Синтез глико- и фосфолипидов, содержащих сульфгидрильные группы, и изучение их физико-химических свойств в составе липосом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ , ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. Ломоносова Специализированный Совет Д 063.41.01

На правах рукописи

Дюбешгага Алекссвдр Викторович

СИНТЕЗ ГЛИКО-П ФОСФОЛИПИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ СТЛЬФГВДРИЛЫШ ГРУППЫ, Н КЗУЧЕГШ ИХ МШКО-ХНЯГВСКИХ СВОЯСТВ В СОСТАВЕ ЛППОСОЦ

'V ’ , •

02.00.10 - Биоорганическая такая, химия потродных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

р:1отз внтюллпнэ па коТдгр" :: "с.-тгслсг:-; *;с. орл*.

н;.::сск:<> соо.-;;;и:аипЛ ;.!оског.с:сого ордона Трудопого Кроемого Зпппога х: клеено;' тозкологс»! У.В. Ло::о;/:?<'.зг.

. /-.л,;' ;:с;;р.;с':сл.;,о;1;' 1С;-: ос-'_^с ->><■<

1 ;• 1

г;;: /у^:;ср :.С";,1чОС..: ■

Г.;;, й.!.м5> ■•.>'а (!,г.

.Т.::.ар ? 1: ; ... с.ьр.

»,Г. ;:о5гч';;с{:с,г^:: (Ж!

пр\'гшззцвя: ВсороссвЛасла гафД'лог.огьПзсяуЛ голир,

\ ’

гадите диссертации состоится ** 6 * апреля 193?, г. и 15 час. 00 ьзгн. на ЗЕсгде:ш ешциагазгфовщшого Согсте л СЗЗ ,<11.01 ари Московской кастлтую тоаной хтшчоскоЛ мтсло-лгил 1':.'. ‘Л.Б- Логшосова ' (117671, Цасюга,-пр. Вернадского, д.КЗ, тол. 0.7-1926). - . '

С дассэртацаей М'лшо ознекоются в 6иОлко5окй ЯГй’Г К1 М.Б. Лог.оиоеава (112831, Ыосква, ул. Ы.ПирогоЕская, дЛ). •

дцторз.ф^рат разослан " 6 " .глргд 1932 г.

.Учешй секретарь Совата ' ' . '< ■

канд. хем. наук, ст.н.с. Лжик А.К. ■

'Я!?ПКе"'Г., . .

Г I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

, ' Актуальность проблемы. В настоящее время исследования з об, • • , - - •

ластй моделирования клеточных мемс зан, связанные с использованием

г'-'.рТ-’ЦК.'; ; ‘

липосом. получили широкое распространение. Однако при создании липосомальннх систем, существует ряд проблем, затрудняющих их использование в качестве мембранных моделей.

Одна из основных трудностей заключается в повышении стабильности липосом In vivo. В этих целях можно использовать способность липидов вступать в реакцию полимеризации в результате химической инициации или. при облучении УФ-светом. Способными к полимеризации в составе липидов могут выступать сопряженные диеновые и диацбтилвноБыё системы, метвкрильные и некоторые другие группы. Однако пря переносе модельных исследований на объекты in vivo встает задача бродеградации полимерных структур. Полимерные липо-cowi, полученные на основе мономеров с перечисленными выше поли-меризуемыш группами, но способны к биодеградации в нативных системах й имеют тенденцию к накоплению.

Чтобы решить эту проблему, было предложено использовать соединения, которые в полимерном состоянии способны разрушаться под действием ферментов. Ими могут служить липидные аналоги, способные образовывать дисульфидные или пептидные связи.* В последние годы получено несколько подобных соединений, для которых показана возможность образования липосом,. их полимеризация и дальнейшая биодеградация. ,

Другая важная задача заключается в возможности использования липосом для направленного транспорта заключенных в них соединений. По. аналогии с межклеточным узнаванием большую роль в этом процессе долом играть углеводные детерминанты, находящиеся из

ионеріиоск: транспорта» скоте:.:. ■

иозмоп'эо'л, «пфзкоС ьврпеца;.' ?остсг2 летяссг»', е теїсз еефт-Сліьног.ть гтп<од?яц!7^, яозсоляс: к;одат; гослодпгс. г. лгпдаїї-г б;;еля: лчк енг.і'&д^: іт*.;зоі?;о£ тззргкссік клотечсг из:.:с!ры:. Те-. кі:е кзлй^іг!**.®пнп”£ ятэсою свосоогі .епзцв&гчгскв взсгходвїстг-.* сэь&гь с природнил; к^отечн^гл: сиогсгжгд с досїстсчігЛІ стопеїаг. &М'Згї.-:ьні-сї». Ьіо, наряду с сохрзпьагек ^тікі^г.аа-ько^ активксн:-т:. иивстагікч е каа» жпо.’оіл: создглісніЛ, иозволязг с^яїв-іі к?

о.)лос. удоЗікаа: трглтглюртілгл: сродсті-іг": , чаг; коки-тчли есцсгїго -м^аэоу'локу.пе її:..-,: сгптег-пзсшго шгсрс:саису.ы.. .

Г святг. с вкйЗЕЗКжзтш:..' |ірбдрта?лші'сг аптуившті обмда-' ш*ті- доа ошісбвдах- вслрвідаккя в создзтз; воягаргот бнодзгрг^-руветх несуща иа своей всссрг^изтй уі\8зи>,сад детор:.Ь~

ііелїк в качество вс-’ііора для іі£лрсгс:;і>'огс трссаорта Іп VIне.

Л[»Л??аг»>нвег. работа является чкетьв Фундгаспталяса: цву»: - ' шу во<уедое:кк£, проводок:! на ковдра. Химк^и тоужшзгш: тошхг оргшпгсэскиг совдинок£2 8ЬЯХТ т. иі.Б.Ломоноссівв по то^гг Лі 11-ЄСГ •’іаделзіок» и сш:теа отдольшп молвкулярс^г тшшв лшпдоіі, изучение кх свойств в мокЗранаї, истюльзованш для создана. физ:;о.язгк-чооки активных ліішідннх препаратов и липосомалышх фор«“ (но..::] іосудцрстшкной регистрации 01.86.0132597). . . .

