Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правахрукописи

ВЛАХ Евгения Георгиевна

СОЗДАНИЕ МОНОЛИТНЫХ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АКТИВАТОРОВ ПЛАЗМИНОГЕНА

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2005

Работа выполнена в отделе биологически активных полимеров Института высокомолекулярных соединений Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

доктор химических наук, Т. Б. Тенникова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, И. Ю. Филиппова

кандидат химических наук, С В. Буров

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Минздрава РФ

Защита диссертации состоится « 17 » февраля 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.229.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу:

199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан « 14 » января 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат физ.-мат. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Выделение и очистка белков аффинными методами, основанными на предварительном in vitro моделировании сложных биоспецифических взаимодействий с участием интересующего объекта, имеющих место в живой природе, играют ключевую роль к&к в решении фундаментальных, так и практических задач, например, при создании лекарственных препаратов. Активаторы плазминогена, а именно, стрепто-киназа (СК), урокиназа (УК)., про-урокиназа (про-УК), тканевый активатор плазминогена (ТАП) и стафшокиназа (САК), представляю! собой группу протеиназ, разрешенных для использования в медицинской практике в качестве тромболитических средств в терапии острых сердечко-сосудистых заболеваний. В настоящее время наиболее перспективными способами получения лекарственных препаратов на основе белков являются генно-инженерные методы. При этем важнейшей проблемой является разработка как аналитической, так и препаративной методологий обеспечения биотехнологических процессов. 1Ъамотно построенные методы позволяют сократить время и экономически затраты на разработку всего процесса в целом, включая стадию полученш аффинного сорбента.

Одним из самых современных и перелективных носителей, удовлетворяющих всем требованиям, выдвигаемык к разделительным стационарным фазам, являются макропористые монолитные сорбенты на основе сополимера глщидилметакрилата и этшенгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА), выполненные в форме цельных дисков. Морфологические свойства данных носителей, т.е. структура пороюго пространства, определяющая стерические и гидродинамические особенности осуществляемых на их основе межфазовых процессов, позволяют проводить биосепа-рационные процессы с использованием высоких скоростей потока подвижной фазы. Резкое сокращение времени разделения становится возможным из-за практически полного отсутствия диффузионных ограничение h "Шальному межфазовому переносу вещества. Именно это обстоятельст 80 =*чволяет не только эффективно разделять вещества разных классов, н< таю.= нгйщодать практически неискаженную кинетику биоспецифически межд-)лекул>.7ных взаимодействий. Метод динамического разделени semetB с использованием данных сред получил название высокоэффе тивног монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ).

важным этапом любого разделительного процесса, основанно) на биол(.веской комплеменКарности (аффинности), прежде всего, явл ется выбс наиболее эффективною лиганда. Традиционно, в качестве а финных л "андов используют макромолекулы белков, обладающих пр родным 1сР1СТВОМк выделяемому продукту (белку). Однако, несмотря н

высокую специфичность подобных лигандов, неустойчивость структуры белка, а также высокая стоимость таких аффинных партнеров лимитируют их применение. Поэтому быстрый и достоверный поиск более дешевых и стабильных синтетических лигандов - пептидов - является одной из важнейших задач при разработке методов анализа и выделения белков.

В соответствии со всем вышесказанным, поиск новых аффинных партнеров с целью использования их для эффективного скоростного выделения таких ценных генно-инженерных лекарственных препаратов, как активаторы плазминогена, а также разработка новых способов создания аффинных сорбентов являются, несомненно, актуальными проблемами.

Цель исследования. Целью данного исследования являлась разработка методов построения аффинных сепарационных систем с участием пептидных лигандов, обеспечивающих биоспецифическое связывание интересующих белков (активаторов плазминогена). При этом введение в структуру сорбента адсорбционных центров осуществлялось двумя способами, а именно, ковалентной иммобилизацией предварительно синтезированного пептида, а также оригинальным методом твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) непосредственно на поверхности макропористой монолитной стационарной фазы, используемой далее в аффинной хроматографии. В цели работы также входило сравнение свойств получаемых типов сорбентов, осуществляемое методом скоростной аффинной хроматографии. В конечном счете, данное исследование определило выбор наиболее эффективного аффинного лиганда для решения практической задачи -скоростного выделения активаторов плазминогена методом ВЭМДХ.

Для достижения заданной цели были поставлены и решались следующие задачи:

выбор пептидов, комплементарных к интересующим белкам, на основе анализа природных биологических взаимодействий с участием данных белков;

синтез выбранных пептидных лигандов традиционным твердофазным методом и их физико-химический анализ; получение аффинных сорбентов путем ковалентной иммобилизации биолигандов на поверхности ГМА-ЭДМА монолитных сорбентов;

разработка оригинального метода твердофазного пептидного синтеза на поверхности монолитных сорбентов и детальный анализ качества получаемых пептидных соединений; использование данного метода для получения сорбентов с пептидными лигандами, необходимыми для выделения активаторов плазминогена;

определение количественных параметров биокомплементарного взаимодействия активаторов плазминогена (СК, про-УК и ТАП) с различными лигандами с использованием метода скоростной аффинной ВЭМДХ;

сравнение характеристик аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности монолитного сорбента;

исследование процессов выделения ТАП, СК и про-УК из многокомпонентных смесей.

Научная новизна работы. Применение монолитных сорбентов для высокоэффективных сепарационных процессов является одним из современных и оригинальных научно-практических направлений. Достоинством макропористых монолитных ГМА-ЭДМА сред оказалась уникальная возможность их использования как стационарных фаз для аффинной ВЭМДХ, так и носителей для твердофазного синтеза пептидов. Это обстоятельство и определяет научную новизну работы, которая заключается в:

разработке оригинального метода построения аффинных сепара-ционных систем на основе макропористых сорбентов монолитного типа с использованием метода прямого твердофазного синтеза пептидов, выполняющих функцию биоспецифических лигандов; хроматографическом моделировании и количественном сравнении биологических взаимодействий на примере одного из механизмов фибринолиза;

разработке и оптимизации скоростного одностадийного метода выделения биологических продуктов (активаторов плазминогена) из многокомпонентных смесей.

Практическая значимость работы. В рамках работы проведена серия важных для дальнейшего практического применения экспериментов, направленных на оптимизацию процессов аффинной сепарации. Разработанный метод получения аффинных сорбентов посредством прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности монолитных носителей позволяет сократить время, традиционно требуемое для этих целей. Это обстоятельство, в свою очередь, делает возможным быстрый количественный скрининг ряда пептидных лигандов с целью выбора наиболее эффективного для аффинного выделения того или иного продукта. Показана возможность прямого выделения активаторов плазминогена с использованием полученных аффинных сорбентов из клеточных супернатантов (генно-инженерный продукт) и модельных смесей белков методом ВЭМДХ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Макропористые полиметакрилатные носители монолитного типа, имеющие оптимальную поровою структуру, могут быть использованы в качестве твердой фазы для синтеза пептидов; Адсорбционно-активные матрицы, полученные путем прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА носителей, могут успешно использоваться для скоростной аффинной хроматографии;

На примере одного из путей фибринолиза показано, что метод ВЭМДХ может быть применен для in-vitro моделирования различных этапов метаболических процессов, происходящих через образование биоспецифических комплексов природных комплементарных молекул;

Выбранные на основе анализа природных взаимодействий пептиды образуют биоспецифические комплексы с исследуемыми активаторами плазминогена;

Полученные аффинные матрицы могут быть использованы для прямого и эффективного выделения активаторов плазминогена из многокомпонентных смесей.

Работа выполнена в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (гранты DFG KR 1076/6-1 и ННО-РАН 436 RUS 113/555/0); при участии лаборатории №4 ИВС РАН и Института прикладной микробиологии Университета сельскохозяйственных наук Вены, а также при финансовой поддержке фирмы BIA Separations, d. о. о. (Любляна, Словения).

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и всероссийских симпозиумов: 2(f International Symposium on the Separation and Analysis of Proteins, Peptides and Polynucleotides (Любляна, Словения, 2000), 25h and 27h International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (Маастрихт, Нидерланды, 2001, и Ницца, Франция, 2003), Td and 3rd International Symposium on Separation in the BioSciencies (Прага, Чехия, 2001, и Москва, Россия, 2003), l8h Meeting ofthe European Society for Animal Cell Technology (Гранада, Испания, 2003), Jrd International/28h European Peptide Symposium (Прага, Чехия, 2004), ï' Monolith Summer School: Applications in Biochromatography, Bioconversion and Solid Phase Synthesis (Порто-Рош, Словения, 2004), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, Россия, 2003) и Всероссий-

ском симпозиуме "Хроматография ихроматографические приборы " (Москва, Россия, 2004).

Кроме того, результаты диссертационной работы также обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, 2003) и на научном семинаре «Монолитные сорбенты: Новейшая генерация носителей для биотехнологии и медицины», проводимом ФГУП «НПО«Микроген» (Москва, 2004). Работа представлялась на VII ежегодном конкурсе молодых ученых ИВС РАН (Санкт-Петербург, 2004), где заняла 1-е место.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, включающих 4 полнотекстовые статьи в журналах Journal of Chromatography (серии А и В), Journal of Biotechnology и Journal of Peptide Science, а также 10 тезисов устных и стендовых докладов. Одно краткое сообщение находится в печати

Структура работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Работа изложена на 154 страницах, включает 24 таблицы, 31 рисунок и библиографию из 178 источников.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д. х. н. Тенниковой Т. Б., а также д. х. н. Власову Г. П. к. х. н. Платоновой Г. А., к. х. н. Королькову В. И., к. х. н. Гурьянову И. А., н. с. Дорош М. Ю. и н. с. Дитковской И. Б. (все из ИВС РАН), к. х. н. Новикову А. В. (ИАП РАН) за сотрудничество при выполнении работы. Автор благодарит также зарубежных партнеров господина А. Тарре, доктора G. Kretzmer и доктора С. Rasper (Ганновер, Германия), профессора A. Jungbauer (Вена, Австрия), а также компанию BIA Separations, d. о. о. в лице доктора А. Strancar и доктора A. Podgornik (Любляна, Словения).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность работы, обозначена научная новизна и практическая значимость, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы состоит из четырех разделов. Первый раздел посвящен аффинной хроматографии, проблеме выбора аффинного лиган-да, а также методам количественной оценки аффинного комплексообразо-вания. Во втором разделе изложены требования, предъявляемые к сорбен-

там для аффинной хроматографии, проведен анализ свойств монолитных сорбентов, а также рассмотрены основные аспекты высокоэффективной хроматографии с использованием монолитных ультра-коротких ГМА-ЭДМА стационарных фаз. Третий раздел посвящен способам создания аффинных матриц (нековалентная и ковалентная иммобилизация, прямой твердофазный синтез пептидов на поверхности монолитных матриц), и, наконец, четвертый - активаторам плазминогена.

Глава 2. Результаты и обсуждение.

В качестве стационарной фазы для биоспецифического выделения активаторов плазминогена (АП) в работе использовались коммерческие монолитные сорбенты, изготовленные в форме макропористых дисков размером 12x3 мм (CIM® Epoxy Disks, BIA Separations, d.o.o., Любляна, Словения). Материал данных носителей представляет собой жесткий макропористый сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольди-метакрилата (ЭДМА) (60 и 40 мол.%, соответственно), получаемый методом радикальной полимеризации в блоке. Макропористый характер структуры достигается путем введения в полимеризационную смесь термодинамически "плохих" растворителей (порогенов). Использованные образцы полимерных дисков имели средний размер пор около 1 мкм, пористость 0.6 мл/мл сорбента, и площадь специфической поровой поверхности, равную 10-15 м2/г. Стандартное содержание реакционноспособных эпоксидных групп составляло в среднем 4 ммоль/г.

Выбранные активаторы плазминогена (АП), а именно, стрептоки-наза (СК), про-урокиназа (про-УК) и тканевый активатор плазминогена (ТАП) отличаются механизмом биологического действия, тогда как результат этого действия во всех случаях одинаков. В качестве природнго лиганда, т.н. точки отсчета, для оценки специфичности взаимодействий АП с тем или иным лигандом, из ряда естественных комплементов был выбран общий природный субстрат для всех исследуемых протеиназ -плазминоген. Кроме того, в качестве аффинных лигандов для ТАП были использованы также моноклональные антитела (мАТ) и косвенный участник представляемого случая фибринолиза - фибриноген (Фбг). Из ряда пептидных лигандов были выбраны известный из литературы пептид GPRP (ингибитор полимеризации фибрина), а также обусловленные природным сродством ТАП к лизину линейные гомопроизводные лизина КККК, КККККККК, КККККККККККК, комбинированные производные KKKKGPRP и KKKKKKKKGPRP и, наконец, дендример лизина Ki5A. Последний был включен в исследуемый ряд с целью сравнения аффинных свойств линейных и разветвленных лигандов. Три линейных го-мопроизводных лизина были выбраны для выяснения влияния на аффин-

ное связывание длины лиганда, а комбинированные производные пептида GPRP и гомопроизводных лизина - для исследования зависимости аффинного комплексообразования от структуры лиганда. Кроме того, линейный и циклический KCPGRVVGGC, RVVGGC(Acm) и KC(Acm)PGRV пептиды, имитирующие участок молекулы плазминогена (557-566, 557-562, 561566, аминокислотные остатки в последовательности молекулы плазминогена, соответственно), ответственный за связывание АП, были также выбраны в качестве возможных специфических партнеров.

