Синтез и изучение олигонуклеотидов, модифицированных остатками пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



АКАДЕШЯ НАЛ УКРА1НИ 1НСТИТУТ БЮ0РГАН1ЧН01 Х1ИП ТА НАФТ0ХШ1

на правах рукоп:;су

ЯЖЖ. СЕРШ ИЮКШИОВИЧ

СЖГЕЭ ТА ВКЗЧьННЯ ОЯ1ГОНУХЛЕОТИЯ1Э. МОДИФ1КОВАНИХ ЗАЛИВКАМИ ПЕ1ТШ1В.

02.00.10 -Бхоорганхчна ххмХя. хкая природних х фхзхояогхчно активних речовкн

Автореферат дисертаци на здоЗуття науксвого ступеня кандидата ххмхчних наук

Кихв - 1993

Робота викокака в 1кститут1 молекулярно! сИологП 1 генетики АН Украхни. ... '

Науков1 керхвники:

доктор зшачних каук В. П. Заситоза

кандидат хшхчних каук I. В. Алексеева

ОфИЦкн! опокекти:

доктор 61олог1чних наук В. К. К1(51рев

Проз1дна установа:

кандидат хишших наук А. Г. Терентиев

ййвський университет 1м. Т. Шевченка

Захист в!дйудеться "_ // " ф^О/б? 188,5 р. на

зас1данн1 спец!ал1зовано1 вчено1 {$ади Д 016.65.01 в 1нститут1 сЯооргак!чно! :а;л1 та нафтох1ми АН Укра1ни (253060 м. Клав, вул.Мурманська, 1)

3 дисертацдеп можна -оэнайомнтись в б1блютец1 1нституту •б1оорганг,-ио"1 х1м!1 та нафтох1мП АН Укра1нл.

Автореферат роз1сланий " У "

Т

Вчений секретар

199-Зр.

спец1ал!зовано1 вчено! ради

Д. М. Федоряк

- 1 -

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА Р050ТИ

Актуалы-псть пдоблемн. Нротягсм останн1х рок!з з р1зко:.'.ан1тн::к прокар1отячких i еукар1отцчн::х дкерел вид!лен1 зм!зан1 НК.(нукле1-ноео кислотно )-о1яков1 б1опол1мери о козалекткжи зв'язкамн мож компонент а;,■ и. Аналог1чн1 структура можуть утвсрюватись при д!о ряду феру.ент1в кг ДКХ.напрпклад, топо!зомераз. Встаксзлено, цо практично у Bcix нуклеотидСЕК >-болков:1Х структурах (за влнятксм амигоацил - тРКК) боякова частика молекули пркегднана до ИХ ado куклеозиду через залгхок фосфорко! кислота. В зиясненно структура i функцП таких гобрндних б1опол1».к?роз ьажлизу роль можуть з!грати синтетичн1 ОЛ1ГО- i нуяяеспептид;: з сосфод::еф1рн::м ado фсссам1дки:.: зв'язкамн Mi:x компонентами. А:,икокислотн1 чох1дн1 мсно- "Г ол!го-нуклеотидов uiKaBi i зручк! у.оделыи систоми для зизчекня прсцесоз о'1лкозо-кукле1ново1 взгомодН , для моделкзання бэрмектативнпх реакидй.

(Шгонуклеопептидп (ОКП ) знаходять таксж застосузанкя як xi-м1чн1 зонди, маркер:; в молекулярной б1олого! та б1оорганочной xi-МП.

■ i Ук1версальна властивостъ ол1гонуклеотид1з утзораватп м!цно специфочн1 комплекси з ксмплемеятарними д1лянками нукле1козих кислот лояладена в основу створення л!карських засоб!в нового поколз.-ння (Antisense oligonucleotides).Бараний ефект дссягаеться шрхом -направленого 1нгобування експресИ певних генов , цо приводить до пригн1чення ix функоионування. Шдвиаення ефэктизност1 д!1 подобии ол1гонуклеотидних реагонт1в, на наш погляд, можна досягнути шляхом козалентного прнеднакня до них пэптад!в. "Пептидна модио!-кац!я" може сприяти транспорту таких кон'югатов через цитоплазма-тичну мембрану клотини, п1двиаувати стабильность дуплексних структур, а такох подвищувати стшкость ологонуклеотид1з до ферментов.

Мета робота полягала в розробц1 методу синтезу ол1гонуклео-пелтщЦв фосфамодного типу шляхом застосування окислювально-в1дновного реагента - cyMiiri тркфен1лфосф1ну Г'дширидилдисульфз.-ду. 0кр1м того нео<3х1дно було такох провести попередне досл1дження мохливост! використання ОНП в якост1 антисенс^ ол1гонуклеотидов (cTiHKiOTb до ферментов, здатн1сть утворювати комплементарн1 ком-

плекси

Основными задачами бута:

1.Розробка методу синтезу ол1гокухлеоткдил-( Р-»-К)- пептид1в з допо-могоэ окксл;овально-в1дновного реагента - три$ек1лфосй1ку 1 2,2'-дипаридилдисульф1ду.

2.Вивченкя реакцП утворення Р-К зв'язку та визначення оптималь-них умов кокденсацП. ол1гонуклеотиду 1 пептиду.

3.0ц1нка можлквоот1 використання запропоковакого п1дходу для сан- : тезу арги1иноЕ>.иснпх ол1гонуклеопелптид1в без попередкього захис-ту гуа:ид1нсзого залиику ам1нокислоти.

4.Вивчення впливу пептидно! кодиф1кацИ на збереження аф1нност1 ол1гонуклеотид!з. 0ц1кка ст1йкост1 ОНП до протеол1тичних--фермен- • т1е.

Положения. як! виносяться на захист: 1.Окислювалъко-вадновкий реагент - сум1ш трифен!лфосф1ну 1

2,2'-д!1Гпридиядисульф!ду може бути заетосований для синтезу ол1го-нуклеоткдил-СР-»-Н>-пептйД1В.