Цаяь работы. Сиптоз гашкозшщиглицвркдов, содарасе-зх сульф-ггдріишше группы в термжзлытой части лшидао?. компонента, к пзучгшз особенностей иг. поведение в состава кодс-лыт фоской:-іаідетх кымбрал. Разработка альтерьатіЕшл. кэтодэв сиатйзс т\кнко-гллдплицеридов и Шиїравленаого получения ацомерой двлвого адсссе соединений. Изучение взаимодействия гілпсозигаровпнігіг лштосок с лекткиаьи. , •■•:■: ? •'5*

■ еіхпязя пепшз. З хот ваполістія сяпто-отэскоЯ чзптп раз. рбогсн одоосгадавші ча?о.ц ло/ученяя глзде]загД2Х0ЕИД03 :;о ое:г> зэ по.^пн -гцотатоз сахарзв я аздрсягтяеш'лдортю. іірздлгсои простої л удоЗіг-гЗ з проппдаїішпс!! отзэпошт *-:-т:лд с;гдт>эза энотир-::о "лісгп лг-гасосіксз. 3.~грЕиэ оотг^стзлъа сгл?оз г;.тло-

. 5хідз'.гл:'ЗГ'!.чГ!3, содоргг'са cy.r.-Jrs^s/t-rrje группа з їерап;іа';от?Л •тзста згеттхкз. • "селздсзгпо позвлозгв гдаоз^тдигглиэрадсз, ?.;о.пи-

;”"ТІ;~0?-ГГПІХ Су.Т:-'і‘ЗДраЛЇ,Г!Т.’?;Л ?pi'nns?3l, 3 ЗССГДГЭ фо5Р.’3!Ш*!Г;ЛК:

ггаг-п-'ул с зшдоі’а^іздя..тфгсклслоттыа остаїпі_,’н. Нзхзліло yr.or.i--•гс!"гэ ггс'з-яьпостл таких vTs:occa у результате огяслєеігя сульфчв р^лі-гпх груяп, ’гп:Е';-"гро?.с5лгсп уіЗ-облуплзем чла гайикаа п-зк'чпси •мдорода. Прсзздспо .срзЕзлтелпоэ кзпснгл г..:с:отл,ко:е-удлйс . .•risoccu, содгpsai'sis ра^лгангэ тглс-1*',,”г;й даседоідо-яг, о г.э-.’.;.:лом ' RC-V •-

Гр-ггг.гтс’мя■ г.ійпосїь ;:"0'гл. Гнсргвотлягий ‘ятод юлгкчш гяіцорй.т.'гтос.'їдсз ::оггг>;:лот лепольяов.іть г-го для мрсстигм п удойюго л :.7ГЕГ-рзгнх«'см огеггзйяи •■^•птспз ггзиеяижг/гтцэ/мдоя. еодер^Т-Х і'пу.глодос^ічзїио ■.:’уп1'".::сло'Л^:о остатня.

Псхадг'то, что пго.гг'.^р":') -йзкнулі из с:«тес:»ро?jSRcro »юо.?о-гипяда сксса «со Сол~о огьСкльлгла по ерззпонхл с otfu кг.глі, :: jr:o-.'.ггло|.иос!:глгг.т-*ч ".нялогггті; з то го £рг::л ояч абаддизг отсосал» ш'Ьп к гос/руяцзі. Р:;-эго:г.:о з :а з :%£’<цт :,.<;-:.пу.:п :.* “'^шгкк;г,;л;ого r.riwab^j, ел.д?! їлцого л::кїо:лМг.к;'$ ci/гэт--.::, :

ЗО/ИЛО К Й0ГЛ.*0«И0СТЯ СП:)Г;іч,Л’!'.>.:К’Н R1i:РМОД!Зі:ГРОБЗТЬ Л iK'W.lft,*

RCA*. 1Толу'іс;;;;иі: „'.тгтосс.’.тэл sxra ой-г.с:*.і .тогу»* Сйі’й ?ciio--b.v.j;W!r-j ДЛЯ прМЭЗДГЗД 3 аіГі.ХПМК'іОСі'ЛС Я ДО/ИШіН'ЯШ ИСС.Ш;0?!'ГМЛ.{ .

На защиту выносятся следящие освоение положения:

1. Синтез гликозилдиглицеридов, содержащих сульфгидрильные группы в терминальной части агликона.

2. Одностадийный уетод получения глицерилгликозидов из полных

ацетов сахаров и изопропилиденглицерина в присутствии кислоты Льюиса. .

3. Метод направленного синтеза аномерно чистых глицерилгликозидов за счет аллилировакия полных' ацетатов сахаров в присутствии кислот Льшса с последупцим окислением двойной связи до даола.

4. Исследования мвмбранообразупцих свойств модифицированного.фос-

фатидилхолина, содержащего в Липидной части сульфгидрильные. групхи, методом “Р-ЯМР. Изучение окисления, тиольных групп полученного фосфолипида в составе липосом при различных условиях. ‘ . .

5. Исследования по включению модифицированных гликозилдаглицеря-

дов в фосфолипидные липосомы, содержащих аналогичные жирнокислотные остатки. Изучение взаимодействия гликозилированных ли-, носом да!шого класса с лектином RCAt. .

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 2 печатные работы, тезисы доклада. ; ■ .

Апробация работа. Материалы диссертационной работы частично доложены на IV Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Черноголовка, 1'Э30). . . .

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков, 5 таблиц и.состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждении результатов, экспериментальная часть, список литературы, ' включающий 167 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕИЛНИВ РАБОТЫ

1. Синтез г лихо- к фосфсисшкдов с сульфгадряльними группами в

Для создания стабильных биодеградируемых ляпосом из фосфолипида, содержащего сульфгидрилъние группу, и введянья в их состап гликозилдиглицеридов с аналогичными кирнокислотными остатками были синтезированы следующие соединения: 1,2-ди- (Н-меркаптоувдвкн-ноял)-гас-глицеро-3-0-р-1)-глясопиранозид (1), 1,2-ди •( I!-меркап-тоундекаяоил) -гос-глицеро-З-О-р-ЕМ альктопиранозид (2), 1,2 -ли-

(1 |'нотрка1Ггоундеканскл)-гас-ппщеро-а-0-р-В-л8ктозид (3) и 1,2-ди- (11 -мвркаптоунл0К8ноил)-яп-глиц‘5ро-3-фосфохолип (4). Соединения <1МЗ) получены впервые. '

