Роль элементов 23S pРНК в формировании сайтов связывания тРНК на рибосоме Escherichia coli и в процессе транслокации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ЛЕСНЯК Дмитрий Витальевич

РОЛЬ ЭЛЕМЕНТОВ 23S рРНК В ФОРМИРОВАНИИ САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ тРНК НА РИБОСОМЕ Escherichia coli И В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛОКАЦИИ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических иаук

lililí

ООЗ158633

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова и в Институте Молекулярной Генетики им М Планка, Берлин, Германия

Научные руководители кандидат химических наук,

доцент

Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Гарбер Мария Борисовна, кандидат химических наук, ст н сотр Хомутов Алексей Радиевич

Ведущая организация Институт Биоорганической Химии им

ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, г Москва

Защита состоится 23 октября 2007 г В 16 00 на заседании диссертационного совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им MB Ломоносова по адресу 199992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомив в библиотеке Химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 21 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Рибосома является сложной молекулярной машиной рибонуклеопротеидной природы В ходе трансляции она осуществляет биосинтез белка, перекодируя информацию нуклеотидной последовательности мРНК в первичную структуру полипептидных цепей В качестве субстратов этой реакции используются аа-тРНК, и на разных этапах цикла трансляции с рибосомой взаимодействуют различные белки-факторы трансляции, расходуется энергия GTP, происходят постоянные изменения конформации рибосомных субчастиц Ключевую роль в этих процессах играет рРНК Роль отдельных ее элементов в процессе связывания тРНК, перемещения ее в рибосоме и в диссоциации комплекса тРНК с рибосомой и мРНК интенсивно изучается Рибосома имеет три участка связывания тРНК А, Р и Е, каждый из которых образован малой и большой субчастицами Известны конкретные нуклеотидные остатки, важные для формирования сайтов связывания тРНК и ее транслокации, но данных об их структурно-функциональной роли накоплено немного В данной работе была изучена роль двух нуклеотидных остатков этой группы - С2394 и G2061 23S рРНК, входящих в состав пептидилтрансферазного центра, в цикле трансляции Цель работы

1 Изучить свойства E-сайта рибосомы с помощью сайт-направленного мутагенеза 23 S рРНК,

2 Выяснить, каким образом эффективность связывания тРНК с E-сайтом влияет на точность трансляции, на взаимодействие рибосомы с EF-G и на прохождение транслокации,

3 Определить, каким образом мутация C2394G влияет на формирование РЖ-гибридного сайта связывания тРНК рибосомами,

4 Выяснить роль нуклеотида G2061 в процессе транслокации и в работе пептидилтрансферазного центра

Научная новизна и практическая значимость работы В ходе работы были получены варианты рибосом, несущих мутации в 23S рРНК C2394G и G2061C Первая мутация привела к сильному снижению жизнеспособности клеток, вторая оказалась летальной Фенотипы данных мутаций исследованы т vivo и детально охарактеризованы т vitro Изучение функционирования рибосом, несущих мутацию C2394G, позволило понять роль связывания тРНК с E-сайтом рибосомы в трансляции и, в частности, в функционировании фактора элонгации G Тем с?мым были разрешены многие противоречия, более десяти лет существовавшие в научной литературе Показана

важность формирования Р/Е-гибридного сайта связывания тРНК для стимуляции ОТРазной активности EF-G В ходе экспериментов т vivo с применением репортерных конструкций с генами р-галактозидазы выяснилось, что мутация C2394G вызывает повышение частоты ошибочного прочтения стоп-кодонов и вызывает сдвиг рамки считывания Таким образом, впервые экспериментально показано, что E-сайт участвует в поддержании рамки считывания в процессе трансляции в живой клетке

Планируя введение мутации G2061C в 23 S рРНК, мы исходили из структуры комплекса 50S субчастицы с аналогами пептидил-тРНК, и предполагали, что роль этого высококонсервативного нуклеотида состоит во взаимодействии с пептидной группой пептидил-тРНК Это взаимодействие, возможно, обеспечивает более высокое, чем для аминоацил-тРНК, сродство пептидил-тРНК к Р-сайту, что, в свою очередь, важно для обеспечения направленности транслокации В ходе экспериментов на очищенных препаратах рибосом роль G2061 в обеспечении селективности Р-сайта к пептидил-тРНК не была обнаружена, поэтому мы прибегли к постадийному анализу эффективности функционирования рибосом, несущих мутацию G2061C Выяснилось, что замена G2061C приводит к угнетению пуромициновой реакции мутантных рибосом, изменяет аффинность рибосом к Phe-rPHKphe и нарушает взаиморасположение нескольких нуклеотидных остатков, расположенных в пептидилтрансферазном центре рибосомы Также в ходе работы впервые показано, что нуклеотидный остаток G206I необходим для взаимодействия рибосомы с белком RMF в условиях стресса

Для выяснения роли G2061 была создана тестовая система пошаговой трансляции с контролем всех этапов, включая стадию терминации Для ее проверки использовали антибиотики, влияющие на различные этапы работы рибосомы Выяснилось, что, используя эту систему, можно тестировать механизм действия неизученных ингибиторов биосинтеза белка, в одном тесте определяя стадию цикла трансляции, ингибируемую антибиотиком С учетом того, что среди известных антибиотиков большая доля действует именно на рибосому, создание тестовой системы ингибиторов трансляции может иметь важное практическое значение для поиска и проверки новых антибиотиков

Апробация работы Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им Ломоносова, на семинарах лаборатории Ниерхауса AG Ribosomen Института молекулярной генетики Макса Планка, Берлин, I ермания, докладывали на конференциях HHMI Meeting of International Research Scholars Ashburn,

VA, США Сентябрь 26-29, 2006, 21st tRNA WORKSHOP, Бангалор, Индия Декабрь 2-7, 2005, RNA 2006 The eleventh annual meeting of the RNA society Университет Вашингтона, Сиэтл, Вашингтон, июнь 20-25,2006

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы Материал иллюстрирован 27 рисунками и 7 таблицами Библиографический указатель включает 132 цитированных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В пептидилтрансферазном центре G2061 занимает важное место Он формирует водородную связь с А2451, нуклеотидом, важным для образования пептидной связи рибосомой, очевидно участвуя в формировании третичной структуры каталитического центра Кроме того, он расположен у входа в йептидный тоннель Если рассмотреть кристаллическую структуру претранслокационного и постгранслокационного рибосомных комплексов, можно предположить, что G2061 может непосредственно вовлекать растущую пептидную цепь в пептидный тоннель, помогая белку принять конформацию а-спирали Это следует из того обстоятельства, что кислород карбонильной группы, присоединенной ко второму аминокислотному остатку претранслокационного комплекса и к первому - постгранслокационного находится на расстоянии 2,8 А от экзоциклической аминогруппы G2061, и между ними весьма вероятно образование водородной связи Для молекулы воды там недостаточно места, и компенсировать потерю водородной связи другим способом нельзя

G2061 находится в стэкинге с С2063, который также высоко консервативен С2063 формирует водородную связь с А2450, также стабилизируя третичную структуру пептидилтрансферазного центра Учитывая все эти структурные данные, можно предположить, что рибосомы, содержащие мутации G2061, будут дефектны в синтезе белка, и, возможно, не смогут дискриминировать при прямом связывании с Р-сайтом аминоацил-тРНК и пептидил-тРНК Это бы прямо указало на участие этого нуклеотида в направлении растущего пептида в тоннель путем фиксации его конформации

Роль нуклеотида С2394 в функционировании Е-сайта предполагали давно Он формирует неканоническую водородную связь с 3'-концевым аденозином тРНК,

транслоцированной из Р-сайта Связывание деацилированной тРНК защищает этот нуклеотид от модификации Образование водородной связи между деацилированной тРНК и E-сайтом на большой субчастице должно влиять на образование Р/Е-гибридного сайта, и, следовательно, это взаимодействие может быть важно для транслокации Чтобы выявить функции нуклеотидов С2394 и G206!, мы ввели мутации в рРНК и протестировали полученные штаммы ги vivo и выделенные мутантные рибосомы in vitro

1. Исследование Е-сайга на большой субчастице

В нашей работе мы заменили С2394 на в в 23в рРНК Экспрессия рДНК, содержащей мутацию, при полном отсутствии в клетке рибосом дикого типа привела к замедленному росту клеточной культуры Время удвоения клеток в среде ЬВ при 37°С увеличилось с 85±2 мин до 103±2 мин При 30°С рост мутан итого штамма практически не детектировался

1.1 Проверка связывания тРНК с нарушенным Е-сайтом

Связывание тРНК с Е-сайтом которых впервые было обнаружено

5 10 15 30 25

Избыток ТРНК над рибосомами

Рисунок I Связывание деацилированной тРНК№ с рибосомами С23940 График показывает число связанных моче кул тРНКр е в зависимости от избытка тРНКи,е А - рибосомы дикого типа, В - мутантные рибосомы Кривые подписаны в зависимости от испочьзованной тРНК и наличия полиО

рибосомы было проверено в тех же условиях, в наличие Е-сайта Аналогичными были схема эксперимента и буфер реакции, содержащий полиамины Для титрования рибосом тРНК использовали программированные рибосомы, и рибосомы без мРНК Для тестов выбрали тРНКР1к, в качестве мРНК использовали полии Степень связывания тРНК определяли путем фильтрования смесей тРНК и рибосом через нитроцеллюлозныи фильтр, который >"5 задерживает свободную тРНК, но задерживает комплекс тРНК-рибосома В качестве отрицательного контроля использовали тРНК, не содержащую 3'-концевого аденозина, поскольку ранее было показано, что она не способна к связыванию в Е-сайт Результаты эксперимента показаны на рисунке 1