2.Ковалентн1 кон'»гати ол!гонуклеотид1в 1 основних пептидхз можуть бути е""ористан1 в якост! антисенс- ол1.гонуклеотщив.

Кс./кова новизна та практична значения робота. В робот 1 вперае показано мохлив1сть використання 6кмсно-в1дновко! пари - сум1ш1 трифен!лффф1ну 1 2,2'-дип1рикилдисульф1ду для одерхання ол1гонук-леотидил-(Р->-Н )-пептид1в. Реакидя утворенкя Р-К зв'язку зивчека в присутност! р1зномак1тких нуклеоф!льних катал1затор1в, ауднокислот та пептидлв р1зно1 осноеност! 1 разного ступени !х захисту. 3 до-помогою ЯМР-спектроскопП, кап1лярного электрофорезу, високоефек-тквно! хроматограф!.! проакал1зовано склад реакцШних суьишей одерхання ОНП, :.денткф1 ковано основн! поб1ЧН1 продукта. Показано моя-'лив!сть використання ковалентних кон'югат1в ол1гонуклеотид1в 1 основних пептид1в в якост1 антисенс - ол!гонуклеотид1В. •

Матер1али цхс! робота були подан1 на школх-конфереши! "Структура 1 функцп б1опол1мер!в" ,СЛьв1в, 1989); на Шжнародному симпоз1ум1 "Синтетичн1 ол1гонуклеотиди: проблеми ! перспективи практичного використання" (Москва, 1991).

По матер1алах дисертацП опубл:.ковано 9 роб1т.

Робота складаеться !з вступу, л1тературного огляду (I роз-

Д1Л), odroBopsKHH результатов CII розд1л), експерименталию! частики (III розд1л), знсновхав i списку цитовано1 лхтератури.

В першому розд'1л! дисертаци зроблено лхтературний огляд метод1в, як1 застосовуються для синтезу ол1гонуклеопептид1в .(ОНП) фосфа.\идного тапу. Серед них найб1льиого поширення набув п!дх1д з викорястанням водорозчинного харбодПмду. Для синтезу ОНП ui умо-ви не завэди приЯнятлив1, оскхлькк г1дрофсб:-и пептяди погано роз-чиняються у зод1. В свои черту функидональн1 групи водорозчкнних пептидхз можуть • давати nodi4Hi реакцП з

I-етил-3-(3'-диметилам1нопроп1л)карбод11м1дом i, отае, потре<5ують захиснкх труп, що в1дпов1дно понижуе' розчишисть блоковаких про-дукт1в у BOfli. Основним недол:ком зазначеного методу е досить тривалий час реакцП, який може приводит» до nodi4Hoi реакцП мо-диф1кацП гетероцикл!чних основ ол1гонуклеотиду п1д д1ея карбод1-iuixy.Запропонована для усунення цього недол1ку обробка фосфам1-Д1В, то ьастять модиф1кован! гетероциюичн! основа, 25% водним розчином ам!аку (12 год, 20"С) ке завжди прийнятна для ОНП, ос. к1льки в dinbiiiocTi випадк1в використовупться етериф1кован1 пептиди, складноеф1рна трупа яких може п1д д!ею амааку омилятись ado перетворюватись з ам!дну. 0кр1м того, при допомоз1 зодорозчинного карбодНм1ду oTpHMaHi лише ам1нокислотн1 пох1дн1 ол1гонуклеотид1в.

На наш погляд, для синтезу ОНП сл1д застосовувати сумщ три-фен1лфосф1ну i 2,2'-дип1ридилдисульф!ду (Ph3P/Py2S2) в присутност1

II-метил1м1дазолу (Melm). Цей окислювально-з1днозний реагент '.¡зико-ристозувався для синтезу фосфамШв ол1гонуклеотид1в i нуклеозид-5'-пол1фосфат1в .BiH не реагуе з кияснуклеотидними фосфатами, З'-оксигрупами вуглеводнезих залиикхв. 0кр1м того, при допомозг цього реагенту реагаию утворення P-N зв'язку у.ожна проводити як i в орган1чних розчинниках; так i в водному середовк'д! з викоркстан-ням активного промхкного 1нидазол1ду.

Другий розд1л присвячено розробц! методик синтезу ОНП, синтезу модельних ол1гонуклеот:шз, синтезу модельних пептидов.

■ Анал1з можливих - умов проведения реакцП синтезу ол1гонуклеотидил-(Р-»41>-пептид1вза допомогою cyMirni Ph^P/Py^s,.

При спроб! эастосування РЬ3Р/Руг5г для синтезу ОНИ фосфам1д-ного типу кеобххдко врахозувати, по-лерше, р1зноман1тн!сть функа1-ональних груп пептид1в, по-друге, що в 61лы1>ост1 зипадк1з пептид ( його складкий еф1р) перебувавть в солъозгй: форм!, а це вимагае внесения в реакц1йну сумш додатково сснови.

Конденсац1ю монозагащено! фосфатно! групи ол1гонуклеотиду з аминокислотою при дП РЬ3Р/Руг2г мокка подати каступкою схемою 1:

и - PyzS2/Ph3P RO-P-O —i-f-—

А-

RO-^-O-PPh-

¿Н '

"S N

Ру СМоХ} fDMAP)

-R0

и .NHa"i

-Р-О-т

О

R0-J-NHR,

R -

залишок олггонуклеотиду

Rj. - залкшок пептиду•або алк1л Схема 1. Синтез фосфам!дних пох1дних ол!гонуклеотид1в з вико-ристанням куклеоф1льних катал1затор1в (a) i без них (б).