тершгаальвой частя ли шдной компоненты

(1)

(2)

сн,он

сн,он

но

*'00С(СН1)1О2Н

1-Ю0С(СНа;1ОйН

ш

он

СНаООС(СН,)1аБН

Н5(СН,)1с1

-С - . м

QCi$il вздох к omiesy изасо/гпздгш' (1 )-(3) еакдо&шзя е сл-ляларосашк псипа сцеткчіг оьхарог. с крг&у50тв:з'. іо-атаї Jtosss, с ji(H-.j!ecarix?": о:хіу:::їі:сг.: дпоСііої. овяаі: до jckUw.' r r-4':&:j№ssic:: rz~ ' охосдорггетГ izpnot ісколс(Тог t ьркогїсгЕг:; дащ^аагексикхорбодз'-иміда (ДЦіС) с да^зтЕлаааііотгівдаше (ДОШ). .

Сос&шшцц (4) пододай едрврош&са .йзадцсй коотжктоі:. кадаазпого і«кдшіке5 глгяррофааЬзгоісвЕ. . ' •

І * t « CCJ З Л 1^3^ ■— і- . .. JV. і Cf-ia^-'л ц ■ ’

£ ксчестк» їсооокР]'г^з£ 'щв;о£ кв&еэте Сала кгЗргаа 11-<отііинтго)і-цд<жкоЕг?.югсяота (S.). 'De mrjiaxz в л^з оїедпв гг ког.иорчссгоС и-бр0йзгвдакейл“л2’ шиза: (6) (і.' щ;. /.D-Gt°C) г смак с доотушасію юхавддсг {схоггэ '1). І-Із горза: ciWi- np>u>-дзуіГ. ггскооедгаок:» tsoeerskuz? к (5) с кгклс&іза раздоозсод: об-'. Р«зувт;в2ся со® (G) Лиоднда раеткзрж: даккз дэ І І -«ргеттарн^іЖг KOBOf. КГОЛОЇС (’’) (Т. tJI. 5S-6J°C). ЕЗДОДЬ^ОГС^ГЗ' .вС5*ГСЕ21їрШіа Е глч&стаг ргстворгійгп. кігота ірадядеигюй ро®а-оть2одгхй; йзсе пойуолгло уяолгчіггь еігіо»;.’ и ' да ’ Ерегтс'ісжг еокг'кстїзі;-:

ші. . КодкОїщвровгввдк хгрггуя ішсвоту (З) поаучгл^, • іізргігод,',

оуЛЬфі’ЕДПИЯЬВу» rpyraij І. ЗОЇЗЄіОІЯіуЕ .Іоркї Б ЕЗДО ЬТлЛДГХ.уЛЬ^а . с '

іюизцьк ягязтютг^сулі-іскггі (8), коиркй. Б сеая очврадь,•. би

. ■ . • . . • .. '■ " CK01IQ 1. _

, Шдучз^ ксїйг>гсга, "• ' ’

- s ■ ' ;

. SjEfes, Г ■•• -КПЛ 1, ЕїЗЇЇ

НООСЧОГ-)^ -----------Вг~ ■■ : - •- •<

(5) I (6) *• K

0 ". ■ .

'■Et&Fi

EJ0g<CK??>oSg KOCiEr4)tc^K

(T) ta) (9)

Второй способ заключается в глнкозилировании изопропилиден-глицерина с послвдуадим снятием шопрошишденовой защиты и ацили-рованием образующихся гллцерилгликозщюв. Гликозилирование осуществляется лмбо по ортоэфтрному методу с выходами 45-50%, либо по методу Кенигса-Кнорра через бромацетаты сахаров в присутствии солей серебра (I) с шход.чми 40-45*. Снятие ис:опропилиденовой зашиты также не удается провести удовлетворительно в связи близости реакционной способности защитной группировки (кеталышй тип связи) и 0-гликозидной связи (ацетальнпй тип связи). Креме того, получение самих бромацетатов или ортоэфирон сехаров, например, из ' иг. порацетатов треоуеу еще одной или доух стадий соответственно. Таким образом, синтез глицерилгликозидов включает в себя 3-4.стадии с суммарным выходом 15-20%. . • " ' , ,

Б связи с изложенными трудностями была поставлена задача разработки альтернативных путей гликозилированйя, которые позво--дали бы упростить технологию синтеза, поднять выходы и расширить спектр гликозильных компонент, способных участвовать в данных реакциях (например, олигосахариды). • , . ■ .

Первый шаг в этом направлении заключался в апробации нокото-рых методов, применяемых в олигосахаридных синтезах. Однако активация аноморного центра углеводов с помощью комплекса бромид меди (II) - тетрабутиламмокий бромид или гликозилирзвание 1-Б-алкил (ьрид)-глжозидов в присутствии Н-Зромоукцинимида не привели к келаемым про,цуктам. Очевидно, ьто вызвано меньшой реакционной способностью алифатическта агликонов по сравнению с их гликозиль-ными аналогами. ' .

Положительные результаты удалось получить, используя в ка, чзствн промотора кислоты'Львиса (эфиретный комплекс трехфторис1б-

го борз ГТЛ21 пэтярзчхяорзстгэ олодо). 3 жтаигво ег.т*уеия зтрг?4чіял-гаї-пзоііропд?піхояг;ля:др;і (охзмз 2) Мэтол бял яатэросйн тем, что т даяіаи услоккпс щ:спя*л:пл р?а:<ц?э проігохопло г/отсзилярог^лгле

о дчдыиГг/а снята ял :&г;щ^у,тлгллжог.<\\ игуи-д. (В сг>;;ли !• у*и:с*і’* -

ov. V. тхч^иг:: :г..сг.о'::г ZiP'tcs '>пі:ь .г'лгстсл ус.мг.::;> г,7с?т

втгап Ъ'охрз пгл по ж-ізд^і в роцггц’т.іг.іум м.^гу пр-'псхэ-

дчг c:i"tnn жичфсплчп,поіпо*;с'.1 :іа.їЯїіі tl с^рэдуэтсл 'Грудчоотділ:;::* noikntSiJ ссо;;:'*:и:::і:і - 2- 0- ї\дгцор;шдаяатлн>і.) Тргшм сСгмі-ом cr.my УЛДЛССЬ ПОДТЯТЬ ЯЦОТПЛ5!рСП^:?Г2І г.гл;5рялт;<0’сг»3і СО CSKXkVBWU

годрстмядътгг.а груш/еті но г.ти'эряюпсму :<еглюзэа?у (Иа-г>) яз ііорзіптаїсп арпкэнягстсл’ изхаров (IC«-u). йіхояк состояла 3Q-&S7 для тюсзхоридоз (ІИ-<Л я і!>3 .тм ласахаркда (іі.’).