2.1. Создание аффинных сорбентов на основе макропористых ГМА-ЭДМА монолитов

2.1.1. Ковалентная иммобилизация белков на поверхности монолит-ныхГМА-ЭДМА сорбентов

Принимая во внимание высокое содержание собственных эпоксидных групп в структуре сополимера и свободных аминогрупп в молекулах белка, процесс ковалентного связывания лиганда выполнялся как одностадийная реакция в статических условиях по следующей схеме:

У О

II II

9-0 "СН2 " СН-СН2 мНгБелок ^ - О -СН2 - СН - СН2- ЫН -Белок

"нэ-3 6Е=ЕЭ он

Результаты ковалентной иммобилизации выбранных белков приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты ковалентной иммобилизации белковых лигандов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА носителей. Условия: исходная концентрация раствора белка 5 мг/мл, 30°С, 16-18 часов.

Количество иммобилизо-

Лиганд ММ ванного лиганда

мг/диск* мкмольх102/мл сорбента*

Плазминоген 90 000 1.2 3.8

Моноклональные 150 000 1.6 3.2

анти-ТАП-антитела

Фибриноген 340 000 0.7 0.6

В таблице представлены средние значения количеств иммобилизованного лиганда, полученных по результатам измерений оптической плотности раствора до и после иммобилизации и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 10%.

Полученные данные хорошо коррелируют с уже опубликованными результатами по ковалентному присоединению белков к поверхности макропористых ГМА-ЭДМА монолитов. Из приведенных в таблице данных, очевидно, что количество связанного с поверхностью лиганда зависит от его молекулярных размеров, увеличение которых, естественно, ведет к уменьшению его молярной концентрации.

2.1.2. Ковалентная иммобилизация предварительно синтезированных

пептидных лигандов

2.1.2.1. Синтез и исследование пептидов

Все пептиды были синтезированы твердофазным методом. После удаления пептидов с полимерной СТ-ДВБ смолы продукты очищали от низкомолекулярных примесей с помощью гель-фильтрации на колонке, заполненной полиакриламидным гелем, а затем - обращенно-фазовой ВЭЖХ, в случае гетеропептидов, или ионообменной ВЭЖХ, в случае го-моолиголизинов. Чистота всех очищенных продуктов составляла 88-95%.

В отличие от линейных пептидов, синтез разветвленной дендри-мерной молекулы имел некоторые особенности. Для получения разветвленного продукта к предварительно введенному аланину-спейсеру присоединяли ди-Вос-лизин, что позволяло на одной стадии деблокирования получить две свободные аминогруппы лизина. Дальнейшее присоединение ди-Вос-лизина проводили с двух-, четырех- и восьмикратным увеличением концентрации ацилирующей смеси. Очистку синтезированного дендримера Е^Д проводили методом ОФ ВЭЖХ. Как видно из представленной на Рис. 1 хроматограммы, продукт синтеза не являлся гомогенным веществом, и представлял собой набор разветвленных структур. Чистота выделенного дендримера составляла 80%.

Все синтезированные и хроматографически очищенные гетеро-пептиды исследовали стандартным методом аминокислотного анализа, из результатов которого следует, что полученные продукты имели состав, соответствующий теоретически заданному. Дополнительно, масс-спектрометрический анализ линейных пептидов показал соответствие экспериментально найденной и теоретически рассчитанной молекулярных масс, что подтверждает структуру полученных соединений (Таблица 2).

Для доказательства структурных различий синтезированных го-моолиголизинов (длина цепи) полученные продукты были исследованы методами гель-проникающей ВЭЖХ. Так, для определения молекулярной массы обсуждаемых пептидов использовали колонку, заполненную TSK-PW 2000 гелем и калиброванную синтетическими пептидными стандартами в соответствующем интервале молекулярных масс. Согласно результатам анализа, молекулярные массы синтезированных образцов оказались

Рис. 1. Очистка дендримера К15А методом ОФ ВЭЖХ. Аналитический профиль элюции: (а) до препаративного разделения; (б) после препаративного разделения.

равными 1550, 1030 и 540, что удовлетворительно совпадало с теоретически рассчитанными массами, а именно, 1553, 1041 и 529 для додека-, окта- и тетрали-зина, соответственно.

Для дополнительного доказательства различий в молекулярных массах синтезированных пептидов осуществляли разделение приготовленной смеси гомоолиголизинов методом ка-тионообменной градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Рис. 2) с использованием к качестве стационарных фаз макропористых монолитных дисков

Полученный результат однозначно подтверждает различие структуры синтезированных продуктов, а также представляется интересным с точки зрения потенциального использования монолитных сорбентов.

Таблица 2. Результаты масс-спектрометрического анализа синтезированных гетеропептидов.

Пептид ммтеор. ММ-,кс„гр

основная минорные

KC(Acm)PGRVVGGC(Acm) 1 149 1 149 1 045

KfcPGRVVGdc 971 971 -

К15А 2 009 2 009 1 881, 1 753, 1 625, 1 497

KKKKGPRP 936 937 810, 682

KKKKKKKKGPRP 1 448 1 448 1 320, 1 192, 1 064

Циклический декапептид был получен циклизацией очищенного линейного аналога. Избыток низкомолекулярных веществ удаляли гель-фильтрацией на колонке, заполненной Сефадексом G-10. Чистота целевого (циклического) пептида после очистки методом ОФ ВЭЖХ составляла не менее 95%.

2.1.2.2. Иммобилизация пептидов на поверхности монолитных носителей Как и в случае белков, ковалентное связывание пептидов проводили одностадийно, без дополнительного введения промежуточных спей-серов, в статических условиях при щелочных значениях рН (10.0). Результаты иммобилизации представлены в Таблице 3. Из приведенных данных

объемная (или поверхностная) концентрация вводимых лигандов зависит от их молекулярной массы, точнее, молекулярного размера; обнаруженная молярная концентрация связанных пептидных лигандов значительно превышала таковую для высокомолекулярных белков; количество введенных в структуру сорбента всех синтезированных гомо- и гетеро-пептидных лигандов оказалось приблизительно одинаковым (2-3 мкмоль/мл сорбента), что позволяет адекватно сравнивать количественные параметры аффинных взаимодействий комплементов.

2.1.3. Прямой синтез пептидныхлигандов на поверхности проточных ГМА-ЭДМА сорбентов (дисков)

Получение аффинных матриц путем непосредственного «выращивания» пептидного лиганда на поверхности монолитного носителя, как правило, применяется в случае приготовления аффинных микроаналитических слоев (биочипов). В случае же формирования стационарных фаз для аффинной хроматографии подобный подход еще не исследовался.

можно сделать следующие выводы:

¿ одо^

3 I кккк

О | i

0,15 -i 1

! ||

о,ю i |

i j| кккккккк

! ¡i ; KKKKKKKKKKKK

0JD5 -I I | • i

«,0« -j—

и 20» 4«0 64Ш 8(10

1, сек.

Рис. 2. Катионообменная ВЭМД-хроматограмма разделения смес* гомоолиголизинов.

Таблица 3. Результаты ковалентной иммобилизации пептидных лигандов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА носителей.

Лиганд MM Количество иммобилизованного лиганда

Mr/диск* мкмольхЮ2/ мл сорбента*

КККК 529 0.60 300

КККККККК 1 041 0.85 240

кхкккккккккк 1 553 1.20 230

GPRP 424 0.45 310

KKKKGPRP 936 0.90 280

KKKKKKKKGPRP 1 448 1.25 250

KC(Acm)PGRV 728 0.70 280

K(tPGRVVGG(t 971 0.90 275

KC(Acm)PGRWGGC(Acm) 1 115 0.90 240

RVVGGC(Acm) 659 0.70 310

дендример K15A 2 009 1.40 210

В таблице представлены средние значения количеств иммобилизованного лиганда, полученных по результатам измерений оптической плотности раствора до и после иммобилизации и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 10%.

К основным достоинствам предлагаемого метода, в первую очередь, относится быстрота и простота его реализации. Так, традиционный подход приготовления аффинного сорбента, модифицированного, например, декапептидом (ТФПС, снятие, анализ, очистка, иммобилизация), требует как минимум 7-10 дней, что соответствует полутора-двум рабочим неделям. Ниже приведен приблизительный постадийный расчет времени указанного процесса:

синтез декапептида - 1-4 дня в зависимости от протокола синтеза;

удаление пептида с поверхности носителя и гель-фильтрация - 1 день;

ВЭЖХ очистка и анализ - 1 день; лиофильная сушка - 1 сутки;

аминокислотный анализ, определение содержания пептида в лиофилизате - 1 день;

подготовка хроматографического сорбента и иммобилизация - 1 день;

анализ количеств лиганда, присоединенного к поверхности носителя, промывание - 1 день.

В то же время, процедура приготовления аффинного сорбента методом прямого синтеза пептидного лиганда на поверхности хромато-графического носителя, демонстрирующего, как показано ниже, аналогичные результаты аффинного взаимодействия, позволяет значительно сократить время процесса. Так, для приготовления аналогичного сорбента предлагаемым способом требуется всего 2-3 дня.

Другим достоинством данного метода является его экономичность, поскольку для прямого ТФПС лиганда требуется в несколько десятков раз меньшие количества реагентов и растворителей, чем в случае приготовления аффинных сорбентов традиционным методом.

2.1.3.1. Предварительная функиионализаиия монолитного носителя

Для начала процедуры пептидного синтеза на данном сорбенте необходимо наличие амино- или гидроксильных групп. Как изображено на Рис. 3, оба типа функций могут быть получены конверсией эпоксидных групп посредством гидролиза или аминирования.

а) О О

11 II

С-0-СН-01-Ш, С-О-СНг-СН-СНг -ОН

"ЕВ ^^--* ЕЭ ¿н

6) о

' II

-О-СНг-ОН^СНг м-^щ ^ ^-О-СН-СН-СН;-^

" бЕгЭ 0й

в) О О

II ц

С-О-СН-СН-СНг щсн^щ С-О-СН-СН-СНг-ЬН-СН-СН

~ I

МНг

-¿н

Рис. 3. Функционализация ГМА-ЭДМА-сорбентов: (а) гидролиз; (б), (в) аминирование.

Оценка результатов реакции гидролиза осуществлялась методом количественной ИК-спектроскопии. Проведение реакции в 0.1 М H2SO4 при 80°С в течение 6 ч позволило достигнуть 80% конверсии эпоксидных групп, а в случае использования 0.1 М раствора НС1О4 при 20°С в течение 12 ч степень конверсии составила 60%.

Аминирование поверхности монолитного носителя проводили с помощью аммиака и этилендиамина (Таблица 4). Конверсию эпоксидных групп в аминогруппы оценивали методом элементного анализа и количественной ИК-спектроскопии. В случае использования этилендиамина наблюдалась небольшая деструкция полимера, что выражалось в появление взвеси в жидкой фазе, а также в ухудшении протекаемости сорбента при промывании ее в динамическом режиме. При использовании растворов аммиака данного побочного явления не наблюдалось. Поэтому оптимальными условиями было признанно использование растворов аммиака.

Как видно из представленных данных значения степени конверсии эпоксидных групп в аминогруппы, найденные методом элементного анализа, приблизительно в два-три раза выше, чем результаты, полученные другими методами. Вероятно, это расхождение связано с тем, что в процессе аминирования происходит не только раскрытие эпоксидных групп с образованием первичной аминогруппы, но протекает и побочный процесс аминолиза сложноэфирных связей сополимера, сопровождающийся образованием амида.

Таблица 4. Результаты аминирования ГМА-ЭДМА сополимера.

Условия реакции Степень конверсии эпоксидных групп, %

Элементный ИК- Определение

анализ спектроскопия свободных аминогрупп**

25% ]ч[Н4ОН, 40°С, 5 ч 45 21 16

25% МН4ОН, 20°С, 12 ч 25 - -

этилендиамин, 50°С, 5 ч 100 50 -

этилендиамин, 20°С, 12 ч 90 35 -

Величина рассчитана из предположения, что определенное методом элементного анализа количество азота входит только в состав первичных аминогрупп, полученных при раскрытии эпоксидных циклов.

Определение проводили спектрофотометрическим анализом л-толуолсульфокислоты и титрованием хлорид-ионов, количество которых эквивалентно содержанию свободных аминогрупп.

2.1.3.2. Введение Р-А1а спейсера в структуру сополимера

Поскольку содержание функциональных групп на поверхности модифицированного сополимера существенно превышает поверхностную концентрацию, необходимую для проведения синтеза лигандов и реализации последующих аффинных взаимодействий, представлялось целесообразным контролируемое введение якорной аминокислоты, регулирующей концентрацию синтезируемого пептида и, следовательно, адсорбционную

емкость аффинного сорбента. В качестве такой якорной аминокислоты был выбран Р-аланин. Введение |}-А1а проводили двумя способами: (1) карбодиимидным методом с использованием ^метилимидазола в качестве катализатора; и (2) методом активированных эфиров. В случае ОН-функционализованных сорбентов карбодиимидный метод демонстрировал лучшие по сравнению с NH2-сорбентом результаты количественного присоединения Р-А1а, тогда как в случае использования растворов активированных аминокислот ситуация менялась на противоположную. Исследование зависимости количества вводимого в структуру сополимера Р-А1а от температуры, времени реакции и концентрации ацилирующей смеси представлено в Таблице 5.

