекуле МДГ взаимодействие еубъединиц аналогично -контакту молекулы ЛДГ. У ДДГ и ГАФД одинаковыми являются лишь -контакты, взаимодействие субъединиц АДГ отличается от любого из онтактов Р, а и R. В ФДГ кофесчентсвязывагацие домены '»тактируют еми же спиралями, которые участвуют в Q-контакте ЛДГ и ГАФД, но з-за различия в ориентации доменов характер взаимодействия при..финально различается. Тем не менее, анализ ориентации коферментсвя-ывакхцих доменов дегидрогеназ относительно осей Р, Q, и R молекулы ДГ позволил нам выявить некую общую закономерность организации етвертичной структуры дегидрогеичз, а именно: каждая пара НАД-вязцвою'А'Я доменов ГАФД, МДГ, AJiС и ФДГ ориентирована относительно воей оси симметрии так , что трансляцией в пространстве она может ать совмещена с одной из пар доменов ДДГ (рис.8). Для проверки гой гипотезы били совмещены р-листы НАД-связываодих доменов каадой з перечисленных дегидрогеназ с /(-листами соответствующих доменов 1Г ( использовались 29 экьу лентных Co-атомов). Отличия поверну-*f осей симметрии от осей Р, Q, R приведены в таблицах 5 и 6. гементарный расчет показывает, что вероятность случайного попада-W осей в 30° близость друг к другу одновременно для всех фермен->в ничтелно мала. Таким образом, можно зцмючить, что НАД-шзываодие домены ФДГ имеют Р-ориентацию относительно оси симмет-w, ЛДГ и МДГ - Q-ориентацию, А ГАФД и ЛДГ - все три.

Причина возникновения такой странной закономерности не поиггнв, «можно,она сьлззна с геометрическими характеристиками кофермент-(язывакадего домена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении диссертации кратко обобщены основные этапы гтрове-

- гг -

ЛДГ

ГАФД

6Г*

&

МДГ

$<1

ЛДГ ГАФД мышцы омара

мышцы акулы Р 0

Р 23 69 82

а 69 21 88

и 82 88 В

Рис.8 • Диаграмное предста вление ориентации субъеди ниц дегидрогеназ относи тельно осей Р, (ЗиЛ Стрелкой указаны (¡-листы А - адениновая часть НАД N - кикотинамидная часть.

ЛДГ акулы ГАФЯ В^еа^)!

Р 0 й РОЙ

ФДГ Реей!. 25 85 68 22 73 77

АДГ лошадь 84 28 63 80 33 39 ■

Таблица 5

Значения углов (град.) между молекулярными осями симметри ЛДГ и ГАФД при совмещении /3-листов их коферментсвязыба-щих доменов

Таблица 6

Значения углов (град.) между молекулярными осями симметрии димерных и тет-рамерных дегидрогеназ при сдамещешш р-листов их ко ферментовязывающих домик

денной работы, выделены наиболее интересные,с точки зрения автора, результаты исследования структуры ФДГ.

ВЫВОДЫ

Основные результаты работы, уложенные в диссертации, сводятся к следующему.

1). Получены тяжелоатомные производные кристаллов тройного кс лек-са НАД-азид-фДГ, изоморфные до разрешения :

2). Собраны наборы кристаллографических даиних для нативного и трех производных кристя"лов с разрешением около ЗА.

3). Расшифрованы фазы структурных факторов нативного кристалла й получен синтез электронной плотности, позволяющий построить атомную модель молекулы.

4). Определена укладка цепи в молекуле ФДГ и построена атомная модель тройного комплекса НАД-азид-ФДГ - аналога переходного состояния ферментативной реакции.

5). Проанализировано взаимодействие молекулы НАД с остатками активного центра, проведено сравнение особенностей связывания НАД в ФДГ с другими структурно изученными т,егидрогеназамл.