. (ікимя с .

.. - %

ОдпостлдзЛяз3 способ полу г?:!:..* л гкяцзря.тглтга/’оь

’ С!!3СЛз ПО, СТКОЛс

6?-^ fe?b

С'Л

СЛс .. 04с

(10.1-3) ■ ■ (tifi-л; .

:•.' я’= а, їь нас (а) •. іі, в= ](0;с w

. !iV«0, ц-_-п (d) . •

' ' . 0Де

• Чк*йі жялхяаі зекдзяять ттвсансеть сбрг-голапял по(Ч>ч»нд лродуятоз бал.разр&Ьо'Гзд г»тол. ііредвгазявимії на еаокэ 0. д«гаша подход псз15ояяэт получать. зкогфрпо числю продукта з-гясниой коп-■?ЯГУРЗ!СЇЯ нпираайоагаїм спітспг.ч. гтря этс-н яегюльзутотол доег.утгне рэппкии я ace -ctiuc.b продосоп вбивают хэкпх-ляйс тйхдулогя-чзстих затруднений. .

Схема 3.

Получение глицерилглинозидоп через аллильные производные углеводов

_СНаОЛс і '' " 0С112СН=СНа

(IОа-в)

А110Н и .

А/Н+(

кислота Льюиса

101

(11а-в)

V®

оснасй=сна

СН,04с

Г*н

101 I/ V

* 1\0Ас /1

иу-—Г о-1

ОАс (14а-в)

(8пС1„ или Е^Е^О)

Ключевой стадией является аллилирование полных ацетатов сахаров. Такие аллильные производные являются ваюшми сштонами в области углеводного синтеза: аллильная группа кокет слуиить как временная задана гидроксильной группы при апомерном центра или бить промежуточным звеном в синтезе глицерилгликозидов. В связи с этим нами было проведено систематическое исследований по оптимизации этого процесса с помощью ВЗКХ*), где в качестве модельных углеводных компонент были выбраны пёнтаацетаты р-Б-глюкозы и р-Ц-галактозы. .■< ■ : . .

Оптимальным оказалось примерно аквимолярцоё соотноаешш _реа-гентов и кислоты Лыиса (певтаацетат углевода - аллиловый спирт -кислота Льюиса, 1:1,1:1.1) (рисЛ.), Увеличение избытка аллилово-го спирта (отношение 1:1.5:1.1) приводит к первоначальному накоп-7Ш1ШЮ диал^ильных вциклических интермедиатов, хотя в дальнейшем выход продуктов имел лр1шеррс такое ко вначояие, к&ч и в пзрвом

*7

Б работу принимал участие к.х.н., н.с, Аникин М.В, ’

случав. Превышение количества кисл гы Льшся над аллиловым стр-том (отношение 1:1.2:1.5) такие не приводило к увеличению скорости реакции по сравнению о оптимальным соотношением реагентов.

Рис.1. Аллилированиэ пентаацетатов глюкозы (а) и галактозы (б) в присутствии ВР3>Е1;а0. Отношение 01с(Са1):А110Н:ВР,*Е130

—I-----1:1.1:1.1, —+------1:1.5:1.1, —э-------1:1.2:1.5

Оптимальное время реакции составило 5-6 ч. При атпм скорость реакции в случае галактозы была заметно выше, чем для глюкозы. Значительно более длительнее время выдержки (24 ч) приводило к некоторой деструкции продукта и появлению примеси а-изомерэ. Выбор кислоты Льюиса ДО,-Е1;,0 или ЗпС1„) йе оказывал сколь-лиоо принципиального воздействия на процесс. Однако ОТ.,-И,0 является все же более предпочтительным промотором, т.к. он менее подвержен гидролизу, чем 5пС1* (что приводит к появлению примеси а-аноуо-ра), а в ходе нейтрализации и дальнейшей обработки реакционной массы не дает таких словно разделимых суспензий, как соли оловянных кислот. Полученные результаты значительно лучше но сравнении

_ 5 Л - • ••

■;V .

с um^oi'mmxzi дшзнвзд. ж.аигт/іг.сг. ъ додрвдрс (їхавд СС-таї,

• ,U!uG J4iw 4:1 ). . ’

:ішко,>;ошю риакцпи а прксутстйш: л~п:оуз проїоїіиі; (уксускоГ; :-л:с.и.пі: і крайодцдо к обризовгиа'й чксінх а-еиоі^хш. іЦкк^рцай ■ш-лога доказывалась о ш-ялнью споитрос IK? г, опіхздокйіея yrxac '.итачеокоги вргодшт.' Тсі;, дяк р.-В-с&іцтжозшід -:12ft) s • 4.45 а..г., J.5 ,, ?.f> Гц; la]]® -1У.0!, глі с-В-ьллзац’лаїоалда (13о! й і>. ;0 2 3.5 Гц; !«і^1 -»»35\ лад р~В~«;л«шчижяозвла

;:;~гї) і (.лі J, - '*•.■> Гц; Uil;° пал

•• • ()УС) З b.t& , J, ;{,и ft*; •> 1Г,° ♦ МІГ ійз

да; (|йа) Г«х£° -Г.сЯ (:20; ?ь і'3 4 И.Г. ‘ІЮ Гс-»д°.

>'ЛіНи;;3'У.О ДЇЯІдаЙ'. овяаіі НрОЬОГ;:.1: І/1 i/.JX B.V;4u;U IWpW.lUV.-

• ч:1.е“.г.« » педиэ-эдзтагоя®; иіте;-; с^стігл : :v іїї

. :.ис8иьх "urr/o’jti »^йсогЕ.^Я’лгзі'.і«:іЗ?;. Шіадлигі^іХіЗД *;о-и :-.j > ■■■ ..’.ерг іV:‘.yи-зj'.oltK'/.qi* <11 й-d).