Для одержання звичайних 5'-фосфамШв ол1гонуклеотид1в, ■ як правило, використовували 2,5-гЗ -краткий надлишок Ph3P/PyaS2 L 4f7 - кратки!' кадлкшок ам!ну на кожку 5'-к!нцеву фосфатну групу. Якщо дотркууватись запропонованого сп1вв1дношення конденсуючого реагенту i ол1гонуклеотиду СО,002 мг Py2S2 i 0,0025 мг Ph3P; 5 ' Azeo ол1гонуклеотиду ),то 0Ш практично не утворювались i основним продуктом реакцН був симетричний гарофосфат олi гонуклеотиду. Такий результат був слричинений, можлкво, незначними калькостями води, но попадали в багатокомпонентну сумхш. Запоб1гти цьому мокна було значниы 50-кратним надлишком Ph3P/Py2s2 , який "випалював" воду в pearauflHift cyMiuii. Надлишок пептиду або амшокислоти в реакцН також в1дповз.дно зб1льшувався i досягав 1нод1 50-100-кратного, по Б1дношенни до вих1дного ол1гонуклеотиду.

Карбоксильн! групи пептидхв здатнх активуватксь Ph3P/Py2s2.

цо, очевидно, викликало б перебхг некоктрольованих реакцхй. Запо-dirra цьону кебажаному пронесу у.ожна буяо эикористанкям метилоЕих e$ipiB пептидхз. Метилов! еф1ри аминокислот, пептид1в дуке часто перебунаэть з сольов1й форм!. Необх1дне в цьому внпадку додаткове внесения з реагаЦину сумхш оснози- триетиламхну С ТЕД) в досить небезпечним: в!до.мо, ас сильнi основи зупикяють реакцию утворенкя P-N зв'язку з допомогои Py2s2/Ph3P на стадИ сим.етричкого пхрофос-■ фату..I д!йско при одночаскому введема scix компонент1в в реак-uin, в тому чпсл! i TEA синтез ОНП практично не йиоз, утворвва-лася лише незначна к1льк!сть симетричного п1рофосфату олхгонуклео-тиду. Отже.диильно булс попередньо активузати б'-кпщевий фосфат ол1гонуклеотиду, а вке потхм добавляти cywia пептиду з- -тел. ■ -В цьому зипадку з допомо'гов кап!лярного електрофорезу рееструзали каявнхсть ОЫП з реакц1йнхй cyuiai.

OflHiea з занливих умов усп1акого проведения реакцхй такого типу, е добра розчинн!сть il.компонентов. (Мгонуклеотиди викорис-товувалися в вигляд1 цетавлонових солей, якх розчинялися в орга-н1чких розчинниках (диметилформам1д СDMrA), диметилсульфоксид • ( dmso ), п1рвдин (ру)), , але кайкрашда розчинником для них' був DMSO.В сбою чергу унхверсальним розчинником для пептид1в, ix метилових e6ipiB е' DMrA. Виходячи з цих пяркувань активне пох1дне ол1-гонуклеотиду отримузали в dmso, яке пот1м вводили в реакцхю з роз. чином пептиду з DMFA. --

Отгсе, для синтезу ОНП фосфамхдного типу бажано використовува-ти великий надлишок конденсуючого реагенту (P2s2/Ph3P), прозодитл преактивахи» кхнцезо! фосфатно! групи э dms0 з наступним добавлениям пептиду i. tea в dmfa.

Аналхз основних продукт1в реакцп одержання ОНП ■ • '(Ьосйамхдного типу.

. Можливхсть утворення фосфашдного зв'язку ,Mix олхгонуклеоти-дом i пептидом була вивчена методом ^Р-ЯМР на приклад! взаемодП рТС Ac) i трипептиду Pro-Arg-Val-OMo * 2 TFA. До попередньо активо-ваного мононуклеотиду рТ(Ас) (0,1 М); Pyzs2 (0,3 М );Ph3P (0,3 М ); Melm (0,3 М)),через 15 ХВ ДОДали трипептид Pro-Arq-Val-0Me*2TFA

0,5-

2Б0.;.

СНзСЫ,'^ -20

МсОУа1 АгдРгорС^Сб' >

/

/■

/

✓

/

/■

/

/ ,

-10

0 Час ,хв 15

30

42Б0

/

/

-0.15

О Час,хв Ъ

0.5-

СНзСЫ,'/./ У

рСССС

/

/

о Час

,хв 15

20

10

30

260

0,5-

СН3СМ,И 4-20 ССССр(5'-5')рССеС / '

/

/

/

У

у

У

1

О Час ,хв 15 •

1-ю

30

Мал. 1." Анал1з реакц1йно1 сумош синтезу (рСССС )-5'-Р-Рго-Агд-Уа!-0Ме з використанням ВЕРХ: 1онообм1нна хроматограф1я реак-ц1йно1 сум!ш1 (а) та ОФХ П компонент1в (б-г) (1 - продукт реак-цН, с рСССС >-5' -Р-Рро- Агд-ОМе; 2 - ВИХ1ДНИЙ рСССС; 3 - СНМетриЧ-НИЙ ирофосфат, ССССр- (5'-5')-рСССС).

ЮХ

ОФХ

-0,15

2БО

-0,15

-0,15

СН3СМ,« -20

-10

,ХВ 15

Мал 2. Анализ реаюийних супишей ' синтезу ОНЛ:

(рТ10 >5'-Р-АЬх-Агд-0Мв, (рТ10) -Б' -Р-АЬх-Ард-Агд-ОМе, (рТ10)-5'-Р-ЛЬх-Агд-АЬх-Агд-ОМе 3 ВИКОрИСТЭННЯМ

1онообм1нно1 (ЮХ) та ойернено фазоЕо! (ОФХ) ВЕРХ, х- - позначено п1к, що вд.дпов1дае симетричному гпро-фосфату ол!гонуклеотиду, сссср(5'-5')рсссс,

(0,2 M) i TEA (0,2 M). Через 30 хв сигнал вихХдного мононуклеоти-ду (-0,2 и.д. ) зникав, проте реестрували сигнал з хпичнкм зсувом 5,14 м. д. , характерний для фосйамШв.

В Р-ЯМР-спектр1'спостер1гали також сигнал nodi4Horo продукту (-10,17 м. д. ) - симетричного трофосфату ол1гонуклеотиду, 1нтенсивн1сть якого залежала в1д умов проведения реакцП.