Как видно из данных Таблицы 5, варьируя условия присоединения якорной аминокислоты, возможно направленно задавать желаемую емкость создаваемых аффинных носителей в интервале от 2.5 до 20 мкмоль/мл сорбента, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к емкости аффинных сорбентов, которая не должна превышать 20 мкмоль/мл сорбента.

Таблица 5. Влияние температуры, времени и концентрации ацилирующей смеси на количество вводимого в структуру полимерного монолит-

ного носителя.

Концентрация Время Количество введенного Р-А1а, мкмоль/мл

ацилирующей реак- сорбента

смеси, М ции, Однократное Двукратное

мин ацилирование ацилирование

20°С 40°С 20°С 40°С

0.2 180 5.9 14.4 8.4 19.5

0.2 90 3.9 8.4 6.2 11.3

0.2 45 2.4 4.0 4.2 7.3

0.4 45 4.1 8.4 6.0 13.1

В таблице приведены усредненные данные двух аналитических методов, полученные для ОН-сорбента при использовании карбодиимидного метода ацилирования.

2.1.3.3. Выбор стратегии твердофазного синтеза и анализа продуктов, полученных на монолитных носителях. Синтез модельных пептидов

Для успешной реализации прямого синтеза пептидов на монолитных метакрилатных носителях была разработана оптимальная процедура синтеза, удаления с носителя и анализа полученных продуктов. Большая часть исследования была проведена на ОН-функционализованных носителях. Прикрепление первой аминокислоты к поверхности монолитной мат-

рицы за счет образования сложноэфирной связи позволяет проводить удаление пептида с поверхности монолитного носителя с целью его дальнейшего анализа. Поскольку в качестве блокирующей группировки для а-И-аминогрупп нами была выбрана Fmoc-защита, наиболее удобной боковой защитой представлялась Вос-группа. Удаление Вос-защиты осуществляли с помощью п-толуолсульфокислоты (п-ТСК).

Все синтетические процедуры на монолитных дисках выполнялись при использовании стандартного картриджа-держателя. Гидравлический ввод реакционных растворов осуществляли с помощью шприца. Все процедуры промывания выполняли в потоке, встраивая картридж с диском в стандартную хроматографическую систему. Для апробации выбранной стратегии был проведен синтез и анализ пяти модельных пептидов, содержащих от 4 до 10 аминокислотных остатков. Первоначально, ацили-рование проводили 0.3 М растворами пентафторфениловых эфиров в N метилпирролидоне, 2x15 мин. Контроль протекания пептидного синтеза осуществляли, определяя количество образующегося при снятии Fmoc-защиты фульвен-пиперидинового аддукта. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализы показали, что использованный протокол ацилирования является удовлетворительным при получении пептидов длиной до 5-6 аминокислот. В случае получения более длинных пептидов время реакции должно быть увеличено. Так, использование схемы 3x15 мин позволило повысить выход декапептидов с 60 до 90% (по данным ОФ ВЭЖХ).

2.1.3.4. Синтез целевых последовательностей

Поскольку, иммобилизация предварительно синтезированных пептидов происходит с участием ^концевого аминокислотного остатка (при отсутствии свободных боковых аминогрупп в пептиде), а прямой синтез на монолитном сорбенте обеспечивает связывание пептидной молекулы через С-концевую аминокислоту, то для унификации аффинных сорбентов, получаемых обоими методами, за основу было выбрано единообразное расположение аминокислот относительно поверхности сорбента.

Синтез каждого пептида выполняли в виде параллельных опытов 3-4 раза с целью получения материала для последующего анализа, а также использования в аффинной хроматографии. Удаленные с поверхности полимерного сорбента пептиды исследовали методами аминокислотного анализа, масс-спектрометрии и ОФ ВЭЖХ. Также как и в случае модельных пептидов, все синтезированные на проточных монолитных дисках соединения имели аминокислотный состав, удовлетворяющий теоретиче-

ски заданному. Масс-спектрометрическое исследование ОФ ВЭЖХ неочищенной фракции пептидов подтвердило получение заданных пептидных последовательностей. В качестве иллюстрации, на Рис. 4 представлен масс-спектр пептида РКРСКККК-(3-А. Из спектра очевидно существование трех молекулярных ионов целевого вещества (ММ 1 007): однозарядного 1008.66, двухзарядного 504.82 и трех-зарядного 336.88. Основными дефектами структуры полученных пептидных продуктов были пропуски одного и двух остатков лизина, что было характерно и для производных лизина, полученных традиционным ТФПС.

Найденные значения молекулярных масс пептидов, имитирующих АП связывающий участок молекулы плазминогена, соответствовали теоретически рассчитанным, а именно, составляли 799, 730 и 1186 для пептидов У1ШРС(Аст)К-р-А, С(Аст)ООУУК-р-А и

соответственно. На Рис. 5 представлен масс-спектр пептида из которого очевидно наличие

пиков, отвечающих пептидным продуктам с молекулярными массами 1186 (целевой продукт), 1044, 1056 и 1115. Наличие дефектов в структуре пептидов данной группы было связано с пропусками остатков лизина, ва-лина и аргинина.

ОФ ВЭЖХ анализ полученных продуктов позволил определить количественное содержание заданной пептидной последовательности, которое составляло 80-90%, что является достаточной степенью чистоты, для реализации сильноспецифических (аффинных) взаимодействий.

Из представленного на Рис. 6 профиля элюции пептида CGGVVRGPCK-

-Р"А очевидно присутствие мажорного пика целевого продукта и нескольких минорных пиков побочных веществ.

Получение циклического пептида осуществ-

ляли путем циклизации предварительно синтезированного на монолитном сорбенте линейного аналога. Ацетамидометильную группу удаляли с помощью раствора ацетата двухвалентной ртути, с последующим осаждени-

ем (3-меркаптоэтанолом. Удаленный с поверхности носителя и обессолен-

ный продукт синтеза исследовали методами масс-спектрометрии и ВЭЖХ.

ОФ

Рис. 5. Масс-спектр пептида, С(Аст)ООУУ]ШРС(Аст)К.-р-А, синтезированного на С1М®-монолите.

Согласно данным масс-спектрометрии, исследованный образец представлял собой циклическое вещество, содержащее небольшое количество линейного аналога. ОФ ВЭЖХ анализ образца также обнаружил существование двух основных пиков, соответствующих циклическому и линейному аналогам. В соответствии с результатами хроматорафического анализа, содержание циклического продукта составляло 75%, тогда как линейного аналога всего 14%.

2.2.1. Хроматографическая оценка аффинных характеристик комплексов ЛПс природными и синтетическими комплементами

2.2.1.2. Взаимодействие ТАЛсприродными биокомплементами

Как и ожидалось, наиболее сильные специфические взаимодействия наблюдались для пары ТАП- моноклональные антитела (Таблица 6). Высокой, сопоставимой с иммунной, оказалась прочность комплекса фермент-субстрат (ТАП-плазминоген). Определенная термодинамическая прочность комплекса ТАП с непрямым природным комплементом фибриногеном оказалась значительно ниже, что выражалось в увеличении константы диссоциации на два порядка. Из данных Таблицы 6 видно, что количество ТАП, адсорбирующееся на диске с иммобилизованными ли-гандами, в несколько раз меньше по сравнению с емкостью иммобилизации (Отщ/Ошах)- Данный результат может быть объяснен несколькими причинами. Во-первых, безусловно, имеют место стерические ограничения, возникающие при взаимодействии двух макромолекул внутри жесткой поровой структуры сорбента. Во-вторых, это может быть вызвано конформационной лабильностью белковых лигандов, выражающейся в уменьшении доступности их активных центров.

2

2.2.1.2. Взаимодействие ТАП с иммобилизованными пептидными лигандами

Таблица 7 демонстрирует результаты исследования аффинного комплексообразования ТАП с иммобилизованными пептидными лигандами. Как видно из данных Таблицы 7, все синтезированные и исследованные пептидные лиганды демонстрируют высокое сродство к ТАП, а рассчитанные параметры комплексо-образования позволяют говорить о них как о лигандах высокой специфичности. В принципе, полученный результат был ожидаемым, т. к. все лиганды были выбраны на основании биологических свойств ТАП. Однако, несмотря на значения констант, лежащих для линейных пептидов в одном степенном ряду (1СГ6 М), анализ данных, представленных в Таблице 7, дает возможность заключить, что наиболее прочные комплексы с ТАП образуются в случае использования в качестве комплементарных лигандов коротких КККК и вРЯР пептидов. Как и ожидалось, высокое сродство к ТАП обнаружили пептиды, имитирующие участок молекулы плазминогена, ответственный за связывание АП. Наиболее близкими к плазминогену свойствами обладали пептиды КСРвЯУ и КСРОЯУУООС. Увеличение длины гомпроизводных лизина приводило к небольшому увеличению значений Кё^, т. е. наблюдалась тенденция к уменьшению сродства. Полученный результат косвенно свидетельствует о повышении вероятности многоцентрового связывания длинных пептидов в сравнении с короткими пептидами, образующими на поверхности подобие «щетки». Подобная укладка длинных лигандов может снижать доступность адсорбционных центров для растворенных молекул ТАП. Данные, полученные для гетеропептидов ККККвРЯР и ККККККККвРЯР, свидетельствуют о том, что введение лизинового фрагмента и увеличение его длины оказывало незначительное влияние на связывающие свойства

Рис. 6. ОФ ВЭЖХ анализ пептида СООУУ1ШРСК-Р-А, синтезированного на С1М®-диске.

GPRP-пептида, и значительное - на увеличение адсорбционной емкости полученных сорбентов.

Таблица 6. Динамические константы аффинного взаимодействия ТАП с природными лигандами.

Лиганд м* ^тах? мг/диск" Отах« мкмольхЮ2/ мл сорбента От ах

Моноклональ-

ные антитела (1.8 ± 0.4) х 10"7 0.3 1.2 1.91

Плазминоген (9.3 ± 0.2) х 10"7 0.1 0.6 6.34

Фибриноген (1.4 ± 0.7) х 10"5 3.4 15.6 0.04

Таблица 7. Параметры аффинного взаимодействия ТАП с иммобилизованными пептидными лигандами.

Ошах? Оипт./

Лиганд М* мг/диск* мкмольх 102/ Отах

мл сорбента

КККК (1.4 ± 0.4) х 10'6 0.7 3.4 88

КККККККК (2.7 ± 0.3) х 10"6 1.1 4.9 49

кккккккккккк (4.5 ± 0.6) х Ю"6 1.0 4.3 53

ОРЯР (2.0 ± 0.3) х 10"6 0.3 1.3 238

ККККОРЮ> (4.9 ± 1.0) х 10 6 0.5 2.1 133

ККККККККСРЯР (5.4 ± 0.6) х 10'6 0.8 3.2 78

КСРСЮ/ (1.5 ±0.5) х Ю"6 0.4 1.8 165

ЯУУОСС (3.4 ± 0.3) х Ю"6 0.6 2.5 124

КСРСЯУУСОС (2.1 ±0.2) х 10"6 0.4 1.9 133

1 1 КСРОКУУООС (3.5 ±0.7) х 10"6 0.5 2.2 125

дендример К15А (4.9 ± 1.3) х 10'5 0.9 4.0 53

Математическую обработку проводили стандартным методом, рассчитывая выборочную дисперсию и вычисляя погрешность измерения с использованием коэффициента Стьюдента. Доверительный интервал составлял 95%, число измерений - 3.

В таблице представлены средние значения количеств, связавшегося ТАП, полученные по результатам измерений оптической плотности элюата и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 5-7%.

Чтобы подтвердить аффинные свойства выбранных пептидных лигандов, на поверхности монолитов был проведен прямой синтез двух пептидов, не содержащих аминокислоты, находящиеся вблизи выбранного участка молекулы плазминогена, а именно, аффинно-инертные пептиды KCLFVP и CGNLSTQY. Тесты по адсорбции ТАП на полученных матрицах из растворов различной концентрации показали, что адсорбция не превышала 5-7%, что может объясняться исключительно неспецифическими взаимодействиями ТАП с данными пептидными лигандами

Как видно из данных Таблицы 7, соотношение ОштУРтах для пептидных лигандов лежит в интервале от 49 до 238. Очевидно, что такое соотношение сопряжено, прежде всего, с молекулярными размерами взаимодействующих веществ. Понятно, что при адсорбции одной макромолекулы ТАП происходит экранирование определенной части поверхности, содержащей не один, а несколько пептидных лигандов. В целом, взаимодействие выделяемого белка происходит не с единичным пептидом, а с блоком адсорбционных центров.

2.2.1.3. Взаимодействие СКи про-УКс иммобилизованными пептидными лигандами и плазминогеном

Исследования, аналогичные описанным в предыдущем параграфе для ТАП, были проведены для двух других АП, а именно, СК и про-УК. Результаты исследования взаимодействия СК и про-УК с рядом иммобилизованных пептидов и природным субстратом плазминогеном представлены в Таблицах 8 и 9.

Как и ожидалось, наиболее сильное комплексообразование было найдено для пары фермент-субстрат, т. е. пар СК-Пмг и про-УК-Пмг, что выражалось в значительно более низких (10~7 М) значениях констант диссоциации, чем для остальных исследованных пар. Полученные нами результаты согласуются с параметрами, представленными другими исследователями для случая использования плазминогена иммобилизованного на Сефарозе. В частности, К^ комплекса СК-Пмг-Сефароза была найдена равной 6.3x10"8 М. Что касается взаимодействия СК и про-УК с пептидными лигандами, то наиболее сильные специфические взаимодействия, характеризуемые константами диссоциации комплексов одного (10~б М) порядка, наблюдались для группы пептидов, имитирующих связывающий участок молекулы плазмингена.