1.3, Сй.ггі£ііс» алц-щл

кЧдо&ши^зшшдео глглозкд-ж^;»»]Г£*. (! )~(8) подучал.. сдоі:;-

і. г.г'іцоріиггллаззя/.сх: (Its-ii) илі;о£ (0) »

ДЩС ь І££!І о'шходеї;^ €.7-701 /•.:.£ вдіоссодвд^:: t

а?*'. ,.чл ;:;.:сщ;цкда (І5в) (саад 5). Crjiocimc сскдаігеаь:!-, (1Ьи-і;) г.о.тгкорздсіі.о скекїрс&к Ш1 -(с»с1а, С, к.д.): /fn (55?) t: (1 Gc>> І.Si 1-2.10 (4c, 12U, сна0(0)>, г.Ш-г.ЧЬ (т-н:, ви. CUgSSGU,., 0 7.0 Гц), 4.6(1 (д, Ш, К-1. Jj.g 'f.G Гіи. і Длк <15ь) епоктр анвг.ап,-ч«.-:г ссоїіюгстаі'щзьу -спектру • соодтасітк (Ібе) грою осілісіі: (ЛП-4.50 (2А. 211, Jl-t, Я-1', J.^ 2 V.5 Гц). ' '

Ол'<’.;а

Шяутввто г.тш'лг.кдот’лщорйдер, сЪ.гн-рга’?:'^ к ягдишко с/дг^Уїріїлигда групп»

■ с;г3слс

£0) Г/ 4F ! >wf£; *U~Q

Міп-пі -&< рГОСЧегЦ?*/^ —---------------*

?~ОСїЯ іС:їа

)4055П

[ г'ІГ-йГІ ]

* * < ' і

: ?■'* \9-і • : гч»г

- : \\рЛ л i‘Wr.{Gr..;’,„:.Ci-,t і ——-

І Гг'і-----і ЦгЗЗШЇ, lt.!

Ч с* *1‘ --• |І

; 1 О; -І; ■

. о \ І

’ •' ■' ■'Г1' . ; пд ДСґ.і;'-. і.:::; і-:

і:y;:vтог.сл:т:г:с;;';'\: ip! г'ч:(:5:' а). :?.'-;ол с_о,гп::ег"і; (!; і: Г ; f ;ri—*('со-! г "і П) rpl'i:;; : отх::.?; ': s':1 -

даы-.1ІГ.'Р-спаирзсі-ляш; ■■’'•'> кс-іссисл^іта с::і,,;г.‘.:\і гг-ото;;:,.* ■гігмиг. іо 3.0 ї'.д. ; і: ьг'-:.'\чсу::!,у'л;;г^ .w ■;•.') ічл.) осг.гмо'і; Дсколгавді-кз;ї хзратсч-іі*;пс*гігtл ісксохчиндор -<і )-(3) inuyvc-.M с :n ілоп,иі даяізрс:”: оптвчопкого прш->.9ітл ДОВ (с 1, пап., аул:1., і :і , 1г;Г?0, Град. (?., тім)) Л”Л (1): -a. S (.'/'О. t ), (У.6.||, -о.и

(436.0). -6.0 (407.0), -12.0 <334.1), -Гхі.О (2?9C..Q), -М3, і.

(2G9.4); дня (2): (5.5 (579Л ні.О (546.1), ,9.5 (4;У.Л). >'■ 'J.\

(407.8), +6.5 (334.1), -62.5 (296.6); для (3): +4.0 (579.1), +4.5

Синтез модифицированного фосфолипида (4) осуществляли аналогично получению гликозилдаглицоридов (1)-(3) общепринятым методом ацилирования жирной кислотой (9) кадмиевого комплекса глицерофос-фохолина (17) в присутствии ДЦК и ДОШ с дальнейшим восстановлением сульфгидрильшх групп три0утилфоамином (схема 6). Индивидуальность и структура целевого продукта (4) подтверждена с помощью

ТСХ и ПМР-спектроскопии: ШР-споктр (СБСІ,, А, м.д.): 1.20-1.45 (М, 24Н, (СНЯ)В), 1.55-1.75 (М, 8Н, СНаСНаО И СНаСН23), 2.30-2.40 (Т, 4Н, СНа(0)), 2.75 (Т, 4Н, СНа8), 3.35 (С. 9Н, ЛСН3), 3.754.30 (м, 8Н, СНа0 И СНЯЛ), 5.15 (М, 1Н. СН-глицор.).

(546.1), +7.0 (407.8), +8.5 (366.3), +8.0 (334.1), -9.0 (296.8),' -39.0 (289.4).

1.4. Синтез иоднфацяров о иного фосфолипида

Схема 6.

• Получение модифицированного фосфолипида, содержащего в в жирнокислотной части сульфгидрильнне гругпк

(17)

(18)

Ви,Р

2. йізнко-хииическне исследования липосои, сформированных на основе получении соединений

ГІОЛ5!Мвр]Ш0 формі фосфолипидных везикулярных бислоев пред ставляют собой уникальные объекты клеточного уровня, которые могут найти иирокое применение как модели биологических мембран и переносчики лекарственных препаратов. Они имеют близкое сходство С ОбЫЧШДД! липосомами с точки зрения их объемной морфологии, проницаемости п мембранной структуры, но значительно более стабильны. В случае 2в, когда полимерные везикулы можно обратимо дешлимеризовать (особенно в условиях (п vivo), их использование в качестве мембранных моделей значительно расширяется. Нанршер, они могут достаточно полно удовлетворять требованию долгоживущих переносчиков лекарственных препаратов. Включение в состав липосо-нального. бислоя углеводішх детерминант еще более приближает такие кодели к природным клеточныи системам. Таким образом, данное направление в развитии современной липосомологии представляет собой актуальную задачу на пути к созданию искусственных мембран.