Склад реакц1йних сумшей досл1джували при допомоз1 високо-ефективно1 р1динно1 хроматограф!I (ВЕРХ), як це показано ка прик-т лад1 синтезу (pCCCC)-5'-P-Pro-Arg-\/al-OMe (мал.1). Дан1 iOHOOdMiH-Hoi хроматографы (а) вказували на присутн!сть в реакц!йн1й су»цш1 поруч з вих1дним олхгонуклеотидом (2) двох нових пох1дних. Одне з них (1) мало меншу к1лыисть зарядгв, а в другому (3) cnocTepira-лося значне ix зб!лынення по в1дкошенни до виххдного ол1гонуклео-тиду. Складов! реакцшно! cyMiuii р1знилися також своев г1дрофобн1-стя i максимальной вона <5ула в продукта (1 ). Враховуючи ui дан! можна припустити, ; но niKy (1) з1дпов1дае ОНП, тобто (pCCCC)-S' -P-Pro-Arg-Val-CMo (зменшенкя заряду, 'збхльшення гхдро-фобност1); a niKy (3) в1дпов1дае поб1чний продукт - симетричний шрофосйаг, ССССр(5' -5' ЗрСССС ( р!зке зб1льшення заряду, незначне зб1льшення г1дрофобност!). Симетричний п1рофосфат ол1гонуклеотиду, не Miстив пептидного залишку. Через те його хроматограф1чн1 характеристики повинн1 бути тотожн1 в реашийних сум1шах з однаковим вих1дним ол1гонуклеотидом, але р1зними виулдними п£1)тидами. Це припущення п1дтверджувалось анал1зом реаюийних"сум1шей синтезова-Hoi нами cepii ОНП. Час зиходу з колонки симетричного. пхрофосфату однаковий при хроматограф:! реакц1йних сумшей р1зних пептид1в (мал 2).

Про приеднання до ол1гонуклеотиду пептидного залишку св1дчив також кислий (0,1 М НС1,14.год) i лужний (TEA: вода: п1ридин, 5:3:2, 14 год ) г!дрол1зи ОНП. Кислий гхдрол1з в умовах розщеплення фосфа-миного'зв'язку приводив до утворення олХгонуклеотиду (мал. 3,6 ). Наслхдком деблокування карбоксильно! групи пептиду ол1гонуклеоти-дил-(5'-Ю-пептиду в умовах лужного г1дрол1зу було зменшення , часу виходу нуклеотидного материалу з колонки при ОФХ ( мал.3,в).

Синтезованх ОНП а також контролый проби з в!дпов1Дними, але ' не модиф1кованими ол1гонуклеотидами оброблялись 5,7 N НСI при 110°С

протягом 24 год. 0триман1 г1дрол1зати для визначенкя к1льк1сного сл!вв1дношення пептиду 1 олхгонуклеотиду в ОНП анал1зувались при допомоз! аминокислотного анализатора.

А260 СН3СМ,5<

Мал. 3. ПрофШ ОФХ реаюийних сумхшей, що отриман1 в результата а-синтезу (рсссс )-5'-Р-Рго-Лгд-\/а1-0Ме;й-сум1ш1, но отримана в результат! кислотного; в - 1 лукного го.дрол1з1в ( кроссе, 2 -ССССр-(5' -5')-рСССС, 3 - (рСССС)-5' -Р-Рго-Агд-Уа1-ОМо).

Запропонована нами структура симетричного п1рофосфату ол1го-нуклеотиду для основного поб!чного продукту реакци синтезу ОНП узгоджувалася з даними ^Р-ЯМР-спектроскогиг, ВЕРХ 1 ам1нокислот-ного анал1зу.

Шд61р оптимальних умов синтезу РКП.

0сновн1сть реакидйного середовища мае виршальне значения для синтезу фосфам1д1Е з використакням ау25г/р^зр- Було показано, цо в присутност1'теа така реакцдя взагал: не проходила, що примускло нас проводити попередню активаидю ол1Гонуклеотиду з наступним до-давакням сум1п1 пептиду з тед . Значний надлишок теа ь!дчутно зни-жував вих1д идльового продукту реакци, зб1льшуючи 'к1льк!сть по--бхчного симетричного пхрофосфату (таб. 1).

Таблиця 1. Вплив к!лькост1 TEA на вюид ц1льового продукту при ClIHTe3i ( рСССС )-5' -P-Pro-Arg-Val-CMo.

Молярне сп1вв1днои;ення Вихд.д 0НП,% Вих1д симетричного

пептиду i TEA пхрофосфату,^

1:1 79 .21

1 : 2 39 . 61

1 : 3 35 65

Опираючись на наведен! вище дан1, доц!льно було використову-вати методику, яка передбачае мШмальне внесения tea чи взагал! сильних основ в реагаЦйну сум1ш .

•Синтез фосфамШв ол1гонуклеотид1в при допомоз1 py2s2/ph3p можна було проводити двома шляхами: в присутност1 катал1затора або без ньото (схема 1).

На nepinitt стади в1дбуваеться активаидя фосфомоноеф1ру. При наявностг в реакц!йн!й cywimi нуклеоф1льних катал1затор1в- Molm, Ру, диметилам1ноп1ридину (DMAP), йде утворення промхкних високо-реакцхйних цв1ттер1окних 1м1дофосфат1в, як1 реагують з нуклеофаль-ними ам1нокоыпонентами. Застосування Py2s2/Ph3P без катализатора дае змогу легко фосфорилювати слабкоосновнд. амхни (схема 1,6). Присуппсть катализатора, навпаки, утруднюе реашЦю з слабкооснов-

- 11 -

ни мм 1 уможливлюе и э б1льш оскозними ам1нами (схема 1,а).

И-концев! амшогрупи пептщцв належать до гмтв середньо! оснозност! (рКа<9). Тому синтез олз.гокуклеотидил-(5'-Н)-пептад1в, на наш погляд, детально було проводитя в присутност1 нуклеоф1льно-го катал1затора. Це припудення яскраво гйдтверджувалк дакг, наведен! в таблиц! 2.