Известно, что в отличие от ТАП, имеющего сродство к фибрину, продуктам его деградации и другим участникам системы фибринолиза, ни СК, ни про-УК такими свойствами не обладают. Это обстоятельство было также подтверждено нашими экспериментами. Так, в отличие от ТАП, комплексы СК/про-УК с КККК-пептидом имели К^ порядка 10"4 М, что

объясняется присутствием скорее ионных взаимодействий. Анализ параметров комплексообразовния СК/про-УК с GPRP и KKKKGPRP пептидами свидетельствует о слабоспецифическом взаимодействии этих АП с данными лигандами с Кл55 ~ 10"5 М. Ясно, что в случае использования в качестве лиганда пептида KKKKGPRP полученное значение константы диссоциации, в первую очередь, определяется наличием в структуре этого соединения GPRP фрагмента. Наличие такого сродства можно объяснить присутствием в последовательности данного пептида таких аминокислот как Gly, Pro и Arg, которые также входят в состав АП-связывающего сайта в молекуле плазминогена.

Таблица 8. Параметры взаимодействия СК с иммобилизованными пептидными лигандами и плазминогеном.

Лиганд KdiSS, M* Qmaxs ^ мг/диск Qmaxs мкмольхЮ 2/ мл сорбента Qimm./ Qmax

Плазминоген (7.7 ± 0.5) x Ю-7 0.05 0.3 L 13

КККК (1.5 ± 1.2) x 10"4 0.45 2.8 107

GPRP (1.1 ±0.7)x 10"5 0.15 0.9 344

KKKKGPRP (2.5+ 1.3) x 10"5 0.40 2.5 112

KCPGRV (1.3 ± 0.4) x 10"6 0.13 0.8 350

RVVGGC (3.2 ± 0.8) x 10"6 0.24 1.5 207

KCPGRWGGC (2.5 ± 0.3) x 10-6 0.18 1.1 218

K^PGRVVGG (1.8 ± 0.3) x 10"6 0.15 0.9 306

Математическую обработку проводили стандартным методом, рассчитывая выборочную дисперсию и вычисляя погрешность измерения с использованием коэффициента Стьюдента. Доверительный интервал составлял 95%, число измерений - 3.

В таблице представлены средние значения количеств, связавшегося ТАП, полученные по результатам измерений оптической плотности элюата и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 5-7%.

2.2.2. Сравнение характеристик аффинного комплексообразования АП с пептидными лигандами, иммобилизованными и синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов

Аффинные сорбенты, полученные путем прямого твердофазного синтеза на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов, были также использованы для ВЭМДХ анализа и сравнения термодинамических характеристик

аффинных пар АП - пептидный лиганд. Условия синтеза лигандов подбирались так, чтобы емкость получаемых матриц была близка к таковой, получаемой в случае предварительно синтезированных и иммобилизованных пептидов, т. е. около 3 мкмоль/мл сорбента. Результаты проведенных исследований представлены в Таблицах 10,11.

Таблица 9. Параметры взаимодействия про-УК с иммобилизованными пептидными лигандами и плазминогеном.

Qшaxí С^пшх? Qilшn./

Лиганд Кля, М* ; мг/диск мкмольхЮ2/ С^тах

мл сорбента

Плазминоген (5.0 ± 0.2) х Ю-7 0.1 0.6 6

КККК (2.2+ 1.0) х Ю"4 1.0 5.3 57

ОРИР (1.210.6) х 10"5 0.7 3.8 82

ККККХдРНР (2.0 ± 0.9) х Ю"5 0.8 4.4 64

КСРОИУ (5.0 ± 0.4) х Ю"6 0.5 2.9 96

ЯУУССС (6.7 ±0.6) х 10"6 0.7 3.5 86

КСРвКУУСОС (2.5 ± 0.6) х 10"6 0.5 2.8 86

К^РСЯУУО&Ь (3.5 ± 0.5) х 10'6 0.5 2.8 98

дендример К]5А (4.4 ± 1.5) х 10"4 1.0 5.5 38

Математическую обработку проводили стандартным методом, рассчитывая выборочную дисперсию и вычисляя погрешность измерения с использованием коэффициента Стьюдента. Доверительный интервал составлял 95%, число измерений - 3.

В таблице представлены средние значения количеств, связавшегося ТАП, полученные по результатам измерений оптической плотности элюата и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 5-7%.

На основании данных, представленных в Таблице 10, можно сделать вывод о практической идентичности констант диссоциации комплексов ТАП-пептид для обоих случаев фиксации лигандов, т. е. через слож-ноэфирную или амидную связь. Это косвенно подтверждает высокое качество лигандов получаемый на NН2-функционализованных носителях. Такой вывод является правомерным, т. к. эксперименты по аффинной хроматографии на монолитнвгх дисках, содержащих синтезированные пептидные лиганды заведомо ложных последовательностей, были неудачными, что выражалось в отсутствии специфической адсорбции целевого белка.

Таблица 10. Параметры аффинного взаимодействия ТАП с пептидными лигандами, синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов.

Лиганд К^', М О " ><шах ) МКМОЛЬхЮ2/ мл сорбента.

О- Р-АКККК (1.1 ± 0.3) ± 10"6 2.1

Р-АСРЯР (2.7 ± 0.6) ±10"6 1.9

Р-АККККЙРКР (1.7 ± 0.5) ± 10~6 2.8

р-АКСРСЛУ (1.2 ± 0.4) ± 10"6 1.6

р-А^УввС (3.6 ± 0.6) ± 10"6 3.4

р-АКСРОЯУУООС (3.0 ± 0.6) ± 10"6 1.8

Р-АК^РСЯУУООЬ (3.3+0.2) ± 10"6 1.8

■ш- РАОРИР (2.4 ±0.5)+ Ю-6 1.7

Р-АККККОРЯР (2.1 ±0.3) ± Ю-6 2.1

Р-АКСРОЛУУССС (3.5 ±0.3)+ Ю-6 2.2

Математическую обработку проводили стандартным методом, рассчитывая выборочную дисперсию и вычисляя погрешность измерения с использованием коэффициента Стьюдента. Доверительный интервал составлял 95%, число измерений - 3.

В таблице представлены средние значения количеств, связавшегося ТАП, полученные по результатам измерений оптической плотности элюата и данных метода Лоури-Фолина. Стандартное отклонение составляло 5-7%.

Таблица 11. Параметры аффинного взаимодействия СК и про-УК с пептидными лигандами, синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов.

Лиганд ск про-УК

К*,*, м МКМОЛЬХ 102/мл сорб. К<ЦИ, м 0 т - МКМОЛЬХ 102/мл сорб.

> Р-ЛОРЯР 2.3 X 10"5 1.4 - -

Р-АККККОРЯР 1.2 х 10 5 2.5 1.3 X Ю"5 5.6

Р-АКСРОЛУ 2.8 х Ю'6 0.8 2.3 х Ю-6 1.9

Р-АЯУУСОС 4.0 х 10'6 1.8 7.5 х Ю"6 4.2

З-АКЬРОКУУООС! 2.7х Ю"6 0.9 2.3 х 10"6 1.9

Интересным фактом является также демонстрируемая нашими экспериментами независимость специфичности аффинной матрицы одной и той же адсорбционной функциональности от способа присоединения лиганда к полимерному носителю. Практическое совпадение значений К^ для пар ТАП-иммобилизованный пептид и ТАП-синтезированный пептид (сравн. Таблицы 7 и 10) позволяет заключить, что приготовленные методом прямого ТФПС лиганды имеют качество, сопоставимое с предварительно синтезированными и затем иммобилизованными пептидами. Аналогичные результаты были получены также при исследовании взаимодействий других АП с синтезированным и иммобилизованными на монолитных носителях пептидными лигандами (сравн. Таблица 7, 8 и 11).

Основное отличие этих двух типов аффинных сепарационных сред состоит в том, что в случае прямого синтеза лигандов заведомо имеет место одноточечное связывание пептида с поверхностью сорбента, в то время как иммобилизованные лиганды могут быть присоединены к носителю нескольким ковалентными связями. Вероятность многоточечного связывания возрастает с увеличением числа свободных аминогрупп, содержащихся в структуре пептида. Так, например, выявленные отличия в константах диссоциации комплексов ТАП-октапептид KK.KK.GPRP для обоих случаев получения носителей (2.0 и 4.9 мкМ для синтезированного и иммобилизованного лигандов, соответсветственно) могут быть результатом различного поверхностного расположения лигандов. Однако, для коротких пептидов, стерическая ориентация лиганда, с высокой долей вероятности, будет одинаковой для обоих случаев введения адсорбционных центров.

Другим важным отличием аффинных сорбентов, получаемых иммобилизацией и синтезом пептидов, является прикрепление лиганда к поверхности, которое, в первом случае, происходит через присоединение N концевой, а во втором, С-концевой аминокислоты. Однако, несмотря на данное отличие, аффинные характеристики исследуемых комплексов с АП оказались очень близкими. Более того, установлено, что синтезированные на ГМА-ЭДМА последовательности вРКР и его линейный антипод PRPG также не отличались по своим аффинным свойствам.

2.3. Скоростное аффинное выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков

Для эффективного выделения активаторов плазминогена из биологических жидкостей, также как и для выделения других белков, используют метод аффинной хроматографии. Однако, традиционная аффинная хроматография на гелевых сорбентах - это медленный сепарационный процесс, где один разделительный цикл длится часами. В случае исполь-

зования монолитных макропористых носителей, один разделительный цикл осуществляется за 10 минут, что является результатом возможности использовать высокие рабочие скорости.

2.3.1. Выделение рекомбинантного ТАП из СНО-клеточных суперна-тантов. Анализ чистоты выделенного продукта

В работе использовали несколько видов клеточных супернатантов СНО-клеток (CHO=Chinese Hamster Ovary; клетки яичников китайского хомячка), отличающихся друг от друга содержанием ТАП и общего количества белка, а именно, содержащих 4, 6, 12, 30 и 150 мкг рекомбинантного продукта/мл среды (общая концентрация белка составляла, соответственно, 20, 26, 45, 70, 350 мкг/мл супернатанта). Определение количеств выделенного ТАП осуществляли методом иммуноферментного анализа и методом Лоури-Фолина.

Важным результатом проведенных исследований являлось совпадение результатов, получаемых на пептидсодержащих матрицах, приготовленных двумя обсуждаемыми ранее методами. В случае использования супернатантов с низкой концентрацией (4 и 6 мкг/мл) целевого белка, наилучшие результаты демонстрировали плазминоген (78%), пептиды, имитирующие его фрагмент (85-98%), а также пептид GPRP (80-86%). Линейные производные лизина демонстрировали значительно более низкие показатели (29-40%), тогда как количество ТАП, выделенного на диске с иммобилизованным дендримером лизина, достигало 70%. Такой результат может объясняться конкурентной адсорбцией присутствующих в биологической жидкости белков, что, в свою очередь, снижает количество выделяемого целевого белка.

На Рис. 7 представлены результаты исследования элюатов методом гель-электрофореза. Использование в качестве лигандов плазминоге-на, синтезированных и иммобилизованных пептидов, имитирующих его фрагмент, а также тетрапептида GPRP, обнаружило наличие только зон соответствующих целевому белку (Рис. 7а). В то же время, аналогичный анализ продуктов, выделенных с помощью производных лизина, выявил наряду с присутствием ТАП также зоны других белков (Рис. 76). Увеличение содержания целевого белка в исходной культуральной жидкости до 12 и 30 мкг/мл сохранило общую тенденцию количественного выделения ТАП. Тем не менее, эффекта связывания посторонних белков производными лизина в данном случае не наблюдалось. Вероятно, в условиях достаточного содержания целевого белка, идет связывание преимущественно с ним, тогда как при низких концентрациях имеет место конкурентная адсорбция.

2.3.2. Выделение СК и про-УК из модельных смесей белков

Для выделения СК и про-УК использовали смеси, содержащие 10 и 50 мкг/мл целевого белка (общая концентрация белка составляла 45 и 400 мкг/мл, соответственно). Смеси содержали фосфорилазу Б, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, ри-бонуклеазу А, лизоцим, ингибитор трипсина, карбоновую ангидразу и, соответственно, СК/про-УК. В случае выделения СК наилучшие результаты демонстрировали плазминоген (25%) и пептиды, имитирующие его фрагмент (35-45%). Важно, что количество целевого белка, выделяемого с помощью КСРвЯУ и циклического КСРОЯУУОвС пептидов, приблизительно в 1.5 раза больше, чем в случае использования макромолекулярного субстрата. В случае выделения про-УК наилучшие результаты демонстрировали те же лиганды (70-90%). Количество белка, выделенное с помощью вРЯР-пептида, а также лигандов - производных лизина, превышало количество СК/про-УК (выделено > 100% белка), содержащееся в модельных смесях. Это обстоятельство свидетельствует о неприменимости данных матриц для аффинного выделения этих активаторов плазминогена.