• О

2.1. Изучение поведеній липидных иолапул в ионоиерных ■

и полішерких липосоиах методой спектроскопии 31Р-ЯМР

Для изучения структурной организации мономерных и полімерних мембран из фосфолипида (4) наш был применен метод 31Р-ЯМР. Он позволяет, проследить за структурными изменениями в мембранах иод действием различных факторов. В связи с этим нами проведено сравнительное исследование поведения липосом из соединения (4) в ходе приготовления н обработки ультразвуком, а также при окислении в различных. условиях (инициация УФ-облучеіщац,. при- 254 нм или обработка избытком перекиси водорода) (рис.2.),

. f. « ,..W—I—

•сі и гэ

зі

Гїіс.2. Слехтрц P-fL'JP ьавлкулярззх далллрсиіі

При псыцгюпап іюозпучвшічї гйкдайрзпл лдаосо.л з сііоктр? а*Р-ЯМР наЯлядадся арко гар&ліетлП'ьаизоїроікніЗ ситная or мульти-оислоШш лапосоа с шиорюЗ нзотропаоЭ соегоажщэД (ряс. 2о). І» ходо УФ-сблучония вгозз.учошзш дяпоаїл (<\ 251 і;;,;, 1.5 ч, 50°С) происходило ллаь цэСодызол цзжіізігяо а про*їзігз скст-ра ао счет усиления изотропного сигнала, хпргкторного для саочкикид іашлл (рас. 26). Ярп атом сбразоггисо ікм£ядра протокам екіі о казна- ' чнтелъиоЗ стогеоіга (рпзд.2.2.). Okwjko, аго сзлзеяо с илолкм расяродолзнімм охяслнталя - клслорода воздуха - а яультіШ)зіиу-лярлой диспарсіпі. •

Окиелошз ааоопучсшзіх гоїшул п присутствии кэрзааси водорода (20 3KD., 3 ч. 4сРс, рИ 3.5), наоборот, пркшдпло :с сисстк стопзни нодізмзризачми, ііа чїо. а частности, -указывало нймоіюіаго в хроаатограїичесной подзязсіостя вэаикударпсго образца (R{ 0.25 в системе хлорофора-мотанол-всда, 65:25:4 к Р{ 0 для по.тазриоґо образца). Крона того, наблэдзлссь задатков умаяьагеняе оятическоЛ

плотности везикулярного раствора (Ацоо 0.4). При этом в спектре Э*Р-ЯМР происходила разительная перемена: полное исчезновение анизотропной составляющей и появление изотропного сигнала (рис.2в). отот факт можно объяснить внутренней перестройкой, происходящей в ходе окислительной полимеризации, в мембранном Спелое : мульгибислойнзя организация смэняется мицеллярной с одновременным уменьшением размеров и увеличением однородности 1X0 линейным размерам получаемых мембранных систем.

Предварительное озвучивание <4«10 сек. до постояной оотиче-ской плотности) также способствовало образованию мицелл. При этой, как и в случев обработки яерокисью водорода, происходило значительное уменьшение мутности раствора. Однако в данном случае УФ-оОлучэние уже приводило к высокой степо;ш полимеризации. Таким образом, можно сделать вывод, что окислительная полимеризация фосфолипида.(4) в составе липосом требует предварительной переорганизации пипидного бислоя от мультиламеллярной структуры к ми-.целлярной. Очевидно, это вызвано недостаточной длиной углеводородных остатков (Схх), что при любом дезинтегрирующем воздействии приводит к структурному коллапсу. •

Дальнейшиэ исследования прово;силипь на озвученных образцах вазинул, окислительную полимеризацию которых проводили с помощью инициации УФ-оСлучением (л 254 нм, 1 ч, 50° 0).

2.2. Стабильность липоооы в присутствии детергента

Качественное различие в стойкости мономерных и полимерных везькул из (4) заметно уке только из оценки временной стабильности их водных дисперсий: в ггротивоположность мономерному образцу, который разрушался при стоянии в течение’ 48 ч, фотополимеризовен-

куіі no::j.'j оззучі;ьг;;,-;я аиалог нл п-імзал ро1;;зтр:фуь:.:.)ги Ескакэшк в от;;лос:;пЛ : їло глоси, г- тсіч<.ікг) f 0 сую;;. Гіохоо гзув'ляй і. осла -->и.ч:п'л ь ятем ;!глірс.;л'.'!ііп; їд:;';ісі, про.. *стп, псгтоли.‘)г;і г':;.фгс.;; ї. *U‘;i X--U;.! ({ло.л. ■

-)-

4 І.......і ! і \ЧГ

";;иг.:< л-ІОН/:. ur./:.\j.'T.

Гі. :.3. Стс.б.иіі.н.-сть <і Чд-о п;ііішг:Ц.с (г.) (0)

Ju:;ia::.v: ;• п;я:суи;'і;;; гиг гч;ііп; ,

£і) . М

--j------- І.тооз.учс-Ш-4''.' , "Ф •0(5.vi!*!31!' . _ дгі- . .

і:" G'- і

- озвучен1:';."

r.z.C:і;сч: У'/\

---- опауч лиш-' , У'Ь-пблучЭ'И,-? -—s — - 2;.- (І'І .;

Ґі:;,;; ;ч:ч; j, ч ,т. -тиэ:;;ггс .г;ь:;;>. *■( ■■7'7:Yr,l:n;t';:\.

},:;на .iP-mm'v;-' яг; і]ос| j гі’..т;.' : ! і; і::: л;иг;-:ч,:;иі ирі; уь г г ; .'м-'.’.-.тглі;;."'

”.“уии-7-.м: Hi-'t'CSsy'7і,О '.V;.'”."Ч1‘Г. 1 ■? ї Г.І і. лі У. -! ГК)

к (хкікп-.:;; уо-ііїЛ'з;;;;..' смїі'У':?ес-:<п’ік »’ огь і .гт<Л'гчн?.>\ г-чХі'.чіиі?! it- пт;;)і;!]і!:иіт И1', от >:о;;о:;ь .-г -• :ї;і'Г)г;іі;;п Это ^стп och/n; к;Гі і її! ■■ j - г* -; і 1 си ’ , Г:(‘:-.).о;г.м

к прггакчосіж прос-ргггзі раствсіех в отлачпг от- первоначальных козгиух-гргт'г гте’і яісшрсиЗ. Тоїсг-іс прзкї-кческЕ погюку пгзрушо-кггі подсгргзлгсі: сзос?;че:шие .таксові сз (4), сОДссздо; Уй-см-тс?: е уггоггз і Лі ч (ігго. Зо). Кас гтл гоег-реїлосії КПП (разд. g. 1.)t сто, по-Е"7,т:о'';у, обілокястся і:ор£^яо^:р?:?г'. распрздэдглкск кпзлэрой* ішлухі-. с ^л.тетс'Зп;;у/.*гсг.Е л'іспгргші, что далаот уль-

• ТрсЗ:ЛЕЭТ029Э ОГчЧ.уЧСГЗО НОЕКОХІьГгаИ.