Таблиця 2. Анал1з реакц1йних сумшей синтезу пептидних пох1д-них рсетсстс фосфам1дкого типу при допомозо каполяркого електрофо-резу.

Пептид Нуклео-ф1льний катало-затор Трива-лость реак-цП.гоЭ Склад реакш.йно! сум1д1,%

ОНП Олхго- нуклео- тид Симетрич-ний п1ро-фосфат Кез1до>а продукти

С1у-Е1у-0Ме Мс1т 0,5 52,7 13,5 33,8 -

СТу-бТу-ОМэ - '2,5 26,0 37,2 10,8 25,0

Агд-СМе Мо1т 0,5 45,5 18,4 19,1 ' 17,3

Агд-СМе - 2.0 32,1 32,2 28,3 7,4

В1домо,; ¡до реагаийна здатн^сть прогажних фосфамШз зменшу-еться в1д хиридинового до ОМАР-похшюгс. Нами встановлено, ¡до для синтезу ОНП можна застосовувати кохен з трьох катал!затор1в. Але коли в реаюаю вводилися аргищновмосн! пептиди з сольовим захис-том гуанодоноЕих груи бажано використовувати МеХш, який забезпечуе найкращий вих1д цольового продукту (таб.3). •

3 експериментальних данних видно (таб. 4). то зм!на основно-ст1 пептидов суттево впливала на ход реакци, змхнпючи як!сний склад реакц!йних сумшей. Так, нгЛкраще конденсация йшла з прол1но-вм1стним пептидом, метиловими еф1рами глщилпацину 1 аргинону. 3 пептидами, що м1стять неприродну 8-ам1нокапронову кислоту (АИх) вих!д побочного продукту (симетричного порофосфату) перевицував вих1д ОНП. Хоча ран1ше було показано, що ал1фатичн1 ам1ни ацилю-ються практично к1льк!сно з застосуванням Ру252/РЬ3Р.

Таблиця 3. Анал1з з застосуванкям капглярного електрофорезу реакцЛйних сукишей синтезу (рсетсстс)-5'-р-АИх-Агд-сме а викорис-танням р1зних . катал1затор!в.

Нуклеоф1льнпй катализатор Склад реакихйно! сумШ.Я

ОНП Олхго- • нуклео-тид Симетрич-КЯЙ шро-фосфат Нев1ДОм1 продукта

Ру 12,2 ■30,8 17,8 39,2

Ме1го 14,4 33,7 48,4 -

ОМАР • 12,5 53,1 : 34,4

Таблиця 4.Анал1з реакидйних сум!шей синтезу пептидних пох1д-них рсетсстс фосфам1дного типу при допомозх кап1ляриого електрофо-резу.

Пептид рКа - акино-групи Н-К1Н- . цево! амхно- . ккслоти Склад реактйно! сумш!, %

ОНП Олхго-нуклео-тид . Симетрич-ний пхро-фосфат Неведом! продукте--

Рго-Агд-\Га1-0М© 10,2 53,5 25,0 -21,5

Оу-БДу-ОМе 9,8 - 52,7 13,5 33,8

Агд-ОМо 9,0 42,2 17,1 " 17,5 23,2

АЬх-ОМе 10,7 35,6 35,9 28,5

АЬх-Агд-ОМо 10,8 27.3 32,7 40,0 . " - ■

АИх-Агд-Агд-ОМо 10,8 10,3 45,1 30.4

' Наведен1 дан1 св1дчать про переб1г конкурентнее процесив, як! йезпосередньо зз'язан1 з основн1стю використовуваних пептид1в. Значне зб1льшення "загальноГ' основной! пептиду приводило до зм1-

щення piBHOBam реакци в <3iK утворення симетричного пхрофосфату i зниження.виходу ОНП. • В той же час зростання стаб!лькост1 к!нцевого продукту реакци - фосфам1ду ол1гонуклеотиду спричинввало зсЛльше-ння виходу ОНП. Так, наприклад, пролхновий пептид, маючи високу ocHOBKicTb, але утворвючи кайст!йк1ший фосфамх.д серед ycix Еикори-станих пептидхв, дав дсскть високий виххд ОНП. В окремих реакц1ях ол1гокуклеотид1в з цим пептидом нам вдавалося досягти ;практично KinbKiCHOrO виходу ОНП.

Отхе.на nepedir реакцИ, утворення ОКП i поб1чних ' продукт1з безпосередн1й вплив мали як нуклеоф!льн1 катал1затсри так i основ-н! властивост1 ам1ногруп пептиду. Реакцхв сл1д проводити з викори-станням каталхзатора', бажако Helm.

Синтез ол1гонуклеотидил-( 3'-N )-пептид!в.

Ще в перших cnpodax використання Py2S2/Ph3P для синтезу олх.-гонуклеотидхв (10 екв. реагента, 48 год) вгдзначалссь замщення в1льних оксигруп в вуглеводневих залишках на 2-т1оп1ридинсв1 (до 5'/.)з утворенням 5'-$-п1ридилтхо-5' -дезоксирибонуклеотид1в. Можли-во в силу них чи imirax киркувань для синтезу фосфамШв моно- i ол1гонуклеотидхв викорисговувались в основному 5,'-фосфати нуклео-тнд1в i ол1гонуклеотид1в. При наявност1 в1льних 3'-г1дроксильних груп в ол1Гонуклеотидах nodi4He алк1лт1олування не спостерхгалось. Не эареестровано воно i нами при синтез! ол2.гонуклеотидил-( 5' -N )-пептид1в.