Как и ожидалось, рибосомы дикого типа, запрограммированные полии, связывают до трех молекул деацилированной тРНКр'"с В наших экспериментах не удалось достичь связывания трех молекул, точная цифра составила 2,5 Это объясняется низкой аффинностью А-сайта рибосомы к деацилированной тРНК Отсутствие 3'-концевого аденозина уменьшает число связанных молекул TPHKphc рибосомами дикого типа до двух (точное значение 1,8) В отсутствие мРНК связывается только 1 молекула тРНК (1,0) Из данных литературы известно, что в таких условиях связывание происходит с Р-сайтом Рибосомы, несущие мутацию C2394G, показали способность связать только две молекулы тРНКРЬе (предположительно в Р- и в А-сайты) Кривые связывания полноразмерной тРНКРЬе и тРНК№е без А76 для мутантных рибосом практически совпали Принимая во внимание неспособность контрольной тРНК связываться с Е-сайтом рибосомы, мы сделали вывод о том, что введенная мутация специфически повлияла на способность рибосом связывать тРНК в Е-сайт

Далее мы измерили способность рибосом к прямому связыванию тРНК в Е-сайт по другой схеме Рибосомы программировали аналогом природной мРНК, содержащей последовательность Шайн-Дальгарно и стартовый кодон, за которым следовал кодон UUC, узнающийся тРНК?Ье К программированным рибосомам добавляли AcPhe- тРНКРЬе (аналог пептидил-тРНК, обладающий хорошим сродством к Р-сайту рибосомы) Таким образом, стартовый AUG кодон оказывался в Е-сайте Результаты, показанные в таблице, демонстрируют, что мутация C2394G нарушила способность рибосом к связыванию TpjjjjfMet в Е-сайт Степень связывания 11%, которую удалось детектировать, по-видимому, обусловлена взаимодействием тРНКшя с рибосомами, Р-сайт которых не был заполнен AcPhe- тРНКР1к

Таблица 1 Прямое связывание тРНКШс' в Е-сайт MF-программированных рибосом

тип добавленной тРНК Количество тРНК, связавшейся с рибосомой

WT рибосомы C2394G рибосомы

AcPhe-тРНК™ (Р-сайт) тРНКмм (Е-сайт) AcPhe-TPHK™ (Р-сайт) тРНК (Е-сайт)

АсРЬе-тРНК™ 0,77±0,04 0,95±0,06

АсРЬе-тРНК1Ье+ TPHKfMet 0,76±0,03 0,44±0,05 0,91±0,06 0,11 ±0,03

1.2. Влияние нарушения связывания тРНК с Е-сайтом на элонгационный

цикл

Рибосом и с мутацией C2394G были проверены in vitro на их способность формировать различные функциональные комплексы, соответствующие отдельным стадиям элонгации. Для этого использовали мРНК, кодирующую пептид состава Mh~K. набор соответствующих тРНК и факторов элонгагши. Каждый сформированный функциональный комплекс был охарактеризован несколькими путями. Во-первых, связывание тРНК проверяли путем фильтрации через Нитроне л дю ночные фильтры. Повтор ых, положение тРНК на рибосоме контролировали методом тоупринтов, В третьих, использовали химическую

модификацию комплекса рибосомы с тРНК, что позволило не только независимым путем оценить степень связывания тРНК, но и различить, связана ли тРНК с Р/Р- или Р/Е-сайтами.

На первой стадии рибосомы, программированные МРК-мРНК, инкубировали

а

$0 ^oni-mgawauauacc »ib ti9 .и ,¡4 îuocîiïs^liîc.iiorii и f к

в m СОЧИ

12 3 4 12 3 4

шнг' -- мим i

■m* +22 +24

Рисунок 2. Пошаговая трансляция МРК-мРНК. А - участок мРНК с обозиаченними пощшпо! тоупринтов, ста[т>вым колоном и последовательностью Шайк-Далъгарно в -- радиоавтограф геля после электрофореза кДНК, полученной путеу тоупрннт-апалита, 1 комплекс рибосом, -чР11К к тРНК™". 2 - комплекс состава рибосома, мРНК, тРНК™". АсРЬе-тРНК'1"-. ,1 - комплекс состава 2 после добавления К:--1;*С": IV 4 - комплекс состава 3 после добавления ЕР-Тт^-тРНК^'ОТУ,

с деацилированной тР11К'Ме1( меченой ИР.

Уровень связывания составил 82% (таблица 2) для мутантных рибосом и рибосом дикого типа. Главное отличие рибосом, несущих мутацию C2394G от рибосом дикого типа на этой стадии было обнаружено с помощью химической модификации оснований 23S рРИК (рисунок 3). Рибосомы дикого типа связывали тРНК™" в гибридный Р/Е -сайт. Характерные для Е-сайта защиты нуклеотндов G2! 12, G2116 составили 23±3%, Основание U2585, зашита от модификации которого наблюдается при занятом Р-сайте, осталось незащищенным. Мукнсотндные остатки мутантных рибосом модифицировались с измененной эффективностью. Здесь основания, специфичные для Р-сайта, оказались защищены от модификации при связывании деацидированной

TPHK¡Ma í3Srt3u/o защихы). защиТ1 специфичных для E-сайта, напротив, найдено не было. Это показывает, что формирование Р/Е-гибридного сайта мутантными рибосомами нарушено.

После заполнения Р-сайта tPHKwm, в A-сайт связывали AcPhe-TPHKíbe Это приводило к появлению характеристичной второй полосы на тоупринтах (рисунок 2) Полоса не так ярко выражена, как обычно в аналогичных экспериментах, вследствие используемой системы буферов Будучи оптимальной для связывания тРНК с Е-сайтом, она не является благоприятной для связывания тРНК в A-сайт in vitro Тем не менее, функциональные комплексы с двумя тРНК, связанными в Р- и в A-сайты удалось получить, и метод футпринтов убедительно продемонстрировал, что на рибосомах дикого типа тРНК связаны в А/Р и Р/Е гибридных состояниях, а на мутантных рибосомах - А/А и Р/Р Защита основания U2585, характерная для занятого Р-сайта, была детектирована на обоих вариантах рибосом, защита A-сайта на малой субчастице (основание А1408), подтверждает связывание тРНК в A-сайт, которое мы видели в экспериментах по тоупринт-анализу И, наконец, защита оснований G2112 и G2116, специфичных для занятого E-сайта рибосомы, практически не видна для мутантных рибосом, и ярко выражена для рибосом дикого типа, что отвечает образованию на этой стадии гибридных А/Р и Р/Е сайтов

Таблица 2 Доля деацилированной тРНКМй, оставшаяся связанной с рибосомой на различных стадиях пошаговой трансляции МРК-мРНК

Стадия трансляции Количество тРНК™", связанной с рибосомой

WT рибосомы C2394G рибосомы

Связывание тРНК,мм с Р-сайтом 0,82±0,01 0,83±0,1

Связывание AcPhe-TPHK™5 с А-сайтом 0,76±0,03 0,69±0,05

EF-G*GTP транслокация 0,7±0,1 00,45±0,08

Lys-TPHKLys*EF-Tu*GTP связывание с А-сайтом 0,45±0,05 0,4±0,04

После связывания второй тРНК мы индуцировали транслокацию добавлением ЕР-С*ОТР Транслокация АсРЬе-тРНК?Ье из А-сайта в Р-сайт не вызвала высвобождения деацилированной тРНКШй на рибосомах дикого типа, но на рибосомах с мутацией С2394С количество высвобожденной тРНКШЙ было эквивалентно количеству транслоцированных тРНК Деацилированная тРНК, оставшаяся связанной с рибосомами, осталась связанной с Р-сайтом, как показано тоупринтами и футпринтами Рибосомы дикого типа после транслокации сохраняют деацилированную тРНК в Е-сайте Из этих результатов нельзя исключить, что деацилированная тРНК не может быть транслоцирована в Е-сайт мутантных рибосом, но, по крайней мере, убедительно видно, что она не может быть там стабильно удержана

После первого шага транс локации in vitro, в А-сайт была добавлена Lys--Tu'GTV. Поскольку в реакционной tMCCH уже присутствовал EF-G, после транспептидадаи немедленно произошла транс локация. Деацилированная тРНК№| на рибосомах дикого типа диссоциировала из комплекса с рибосомой. Мутантные рибосомы на этой стадии не теряли деацияиро ванной тРНК,м<1. Это говорит о том, что диссоциация

тРНК из Е сайта произошла на

UVT С 2394 G

ACGU КК1 2 341 2 34

* -- i-: й -

G2116

WT C2394G |ACGU КК12 3412 34

HU2585

J*" у' ' ••

WT C2394G ftCGUKK12 3412 34

• . .-г.-

-«A1408

предыдущей стадии, а тРНК. оставшаяся связанной с рибосомами, находится и Р сайте рибосом, не связавших AcPhe-

Из приведенных экспериментов можно сделать несколько выводов об отличиях между рибосомами дикого типа и рибосомами с мутацией С2394G в особенностях функционирования.