Дооістг.’~о г?оокгя -ствбздшхяь с&еэгккгь у Еівжуг, обреба-•уезгіх кгфтак! ігрхгся г.одорэдЕ (сксоло 60S от нечелького аиачс-■ -І~іл СГЗТОрЗЙКгТТї врв С8&ПК6 Л^торг^аи). Кскбаязе USiCOKJ'D ус-тсСчяпзеть к м^хгэ даторгепта, одавяо, прапхяля продоаратсдько

ОЗЇЧГЧСЗПО €07020ГГЛ1»ЭЭЕа!!1УЭ СЗЗСКДО (021- ОТ ЕСГОДІІОГО ургіГЛіЯ

ргггітчгсіх*: пло-люетс). ГЬ-кэдккжу, коаяо прок ота коррааздее

ГС^У ОЇЇЮОЕЇМаКйІ УрОГ.Г".^ СЕГЛОрССОСЕНГЯ і' ГДОТЮПЬГ! ло,тл;зр::&а-

ц'";. 0їзї?»,гз , ггзкзхужг даявдо, са влеадзеаз учхстке б оозд&пкп ]!'.хі:::~ра, обрззугі- о датсріч:::^;■ ііроторц!-:снал.і;о уі/.еиь-

SS." ESS'??»» (KFKIKGCKOtj ПЛОТЕОС1П дісперспі;. ТбКСЛ осрьзои, копо-uojsxs ь .бжгчкярй’з апявхув? .вгяадз вгргходят Е рзотпор сг 00 -■XP3IESX5SL, ПрЧ.ОйЗїЗ КгОСПОЁ СТСПСІИ ПО.ШКЄр!!32ЇІКП, CL-OB структуру '-взвгкул. •.••', ■

. Китвроспгэ разухьта5-и бша плЕучгЕа прз о5рр.Дсчке детергентом ггйі03шп5і02Епга' дгзосов (ріс. 36)., Оптоквнкв г-Еніагашедог. (1)-(3) к фэс{олппн'*у (4 ) Е ьгмздлях бігло выбрскс как 1:20. Эта вропорцЬ: явя&тоя достаточно оахкэдвяов при БввтаюлеЯсз-вЕи глк-,кост.»!фОЕЫПсХ'Л2Посом с. лехмазив (pss.5. 2.Й.).

Шло. погссзаст, что остаточная отелень свзгорйооеяшт ирп ПЗСіЛ'КЄ даиргента .ДЛЯ Б ОС Г. УГХГЕОЛШП ДОТЗрХЗШЫМ состав ПЯЭТ . прайрнэ 1/2 от исходною . значення. Вэ-ввякаску, sto'снязаао с

повышением структурной изотропности липидной упаковки гликозили-рованннх везикул по сравнению с бислсем из чистого фосфолипида (4). Кроме того, при небольшом количестве детергента (0.25 моль Triton Х-100/ 1 моль липидной композиции) оптическая плотность везикулярных дисперсий повышалась. Очевидно, это объясняется встраиванием малых количеств детергента в везикулы, что приводит к их укрупнению и, как следствие,- к увеличению светорассеяния.

2.3. Взаимодействие гяххозпровашоа везикул с лекпгааья

Многочисленные примерк биологического узнавания на клеточном уровне позволяют считать, что каздый тип клеток имеет присущую только ему молекулярную архитектонику хлеточной поверхности. При отом, счэвидно, именно углеводные детерминанты определяют специфичность последней, поскольку они обеспечивают такое разнообразие молекулярного состава плазматические мембран, какого не мсгут дать никакие друг/e компоненты. В принципе, биологические еффэкта от поверхностных взаимодействий при определенных условий! мокко зарегистрировать. Включая глкколилиды и/или гликопротеюш в со-., став фосфолипидннх мембран, можно получать модельные, систега, которые способны взаимодействовать с макромолекулами биогенного лроисхогдения, имевдими специфическую реакцию на углеводные остатки мембранной поверхности,- лэктянсми. Именно с помоігьп после днгас удается установить такие параметры модельных систем,. как уі'леводную специфичность, плотность рецепторов, физикс-химическиэ свойства липидного матрикса в околорецепторнсм окружении,' что в суйме и определяет индивидуальность клеточной поверхности.

■ В сеєтє сказанного были проведены исследования до взаимодействию гликозилировйнныу везикул с гя.чактогюсвязыващим пектином

клещевины - И1с1пиа соптт1э (ИСАХ). Известно, что гликопротеины с концевыми галактозильннми остатками, дающими положительную реакцию преципитации с .пектином ИСА1, обладают также сродством и к другим галактозосвязывавдим лектинам, в частности, к лектину, локализованному на наружной поверхности плазматической мембраны ге-патоцитов человока и животных. В связи с этим логично предположить, что гликозилировянные лилосомы, преципитирупдие в присутствии НСА^, будут также характеризоваться повышенным сродством к гепатоцитам.

В настоящей работе в качестве углеводсодержащих компонент использовали синтезированные гликолипида (1)-(3), которые встраивали в липосомы из фосфолипида (4) в количестве . После

озвучивания и фотополимеризации липидной композиции в физиологическом растворе к везикулам прибавляли лектин НСА1. Процесс преципитации контролировали по изменению оптической плотности дисперсий при 360 нм.

Как видно из приведенного графика (рис. 4а), наиболее высокую степень связывания показали липосомы, гликозилированные лактозой (85Ж-ое> относительное, повышение оптической плотности). Значительно менее эф$ективно с лэктином взаимодействовали везикулы, содержащие в качестве углеводной детерминанты галактозу, и практически совершенно но прёципитировали липосомы, имеющие на своей поверхности глюкозу. •

Полученные данные говорят о реальной углеводной специфичности лектияа НСАХ к терминальной' галактозе получешшх модельных систем. При этом определяющим фактором является удаленность га-лактозильноЯ детерминанты от липосомальной поверхности, /звестьо, что монссахяр/дные грунта в составе липосом находятся на уровне

'00

б

71;

—>-

і 10 15

Г,'с;л

СО

fuc. l. Вгіі«‘лдс.2стаи9 і\ігзсоі’кя*рогпппх

3)

-------■*'1 І£С

__а-----------5 і Gal

- »— 5;; сіс

б)

™осо:« с лєкплюм ГС"^.