Використовуючи низьку здатнхсть 5'-гхдроксилу тим1дину утзо-рвватм 5'-8-алк1лт1опох1дн1 пор1вняно з хншими нуклеозидами, нами зроблена спроба одеркати ол1гонуклеотидил-( 3' -N )-пептиди без попе-реднього захисту 5'-кхнця ол1гонуклеотиду. Проте в рамках запропо-новано1 методики синтезу ОНП, що передбачае'проведения конденсаци протягом нетривалого часу (30 хв), "все ж таки мало м1сце 5'-алкит1олування модельних тритимхдилатх.в. Питвердженням цього були дан1 ОФХ ( мал. 4), де моди4.^кац1в по 5' -г1дроксилу зазнав весь склад реакц!йно1 cyMiuii. Вхдносна частика, тхопоуддких складала майже Можливо цей ефект був зумовлений використанням значно б1льшого надлишку реагенту Py2s2/Ph3P, так як важко припустити, да • причиной е присутн1сть в реакцхйн1й сумхшх Melm i атнокислоти.

О 15 • 30

Час, хв

Мал. 4 Профиль ОФХ реакиЦйно! сукиии, отримано1 в результат! синтезу (ТрТрТр)-3'-Р-АИх-Аго-ОМе ( 1 - ТрТрТр; 2 ТрТРТр-(3'-з;'-рТрТрТ; 3 - (ТрТрТр) -3' -Р-АЬх-Дгд-ОМе; 1' - 3'-5'-5-алк!лт!опох1дн! виповино 1-3.

Незважаючи на цей небаясаний пересНг peaKu.il, ОНП, синтезован1 на основ! коротких ол!гонуклеотид1в, практично мокна влд!ляти з реакц1йних сум1шей при допомоз! ВЕРХ. Прч синтез! антисенс-ол!гонуклеотид!в така модиф!кац1Я може стати ! в нагодх, оск!льки

захищае 5'-к1нець ол1гонуклеотиду в1д дП в1дпов!дних екзонуклеаз.

]

Синтез ол1гонуклеотидил-( Р-М >пептид1в з в!льною карбоксильной групою.

ОНП з в1льною карбоксильно» групою необх1дн! як вих1дн! спо-луки для синтезу ОНП шляхом нароаування пептидного ланцвга. 0кр1м того вони потр!бн! для вивчення впливу в1льно1 карбоксильно! групи на ф!зико-х!кцчн! властивост! ОНП.

В пептидна ххмП поширене використання сольового захисту. для карбоксильно! групи пептиду в реаюиях конденсаид!. Аналог1чний П1дх!д спробували використати ! ми для синтезу ОНП з в1льною карбоксильной групою. Активне 3'-метил1м1дазольне поххдне олхгонукле-

отиду, «о одержувалось при допоькт Ругз2/РЬ3Р , висаджувалось хз реакцдйно1 сум1ш1 исю4 1 негайно вводилось в реак1ии з розчином пептиду в карбонат! натр1я (рН=11). В результат! реакци ОНП утзо-рпеться, проте проходить його модкф1кац1я з утворенням пох1дних нев!домо! природи.

Аналогична модифшагЦя ,спостер!галась нами при синтез! ( рССТССТС>5' -Р-Жэ-Туг-Уо!.

Була також зроблена спроба отримати ОНП з допсмогою тетра-алк1ламон!свих солей а».инокислот. Отримане аналогично активне по-ххдне ол1гонуклеотиду взодилось в реакц1юз тетрабутиламмонгйною с1ллю у-й!у. Бажаний продукт утворпвався, але з поганим зиходом. Очевидно, давалась взнаки присутн1сть в реамШшй сумхил сильного ■гм!ну .

На наш погляд, ОНП з в1льнов карбоксильной групою бажано от-римувати омиленням триетиламхном складноеф1рних пох1дних ОКП (три-ет::ла;,ин : вода : п1ридин, 5:3:2). Реакц1я 1де к!льк!ско ! без особливих ускладнень.

Конструрвання антисенс-ол1гонуклеотад1в з викооистанням аРгин1новм1сних пептид1в. ,

0л1гонуклеотиди, модиф1кован! задатками пептшив, можуть зна-йти практичне застосування як антисенс-олхгонуклеотиди.

Нами синтезовано ряд аргШновьисних- ОНП , оск1льки пол1ка™1-онн1 пептиди в1дом1 як вектори для доставки р1зноман1тних речовкн в юйтину.

Нами зд1йснено також синтез фрагмента, токсину змНно! отрути _ -Рго-Агд-Уа!-. Иого гф!нн1сть до певних юптинних рецептор!в, на наш погляд, повинна сприяти захвату ОНП юптиною.

В1домо, що модифлкацдя гадрофобними слолуками ол!гонуклеоти-д!в сприяе транспорту таких кон'»гат1в через цитоплазматичну мембрану кл1тини. "Пдрофоб!за1Щ" ол1гонунлеотиду можна також досягти шляхом його кон'югацп з г!дрофобними пептидами. 3 идею метою нами було зд1йснено синтез модельного гидрофобного пептиду АЬх-Тгр-Трр-Тгр-С1у-0Ме для одержання в!дпов1дних ОНП.

Ми намагались визначити вплив ковалентно-приеднаного пептиду

■ -16 -

на здатн1сть олхгонуклеотиду утворввати комплементарн! комплехси. Як видно !з таб.5, коротко аргин1новм1сн1 пептиди в склад! ОНП практично не впливаать на стабильность комплементарних комплекс1в при ф1зхолог1чних значениях 1онно1 слли.

Таблиця 5. Температура плавления комплексов А1В з ОНП.

0л1гонуклеотид Тпл, С°

РТ10 23,3

(рТ1О)-5'-РтАНх-Агд-0Ме 29,0

( рТ10) -5' -Р-А1пх-Агд-Агд-ОМс 28,3

СрТ10)-5'-Р-АЬх-Агд-АИх-Агд-ОМо ' 28,6

Таблиця 6. Температура плавления комплексу А16 з ол!гонуклеотидил-пептидом СрТ1а)-3'-Р-Рго-Дгд-Уа?-0Ме.