В заключение необходимо отметить, что использование полученных аффинных матриц на основе ГМА-ЭДМА макропористых монолитов в течение 1 года (более 60 циклов) и их хранение при 4°С не сопровождалось значительной потерей емкости сорбентов. В наших контрольных экспериментах по определению и выделению ТАП на диске с иммобилизованным плазминогеном было установлено, что спустя год емкость данного сорбента уменьшилась всего на 10%, а в случае использования пептидных лигандов, падения емкости не наблюдалось вообще.

а) 1234567 б) 1234567

Рис. 7. ПААГЭ анализ чистоты ТАП, выделен -ного из супернатанта с низким содержанием целевого белка.

Обозначения: (а) 1 - нативный СНО-супернатант (содержание ТАЛ 6 мкг/мл); 2, 3,4 - ТАП, выделенный с помощью сорбентов: диск-р-АКСРОЯУУООС, диск-КСРОЮТООС и диск-плазминоген, соответственно; 5 - ТАП-стандарт, 6 -ТАП, выделенный с помощью диска с иммобилизованным КСРОЯУ пептидом; 7 - маркеры.

(б) 1, 7 - маркеры; 2 - ТАП-стандарт; 3 - нативный СНО-супернатант (содержание ТАП 4 мкг/мл); 4, 5 - ТАП, выделенный с помощью сорбентов с иммобилизованными ККККОРИР и дендримерным лигандами; 6 - ТАП, выдел ен-ный с помощью ОРЯР-пептида.

ВЫВОДЫ

Перечисленные выше результаты могут служить основой для следующих выводов:

1. Разработан оригинальный метод создания аффинных носителей путем прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности макропористых монолитных полиметакрилатных сорбентов, позволяющий получать качественные сепарационные среды при незначительных затратах времени и реагентов.

2. Впервые, на примере одного из путей фибринолиза показано, что метод ВЭМДХ может быть использован для in vitro моделирования различных этапов метаболических процессов, происходящих через образование биоспецифических комплексов природных комплементарных молекул. Данный подход был использован для подтверждения различий механизмов взаимодействия с субстратом исследованных активаторов плазминогена, а также при поиске эффективных биоспецифических лигандов для их выделения.

3. Проведено количественное сравнение аффинных свойств носителей с иммобилизованными и непосредственно синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов лигандами. Показано, что в случае одноточечного связывания, способ прикрепления лиган-да к поверхности носителя (через С- или N-концевую аминокислоту) не отражается на величинах констант диссоциации аффинных комплексов, тогда как многоточечное связывание лиганда с поверхностью сорбента ведет к ухудшению аффинных характеристик.

4. Впервые с использованием полученных аффинных матриц показана возможность скоростного и эффективного выделения активаторов плазминогена из многокомпонентных смесей белков, включая нативные клеточные супернатанты, содержащие рекомби-нантный продукт.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Т. В. Tennikova, G. A. Platonova, E. G. Vlakh, G. Renemann, С. Kasper, G. Kretzemer, Quantitative in vitro investigation of affinity pairing of tissue plasminogen activator with its possible in vivo counterparts by means of modern HPMDC method, in: Book of Abstracts, 20 International Symposium on the Separation and Analysis of Proteins, Peptides and Polynucleotides, ISPPP'2000, Ljubljana, Slovenia, 2000, P. 17-18.

2. E. G. Vlakh, G. A. Platonova, V. I. Korol'kov, G. P. Vlasov, C. Kasper, G. Kretzemer, Т. В. Tennikova, Use of linear/branched oligo/poly-1-lysines as specific affinity ligands to tissue plasminogen activator (t-PA), in: Booh of Abstracts, 25h International Symposium on High Performance Liquid Phase Sepuicttians and Related Techniques, HPLC'01, Maastricht, The Netherlands, 2001, v. l, P. 275.

3. N. Ostryanina, E. Vlakh, K. Pflegerl, A. Jungbauer, T. Totmikova, Comparison of affinity ligands to tissue plasminogen activator (t-PA) obtained by immobilization and direct syntesis on GMA-EDMA disks, in: Book of Abstracts, 2" International Symposium on Separation in the BioSciencies, SBS'01, Prague, Czech Republic, 2001, P. 113.

4. E. G. Vlakh, G. A. Platonova, G. P. Vlasov, С Kasper, A. Tappe, G. Kretzmer, Т. В. Tennikova, In vitro comparison of complementary interactions between synthetic linear/branched oligo/poly-L-lysines and tissue plasminogen activator by means of high-performance monolithic-disk affinity chromatography, J. Chromatogr. A, 2003, V. 992, P. 109-119.

5. A. Tappe, G. Kretzemer, C. Kasper, T. Scheper, E. G. Vlakh, Т. В. Tennikova. In vitro comparison of complementary interactions between synthetic ligands and tissue plasminogen activator (t-PA) by means of high performance monolithic disk chromatography, in: Book of Abstracts, 18h Meeting of the European Society for Animal Cell Technology, ESACT'03, Granada, Spain, 2003, P. 183.

6. E. G. Vlakh, G. P. Vlasov, Т. В. Tennikova, Study of affinity interactions between t-PA and synthetic peptides imitating natural substratum part, in: Book of Abstracts 400 Years of Chromatography', 3d International Symposium on Separation in the BioSciencies, SBS'03, Moscow, Russia, 2003, P. 156.

7. E. G. Vlakh, G. P. Vlasov, Т. В. Tennikova, Affinity chromatography on monoliths: application of peptidyl ligands directly synthesized on GMA-EDMA disks, in: Book of Abstracts, 27h International Sympo-

sium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC'03, Nice, France, 2003, P. 168.

8. E. Г. Влах, Г. П. Власов, Т. Б. Тенникова. Твердофазный синтезов пептидов на проточных монолитных метакрилатных дисках. Сб. тезисов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, Москва, Россия, 2003, С. 12.

9. Е. Vlakh, N. Ostryanina, A. Jungbauer, T. Tennikova. Use of monolithic sorbents modified by directly synthesized peptides for affinity separation of recombinant tissue plasminogen activator (t-PA). J. Biotechnol 107(2004)275-284.

10. E. Г. Влах, Т. Б. Тенникова. Сравнение аффинных свойств активаторов плазминогена методом ВЭМАДХ. Сб. тезисов Всероссийского симпозиума "Хроматография и хроматографические приборы ", Москва, Россия, 2004, С. 233.

11. Е. G. Vlakh, Т. В. Tennikova. Application of monolithic CIM disks for solid phase peptide synthesis, in: Book of abstracts, Г Monolith Summer School: Applications in Bio chromatography, Bioconversion and Solid Phase Synthesis, Portoroz, Slovenia, 2004, P. 60.

12. E. G. Vlakh, Т. В. Tennikova. Solid phase peptide synthesis on macroporous methacrylate monoliths. Abstracts of the 3d International and 28h European Peptide Symposium, EPS'04, Prague, Czech Republic. J. Pept. ScL, supplement, 2004, V.10/S2, P. 91.

13. E. G. Vlakh, A. Tappe, С Kasper, Т. В. Tennikova. Monolithic pepti-dyl sorbents for comparison of affinity properties of plasminogen activators. J. Chromatogr. B, 2004, V. 810, P. 15-23.

14. E. Vlakh, A. Novikov, G. Vlasov, T. Tennikova. Solid phase peptide synthesis on epoxy-bearing methacrylate monoliths. J. Pept. ScL, 2004, V. 10, P. 719-730.

02, 00

Автореферат отпечатан в ИВС РАН. Ризография. Тираж 100 экз.

2 2 ФЕ8 Ж 9 6

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Биосепарация - основной этап биотехнологии.

1.1.1. Использование аффинности в разделительных процессах. ц 1.1.2. Сущность аффинной хроматографии.

1.1.3. Аффинные лиганды.

1.1.4. Количественное определение параметров аффинного комплексообразования.

1.2. Монолитные сорбенты для биоспецифических (аффинных') межфазовых разделений биологических молекул.

1.2.1. Требования, предъявляемые к стационарным фазам для аффинной хроматографии.

1.2.2. Современные стационарные фазы: монолитные сорбенты.

1.2.3. Высокоэффективная монолитная хроматография на основе ультра-коротких ГМА-ЭДМА стационарных фаз.

1.2.4. Применение высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ) для аффинного выделения белков.

1.3. Способы создания аффинных матриц.

1.3.1. Нековалентная иммобилизация.

1.3.2. Ковалентная иммобилизация белков и пептидов.

1.3.2.1. Основные аспекты.

1.3.2.2. Методы химической иммобилизации аминосодержащих л лигандов.

1.3.3. Прямой твердофазный синтез пептидов на монолитных носителях.

1.3.3.1. Основная концепция твердофазного синтеза пептидов.

1.3.3.2. Монолитные носители и твердофазный синтез на их основе.

1.3.3.3. Проблема контроля пептидного синтеза на монолитных носителях.

1.3.4. Создание аффинных сорбентов полимеризацией предварительно модифицированных сомономеров.

1.4. Активаторы плазминогена.

1.4.1. In vivo взаимодействия белков крови при тромбозе и фибринолизе.

1.4.2. Стрептокиназа.

1.4.3. Урокиназа и про-урокиназа.

1.4.4. Тканевый активатор плазминогена.

1.4.5. Стафилокиназа.

1.4.6. Производство и выделение активаторов плазминогена.

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Создание аффинных сорбентов на основе макропористых монолитных ГМА-ЭДМА дисков.

2.1.1. Ковалентная иммобилизация белковых лигандов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов.

2.1.2. Ковалентная иммобилизация предварительно синтезированных пептидных лигандов.

2.1.2.1. Синтез и исследование пептидов.

2.1.2.2. Иммобилизация пептидных лигандов на поверхности монолитных носителей.

2.1.3. Прямой синтез пептидных лигандов на поверхности проточных ГМА-ЭДМА сорбентов (дисков).

2.1.3.1. Предварительная функционализация монолитного носителя.

2.1.3.2. Определение концентрации свободных аминогрупп на поверхности модифицированного полимерного сорбента.

2.1.3.3. Введение fi-аланина в структуру сополимера.

2.1.3.4. Выбор стратегии твердофазного синтеза и анализа продуктов, полученных на монолитных носителях. Синтез модельных пептидов.

2.1.3.5. Синтез целевых последовательностей.

2.1.3.6. Характеристика матриц, полученных для аффинной хроматографии.

2.2. Изучение аффинных свойств активаторов плазминогена методом ВЭМДХ с использованием полученных белок- и пептидсодержащих сорбентов.

2.2.1. Хроматографическая оценка аффинных характеристик комплексов активаторов плазминогена с природными и синтетическими комплементами.

2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена с природными биокомплементами.

2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена с иммобилизованными гомо- и гетеропептидными лигандами.

2.2.1.3. Взаимодействие стрептокиназы и про-урокиназы с иммобилизованными пептидными лигандами и плазимногеном.

2.2.2. Сравнение характеристик аффинного комплексообразования активаторов плазминогена с пептидными лигандами, иммобилизованными и впрямую синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов.

2.3. Скоростное аффинное выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков.

2.3.1. Исследование возможности неспецифического связывания различных белков полученными пептидсодержащими сорбентами.

2.3.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из нативного клеточного супернатанта. Анализ чистоты выделенного продукта.

2.3.3. Выделение стрептокиназы и про-урокиназы из модельных белковых смесей. t 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Синтез вспомогательных веществ и производных аминокислот.

3.3.2. Твердофазный синтез пептидов на полистирольном носителе.

3.3.2.1. Общая схема твердофазного пептидного синтеза.

3.3.2.2. Качественные реакции, используемые в твердофазном пептидном синтезе.

3.3.2.3. Удаление пептидов с полимерного носителя.

3.3.2.4. Деблокирование и окисление сульфгидрильных групп остатков цистеина (циклизация декапепида KCPGRWGGC).

3.3.2.5. Очистка и ОФ ВЭЖХанализ синтезированных пептидов.

3.3.3. Твердофазный синтез пептидов на поверхности проточных монолитных ГМА-ЭДМА дисков.

3.3.3.1. Функционализация монолитного носителя.

3.3.3.2. ИК-спектроскопия.

3.3.3.3. Общая схема синтеза.

3.3.3.4. Циклизация пептида CGG WRGPCK-ß-A.

3.3.3.5. Выделение и предочистка пептидов для аналитических целей.

3.3.3.6. ОФ ВЭЖХанализ пептидов, синтезированных на ГМА-ЭДМА дисках.

3.3.4. Методы исследования пептидных продуктов.

3.3.4.1. Аминокислотный анализ.

3.3.4.2. Масс-спектрометрия.

3.3.4.3. Хроматографический анализ олиголизинов.

3.3.5. Иммобилизация аффинных лигандов на поверхности монолитных макропористых ГМА-ЭДМА сорбентов.

3.3.5.1. Характеристика и подготовка стационарных фаз.

3.3.5.2. Иммобилизация пептидных лигандов.

3.3.5.3. Иммобилизация белков.

3.3.5.4. Аналитические методы определения концентрации белок- и пептидсодержащих растворов.

3.3.6. Определение параметров аффинного взаимодействия.

3.3.6.1. Аффинная ВЭМДХ.

3.3.6.2. Определение количественных параметров аффинного комплексообразования.

3.3.7. Выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков.

3.3.7.1. Приготовление клеточных супернатантов.

3.3.7.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из клеточных супернатантов.

3.3.7.3. Выделение стрептокиназы и про-урокиназы из модельных смесей белков.

3.3.7.4. Иммуноферментный анализ (метод конкурентного связывания).

3.3.7.5. Гель-электрофорез.

Выводы.

Одной из наиболее острых проблем мирового здравоохранения является высокий процент смертности от острых сердечно-сосудистых заболеваний. Причиной данного заболевания является поражение кровеносных сосудов образующимися тромбами, наличие которых серьезно нарушает, а впоследствии может полностью блокировать нормальный кровоток. Природной альтернативой образованию тромбов в живом организме является обратный процесс, а именно, растворение тромбов, или фибринолиз, происходящий под действием фермента плазмина. Данный фермент является продуктом расщепления его предшественника - плазминогена, которое происходит при каталитическом участии так называемых активаторов плазминогена, таких как стрептокиназа (СК), про-урокиназа (про-УК) и тканевый активатор плазминогена (ТАП). Очевидно, что естественных количеств образующегося при нормальном фибринолизе плазмина хватает лишь для растворения небольшого количества тромбов, т.е. для поддержания природного баланса между тромбозом и фибринолизом, присущего здоровому организму. В случае же отклонения от нормы, усиленный тромболитический эффект может быть достигнут использованием терапевтических доз экзогенных активаторов плазминогена.

В настоящее время наиболее перспективными способами получения подобных лекарственных препаратов, как из-за отсутствия ограничений по источнику сырья (донорской крови), так и относительно низкой стоимости конечного продукта, являются генно-инженерные методы. При производстве терапевтических белков генно-инженерным способом возникают такие технологические проблемы как (1) анализ чистоты выделяемого продукта, и (2) его препаративное, желательно одностадийное, выделение непосредственно из клеточных лизатов или супернатантов. Одним из приоритетных методов для решения данных задач является аффинная хроматография, основанная на образовании высокоспецифических обратимо-диссоциирующих комплексов биологических макромолекул с комплементарными адсорбционными центрами, локализованными на поверхности неподвижной фазы.

Развитие идеологии современных аффинных разделений тесно связано с конструированием новых материалов-носителей и новых подходов к получению аффинных сорбентов. Одним из самых современных и перспективных сорбентов, удовлетворяющих всем требованиям, выдвигаемым к разделительным стационарным фазам, являются так называемые монолитные твердые фазы, в частности, макропористые сорбенты на основе сополимера глицидшметакрилата (2,3-эпоксипропилметакрилата) и этиленгликольдиме-такршата (ГМА-ЭДМА), выполненные в форме цельных дисков. Метод динамического

разделения веществ с использованием данных оригинальных сред получил название высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ).

Морфологические, стерические и гидродинамические свойства данных носителей позволяют проводить биосепарационные процессы с использованием высоких скоростей потока подвижной фазы. Осуществление скоростных разделений становится возможным, благодаря практически полному отсутствию диффузионных ограничений нормальному межфазовому переносу вещества. Именно это обстоятельство позволяет не только эффективно разделять вещества разных классов, но также исследовать неискаженную кинетику биоспецифических межмолекулярных взаимодействий. Кроме того, серьезным преимуществом ГМА-ЭДМА стационарных фаз является наличие собственных эпоксидных групп, позволяющих проводить одностадийную функционализацию сорбента биологически активными веществами (лигандами).

Важным этапом любого разделительного процесса, основанного на природной био-комплементарности, прежде всего, является выбор наиболее эффективного лиганда. В качестве аффинных лигандов для выделения активаторов плазминогена (АП), в большинстве случаев, используют моноклональные антитела, полученные в результате иммунного ответа организма при введении соответствующего АП. Однако, несмотря на высокую специфичность, природные биомолекулы имеют ряд недостатков, ограничивающих их практическое использование. Среди таких недостатков можно назвать, в первую очередь, их высокую стоимость, а, во-вторых, неустойчивость (лабильность) структуры белка, затрудняющую их эксплуатацию. Поэтому поиск более дешевых и устойчивых синтетических лигандов является одной из важнейших задач для разработки методов анализа и выделения АП. Из ранее опубликованных данных известно, что роль аффинных лигандов, способных образовывать высокоспецифичные комплексы с ТАП, могут выполнять различные производные лизина, а также пептид 01у-Рго-А^-Рго (ОРЯР). Однако систематических исследований с целью сравнения и выбора оптимального синтетического партнера для выделения ТАП и других активаторов плазминогена до сих пор не проводилось. В соответствии со всем вышесказанным, поиск новых аффинных партнеров и использование их для эффективного скоростного выделения таких ценных генно-инженерных лекарственных препаратов, как активаторы плазминогена, является, несомненно, актуальной проблемой.

Традиционно, аффинные сорбенты получают иммобилизацией предварительно синтезированных и очищенных пептидов. Однако альтернативным и более экономичным подходом представляется прямой синтез данных соединений на поверхности хроматогра-фических сорбентов. При этом матрица должна удовлетворять требованиям, предъявляемым как к твердым фазам для пептидного синтеза, так и к сорбентам для хроматографии. Другими словами, подобная стационарная фаза должна быть хорошо проницаемой, стабильной как в органических, так и в водных средах, содержать функциональные группы позволяющие осуществить ТФПС, а также должна обеспечивать высокую доступность для молекул выделяемого вещества. Во избежание денатурации биологических продуктов, аффинные сорбенты должны быть гидрофильны. В соответствии с перечисленными свойствами, макропористые монолитные ГМА-ЭДМА сорбенты идеально подходят для обоих видов использования. Это и определяет научную новизну работы, которая заключается в:

- разработке оригинального метода построения аффинных сепарационных систем на основе макропористых сорбентов монолитного типа с использованием метода прямого твердофазного синтеза пептидов, выполняющих функцию биоспецифических лигандов;

- хроматографическом моделировании и количественном сравнении биологических взаимодействий на примере одного из механизмов фибринолиза;

- разработке и оптимизации скоростного одностадийного метода выделения биологических продуктов (активаторов плазминогена) из многокомпонентных смесей. Таким образом, целью данной работы являлось создание аффинных сорбентов традиционным способом и посредством прямого ТФПС на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов, а также исследование и сравнение их специфических взаимодействий с интересующими объектами, а именно, активаторами плазминогена. Данное исследование определило выбор наиболее подходящего аффинного лиганда для решения практической задачи — скоростного и эффективного выделения активторов плазминогена методом ВЭМДХ.

В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи: выбор пептидов, комплементарных к интересующим белкам, на основе анализа природных биологических взаимодействий с участием данных белков;

- синтез выбранных пептидных лигандов традиционным твердофазным методом и их физико-химический анализ;

- получение аффинных сорбентов путем ковалентной иммобилизации биолигандов на поверхности ГМА-ЭДМА монолитных сорбентов;

- разработка оригинального метода твердофазного пептидного синтеза на поверхности монолитных сорбентов и детальный анализ качества получаемых пептидных соединений; использование данного метода для получения сорбентов с пептидными лигандами, необходимыми для выделения активаторов плазминогена;

- определение количественных параметров биокомплементарного взаимодействия активаторов плазминогена (СК, про-УК и ТАП) с различными лигандами с использованием метода скоростной аффинной ВЭМДХ;

- сравнение характеристик аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности монолитного сорбента; исследование процессов выделения ТАП, СК и про-УК из многокомпонентных смесей.

Работа выполнена в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (гранты DFG KR 1076/6-1 и ННО-РАН 436 RUS 113/555/0); при участии лаборатории №4 ИВС РАН и Института прикладной микробиологии Университета сельскохозяйственных наук Вены (Австрия), а также при финансовой поддержке фирмы BIA Separations d. о. о. (Любляна, Словения).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биосепарация — основной этап биотехнологии

Современный уровень генной инженерии позволяет достаточно легко масштабировать производство природных биологически активных веществ различных классов, в частности, белков. При этом возникает необходимость создания эффективных методов, как аналитического производственного контроля, так и препаративного выделения чистого продукта непосредственно из клеточных лизатов и супернатантов. Таким образом, разработка стадии выделения и тонкой очистки, т.е. создание высокоэффективных и высокопроизводительных сепарационных методов, является одной из основных и важнейших задач в производстве биологически активных веществ медицинского назначения.

Для очистки целевой субстанции в условиях непрерывного биотехнологического процесса широко используются такие методы как осаждение, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, жидкостная хроматография и др. [1], однако только последняя может гарантировать степень очистки продукта до безопасного терапевтического уровня. По современному определению, хроматографический сепарационный процесс происходит в условиях динамического квазиравновесного распределения вещества между подвижной (жидкой) и неподвижной (твердой) фазой [2]. При этом разделяемые биологические молекулы взаимодействуют с поверхностью неподвижной, как правило, пористой фазы по механизму адсорбции («положительное» взаимодействие) или эксклюзии («отрицательное» взаимодействие или исключение из пор малого размера). Однако биомолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно; поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует значительных временных затрат. Вследствие этого, в процессе выделения существенно падает биологическая активность продукта из-за его денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. [3].

ВЫВОДЫ

Перечисленные выше результаты могут служить основой для следующих выводов:

1. Разработан оригинальный метод создания аффинных носителей путем прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности макропористых монолитных по-лиметакрилатных сорбентов, позволяющий получать качественные сепарационные среды при незначительных затратах времени и реагентов.

2. Впервые, на примере одного из путей фибринолиза показано, что метод ВЭМДХ может быть использован для in vitro моделирования различных этапов метаболических процессов, происходящих через образование биоспецифических комплексов природных комплементарных молекул. Данный подход был использован для подтверждения различий механизмов взаимодействия с субстратом исследованных активаторов плазминогена, а также при поиске эффективных биоспецифических ли-гандов для их выделения.

3. Проведено количественное сравнение аффинных свойств носителей с иммобилизованными и непосредственно синтезированными на поверхности ГМА-ЭДМА монолитов лигандами. Показано, что в случае одноточечного связывания, способ прикрепления лиганда к поверхности носителя (через С- или N-концевую аминокислоту) не отражается на величинах констант диссоциации аффинных комплексов, тогда как многоточечное связывание лиганда с поверхностью сорбента ведет к ухудшению аффинных характеристик.

4. Впервые с использованием полученных аффинных матриц показана возможность скоростного и эффективного выделения активаторов плазминогена из многокомпонентных смесей белков, включая нативные клеточные супернатанты, содержащие рекомбинантный продукт.

1. Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.

2. Сборники научно-нормативной терминологии. Хроматография. Основные понятия. Терминология. Вып. 114 , Москва, 1997.

3. Я. Туркова. Аффинная хроматография, М.: Мир, 1980.

4. Y. D. Clonis. Matrix evaluation for preparative high-performance affinity chromatography. // J. Chromatogr. 1987. V. 407. P. 179-187.

5. И. Ю. Галаев. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1013-1021.

6. И. Ю. Галаев, Б. Маттиассон. Новые методы аффинной очистки белков. Аффинное осаждение. И Биохимия. 1997. Т. 62. С. 669-676.

7. J. Turkova. Bioaffinity Chromatography, in: Aboul-Enein H.Y. (Ed.) Analytical and Preparative Separation methods of Biomacromolecules. New-York: Marcel Dekker. 1999. C. 99-166.

8. Т. M. Phillips, J. M. Krum. Recycling Immunoaffinity Chromatography for Multiple Analyte Analysis in Biological Samples. //J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 55-63.

9. S. Katoh, M. Terashima, N. Shiomi. Utilization of Antipeptides Antibodies as Affinity1.gands in Immunoaffinity Purification. II J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 147-152.

10. K. Huse, H. J. Böhme, G. H. Scholz. Purification of Antibodies by Affinity Chromatography. II J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. V. 51. P. 217-231.

11. N. B. Tulsani, A. Kumar, M. A. Vijayalakshmi. Purification of Muscle Enzymes by Pseu-doaffmity Chromatograpfy. // Prep. Biochem. Biotechnol. 1999. V. 29. P. 151-161.

12. A. W. Adamanson. Physical Chemistry of Surfaces. New-York: Wiley Interscience. 1976.1. P. 553-556.

13. E. C. Moreno, M. Kresak, D. H. Hay. Adsorption of two human parotid salivary macromolecules on hydroxy-, fluorhydroxy- and fluorapatites. // Arch. Oral. Biol. 1978. V. 23. P. 525-533.

14. E. C. Moreno, M. Kresak, D. H. Hay. Adsorption thermodynamics of acidic proline-rich human salivary proteins onto calcium apatites. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 2981-2989.

15. R. Freitag. Utilization of Enzyme-Substrate Interactions in Analytical Chemistry. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 722. P. 279-301.

16. S. Ohlson, M. Bergström, P. Pahlsson, A. Lundblad. Use of Monoclonal Antibodies for Weak Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. A1997. V. 758. P. 199-208.

17. P. Y. Huang, R. G. Carbonell. Affinity Chromatographic Screening of Soluble Combianato-rial peptide Libraries. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 63. P. 633-641.

18. R. Arshady. Beaded polymer supports and gels. Physico chemical criteria and functionali-zationv. // J. Chromatogr. 1991. V. 586. P. 199-219.

19. H. Chen, C Horvath. High-speed High-performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins. II J. Chromatogr. A. 1995. V. 705. P. 3-20.

20. R. Janzen, K. K. Unger, H. Giesche, J. N. Kinkel, M. T. W. Hearn. Evaluation of Advanced

21. D. D. Frey, X. Kang. Chromatofocusing Using Micropellicular Column Packings with

22. Computer-aided Design of the Elution Buffer Composition. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 10381045.

23. N. B. Afeyan, S. P. Fulton, F. E. Regnier. Perfusion Chromatography Packing Materials for Proteins and Peptides. II J. Chromatogr. 1991. V. 544. P. 267-279.

24. H. Iwata, K. Saito, S. Furusaki, T. Sugo, J. Okamoto. Adsorption Characteristics of an Immobilized Metal Affinity Membrane. II Biotechnol. Prog. 1991. V. 7. P. 412-418.

25. J. Hradil, D. Horak, M. Benes, in: M. Potschka, P. Dubin (Eds.). Strategies in Size Exclu-p sion Chromatography. ACS Symposium Series 635. Washington, D.C. 1996. P. 212-245.

26. V. Saxena, A. E. Weil. Radial Flow Column: a New Approach to Scaling-up Biopurifications. // BioChromatography. 1987. V. 2. P. 90-97.

27. F. Svec, J. M. J. Frechet. Modified Poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) Continuous Rod Columns for Preparative-scale Ion-exchange Chromatography of Proteins. H J. Chromatogr. 1995. V. 702. P. 89-97.

28. S. Hjerten, J. L. Liao, R. Zhang. High-performance Liquid Chromatography on Continuous Polymer Beds. H J. Chromatogr. 1989. V. 473. P. 273-275.

29. J. Mohhammad, S. Hjerten. Continuous Beds. Their Applicability for Immobilization of Proteins. //Biomed. Chromatogr. 1994. V. 8. P. 165-169.

30. T. B. Tennikova, M. Bleha, F. Svec, T. V. Almazova, B, G. Belenkii. High Performance Membrane Chromatography of Proteins: a Novel Method of Protein Separation. // J. Chromatogr. 1991. V. 555. P. 97-107.

31. T. B. Tennikova, F. Svec. High-performance Membrane Chromatography: Highly Efficient Separation Method for Proteins in Ion-exchange, Hydrophobic Interaction and Reversed-phase Modes. II J. Chromatogr. 1993. V. 646. P. 279-288.

32. H. Abou-Rebyeh, F. Korber, K. Schubert-Rehberg, J. Reusch, Dj. Josic. Carrier Membrane as a Stationary Phase for Affinity Chromatography and Kinetic Studies of Membrane-bound Proteins. II J. Chromatogr. B. 1991. V. 566. P. 341-350.

33. D. Josic, J. Reusch, K. Loster, O. Baum, W. Reutter. High Performance Membrane Chromatography of Serum and Plasma Membrane Proteins. // J. Chromatogr. 1992. V. 590. P. 59-76.

34. F. Svec, J. M. J. Frechet. Kinetic Control of Pore Formation in Macroporous Polymers. Formation of "Molded" Porous Materials with Flow Characteristics for Separation and Catalysis. II Chem. Mater. 1995. V. 7. P. 707-715.

35. F. Svec, T. Tennikova. Polymeric Separation Media for Chromatography of Biopolymers in a Novel Shape: Macroporous Membranes. // Bioact. Compat. Polym. 1991. V. 6. P. 394-406.

36. C. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, T. Tennikova. Fast Isolation of Protein Receptors from

37. Streptococci G by Means of Macroporous Affinity Disks. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 65. P. 65-72.

38. L. Berruex, R. Freitag, T. B. Tennikova. Comparison of Antibody Binding to Immobilized Group Specific Affinity Ligands in High Performance Monolith Affinity Chromatography. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V. 24. P. 95-104.

39. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet. Rigid Macroporous Polymer Monoliths. I I Adv. Mater. 1999. V. 11. P. 1169-1181.

40. A. Podgornik, M. Barut, I. Mihelic, A. Strancar. Tubes. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 77-102.

41. P. Gustavsson, P. Larsson. Monolithic Polysaccharide Materials. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 121-142.

42. E. Calleri, G. Massolini, D. Lubda, С. Temporini, F. С. Loiodice, G. Caccialanza. Evaluation of a monolithic epoxy silica support for penicillin G acylase immobilization. // J. Chro-manogrA. 2004. V. 1031. P. 93-100.

43. X. Huang, S. Zhang, G. A. Schultz, J. Henion. Surface-alkylated Polystyrene Monolithic Columns for Peptide Analysis in Capillary Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometry. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2336-2344.

44. C. G. Huber. Biopolymer Chromatography, in book: R. A. Meyers (Ed.). Encyclopedia of Analytical Chemestry. Chichester: John Wiley & Sons Ltd. 2000. P. 11250-11278.

45. F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003.

46. Т. B. Tennikova, F. Svec. Theoretical Aspects of Separation Using Short Monolithic Beds. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 351-372.

47. A. Podgornik, M. Barut, J. Jancar, A. Strancar, T. Tennikova. High-performance Membrane Chromatography of Small Molecules. II Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 2986-2991.

48. R. Giovannini, R. Freitag, Т. В. Tennikova. High-performance Membrane Chromatography of Supercoiled Plasmid DNA. II Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 3348-3354.

49. Т. B. Tennikova, R. Freitag. An Introduction Disks as Stationary Phases for High Performance Biochromatography, И J. Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 27-38.

50. А. А. Демин, А. Д. Могилевская, Г. В. Самсонов. Особенности многокомпонентной сорбции белков катионитсодержащими композитами. И Журнал физической химии. 1996. Т. 70. С. 2059-2062.

51. А. Е. Rodrigues, V. G. Mata, М. Zabka, L. Pais. Flow and Mass Transfer. In book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 325-350.m

52. D. Josic, A. Buchacher, A. Jungbauer. Monoliths as Stationary Phases for Separation of Proteins and Polynucleotides and Enzymatic Conversion. II J. Chromatogr. B. 2001. V. 752. P. 191-205.

53. M. B. Tennikov, N. V. Gazdina, Т. B. Tennikova, F. Svec. Effect of Porous Structure of Macroporous Polymer Supports on Resolution in High-Performance Membrane Chromatography of Proteins. II J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 55-64.

54. A. Strancar, М. Barut, A. Podgornik, P. Koselj, H. Schwinn, P. Raspor, D. Josic. Application of Compact Porous Tubes for Preparative Isolation of Clotting Factor VIII from Human Plasma. II J. Chromatogr. A. 1997. V. 760. P. 117-123.

55. R. Freitag, J. Breier. Displacement Chromatography in Biotechnological Downstream Processing. II J. Chromatogr. 1995. V. 691. P. 101-109.

56. R. Freitag, S. Vogt. Comparison of Particulate and Continuous-bed Columns for Protein Displacement Chromatography. II J, Biotechnol. 2000. V. 78. P. 69-82.

57. D. Josic, F. Bai, H. Schwinn. Isolation of Plasma Proteins from the Clotting Cascade by Heparin Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. 1993. V. 632. P. 1-10.

58. JI. Ф. Мерингова, Г. Ф. Леонтьева, Т. В. Гупалова, Т. Б. Тенникова, А. А. Тотолян. Выделение и исследование рекомбинантного IgG-связывающего рецептора стрептококка группы G с использованием макропористых дисков. // Биотехнология. 2000. Т. 4. С. 45-53.

59. G. A. Platonova, G. A. Pankova, I. Е. Il'ina, G. P. Vlasov, Т. В. Tennikova. Quantitative Fast Fractionation of Pool of Polyclonal Antybodies by Immunoaffinity Membrane Chromatography. II J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 129-140.

60. N. D. Ostryanina, О. V. Il'ina, Т. B. Tennikova. Effect of Experimental Conditions on Strong Biocomplementary Pairing in High-Performance Monolithic Disk Affinity Chromatography. II J. Chromatogr. B. 2002. V. 770. P. 35-43.

61. N. D. Ostryanina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Multifunctional Fractionation of Polyclonal Antibodies by Immunoaffinity High-performance Monolithic Disk Chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 163-171.

62. J. Hagedorn, С. Kasper, R. Freitag, Т. Tennikova. High Performance Flow Injection Analysis of Recombinant Protein G. // J. Biotechnology. 1999. V. 69. P. 1-7.

63. R. Necina, K. Amatschek, E. Schallaun, H. Schwinn, D. Josic, A. Jungbauer. Peptide Affinity Chromatography of Human Clotting Factor VIII. Screening of the vWF-binding domain. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 191-201.

64. M. Nisnevitch, M. A. Firer. The Solid Phase in Affinity Chromatography: strategies for antibody attachment. И J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 49. P. 467-480.

65. А. V. Litvinchuk, A. A. Morozova, М. I. Savenkova, D. I. Metelitsa. Noncovalent immobilization of catalase on antibodies adsorbed on carbon fabric. // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1994. V. 30. P. 572-581.

66. F. W. Autin, R. E. Corstvet. Purification of a Pasteurella Haemolitica Serotype I-specific Polysaccharide Epitope by Use of Monoclonal Antibody Immunoaffinity. // Am. J. Vet. Res. 1993. V. 54. P. 695-700.

67. R. F. Taylor. Protein Immobilization: Fundamentals and Application. New York: Marcel Dekker. 1991.

68. S. S. Wong. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking. Boca Raton: CRC Press, 1993.

69. G. Fassina. Oriented Immobilization of Peptide Ligands on Solid Supports. // J. Chroma-togr. 1992. V. 591. P. 99-106.

70. B. Lu, M. R. Smith, R. O'Kennedy. Oriented Immobilization of Antibodies and its Applications in Immunoassays and Immunosensors. ¡/Analyst. 1996. V. 121. P. 29R-32R.

71. Z. Bilkova, J. Mazurova, J. Churacek, D. Horak, J. Turkova. Oriented Immobilization of Chymotrypsin by Use of Suitable Antibodies Coupled to a Nonporous Solid Support. // J. Chro-matogr. A. 1999. V. 852. P. 141-149.

72. J. Hale. Irreversible, Oriented Immobilization of Antibodies to Cobalt-intermediate Resin for Use as Immunoaffinity Media //Anal. Biochem. 1995. V. 231. P. 46-49.

73. G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith. Immobilized Affinity Ligand Techniques. New York: Academic Press. 1992.

74. Т. Дэвени, Я. Гергей. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Мир. 1976.

75. Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Наука. 1985.

76. Merrifield R. В. Solid Phase Peptide Synthesis. 1. The Synthesys of a Tetrapeptide. // J. Am. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 2149-2154.

77. Дж. Стюарт, Дж. Янг. Твердофазный синтез пептидов. М.: Мир. 1971.

78. А. А. Гершкович, В. К. Кибарев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев: Нау-кова думка. 1987.

79. G. В. Fields, R. L. Noble. Solid Phase Peptide Synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids. // Int. J. Peptide Protein Res. 1990. V. 35. P. 161-214.

80. Ред. В. Т. Иванов. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. М.: Наука. 1993.

81. Ред. Э. Гросс, И. Майенхофер. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. М.: Мир. 1965.

82. Д. Гринштейн, М. Виниц. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир. 1965.

83. Э. Шредер, К. Любке. Пептиды. М.: Мир. 1967.

84. A. Jungbauer, K. Pflegerl. Solid Phase Synthesis and Auxiliaries for Combinatorial Chemistry. In Book: F. Svec, T. Tennikova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. P. 725-743.

85. Huang P. Y., Carbonell R. G. Affinity Chromatographic Screening of Soluble Combinatorial Peptide Libraries. // Biotech. Bioeng. 1999. V. 63. P. 633-641.

86. B. Blankemeyer-Menge, R. Frank. Simultaneous Multiple Synthesis of Peptide Fragments on "Allyl"-functionalized Cellulose Disc Supports. II Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 58715874.

87. R. Döring, R. Frank. Simultaneous Multiple Synthesis Under Continuous Flow Conditionson Cellulose Paper Discs as Segmental Solid Supports. // Tetrahedron. 1988. V. 44. P. 60316040.

88. R. Frank R. Spot-Synthesis: An Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support. // Tetrahedron. 1992. V. 48. P. 9217-9232.

89. H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, U. Reineke. Coherent Membrane for Parallel Microsynthesis and Screening of Bioactive Peptides. // Biopolymers. 2000. V. 55. P. 188-206.

90. S. B. Daniels, M. S. Bernatowicz, J. M. Coull, H. Köster. Membranes as Solid Supports for Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 4345-4348.

91. R. Berg, K. Aldmal, W. B. Pedersen, A. Holm, J. P. Tarn, R. B. Merrifield. Long-Chain Polystyrene-Grafted Polyethylene Film Matrix: A New Support for Solid-Phase Peptide Synthesis. II J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 8024-8026.

92. A. M. Bray, N. J. Maejl, H. M. Geysen. The Simultaneous Multiple Production of Solution Phase Peptides; Assessment of the Geysen Method of Simultaneous Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. P. 5811-5814.

93. F. Rasoul, F. Ercole, Y. Pham, C. T. Bui, Z. Wu, S. N. James, R. W. Trainor, G. Wickham, N. J. Maeji. Grafted Supports in Solid-Phase Synthesis. II Biopolymers. 2000. V. 55. P. 207-216.

94. R. Li, X. Y. Xiao, W. Czarnik, R. B. Merrifield. Microtube™ Reactors for Solid Phase Synthesis. II Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. P. 8581-8584.

95. A. R. Mitchell, S. B. Kent, B. W. Erickson, R. B. Merrifield. Preparation of Aminomethyl-polystyrene Resin by Direct Amidomethylation. // Tetrahedron Lett. 1976. V. 42. P. 3795-3798.

96. V. K. Sarin, S. B. Kent, J. P. Tam, R. B. Merrifield. Quantitative Monitoring of SolidPhase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction. II Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 147-157.