6). Прейдено сравнение структурной организации ФДГ о другими де-гидрогеназами, при этом выявлено:

а) коферментсвязывакхций домен ФДГ имеет в своей основе НАД-связинякщую часть, содержащую неискаженный канонический НАД-связынающий домен дегидрогеназ; принципиальным отличием здесь является дополнительный «р-эл< |т никотинамидсвязывающего субдомена

ЗДГ;

б) два глицина из пяти , ранее считавшихся консервативными в структуре коферментсвязывандих доменов дегидрогеназ, замещены на остатки, имею! • боковые группы;

в) каталитический домен ФДГ в отличие от соответствующих доменос других известных дегидрогеназ имеет в сбоей основе параллельный р-лист;

г) ФДГ имеет аналогичное АДГ расположение домрнов вдоль полипептидной цепи, доменную организацию, совпадающую с точностью до взаимного положения доменов в молекуле, однако., ориентация субъединиц относительно оси симметрии и группы, организующие контакт еубт.ег'.тгл, принципиально раз-гача^лия, различаются такяе топология кат9л;тг>1вг.'-

кмх доменов и природа каталитических групп ферментов; д) из анализа четвертичной структур« четырех различных дегидрогеназ, включая ФДГ, выявлена закономерность расположения коформент-связыващих доменов относительно осей симметрии молекул.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих статья;

1. Алешин А.Е-, Ламзин B.C., Деведхиев Я.Д., Рубинский C.B., Ilonof В.О., Егоров A.M., Арутюнян Э.Г..Березин И.В. Рентгеноструктур-ное исследование бактериальной НАД-зависимой формиатдегидрогеш зы при разрешении 5й.// Доклады Акад. наук СССР, -1987.-т.Р°1,N.4.-0.973-976.

2. Ламзин B.C., Алешин А.Е., Попов В.О., Арутюнян Э.Г. NAD-зависи мая формиатдегидрогенмза метилотрофных бактерий Paeudomonai sp.'101. II. Пространственная структура фермента при разрешеюп 3Î.// Биоорг.химия.-1990.-т.16,N3. -с.336-344.

3. Ламзин B.C., Алешин А.Е. .Шумилин И.А., Устинникова Т.В., Eropoj Ц.А., Арутюнян Э.Г, Попов В.О. MAD- зависимая формиатд'тидроге-наза метилотрсфцих бактерий Püemlomona« ер. 101. III. Сравнительный анализ.// Еиоорг.Х1шия.-1990.-т.'1б,ю.-с.33б-344.

4. Lamzin V.S., AleKhln А.Е., Str^kopytov B.V., Yuklmevioh M.fi. Popov V.O., Harutyunyari F П., Wilson К.S. Crystal atmeture о NAD-dependetit ionrale delist roijenase. // Eiir.J. Bioehem.-1992. -v.206.-p.441-45?.

Цитируемая литература

1. ürau U.M. Struotura] torarttlori wit Ii еп;'.упшв.-1п: The Pyridin Miusleotide Cowriymt-v. ( J. Kvei-ae «t al. ed.-) -New York-Ь >rulon А Л. Ггекк, 1982.-p. 135-187.

Ламзин B.C. Структура и механизм действия бактериальной форми йтдегидрогеназы. -Канд мое.-1986.-Москва.

3. Де&едашеи Я.Д., Мороз О.В., Арутюнян Э.Г., Ламзин B.C., Егоре A.M., Поиоь В.О., Березин И.В. Кристаллизация и предварительно рентгеноотруктурчоо исследование бактериальной форшатдегидрог назы.// Доклады лкадемии Наук СССР. 1986.-т.286,N3.-с.757-760

4. Ropamarv Ч. G., Liljaü A., Branden С.]., Вя^ча/.ак L.J. Evoii onaiy and ütruotural relat] ships' ainong .b*!hydrogi'naaes.-Tn

'he iînzymes. (P.D. Зоуег ei. ) -New York: Acad. Press.,1975.-.XT.-p.61.-102.

Ilerervçi R.K.. Ter, Лга P., Hol W.G.J. Prediction or the iccurrence of the ADP-Mnding j?a/î-fold in proteins using an mino add sequence fingerprint //J.Mol.Biol.-1986.-v. 187. -p. 101-107.

PTII IEÍ-K-, зак.694, тир .100, уч. -изд. л. I ; 29/1У.-1992г. Бесплатно