...43 Іде

—і------S3 Гео

—2— -125 Lee

Підрс>ік-лііьх учсстксв фсоЗог^Е’даых молекул. То::оо рссаслоіаш) іірасодйг х йхрлщровйіда угаоаодаах іруни я, isa сеугл, :< а«труд-нтпг? спец^ДОясксго воlizx.'Г(>:е::я ejctiit.ного цеиерз далеку £i лекиша с rjaso^xuiLKcA догорікангой. йшеоагл «з ю^иизллого •Ірагмоиіа і:з едіїо. углезедаоо ьгспэ >і»д поверхностью ;*оіл! -puru от-ГріЛПвТ сосЗодпгЛ дсстул к іггту, Пр?К'*йЧаСгіИ зсилтлал з.'.ї:.ч;глл Hocofmiicoi-J xcuspzui кз вслаодеЛо-ГЕЗД. .

С>цбС1^э:жи;.1 явяязтоя з плотность углэсодоа датергезюя? на ногэрхлоста :.:c:,.!CptKi (р«с. it?!. ?5;г, уге^ячигле дол.! г/.ико.Е.іШ’ди з „чйіидясй іісмпоз:і!*ьи ке сигкьаот yuasczniii сіж:ійл;ііія с .-синкноы. Очдгидно, ирозгкскйе яекоюрого к[«ітлчосхо"о зн.пекяи нлоїтак-іи r.w.'j3H4fc:cix осгачков приводит к тому гл ьфіекту, что ;t бліпсоть олюа .шзосомальноЛ нодоршоспи,- иршшотгеззихм сшшгсуши ул

terrors центра лекікий с угл^ьсдасИ детврдашггой.

. Токи? образец, паг.учза::^с кодзлгяас слеша удовд&творядо рег-гит востйЕД'Яз:^. зйдач: по.’гі-.'срглк вззйі^’лі из фосіолкииди (4; ccr.z2zrr.cb ciassin-inii оСі"п?;г, нског^сг^г-тзаа ааачшчн., ь ТС £К Ер^Г'г ОЯЛСД"' O’lOCuC'K'-CT^r г л^отруюсзг. BbO£i!iUC Е к* СОГ-TZS: КГКОрХГГ КГ-.Гі:-;сСЇ2 ГЛК’./СГЛ:';;»' (3) Прі".'ДП^ К РаЗ!ІСИІ005Е

спс-’г^г-'з ас кг.—:од?Ис гіігг:;: ь с гзютьсу RC/'.. Псійслйє eose.:-

Л.1СГ ЕЗД’-ТіСЛ, ЧТО Д'’—"’? КГДЛ.ГЇ КЗҐ^Т (Krrt БСП9&! ЗОВПНіі Г. І.І.-

чссте-з с7с0:і-*.;*п: Сг^грг..т^Г"зкїт ксп1: сЯгсрег. дг”? ксттраилоізюгг;

тр:гс;70рг2 ІЯ Vfl'O.

В У Е 0 І Ь!.

(йгггссгрогггіг нокгс глйі£-г2да.тіпЗізрда, содерссазз. сухьСччц,-рклцгс ітрушеі в тзр^из^ілсГ »?гстг легпдно* кпкпеигю;.

Z. ГазраЗотан оіпгсїад^іЛ мсто;; получения гАЩврвягликозадэй пг

ОСКСТК ТІОЛОТТ аЦ9ТБТОо СКгрСЕ И ИЗОХІрОТШЛЇДЄИГЛИЦОр7™й Б пр:і-сугетгл™ квояотг Лькягсв.

:і. Пгхдаотоп метод сютеог гл^эрилглкксзидоЕ с f-ксіф'.гурвц’ггГ прй гйомерном цептгл путе.*'. аглк.'шровегаія полных ацматеп гахь-JK.B е прпеутсткз: казло* Львиса с последующим еггздвішж дпоГ-кей связг до диолг. Кзучолг кинетика аллилировгпид пенїрацоті.-тов р Ь-глшсет и р D-галчктоак. . _

4. Ис.с де довгім Mor:5j анообрвзутсг;?? свойств?. мсд^їицтроЕЕішого <їос-

. фзтвдшяолгетз, содоржаг®го е лппадво» часта cyj4^rn^p:i"i гі,л

_ грузгш, методом ал Г-ЯК?.. Изучат окислю в Лакая поли.тарі’.зшікг:

лолучркгаго фосфолапидя в сос^аиз лтпіосок прк различных уоло-

ЬІ'.ПХ .

£. ИрсдоиоистркроЕвча воі'моїиость ві лю'ієіієя получэ:jktd; гликолит-

дов в состав липосом. Проведено сравнительное Исследование связывания гликозшшрованных полимерных липосом о лектином ЯСА1. Показана высокая степень сродства лектина к лилосомам, содержащим в качестве углеводной детерминанты лактозу.

Ос;ювные результаты работы изложены в следущих публикациях:

1. Любешкин А.В., СеОякин Ю.Л., Евстигнеева Р.П. Синтез бяс(ал-кклгликозид)дисульфидов для получения смешанных липосом. / Материалы V Всесоюзного симпозиума по органическому синтезу "Новые реагенты и метода в тонком органическом синтезе", Москва, 12-14 декабря 1988 г.- М.: из-во АН СССР.- 1588,- С.109.

2. Любешкин А.В., Ким Е.Н., СеОякин Ю.Л., Евстигнеева Р.П. Синтез О- и Б-октадакадиенил-р-О-глвкозидов. / КОрХ. 1990.- Т.26.-Вып.6.- С.1237-1240.

3. Любешкин А.В., Себякин Ю.Л., Евстигнеева Р.П. Простоя метод получения гликозилдиглицеридов. / Биоорган, химия.— 1991.-Т.17.- Л Ь.- С.710-713.

Зак. 331 тир. 100 Бесплатно формат 60x90/16 Ротаприятная МЭТХТ им.Ц.В.Ломоаосова

и.Пироговская м. д. I