97. N. Hird, I. Hughes, D. Hunter, M. G. Morrison, D. C. Sherrington, L. Stevenson. Polymer Discs An Alternative Support Format for Solid Phase Synthesis. // Tetrahedron. 1999. V. 55. P. 9575-9584.

98. A. Papra, H. G. Hicke, D. Paul. Synthesis of Peptide onto the Surface of PoIy(Ethyleneterephthalate) Particle Track Membranes. // J. Appl. Polym. Sei. 1999. V. 74. P. 1669-1674.

99. V. I. Korol'kov, G. A. Platonova, V. V. Azanova, T. B. Tennikova, G. P. Vlasov. In situ Preparation of Peptidylated Polymers as Ready-to-use Adsorbents for Rapid Immunoaffinity Chromatography. II Lett. Pept. Sei. 2000. V. 7. P. 53-61.

100. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Berger, A. Jungbauer. Direct Synthesis of Peptides on Con-vective Interaction Media Monolithic Columns for Affinity Chromatography. // J. Comb. Chem. 2002. V. 4. P. 33-37.

101. K. Pflegerl, A. Podgornik, E. Berger, A. Jungbauer. Screening for Peptide Affinity Ligands on CIM Monoliths. // Biotech. Bioeng. 2002. V. 79. P. 733-740.

102. Z. Xu, Q. Liu, J. A. Finch. Silanation and Stability of 3-aminopropyl triethoxy silane on Nanosized Superparamagnetic Particles: 1. Direct Silanation. // Appl. Surf. Sei. 1997. V. 120. P. 269-278.

103. S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas. Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. //Science. 1991. V. 251. P. 767-773.

104. M. Lebl. Solid-Phase Synthesis on Planar Supports. // Biopolymers. 1998. V. 47. P. 397404.

105. S. Moore, W. H. Stein. Photometric Ninhydrin Method for Use in the Chromatography of Amino Acids. II J. Biol. Chem. 1948. V. 176. P. 367-387.

106. E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-phase Synthesis of Peptides. II Anal. Biochem. 1970. V. 34. P. 595-598.

107. V. K. Sarin, S. B. H. Kent, J. P. Tarn, R. B. Merrifield. Quantitative Monitoring of SolidPhase Synthesis by the Ninhydrin Reaction. II Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 147-157.

108. G. Losse, R. Ulbrich. Kontrolle des Umsatzgrades bei der Merrifield-Synthese. II Z. Chem. 1971. V. 11. P. 346-347.

109. V. Krchnak, J. Vagner, P. Safar, M. Lebl. Noninvasive Continuos Monitoring of Solidphase Peptide Synthsis by Acid-base Indicator. II Coll. Czechosl. Chem. Commun. 1988. V. 53. P. 2542-2548.

110. V. B. Ivanov, J. Behnish, A. Hollander, F. Mehdorn, H. Zimmermann. Determination of functional Groups on Polymer Surfaces Using Fluorescence Labelling. // Surf. Interface Analysis. 1996. V. 24. P. 257-262.

111. L. C. Dorman. A Non-destructive Method for the Determination of Completeness of Coupling Reactions in Solid Phase Peptide Synthesis. // Tetrahedron Lett. 1969. V. 10. P. 23192321.

112. B. F. Gisin. The monitoring of Reactions in Solid-phase Peptide Synthesis with Picric Acid. II Anal. Chem. Acta. 1972. V. 58. P. 248-249.

113. R. Hahn, A. Podgornik, M. Merhar, E. Schallaun, A. Jungbauer. Affinity Monoliths Generated by in situ Polymerization of the Ligand. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 5126-5132.

114. Т. Devendrán. Das bahnbrechende Medikament t-PA. Der Lebensretter nach dem Herzinfarkt, Pharmazie. Bild der Wissenschaft. 1988. V. 3. P. 95-103.

115. А. В. Максименко. Тромбин: соотношение структура функция в биохимических взаимодействиях. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1373-1382.

116. Э. В. Луговской, С. В. Комисаренко. Моноклональные антитела как инструмент исследования полимеризации фибрина. // Биоорг. Хим. 2000. Т. 26. С. 883-891.

117. А. В. Максименко. Активаторы плазминогена 3-го поколения. Новое направление изучения. // Биоорг. Хим. 1999. Т. 25. С. 563-571.

118. А. Б. Добровольский, Е. В. Титаева. Система фибринолиза: регуляция активности ифизиологические функции ее основных компонентов. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 116-126.

119. А. В. Максименко. Сочетанный тромболизис фармокинетическими активаторами плазминогена. // Биоорг. Хим. 1998. Т. 24. С. 376-380.

120. D. Collen. Fibrin-Selective Thrombolythic Therapy for Acute Myocardial Infraction. // Circulation. 1996. V. 93. P. 857-865.

121. А. В. Максименко. Молекулярные взаимодействия при фибринолизе. Поиск новых активаторов плазминогена. // Мол. Биол. 1995. Т. 29. С. 38-59.

122. K.-Ch. Young, G.-Yu. Shi, Yu.-F. Chang, B.-I. Chang, Li-Ch. Chang, M.-D. Lai, W.-J.

123. Chuang, H.-L. Wu. Interaction of Streptokinase and Plasminogen. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 29601-29606.

124. X.-Ch. Wu, R. Ye, Ya. Duan, S.-L. Wong. Engineering of Plasmin-Resistant Forms of Streptokinase and Their Production in Bacillus subtilis: Streptokinase with Longer Functional Half-Life. // Apll. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 824-829.

125. S. A. Cederholm-Williams, F. De Cock, H. R. Lijnen, D. Collen. Kinetics of the Reaction between Streptokinase, Plasmin and alpha-2-antiplasmin. // Eur. J. Biochem. 1979. V. 100. P. 125-132.

126. Т. V. Hrynenko, le. M. Makohonenko, О. I. Yusova, S. A. Cederholm-Williams. Degradation of Streptokinase and the Catalytic Properties of the Plasmin-Streptokinase Complex. // Ukr. Biokhim. Zh. 2002. V. 74. P. 50-57.

127. G. E. Siefring, F. J. Castellino. Interaction of Streptokinase with Plasminogen. Isolation and Characterization of Streptokinase Degradation Products. // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 3913-3920.

128. P. Rodriguez, P. Fuentes, M. Barro, J. G. Alvarez, E. Muñoz, D. Collen, H. R. Lijnen. Structural Domains of Streptokinase involved in the Interaction with Plasminogen. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 824-829.

129. D. Stump, M. Thienpont, D. Collen. Urokinase-realated Proteins in Human Urine. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1267-1273.

130. Y. Horiuchi, J. M. Marshall, S. A. Cederholm-Williams, T. J. Ryan. Secretion of Urokinase and Tissue-Plasminogen Activator by epidermal Cells in the Presence of Psoriatic Fi-broblast-Conditioned Medium. II Acta Derm. Venerol. 1992. V. 72. P. 401-402.

131. P. A. Andreasen, L. Kjoller, L. Christensen, M. J. Duffy. The Urokinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: a review. // Int. J. Cancer. 1997. V. 72. P. 1-22.

132. H. R. Lijnen, C. Zamarron, M. Blaber, M. E. Winkler, D. Collen. Activation of Plasminogen by Pro-urokinase: Mechanism. II J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1253-1258.

133. D. Collen, C. Zamarron, H. R. Lijnen, M. Hoylaerts. Activation of Plasminogen by Pro-urokinase: Kinetics. H J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1259-1266.

134. R. Pannell, V. Gurewich. Pro-urokinase: a Study of its Stability in Plasma and of a Mechanism for its Selective Fibrinolytic Effect. II J. Am. Soc. Hemat. 1986. V. 67. P. 1215-1223.

135. D. Stump, H. R. Lijnen D. Collen. Purification and Characterization of Single-chain Urokinase-type Plasminogen Activator from Human Cell Cultures. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1274-1278.

136. J. Loscalzo, T. P. Wharton, J. M. Kirshenbaum, H. J. Levine, J. T. Flaherty, E. J. Topol, K. Ramaswamy, B. D. Kosowsky, D. N. Salem, P. Ganz. Clot-selective Coronary Thrombolysis with Pro-urokinase. // Circulation. 1989. V. 79. P. 776-782.

137. L. Hansen, Y. Blue, K. Barone, D. Collen, G. R. Larsen. Functional Effects of Asparagine-linked Oligosacharide on Natural and Variant Human Tissue-type Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15713-15719.

138. W. Asche. Gewinnung von t-pa aus E.coli. II BioEngineering. 1989. V. 6. P. 43-45.

139. M. Hoylaerts, D. C. Rijken, H. R. Lijnen, D. Collen. Kinetics of the Activation of Plasminogen by Human Tissue Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 29122919.

140. D. C. Rijken, M. Hoylaerts, D. Collen. Fibrinolytic Properties of One-chain and Two-chain Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator. II J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 29202925.

141. G. Larsen, К. Henson, Y. Blue. Variants of Human Tissue-type Plasminogen Activator. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1023-1029.

142. A. Klausner. Researchers Probe Second-Generation t-PA. 11 Biotechnology. 1986. V. 4. P. 706-711.

143. V. Fleury, S. Loyau, H. R. Lijnen, W. Nieuwenhuizen, E. Angles-Cano. Molecular Assembly of Plasminogen and Tissue-type Plasminogen Activator on an Evolving Fibrin Surface. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 216. P. 549-556.

144. E. Kaezmarek, M. H. Lee, J. McDonagh, Initial Interaction between Fibrin and Tissue Plasminogen Activator (t-PA). И J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 2474-2479.

145. E. В. Парфенова, О. С. Плеханова, В. А. Ткачук. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 139-156.

146. I. Y. Sazonova, А. К. Houng, S. A. Chowdhry, В. R. Robinson. The Mechanism of a Bacterial Plasminogen Activator Intermediate between Streptokinase and Staphylokinase. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 12609-12613.

147. D. V. Sakharov, H. R. Lijnen, D. C. Rijken. Interactions between Staphylokinase, Plasminogen) and Fibrin. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 27912-27918.

148. D. Collen, H. R. Lijnen. Staphylokinase, a Fibrin-specific Plasminogen Activator with Therapeutic Potential? // Blood. 1994. V. 84. P. 680-686.

149. F. Z. Li, X. Z. Li, H. Q. Zhang, B. C. Hu, W. Y. Yu, J. M. Fang, C. F. Huang. Expression of Pro-urokinase cDNA in Chinese Hamster Ovary Cell Line. // Chin. J. Biotechnol. 1991. V. 7. P.113-120.

150. D. Collen. Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli. II Nature. 1983. V. 301. P. 214-220.

151. С. Zhaolie, W. Benchuan, L. Hong, L. Shichong, H. Peitang. Study on rt-PA Production by Recombinant CHO-cells Immobilized with a Porous Microcarrier. // Chin. J. Biotechnol. 1999. V. 15. P. 239-244.

152. С. H. Fann, F. Guirgis, G. Chen, M. S. Lao, J. M. Piret. Limitations to the Amplification and Stability of Human Tissue-type Plasminogen Activator Expression by Chinese Hamster Ovary Cells. // Biotechnol Bioeng. 2000. V. 69. P. 204-212.

153. M. Einarson, J. Brandt, L. Kaplan. Large-scale Purification of Human Tissue Plasminogen Activator Using Monoclonal Antibodies. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 830. P. 1-10.

154. D. Lau, G. Kuzma, C.-M. Wei, D. J. Livingston, N. Hsiung. A modified Human tissue Plasminogen Activator With Extended Half-life in Vivo. // Biotechnology. 1987. V. 5. P. 953958.

155. G. A. Munk, M. P. Caspers, G. T. Chang, P. H. Pouwels, В. E. Enger-Valk, J. H. Verhei-jen. Binding of Tissue-tipe Plasminogen Activator to Lysine, Lysine Analogues and Fibrin Fragments. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 318-7325.

156. A. Petel, M. O'Hara, J. Callaway, D. Greene, J. Martin, A. Nishikawa. Affinity purification of tissue plasminogen activator using transition-state analogues. II J. Chromatogr. 1990. V. 510. P. 83-93.

157. B. J. Bergot, R. L. Noble, T. Geiser. Utility of Trifluoromethane Sulfonic Acid as a Cleavage Reagent in Solid Phase Peptide Synthesis. I I Applied Biosystems User Bulletin. 1986. P. 16.

158. К. Наканиси. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир. 1965.

159. И. Дехант, Р. Данц, В. Киммер, Р. Шмольке. Инфракрасная спектроскопия полимеров. М.: Химия. 1976.

160. А. Ю. Билибин. Изучение синтеза пептидов с использованием Сефадексов в качестве полимерных носителей. Диссертация на соискание уч. степ, к.х.н. ИВС РАН. Ленинград. 1974.

161. U. Ragnarsson, S. Karlsson, В. Sandberg. Studies on the Coupling Step in Solid Phase Peptide Synthesis. Some Preliminary Results from Competition Experiments. // Acta Chem. Scand. 1971. V. 25. P. 1487-1489.

162. Е. В. Кудрявцева, М. В. Сидорова, А. С. Молокоедов, М. В. Овчинников, Ж. Д. Беспалова. Направленное и спонтанное замыкание дисульфидных связей с помощью перекиси водорода в синтезе эндотелионов-1 и -3. // Биоорг. Хим. 1999. Т. 25. С. 107-116.

163. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М: Мир. 1991.