Например, очевидно, что транс локация, катализируемая EF-G, и для тех, и для других проходит достаточно эффективно. Второй раунд транслокации уже заметно отличается для рибосом дикого типа и рибосом с мутацией C2394G. Для рибосом дикого типа первый раунд прошел с эффективностью 66%, а второй - 6f¡%, Для мутантных рибосом первый раунд был так же эффективен (69%), по второй - заметно менее эффективен (43%). Колее того, для мутантных рибосом после добавления Lys-tPHKLïs*EF -Tu*GTP воспроизводимо появлялся дополнительный сигнал тоупринтов. Он соответствовал неправильно транс лоцированной тРНК. со сдвигом рамки в +2 положение.

Рисунок 3, Радиоавтограф геля после электрофореза продуктов обратной транскрипции на матрице рРНК после химической модификации. Номера дорожек соответствуют функциональным комплексам: !, Рибосомы без добавления тРНК н мРНК, 2, Рибосомы с добавленными MFK-mPHK h тРНКл<с\ 3. Рибосомы с добавленными MFK-mPHK, тРНКШе4. АсРЬе-тРИК11*, 4 Рибосомы с добавленными MFK.-мРНК, тРНК™*, АсРНе-тРНК"4, EF-G*GTP. А, Ст G. U соответствуют сиквенсным дорожкам, К -немодифициро ванной рРНК. А модификация кстоксалем, Б - СМСТ, В диметилсульфатом.

1.3. Влияние нарушения формирования гибридных сайтов, вызванное мутацией C2394G, на функционирование EF-G

Любая современная модель элонгации подразумевает, что связывание тРНК в Е-сайт неотъемлемо сопутствует транслокации. Это подтверждают эксперименты, а которых транслокацвя заметно ухудшается при использовании производных тРНК, не способных к связыванию в Е-сайт, Мы проверили способность EF-G связываться с рибосомами, в которых Е-сайт был нарушен с помощью мутации C2394G Использовали как рибосомы без дигшдсв., так и претраншжатокйиый комплекс мутантных рибосом следующего состава: MFK-программиро ванные рибосомы, fMet-TPHKfMei + Fhe-TFHKn". Комплекс EF-G с рибосомами стабилизировали, используя негидролизуемый аналог GTP - GDPNP, либо фусидовую кислоту.

EF-G связывался со всеми исследованными комплексами рибосом. Связывание EF-G с рибосомами, несущими мутацию C2394G, во всех комплексах было слегка слабее, чем с рибосомами дикого типа, но эффект оказался незначительным (10-20% разницы в степени модификации соответствующих нуклеотидов). Мы решили проверить, насколько разные рибосом ные комплексы способны стимулироватъ С'ГРазпую активность этого фактора. Особенно нас интересовал вопрос, будет ли деацилированная тРНК, связанная с Р-сайтом мутантных рибосом, стимулировать гидролиз GTP .

Стимуляцию G'1'Разной активности EF-G комплексами рибосом дикого типа с тРНК удалось обнаружить в полном соответствии с литературными данными (рисунок 5). Рибосом ы без тРНК стимулировали гидролиз GTP фактором G гораздо менее эффективно, чем комплекс рибосом, мРНК и деацилированной тРНК. То, что мутантные рибосомы отличались по степени гидролиза от рибосом дикого типа, вероятно, объясняется найденными

WT C2394G

А С G U К 5 4 3 2 1 К 54321

I '»Ч •ч 4 " чмоат ztssz

—

** т.

ИТ C;3S4G

АС 6 U К 5 4 3 г \ К 5 4 3 2 1

"Ш -■5 V - - ttit"

Рисунок 4. Взаимодействие РР-С! с мутантнымм рибосомами; анализ с помощью химической модификации рибосом ди метши)::: ::: ]:А, С, С, и - сиквснсиые дорожки, К ~ немодпфнциронапиая рРНК. I. Рибосомы без добавления литандон, 2. \1FK-МГ'НК. [Мсг-тРКК"'" РЬе-тРНК^'ЕР-Ти'ОТР, ЕР-0*ШРРМР. 3. рибосомы, МРК-мРНК, ¡МеРтРНК™". РЬе-тРНК^'ЕР-РиЧУГР. Рг СОТР, фуендопая кислота. 4. рибосомы, ЕР-0*0МРР>(Р. 5. рибосомы, ЕР-С>*{ГП\ фусидовая кислота.

небольшими нарушениями в связывании ЕБ-О Главное, что удалось обнаружить, - это отсутствие стимуляции гидролиза ОТР комптексом деацилированной тРНК с рибосомами, несущими мутацию С2394С

Если вернуться к результатам применения химического пробинга, то можно вспомнить, что рибосомы с мутацией С2394 3 оказались неспособны формировать Р/Е гибридныи сайт связывания деацилированной тРНК По всей видимости, отсутствие стимуляции мяогораундового гидролиза вТР, который мы наблюдали в случае связывания деацилированной тРНК, происходит вследствие нарушения формирования Р/Е гибридного сайта

и -5 Q-

sfe „

Время, мин

WT+rPHK

,2394G+tPHK ^ ¿2394G / WT

ln количества EF-G, фмоль

Рисунок 5 Стимуляция вТРазной активности фактора EF-G различными рибосомнычи комплексами

1.4. Проверка влияния мутации C2394G на частоту ошибок трансляции m vivo

С помощью пошаговой трансляции нам удалось показать нарушения транслокации тРНК, происходящие вследствие замены C2394G23S рРНК Чтобы проверить, будет ли наблюдаться увеличение частоты сдвига рамки считывания, вызванное мутацией C2394G w vivo, мы использовали серию репортерных конструкций, основанных на экспрессии Р-галактозидазы Каждая плазмида в использованной серии (кроме pSG25, которую использовали как контроль) содержит мутацию в гене lacZ, которая приводит к синтезу неактивного белка, если трансляция идет без ошибок Активный фермент может быть синтезирован в результате сдвига рамки счшывания или ошибочного прочтения стоп-кодона, компенсирующих мутации в ДНК

Таблица 3 Изучение влияния мутации C2394G 23S рРНК на частоту ошибок трансляции irt vivo

Тестовая плазмида Тип ошибки трансляции Рибосомы дикого типа Рибосомы, несущие мутацию C2394G

pSG 853 Прочтение кодона UAA 2 2 ± 0 6 7 3 ± 0 6

pSG 12-6 Прочтение кодона UAG 7 ± 0 4 12± 0 5

pSG 3/4 Прочтение кодона UGA 43 ±2 64 ± 3

pSG 1ас7 +1 сдвиг рамки считывания 41 ±2 74 ±4

pSG 12DP -1 сдвиг рамки считывания 44 ±2 84 ± 5

f CSH 103 замена Glu на Gin 06±0 1 06±0 1

pSG25 Контроль, нет ошибки 4280 ±70 5990 ± 80

Значения даны в единицах р-галактозидазной активности Миллера Чем выше значение, тем больше частота ошибки данного типа

Мутация C2394G привела к повышению «частоты прочтения стоп-кодонов, как смысловых и сдвига рамки считывания С другой стороны, частота ошибок декодирования смысловых кодонов осталась без изменений Синтез фермента, закодированного без мутаций на контрольной плазмиде в мутантном штамме также оказался повышен Повышенная частота прочтения стоп-кодонов и сдвиг рамки считывания в -1 сторону Значительно превышали в наших экспериментах общее увеличение уровня трансляции, что мы связываем со специфическим результатом введенной мутации Следует отметить, что, несмотря на давние предположения о важности роли E-сайта в поддержании рамки считывания, до этого никому не удалось показать это в эксперименте т vivo, так что наши данные можно рассматривать как первое свидетельство того, что связывание тРНК в Е-сайт действительно помогает поддерживать точность трансляции

2. Изучение структурно-функциональной роли нуклеотида G2061 23S рРНК

Попытка получения штамма AVS69009, в котором плазмида pStr25-G2061C, содержащая мутацию G2061C в ггпВ опероне, служит единственным источником рРНК, не привела к каким-либо жизнеспособным клеткам Таким образом, мутация G2061C оказалась летальной. При трансформации штамма XL1 плазмидой pStr25-G2061C, в результате которой в клетке образуются как рибосомы дикого типа, так и мутантные, колонии клеток наблюдались Их рост был сильно замедлен по сравнению с клетками,

которые трансформировали плазмидой pStr25, не содержащей мутации нуклеотида G2061 Скорость роста в жидкой культуре оказалась так же значительно меньше (время удвоения 75±3 минуты в штамме с мутшшгой G2061C конструкцией против 45±3 минуты в штамме с аналогичной плазмидой без мутации) Таким образом, было показано, что мутац"я G2061C рецессивно детальна

Рибосомы, содержащие данную мутацию и стрептавидин-связываюший аптаме^, были получены в виде чистых препаратов с помощью аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе и протестированы in vitro В контрольных экспериментах использовали рибосомы, выделенные параллельно, экспрессированные с плазмиды pStr25, не содержащей мутации

2.1 Изучение связывания тРНК рибосомами, несущими мутацию G2061C

Нуклеотид G2061 расположен у входа в пептидный тоннель и может участвовать в дискриминации аминоацил-тРНК и пептидил-тРНК Это подразумевает участие этого нуклеотида в направлении растущего пептида в тоннель путем фиксации ею конформации Чтобы это проверить, мы измерили константы связывания Phe-TPHKphe и NAcPhe-tRNAplK с мутантными рибосомами Ацетилированная по аминогруппе аминокислотного остатка РЬе-тРНКр,ю является аналогом пептидил-тРНК, и в качестве

Для измерения

связывания мы титровали рибосомы в присутствии и в отсутствие полиуридиловой кислоты избытком тРНК Линеаризация по Скэтчаргу (количество молекул тРНК, связавшееся с одной рибосомой', отнесенное к концентрации несвязанной тРНК против количества связавшихся

молекул тРНК) позволила подсчитать константы

ассоциации тРНК с рибосомой Графики линеаризации

несвязанной Ti-tm

такого аналога давно применяется в тестах in vitro Д g

Рисунок б Связывание тРНК с рибосомами С2061С Серыми обозначены кривые, полученные для мутантных рибосом, черных — для рибосом дикого типа Линеаризация по Скэтчарду А Комплексы рибосом, АсРЬе-тРНК1''" и полии, Б комплексы рибосом, АсРЬе-тРНКРЬе, В комплексы рибосом, РЬе-тРШС"" и полиХ], Г комплексы рибосом, РЬе-тРНКга° По оси абсцисс отложено число молекул тРНК, связавшихся с рибосомой, по оси ординат - количество молекул тРНК, связавшееся с одной рибосомой отнесенное к концентрации

представлены на рисунке б Полученные константы представлены в таблице 4

Сравнение полученных констант показывает, что исходная гипотеза оказалось не верна В результате мутации рибосомы не перестали отличать аминоацил-тРНК от аналога пептидил-тРНК при связывании с Р-сайтом Разница в константах между разными типами рибосом в связывании НАсР11е-ЖМАИ1е практически незаметна С другой стороны, между рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию 02061С, наблюдается почти двукратная разница в связывании РЬе-ИШАр1к, особенно выраженная в отсутствие мРНК

Таблица 4 Константы связывания тРНК с рибосомами 02061С

Связываемые лиганды Ка \УТ рибосом Ка С2061С рибосом

РЬе-тРНК№е 33,2=С2,8*10"7М 75,5±5,2*10"?М

НАсРЬе-1ШАр1к 21,57±2,5*10~7М 19,57±2,3*10 7М

РЬе-тРНК№с, полии 6,15±0 71*10"7М 6,64=с0,73*10"7М

МАсРЬе-1БадАР1,е, полии 1,76±0,2*10"?М 2,35±0,14*10~7М

2.2 Тестирование эффективности пептидил грансферазной реакции для рибосом, несущих мутацию С2061С

Мутация С2061С затрагивает район пептидилтрансферазно1 о центра Известно, что данный нуклеотид формирует водородные связи с А2451, 2'-ОН рибозы которого предположительно участвует в катализе реакции переноса пептида Введенная мутация вполне могла повлиять на взаиморасположение и контакты оснований в пептидилтрансферазном центре

Стандартным способом тестирования пептидилтранссреразной реакции является

пуромициновая реакция Для проведения этой реакции мы образовали комплекс рибосом с полиуридиловой кислотой и КАсРЬе-1КЫАРЬе, и затем добавляли к этому комплексу пуромицин в возрастающих концентрациях Затем экстрагировали полученные эфиры и измерили радиоактивность экстрактов

1 ов1 2 __. т

£ 05-

5 04

о.

; оз-

£

< 02 -о —• егоб1С

5 0 12 0 50 100 '50 200

Концентрация пуромицина мкМ

Рисунок 7 Пуромициновая реакция рибосом 02061С Зависимость скорости реакции от концентрации пуромицина

Резуль гаты пуромициновой реакции показаны на рисунке 7

Оказалось, пептидичтрансферазная реакция с пуромицином, катализируемая рибосомами, содержащими мутацию 02061С, сильно ингибирована Но пуромицин не является природным субстратом рибосомы, и полученные результаты необходимо было воспроизвести и уточнить, используя аминоацил-тРНК, аналогичные природным Реакцию синтеза дипептидов проводили следующим образом Используя синтетическую мРНК, содержащую последовательность Шайн-Дальгарно, формировали инициаторный комплекс, затем добавляли тройной комплекс ЕР-Ти*РЬе-тРНК№е*ОТР Через пять минут реакционную смесь обрабатывали фенолом, хлороформом, экстрагировали и осаждали РНК После осаждения РНК гидролизовали щелочью, и продукты реакции анализировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии В тех фракциях, где количество меченого формилметионина совпадало с количеством меченого фенилаланина, считали количество синтезированного дипептида

Анализ образования дипептида показал (рисунок 8), что оба типа рибосом, 02061С и дикого типа, одинаково эффективно способны образовывать пептидную связь на природных субстратах рибосомы £Ме1-тРНКМй и РЬю-тРИК^

Во всех изученных реакциях рассчитывали эффективность образования инициаторного комплекса, с участием факторов инициации и без них, и оказалось, что комплекс образуется одинаково эффективно Выход комплекса в случае фактор-зависимой инициации обычно составлял 65-75%

Пуромициновая реакция,

катализируемая рибосомами дикого типа всегда шла с хорошим количественным выходом, а в случае рибосом с 02061С практ ически

отсутствовала С другой стороны с помощью этих экспериментов показано, что с

Рисунок 8 Распределение радиоактивных меток формилметионина и фенилаланина в хроматографических фракциях По оси ординат - удельные активности аминокислот В двенадцатой фракции удельные активности совпадают, что свидетельствует о том, что детектируемый продукт состоит из равных количеств обеих аминокислот, то есть, является искомым дипептидом

природными субстратами рибосоме пептидилтраноферйная реакция проходит одинаков Эффективно для рибосом дикого типа и рибосом с мутацией G2061C. Это можно объяснит], тем. что молекула пуромицина из-за своих размеров образует гораздо меньше контактов с рибосомой, чем полноразмеряая амшощнл-тРНК. ¡щгфоршция rPJJîf подвержена строго обусловленным изменениям в процессе элонгадиоиного цикла. Обеспечиваемым обеими су б частицами. Нарушение копформации

пептид и л-трансферами ого центра может не сказаться на связывавши изучаемым ампноацил-гРНК. участвующие в переносе пептида. Ич взаимодействие с рибосимой стабилизировано большим количеством других взаимодействий, из-за которых тРНК позиционируются более эффективно, чем пуромнцин. Для молекулы пуромицина, с другой стороны, введенные мутацией G2061С нарушения структуры цептидилтрансферадног о центра могут оказаться критичными.

2.3. Исследован и е структуры комплексов рибосом, несущих мутацию G 2061С с тРНК в А- и Р-сайтах с помощью химической модификации

Чтобы оценить, как мутаций ■ G206IC сказалась на структуре

пептидилтранеферазного центра, мы применили метод химической модификации. Нас

интересовали изменения в районе пептидилтранеферазного центра и защиты от

химической модификации нуклеотндов рРНК, находящихся в контакте с тРНК.

В экспериментах использовали рибосомы без тРНК, инициаторный компле. с

рибосом с мРНК и одной fMet-

тР1Ж,-Мс\ и комплекс

рибосомы с двумя тРНК после

переноса пептида.

Обобщенные результаты этих

экспериментов представлены

на рисунке 9. Можно сделать

вывод, что образование всех

видов комплексов прошло

эффективно, наблюдаются

характеристичные защиты

нуклеотндов от химичссксч

модификации. Например,

Рисунок 9. Радиоавтографы электрофиреза кДНК, л слученной после хорошо выражены защиты А-

химической модификации комплексов тРНК с рибосомами ликого типа и

рибосомами, несущими мутацию Ci2061 С. 11редстявлены фрагменты

гелей, соответствующие отучаемым основаниям. Во нсеч дорожках

суммарную радиоактивность перед электрофорезом выраьнивалн.

гзгттт гггаш!-ттттгггв шш

АШЬс-ЯНЩ^Г ^ <

51кг

!1»

lejcn-

l

% ¿fc ШМ*

s m---OJOE

— := —=

Il-

7 8 9 wt

î г з 4 s e ю n t2 G206i4

Схемг. flopQiKOf.iL!l[Al[Cl(Gl M ¡Mut) jno jRNAl RMefl Pliai

сайта на малой субчастице (нуклеотиды А1492, А1493, G530, U531 16S рРНК) Мож"о наблюдать характерные защиты оснований рРНК в А-сайте уже после добавления первой тРНК, связывающейся в Р-сайт Э~-и нуклеотиды, вероятно, защищает IF1, который м_л использовали для образования инициаторного комплекса Связывание инициаторной тРНК защищает от химической модификации G2252 и G2253 23 S рРНК - основания, находящиеся в Р-саите большой субчастице В некоторой степени уже связывание первой тРНК приводит к защите оснований G2112, G2116, С2394, расположенных в Е-сайте Эти защиты усиливаются после добавления второй тРНК, после переноса пептида Нуклеотид А2602 мутантной 23S рРНК, в отсутствие добавленных тРНК модифицируется слабее, чем в комплексе тРНК с рибосомой Вероятно, это вызвано конформационными изменениями, произошедшими вследствие мутации Вообще, структурные отличия мутантных рибосом G2061C от рибосом дикого типа можно наблюдать только в пептидилтрансферазном центре

Обращает на себя внимание модификация основания А2451 В рибосомах без добавленной тРНК он модифицируется одинаково у дикого типа и у рибосом с мутацией G2061C Добавление первой fMet-TPHKfMet не меняет характер ею метилирования диметилсульфатом Но в случае добавления второй тРНК в случае рибосом дикого типа видна защита на 70%, а мутаншые рибосомы остаются модифицированными в той же степени, что и без тРНК

Применение чимичсскои модификации рРНК в составе рибосом выявило отсутствие значительных нарушений, вызванных мутацией в характере связывания тРНК и в структуре пептидилтрансферазного центра Наблюдаемые изменения могут оказывав какое-либо локальное действие, но едва ли с их помощью можно объяснить летальный фенотип, вызванный мутацией

2.4. Создание пошаговой системы для определения эффективности отдельных этапов цикла трансляции т vitro

Для подробного тестирования эффективности различных сгадий трансляции мы усовершенствовали систему пошаговой трансляции in vitro Была синтезирована мРНК, содержащая последовательность Шайн-Дальгарно, стартовый AUG кодон, за которым следуют 10 ко донов A AG, узнающихся TPHKLys, затем кодон для тРНКр|1С и нонсенс-кодон, узнаваемый фактором герминации 2 В реакции использовали ту же систему очищенных компонентов, что и ранее Для начала мы показали, что известные ингибиторы трансляции гигромицин Ь и неомицин оказывают действие на трансляцию в

нашей Системе (рисунок 10). В качестве проверочного шпибиотйка. мы использовагч олигомицин, активность котор<>1 о /я \4tro еще не показана.

На радиоавтографе видно, что образование пнициаторного комплекса н комплекса рибосомы с двумя тРНК приводит к останпккам обратной транскриптазы, похожим на те, что мы наблюдали ранее. Добавлений смеси факторов элонгации вьаывает смешение Вогнала тоуггривта на 30 нуклеотвдов (10 ко допои). После добавления Рйе-тРНКг|,е, появляется сигнал тоупринта, соответствуюIднй Прочтению П колонов мРНК. Теперь в А-сайте находится стоп-кодон, и добавление КР'2, КРЗ и ИЯГ приводит к

диссоциации комплекса на су б частицы рибосомы, мРНК, деацилиро ванную ¡РНК к додекапептид состава МК. щР.

Гигромицнн Б. как и другие аминогликоэиды, действует на малую субчастицу рибосомы. В наших эксперимент было получено новое

подтверждение. что сч действует на рибосому не ¡[а стадии связывания гРПК, а на стадии траислокации. На рисунке 10 видно, как во время элонгации рибосома задерживается на каждом кодоне. 1ак и не завершив синтез. Добавление неомиципа, также относящегося к аминогликозидум, в нашем Эксперименте нарушает связывание тРНК с Р-сайтом рибосомы, препятствуя образованию ишщпачорного комплекса, что снижает эффективность всех н&слсдуюших стадий трансляции м \ntro, и приводит к усилению синтеза полноразмерной кД VI К" обратной транскринтазой.

Таким образом, н наших руках оказалась система для тестирования всех базовых реакций трансляции й г//гв. С ее помощью можно эффективно обнаружить стадию, на которой происходит иигибиронание синтеза белка. Мы повторили приведенные эксперименты с использованием рибосом, несущих мутацию 020б!С. Результата представлены на рисунке 11.

Рисунок \ 0. Радиоавтограф зяектрофор^ча Ж после экспериментов с Пошагово!: трансляцией в арнсутсгашэ■ нбиотикчг!

Как видно, никакого выраженного влияние на отдельные стадии трансляции in vitro мутация G2061C не окачивает. Снизывание тРНк'. элонгация, терминация - вес проходят одинаково эффективно по сравнению с рибосомами дикого типа. Нет разницы, использовать для диссоциации поеттермминашгошюго комплекса 1F3 или RF3 па рибосомах дикого типа и на рибосомах, содержащих мутацию G2061C.

2.5. Изучение влияние мутации С2061С tin функционирование фактора модуляции рибосом

Фактор модуляции рибосом - Ribosome modulating factor (RMF) - небольшой (55 аминокислотных остатков) белок, впервые обнаружений! во фракции 1 OOS частиц, выделенных из клеток Е. coli. вмращенйЫХ до стационарной фазы. Очищенный бе.чок показал способность димернзовать 70S рибосомные частицы с образованием 1 OOS частиц in vitro. Образование рибосом ных димеров, неактивных в синтезе белка, в стационарной фазе роста бактериальной культуры, связали с инактивацией рибосом с целью их консервации. Кроме стационарной фазы, RMF оказывает протекторное действие на рибосомвт в условиях теплового шока. Делеция этого белка из генома не оказывает летального действия.

RMF связывается с рибосомами в районе пепти дилтрансферазного центра. Он образует сшивки с белками L2, L.13, S13 и защищает от модификации димстилсульфатом нуклеотиды А2058, А2059, А2062. С2394, А245 ]. Эти нуклеотиды являются важнейшие :i элементами пентидилтране^еразного центра, и, более тога, непосредственно окружают

район мутации G2061C, которую мы ввели в рРНК, и которая вызвала летальный фенотип. В связи с данным обстоятельством мы

решили проверить,

повлияла ли мутация G2061C на

функционирование RMF.

Wt G2061C

IMeMRNA"*-' + + + + + + +j+i * +

Lye-tRNA^'cF-Tu + + + + T [ + * +

Ftw-tRNA'T" + + + + + +

EF-G'GTP + + + + v + T

RF2*RF3+RRP»CTP + +

RFi ♦ IF3+ RRF +GTP . J__ + +

# я —■:D ^Imrait i rf-HK t A-1. F'aiiti

КвиЯЛтХ ПКГЩ VW*»*.*! ад Iii pbcw

—

Рисунок П. РадиоавтогЩф элолрофореза кДНК после экспериментав с пошаговой трансляцией ил рибосомах с чпчациен G206IC с добавлением 1F3 или KU

Для начала мы измерили скорость роста при 42°С штаммов РОР2136 дикого типа, РОР2136 с плазмидой pStr25-G2061C и штамма с де котированным RMF (ARMF) На рисунке 25 представлены кривые роста этих трех штаммов Мутантные рибосомы, даже при экспрессии на фоне рибосом дикого типа, вызывают видимое уменьшение скорости роста клеток Интересно при этом, что рост колоний в тех же условиях (LB, 42°С) у того же штамма не отмечался, из чего мы впервые сделали вывод о летальности мутации То есть оказалось, что клетки способны многократно делиться в этих условиях, но неспособны вырасти в виде колоний Это проверяли дополнительно, путем длительною культивирования (LB, 42°С) с последовательными пересевами в свежую среду

Наконец, штамм ARMF также продемонстрировал более раннее наступление стационарной фазы роста культуры с соответствующим замедлением скорости удвоения, хоть этот эффект и не был так же ярко выражен, как у штамма РОР2136 pSti 25-G2061С

Для анализа димеризации рибосом мы собирали клетки в различных стадиях роста культуры, разрушали их в буфере с 20 мМ Mg2+, при котором рибосомные комплексы стабильны, и анализировали методом ультрацентрифугирования в чрадиенте плотности сахарозы Схема профилей градиентов показана на рисунке 13 Видно, как при выходе кривой роста на плато клетки дикого типа демонстрируют постепенное > величение фракции тяжелых 100S частиц и постепенное уменьшение фракции 70S рибосом По этому признаку оба исследуемых штамма РОР2136 pStr25-G2061C и ARMF показали одинаковые эффекты, состоящие в почном нарушении формирования тяжелых 100S частиц

Мы показали, чго отсутствие RMF in vivo вызывает сходное действие на рибосомные частицы, что и мутация G2061C Чтобы подтвердить это явление т vitro, мы сделали футпринтинг RMF в районе пептидилтрансферазного центра Эти эксперименты подтвердили связывание RMF с пептидилтрансферазным центром рибосом дикого типа, что характеризовалось защитами оснований А2058, А2059, А2062, А1918, А1927, А1936 от химической модификации при связывании этого белка Также выяснилось, что

ООО 1 12 2 24 3 36 4 48

Время инкубации

Рисунок 12 Кривые роста в жидкой среде штамма с делегированным геном 11МР, штамма с индукцией экспрессии гена рРНК несущем мутацию 0206! С, и штамма дикого типа По оси абсцисс отложено время инкубации

WT

G206 ¡ С ARMF

0,9

1,0

Asno

Рисунок 13 Схема распределения рнбосомных частиц после ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы Показана зависимость формирования ЮОБ рибосомных димеров от оптической плотности культуры клеток, которую использовали для выделения рибосом Оптическая плотность нормализована к штамму дикого типа, поскольку штамм, экспрессиругоиий рибосомы с мутацией С2061С, ранее входит в аационарную фазу роста

IJl CE «irim VtTWTMUrMUT

м ц г» к

• с:

-A2Q62

Sv-Sí'i

я x ti

Рисунок 14 Радиоавтографы электрофореза кДНК, полученной после химической модификации комплексов 1ШР с рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию 02061С Представлен фрагмент г та, соответствующий изучаемым основаниям Во всех дорожках суммарную радиоактивность перед электрофорезом выравнивали и, А, С в соответствуют линиям секвенирования, ит -немодифицированной рРНК

добавление КМР к рибосомам, содержащим мутацию 02061С, вызьшает увеличение реакционной способности большинства из перечисленных оснований, таким образом, ясно свидетельствуя об изменении его обычного характера связывания (рисунок 14)

Роль нуклеотида 02061 238 рРНК в работе рибосомы, таким образом, представляется довольно разнообразной Являясь частью наружной группы оснований, образующих пептидилтрансферазный центр, он может оказывать влияние на связывание тРНК, на скорость переноса пептида, участвова гь в поддержании конформации пептидилтрансферазного центра, а также необходим для активности белка 1ШР з сохранении рибосом в условиях стресса

ВЫВОДЫ

1 Мутация С2394в 23Б рРНК нарушает связывание деацилированной тРНК с Е- и Р/Е-сайтами рибосомы

2 Отсутствие стабильного связывания тРНК с Е- и Р/Е-сайтами рибосомы приводит к увеличению частоты сдвига рамки считывания и прочтения стоп-кодонов как смысловых

3 Связывание тРНК с гибридным Р/Е-сайтом рибосомы необходимо для стимуляции ОТРазной активности EF-G

4 Мутация G2061C 23 S рРНК летальна Она вызывает ухудшение связывания Phe-тРНКр1м с рибосомой, ингибирует пептидилтрансферазную реакцию с пуромицином и приводит к изменению конформации пептидилтрансферазного центра

5 Нуклеотид G2061 23S рРНК необходим для функциональной активности белка RMF

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бураковекий Д Е, Смирнова А С, Лесняк Д В , Кипарисов С В , Леонов А А, Сергиев П В , Богданов А А, Донцова О А Взаимодействие спиралей 89 и 91 23 S рибосомной РНК Escherichia coh способствует функционированию IF2, но не важно для работы факторов элонгации Молекулярная биология (2007), том 41, X» б, стр 241252

2 Sergiev PV, Lesnyak DV, Kiparisov SV, Burakovsky DE, Leonov AA, Bogdanov AA, Bnmacombe R, Dontsova OA Function of the ribosomal E-site a mutagenesis study Nucleic Acids Res 2005 Oct 20,33(18) 6048-56 ,

3 Sergiev PV, Lesnyak DV, Burakovsky DE, Kiparisov SV, Leonov AA, Bogdanov AA, Bnmacombe R, Dontsova OA Alteration in location of a conserved GTPase-associated center of the nbosome induced by mutagenesis influences the structure of peptidyltransferase center and activity of elongation factor G J Biol Chem 2005 Sep 9,280(36) 31882-9

4 P V Sergiev, D V Lesnyak, D E Burakovsky, S V Kiparisov, A A Leonov, A A Bogdanov and О A Dontsova Communication between functional centers of the nbosome RNA-protein interactions The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protem Interactions", August 19-24, 2006 Russian Academy of Sciences, Moscow

5 Sergiev P V., Lesnyak D V, Kipansov S V, Burakovsky D V, Bogdanov A A, Dontsova О A Function of Ribosomal E-site Effect of C2394G Substitution m the 23S rRNA of the Escherichia coli 21st tRNA WORKSHOP, Bangalore, India December 2-7,2005

6 Petr Sergiev, Dmitry Lesnyak, Dmitry Burakovsky, Sergey Kiparisov, Andrei Leonov, Alexey Bogdanov, Olga Dontsova Communication between the nbosomal P- and E-sites and elongation factor binding sites RNA 2006 The eleventh annual meeting of the RNA society University of Washington, Seattle, Washington June 20-25, 2006

Подписано в печать 15 09 2007 Формат 60x88 1/16 Объем 1 5 п л Тираж 100 экз Заказ № 694 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура 70S частиц Escherichia сои.

1.2. Связывание тРНК с рибосомой.

1.3. Расположение молекул тРНК в различных функциональных состояниях рибосомы.

1.3.1. А/Т положение тРНК.

1.3.2. А/А положение тРНК.

1.3.3. Р/Р положение тРНК па рибосоме.

1.3.4. Е/Е-положение тРНК на рибосоме.

1.4. Изменение конформации тРНК во время элонгационного цикла.

1.5. Гибридные сайты связывания тРНК.

1.6. Исследования динамики тРНК на рибосомах методом флуоресцентного резонансного переноса энергии.

1.7. Структура рибосомы при гибридном положении тРНК.

1.8. Эволюция представлений о структуре и функции Е-сайта.

1.9. Обратная транслокация тРНК.

Рибосома - сложная молекулярная машина рибонуклеопротеидной природы. В клетках всех живых существ она отвечает за синтез белка. Процесс биосинтеза белка занимает центральное место в молекулярной биологии, и история его изучения насчитывает уже более половины столетия. За это время значительно возросли возможности исследователей, умножились знания во всех областях науки, ускорились средства получения и обработки экспериментальных данных, но количество работ, посвященных изучению работы рибосомы, только возрастает. В рибосомологии осталось много загадок.

Одной из наиболее интригующих тайн является транслокация мРНК и тРНК на рибосоме. Это активный, динамичный процесс, для понимания которого мало знать атомарную структуру рибосомы и ее комплексов с мРНК и тРНК. Необходимы глубокие структурно-функциональные исследования, воспроизведение промежуточных стадий процесса in vitro и их изучение, выяснение роли отдельных элементов всего молекулярного ансамбля в транслокации.

В настоящей работе мы изучали свойства Е-сайта рибосомы с помощью сайт-направленного мутагенеза, а также выясняли роль малоизученного участка пептидилтрансферазного центра в цикле трансляции. Нами были сделаны две точечные замены в 23 S рибосомной РНК, которые оказали серьезное влияние на жизнеспособность мутантных штаммов Escherichia coli. Мутации были нацелены на заранее определенные этапы процесса транслокации. Одна из введенных мутаций привела к сильному снижению жизнеспособности клеток, вторая оказалась летальной. Работа посвящена изучению отдельных стадий функционирования рибосомы, которые оказались нарушены в результате данного мутагенеза. Основные эксперименты сделаны in vitro на очищенных компонентах аппарата трансляции. Обзор литературы посвящен положениям тРНК на рибосоме на различных этапах элонгационного цикла и рассмотрению современных моделей транслокации мРНК и тРНК на рибосоме.

1. Обзор литературы

4. Выводы

1. Мутация С2394в 23Б рРНК нарушает связывание деацилированной тРНК с Е- и Р/Е-сайтами рибосомы.

2. Отсутствие стабильного связывания тРНК с Е- и Р/Е-сайтами рибосомы приводит к увеличению частоты сдвига рамки считывания и прочтения стоп-кодонов как смысловых.

3. Связывание тРНК с гибридным Р/Е-сайтом рибосомы необходимо для стимуляции СТРазной активности ЕР-в.

4. Мутация в2061С 23Б рРНК летальна. Она приводит к изменению константы связывания РЬе-тРНКРЬс с рибосомой, ингибирует пептидилтрансферазную реакцию с пуромицином и приводит к изменению конформации пептидилтрансферазного центра.

5. Нуклеотид в2061 23Б рРНК необходим для функциональной активности белка ЯМЕ.

1. Cech, T.R., A.J. Zaug, and P.J. Grabowski, In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. Cell, 1981. 27: p. 487-496.

2. Noller, H.F., Ribosomal RNA and translation. 1991.60: p. 191-227.

3. Doty, P., et al., Secondary structure of ribonucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1959. 51: p. 1134.

4. Hansen, J.L., et al., Progress toward an understanding of the structure and enzymatic mechanism of the large ribosomal subunit. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2001. 66: p. 33-42.

5. Ban, N., et al., A 9 A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit. Cell, 1998. 93: p. 1105-1115.

6. Ban, N., et al., Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal submit. Nature, 1999. 400(6747): p. 841-847.

7. Ban, N., et al., The complete atomic structure of the large ribosomal submit at 2.4 A resolution. Science, 2000.289(5481): p. 905-920.

8. Klein, D.J., et al., The kink-turn: a new RNA secondary structure motif. Embo J, 2001. 20(15): p. 4214-21.

9. Tamura, M. and S.R. Holbrook, Sequence and structural conservation in RNA ribose zippers. J Mol Biol, 2002. 320(3): p. 455-74.

10. Ban, N., et al., The complete atomic structure of the large ribosomal submit at 2.4 A resolution. Science, 2000.289(5481): p. 905-20.

11. Mueller, F., et al., The 3D arrangement of the 23 S and 5 S rRNA in the Escherichia coli 50 S ribosomal submit based on a cryo-electron microscopic reconstruction at 7.5 A resolution. J Mol Biol, 2000. 298(1): p. 35-59.

12. Frank, J., et al., A model of the translational apparatus based on a three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli ribosome. Biochem. Cell Biol., 1995. 73(11-12): p. 757-765.

13. Baram, D. and A. Yonath, From peptide-bond formation to cotranslational folding: dynamic, regulatory and evolutionary aspects. FEBS Lett, 2005. 579(4): p. 948-54.

14. Gilbert, R.J., et al., Three-dimensional structures of translating ribosomes by Cryo-EM. Mol Cell, 2004.14(1): p. 57-66.

15. Lu, J. and C. Deutsch, Folding zones inside the ribosomal exit tunnel. Nat Struct Mol Biol, 2005.12(12): p. 1123-9.

16. Voss, N.R., et al., The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J Mol Biol, 2006. 360(4): p. 893-906.

17. Cate, J.H., et al., X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science, 1999.285(5436): p. 2095-104.

18. Sergiev, P.V., et al., The conserved A-site finger of the 23S rRNA: just one of the intersubunit bridges or a part of the allosteric communication pathway? J Mol Biol, 2005. 353(1): p. 116-23.

19. Selmer, M., et al., Structure of the 70S Ribosome Complexed with mRNA and tRNA. Science, 2006(313): p. 1935-1942.

20. Kaminishi, T., et al., A snapshot of the 30S ribosomal subunit capturing mRNA via the Shine-Dalgarno interaction. Structure, 2007.15(3): p. 289-97.

21. Zavialov, A.V. and M. Ehrenberg, Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors. Cell, 2003.114(1): p. 113-122.

22. Selmer, M., et al., Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science, 2006.313(5795): p. 1935-42.

23. Schillingbartetzko, S., et al., Apparent Association Constants of Transfer-Rnas for the Ribosomal A-Site, P-Site, and E-Site. Journal of Biological Chemistry, 1992. 267(7): p. 4693-4702.

24. Wurmbach, P. and K.H. Nierhaus, Codon-anticodon interaction at the ribosomal P (peptidyl-tRNA)site. Proc Natl Acad Sci USA, 1979. 76(5): p. 2143-7.

25. Samaha, R.R., R. Green, and H.F. Noller, A base pair between tRNA and 23S rRNA in the peptidyl transferase centre of the ribosome. Nature, 1995.377(6547): p. 309-14.

26. Kim, D.F. and R. Green, Base-pairing between 23S rRNA and tRNA in the ribosomal A site. Mol Cell, 1999.4(5): p. 859-64.

27. Virumae, K., et al., Functional importance of the 3'-terminal adenosine of tRNA in ribosomal translation. J Biol Chem, 2002.277(27): p. 24128-34.

28. Valle, M., et al., Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy Nat. Struct. Biol., 2003.10(11): p. 899-906.

29. Valle, M., et al., Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J., 2002.21(13): p. 3557-3567.

30. Swart, G.M.W. and A. Parmeggiani, Effects of the mutation glycin-222 -> aspartic acid on the functions of elongation factor Tu. Biochemistry, 1987. 26: p. 2047-2054.

31. Vorstenbosch, E., et al., The G222 mutation in elongation factor Tu inhibits the codon-induced conformational changes leading to GTPase activation on the ribosome. EMBO J., 1996.15: p. 6166-611 A.

32. Pape, T., W. Wintermeyer, and M.V. Rodnina, Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. EMBO J., 1998.17(24): p. 7490-7497.

33. Rodnina, M.V., et al., Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J.Biol.Chem., 1996. 271(2): p. 646652.

34. Yusupov, M.M., et al., Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science, 2001. 292(5518): p. 883-96.

35. Lodmell, J.S. and A.E. Dahlberg, A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science, 1997. 277(5330): p. 12621267.

36. Ogle, J.M., et al., Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal submit. Science, 2001. 292(5518): p. 897-902.

37. Abdi, N.M. and K. Fredrick, Contribution of 16S rRNA nucleotides forming the 30S submit A andP sites to translation in Escherichia coli. Rna,2005.11(11): p. 1624-32.

38. Ashraf, S.S., R. Guenther, and P.F. Agris, Orientation of the tRNA anticodon in the ribosomal P-site: quantitative footprinting with U33-modified, anticodon stem and loop domains. RNA, 1999. 5(9): p. 1191-9.

39. Lancaster, L. and H.F. Noller, Involvement of 16S rRNA nucleotides G1338 and A1339 in discrimination of initiator tRNA. Mol Cell, 2005.20(4): p. 623-32.

40. Bashan, A., et al., Structural basis of the ribosomal machinery for peptide bond formation, translocation, and nascent chain progression. 2003.11(1): p. 91-102.

41. Moazed, D. and H.F. Noller, Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites. Cell, 1989. 57(4): p. 585-97.

42. Semenkov, Y.P., M.V. Rodnina, and W. Wintermeyer, The "allosteric three-site model" of elongation cannot be confirmed in a well-defined ribosome system from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996. 93(22): p. 12183-12188.

43. Döring, T., et al., The decoding region of 16S RNA; a cross-linking study of the ribosomal A, P and E sites using tRNA derivatized at position 32 in the anticodon loop. Embo J, 1994. 13(11): p. 2677-85.

44. Feinberg, J.S. and S. Joseph, Identification of molecular interactions between P-site tRNA and the ribosome essential for translocation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001. 98: p. 11120-11125.

45. Lill, R., J.M. Robertson, and W. Wintermeyer, Binding of the 3'-terminus of tRNA to 23S rRNA in the ribosomal exit site actively promotes translocation. EMBO J., 1989. 8: p. 39333938.

46. Schmeing, T.M., P.B. Moore, and T.A. Steitz, Structures of deacylated tRNA mimics bound to the E site of the large ribosomal subunit. RNA, 2003.9(11): p. 1345-1352.

47. Pan, D., et al., Rapid ribosomal translocation depends on the conserved 18-55 base pair in P-site transfer RNA. Nat Struct Mol Biol, 2006.13(4): p. 354-9.

48. Cochella, L. and R. Green, An active role for tRNA in decoding beyond codon:anticodon pairing Science, 2005.308: p. 1123-1124.

49. Vacher, J. and R.H. Buckingham, Effect of photochemical crosslink S4U(8)-C(13) on suppressor activity of su+ tRNATrpfrom Escherichia coli. J Mol Biol, 1979.129(2): p. 28794.

50. Bretscher, M.S., Translocation in protein synthesis: a hybrid structure model. Nature, 1968. 218(5142): p. 675-7.

51. Moazed, D. and H.F. Noller, Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature, 1989.342(6246): p. 142-8.

52. Agrawal, R.K., et al., Effect of buffer conditions on the position of tRNA on the 70 S ribosome as visualized by cryoelectron microscopy. J. Biol. Chem., 1999. 274: p. 87238729.

53. Taylor, D.J., et al., Structures of modified eEF2 80S ribosome complexes reveal the role of GTP hydrolysis in translocation. Embo J, 2007. 26(9): p. 2421-31.

54. Valle, M., et al., Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell, 2003. 114(1): p. 123134.

55. Allen, G.S. and J. Frank, Structural insights on the translation initiation complex: ghosts of a universal initiation complex. Molecular Microbiology, 2007.4(63): p. 941-950.

56. Sharma, D., D.R. Southworth, and R. Green, EF-G-independent reactivity of a pre-translocation-state ribosome complex with the aminoacyl tRNA substrate puromycin supports an intermediate (hybrid) state of tRNA binding. RNA, 2004.10(1): p. 102-113.

57. Ermolenko, D.N., et al., The antibiotic viomycin traps the ribosome in an intermediate state of translocation. Nat Struct Mol Biol, 2007.14(6): p. 493-7.

58. Dorner, S., et al., The hybrid state of tRNA binding is an authentic translation elongation intermediate. Nat Struct Mol Biol, 2006.13(3): p. 234-41.

59. Spiegel, P.C., D.N. Ermolenko, and H. Noller, Elongation factor G stabilizes the hybridstate conformation of the 70S ribosome. RNA, 2007(13): p. 1-10.

60. Blanchard, S.C., et al., tRNA dynamics on the ribosome during translation. 2004. 101(35): p. 12893-12898.

61. Munro, J.B., et al., Identification of two distinct hybrid state intermediates on the ribosome. Mol Cell, 2007.25(4): p. 505-17.

62. Pan, D., S.V. Kirillov, and B.S. Cooperman, Kinetically competent intermediates in the translocation step of protein synthesis. Mol Cell, 2007. 25(4): p. 519-29.

63. Borowski, C., M.V. Rodnina, and W. Wintermeyer, Truncated elongation factor G lacking the G domain promotes translocation of the 3' end but not of the anticodon domain of peptidyl-tRNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1996.93(9): p. 4202-6.

64. Frank, J. and R.K. Agrawal, A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature, 2000.406(6793): p. 318-322.

65. Gao, H., et al., Study of the Structural Dynamics of the E. coli 70S Ribosome Using RealSpace Refinement. Cell, 2003.113(6): p. 789-801.

66. Allen, G.S., et al., The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell, 2005.121(5): p. 703-12.

67. Klaholz, B.P., A.G. Myasnikov, and M. Van Heel, Visualization of release factor 3 on the ribosome during termination of protein synthesis. Nature, 2004. 427(6977): p. 862-865.

68. Gao, N., et al., Mechanism for the disassembly of the posttermination complex inferred from cryo-EM studies. Mol Cell, 2005.18(6): p. 663-74.

69. Ermolenko, D.N., et al., Observation of Inter subunit Movement of the Ribosome in Solution Using FRET. J Mol Biol, 2007.370(3): p. 530-40.

70. Korostelev, A., et al., Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell, 2006.126(6): p. 1065-77.

71. Davydova, E.K. and L.P. Ovchinnikov, ADP-ribosylated elongation factor 2 (ADP-ribosyl-EF-2) is unable to promote translocation within the ribosome. FEBS Lett, 1990. 261(2): p. 350-2.

72. Schuwirth, B.S., et al., Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science, 2005.310(5749): p. 827-34.

73. Rheinberger, H.J., H. Sternbach, and K.H. Nierhaus, Three tRNA binding sites on Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981. 78: p. 5310-5314.

74. Robertson, J.M. and W. Wintermeyer, Mechanism of ribosomal translocation. tRNA binds transiently to an exit site before leaving the ribosome during translocation. J. Mol. Biol., 1987.196: p. 525-540.

75. Chinali, G. and A. Parmeggiani, Differential modulation of the elongation-factor-G GTPase activity by tRNA bound to the ribosomal A-site or P-site. Eur. J. Biochem., 1982. 125: p. 415-421.

76. Nagel, K. and J. Voigt, Regulation of the uncoupled GTPase activity of elongation factor G (EF-G) by the conformations of the ribosomal subunits. Biochim. Biophys. Acta., 1993. 1174: p. 153-161.

77. Sergiev, P.V., et al., Function of the ribosomal E-site: a mutagenesis study. Nucleic Acids Res, 2005.33(18): p. 6048-56.

78. Voigt, J. and K. Nagel, Regulation of elongation factor G GTPase activity by the ribosomal state. The effects of initiation factors and differentially bound tRNA, aminoacyl-tRNA, and peptidyl-tRNA. J. Biol. Chem., 1993.268: p. 100-106.

79. Joseph, S. and H.F. Noller, EF-G-catalyzed translocation of anticodon stem-loop analogs of transfer RNA in the ribosome. Embo J, 1998.17(12): p. 3478-83.

80. Konevega, A.L., et al., Spontaneous reverse movement of mRNA-bound tRNA through the ribosome. Nat Struct Mol Biol, 2007.14(4): p. 318-24.

81. Qin, Y., et al., The highly conserved LepA is a ribosomal elongation factor that back-translocates the ribosome. Cell, 2006.127(4): p. 721-33.

82. Shoji, S., S.E. Walker, and K. Fredrick, Reverse translocation of tRNA in the ribosome. Mol Cell, 2006.24(6): p. 931-42.

83. Spirin, A.S., Energetics of the ribosome. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1978. 21: p. 3962.

84. Bergemann, K. and K.H. Nierhaus, Spontaneous, elongation factor G independent translocation of Escherichia coli ribosomes. J. Bio. Chem., 1983. 258: p. 15105-15113.

85. Wintermeyer, W., et al., Mechanisms of elongation on the ribosome: dynamics of a macromolecular machine. Biochem Soc Trans, 2004.32(Pt 5): p. 733-7.

86. Agrawal, R.K., et al., Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998. 95(11): p. 6134-6138.

87. Stark, H., et al., Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation. Cell, 2000.100(3): p. 301-309.

88. March, P.E. and M. Inouye, GTP-binding membrane protein of Escherichia coli with sequence homology to initiation factor 2 and elongation factors Tu and G. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985.82: p. 7500-7504.

89. McGarry, K., et al., Destabilization of the P Site Codon-Anticodon Helix Results from Movement of tRNA into the PIE Hybrid State within the Ribosome. Molecular Cell, 2005. 20: p. 613-622.

90. Youngman, E.M., et al., The active site of the ribosome is composed of two layers of conserved nucleotides with distinct roles in peptide bond formation and peptide release. Cell, 2004.117(5): p. 589-599.

91. Kunkel, T., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotype selection. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1985.82: p. 488-492.

92. Kunkel, T., K. Bebenek, and J. McClary, Efficient site-directed mutagenesis using uracil-containing DNA. Methods Enzymol., 1991.204: p. 125-139.

93. Asai, T., et al., An Escherichia coli strain with all chromosomal rRNA operons inactivated: complete exchange of rRNA genes between bacteria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999. 96(5): p. 1971-1976.

94. Sergiev, P.V., et al., Mutations at position A960 of E. coli 23 S ribosomal RNA influence the structure of5S ribosomal RNA and the peptidyltransferase region of 23 S ribosomal RNA. 2000.299(2): p. 379-389.

95. Blaha, G., et al., Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol., 2000.317: p. 292-309.

96. Leonov, A.A., et al., Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23S rRNA that affects the translocation. J.Biol.Chem., 2003.278: p. 25664-25670.

97. Bartetzko, A. and K.H. Nierhaus, Mg2+/NH4+/polyamine system for polyuridine-dependent polyphenylalanine synthesis with near in vivo characteristics. Methods Enzymol., 1988. 164: p. 650-658.

98. Noller, H.F., et al., Secondary structure model for 23S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res, 1981.9(22): p. 6167-89.

99. Harms, J.M., et al., Alterations at the peptidyl transferase centre of the ribosome induced by the synergistic action of the streptogramins dalfopristin and quinupristin. BMC Biol, 2004. 2: p. 4.

100. Douthwaite, S., Interaction of the antibiotics clindamycin and lincomycin with Escherichia coli 23S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res, 1992.20(18): p. 4717-20.

101. Hansen, J.L., et al., Structural insights into peptide bond formation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2002.99(18): p. 11670-11675.

102. Schmeing, T.M., et al., A pre-translocational intermediate in protein synthesis observed in crystals of enzymatically active 50Ssubmits. Nat.Struct.Biol., 2002.9(3): p. 225-230.

103. Camps, M., G. Arrizabalaga, and J. Boothroyd, An rRNA mutation identifies the apicoplast as the target for clindamycin in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology, 2002. 43(5): p.1309-1318.

104. Grajevskaja, R.A., Y.V. Ivanov, and E.M. Saminsky, 70-S ribosomes of Escherichia coli have an additional site for deacylated tRNA binding. Eur. J. Biochem., 1982.128: p. 47-52.

105. Lill, R., et al., Specific recognition of the 3'-terminal adenosine of tRNAPhe in the exit site of Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol., 1988.203: p. 699-705.

106. Kirillov, S.V. and P. Semenkov Iu, Non-exclusive principle of AcPhe-tRNA interaction with the donor and acceptor sites of Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett, 1982.148: p. 235— 238.

107. O'Connor, M. and A.E. Dahlberg, Mutations at U2555, a tRNA-protected base in 23S rRNA, affect translational fidelity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993.90(19): p. 9214-9218.

108. Moine, H. and A.E. Dahlberg, Mutations in helix 34 of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA have multiple effects on ribosome function and synthesis. J. Mol. Biol., 1994. 243(3): p. 402412.

109. Steege, D.A. and J.I. Horabin, Temperature-inducible amber suppressor: construction of plasmids containing the Escherichia coli serU- (supD-) gene under control of the bacteriophage lambdapLpromoter. J Bacteriol, 1983.155(3): p. 1417-25.

110. Bachler, M., R. Schroeder, and U. von Ahsen, StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-bindingproteins. RNA, 1999. 5: p. 1509-1516.

111. Bogdanov, A.A., Some structural aspects of the peptidyltransferase reaction., Mol Biol (Mosk), 2003.37(3): p. 511-4.

112. Scatchard, G.N., The attractions of proteins for small molecules. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1949.51:p.660-672.

113. Hesslein, A.E., et al., Exploration of the conserved A+C wobble pair within the ribosomal peptidyl transferase center using affinity purified mutant ribosomes. Nucleic Acids Res, 2004.32(12): p. 3760-70.

114. La Teana, A., C.O. Gualerzi, and A.E. Dahlberg, Initiation factor IF 2 binds to the alpha-sarcin loop and helix 89 of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. RNA, 2001. 7(8): p. 11731179.

115. Moazed, D. and H.F. Noller, Binding of tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16 SrRNA. J Mol Biol, 1990.211(1): p. 135-45.

116. Moazed, D. and H.F. Noller, Sites of interaction of the CCA end ofpeptidyl-tRNA with 23S rRNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991.88(9): p. 3725-8.

117. Polacek, N., et al., The critical role of the universally conserved A2602 of 23S ribosomal RNA in the release of the nascent peptide during translation termination. Molecular Cell, 2003.11(1): p. 103-112.

118. Hausner, T.P., U. Geigenmuller, and K.H. Nierhaus, The allosteric three-site model for the ribosomal elongation cycle. New insights into the inhibition mechanisms of aminoglycosides, thiostrepton, andviomycin. J Biol Chem, 1988.263(26): p. 13103-11.

119. Borovinskaya, M.A., et al., Structural basis for aminoglycoside inhibition of bacterial ribosome recycling. Nat Struct Mol Biol, 2007.14(8): p. 727-32.

120. Ali, I.K., et al., Deletion of a conserved, central ribosomal intersubunit RNA bridge. Mol Cell, 2006.23(6): p. 865-74.

121. Lovmar, M., T. Tenson, and M. Ehrenberg, Kinetics of Macrolide Action. J. Bio. Chem., 2004.279(51): p. 53506-53515.

122. Herr, A.J., et al., Drop-off During Ribosome Hopping. J. Mol. Biol., 2001.311: p. 445-452.

123. Wada, A., et al., Structure and probable genetic location of a ribosome modulation factor associated with 100S ribosomes in stationary phase Escherichia coli cells. Proc Natl Acad Sei USA, 1990.87: p. 2657-2661.

124. Wada, A., et al., Ribosome modulation factor: stationary growth phase-specific inhibitor of ribosome functions from Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun, 1995. 214(2): p. 410-417.

125. Hinnebusch, A.G., Translational control of GCN4: an in vivo barometer of initiation-factor activity. Trends Biochem. Sei., 1994.19: p. 409-414.

126. Niven, G., Ribosome modulation factor protects Escherichia coli during heat stress, but this may not be dependent on ribosome dimerisation. Arch Microbiol, 2004.182: p. 60-66.

127. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library

128. A Complete Set of E. coli K-12 ORF Archive): Unique Resources for Biological Research. DNA Research, 2005.12, p. 291-299

129. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology, 2006. 2:2006.0008.

130. Youngman, E.M. and R. Green, Affinity purification of in vivo-assembled ribosomes for in vitro biochemical analysis. Methods, 2005.36(3): p. 305-12.

131. Smeulders, M.J., et al., Adaptation of Mycobacterium smegmatis to stationary phase. J Bacteriol, 1999.181(1): p. 270-83.