Ол1гонуклеотид Тпл, С°

Ртю (РТ10)-3'-Р-Рго-Агд-УаI-ОМс 23,2 23,6

В1дсутн1сть спейсера (АНх) в структур! (рТ10)-3'-Р-Рго-Агд--\/о1-ОМо таких не впливаз на термочну ст1йк!сть: дуплекса , який утворюо ОНП (таб. 6). В!домо, цо осноен1 ам1нокислоти стаб!л1зують подв1йн! комплекса нуклеонових кислот ! ця стабШзапдя пропорц1й-на зменшенни 1онно1 сили середовища. • В ОНП'п!дсилення стабШза-цЦ не спостер!галось, але не рееструвалось ! небажаного з.нинсення терм!чно! ст1йкост1 комплементарних комплекс!в ОНП з ол!гонуклео-тидами. Характер дИ нуклеаз на ол1гонуклеотиди ,як1 модиф1козан1 основними аминокислотами,' вивчений 1 можливий результат можка пе-редбачити. В.то.хе.час вплив нуклеотидного фрагменту на розцеплен-ня пептидного зв'язку з'ясовано не достатньо,- можливо, тому що-використовувались лише Б.Ь-пептнди. ' •

Для вивчення ензиматично! стШкост! пептиду в ОНП застосоэу-

вався трипсин. 1ккубац:я з ним ТрТрТр-Рго-Агд-УсП-оме привела до 100% утзорення ТрТрТр-Рго-Агд-он, то узгодяувалося з! специф1чк1-стя ди ферменту. За них умов ТрТрТр-АЬх-Агд-ОМо г1дрол1зувався до ТрТрТр-АЬх-Агд-он не повнхстю (8(Ю, що, напевно, с5уло спричикено утворенням вторкнно! структури (мал 5). Трипсиновий г1Дрол1з син-тезованних пептидов за стандартних умов вибузазся згхдно специ-ф!чност! фермента а до к1нця (0,2 М N04003, 37°с, 12 год).

»260

12 3

0,03-

0,02-

0,01-

-1-:-Г"

5 10 Час (хв)

15

Малюнок 5. Анал1з реакц!йно1 сум1иа ензиматичного роэщеплення трипсином ТрТрТр-АН|х-Агд-0Ме з використанням кап1лярного електро-форезу: 1 - ТрТрТр-АИх-Агд-ОМе; 2 - ТрТрТр-АЬх-Агд-ОН; 3 - ТрТрТр. Штрих-пунктиром вказащ можлив1 продукта деградацИ.

Отже, отриман1 нами результата дапть -п1дставу спод1ватись, ао, ОНП. до складу яких входять аргШнов! пептида, можуть бути використан1 для п1двиш,ення ефективносП антасенс-ол1гонуклеотид1в.

Синтез ол1гонуклеотид1в.

Синтезовано ряд шдельних ол!гонуклеотид1в рСССС,

РСБТССТС, рТ10, (Тр)3, як1 були необх1дн1 для синтезу ОНП.

0л1гонуклеотиди-з к1нцевим-5'-фосфатом одержували на основ1

методик триеф1рного методу синтезу ол1гонуклеотид1в, розроблених в 1нститут1 б1оорган1чно! х1м!1 СВ РАН. Фосфата! групи сшшшв са-хиаали цданоетпльними та п-хлорфен1льними залишками , 3'- оксигру-пу дезоксирибози - залкшком левулшово! кислоти.

Для одержання З'-фосфорильованих ол!гонуклеотид1в засто-совували фосфотриеф1рну стратегию ол1гонуклеотидного синтезу, за-пропоновану Корана. Для 5'-г1дроксильно1 групи нуклеозиду викорис-товували тритильний захист, його 3'-положения фосфорилювали при допомоз1 п-хлорфен1лдихлорфосфату.

Ам1ногрупи гетероцикл1чних основ блокували . загальноприйнятими захисними трупами. Як конденсуючий реагент застосовували три1зо-проп1лбензолсульфохлор;гд в присутност1 метюпм1дазолу. -Очистка деблокованих ол1гонуклеотид1в проводилась з залтосуванням обробле-ного триметилхлорсиланом сил!кагелю в комб!наци з !онообм!нною хроматографхею на оеае -целюлоз1.

Синтез пептид1в.

AprHHiHOBMiCHi - пептиди AhxrApg-OMe, Ahx-Apg-Apq-OMe,

Axh-Apg-Ahx-Apg-OMe синтезували класичними методами в розчин! (схема .2):

cv .

Ahx Apg Apg

-ОН

■ОН -ОН

■ОМе

-ОМе

-ОМе

Схема 2. Синтез пептиду АЬх-Агд-Ард-Агд-ОМе.

Пептид АЬх-Агд-ОМо був одержаний дициклогексилкарбодИмхдннм методом в присутност! И-оксисущшимиу, пептид АЬх-Агд-оМе, АЬх-Агд-АКх-Агд-оме з добавкою И-г!дроксибензтриазолу. Опти-мальним методом очистки для даного типу пептид1в була ОФХ на сила-

н1зованому скл1кагел1. Для гпдтвердкэння структури синтезованних

1 ^

пептидов була застосована А"С-спектроскоп1я.

СиКТеЗ трипепткда Рго-Аго-УаТ-СМо эд1йснювал5! з1дпов1дко до схеми 3:

Рго Агд Уа1

Вое 4 он Вое Вое Н

Н —

ОН •ОН

н —4 ом©

■ОМо

ОМо

Схема 3. Синтез пептиду Рго-Агд-Уа1-0Мо.

Дипептид Вос-Рго-Агд-0Н одержували при взаемодп Вос-Рго-оизи 1 в1льного арги'ину. Трипептид синтезувал:: 1з дипеп-тиду Вос-Рго-Агд-ОН 1 \/а1-0Мо при Д0П0М031 ИСС 3 ДОбаВКОЯ N -ОКСН-сукци!!1м1ду 1 вид1ляли з застосуванням ВЕРХ.

Пептид АНх-7гр-Тгр-Тгр-С1у-0Мо одержувазся при допомоз1 твердофазно! стратеги пептидного синтезу. О у приэднувався до полимеру в умовах м1кфазного катал1зу, з використанням тетрабутлл-амон!йбром!ду ! кал1евих солей амшокислот. Використозувчи цей п1дх1д ми досягали 50 - 70% замещения' галогену з хлорметильованому пол!мер1 Вос-аы!нокислотою. Нарощування пептидного ланцюга проводилось з використанням симетричних ангхдрщцв Вос-амлгокислот. Для в!дщеплення пептиду в!д смоли застосовувалась реакция переетерифх-кгц11. Для 'очистки , повн!стю блокозаного пептиду Вос-Тгр-Тгр-Тгр-Б1у-ОМо використовували звичайну адсорбц1йну хроматограф! ю на колонц! з енлшагелем в град1ент1 концентрацИ метанолу в хлороформ!.

Чистоту вс1х одержаних пептгд1в контролювали з допомого» ВЕРХ, ам!нокяслотного анализу.

- 20 -

ЕИСН03КИ

1.Розроблено метод синтезу ол1гонуклеотидилпептид1в фосфам!дного типу для одср:хання антисенс-ол1гонуклеот7.д1з , модифгкованих за-лииками пептидíb без попереднього захисту функц1оналы:их труп ол1-гонуклеотиду.

2.Впвчеко вплив. на peaKUiD утзорення P-N зв'язку ол1гонуклеопелта-д!в нуклеоф1льних катал!затср1з, xímí4hoí природи пептиду, наяв-hoctí незахищежц первинно! г1дрокспльно! групп олхгонуклеотиду.

3. Показано, цо оптимально,¡ вар1антом конденсацП ол1гонуклеотиду з пептидом з npiicyTHocTi онисно-в1дновного реагенту - cyv.im трифе-н!лфосф1ну i дип1ридилдисульф1ду с:

а>проводення попередкьо! активацИ к1нцево1 фосфатно! групи

ол1гонуклеотиду з участи М-метил1м1дазолу; б)збмеження прот!кання конкурентно! реакцп утворення симетричного пхрофосфату при строгому контрол:ованн1 основное?! сэредовиаа. з >зас.осувакня захисту 5'-г1дроксильно1 групи

ол!гонуклеотяд1в при синтез: ол1гонуклеотидия-(3'-N )-пепти-д1в.

4.Показано, цо запропокозанпй метод мохе бути викоркстаний для синтезу moho- i дкаргик1новм1сних ол1гонуклеотидилпептид1в без

° попереднього захисту гуаншшових угрупувань пептиду. 5.3найдено, що пептидна кодифькаидя-не зпливае на здатнють сл1го-нуклеопептид!в утворвватк дуплекси з комплементарними посл!дозкос-тями. В1дм1чено тйдзищену сг!йк1сть ол1гонуклеотиднлпептид1в до протеол!тичних фермектгв.

Ochobhí науков1 результата опубл!ксвано в роботах: ■

1. Серебрянный С.Б. ,Пальчикозская Л. И. , Ярмолюк С.Н., Федоряк Д. М. Химический синтез производных нуклеозидов и нуклеотидоз // В сб. Методы молекулярной биологии. - Киев: Наукова думка, 1936.

С. 41-47.

2. Серебряный С. Б., Пальчйковская Л. И. , Ярмолск С. Н. , Федоряк Д. М. / Современное состояние триэфирного метода синтеза олигодезоксири-

онуклеотидов. I. Дезоксинуклеозиды: методы синтеза и защита функ-иональных групп // Молекулярная биология. - 1984. - был. 38. - С. 1-71.

Серебряний С. Б. , Пальчиковская Л. И. , Ярмолюк С. Н., Федоряк i . М. / Современное состояние триэфиряого метода синтеза олигоде-оксирибонуклеотидов. 11. Фосфатзащитные группы, фосфорилирующие .генты и конденсирующие средства // Молекулярная биология. - -684,- зып.' 38. - С. 71-81.

. Ярмолюк С. Н. Синтез и- исследование аргининсодержацих 'лигонуклеотидилпептидов // Структура и функции биополимеров.- Тез. ,окл. школы-конференции , Львов, 1989. - Киев: 1S88. - С. 91. i. Синтез олигонуклеотидил-С5'-N)-пептидов,- содержащих аргинин >.Ф. Зарытова, Е. М. Иванова, С. Н. Ярмолпк, И. В. Алексеева // мополимеры и клетка. -1989. - ,N4. -С. 220-222. í. Makitruk V.L., Yarrr.oluk S. N., Shalaisay A.S. & Alexeeva I.V. Oli-[onucleotides modified with phenazine derivatives // In: Synthetic digonucleotides: problems and frointer of practical application, ntern. synp. (Mosicow, 23-30 1991). - Nucleic Acids. -1991.-!ymp. ser. ,N 24. -P. 244.

'. 0л1гонуклеотлди. II. Синтез ол1гонуклеотидил-(P-N>пептид1в з ;опомогою . окисно-в1дновного реагенту - ~рифен1лфссф:ну i !,2'-дип1ридилдисульф1ду. л С.М.Ярмолюк, Л.С.Король, ^.В.Алексез-¡а, А. С. Шаламай Б1опол1мери i клхтина. - 1992. - 8. N5. - С. 16-

Ю. "

!. 0л1гонуклеотиди III. Синтез i вивчення аргин1новм1сних л1гонуклеотидил-(Р-Н )-пептид1в / С.М. Ярмолюк, 8. М. 1ванова, .В.Кондратюк,I. В. Алексеева, А. С. Шаламай, В.П. Заритова // Иопол1мери i юптина. - 1992. -8, N6. - С. 95-100-. ;

I. Олигонуклеотиды IV. Синтез алкилируюздх производных лигонуклеотидил-СР-Ю-пептидов / С.Н. Ярмолюк, Е.М.Иванова, I. Н. Овандер, И.В.Алексеева, А. Шаламай, В.Ф.Зарытова // Сополимеры и клетка. - 1993. - 9,N3.

/

юшукувач ' с.м: